DE1617687A1 - Verfahren zur Abtrennung einer Protein-Globulin-Fraktion mit hohem Gehalt an IgM-Globulin aus Saeugetier-Blut,-Plasma oder -Serum - Google Patents

Verfahren zur Abtrennung einer Protein-Globulin-Fraktion mit hohem Gehalt an IgM-Globulin aus Saeugetier-Blut,-Plasma oder -Serum

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Description

6 Frankfurt am WWn 70 9. Novaib.r
*^27-1·1: GaHa/Pi.
NATIONAL RESEARCH DEVELOPI-äENT CORPORATION
Verfahren zur Abtrennung einer Protein-Globulin-Fraktion mit hohem Gehalt an IgM-Globulin aus Säugetier-Blut, -Plasna oder "Serum
Die vorliegende Erfindung besieht eich auf biologisch aktive Substanzen, insbesondere auf solche, die eine Wirksamkeit
«ie
gegen Colibazillen besitzen« Basillen, die ernste und oft tödliehe Erkrankungen bei neugeborenen Säugetieren, besonders Kälbern und anderen wirtschaftlich wichtigen Tieren verursachen,
Escherichia coli ist einer aus der großen Gruppe von Organ!ssen, die normale Parasiten des Säugetierkörpers, insbesondere der Eingeweide, sind und die unter gewissen Unständen Krankheit verursachen können« Normalerweise sind ia Blut der «eisten erwachsenen gesunden Säugetier· Antikörper vorhanden« die eine natürliche lamunität gegen die Wirkungen der in diesen Arten vorhandenen Organ!säen verleihen; unter gewissen Umstünden, aber besonders, bei Neugeborenen oder alten Individuen» können Jedoch diese schützenden Faktoren fehlen. Solche Mangelerecheinttng kann Much bei Individuen! «die an natürlicher oder künstlicher T— iwiopathle. s.B. Strahlenkrankheit leiden» auf treten«
Ss 1st allgemein üblich» neugeborene Tiere, bei denen a*a clmen Mangel an diesen Antikörperfaktoren autaaOt, durch
BAD OBiGiNAL
tOtiU/2010
von Blut, Plasma oder Seruta Erwachsener dmr gleichen Specie« zu schützen. Jedoch besitzen die verwendeten Produkte den großen Nachteil, daß große Mengen gegeben werden nüssen, weil diese nur einen kleinen Auteil der wirksamen Proteinfraktion gegen Eechorichia coil enthalten. So große Mengen benötigen auch die Anwendung durch einen Tierarzt,und oft ist es nicht nöglich, einen solchen zu der kritischen Zelt (gewöhnlich innerhalb einer Stunde nach der Geburt) verfügbar zu haben.
Versuche sind unternommen worden, um die aktiven Antikörper aus den Serunproteinen zu isolieren» aber die bis jetzt verfügbaren Präparate hatten nur sehr geringen Erfolg. Ss wurde nun gefunden, daß der Hauptgrund für die geringe Hell-Virkung dieser Präparate in den angewandten Sxtraktlonsverfahren liegt» ■ die eine Isolierung einer Fraktion anstrebten und auch erreichten, welche vorwiegend aus Proteinen, dl· unter den verschiedenen Bezeichnungen IgG, 7S Gamsa Globulin, oder Ύ2, bekannt sind, d.h. ans der am wenigsten beweglichen elektrophoretlschen Komponente, bestand. Έ» wurde nun festgestellt, daft die schützenden Antikörper mit der elektrophoretisch beweglicheren Olobulinfraktion, bekannt unter den verschiedenen Bezeichnungen IgM, P2M und 19s Gamma Globulin, hier als 1IgM bezeichnet, verbunden sind. IgM-Prdeine besitzen ein Molekulargewicht über 200.000, meist in der Größenordnung von 900.000.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein pharmazeutisches Präparat zum Schutz von Säugetieren gegen Coli-Infektionen
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erhalten durch leolierung einer Praktion aus Blut, Plasna oder Serum,die einen erhöhten Anteil an IgM=Globulin und eine größere hätaagglutinierende Wirkung für Antigene 09 oder 0?8 gegen Escherichia coil, verglichen Mit des Ausganges» t er la 1 bei gleichen Gewicht, besitzt (Eecherichia coil Serotyp 9 wird auch als E.coli 09K A bezeichnet).
Die Wirksamkeit des Produktes entsprechend der vorliegenden Erfindung wird in Bezug auf seine hämagglut inier ende Wirkung gegen die spezifischen Antigene durch den folgenden Test bestiausti .
Eine Suspension von E.coli Serotyp 09K A (Royal Veterinary College Collection) sit 25 S Bakterien pro 100 ml wird mit der gleichen Menge einer 95 $igen Phenol-, in Wasser -LSsunc; für 30 Minuten bei 68°C erhitzt. Das gekühlte aaaleeh wird 20 Minuten bei 50OO UpM sentrifußiort, die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und Bit des) Fünffachen ihres Voluaens an absolutes Aethanol bei 5°C ausgefällt. Das Präsipitat wird in einer kleinen Menge destillierten Wassers wieder gelöst und Über Nacht gegen destilliertes Hasser bei 5°C dialysiert. Dmx- Rückstand wird Ib Frieren £otr@<sknet. Vor Anwendung wird das Produkt in Wasser bei einer Konsentration von 250 Mikro| per el gelBst und »it der gleichen Menge von 0,02 N-Natrluahydroxyd eine Stunde lang behandelt und dann ait 0,02N-SaIssäure neutralisiert. Die gewonnene Antigen!ttsung wird «ur Sensiblllvon IBkenerythro3Byten, jdie fitr diesen Test angewandt
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werden, verwendet. Gewaschene Erythrozyten werden in Salzlösung (1 Vol# der Zellen) suspendiert und 1Q ml der Suspension eine Stunde bei 37°C mit 0,1 bis 0,3 ml der Antigenlösung (je nach der Stärke der letzteren, durch ein Standardserua eraittelt), bebrütet. Die Zellen werden dann dreiaal alt phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und als eine 1 #ige Suspension in den Puffer für den Test aufbereitet. Die zu prüfende Antikörper IiJ sang; wird serienweise Qit phQsphatgepufferter Salzlösung verdUnnt und aliquote Mengen (0,1 nsl) jeder Verdünnung werden mit dem gleichen Voluven der ZellBUspenslon behandelt und für 30 bis 60 Minuten bei 37°C oder 1 bis 2'Stunden bei Zitnaertenperatur bebrütet. Die Wirksamkeit ist als reziproker Wert der Verdünnung, bei welcher das Ende der Häniagglut Ina tion beobachtet wird, ausgedrückt.
Es wurde gefunden, daß «in Produkt, das den hier später näher erläuterten Gehalt an häwagglutinisrenden Eigenschaften besitzt, parenteral in geeigneten kleinen Mengen des wäßrigen Medluns alt viel größere« Erfolg verabreicht werden kann, als dies «it den bis Jetzt verfügbaren Produkten erzielt wurde. Das nach der vorliegenden Erfindung hergestellte Produkt ist entweder eine Lösung in einen geeigneten wäßrigen Mediua der IgM-Fraktion in solcher Konzentration, daß es eine Wirkung gegen den spezifischen Organismus (E.coli 09) von wenigstens 500 Einheiten/al zeigt, oder ein festes Präparat, das, falls in wäßrige·* Mediua gelöst, um eine Proteinkonzentration von 5 $ (Gew./Vol.) zu geben eine Wirksamkeit von «indestens 500 Einheiten pro al, wie
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im oben beschriebenen Test erläutert, besitzt. Obwohl Schwan- ■ klingen von Charge au Charge bei Serum und Plasma möglich sind, ist im Durchschnitt die Korrelation der hämagglutinierenden Wirkung und des Gewichte der vorhandenen IgM-Fraktion von der Größenordnung von 1 mg IgH/ml, entsprechend 100 Einheiten pro ml an Wirksamkeit gegeben.
Das wirksame oben bezeichnete Produkt enthält daher, entweder in flüssiger Forst als solches oder nach Wiederherstellung in einem flüssigen Medium bei der festgestellten Proteinkonzentration, wenigstens 5 tag/ml an IgM. Vorzugsweise ist das Produkt noch konzentrierter ia Gehalt an IgM1 da es dann is noch kleineren Mengen injiziert werden kann« in der Praxis wird eine awei- oder selbst sehnfache Erhöhung der Konsentration de· Minimalwartes empfohlen. Produkte, die 25 bis 30 mg/ml an IgM enthalten, ergeben sehr ermutigende Ergebnisse bei der Behändlang von Kälbern» .".-."
Die gewünschte Antikörper fraktion kann aus Säuge tierblut, -pla oder -serum durch eine Vielzahl an sich bekannter Methoden gewonnen werden, einschlledlich ZwangsStromelektrophorese, Ionen-' austauechchromatografie, z.B. auf CM-Cellulose oder DEAX-Cellulose, Ultrazentrlfugieren oder durch Präzipitationsmethoden unter Verwendung von Proteinausfällungsmitteln, einscnli«Bllob organischer Lösungsmittel wie Alkohol, Aether und organischen* Salzen wieAKxoniuasulfat. Als Alternative zu diesen Metboden wurde überraschenderweise gefunden, dall die gewünscht· Fraktion
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vorzugsweise nach Verdünnung des Ausgängen» t er ials alt Wasser ausfällt. So wird das Material, wenn Plasma oder vorzugsweise Serum - wegen Abwesenheit τοη Fibrinogen - verwendet wird, mit Wasser bis zu einer mindestens 10-fachen Verdünnung verdünnt und dann für einige Zeit stehen gelassen, während welcher sich ein Präzipitat bildet, des nach Abtrennuni? hauptsächlich au· IgM-Protein besteht» Im allgemeinen werden zumindest IO Vol. Wasser auf 1 Vol. Serum oder Plasma verwendet, aber ein Verhältnis von 10 zu 2O Vol. Hasser zu 1 VoI Serum oder Plasma kann vorteilhaft sein, je nach dem abzutrennenden Proteinbereich Für die Verdünnung wird vorzugsweise destilliertes Wasser verwen det, aber man kann auch gewöhnliches Wasser nehmen, de« ein Bakteriostat, wie Merthiolat oder Phenol, zugesetzt wurde.
Die Lagerungezeit hängt ab von Ionenstärke, Reaktion und Leitfähigkeit des verwendeten Wassers und der Lager tempera tür. Wenn destilliertes Wasser alt einem pH von 6,98 und alt außerordentlich niedriger Leitfähigkeit bei einer Temperatur von k C verwendet wird, beträgt die Logerungszeit ca. k8 Stunden, jedoch wurde bei Abänderung der Bedingungen gefunden, daß die ideale Lagerungszeit zwischen 2 bis 72 Stunden schwanken kann. Das Präsipitat wird in einem Bruchteil der Idealzelt gebildet. Der Rest der Lagerungszeit wird für die Aggregation der ausgefällten Teilchen zu Hassen von größerem Umfang benötigt,, ein Faktor, der die Leichtigkeit der Gewinnung des Produktes wesentlich beeinflußt. Hierbei ist die Art der Abtrennung des Nieder« schlag· ebenfalls wichtig, da bei Verwendung einer Hochleietuag·-
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centrifuge die Lagerunesdauer geringer «ein darf «le die, welche bei Verwendung einer Präparatesentrifug«, die veniger Sediaentationskrüfte entwickelt« benötigt wird."
Es wurde die Beobachtung gemacht, daß die selektive Ausfällung der gewünschten Antikßrperfraktion durch die beschriebene Verdünnungsmethode beträchtliche Verteile bietet bei Anwendung ' dieser Erfindung in große» Maßstab, in Hinblick auf die Einfachheit der Method« und ihr« leichte Anwendung bei großen Mengen an Ausgange jSrodukt.
Die so gewonnene IgM-Praktion liegt in Fons eines Buglobulins vor, dae wieder geltet werden kann in einer alJtarieeh gepufferten Salslttstmg, ue ein» Proteinlösen* «it einer 5 bie 13 £ Proteinkonsentratlon, d.h. ea\ to £> *» ergaben; dieee LSeuag kann so viel wie 32.000 HäBaggltttinatioas-Sinheiten pro »1 der gewUnechten XgM-fraktion enthalten.
Die IgM-FreJction kann a'ls trockene« Pulver oder in gelöster Fora, fertig aur prophvlaktlsohen oder therapeutischen Anwendung gelagert werden. Den wäßrigen Lo*atmgei& ?5@r igM-Fraktion «ur parenteralen Anwendungen kennen, falls gewünscht, andere Subetanaen, B.B· Konservierungeuittel, sugeeetat warden. '
Die Erfindung kann bei Serunproteinen von virtachaftllch wichtigen Tieren, vie Kälbern, Schweinen und Schafen, ebenso wie ■ bei Proteinen menschlicher Herkunft angewandt werden.
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Dae erhaltene Produkt kann parenteral bei jungen Säugetieren vorteilhaft auf intravenösem oder intramuskuläre» Weg applisiert werden. Die notwendige Dosierung hängt ab von dem gewählten Weg, und für Kälber wurde eine Einheitsdosis von «indestens 50.000 bis 35.000 Einheiten an Hämoagglutinationawirkung für die besten Ergebnisse bei intervenöser Applikation benötigt, während die zwei« oder vorzugsweise vierfache Menge dieser Dosis bei intramuskulärer Injektion empfohlen wird. Gewöhnlich gentigt eine einmalige Dosis, üb das Tier über die kritischen ersten Wochen nach der Geburt hinweg zu bringen, aber eine sätzliche Dosis kann manchmal, besonders bei Schweinen, notwendig verden. Bei ernsthafter Bedrohung durch oral« Infektion mit pathogenen E.coll-Stäaaen führten Versuche «it diese« Produkt, das nach diesen Methoden hergestellt wurde, su Ergebnissen alt sehr bemerkenswerte« Erfolg.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele erläutert1
Beispiel 1»
a) 0,5 1 Rinderserum «it 32,000 gegen E.coil 09-Antigen wirksamen Einheiten werden alt 7,0 1 destillierte« Wasser bei 4°C verdünnt. Nach 48 Stunden Lagerung bei k°C wird das PrIl-. Bipitat durch Zentrifugieren bei einer Geschwindigkeit von 3OOO UpM in einer Ko-rb-Eentrifuge abgetrennt, wobei ein nicht perforierter Korb mit Quadrantflügeln verwendet wird. Der eeditaentierte Niederschlag wird «it destillierte« Wasser ge-
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und wieder gelöst iqelner mit Phosphatpuffer auf pH 7,85 gepufferten 0,85 $igen Natriuuchloridlttaung. Das Endvolumen der Proteinlösung beträgt 50 ml mit 4,8 % Proteingehalt. Das so gewonnene Produkt wurde mit 28.500 Hamagglutinetions-Elnheiten (d.h. 570 Einheiten per ml) eingestellt..
b) Das in a) beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß nach dreistündiger Lagerung das Präaipitat durch Zentrifugieren in einer Hochleitungszentrifuge bei 18.000 VpV gewonnen wurde. Die Gewinnung des aktiven Materials ist genau die gleiche wie in a) beschrieben, aber die Proteinnass egewinnung ist deutlich geringer als 2,t g.
Beispiel 2:
0,5 1 Rlnderplasma vom Schlachthaus werden mit einem sauren Citratdex.trose-Konservierungsmittel versetzt, und durch Zufügung von 6,5 1 «destillierten Wassere verdünnt. Nach 24-stündiger Lagerung bei k°C wird das verdünnte Plasma in einer Korb« centrifuge bei' 3000 OpM zentrifugiert und der so erhaltene Niederschlag in einer O,85 %lgen Natriumchloridlösung, der genügend Natrium-Ammonlumphosphat but Erxieluag eines End-pH. von 7»5 augegeben wurde, wieder gelöst.
Wirksamkeit des
ursprünglichen Plasmas (Titer I %
Volumen der wiede^gelöstec Lösung . « i»0 mI bei
2.5 «/100 «1.
Die Bndlösutfg enthält Gammaglobulin, eine kleine Menge Albumin und ca. 8 $ Fibrinogen. Das letztere neigt dazu, bei Lagerung bei -300C, + 4PÖ und +
BÄD ORIGINAL
Beispiel 3:
6,0 1 Menschlichen Plasaas, aus Blut» des «in säur·· Cttratdextroee~Koneervierungs»)ittel zugesetzt wurd·, gewonnen, wurde alt 10 ^ Calcluwchlorid-Lösung bis sub Beginn dar koagulation titriert. Das gekluapte Material wurde 12 Stunden bei *°C stehen gelassen. Nach dar Nlederschlagsperiode wird däa Katarial bai 3000 VpM zentrifugiert und daa ausgefällte Fibrin abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird «it Qk 1 destillierte« Wasser verdünnt und da· verdünnte Produkt nach 6 Stunden Lagarung bai k°C sentrifugiert. Dar so erhaltene Niederschlag wird wieder gelöst in 0,85 $igar Natriuachloridlösung (unter Venrendung ▼on Natriua-Aaaeniuaphosphat auf pH 7,5 eingestellt).
Vlrksaekeit des ursprünglichen » Plasaas (Titer ^j . „ 2kmQQ0 Blnll.it.tt Voluaen der wieder gelösten Lttsung * 65 al von 2,1 g/100 al Gewicht das ausgefällten Proteins If36 g Ti tar der Endlösung (Tit.r _1_} „ ,, 28o Blnn#it.tt.
Die Endlösung enthielt eine Spur Albuain, abar dia gpSBmrm Menge des Proteins bestand ala Ckusaaglobulin.
Beispiel kl
5 1 Rinderplasea (aufbewahrt in eaurea Citrat-Dextroxa-Antikoagulan ) wurden durch einen Asbestfilter gefiltert. pH wurd· •it Milchsäure auf 6,55 eingestellt und dia Leitfähigkeit alt destilliertes} Wasser (57 al) auf I65 Nho/ea eingestallt. Das behandelte Plaesm wurd· dann durch eine Zwangastroa-Elektrophoreseselle geleitet, ait einer Feldstärke von 6,5 Yolt/c«
' 1Ö98 U/'i010 BAo
«wischen dan Elektroden und ein·· Gesamt-Kraftverbrauch von 2«3 Amp. 4,5 1 der Spitzenilaktion werden gewonnen und enthalten 2.8 g Protein per 100 ml. El ektrophoretische Analyse diese· Proteins zeigt, daß es gänzlich aus Gammaglobulin besteht. Eine f einteilige Ausflockung tritt nach 12-etttndiger Lagerung bei k°C auf und wird durch Zentrifugleren gewonnen. Der Niederschlag wird bei Zimmertemperatur In einer Natriumchloridlöeung (alt Natrium-Kaiium-Phosphat und Puffer zu pH 7,2 gepuffert) wieder gelöst. Das Endvolumen tod 6,O al einer Lösung, die 1 g Protein auf 100 ml enthttlt, wird auf diese Weise erhalten. Dies* Lösung enthttlt nur IgM-Proteln.
Die Wirksamkeit dw verschiedenen Substanzen is,t die folgend· t
Original-Plaeoa SpItBenfraktlon EndlOsung
HäsAgglutinations· Titer
32
Gesamtmenge der IgM-
Einheiten
Biologische Wirksamkeit
160.000 36.000
8000
lelepiel 5« - ..
25 1 Sinderblut werden unter Zusatz von 3000 Internationalen Einheiten (i.j.) Na-Heparin in alnen gekühlten Behalter gebracht und durch eine Zwangeatrota-Klektrophoreseselle bis aum Aequivalent von drei vollständigen Umdrehungen zirkuliert. Es wird eine Spltsenfraktion mit 3,2 g Protein pro 100 ml Inhalt bei einem Verh&ltnie von 30 ml/min. (Blut strom betragt 150 ml/min.) gewonnen, wenn der Potentialunterschied innerhalb der Zelle 7,0 V/cm (ver-
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BAD ORIGINAL
brauchter Strom 3,1 Amp.) beträgt. Es wird eine Gesamtmenge ▼on 7,0 1 der Spüzenfraktion gewonnen. Diese enthält verschiedene Proteine, von denen der hervorstechende.Faktor eine GammaglobulinFraktion ist« die 78 $ des gesamten wiedergewonnenen Proteine betrügt.
Die so erhaltene Spitzenfraktion wird mit Zwangestrom-Ilektrophorese, wie in Beispiele h beschrieben, weiter fraktioniert. pH wird auf 6,50 mit Hilfe von Phosphatsalsen und die Leitfähigkeit auf 180 Mho/cm eingestellt, k 1 der Spitsenfraktion werden gewonnen« 12 Stunden bei k°C gelagert und sentrifugiert.
Das so erhaltene Pränipitat wird in 5 ml einer gepufferten SaIs gelöst.
Haaaggluti-
OrlgisMl-Plasna iü Elut
wiedergelöster
Plasaa im Blut nach Behandlung
"verlorenes" IgM
32
Gesa»t«enge der Hanagglutinatione-Kinheiten an IgM Biologische Wirksamkeit
7^8.0OO
160.000
268.000
Beispiel 6ι
8 1 Schweineserum werden mit dem 1*»-fachen Volumen destilliertest
Wasser verdünnt und Zh Stunden bei k°C stehen gelassen· Der Niederschlag wird vermittels einer Korbzentrifuge gewonnen und
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in 50 ml einer phosphatgepufferten Salzlösung wieder gelöst. Gaaamtwirksaiakeit: 48.000 Einheiten.
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Claims (1)

  1. [Belegexemplar
    n»rt nicht dwt *wn»
    Patentansprüche s
    1. Pharoaseutisches Präparat zur Verwendung gegen Coli-Bakterien, bestehend aus einer väßrigen Dispersion von Säugetier~Olobuliri mit einem erhöhten Gehalt an IgM-Globulin, die Je Milliliter mindestens 500 E.coli Serotyp 9 häeagglutinierende Einheiten enthält.
    2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß es einen IgM-Gehalt von mindestens 5 mg/ml enthält.
    3. Pharaaeeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es bis ca 5 Jt Protein enthält.
    h. Kittel zur Heretellung eines pharsaseutischen Präparats
    nach eine« der Ansprüche 1 bis 3» dadurojb cekenaselchziet, , \ daß es Protein,' Oloballn und h«Wgylutlnierende <inheiten "' : in solchen Μβη^βά enthält, dafl es bei« Verdünnen alt VajMec ' «in Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis y «rglbt·
    5. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats nach einen der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel nach Anspruch h alt Wasser verdünnt«
    T088U/2010
    6. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats nach einen der Ansprüche 1 bis 3, oder eines Mittels nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß »an aus den Blut, Blutplasna oder Blutserum von Saugetieren, vorzugsweise von Rindern, eine Globulin-Fraktion «it einen erhöhten Gehalt an IgM-Globulin abtrennt, und den abgetrennten Anteil gegebenenfalls konzentriert.
    7» Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß nan den Ausgangsetoff nlt Wasser verdünnt und den ausgefallenen Anteil abtrennt.
    α Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß nan das Blutplasma oder Blutserum »it 10 bis 20 Volunteilen Wasser verdünnt.
    ο Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß den wirksasen Anteil durch Elektrophorese abtrennt.
    10. Verfahren zun Schütze junger Säugetiere gegen Coli-Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß mam, sä® pharmazeutisches Präparat nach einen der Ansprüche 1 bis 5 parenteral verabreicht oder nit einer Menge von nindestene 35.000 Einheiten Intravenös oder nit einer Menge von Binde»tens 70.000 Einheiten intra* nuskul&r injiziert.
    1098U/201G
DE19671617687 1966-11-15 1967-11-14 Verfahren zur Abtrennung einer Protein-Globulin-Fraktion mit hohem Gehalt an IgM-Globulin aus Saeugetier-Blut,-Plasma oder -Serum Pending DE1617687A1 (de)

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