CN112146955A - 血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血清的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将血浆与可溶性钙盐混合，制备混合溶液，其中，血浆的体积与可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.28mg～3.28mg)；将混合溶液反复冻融后，在7741g～11325g条件下离心，取上清；及对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理，制备血清。上述血清的制备方法的得率高，血浆中总蛋白的回收率高，不额外引入钠离子，应用于吖啶酯作为标记物的化学发光检测时，准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种血清的制备方法。
背景技术
纤维蛋白原(Fibrinogen，又称为血纤维蛋白原)是由肝细胞合成和分泌的一种糖蛋白，具有凝血功能，是血浆中含量最高的凝血因子。纤维蛋白原的分子量约为340kDa，为共价二聚体，每个亚基含有α、β和γ三条肽链，分别由610、461及410个氨基酸残基构成，各肽链彼此通过二硫键相互连接。两个亚基在肽链N-末端附近再通过三对二硫键将对称的两个亚基连结起来而形成中间球状物，中间球状物包含2条α链、2条β链和2条γ链的6个N-末端，6条肽链的N-末端交错在一起，形成两股“卷取螺旋”结构。在凝固过程中，血凝酶切断纤维蛋白原α链N-末端区域的纤维蛋白肽A和β链N-末端区域的纤维蛋白肽B而生成纤维蛋白单体，纤维蛋白单体以交错重叠状态侧向聚合，最终形成由成熟纤维蛋白网络构成的血凝块。
血清指纤维蛋白原已被除去的血浆，主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和生长因子使细胞贴壁免受机械损伤和对培养中的细胞起到某些保护作用等。由于血清的杂质较少，干扰较小，常用于校准品和稀释液的配制，是体外诊断试剂行业中是重要的原料之一。
在血液采集过程中，通常血液采集管中都会预置草酸盐、乙二胺四乙酸盐或枸橼酸盐等抗凝物质，乙二胺四乙酸盐或枸橼酸盐会与血液中的钙离子结合生成稳定的螯合物而使凝血中止。因此，传统的血清制备方法是血浆复钙法，即在含有草酸盐、乙二胺四乙酸盐或枸橼酸盐等抗凝物质的血液中重新加入过量的钙离子而使得凝血继续并快速进行，待反应结束后加入草酸钠沉淀过量的钙离子，最后离心，从而得到血清。然而，按照传统的血清制备方法制得的血清应用于吖啶酯作为标记物的化学发光检测时，准确性较差。
近些年，也出现了将血浆直接在56℃条件下加热而制备血清的方法，然而，在56℃条件下，血浆中的部分蛋白的结构容易发生变化，甚至变性，所以采用这种方法制备的血清的总蛋白回收率较低，血清的整体质量较差，应用于体外诊断检测时准确性也同样较低。
发明内容
基于此，有必要提供一种血清的制备方法，以改善传统的血清制备方法制备的血清应用于吖啶酯作为标记物的化学发光检测时准确性较差问题。
一种血清的制备方法，包括以下步骤：
将血浆与可溶性钙盐混合，制备混合溶液，其中，所述血浆的体积与所述可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.28mg～3.28mg)；
将所述混合溶液反复冻融后，在8000rpm～10000rpm条件下离心，取上清；及
对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理，制备血清。
经本申请研究发现，在传统的血清制备方法中，采用草酸钠去除过量钙离子的方式使得血清中额外引入了钠离子，而这部分额外引入的钠离子会干扰吖啶酯发光信号，进而使得按照传统的血清制备方法制得的血清应用于吖啶酯作为标记物的化学发光检测时准确性较低。而上述血清的制备方法通过优化可溶性钙盐的加入量，并结合反复冻融，避免了额外引入钠离子，使得制得的血清应用于吖啶酯作为标记物的化学发光检测时准确性高，同时上述血清的制备方法还提高了制得的血清中的总蛋白含量、总蛋白的回收率及血清的得率。
在其中一个实施例中，所述可溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙及硫酸钙中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述血浆的体积与所述可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.58mg～2.98mg)。
在其中一个实施例中，在所述将血浆与可溶性钙盐混合的步骤之前，还包括对血浆进行预处理的步骤，所述预处理的步骤包括：将血浆在7741g～11325g条件下离心；及/或，将血浆采用孔径为0.22μm～0.45μm的滤膜过滤。
在其中一个实施例中，在所述将所述混合溶液反复冻融的步骤中，所述冻融的次数为2次～4次。
在其中一个实施例中，所述制备方法还包括加入防腐剂的步骤，所述加入防腐剂的步骤在所述对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤之前；优选地，所述防腐剂选自Proclin 300和叠氮化钠中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤包括：将所述反复冻融后离心所得的上清采用孔径为0.22μm～0.45μm滤膜进行过滤。
在其中一个实施例中，在所述对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤之后，还包括以下步骤：将经除菌处理后的溶液在2℃～8℃条件下静置8小时以上；静置后，若经除菌处理后的溶液出现浑浊，则将出现浑浊的溶液采用孔径为0.22μm～0.45μm滤膜过滤。
上述血清的制备方法制得的血清在制备体外诊断试剂中的应用。
一种检测试剂盒，包括上述血清的制备方法制得的血清。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
经本申请研究发现，在传统的血清制备方法中，因向血浆中添加草酸钠以去除过量的钙离子而使得制备的血清中额外引入钠离子，而这些额外引入的钠离子会干扰吖啶酯发光信号，从而使得按照传统的血清制备方法制得的血清应用于吖啶酯作为标记物的化学发光检测时准确性较低。而近些年出现的将血浆直接在56℃条件下加热而制备血清的方法，虽然没有额外引入钠离子，但是这种方法制备的血清的总蛋白回收率较低，血清的整体质量较差，应用于体外诊断检测时准确性也同样较低且使用范围还受限制。
因此，本发明一实施方式提供了一种血清的制备方法，该血清的制备方法不额外引入钠离子且总蛋白回收率高，按照该血清的制备方法制得的血清的整体质量高、适用范围广。具体地，该血清的制备方法包括步骤a～步骤d：
步骤a：对血浆进行预处理。
对血浆进行预处理，以去除血浆中肉眼可见的沉淀或不溶物。
在其中一个实施例中，对血浆进行预处理的步骤包括：将血浆在7741g～11325g条件下离心。进一步地，离心在0℃～4℃条件下进行。
在另一个实施例中，对血浆进行预处理的步骤包括：将血浆采用孔径为0.22μm～0.45μm的滤膜过滤。在一个可选地具体示例中，预处理中的滤膜的孔径为0.45μm。
在其中一个实施例中，对血浆进行预处理的步骤包括离心和过滤。具体地，先将血浆在7741g～11325g条件下离心，然后将离心得到的上清采用孔径为0.22μm～0.45μm的滤膜过滤，得到澄清的经过预处理的血浆。
在其中一个实施例中，对血浆进行预处理的步骤中的离心时间为8min～15min。进一步地，对血浆进行预处理的步骤中的离心时间为10min～12min。
当然，可以理解的是，在其他实施例中，预处理的步骤也可以省略。
需要说明的是，在本实施方式中，血浆为添加了草酸盐、枸橼酸盐及/或乙二胺四乙酸盐(EDTA盐)作为抗凝剂的血浆。草酸盐、枸橼酸盐或乙二胺四乙酸盐作为抗凝剂的原理是：草酸盐、枸橼酸盐或乙二胺四乙酸盐与血浆中的钙离子结合形成稳定的螯合物，从而阻止了纤维蛋白原转变为纤维蛋白，使凝血中止。
步骤b：将血浆与可溶性钙盐混合，制备混合溶液，其中，血浆的体积与可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.28mg～3.28mg)。
具体地，将血浆与可溶性钙盐混合，可以使得血浆中钙离子的浓度增加，从而重启纤维蛋白原向纤维蛋白转变的反应，进而去除血浆中的纤维蛋白原。
在其中一个实施例中，可溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙及硫酸钙中的至少一种。硫酸钙和硝酸钙为强酸弱碱性盐，添加的可溶性钙盐为硫酸钙或硝酸钙时，可能会影响制得的血清的pH，因此，可以根据实际需求进行选择具体的可溶性钙盐。进一步地，可溶性钙盐为氯化钙。氯化钙的加入不会影响制得的血清的pH。
本实施方式中可溶性钙盐的添加量可以使得纤维蛋白原向纤维蛋白转变的反应重启，但又不会使得血浆中的钙离子过量。因此，不必为去除过量的钙离子而加入草酸钙等沉淀钙离子的钠盐。也即是说，本实施方式的血清的制备方法不包括添加能与钙离子形成沉淀的钠盐(例如草酸钙)的步骤。具体地，血浆的体积与可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.28mg～3.28mg)。在一个可选地具体示例中，血浆的体积与可溶性钙盐的质量之比为1mL：2.28mg、1mL：2.58mg、1mL：2.78mg、1mL：2.98mg或1mL：3.28mg。进一步地，血浆的体积与可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.58mg～2.98mg)。
需要说明的是，本实施方式中的可溶性钙盐均为固态。在一个可选地具体示例中，将血浆与可溶性钙盐混合以制备混合溶液的步骤包括：向血浆中加入可溶性钙盐，并使可溶性钙盐溶解，制备混合溶液。
步骤c：将混合溶液反复冻融后，在7741g～11325g条件下离心，取上清。
反复冻融是指将混合溶液处于冷冻-解冻的循环过程中。反复冻融利于血浆中纤维蛋白的析出，而血浆中的其他蛋白不易析出，进而便于去除纤维蛋白，同时提高总蛋白的回收率。
在一个可选地具体示例中，在将混合溶液反复冻融的步骤中，冻融的次数为2次～4次。需要说明的是，冻融一次是指冷冻-解冻的过程进行一次。具体地，熔融一次是指将液态的混合溶液置于-80℃～-20℃的条件下使混合溶液凝固，然后将凝固后的混合溶液置于20℃～26℃条件下解冻。进一步地，冷冻的温度为-80℃～-40℃。
在其中一个实施例中，将混合溶液反复冻融后的离心时间为15min～30min。进一步地，将混合溶液反复冻融后的离心时间为20min～25min。
当然，可以理解的是，在其他一些实施例中，反复冻融的次数不限于上述。
步骤d：对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理，制备血清。
对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤包括：将反复冻融后离心所得的上清采用孔径为0.22μm～0.45μm滤膜进行过滤。
在一个可选地具体示例中，过滤反复冻融后离心所得的上清的滤膜的孔径为0.45μm。孔径为0.45μm的滤膜可以除掉血清中大多数微生物。进一步地，过滤反复冻融后离心所得的上清的滤膜的孔径为0.22μm。孔径为0.22μm的滤膜可以去除血清中99.99％的微生物，达到GMP或者药典规定的99.99％的除菌要求。
在一些实施例中，上述血清的制备方法还包括加入防腐剂的步骤。具体地，防腐剂选自Proclin 300和叠氮化钠中的至少一种。进一步地，Proclin 300的添加量为0.01％～0.5％。在一个可选地具体示例中，Proclin 300的添加量为0.1％。当然，在其他一些实施例中，防腐剂不限于上述，还可以是其他物质。
在其中一个实施例中，加入防腐剂的步骤在对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理之前。通过在制备血清时添加防腐剂，可以使得制得的血清不易被微生物污染而变质。进一步地，在对混合溶液反复冻融前加入防腐剂，此时防腐剂还可以避免血浆在反复冻融过程中变性。更进一步地，在血浆与可溶性钙盐混合之前加入防腐剂。在一个可选地具体示例中，在将可溶性钙盐与血浆混合时加入防腐剂，也即是，将防腐剂和可溶性钙盐与血浆混合，制备混合溶液。
在一些实施方式中，在对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤之后，还包括以下步骤：将经除菌处理后的溶液在2℃～8℃条件下静置8小时以上；静置后，若经除菌处理后的溶液出现浑浊，则将出现浑浊的溶液采用孔径为0.22μm～0.45μm滤膜过滤。在一个可选地具体示例中，静置的时间为8小时～14小时；静置的温度为2℃～6℃。进一步地，静置的温度为4℃。
本发明一实施方式还提供了一种上述血清的制备方法制得的血清在制备体外诊断试剂中的应用。例如，在制备以吖啶酯为标记物的体外诊断试剂中的应用。应用到体外诊断试剂中时，上述血清的制备方法制得血清可以作为稀释液，也可以作为质控品的组分。
此外，本发明一实施方式还提供了一种检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述血清的制备方法制得的血清。进一步地，该检测试剂盒还包括化学发光标记物，化学发光标记物为吖啶酯。
上述检测试剂盒含有上述血清的制备方法制得的血清，检测的准确性高。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
(1)将新鲜血浆(含作为抗凝剂的枸橼酸盐)放置于室温(本文中的室温指26℃)，使其温度与室温一致。然后取一部分新鲜血浆，并采用双缩脲试剂盒测定新鲜血浆中总蛋白含量，结果如表1所示。
(2)将步骤(1)剩余的一部分新鲜血浆在4℃7741g条件下高速离心10min，得上清，然后用0.45μm滤膜过滤，得到澄清的血浆，取100mL的澄清的血清记作V1。
(3)向步骤(2)的100mL的澄清的血浆中加入Proclin 300和氯化钙并混合均匀，得到混合溶液。其中，Proclin 300的添加量为1‰(Proclin 300与血浆的体积比为1：1000)，加入的氯化钙(固体)的质量与血浆的体积之比为2.78mg：1mL。
(4)将步骤(3)得到的混合溶液放置于超低温(-80℃)保存箱中冷冻8小时，然后置于室温条件下解冻，使混合溶液的温度与室温一致，完成第一次冻融；接着将解冻的混合溶液置于超低温(-80℃)保存箱中冷冻8小时，然后置于室温条件下解冻，使混合溶液的温度与室温一致，完成第二次冻融；最后将解冻的混合溶液置于超低温(-80℃)保存箱中冷冻8小时，然后置于室温条件下解冻，使混合溶液的温度与室温一致，完成第三次冻融；三次冻融在2天内完成。
(5)将步骤(4)得到的经历了三次冻融的混合溶液在4℃8000-10000rpm条件下高速离心20min，取上清。
(6)将步骤(5)得到的上清液用0.45μm滤膜过滤，取滤液，并将其放置于低温冰箱(4℃)静置12小时，无浑浊或沉淀，制得去除纤维蛋白原的血浆(血清)，记制得的去除纤维蛋白原的血浆的体积为V2。
(7)对比新鲜血浆和步骤(6)得到的去除纤维蛋白原的血浆(血清)的外观，并根据步骤(2)中的V1和步骤(6)中的V2计算实施例1的血清的制备方法的得率(V1/V2×100％)。此外，通过双缩脲试剂盒测定步骤(6)的血清中总蛋白含量，并根据处理前血浆中的总蛋白含量和处理后得到的血清中的总蛋白含量，计算实施例1的血清的制备方法的总蛋白回收率，结果如表1所示。
表1
由表1可以看出，实施例1的血清的制备方法经过静置后澄清透明，无沉淀，说明实施例1的血清的制备方法能够去除血浆中的纤维蛋白原，使得液体澄清透明无沉淀，并且实施例1的血清的制备方法的得率和总蛋白回收率高，得率达到92.63％，总蛋白回收率达到95.44％，实施例1的血清的制备方法制得的血清与新鲜血浆相比，蛋白成分基本不变化。
实施例2
采用和实施例1相同的血清制备方法，以10个不同批次的新鲜血浆为原料制备血清，以验证实施例1的血清的制备方法的可重复性，结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，对于10个不同批次的新鲜血浆，采用实施例1的血清的制备方法时的得率在85.64％以上，总蛋白回收率均在91.93％以上，平均得率为89.68％，总蛋白平均回收率为95.5％，说明实施例1的血清的制备方法重复性好。
实施例3
实施例3的血清的制备方法大致与实施例1的血清的制备方法相同，其不同在于，氯化钙的添加量不同，在实施例3中，添加的氯化钙的质量与血浆的体积之比为2.58mg：1mL。
实施例3的血清的制备方法的得率和总蛋白回收率如表3所示。
表3
由表3可以看出，采用实施例3的血清的制备方法时的得率在87.91％以上，总蛋白回收率均在91.53％以上，实施例3的血清的制备方法制得的血清澄清无沉淀，平均得率为90.16％，总蛋白平均回收率为93.49％。
实施例4
实施例4的血清的制备方法大致与实施例1的血清的制备方法相同，其不同在于，氯化钙的添加量不同，在实施例4中，添加的氯化钙的质量与血浆的体积之比为2.28mg：1mL。
实施例4的血清的制备方法的得率和总蛋白回收率如表4所示。
表4
由表4可以看出，采用实施例4的血清的制备方法时的得率均在88.67％以上，总蛋白回收率均在87.56％以上，实施例4的血清的制备方法制得的血清澄清无沉淀，平均得率为90.45％，总蛋白平均回收率为89.63％。
实施例5
实施例5的血清的制备方法大致与实施例1的血清的制备方法相同，其不同在于，氯化钙的添加量不同，在实施例5中，添加的氯化钙的质量与血浆的体积之比为2.98mg：1mL。
实施例5的血清的制备方法的得率和总蛋白回收率如表5所示。
表5
由表5可以看出，采用实施例5的血清的制备方法时的得率均在87.48％以上，总蛋白回收率均在90.92％以上，实施例5的血清的制备方法制得的血清澄清无沉淀，平均得率为91.03％，总蛋白平均回收率为92.1％。
实施例6
实施例6的血清的制备方法大致与实施例1的血清的制备方法相同，其不同在于，氯化钙的添加量不同，在实施例6中，添加的氯化钙的质量与血浆的体积之比为3.28mg：1mL。
实施例6的血清的制备方法的得率和总蛋白回收率如表6所示。
表6
由表6可以看出，采用实施例6的血清的制备方法时的得率均在87.68％以上，总蛋白回收率均在84.36％以上，实施例6的血清的制备方法制得的血清澄清无沉淀，平均得率为89.68％，总蛋白平均回收率为86.17％。
对比例1
对比例1的血清的制备方法大致与实施例1的血清的制备方法相同，其不同在于，氯化钙的添加量不同，在对比例1的血清的制备方法中，添加的氯化钙的质量与血浆的体积之比为1.39mg：1mL。具体地：
(1)取同一批次的新鲜血浆，一部分采用实施例1的血清的制备方法制备血清，作为对照组，另一部分采用对比例1的血清的制备方法制备血清，作为试验组，两组的结果如表7所示。
表7
由表7可知，采用对比例1的血清的制备方法制得的血清，外观上呈现絮状沉淀，浑浊。对比例1的血清的制备方法的得率为81.26％，制得血清中总蛋白含量为63.23mg/mL。
(2)以实施例2中的10个不同批次的新鲜血浆为原料，分别采用对比例1的血清的制备方法制备血清，结果如表8所示。
表8
由表8可以看出，对比例1的血清的制备方法的得率为74.26％～81.22％，远小于实施例1的血清的制备方法的得率(>85％，参见表2)；对比例1的血清的制备方法的总蛋白回收率为64.26％～75.29％，远小于实施例1的血清的制备方法的总蛋白回收率(>91％，参见表2)。此外，对比例1的血清的制备方法制得的血清普遍仍有絮状沉淀产生。
对比例2
对比例2的血清的制备方法大致与实施例1的血清的制备方法相同，其不同在于，氯化钙的添加量不同，在对比例2的血清的制备方法中，添加的氯化钙的质量与血浆的体积之比为5.56mg：1mL。具体地：
(1)取同一批次的新鲜血浆，一部分采用实施例1的血清的制备方法制备血清，作为对照组，另一部分采用对比例2的血清的制备方法制备血清，作为试验组，两组的结果如表9所示。
表9
(2)以实施例2中的10个不同批次的新鲜血浆为原料，分别采用对比例2的血清的制备方法制备血浆，结果如表10所示。
表10
由表10可以看出，对比例2的血清的制备方法的得率为73.84％～78.35％，远小于实施例1的血清的制备方法的得率(>85％，参见表2)；对比例2的血清的制备方法的总蛋白回收率为66.72％～70.65％，远小于实施例1的血清的制备方法的总蛋白回收率(>91％，参见表2)。此外，对比例2的血清的制备方法制得的血清普遍仍有絮状沉淀。
对比例3
取新鲜血浆(含作为抗凝剂的枸橼酸盐)，进行如下操作，以制备对比例3的血清：将血浆放入56℃水浴1小时，间或摇动，然后3000r/min离心15min，取上清，得到对比例3的血清。参照实施例1的方法计算对比例3的血清的制备方法的得率及总蛋白回收率，结果如表11所示。
表11
由表11可以看出，对比例3的制备方法制得血清的外观、得率及总蛋白回收率均比实施例1差。
对比例4
(1)将新鲜血浆(含作为抗凝剂的枸橼酸盐)放置于室温，使其温度与室温一致。然后取一部分新鲜血浆，并采用双缩脲试剂盒测定新鲜血浆中总蛋白含量，结果如表12所示。
(2)将步骤(1)剩余新鲜血浆的一部分在4℃7741g条件下高速离心10min，得上清，然后用0.45μm滤膜过滤，得到澄清的血浆，取100mL的澄清的血清记作V1。
(3)将14.7g的二水氯化钙溶于纯化水中，制得1M CaCl2溶液；在0.5mL1000U/mL的凝血酶溶液中加入4.5mL 1M CaCl2溶液，混匀，室温反应30分钟，制得激活凝血酶溶液。
(4)在步骤(2)的100mL澄清的血浆中加入步骤(3)激活凝血酶溶液和Proclin300，其中：加入激活凝血酶溶液和血浆的体积之比为1：100，Proclin 300的添加量为1‰，混匀，37℃孵育30分钟。
(5)将步骤(4)得到的血浆置于室温120分钟；然后将血浆置于-15℃保存48小时；接着将血浆置于室温4小时，4000rpm离心30分钟，取上清。
(6)将步骤(5)得到的上清液过0.45μm滤膜过滤，取滤液，并将其放置于低温冰箱(4℃)静置12小时，制得去除纤维蛋白原的血浆(血清)，记制得的去除纤维蛋白原的血浆的体积为V2。
(7)对比新鲜血浆和步骤(6)得到的去除纤维蛋白原的血浆(血清)的外观，并根据步骤(2)中的V1和步骤(6)中的V2计算对比例4的血清的制备方法的得率(V1/V2×100％)。此外，通过双缩脲试剂盒测定步骤(6)的血清中总蛋白含量，并根据处理前后的血浆中的总蛋白含量，计算对比例4的血清的制备方法的总蛋白回收率，结果如表12所示。
表12
(8)以实施例2中的10个不同批次的新鲜血浆为原料，分别采用上述步骤(1)～(7)的方法制备血清，结果如表13所示。
表13
经比较发现，实施例1的血清的制备方法的得率(85.64％～93.68％，参见表2)，与对比例4的血清的制备方法的得率(85.74％～92.48％)相近；然而，实施例1的血清的制备方法的总蛋白回收率(91.93％～98.79％，参见表2)好于对比例4的血清的制备方法的总蛋白回收率(91.38％～93.69％)，并且实施例1的血清的制备方法采用试剂更少，不必添加价格昂贵的凝血酶，成本更低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将血浆与可溶性钙盐混合，制备混合溶液，其中，所述血浆的体积与所述可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.28mg～3.28mg)；
将所述混合溶液反复冻融后，在7741g～11325g条件下离心，取上清；及
对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理，制备血清。
2.根据权利要求1所述的血清的制备方法，其特征在于，所述可溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙及硫酸钙中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的血清的制备方法，其特征在于，所述血浆的体积与所述可溶性钙盐的质量之比为1mL：(2.58mg～2.98mg)。
4.根据权利要求1所述的血清的制备方法，其特征在于，在所述将血浆与可溶性钙盐混合的步骤之前，还包括对血浆进行预处理的步骤，所述预处理的步骤包括：将血浆在7741g～11325g条件下离心；及/或，将血浆采用孔径为0.22μm～0.45μm的滤膜过滤。
5.根据权利要求1～4任一项所述的血清的制备方法，其特征在于，在所述将所述混合溶液反复冻融的步骤中，所述冻融的次数为2次～4次。
6.根据权利要求1～4任一项所述的血清的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括加入防腐剂的步骤，所述加入防腐剂的步骤在所述对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤之前；优选地，所述防腐剂选自Proclin 300和叠氮化钠中的至少一种。
7.根据权利要求1～4任一项所述的血清的制备方法，其特征在于，所述对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤包括：将所述反复冻融后离心所得的上清采用孔径为0.22μm～0.45μm滤膜进行过滤。
8.根据权利要求1所述的血清的制备方法，其特征在于，在所述对反复冻融后离心所得的上清进行除菌处理的步骤之后，还包括以下步骤：将经除菌处理后的溶液在2℃～8℃条件下静置8小时以上；静置后，若经除菌处理后的溶液出现浑浊，则将出现浑浊的溶液采用孔径为0.22μm～0.45μm滤膜过滤。
9.权利要求1～8任一所述的血清的制备方法制得的血清在制备体外诊断试剂中的应用。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的血清的制备方法制得的血清。
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