DD296086A5 - Verfahren zur gewinnung von antikoerpern gegen biologisch aktive peptide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Antikoerpern gegen biologisch aktive Peptide. Erfindungsgemaesz werden Peptide, die identische oder modifizierte Teilsequenzen des Proliferationshemmstoffes MDGI (Mammary-Derived Growth Inhibitor) sind, durch ein Vernetzungsreagenz an ein Traegermolekuel gekoppelt. Versuchstiere werden damit immunisiert. Antiseren gewonnen und eine IgG-Fraktion wird isoliert. Anschlieszend werden die Antikoerper mittels Affinitaetschromatographie an MDGI isoliert. Anwendungsgebiet sind Biotechnologie und Medizin.{Antikoerpergewinnung; biologisch aktive Peptide; Proliferationshemmstoff MDGI; Affinitaetschromatographie; Biotechnologie}

Description

60 70 80 90 100

NEH

IKTQSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVQVQKWNgQ 110 120 130

T ETSLVREMVDGKLILTLTHGTAVCTRVYEKQ

(Die Sequenz ist im 1-Buchstaben-Code angegeben. Mikroheterogenitäten sind dadurch gekennzeichnet, daß an den entsprechenden Stellen zwei mögliche Aminosäurereste angegeben wurden.)

Nach bekannten chemisch-synthetischen Verfahren Peptide gewonnen, die verschiedenen Abschnitten dieser Sequenz entsprechen, beispielsweise:

A) EFDETTADDR (identisch Sequenzabschnitt 69-78 von MDGI)

B) TAVCTRVYEKQ (identisch Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI)

C) TRVCTRVYELQtmodifiziert.Sequenzabschnitmi-ISI vonMDGI)

D) TAVSTRVYEKQ (modifiziert, Sequenzabschnitt 121-131 von MGDI)

Einige der auf diese Art erhaltene Peptide entfalten biologische Wirkungen, vorzugsweise proliferationshemmende Wirkungen auf in vitro kultivierte Zellinien wie Mammaephithelzellen sowie desensitisierende Wirkungen auf Herzmuskelzellen bezüglich der Wirkung von beta-adrenergen Effektoren.

Gegen diese Peptide, vorzugsweise Peptid „В", werden spezifische Antikörper gewonnen. Dazu werden die Peptide durch ein Vernetzungsreagenz, vorzugsweise N-Succinimidyl-Bromacetat (Bernatowicz, M.S. und Matsueda, CR. [1986] Anal. Biochem. 155, 92-102) an ein Trägermolekül, vorzugsweise Rinderserumalbumin, gekoppelt. Versuchstiere, vorzugsweise BaIb c/Han Mäuse oder Kaninchen werden nach bekannten Verfahren mit den so erhaltenen Konjugaten immunisiert und Serum wird von diesen Versuchstieren ebenfalls nach bekannten Verfahren gewonnen. Die Reaktivität der Seren wird getestet, vorzugsweise mit einem Immunodot-Test unter Immobilisierung der Antigene auf Nitrozellulose. Als Antigene werden dabei untersucht: Freies Peptid, Peptid-Trägerprotein-Konjugat, MDGI.

Antiseren, die eine deutliche Reaktivität gegenüber freiem Peptid und MDGI zeigen, werden einer Aufreinigung unterzogen. Zunächst wird die IgG-Fraktion isoliert, vorzugsweise durch fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat. Aus der IgG-Fraktion werden dann die spezifischen Antikörper mittels Affinitätschromatographie an MDGI, vorzugsweise unter Verwendung von Sepharose-gekoppeltem MDGI, isoliert.

Biologische Eigenschaften des Peptides „В"

Das Peptid „В" wurde entsprechend der Sequenz 121-131 von MDGI synthetisiert. Die proliferationshemmende Wirkung wurde in einer Kurzzeitkultur von Ehrlich-Aszites Mammakarzinomzellen nach einem beschriebenen Verfahren (Boehmer, F.D., Lehmann, W., Schmidt, H. E., Langen, P., und Grosse, R. [1984] Exp. Cell. Res. 150,466-476) gezeigt. Dabei wurde die Vermehrung der Zellen über 24h in An- und Abwesenheit des Peptides in den angegebenen Konzentrationen sowie verschiedener Effektoren der Zellproliferation anhand der Bestimmung der Zellzahl gemessen.

Konzentration des	Hemmung der Zellvermehrung (%)	Zusätze	CdR
Peptides „В"	(Mittelwerte aus mindestens 3 Versuchen)	Insulin	(10"5M)
		(10"9M)	0
	keine	0	0
		0	0
10"8M	17,1	27,0
10"7M	24,4
10"6M	33,3

Die partielle bzw. vollständige Aufhebung der durch Peptid „В" verursachten Hemmung durch Insulin bzw. Cytitindeoxyribosid (CdR) entspricht Spezifitätskriterien, die auch als Charakteristika der Hemmwirkung des natürlichen Wachstumsinhibitors

(MDGI) gefunden wurden.

Für den intakten natürlichen Wachstumsinhibitor sowie das genannte Peptid „В" wurde gezeigt, daß sie die durch

Arachidonsäure ausgelösten Empfindlichkeitssteigerung von neonatalen Rattenherzmuskelzellen gegenüber dem hydrophilen beta-i-beta-2-adrenergenAgonistenlsoprenalin in einer beschriebenen Versuchsanordnung (Wallukat, G. und Wollenberger,A.

[1987] in Pharmacological Aspects of Heart Desease [R. E. Beamish, V. Panagia, N.S.Dhalla, Eds.), pp. 217-231, Martinus Nijhoff Publishing, Boston, Dordrecht, Lancaster) zu hemmen vermögen.

Die Messung erfolgte anhand der durch Isoprenalin ausgelösten Steigerung der Pulsationsrate der Zellen.

Arachidon-	Arachidon-	—	1,6 ±0,9	Arachidon	5,1 ± 0,8
säure	säure	4,2 ± 0,9	säure	15,1+1,0
	10"7M	7,3 ±1,0	4 χ 10"9M	23,8 ±1,4
	Peptid „B"	18,5 ±1,5	MDGI	37,2 ±1,5
14,0 ±0,8	0,0 ±0,8	42,7 ± 3,2	-	46,3 ± 2,4
15,6 ±1,7	63,8 ± 2,4	-	64,6 ±2,1
24,0 ± 0,8
27,6+1,9
38,0 ±1,5
44,4 ± 2,8
49,6 ± 2,0
65,2 ±1,6

Dosis des beta-2-Agonisten Steigerung der Pulsationsrate (%) nach folgenden

Isoprenalin zusätzlichen Behandlungen

Die Zellen wurden für zwei Stunden mit Arachidonsäure (10"⁸M) bzw. Arachidonsäure gleichzeitig mit den angegebenen Peptiden behandelt. Dann wurde Isoprenalin in den angegebenen Konzentrationen in die Kulturen gegeben und die Pulsationsrate wurde nach 5min bestimmt.

Charakteristika der peptidspezifischen Antikörper

Wesentliches Charakteristikum der beschriebenen peptidspezifischen Antikörper ist, daß sie spezifisch den Wachstumsinhibitor MDGI in entsprechenden Immuntests erkennen.

Dies kann durch Immunnachweis auf Nitrozellulose nach SDS-Gelektrophorese und Elektrotransfer („Western Blotting") mit gereinigtem MDGI, aber auch mit MDGI-haltigen Gewebsextrakten gezeigt werden (siehe Anwendungsbeispiel). Die Wechselwirkung der Antikörper mit MDGI wird gleichfalls demonstriert durch die Bindung an MDGI-Sepharose im Verlaufe der Aufreinigung.

Die Antikörper wurden erzeugt gegen Peptide, welche die Wirkung von MDGI in entsprechenden biologischen Tests simulieren.

Es kann daher angenommen werden, daß diese Peptide zumindest Teile der biologisch aktiven Domänen von MDGI darstellen.

Die Erkennung von MDGI oder verwandten Proteinen durch die entsprechenden Antikörper ist daher nicht nur außerordentlich spezifisch, sondern beinhaltet eine funktionell Aussage: Es kann angenommen werden, daß Proteine, die mit diesen Antikörpern reagieren, funktionell mit MDGI in Beziehung stehen.

Anwendungsbeispiel

Peptid „B" wurde aufgrund zweier Erwägungen zur Synthese ausgewählt: 1. repräsentiert es eine hydrophile Region des MDGI-Moleküls, und sollte somit eine Gewinnung von Antikörpern ermöglichen, 2. entspricht es einer Region im Molekül, in der nur geringe Homologien mit verwandten Eiweißen vorliegen, und die deshalb für die Ausübung spezifischer Funktionen prädestiniert scheint.

In biologischen Tests erwies sich, wie unter „Biologischer Charakterisierung" ausgeführt. Peptid „B" als wirksame, sowohl hinsichtlich einer wachstumshemmenden Wirkung, als auch bezüglich einer desensitisierenden Wirkung auf Herzmuskelzellen.

Entsprechend wurde Peptid „B" ausgewählt für die Erzeugung von Antikörpern.

Zu diesem Zweck wurde in folgender Weise ein Peptid-Rinderserumalbumin-Konjugat hergestellt:

1.8mg Rinderserumalbumin (RSA) wurden in 400μΐ 0,1 M KH₂PO₄, pH 7,0,1 mM EDTA, gelöst und anschließend mit 6,6μΙ 0,5 M Jodacetamid (wäßrig, 4,12 mg/50 μΙ) bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Aktivierung des Trägermoleküls RSA erfolgte unter Zugabe von N-Succinimidyl-Bromacetat (2,1 mg in 32 μΙ DMF) bei 4⁰C und langsamem Erwärmen auf Raumtemperatur innerhalb von 30 min. Das so aktivierte RSA wurde anschließend durch Gelchromatographie an Sephadex G 25 M (10 ml Säule, equilibriert mit 0,1 M KH₂PO₄, pH 7,0, im 1 mM EDTA) gereinigt.

2. 5mg Peptid „B" wurden in 400μΙ 0,55M Tris-HCI, pH 7,8 gelöst und durch Behandlung mit 50μΙ beta-Mercaptoethanol für

2 min im kochenden Wasserbad reduziert. Die Lösung wurde anschließend rasch auf Raumtemperatur abgekühlt und das Peptid „B" (reduzierte Form) durch Gelchromatographie an einer Sephadex-G-10-Säule (7ml Gelbett, equilibriert mit 0,1 M KH₂PO₄, pH 7,0,1 mM EDTA) gereinigt.

3. Auf die beschriebene Weise aktiviertes RSA (1,5ml) und in der beschriebenen Weise reduziertes Peptid „B" (1,2ml) wurden gemischt, 2h bei Raumtemperatur inkubiert und das gebildete Konjugat wurde anschließend gegen PBS dialysiert. Kaninchen wurden im Abstand von zwei Wochen zweimal mit ca. 200μg dieses Konjugates, emulgiert in komplettem Freunds Adjuvans, immunisiert. Vier Wochen nach der letzten Immunisierung ließ sich im Immunodot-Test auf Nitrozellulose noch mit dem lOOOOOfach verdünnten Antiserum eine Reaktion gegen das Konjugat und mit dem 50000fach verdünnten Antiserum eine Reaktion gegen MDGI nachweisen.

Aus den erhaltenen Antiseren wurde die IgG-Fraktion durch fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat (aufeinanderfolgende Fällung mit 50%, 40% und 35% der Sättigung) angereichert. Nach ausgedehnter Dialyse gegen PBS wurde die IgG-Fraktion auf eine MDGI-Sepharose-Säule (Die Säule wurde erhalten durch Kopplung von ca. 2 mg MDGI an CNBr-aktivierte Sepharose CL 6 B, der Firma Pharmacia, entsprechend den Vorschriften des Herstellers.) und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Nach Waschung der Säule mit PBS wurden die adsorbierten Antikörper mit 0,1 M Glycin/HCI pH 2,8 und 2,2 in zwei Fraktionen eluiert. Beide Fraktionen binden im Immunodot-Test sowohl das freie Peptid „B" als auch MDGI, letzteres noch in einer Konzentration von 20ng/ml.

In einem Westernblot-Experiment konnte demonstriert werden, daß der auf diese Art erhaltene anti-„B "-Antikörper- MDGI spezifisch in einem hochtourigen Überstand aus homogenisiertem laktierender Rindermilchdrüse (der Quelle der MDGI-Reinigung) erkennt (Abb. 1, Bahne, d). Zum Vergleich ist die Reaktion von MDGI mit gegen MDGI erzeugten Antikörpern gezeigt (Bahn a, b). Von den zahlreichen elektrophoretisch getrennten Proteinen des Homogenatüberstandes wird im Immunnachweis nur ein ca. 13-kDa-Protein, das mit authentischem MDGI komigriert angefärbt (Bahnen a, c). In Gegenwart eines Überschusses von authentischem MDGI in der Inkubationsmischung wird die Reaktion deutlich abgeschwächt (Bahnen b, d).

Abb.1

Spezifitätsnachweis von affinitätsgereinigten anti-MDGI- und anti-„B"-Antikörpem Die Proteine in einem hochtourigen Überstand aus laktierender Rindermilchdrüse wurden durch Polyacrylamidgelektrophorese in Gegenwart von SDS (12,5% Gel) getrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die entsprechenden Nitrozellulosestreifen wurden durch Inkubation mit Rinderserumalbumin (3%) blockiert und anschließend mit anti-MDGI-Antikörpern (a, b) oder anti-„B"-Antikörpern (c, d), jeweils 2-1 Оцд/тІ, in An- (b, d) oder Abwesenheit (a, c) von MDGI (ca. 50 μΙ) inkubiert. Der Nachweis gebundener Antikörper erfolgte mittels anti-Kanin-alkalischer Phosphatase und einer entsprechenden Farbreaktion.

In einer aus dem gleichen Gewebe erhaltenen Zellkernfraktion erkennt anti-„B" ein hochmolekulares Proteirtvon ca. 70k (Abb. 2, Bahn f). Zum Vergleich wird die Reaktion mit anti-MDGI-Antikörpern, entweder als IgG-Fraktion (Bahn a) oder nach Affinitätsreinigung (Bahn c) bzw. mit gegen Peptid „A" gewonnenen Antikörpern (Bahn e) gezeigt. Als Spezifitätskontrolle dient erneut die Aufhebung der Bandenanfärbung im Falle der Inkubation mit den entsprechenden Antikörpern in Gegenwart von authentischem MDGI (Bahnen b und d).

Da „B" ein biologisch mit MDGI gleichsinnig wirksames Peptid ist, deutet die Tatsache der Erkennung des 70-k-Kernproteins durch anti-„B" darauf hin, daß eine funktionell Beziehung zwischen diesem 70-k-Protein und MDGI bzw. „B" besteht. Es ist zu vermuten, daß das 70-k-Kernprotein ähnliche biologische Wirkungen hat, wie MDGI.

Abb. 2

Aus dem Homogenat von laktierender Rindermilchdrüse wurde eine Zellkernfraktion isoliert. Die entsprechenden Proteine wurden mittels Polyakrylamidgelektrophorese in Gegenwart von SDS aufgetrennt (12,5% Gel) und auf Nitrozellulose transferiert. Der Immunnachweis erfolgte wie in Abb. 1 beschrieben. Bahn a, b: Inkubation mit anti-MDGI-lgG Bahn c, c: Inkubation mit affinitätsgereinigtem anti-MDGI-Antikörper

Bahn а, с in Abwesenheit, Bahn b, d in Anwesenheit eines Überschusses von MDGI Bahn e: Inkubation mit anti-„A"-Antikörpern

Bahn f: Inkubation mit anti-„B"-Antikörpern

Claims (4)

1. Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern gegen biologisch aktive Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß man Peptide, die identische oder modifizierte Teilsequenzen des Proliferationshemmstoffes MDGI (Mammary-Derived Growth Inhibitor) sind, durch ein Vernetzungsreagenz an ein Trägermolekül koppelt, Versuchstiere immunisiert, Antiseren gewinnt, die IgG-Fraktion isoliert und die spezifischen Antikörper mittels Affinitätschromatographie an trägergekoppeltem MDGI isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peptide die einsetzt, die proliferationshemmende Wirkungen auf in vitro kultivierte Zellen und andere biologische Effekte, wie Desensibilisierung von Herzmuskelzellen gegenüber der Wirkung von beta-adrenergen Agonisten zeigen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peptid den identischen Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI einsetzt.

4. Verfahrennach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peptid einen modifizierten Sequenzabschnitt 121-131 von MDGI-TAVSTRVYEKQ einsetzt.

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von spezifischen Antikörpern gegen biologisch aktive Peptide. Anwendungsgebiet sind die Biotechnologie und die Medizin.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Endogene polypeptidische Faktoren sind wahrscheinlich maßgeblich an der Regulation von Proliferation und Differenzierung tierischer Zellen in vivo beteiligt. Verschiedene, bezüglich ihrer zunächst beobachteten Wirkungen als Wachstumsfaktoren (Stimulatoren der Zellvermehrung) und Wachstumsinhibitoren bezeichnete. Polypeptide wurden beschrieben (Langen, P. in „Biological Response Modifiers" [Torrence, P. F., Ed., pp 265-291, Academic Press, Orlando. Fl.]). Später wurde häufig gefunden, daß diese Regulatoren neben ihren proliferationsbeeinflussenden Wirkungen eine breitgefächerte multifunktionelle Wirkung, z.B. auf neuronale Prozesse und auf die Funktion von Immunzellen haben (Sporn, M.B. und Roberts, A. B. [1988], Nature 332, 217-219). Zum Teil haben diese Regelsubstanzen den Charakter von relativ kleinen Peptiden (Laerum, O. und Paukovits, W. [1984] Differentiation 27,106-112). Andererseits wurde für höhermolekulare Substanzen gezeigt, daß zumindest Aspekte der Wirkung durch aus der Aminosäuresequenz des natürlichen Polypeptide abgeleitete kleinere Peptide erzielt werden können (Audhya.T., Scheid, M. P. und Goldstein, G. [1984] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81,2847-2849). Antikörper gegen synthetische Peptide, die Teilsequenzen von Wachstumsfaktoren entsprechen, werden zunehmend als spezifische Reagenzien in der Forschung und für angewandte Fragestellungen eingesetzt (Bringman,T.S., Lindquist, P.B., Derynck, R. [1987] Cell 48,429-440).

Die Isolierung eines neuartigen Wachstumshemmstoffes aus laktierender Rindermilchdrüse (Mammary-Derived Growth Inhibitor-MDGI) wurde in der DDR patentrechtlich geschützt (Pat.-Nr. 143926, Pat.-Nr.24896O). Dieser Inhibitor ist höchstwahrscheinlich der bisher bestcharakterisierte Vertreter einer neuen Familie von Wachstumsregulatoren (Boehmer, F.D., Kraft, R., Otto, A., Wernstedt, C, Hellman, U., Kurtz, Α., Mueller, Т., Rohde, К., Etzold, G., Lehmann, W., Langen, P., Heldin, C. H. undGrosse,G.[1987]J.Biol.Chem.262,15137-15143; Boehmer, F.D.,Sun, Q., Pepperle, M., Mueller,Т., Eriksson, U., Wang, J. L., und Grosse, R. [1987] Biochem. Biophys. Res. Comm. 148,1425-1431). Der Wirkungsmechanismus dieser Proteine ist nicht bekannt, ebensowenig, welche Strukturelemente der Proteine essentiell für eine biologische Wirkung sind.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ausgehend von der Struktur eines Proliferationshemmstoffes (MDGI) Antikörper zu gewinnen, die gegen biologisch aktive Teilsequenzen des Proteins gerichtet sind. Solche Antikörper dienen der Aufklärung von Wirkungsmechanismen des Inhibitors und verwandter Proteine, sowie der Auffindung neuer, nach ähnlichen Prinzipien wirkender Regulatoren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß werden basierend auf der wie folgt ermittelten Aminosäuresequenz des polypeptidischen Wachstumshemmstoffes aus Rindermilchdrüse (MDGI):

1 10 20 30 40 50

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