DE4005062A1 - Antikoerper gegen biologisch aktive peptide, verfahren zu ihrer gewinnung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft spezifische Antikörper gegen biologisch aktive Peptide und ein Verfahren zu ihrer Gewinnung. Anwen­ dungsgebiete der Erfindung sind die Biotechnologie und die Me­ dizin.

Endogene polypeptidische Faktoren sind wahrscheinlich maßgeb­ lich an der Regulation von Proliferation und Differenzierung tierischer Zellen in vivo beteiligt. Verschiedene, bezüglich ihrer zunächst beobachteten Wirkungen als Wachstumsfaktoren (Stimulatoren der Zellvermehrung) und Wachstumsinhibitoren be­ zeichnete Polypeptide wurden beschrieben (Langen, P. in "Biological Response Modifiers" (Torrence, P. F., Ed., pp 265-291, Academic Press, Orlando. Fl.). Später wurde häufig gefunden, daß diese Regulatoren neben ihren proliferationsbe­ einflussenden Wirkungen eine breitgefächerte multifunktionelle Wirkung, z. B. auf neuronale Prozesse und auf die Funktion von Immunzellen haben (Sporn, M. B. und Roberts, A. B. (1988), Nature 332, 217-219). Z. T. haben diese Regelsubstanzen den Charakter von relativ kleinen Peptiden (Laerum, O. und Paukovits, W. (1984) Differentiation 27, 106-112). Anderer­ seits wurde für höhermolekulare Substanzen gezeigt, daß zumin­ dest Aspekte der Wirkung durch aus der Aminosäuresequenz des natürlichen Polypeptids abgeleitete kleinere Peptide erzielt werden können (Audhya, T., Scheid, M. P. und Goldstein, G. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2847-2849). Antikör­ per gegen synthetische Peptide, die Teilsequenzen von Wachs­ tumsfaktoren entsprechen, werden zunehmend als spezifische Reagenzien in der Forschung und für angewandte Fragestellungen eingesetzt (Bringman, T. S., Lindquist, P. B., Derynck, R. (1987) Cell 48, 429-440).

Die Isolierung eines neuartigen Wachstumshemmstoffes aus lak­ tierender Rindermilchdrüse (Mammary-Derived Growth Inhibitor- MDGI) wird in DD 143 926 und DD 248 960 beschrieben. Dieser Inhibitor ist höchstwahrscheinlich der bisher bestcharakteri­ sierte Vertreter einer neuen Familie von Wachstumsregulatoren (Böhmer, F. D., Kraft, R., Otto, A., Wernstedt, C., Hellman, U., Kurtz, A., Müller, T., Rohde, K., Etzold, G., Lehmann, W., Langen, P., Heldin, C. H. und Grosse, G. (1987) J. Biol. Chem. 262, 15137-15143; Böhmer, F. D., Sun, Q., Pepperle, M., Mül­ ler, T., Eriksson, U., Wang, J. L. und Grosse, R. (1987) Biochem. Biophys. Rest. Comm. 148, 1425-1431). Der Wir­ kungsmechanismus dieser Proteine ist nicht bekannt, ebensowenig, welche Strukturelemente der Proteine essentiell für eine biologische Wirkung sind.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ausgehend von der Struk­ tur eines Proliferationshemmstoffes (MDGI) Antikörper zu ge­ winnen, die gegen biologisch aktive Teilsequenzen des Proteins gerichtet sind. Solche Antikörper dienen der Aufklärung von Wirkungsmechanismen des Inhibitors und verwandter Proteine, so­ wie der Auffindung neuer, nach ähnlichen Prinzipien wirkender Regulatoren.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Aminosäuresequenz des MDGI zu ermitteln, biologisch aktive Peptide zu synthetisieren, die Teilsequenzen des MDGI entsprechen und spezifische Antikörper gegen diese Peptide zu gewinnen.

Die Aminosäuresequenz des polypeptidischen Wachstumshemmstoffes aus Rindermilchdrüse (MDGI) wurde wie folgt ermittelt:

(Die Sequenz ist im 1-Buchstaben-Code angegeben. Mikrohetero­ genitäten sind dadurch gekennzeichnet, daß an den entsprechen­ den Stellen zwei mögliche Aminosäurereste angegeben wurden.)

Die erfindungsgemäßen Antikörper wirken spezifisch gegen bio­ logisch aktive Peptide, die Teilsequenzen dieses Prolifera­ tionshemmstoffes (MDGI) sind. Es handelt sich dabei um folgen­ de Peptide, die nach bekannten chemisch-synthetischen Verfah­ ren gewonnen werden:

• A) EFDETTADDR (identisch, Sequenzsabschnitt 69-78 von MDGI)
• B) TAVCTRVYEKQ (identisch, Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI)
• C] TRVCTRVYEKQ (modifiziert, Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI)
• D) TAVSTRVYEKQ (modifiziert, Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI).

Diese Peptide entfalten biologische Wirkungen, vorzugsweise proliferationshemmende Wirkungen auf in vitro-kultivierte Zellinien wie Mammaepithelzellen sowie desensitisierende Wir­ kungen auf Herzmuskelzellen bezüglich der Wirkung von beta­ adrenergen Effektoren.

Gegen diese Peptide, vorzugsweise Peptid "B", werden spezifi­ sche Antikörper gewonnen. Dazu werden die Peptide durch ein Vernetzungsreagenz, vorzugsweise N-Succinimidyl-Bromacetat (Bernatowicz, M. S. und Matsueda, C. R. (1986) Anal. Biochem. 155, 92-102) an ein Trägermolekül, vorzugsweise Rinderserum­ albumin, gekoppelt. Versuchstiere, vorzugsweise Balb c/Han Mäuse oder Kaninchen werden nach bekannten Verfahren mit den so erhaltenen Konjugaten immunisiert, und Serum wird von diesen Versuchstieren ebenfalls nach bekannten Verfahren gewon­ nen. Die Reaktivität der Seren wird getestet, vorzugsweise mit einem Immunodot-Test unter Immobilisierung der Antigene auf Nitrozellulose. Als Antigene werden dabei untersucht: Freies Peptid, Peptid-Trägerprotein-Konjugat, MDGI. Antiseren, die eine deutliche Reaktivität gegenüber freiem Peptid und MDGI zeigen, werden eine Aufreinigung unterzogen. Zunächst wird die IgG-Fraktion isoliert, vorzugsweise durch fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat. Aus der IgG-Fraktion werden dann die spezifischen Antikörper mittels Affinitäts­ chromatographie an MDGI, vorzugsweise unter Verwendung von Sepharose-gekoppeltem MDGI, isoliert.

Biologische Eigenschaften des Peptides "B"

Das Peptid "B" wurde entsprechend der Sequenz 121-131 von MDGI synthetisiert. Die proliferationshemmende Wirkung wurde in einer Kurzzeitkultur von Ehrlich-Aszites-Mammakarzinomzellen nach einem beschriebenen Verfahren (Böhmer, F. D., Leh­ mann, W., Schmidt, H. E., Langen, P. und Grosse, R. (1984) Exp. Cell. Res. 150, 466-476) gezeigt. Dabei wurde die Ver­ mehrung der Zellen über 24 h in An- und Abwesenheit des Pepti­ des in den angegebenen Konzentrationen sowie verschiedener Ef­ fektoren der Zellproliferation anhand der Bestimmung der Zell­ zahl gemessen.

Die partielle bzw. vollständige Aufhebung der durch Peptid "B" verursachten Hemmung durch Insulin bzw. Cytidindeoxyribosid (CdR) entspricht Spezifitätskriterien, die auch als Charakte­ ristika der Hemmwirkung des natürlichen Wachstumsinhibitors (MDGI) gefunden wurden.

Für den intakten natürlichen Wachstumsinhibitor sowie das ge­ nannte Peptid "B" wurde gezeigt, daß sie die durch Arachidon­ säure ausgelösten Empfindlichkeitssteigerung von neonatalen Rattenherzmuskelzellen gegenüber dem hydrophilen beta1-beta2- adrenergen Agonisten Isoprenalin in einer beschriebenen Ver­ suchsanordnung (Wallukat, G. und Wollenberger, A. (1987) in Pharmacological Aspects of Heart Dessease (R. E. Beamish, V. Panagia, N. S. Dhalla, Eds.), pp. 217-231, Martinus Nÿhoff Publishing, Bosten, Dordrecht, Lancaster) zu hemmen vermögen.

Die Messung erfolgte anhand der durch Isoprenalin ausgelösten Steigerung der Pulsationsrate der Zellen.

Die Zellen wurden für zwei Stunden mit Arachidonsäure (10^-8 M) bzw. Arachidonsäure gleichzeitig mit den angegebenen Peptiden behandelt. Dann wurde Isoprenalin in den angegebenen Konzen­ trationen in die Kulturen gegeben, und die Pulsationsrate wurde nach 5 min bestimmt.

Charakteristika der peptidspezifischen Antikörper

Wesentliches Charakteristikum der beschriebenen peptidspezifi­ schen Antikörper ist, daß sie spezifisch den Wachstumsinhibi­ tor MDGI in entsprechenden Immuntests erkennen.

Dies kann durch Immunnachweis auf Nitrozellulose nach SDS-Gel­ elektrophorese und Elektrotransfer ("Western Blotting") mit gereinigtem MDGI, aber auch mit MDGI-haltigen Gewebsextrakten gezeigt werden (siehe Ausführungsbeispiel). Die Wechselwirkung der Antikörper mit MDGI wird gleichfalls demonstriert durch die Bindung an MDGI-Sepharose im Verlaufe der Aufreinigung.

Die Antikörper wurden erzeugt gegen Peptide, welche die Wir­ kung von MDGI in entsprechenden biologischen Tests simulieren. Es kann daher angenommen werden, daß diese Peptide zumindest Teile der biologisch aktiven Domänen von MDGI darstellen. Die Erkennung von MDGI oder verwandten Proteinen durch die entspre­ chenden Antikörper ist daher nicht nur außerordentlich spezi­ fisch, sondern beinhaltet eine funktionelle Aussage: Es kann angenommen werden, daß Proteine, die mit diesen Antikörpern reagieren, funktionell mit MDGI in Beziehung stehen.

Ausführungsbeispiel

Peptid "B" wurde aufgrund zweier Erwägungen zur Synthese aus­ gewählt:
1. repräsentiert es eine hydrophile Region des MDGI- Moleküls und sollte somit eine Gewinnung von Antikörpern ermög­ lichen,
2. entspricht es einer Region im Molekül, in der nur geringe Homologien mit verwandten Eiweißen vorliegen, und die deshalb für die Ausübung spezifischer Funktionen prädestiniert scheint.

In biologischen Tests erwies sich, wie unter "Biologischer Cha­ rakterisierung" ausgeführt, Peptid "B" als wirksam sowohl hin­ sichtlich einer wachstumshemmenden Wirkung als auch bezüglich einer desensitisierenden Wirkung auf Herzmuskelzellen. Entspre­ chend wurde Peptid "B" ausgewählt für die Erzeugung von Anti­ körpern.

Zu diesem Zweck wurde in folgender Weise ein Peptid-Rinderse­ rumalbumin-Konjugat hergestellt:

• 1. 8 mg Rinderserumalbumin (RSA) wurden in 400 µl 0,1 M KH₂PO₄, pH 7,0, 1 mM EDTA, gelöst und anschließend mit 6,6 µl 0,5 M Jodacetamid (wäßrig, 4,12 mg/50 µl) bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Aktivierung des Trägermole­ küls RSA erfolgte unter Zugabe von N-Succinimidyl-Brom­ acetat (2,1 mg in 32 µl DMF) bei 4°C und langsames Erwär­ men auf Raumtemperatur innerhalb von 30 min. Das so akti­ vierte RSA wurde anschließend durch Gelchromatographie an Sephadex G 25 M (10 ml Säule, equilibriert mit 0,1 M KH₂PO₄, pH 7,0 1 mM EDTA) gereinigt.
• 2. 5 mg Peptid "B" wurden in 400 µl 0,55 M Tris-HCl, pH 7,8 gelöst und durch Behandlung mit 50 µl beta-Mercaptoethanol für 2 min im kochenden Wasserbad reduziert. Die Lösung wurde anschließend rasch auf Raumtemperatur abgekühlt und das Peptid "B" (reduzierte Form) durch Gelchromatographie an einer Sephadex G 10-Säule (7 ml Gelbett, equilibriert mit 0,1 M KH₂PO₄, pH 7,0, 1 mM EDTA) gereinigt.
• 3. Auf die beschriebene Weise aktiviertes RSA (1,5 ml) und in der beschriebenen Weise reduziertes Peptid "B" (1,2 ml) wurden gemischt 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, und das gebildete Konjugat wurde anschließend gegen PBS dialysiert.

Kaninchen wurden im Abstand von zwei Wochen zweimal mit ca. 200 µg dieses Konjugates, emulgiert in komplettem Freund′s Adjuvans, immunisiert. Vier Wochen nach der letzten Immunisie­ rung ließ sich im Immunodot-Test auf Nitrozellulose noch mit dem 100 000fach verdünnten Antiserum eine Reaktion gegen das Konjugat und mit dem 50 000fach verdünnten Antiserum eine Reaktion gegen MDGI nachweisen.

Aus den erhaltenen Antiseren wurde die IgG-Fraktion durch frak­ tionierte Fällung mit Ammoniumsulfat (aufeinanderfolgende Fäl­ lung mit 50%, 40% und 35% der Sättigung) angereichert. Nach ausgedehnter Dialyse gegen PBS wurde IgG-Fraktion auf eine MDGI-Sepharose-Säule (die Säule wurde erhalten durch Kopplung von ca. 2 mg MDGI an CNBr-aktivierte Sepharose CL 6B der Firma Pharmacia entsprechend den Vorschriften des Herstellers) und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Nach Waschung der Säule mit PBS wurden die adsorbierten Antikörper mit 0,1 M Glycin/HCl pH 2,8 und 2,2 in zwei Fraktionen eluiert. Beide Fraktionen binden im Immunodot-Test sowohl das freie Peptid "B" als auch MDGI, letzteres noch in einer Konzentration von 20 ng/ml.

In einem Westernblot-Experiment konnte demonstriert werden, daß der auf diese Art erhaltene anti-"B" Antikörper MDGI spe­ zifisch in einem hochtourigen Überstand aus homogenisierter laktierender Rindermilchdrüse (der Quelle der MDGI-Reinigung) erkennt (Fig. 1, Bahn c, d). Zum Vergleich ist die Reaktion von MDGI mit gegen MDGI erzeugten Antikörpern gezeigt (Bahn a, b). Von den zahlreichen elektrophoretisch getrennten Proteinen des Homogenatüberstandes wird im Immunnachweis nur ein ca. 13 kDa Protein, das mit authentischem MDGI komigriert ange­ färbt (Bahnen a, c). In Gegenwart eines Überschusses von authentischem MDGI in der Inkubationsmischung wird die Reaktion deutlich abgeschwächt (Bahnen b, d).

Fig. 1 Spezifitätsnachweis von affinitätsgereinigten anti-MDGI- und anti-"B"-Antikörpern

Die Proteine in einem hochtourigen Überstand aus laktierender Rindermilchdrüse wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von SDS (12,5% Gel) getrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die entsprechenden Nitrozellulosestreifen wurden durch Inkubation mit Rinderserumalbumin (3%) blockiert und an­ schließend mit anti-MDGI-Antikörper (a, b) oder anti-"B"-Anti­ körpern (c, d), jeweils 2-10 µg/ml, in An- (b, d) oder Abwe­ senheit (a, c) von MDGI (ca. 50 µg/ml) inkubiert. Der Nachweis gebundener Antikörper erfolgte mittels anti-Kanin-alkalischer Phosphatase und einer entsprechenden Farbreaktion.

In einer aus dem gleichen Gewebe erhaltenen Zellkernfraktion erkennt anti-"B" ein hochmolekulares Protein von ca. 70 k (Fig. 2, Bahn f). Zum Vergleich wird die Reaktion mit anti- MDGI-Antikörpern entweder als IgG-Fraktion (Bahn a) oder nach Affinitätsreinigung (Bahn c) bzw. mit gegen Peptid "A" gewon­ nenen Antikörpern (Bahn e) gezeigt. Als Spezifitätskontrolle dient erneut die Aufhebung der Bandenfärbung im Falle der Inkubation mit den entsprechenden Antikörpern in Gegenwart von authentischem MDGI (Bahnen b und d).

Da "B" ein biologisch mit MDGI gleichsinnig wirksames Peptid ist, deutet die Tatsache der Erkennung des 70 k - Kernproteins durch anti-"B" darauf hin, daß eine funktionelle Beziehung zwischen diesem 70 k-Protein und MDGI bzw. "B" besteht. Es ist zu vermuten, daß das 70 k-Kernprotein ähnliche biologische Wirkungen hat wie MDGI.

Fig. 2

Aus dem Homogenat von laktierender Rindermilchdrüse wurde eine Zellkernfraktion isoliert. Die entsprechenden Proteine wurden mittels Polyakrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von SDS aufgetrennt (12,5% Gel) und auf Nitrozellulose transferiert. Der Immunnachweis erfolgte wie in Fig. 1 beschrieben. Bahn a, b: Inkubation mit anti-MDGI-IgG

• Bahn c, c: Inkubation mit affinitätsgereinigtem anti-MDGI- Antikörper
• Bahn a, c: in Abwesenheit, Bahn b, d in Anwesenheit eines Überschusses von MDGI
• Bahn e: Inkubation mit anti-"A"-Antikörpern
• Bahn f: Inkubation mit anti-"B"-Antikörpern

Claims (13)

1. Antikörper gegen biologisch aktive Peptide, die Teilsequenzen des Proliferationshemmstoffes MDGI (Mammary-Derived Growth Inhibitor) sind.

2. Antikörper gegen das Peptid EFDETTADDR.

3. Antikörper gegen das Peptid TAVCTRVYEKQ.

4. Antikörper gegen das Peptid TRVCTRVYEKQ.

5. Antikörper gegen das Peptid TAVSTRVYEKQ.

6. Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern gegen biologisch aktive Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß man Peptide, die identische oder modifizierte Teilsequenzen des Prolifera­ tionshemmstoffes MDGI (Mammary-Derived Growth Inhibitor) sind, durch ein Vernetzungsreagenz an ein Trägermolekül kop­ pelt, Versuchstiere immunisiert, Antiseren gewinnt, die IgG- Fraktion isoliert und die spezifischen Antikörper mittels Affinitätschromatographie an trägergekoppeltem MDGI iso­ liert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peptide die einsetzt, die proliferationshemmende Wirkungen auf in vitro kultivierte Zellen und andere biologische Effekte, wie Desensibilisierung von Herzmuskelzellen gegen­ über der Wirkung von beta-adrenergen Agonisten zeigen.

8. Verfahren nach Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peptid den identischen Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI einsetzt.

9. Verfahren nach Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peptid einen modifizierten Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI - TAVSTRVYEKQ einsetzt.

10. Peptid A, Sequenzabschnitt 69-78 von MDGI, EFDETTADDR.

11. Peptid B, Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI, TAVCTRVYEKQ.

12. Peptid C, modifizierter Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI, TRVCTRVYEKQ.

13. Peptid D, modifizierter Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI, TAVSTRVYEKQ.