CN101018805A - 诊断和治疗胶乳变态反应的试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断和/或治疗胶乳变态反应或水果变态反应的试剂，及其制备方法。
Description
本发明涉及诊断和/或治疗胶乳变态反应(latex allergy)或水果变态反应(fruit allergy)的试剂，及制备所述试剂的方法。
在20世纪的最后二十年，针对天然橡胶胶乳(natural rubber latex，NRL)的I型变态反应成为了在职业条件和医疗保健安全方面给患者带来深远影响的不断增加的健康问题。胶乳“致敏作用”或“敏感性”被定义为胶乳变应原特异性IgE抗体在个体血清中的存在。胶乳“变态反应”描述了在致敏个体中通过接触胶乳或胶乳产品而引发的即发型变态反应症状。
世界上多数天然橡胶从橡胶树，巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的胶乳中获得。天然橡胶胶乳的组成相当复杂，其包含了许多物质例如水、橡胶(顺式-1，4-聚异戊二烯)、蛋白质、树脂、糖、灰和甾醇糖苷(sterol glycolside)。对于商品化橡胶产品，为避免凝固，将新鲜胶乳与氨混合至最终浓度200mmol/L，因而称为氨化(ammoniated)胶乳(AL)。另一方面，高速离心非氨化胶乳(NAL)产生三种不同的级分：(i)在顶部的胶粒的白色乳脂层，(ii)主要由液泡样的黄色体组成的底部级分(B-胶清(serum))和(iii)含有来自胶乳管细胞的细胞溶质的在中部的微黄色C-胶清。
诊断针对NRL的I型变态反应的第一步是记录针对NRL的变态反应症状的全面临床史。第二步，为确定致敏状态进行必需的确证试验。通常使用最多的确证试验是皮肤挑刺试验(skin prick test，SPT)和针对胶乳-特异性IgE抗体的血清试验。因此，标准化的用于SPT的提取物和用于测定IgE的表征良好的变应原混合物是诊断胶乳变态反应的重要前提。
在皮肤检测变应原-特异性IgE抗体是一种引人注目的方法，因为其快速、灵敏且包含在皮肤或个体中临床可见和生物学相关的应答。在1995和1996年，用以加拿大产的未加工的AL为基础的Bencard胶乳试剂进行皮肤挑刺试验。研究者描述了在接受哮喘和变态反应治疗(in an asthma andallergy practice)的住院患者中阳性胶乳皮肤试验应答的发病率(prevalence)达4.2％，并且SPT反应的大小与胶乳-诱发症状的严重性正相关2。在最初的1/11期临床研究阶段，对三种候选胶乳原料-AL、NAL和粉末状胶乳(powdered latex)手套的提取物的相对安全性和诊断准确性进行了测定。因此，由于NAL的稳定性和质量控制的简单性，NAL被描述为在未来发展中最引人注目的候选胶乳3。Ebo等人(J Allergy Clin Immunol.1997 Nov；100(5)：618-23)作了包括SPT在内的IgE抗体检测方法的比较研究。他们使用NAL的提取物(Diagnostic Products Corp)，其显示出68％的灵敏度和100％的特异性。在最后的研究中，针对以Stallergènes(Fresnes，France)的NAL的胶乳C-胶清为基础的SPT试剂对其诊断性能进行了检测4。据报道，诊断灵敏度为93％且特异性为100％。这是当今在欧洲唯一可用的标准化的商品化天然橡胶胶乳提取物。多通道(multicenter)III期临床研究用Investigational Greer试剂(Greer实验室，Lenoir，NC)和以NAL为基础的提取物进行5。在该研究中，诊断灵敏度为95％且特异性为100％。重新分析数据将使Greer NAL SPT试剂的总体灵敏度变为70％-75％6。
而且，可从ALK-Abello(Hrsholm，Denmark)购买另一种用于SPT的提取物，其基于现有NAL的胶乳C-胶清。除了可商业购买的产品，希望进行诊断性皮肤试验的变态反应学家，可从手套中制备他们自己的内部胶乳提取物，特别是在各个国家，例如在美国，没有相应的药物批准机构(如FDA)许可的标准化胶乳皮肤试验试剂。
最常用的体外测定血清中的天然胶乳-特异性IgE的技术是放射变应原吸附测定(RAST)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可购买得到多种放射变应原吸附试验。比较三种体外测定(DPC Microplate Alastat、Pharmacia CAPsystem FEIA、和Hycor HYTECH)对于天然橡胶胶乳-特异性IgE抗体的检测7。当与使用Greer实验胶乳试剂的胶乳皮肤试验比较时，Pharmacia CAPSystem和DPC Alastat显示了97％的诊断特异性和分别为76％或73％的诊断灵敏度。这两种测定将约25％的胶乳-致敏病例错误分类为胶乳-特异性IgE抗体假阴性。在对性能的单独研究中，两种测定显示的诊断灵敏度和特异性与上述研究的灵敏度和特异性是等效的8。HYTECH测定在第一次研究中显示了73％的特异性，当与皮肤试验比较时，表明其产生了27％的假阳性结果7。据推测，在CAP和AlaSTAT测定中诊断灵敏度低的原因，可能与这些测定所用的含变应原试剂中的代表性差(poor-represented)和/或变性的变应原有关6。结论为，对于使用衍生自全天然橡胶胶乳的试剂的测定，其准确性和可靠性依赖于变应原的可用性及其与IgE抗体相比过量存在的摩尔量(presence in molar excess in relation to IgE)。
最广泛使用的RAST试剂盒可能是Pharmacia Diagnostics生产的胶乳RAST k82及其酶联免疫吸附测定(Pharmacia CAP系统)。一种更新的来自Pharmacia Diagnostics的胶乳RAST是基于k82，但用重组的Hev b 5(rHev b5)分子来示踪(spiked)。此外，基于重组的胶乳变应原的RAST是现有的。重组的Hev b1、2、3、6.01、6.02、8、9和11可作为与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白获得，rHev b5无MBP。
在2000年，Yip等人提出，重组的胶乳变应原是临床反应性的，能用标准化方式制备，并能潜在地提供诊断胶乳变态反应的灵敏的和特异的试剂9。然而，重组蛋白质的诊断能力取决于它与天然蛋白质的等效性。使用天然Hev b2所进行的SPT显示，这种变应原是主要胶乳变应原中的一种10。RaulfHeimsoth等人描述，rHev b2的IgE-反应性和天然Hev b2之间的相关性差11。他们观察到对它们的rHev b2几乎没有IgE-反应性。该观察结果可能是由于大肠杆菌(E.coli)产物的错误折叠或由于代表IgE结合表位的Hevb2碳水化合物残基12在大肠杆菌所表达的重组蛋白质中不存在。
迄今为止，the International Union of Immunological Societies承认了13种胶乳变应原。据报道，来自橡胶树的天然橡胶胶乳包含250多种多肽，其中的至少60种显示了IgE结合特性13。因此，用13种重组或纯化的变应原诊断胶乳变态反应是不够的。另外，一些主要的胶乳变应原衍生自B-胶清。然而，衍生自NAL的所有商品化胶乳提取物仅来自胶乳C-胶清。
EP704457描述了称为Hev b IV、Hev b II或Hev b III的变应原蛋白质。WO01/61305描述了胶乳变应原，其选自橡胶延长因子(rubber elongationfactore，REF或Hev b1)、胶粒结合蛋白(Hev b3)、酸性16KD蛋白质(Hev b5)和橡胶蛋白(Hev b6.02)。
新鲜的胶乳含有约1-2％蛋白质并能通过高速离心分离成三个主要级分：(i)白色的上层或胶粒；(ii)水层(C-胶清)，其含有来自胶乳管细胞的胞质；和(iii)底层级分(B-胶清)，其主要由液泡样黄色体组成。
而且，对胶乳变态反应的可商业购买的实验方法的比较，显示了结果的大范围变化，并且接受评价的方法不能与所述I型胶乳变态反应的报导的症状相互关联18。当前可用试验的主要缺点是，现今的多种体外方法是检测对胶乳的IgE敏感性所必需的19。
因此，本发明的根本技术问题是提供诊断和治疗胶乳及其相关变态反应的改良试剂。
通过权利要求表征的实施方案，提供了上述技术问题的解决方案。
特别是，本发明提供了包含天然橡胶胶乳(NRL)的基本上所有天然的人类IgE结合蛋白质的组合物的制备方法，该方法包括通过分级沉淀和/或层析分离，从NRL或其一种或多种提取物制备一种或多种蛋白质级分的步骤。
术语“组合物”在此处是指通常包含衍生自NRL(或其任何提取物或级分)的一种或多种蛋白质级分。
术语“天然橡胶胶乳”意思是从任何天然来源获得的所有橡胶胶乳。已经观察到，在不同来源的原料中，由于起源、生长和成熟条件(气候、季节、土壤)等因素，生胶乳中的蛋白质数量及它们的分子量分布是很不同的14，15。然而，在从巴西橡胶树的特殊纯系(例如Hevea brasiliensis Rubber ResearchInstitute的Malaysia纯系RRIM 600)收集NRL的情况下，通过标准化的制备方法，蛋白质含量和特异性是相同的和可再现的16。因此，优选NRL来自巴西橡胶树(H.brasiliens)。优选NRL是非氨化胶乳(NAL)。
术语“天然橡胶胶乳的天然人类IgE结合蛋白质”意思是，在NRL中存在的所有蛋白质，能够充当人类变应原，并因此对胶乳变态反应或至少对致敏作用起作用。本发明的一个重要方面是，通过在此处描述的方法获得的组合物，包含可能存在于天然橡胶胶乳中的所有天然变应原。因此，该组合物不仅包含单一变应原而且包含在天然胶乳橡胶存在的所有变应原。
“NRL提取物”的表述包含衍生自NRL的任何级分或改良的溶液或悬浮液或乳剂，只要所述提取物含有根据上述定义的所有天然的胶乳变应原。
通过离心，优选高速离心获得特别优选的NRL提取物，特别是NAL，其产生上述级分(i)胶粒的白色乳脂层，(ii)B-胶清(底部)和(iii)在(i)与(ii)之间的C-胶清。根据本发明的目的，优选的NAL提取物是B-胶清和C-胶清。
在本发明的一个实施方案中，分级分离通过标准制备方法收集的不同批的NRL，产生组分非常相似的蛋白质提取物。
因此，根据本发明的方法优选包含如下步骤
(a)通过分级沉淀制备NRL或其提取物的一种或多种蛋白质级分和
(b)对在步骤(a)中获得的蛋白质级分进行层析分离。
术语“分级沉淀”意思是，通过溶剂中pH、离子强度和温度的扰动来沉淀蛋白质。优选通过常用的离心步骤来回收沉淀物。也可通过加入高浓度的某种盐或某种易混合的有机溶剂来改良溶剂的特性。在比等渗生理盐水离子强度低的溶液中的盐可代表会使某些蛋白质从溶液中沉淀的扰动。另一方面，以很高浓度和比组织培养基高很多的离子强度存在的盐，可能会使很多蛋白质沉淀。通过用盐使表面电荷中和，通过降低蛋白质的化学活性，并通过降低水的有效浓度，而发生沉淀。这称为蛋白质的“盐析”。使具体蛋白质沉淀所必需的任何盐的浓度，与电荷被中和时蛋白质表面上电荷和非离子极基团的数量和分布、以及暴露并占优势的疏水残基的数量和分布相关。蛋白质的大小和形状也可使可沉淀性相对变容易。硫酸铵是在蛋白质盐析中最常使用的沉淀剂。其主要优点是(1)在饱和状态，它的摩尔浓度足够高，因而能使大多数蛋白质沉淀；(2)它不会使溶液产生大量的热量；(3)即使是它的饱和溶液，密度也不会大到会妨碍通过离心使大多数被沉淀的蛋白质沉积；(4)它的浓缩溶液能预防或限制大多数细菌生长；和(5)在溶液中它保护大多数蛋白质不发生变性。
因此，作为本发明的一部分，在第一步中，通过不同浓度的硫酸铵来分级分离胶乳C-或B-胶清的蛋白质。
本发明的优选实施方案中，作为第二步，进一步通过离子交换层析分离级分的蛋白质。
因此，本发明的方法优选包含以下步骤：
(i)通过分级沉淀制备NAL C-胶清的一种或多种蛋白质级分；
(ii)对在步骤(a)中获得的一种或多种蛋白质级分进行层析分离；和
(iii)对NAL B-胶清进行层析分离。
层析分离可包括离子交换层析、大小排阻层析、疏水层析和/或通过亲和层析，优选使用胶乳变应原-特异性免疫球蛋白。
离子交换层析(IEC)是本发明优选的层析技术。IEC特定为分离离子的或可离子化的化合物而设计。IEC与其它类型的液相色谱的不同在于，固定相携带通过化学键合固定到固定相的可离子化的功能基团。为了满足电中性的需求，这些固定的电荷将携带异号(opposite sign)的反离子。此反离子没有固定因此可被置换。在IEC中涉及两种分开的活动。其一是蛋白质结合到固定电荷，其二是通过对固定电荷具有比所述蛋白质更强亲合力的新的反离子从固定电荷洗脱或置换所述蛋白质。优选，阴离子交换层析用于通过层析来分离NRL提取物或其蛋白质级分，例如NAL，NAL C-或B-胶清，或通过分级沉淀、优选使用硫酸铵盐析NRL(例如NAL)、NAL B-或C-胶清而获得的沉淀物。
在优选的方案中，使用MonoBeads(Pharmacia，Uppsala，Sweden)作为离子介质，其基于10μm连珠状的亲水聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂。优选地，用季胺基取代Beads产生强的阴离子交换剂MonoQ。MonoBeads基质的稳定性与受控合成和柱填充方法一起确保了随着时间和在柱与柱之间可实现十分有再现性的分离。
当然其他的层析树脂，特别是离子交换树脂，也是适合的。例子包括琼脂糖(Agarose)、琼脂糖凝胶(Sepharose)、葡聚糖凝胶(Sephadex)、聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)、葡聚糖纤维素(Sephacel)。
优选的阴离子交换层析的实施方案，例如在MonoQ上的实施方案，是在pH7至7.8，优选pH7.3至7.6，特别是pH7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM Tris-HCl的缓冲剂中，用0至1M NaCl的线性洗脱梯度进行的。当然，可能使用其它梯度形式(例如，等级梯度)或线性和等级梯度的联合，其它缓冲液(例如磷酸缓冲液)和洗脱盐类(例如KCl)。
正如上面已表述的，分级沉淀通过改变NRL或其提取物的pH和/或离子强度和/或通过加入变性剂和/或盐来进行。加入盐类作分级沉淀是最优选的。适当的盐类包括硫酸铵、NaCl和/或Na2SO4。换句话说，可以使用有机溶剂例如乙醇或丙酮(而不是盐类)。参考对蛋白质沉淀的上述讨论，硫酸铵是本发明所用的最优选的盐。
根据本发明方法的更优选的实施方案，分级沉淀通过以下步骤进行
(1)向NRL或其提取物中加入硫酸铵至浓度为15-35％，优选20-30％，更优选22-28％，特别是25％的饱和度；
(2)通过离心回收第一沉淀物和第一上清液；
(3)向第一上清液中加入硫酸铵到浓度为40-60％，优选45-55％，更优选47-53％，特别是50％的饱和度；
(4)通过离心回收第二沉淀物和第二上清液；
(5)向第二上清液中加入硫酸铵到浓度为65-85％，优选70-80％，更优选72-78％，特别是75％的饱和度；和
(6)通过离心回收第三沉淀物和第三上清液。
在这种情况下，优选的NRL提取物是NAL C-胶清。然而，上述的分级沉淀可用于任何NRL(例如NAL)或任何其它衍生自NRL的提取物。
重要的是，包含天然橡胶胶乳(NRL)的基本上所有天然的人类IgE结合蛋白的组合物，包含所有相关变应原。因此，通过纯化方法获得的不同级分优选用从显示出对胶乳的变态反应的患者获得的血清来检测其中变应原的存在。
在本发明的优选实施方案中，通过分级沉淀和/或层析分离获得的单一级分与来自胶乳变态反应性受试者的血清反应。例如可用SDS-PAGE来分离单一级分，硝化纤维素-印迹的级分可以与从胶乳变态反应性受试者获得的血清库或与胶乳变态反应性受试者的个体血清保温。IgE抗体用标记了本领域技术人员众所周知的放射性成分或酶或染料的抗IgE的抗体(优选从动物获得)来鉴定。此外，在分离胶上提供对照区带。通过这种方法，可鉴定所有那些包含天然橡胶胶乳的可与人类IgE抗体结合的天然存在蛋白质的级分。IgE抗体包含从胶乳变态反应性受试者或从实验动物获得的血清。
通过使用由胶乳变态反应性患者获得的一些个体血清，可以鉴定所有那些包含最大含量的那些与变态反应性患者IgE抗体最佳结合的蛋白质的级分。通过选择合适的级分，可选择出那些与变态反应性患者IgE抗体结合最好的蛋白质与那些IgE抗体不结合的蛋白质的最适比例。
通过纯化方法的组合，特别是分级沉淀和/或层析法和监测通过纯化方法获得的成分，可获得包含天然胶乳橡胶的与人类IgE结合的所有蛋白质的组合物。该组合物的优点是其中包含所有可能的变应原。
作为最后的步骤，可通过将通过分级沉淀和/或层析获得的不同蛋白质级分组合，来产生包含所有胶乳变应原的单一组合物，所述胶乳变应原的浓度足以检测变应原特异性IgE抗体。
特别是，通过上述定义方法获得的成分包含较高浓度的NRL的变应原蛋白质作为原料(NRL本身或其提取物例如NAL B-或C-胶清)。反之，基本包括了未与IgE抗体结合的那些组分的连接(connection of suchcomponents to IgE antibodyies do not bind)。
本发明的方法提供了蛋白质组合物，其能成功地用于优选针对胶乳致敏或变态反应的体外诊断和/或治疗、或诊断性和/或药物组合物(药剂)的制备。
因此，本发明的进一步实施方案涉及组合物，其包含通过上述定义的方法获得的天然橡胶胶乳(NRL)的基本上所有天然的人类IgE结合蛋白质。
所述组合物优选含有蛋白质级分，通过以下制备
(A)通过分级沉淀制备NAL C-胶清的蛋白质级分；
(B)对在步骤(A)获得的蛋白质级分进行阴离子交换层析；和
(C)对NAL B-胶清进行阴离子交换层析。
在这方面，具体参照关于本发明方法如上说明的解释和优选实施方案。
更优选地，分级沉淀包含以下步骤
(1)向NAL C-胶清中加入硫酸铵至浓度为15-35％，优选20-30％，更优选22-28％，特别是25％的饱和度；
(2)通过离心回收第一沉淀物和第一上清液；
(3)向第一上清液中加入硫酸铵至浓度为40-60％，优选45-55％，更优选47-53％，特别是50％的饱和度；
(4)通过离心回收第二沉淀物和第二上清液；
(5)向第二上清液中加入硫酸铵至浓度为65-85％，优选70-80％，更优选72-78％，特别是75％的饱和度；和
(6)通过离心回收第三沉淀物和第三上清液。
在一个更优选的实施方案中，组合物包含以下蛋白质级分(或组合物由以下蛋白质级分来代表)：
-通过第二沉淀物的阴离子交换层析，在pH7至7.8，优选pH7.3至7.6，特别是pH7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用120至230mM，优选140至210mM，特别是150至200mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；
-通过第二沉淀物的阴离子交换层析，在pH7至7.8，优选pH7.3至7.6，特别是pH7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用270至530mM，优选290至510mM，特别是300至500mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；
-通过第三沉淀物的阴离子交换层析，在pH7至7.8，优选pH7.3至7.6，特别是pH7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用270至480mM，优选290至460mM，特别是300至450mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；
-通过第三沉淀物的阴离子交换层析，在pH7至7.8，优选pH7.3至7.6，特别是pH7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用420至580mM，优选440至560mM，特别是450至550mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级级分；
-通过NAL B-胶清的阴离子交换层析，在pH7至7.8，优选pH7.3至7.6，特别是pH7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用120至280mM，优选140至260mM，特别是150至250mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；和
-通过NAL B-胶清的阴离子交换层析，在pH7至7.8，优选pH7.3至7.6，特别是pH7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，作为非吸附性流动相洗脱获得的蛋白质级分。
根据本发明的进一步的实施方案，组合物或蛋白质级分固定在固体载体上来产生相应的载体-蛋白质偶联物。
在本发明的载体-蛋白质偶联物中，优选将组合物包覆或偶联到载体上。载体可选自珠子、膜、浸渍片(dipstick)或玻璃芯片。本发明的偶联物特别可用于诊断性应用，例如对人类的胶乳变态反应或致敏的检测。
因此，本发明还涉及诊断试剂盒，其包含上述定义的组合物和/或偶联物，以及用于检测人类IgE抗体的通常使用的试剂或工具。
本发明的诊断试剂盒可用所有公知的用于检测人类IgE抗体的形式存在。实施例包括但不限于体内试验例如皮肤挑刺试验，其测定对于在患者皮肤的部分中存在的蛋白质的变态反应，或体外试验例如ImmunoCAP测定、RAST测定、ELISA、浸渍片、组胺释放等，其测定抗胶乳蛋白质的IgE抗体在被测患者的血清中的存在。
诊断试剂盒特别可用于对于(胶乳)变应原-特异性IgE(特别是在人类)的检测。
因此，本发明进一步提供了检测(胶乳)变应原-特异性IgE(例如在人类)的诊断方法，其包括使本发明的组合物和/或偶联物接触体液(例如，血或其中级分例如血清)的步骤。与体液接触也包括皮下或皮内注射本发明的组合物，例如通过皮肤挑刺试验(SPT)。根据本发明的诊断方法也能用immunoCAP测定、RAST测定、ELISA等进行。
通过本发明的方法提供的试剂，特别是组合物，可用作药剂(或用于其制备)。优选本发明的组合物可用于预防或治疗胶乳变态反应或胶乳-水果综合征(或用于制备针对所述适应症的药剂)。药剂或药物组合物可包含通常使用的可药用的一种或多种载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明也涉及预防或治疗上述适应症的方法，包括给人类患者，特别是患有胶乳变态反应或致敏和/或水果变态反应的人类患者，施用本发明的组合物或药剂的步骤。优选的施用方法包括经肌内途径来注射或例如经舌下途径来粘膜应用。本发明的预防/治疗方法优选以低致敏方案的形式进行。该方案可包括在一段时间内施用浓度增加的变应原提取物。
本发明的优点是，可使用相当少量的Hevea胶乳级分来进行全面的诊断。本申请详细描述了这些级分的制备。此外相对，通常使用总提取物来进行商品化的胶乳变态反应的诊断。
附图说明：
图1显示了从胶乳C-胶清获得的四种级分的SDS-PAGE。使用不同的两批胶乳C-胶清并比较蛋白质含量。
图2显示了5个血清库的IgE反应性，其由胶乳变态反应性受试者的5份血清对如下的各自的反应性组成：a)胶乳C-胶清和四个胶乳C级分，和b)胶乳B-胶清和两个胶乳B级分。将硝化纤维素-印迹的级分与血清库保温并用125I-标记的抗人类IgE的抗体检测结合的IgE(区带1至5)。区带P和N显示了缓冲液对照和对照血清库。分子量标记见图示。
图3显示了在胶乳提取物中Hev b5、Hev b6和Hev b8的存在。将硝化纤维素-印迹的rHev b5、rHev b6、和rHev b8与血清库保温，每个血清库都包括对各自变应原有变态反应的受试者的三份血清。将针对Hev b5的血清库与C3级分预先保温，将Hev b6血清库与B2级分预先保温，并将Hev b8血清库与C1级分预先保温。用125I-标记的抗人类IgE的抗体检测结合的IgE(区带1至5)。区带P和N显示了缓冲液对照和对照血清库。分子量标记见图示。
本发明用下面的非限制性实施例进一步进行说明。
实施例1：胶乳级分的产生
胶乳的B-和C-胶清
收集来自橡胶树(巴西橡胶树，纯系RRIM600)的新鲜Hevea胶乳于冷冻的容器中。在4℃以44,000g离心胶乳1小时，来将其分离成三种主要级分：包含胶粒的顶层级分，水相的C-胶清，和包含黄色体的“重的”底层级分。重复收集和离心水相。冷冻干燥澄清的水性C-胶清并在-20℃储存。在0.4 mol/L甘露醇中重新悬浮包含黄色体的底层级分，重新沉积并重复交替冻融来破裂黄色体。然后通过离心回收黄色体的流体B-胶清17。
通过硫酸铵分级胶乳C-胶清
将一百毫克冻干的胶乳C-胶清溶解于20mM Tris/HCl，pH7.5中。加入(NH4)2SO4达25％的饱和度并在4℃搅拌30分钟。在4℃以12,000g离心沉淀物质20分钟。然后通过加入(NH4)2SO4达50％饱和度来沉淀上清液中的蛋白质。通过离心来回收沉淀的蛋白质并向上清液加入(NH4)2SO4达75％的饱和度。再次离心溶液，将来自三次沉淀步骤的蛋白质在-20℃储存。
阴离子交换层析
将来自硫酸铵分级分离的沉淀物溶解于20mM Tris/HCl，pH7.5，并通过PD-10柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)除去盐分。将每种级分应用于MonoQ HR5/5柱(Pharmacia)中。以相同的方式将一百毫克冻干的胶乳B-胶清溶解于20mM Tris/HCl，pH7.5中，并应用于MonoQ HR5/5柱中。用相同的缓冲液将未吸收的蛋白质从柱中洗脱，在20mM Tris/HCl，pH7.5中使用0-1M NaCl的线性梯度洗脱吸收的蛋白质。
将在不同NaCl浓度洗脱的峰组集中为C1-C4级分。级分C1包含用50-200mM NaCl洗脱的蛋白质，级分C2蛋白质包含用300-500mM NaCl洗脱的蛋白质，这两种级分都衍生自50％(NH4)2SO4的沉淀物。级分C3包含用300-450mM NaCl洗脱的蛋白质，C4包含用450-550mM NaCl洗脱的蛋白质，这两种级分都衍生自75％(NH4)2SO4的沉淀物。用不同的两批胶乳C-胶清进行全部操作。通过12％PAGE分离5μg的每种级分，并用考马斯亮蓝染色(图1)。蛋白质的带型显示非常相似，只在某些蛋白质的浓度(图1，区带1和2)有小差别。
将胶乳B-胶清直接进行离子交换层析产生两种级分。级分B1包含未吸收的蛋白质，级分B2蛋白质用150-250mM NaCl洗脱。
实施例2：对胶乳B-和C-胶清的IgE反应性
在12％SDS/PAGE凝胶上分离每条区带十微克的蛋白质提取物或一微克的重组蛋白质，并在硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)上作印迹。把膜剪成条并用封闭缓冲液(40 mM Na2HPO4，7mMNaH2PO4，0.5％BSA，0.05％w/v叠氮化钠，0.5％w/v Tween-20，pH7.5)处理30分钟。然后将所述条与在封闭缓冲液中1∶5稀释的患者血清在4℃保温过夜。在三次洗涤步骤后，将印迹与125I-标记的抗(人类IgE)的Ig(IBL，Hamburg，Germany)保温过夜。在BiomaxTM MS膜(Kodak，New York，USA)上观察与蛋白质结合的患者IgE。用来自7名健康特应性个体的血清库作为阴性对照，它们对房尘螨有高IgE水平，但皮肤挑刺试验为阴性，并且对胶乳的CAP结果为阴性。
观察库1、2和4对胶乳C-胶清中蛋白质的IgE反应性(图2a，印迹C-胶清)。这些血清库对胶乳C-胶清级分，特别对在40-80kDa范围内的蛋白质的IgE反应增加(图2a，印迹C1-C4，区带1、2和4)。血清库3显示了仅对胶乳C-胶清中一种蛋白质的弱IgE反应性(图2a，印迹C-胶清，区带3)，还测量了对胶乳C-胶清级分中至少6种不同蛋白质的IgE反应。不能测量出血清库5对胶乳C-胶清中蛋白质的IgE反应(图2a，印迹C-胶清，区带5)，但血清库5识别了胶乳C-胶清级分中至少4种蛋白质(图2a，印迹C1-C4，区带5)。7名房尘螨变应性受试者的血清库和缓冲液对照未显示对胶乳C-胶清及其任何级分的IgE反应性(图2a，印迹C-胶清和C1-C4，区带N和P)。
对胶乳B-胶清中蛋白质的IgE反应可用血清库1、2、3和4测量(图2b，印迹B-胶清，区带1-4)。用这些血清库，没有检测到对胶乳B-胶清级分的IgE反应性蛋白质的总数有明显增加，但是更高浓度的一些蛋白质，特别是在33-35 kDa范围内的蛋白质是可测量的(图2b，印迹B1和B2，区带1-4)。血清库5未显示对胶乳B-胶清的IgE反应性，然而可观察到级分B1中大约33 kDa的蛋白质带(图2b，印迹B-胶清，B1，和B2，区带5)。7名房尘螨变态反应性受试者的血清库和缓冲液对照未显示对胶乳B-胶清及其任何级分的IgE反应性(图2b，印迹B-胶清和B1，和B2，区带N和P)。
实施例3：重要胶乳变应原的存在
本发明的胶乳级分包含重要的胶乳变应原Hev b5、Hev b6和Hev b8。用12％PAGE分离重组的Hev b5、Hev b6和Hev b8并印迹到硝酸纤维素上。将膜条与血清库保温，每个库由经测试显示出对各个变应原的IgE的三份血清组成。为作抑制实验，将血清与50μg蛋白质提取物预先保温。为作抑制，将Hev b5血清库与级分C3预先保温，将Hev b6血清库与级分B2预先保温，将Hev b8血清库与级分C1预先保温。将所述血清库与所述级分预先保温会使结合重组变应原的IgE减少或完全耗尽(图3)。
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Claims (29)
1.包含天然橡胶胶乳(NRL)的基本上所有天然的人类IgE结合蛋白质的组合物的制备方法，该方法包括通过分级沉淀和/或层析分离由NRL或其一种或多种提取物制备一种或多种蛋白质级分的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤
(a)通过分级沉淀制备NRL或其提取物的一种或多种蛋白质级分，和
(b)对在步骤(a)中获得的蛋白质级分进行层析分离。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中用含有可与天然橡胶胶乳的蛋白质结合的IgE抗体的至少一种血清，检测通过分级沉淀和/或层析分离获得的NRL的至少一种级分中与IgE抗体结合的蛋白质的存在或缺无。
4.根据权利要求3所述的方法，其中通过分级沉淀和/或层析分离获得的NRL的级分进一步通过分析方法，特别是SDS-PAGE来分离，被分析分离的蛋白质与从胶乳变态反应性的患者获得的至少一种血清发生反应，检测结合的IgE抗体。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述NRL来自巴西橡胶树。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中NRL是非氨化胶乳(NAL)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过离心获得NAL的提取物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述NAL的提取物是C-胶清和/或B-胶清。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括如下步骤：
(i)通过分级沉淀制备NAL C-胶清的一种或多种蛋白质级分；
(ii)对在步骤(a)中获得的一种或多种蛋白质级分进行层析分离；和
(iii)对NAL B-胶清进行层析分离。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中分级沉淀通过改变NRL或其提取物的pH和/或离子强度和/或通过加入变性剂和/或盐来进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过加入盐或有机溶剂进行分级沉淀。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述盐选自硫酸铵、NaCl或Na2SO4。
13.根据权利要求12所述的方法，其中通过以下步骤进行分级沉淀
(1)向NRL或其提取物中加入硫酸铵至浓度为15-35％，优选20-30％，更优选22-28％，特别是25％的饱和度；
(2)通过离心回收第一沉淀物和第一上清液；
(3)向第一上清液中加入硫酸铵到浓度为40-60％，优选45-55％，更优选47-53％，特别是50％的饱和度；
(4)通过离心回收第二沉淀物和第二上清液；
(5)向第二上清液中加入硫酸铵到浓度为65-85％，优选70-80％，更优选72-78％，特别是75％的饱和度；和
(6)通过离心回收第三沉淀物和第三上清液。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述提取物是NAL C-胶清。
15.根据权利要求1至14的任一项所述的方法，其中层析分离包括离子交换层析、大小排阻层析、疏水层析和/或使用胶乳变应原-特异性免疫球蛋白的亲和层析。
16.根据权利要求15所述的方法，其中离子交换层析是阴离子交换层析。
17.根据权利要求16所述的方法，其中用选自MonoQ或DEAE的树脂进行阴离子交换层析。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在pH为7至7.8，优选pH 7.3至7.6，特别是pH 7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl缓冲液中，以0至1M NaCl的线性洗脱梯度进行阴离子交换层析。
19.包含天然橡胶胶乳(NRL)的基本上所有天然的人类IgE结合蛋白质的组合物，其通过根据权利要求1至18任一项所述的方法获得。
20.根据权利要求19所述的组合物，其包含通过如下步骤制备的蛋白质级分
(A)通过分级沉淀制备NAL C-胶清的蛋白质级分；
(B)对步骤(A)中获得的蛋白质级分进行阴离子交换层析；和
(C)对NAL B-胶清进行阴离子交换层析。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述分级沉淀包含以下步骤
(1)向NAL C-胶清中加入硫酸铵到浓度为15-35％，优选20-30％，更优选22-28％，特别是25％的饱和度；
(2)通过离心回收第一沉淀物和第一上清液；
(3)向第一上清液中加入硫酸铵到浓度为40-60％，优选45-55％，更优选47-53％，特别是50％的饱和度；
(4)通过离心回收第二沉淀物和第二上清液；
(5)向第二上清液中加入硫酸铵到浓度为65-85％，优选70-80％，更优选72-78％，特别是75％的饱和度；和
(6)通过离心回收第三沉淀物和第三上清液。
22.根据权利要求21所述的组合物，其包含
-通过第二沉淀物的阴离子交换层析，在pH 7至7.8，优选pH 7.3至7.6，特别是pH 7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用120至230mM，优选140至210mM，特别是150至200mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；
-通过第二沉淀物的阴离子交换层析，在pH 7至7.8，优选pH 7.3至7.6，特别是pH 7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用270至530mM，优选290至510mM，特别是300至500mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；
-通过第三沉淀物的阴离子交换层析，在pH 7至7.8，优选pH 7.3至7.6，特别是pH 7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用270至480mM，优选290至460mM，特别是300至450mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；
-通过第三沉淀物的阴离子交换层析，在pH 7至7.8，优选pH 7.3至7.6，特别是pH 7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用420至580mM，优选440至560mM，特别是450至550mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；
-通过NAL B-胶清的阴离子交换层析，在pH 7至7.8，优选pH 7.3至7.6，特别是pH 7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，用120至280mM，优选140至260mM，特别是150至250mM的NaCl洗脱获得的蛋白质级分；和
-通过NAL B-胶清的阴离子交换层析，在pH 7至7.8，优选pH 7.3至7.6，特别是pH 7.5的10至50mM，优选15至30mM，特别是20mM的Tris-HCl中，作为非吸附性流通物洗脱获得的蛋白质级分。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中在MonoQ或DEAE上进行阴离子交换层析。
24.载体-蛋白质偶联物，其中权利要求19至23任一项所述的组合物固定于固体载体上。
25.根据权利要求24的偶联物，其中所述载体用组合物包覆或与其偶联。
26.根据权利要求24或25的偶联物，其中所述载体选自珠子、膜、浸渍片或玻璃芯片。
27.诊断试剂盒，其包含权利要求19至23任一项所述的组合物和/或权利要求24至26任一项所述的偶联物，以及检测人类IgE抗体通常使用的试剂。
28.根据权利要求19至23任一项所述的组合物在变应原-特异性IgE抗体的体外检测中的用途。
29.根据权利要求19至23任一项所述的组合物在制备预防或治疗胶乳变态反应或胶乳-水果综合征的药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070815 |