DE2612015A1

DE2612015A1 - Arzneimittel zur erhoehung der immunologischen abwehr und verfahren zur herstellung von menschlichem serum- praelabium

Info

Publication number: DE2612015A1
Application number: DE19762612015
Authority: DE
Inventors: Pamela M Burton; Abraham White
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1975-03-24
Filing date: 1976-03-20
Publication date: 1976-10-14
Also published as: SE7603556L; ES446334A1; JPS51118822A; AU1230876A; FR2305191A1; FR2305191B1; GB1511602A; IE43573B1; NZ180367A; IE43573L; AU509024B2; NL7603020A; CA1056305A

Description

Arzneimittel zur Erhöhung der immunologischer Abwehr

und Verfahren zur Herstellung von .nenschlichcm Serum-Präarpumin \

Die Thymusdrüse ist als Endocrindrüse bekannt, die eine wesentliche Funktion im immunologischen Abwehrsysteni der Körpers hat. Neuerdings wurde gezeigt, daß rohe Extrakte von Kälberthymusdrüsen eine als Thymosine bezeichnete Familie von Hormonen enthält, die Molekulargewichte zwischen etwa 3200-70 000 Daltons haben. (Vgl. z.B. N. Trainin "Physiological Reviews", Bd. 54, Sei Seite 272 (1974) und A. White "Ann.N.Y. Acad.Sci.", Bd. 29, Seite 253 (1975).

Es wird angenommen, daß diese Hormone wirken, indem sie die Reifungsgeschwindigkeit untauglicher ("incompetent"), bisher unidentifizierter Vorläuferzellen zu brauchbaren Lymphocyten (Τ-Zellen) regulieren und so wirksame Abwehrmittel gegen fremde Eindringlinge werden. Weiterhin werden Vorläuferzellen anderer Arten, wie Erythroid, in ihrer Produktion und Reifung durch Thymosinpräparate stimuliert. Neuerdings wurde ein relativ roher

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thymosinhaltiger Kälberthymusextrakt zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit eines jungen Mädchens mit angeborener, gestörter Immunität .verwendet (vgl. D.W. Wara et al "Wem Eng. 3. Fled.", Bd. 292, Seite 70 (1975)). Ei_n neuerer Bericht hat uieittr die Verbesserung im hämatologischen Gesamtzustand (erhöhte Anzahl weißer und roter Zellen) bei mit einem Thymosinpraparat behandelten Patienten beschrieben (vgl. 3. Alexsandrowicz et al "Proc.Intl. Congress Immunol.", Brighton, England, 22.-24. 3uli 1974).

Weiter wurde berichtet (vgl. z.B. 3.F. Bach et al "Immunology", Bd. 25, Seite 353 (1973)), daß in frischer; Schweineblut eine thymosinartige Wirksamkeit festgestellt worden ist. Der dafür verantwortliche Faktor hat vermutlich ein !Molekulargewicht von etwa 1000 Daltons.

Die vorliegende Erfindung richtet sich Verfahren und pharmazeutische Präparate, die zur Erhöhung der immunologischen Stärke bzw. Fähigkeit geeignet sind.

In den Prioritätsanmeldungen Ser.Na 561 409 und 597 116 wird die Isolierung und Kennzeichnung eines Proteins mit thymushormonartigen Eigenschaften einer erhöhten immunologischen Fähigkeit beschrieben. Es wird angegeben, daß dieses Protein ein Molekulargewicht von etwa 56700 Daltons und etwa das folgende Verhältnis von Aminosäuren hat:

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Aminosäure M0I-/O

Asparaginsäure	6,6	und es ist aus v/ier Unter
Threonin	9,5
Serin	9,3
Glutamin-säure ί	iü,3
Prolin	6,6
Glycin	8,3
Alanin	9,7
1/2 Cystin	0,9
Ualin	9,5
Methionin	0,7
Isoleucin	4,0
Leucin	5,9
Tyrosin	2,3
Phenylalanin	3,9
Tryptoohan	1,u
Lysin	6,3
Histidin	3,1
Arginin	3,2
Das genannte Protein hat uieiter Glycin	und Histidin als N-end-
ständige Aminosäuren, einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,0
(dfi^-nun als etwa 4,5 bestimmt wurde),
einheiten zusammengesetzt.

Es uiurde nun weiter gefunden, daß dieses Protein identisch ist mit menschlichen Serumpräalbumin, einem in menschlichem Serum natürlich vorkommenden Protein, das bereits isoliert, gereinigt und durch- Aufstellung der Aminosäuresequenz identifiziert worden ist (vgl» Y. Kautia, "3.Biol.Chem.", 249, 6796-6805 (1974)).

Die Identifizierung des vorliegenden Proteins als menschliches Präalbumin erfolgte durch einen Vergleich seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften mit einer im Handel verfügbaren

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Probe und durch Querreaktionsfähigkeit mit menschlichem Präalburninantikörper.

Obgleich menschliches Präalbumin bereits Geschrieben u/urde, wurde gelehrt, daß es nur als spezifischer Träger für verschiedene ausgewählte kleinere Moleküle wirkt, und es ist nicht erkannt worden, daß es irgendeine intrinsische biologische Wirksamkeit zeiqt. Überraschenderuieise wurde nun gefunden, daß menschliches Präalbumin starke thymushormonartige Eigenschaften zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit hat. Die Untersuchung handelsüblicher Proben von menschlichem Präalbumin in ausgewählten biologischen Versuchen, die im folgenden beschrieben werden, zeigt tatsächlich, daß diese Materialien die oben genannte, biener unerkannte biologische Wirksamkeit besitzen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich daher einerseits auf ein Verfahren zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit durch Verabreichung einer wirksamen Menge von menschlichem Serumpräalbumin an einen Patienten, der dieser Behandlung bedarf.

Die vorliegende Erfindung richtet sich weiter auf pharmazeutische Präparate zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit, die eine therapeutisch wirksame Menge an menschlichem Serumpräalbumin in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger enthalten.

Außerdem richtet sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Isolierung und Reinigung von menschlichem Serumpräalbumin aus der menschlichen Blutfraktion Cohn IV-1.

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Die in der vorliegenden Anmeldung verwendete Bezeichnung "immunologische Fähigkeit" bedeutet das Maß des Ansprechens der die Immunität umfassenden physiologischen Mechanismen. Die Immunität verleiht ihrem Träger dir! Fähigkeit zum Neutralisieren. Eliminieren oder Umwandeln fremder Materialien, u/ie Bakterien, Viren und Fungi sowie Zellen anderer Lebewesenarten ohne Schaden für den Träger.

Diese Bezeichnung ist in der Immunologiewissenschaft bekannt und akzeptiert (vgl. z.B. G.A. Bellanti "Immunology", W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa. (1971)). Man kennt z-juai breite Arten von Immunität, nämlich die Humoralimminität auf der Basis der Produktion löslicher, zirkulierenden Antikörper, und die durch die Zellen vermittelte Immunität, die auf der Produktion und dem Funktionieren spezifischer Arten von Lymphoidzellen (Lymphocyten) beruht. Reife Lymphocyten nehmen souiohl an der Humoral- als auch an der durch die Zellen vermittelten Immunität teil (vgl. P.G.H. Gell und P.R.A. Coombs "Clinical Aspects of Immunology", 2.Aufl., F.A. Davis Co., Philadelphia (1968)j 3.F.A.P. Miller und D. Gsaba "Physiological Reviews" 47, 137 (1967); N. Trainin "Physiological Reviews" _54, 272 (1974); A. White "Anm.N.Y.Acad.Soi." ,29, 253, (1975)).

Ohne an irgendeinen Wirkungsmechnismus gebunden werden zu wollen wird angenommen, daß das vorliegende Material wirkt, indem es sowohl die Anzahl als auch die Geschwindigkeit der Reifung immunologisch fähiger Lymphocyten aus unfähigen Vorlauferzellen erhöht.

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Die Uerstärkung der immunologischen Fähigkeit kann durch verschiedene Wege gezeigt werden, wobei sowohl in vitro als auch in vivo Untersuchungen an Kleintieren der in der Immunologietechnik bekannten Art angewendet werden. Dabei können z.B. die folgenden Untersuchungen besonders erwähnt werden:

1. In vitro azathioprinsensitive Rosettenuntersuchung (in vitro Rosettenuntersuchung)

2. in vivo azathioprin.-ensitive Rosettenuntersuchung

3. Antikörpersynthese in vivo

4. Antikörpersynthese in vitro

5. Proliferation von Lymphoidgewebe

6. Gemischte Lymphocytenreaktion

7. Blastogenese mil Concanavalin A

8. In vitro spontane Rosettenuntersuchung

9. Produktion cytotoxischer Lymphocyten

10. In vitro Autosensibilisierung mit Lymphocyten

11. In viso Autosensibilisierung mit Lymphocyten

Wie aus den Beispielen hervorgeht, ist erfindungsgemäß jede der obigen Untersuchungen angewendet worden, um die Erhöhung der immunologischen Fähigkeit durch menschliches Präalbumin darzustellen.

Die obigen Untersuchungen beziehen sich auf eine oder mehrere der folgenden allgemeinen Klassen von klinischer Signifikanz, für welche die immunologische Fähigkeit vermutlich ein Faktor ist:

Stimulierung der Antikörpersynthese (insbesondere Untersuchung 3 und 4)

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Ersatz- und Restorationstherapie (insbesondere Versuch 5-9) Autoimmunerkrankungen (insbesondere Versuch 10 und 11).

Der Versuch für eine schnelle und genaue Anzeige der Wirksamkeit zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit ist die bekannte, oben genannte in vitro -Rosettenuntersuchung (vgl. 3.P. Bach "Proc.Natl. Acad.Sci. U.S.A.", Bd. 68, Seite 2334 (1971)), bei welchem die Sensibilität von rosettenbildenden Milzzellen gegen Azathioprin /6-(1 -Methyl-4-nitro-5-imidazolyl)-mercaptopurin7 gemessen wird.

Dieser Versuch zeigt eine gute Korrelation mit der Anzahl immunologisch fähiger Lymphoc/ten der T-Klasse. Diese Lymphocytenklasse wirkt nämlich gemeinsam mit 3 Lymphocytan in der Antikörpersynthese, und sie sind die Hauptzellen, die die durch die Zellen vermittelte Immunität regulieren. Es gibt viele Beu/eise für die Bedeutung dieser Untersuchung zur Bestimmung des immunologischen Zustandes (vgl. 3.F. Bach "The Mode of Action of Immunisuppressive Agents" North Holland/American Elsevier Publishing Co., Amsterdam/ New York, (1975)).

Somit kann menschliches Präalbumin klinisch zur Behandlung von Patienten in Fällen geeignet sein, so die immunologische Fähigkeit als wesentlicher Faktor angenommen wird, z.B. Autoimmunerkrankungen (luie Lupus erythematosus, ulcerative Colitis, autoimmune hämolytische Anaemie, Thyrotoxicose, Rheumatoidarthritis, Lebercirrhose), Thymusaplasie und -dysplasie, verstärkte Immunität bei infektiösen Störungen (z.B. bakteriale, virale und fungale Störungen), morbus Hodgkin, hypogammaglobulinämisches Syndrom, besonderes Wachstum von mißgebildeten Zellen ("aberrant cell proliferative conditions"),

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verminderte immunolgische Fähigkeit aufgrund eines zeitweiligen Absinkens der Hormonproduktion der Thymusdrüse, bei chemisch oder radiologisch induzierten immuna-suppressiven Zuständen usiü.

Es wurde gefunuan, daß ein in der im folgenden beschriebenen Weise hergestellten, von Verunreinigungen praktisch freies menschliches Präalbumin beim in v/itro Rosettenversuch eine Wirksamkeit unter 1 Nanogramm zeigt.

Obgleich es für viele Zwecke wünschenswert ist, praktisch reines menschliches Präablumin in einem zur therapeutischen Verabreichung geeigneten Präparat zu verwenden, so macht es die mühsame Reinigung und Herstellung des reinen Materials in großen Mengen, die mit einem erheblichen Verlust an Material und entsprechenden Kosten und Mühen verbunden sind, zweckmäßig, für viele therapeutische Zwecke weniger reine, menschliches Präalbumin enthaltende Fraktionen zu verwenden, vorausgesetzt, diese sind frei von cytotoxischen Verunreinigungen. So wurde gefunden, daß teilweise gereinigte Fraktionen mit einer Wirksamkeit im in vitro Rosettsnversuch von etwa 0,01-0,20 Mikrogramm für therapeutische Zwecke äußerst geeignet sind.

Menschliches Präalbumin entweder in praktisch reiner Form oder als Komponente einer teilweise gereinigten, von cytotoxischen Verunreinigungen freien Fraktion kann in Form üblicher pharmazeutischer oder medizinischer Präparate durch Mischen mit pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Streckmitteln hergestellt werden. Das Material kann z.B. mit organischen oder anorganischen inerten pharmazeutischen Trägern zur parenteralen Verabreichung,

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z.B. intramuskulär, subkutan oder intravenös, in Form von z.B. flüssigen Lösungen, Suspensionen usuj. in Einheits- oder unterteilten Dosen gemischt werden.

Die das erfindungsgemäße Material enthaltenden pharmazeutischen Präparate können den üblichen pharmazeutischen Maßnahmen, nie Sterilisation (z.C. durch Milliporenfiltration) unterworfen werden und die üblichen pharmazeutischen Zusätze, wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Massen/Binde-Mittel, Salze zur Einstellung'des osmotischen Druckes oder Puffer, enthalten. Die Präparate können auch andere therapeutisch wertvolle Materialien oder Materialien enthalten, die die Wirkungsdauer der erfindungsgemäßen Verbindung verlängern. Die Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder dem Fachmann offensichtlich. Eine eingehende Zusammenfassung dieser Formulierungstechniken findet sich z.B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der das erfindungsgemäße Material enthaltenden Formulierungen besteht in der Rekonstituierung won lyophilisiertem menschlichem Präalbumin. So kann menschliches, in der im folgenden beschriebenen Weise hergestelltes Präalbumin entweder allein oder mit anderen festen Streckmitteln sterilisiert und lyophilisiert werden und bis zum Gebrauch in einer sterilen Ampulle gelagert werden. Unmittelbar vor der Verabreichung wird die gewünschte Menge an Lösungsmittel, wie Wasser, wasserhaltige Konservierungsmittel oder eine Lösung verschiedener Streckmittel in Wasser, zum Lösen des menschlichen Präalbumins zugefügt.

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In jedem Fall enthält das zu verabreichende pharmazeutische Präparat eine zur Behandlung der betreffenden Erkrankung therapeutisch wirksame Menge an menschlichem Präalbumin.

Die Dosierungweise kann aus einzelnen oder geteilten ^i:osen bestehen, ist in jedem Fall jedoch notwendj gerweise von den Bedürfnissen des zu behandelnden Patienten und dem Urteil des behandelnder, Mediziners abhängig. Als allgemeine Richtlinie für die meisten Zwecke ujird jedoch das erfindungsgemäöe, praktisch reine Material in einer Menge von etwa 10 pg/kg/Tag bis etuia 20 /ug/ kg/Tag, vorzugsweise etwa 100 pg/kg/Tag bis etwa 3 ,-ug/kg/Tsg, verabreicht. Anders ausgedrückt würde dies für einen durchschnittlichen erwachsenen Patienten (70 kg) etwa 0,7 ng/Tag bis etwa 1,4 mg/Tag, vorzugsweise etwa 7 ng/Tag bis etwa 0,2 mg/Tag, betragen; man kann, die Dosierung auch aufgrund der Ergebnisse der anfänglichen täglichen Behandlung bei den obigen Vierten bestimmen. Eine weniger reine Fraktion wird notwendigerweise in entsprechend höherer Dosis verabreicht.

Menschliches Präalbumin wird entweder als Komponente einer teilweise gereinigten, von cytotoxischen Verunreinigungen freien Fraktion oder in praktisch reiner Form isoliert, wobei von menschlichem Blut oder einer leicht verfügbaren menschlichen Blutfraktion in einem mehrstufigen Reinigungsverfahren ausgegangen wird*

Eine besonders wertvolle Quelle von menschlichem Präalburrin ist die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte menschliche Blutfraktion, die während der Fraktionierung von menschlichem Blut erhalten und gewöhnlich als Abfallfraktion verwarfen wird. Diese Fraktion ist somit in großen Kengen aus Blutquellen erhältlich und relativ

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billig. Durchschnittlich zeigt die Cohn IV-1 Fraktion beim in vitro Rosettenversuch eine Wirksamkeit von etwa 24 Mikrogramm. Ausgedrückt als Wirksamkeit im Rosettenversuch stellt die Cohn IV-1 Fraktion eine etuia 10-fache Reinigung aus rohem menschlichem Serum dar. Somit ist reines menschliches Präalbumin mit einer Wirksamkeit im Rosettenversuch unter 1 Nanogramm, gewöhnlich 0,2-1,0 IManogramm, eine 24000-120000-fache Verbesserung der Wirksamkeit im Vergleich zur Cohn IV-1 Fraktion und eine 240 000-1 200 000-fache Verbesserung der Wirksamkeit im Vergleich mit rohem menschlichem Serum. Diese verbesserte Wirkc-amkeit" beruht vermutlich teilweise auf der Entfernung einer im Serum normalerweise anwesenden Inhibitorfraktion. Das zur Erzielung eines so bemerkenswerten Maßes an verbesserter Wirksamkeit notwendige, komplexe Reinigungsverfahren, das das erhaltene Material praktisch rein macht, ist im folgenden beschrieben.

Das Verfahren zur Reinigung von menschlichem Präalbumin, ausgehend von der Cohn IV-1 Fraktion, umfaßt die folgenden Stufen.

1) a. Molekularfiltration zwecks Ausschluß von hoch molekularem

Material und niedrig molekularem Material oder b. Ammoniumsulfatfraktionierung

2) Gelchromatographie

3) Wiederholung von Stufe 2 oder frei fließende Elektrophorese

4) Präparative Gelelektrophorese und

5) Gelchromatographie

Während jsder Stufe des Reinigungsverfahrens werden die verschiedenen gebildeten Fraktionen routinemäßig untersucht, vorzugsweise nach dem in vitro Rosettenversuch, um die thymushormonartige Wirksamkeit zu bestimmen. Die den wesentlichen Anteil dieser Wirksam-

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- 12 - 2 6 12 0 1b

keit enthaltende(n) Fraktion oder Fraktionen uierden in dan späteren Stufen weiter behandelt, wodurch die aktiven Fraktionen zu immer kleineren Volumen konzentriert werden, mährend man die aktive Komponente von ip^ktit'en Verunreinigungen abtrennt, bis man das gewünschte Material in praktisch reiner Form erhält.

Obgleich die bevorzugten Ausführungsformen dar obigen Reinigungsstufen in Beispiel 1 und 9 beschrieben werden, wird hier eine kurze Beschreibung des Reinigungsverfahrens gegeben:

Die rohe Cohn IV-1 Fraktion kann wahlweise gegebenenfalls lyophilisiert uierden. Dies erfolgt gewöhnlich durch Suspendieren derselben in destilliertem oder deionisiertem Wasser, Rühren zum Lösen von Klumpen und anschließende entfernung des Lösungsmittels und anderer flüchtiger Materialien unter vermindertem Druck-.

Das lyophilisierte Material hat eine größere Stabilität und kann in der Kälte längere Zeit gelagert werden. Vor der Reinigung wird die rohe oder lyophilisierte Cohn IV-1 Fraktion als wässrige Lösung hergestellt und vorzugsweise zur Entfernung von Sediment zentrifugiert.

Zur Molekularfiltration wird destilliertes oder deionisiertes Wasser als Lösungsmittel verwendet, wobei der pH-Wert vorzugsweise auf etwa 7,G eingestellt wird; zur Ammoniumsulfatfraktionierung wird ein wässriger Puffer verwendet.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die (rohe oder vorzugsweise lyophilisierte) Cohn IV-1 Fraktion in Lösung in destilliertem oder deionisiertem Wasser zwei Molekularfiltrationen unterworfen, um Komponenten mit Molekulargewichten

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wesentlich oberhalb und unterhalb desjenigen der gewünschten Komponente zu entfernen. Bei einem geeigneten Molekularfiltrationsv/erfahrens wird anfänglich die oben genannte Lösung durch einen Hohlfaserfraktionator mit geeignetem Membranfilter geleitet, um Komponenten mit hohem Molekulargewicht (über etica 60-7C üüO Daltons in Abhängigkeit von Filtrationsdruck) zu entfernen. Geeignete Hohlfaserfraktionatoren sind (in Abhängigkeit vom S;Jbstratvoiumen) die Fraktionierungsvorrichtungen "Amicon DC-2" und "DC-30", Bei Verwendung des DC-2 Fraktionators ist ein geeignetes. Membranfilter das Material "Amicon HIDX-50". Mit dem DC-30 Fraktionator ist "Amicon HIOX-50" als Filter geeignet.

Das Filtrat aus der obigen Molekularfiltrav..".on wird zur Entfernung niedrig molekularer Materialien einer weiteren Molekularfiltration unterworfen. So führt der Durchgang durch einen ähnlichen Hohlfaserfraktionatar, der mit einer Membran zum Zurückhalten von Material eines.Molekulargewichtes von etwa 10 000 Daltons oder mehr versehen ist, zum gewünschten Material mit einem Molekulargewicht von etwa 56 700 Daltons, das aus dem zurückgehaltenen Material isoliert wird. Ein geeignetes Filter zu diesem Zweck in Verbindung mit der DC-2 Vorrichtung ist "Amicon HIüP-10" und mit der DC-30 Vorrichtung "Amicon HIOSM".

Das Filtrationsverfahren kann auch umgekehrt werden, so daß zuerst die niedrig molekularen und dann die hoch molekularen Verunreinigungen entfernt werden. Das erstgenannte Verfahren wird jedoch bevorzugt.

In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird die rohe oder vorzugsweise lyophilisierte Cohn IV-1 Fraktion einer Ammoniumsul-

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fatfraktionierung unterworfen. Durch dieses Uerfahren wird eine wesentlich höhere (etwa S-fache) Ausbeute an gewünschtem Material im l/ergleich zum oben beschriebenen Rolekularfraktionierungsuarfahren erhalten.

Die Cohn IV-1 Fraktion wird zuerst in einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert zwischen etoa 7,8-8,2, wie Tris-(hydroxymethyl)-ai^inomethan-natriuraazid (gewöhnlich als Tris-natriumazid bekannt) gelöst und zur Entfernung von Sediment vorzugsweise zentrifugiert« Dann wird die Lösung bei einer Temperatur zwischen etu/a 0-5 C. nacheinander mit Anteilen an Ammoniumsulfat zum "Aussalzen" verschiedener Fraktionen behandelt. Nach jeder Ammoniun;sulfatzugabe wird der gebildete Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, die dann weiter mit Ammoniumsulfat behandelt wird»

Die das gewünschte Material enthaltende Fraktion wird "ausgesalzen" oder ausgefällt, wenn Ammoniumsulfat zugefügt wird, um den Ammoniumsulfatgehalt der Lösung von etwa 4G-;£iger auf etwa 60-^iige Sättigung zu bringen. Die zum Erreichen des entsprechenden Sättigungsgrades notwendige Ammoniumsulfatmenge kann aus Löslichkeitstabellen leicht bestimmt werden.

vorzugsweise Der das gewünschte Material enthaltende Miederschlag wird/nach bekannten Verfahren, z.B. Diafiltration, oder vorzugsweise durch Dialyse einer Lösung des Niederschlages in dest. Wasser entsalzt. Dann wird das entsalzte Material zur Vorbereitung für die nächste Stufe z.B. durch Lyaphilisierung aus dem gefrorsnen Zustand konzentriert.

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In der nächsten Stufe ujird das gewünschte Material aus der vorangehenden Molekularfiltration oder Ammoniumsulfatfraktionierung einer Chromatographie suf einer Polysancharidgelkolonne unterworfen, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert. Geeignete Kolonnen sind z.B. aus vernetzten Dextranen hergestellt, wie "Sephadex G-75", G-100, G-150 oder G-2D0 (der Firma Pharmacia Fine Chemicals). Eir bevorzugtes Material ist "Sephadex G-150", da es eine optimale Trennung der Komücnenten ergibt, wie durch Untersuchung der Kurve von K gegen

a ν

log des Molekulargewichtes bestimmt wird (vgl. Andrews "Biochem.3.", Bd. 91, Seite 222 (196^)). Eine solche Gelchramatographie erfolgt zweckmäßig, indem man einen wässrigen CIu¹" erungspuf f er mit einem pH-Werl von etwa 7,8-0,2, vorzugsweise etwa 8,0, durch die böladcne Kolonne leitet. Ein geeigneter Puffer ist Tris-NaCl-NaN . Die Temperatur sollte zwischen etwa 0-10 C, vorzugsweise etwa bei 5 C, liegen. Die Eluierungsfraktionen werden aus der Gelchromatographie gesammelt, und die die gewünschte Komponente enthaltende(n) Fraktion(en) kann durch UU Absorption, eluiertes Gesamtprotein und/oder Biobestimmung bestimmt werden. Die Kolonne kann so kalibriert sein, daß die den gewünschten Molekulargewichtsbereich enthaltende Eluierungsfraktion leicht bestimmt werden kann (vgl. Andrews, ibid.).

Die gewünschte(n) Fraktion(en) werden vorzugsweise durch Dialyse oder insbesondere Diafiltration entsalzten und in Vorbereitung auf die nächste Stufe z.B. durch Lyophilisierung konzentriert. Die Diafiltration erfolgt unter Druck (z.B. 4,9-5,6 kg/cm² Stickstoff) durch eine Membran mit entsprechender Porengröße, so daß

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das gewünschte Material zurückgehalten wird. Geeignete Membrane sind z.B. "Amicon UM-05^r' und UM-10 mit einem Bereich für abgetrennte Molekulargewichte von 500 bziu. 10 000. Andere verwendbare Membrane sind »Amicon UM-2", PM-10 oder UM-20E.

In der nächsten Stufe wird das obige Material aus der Gelchromatographie entweder durch dieselbe oder eins ähnliche Gelkolonne zurückgeführt oder ein^c.r frei fließenden Elektrophorese unterworfen; diese erfolgt nach per se in der Technik bekannten l/erfahren, Der pH-Wert sollte zwischen etwa 5,0-5,5, vorzugsweise bei etwa 5,25, liegen. Ein bevorzuger Puffer zur Einstellung eines solchen pH-Wertes ist Natriumacetat-Essigsäure. Die gewünschte Komponente wird wiederum durch UV Absorption, Gesamtprotein und/oder Bioversuchsverfahren und/oder durch Verwendung einer kalibrierten Kolonne lokalisiert.

Dann wird das gewünschte Material aus der vorangehenden Stufe einer präparativen Gelelektrophorese auf einer Polyacryiamidscheibe in der für solche Verfahren üblichen Weise unterworfen. Diese Elektrophorese erfolgt vorzugsweise so, daß das Trennungsgel und der Eluierungspuffer einen pH-Wert zwischen etwa 8,5-9,5, vorzugsweise etwa 6,9, haben. Ein bevorzugter Puffer zur Einstellung eines solchen pH-Wertes ist Tris-HCl. Normalerweise erhält man nach diesem Verfahren ein elektrophoretisch homogenes menschliches Präalbumin. Die Homogenität der erhaltenen Komponente wird durch analytische Standardverfahren, z.B. durch Anwendung einer analytischen Scheiben-Gel-Elektrophorese oder isoelektrischer Einstellung bestimmt; die Hormonwirksamkeit wird durch Bioversuche bestimmt. Als abschließende Stufe wird das Material von Polyacrylsäure und restlichen Salzen wie oben durch Chromatographie auf

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einer Mikropolysaccharidkülonne, vorzugsweise "Sephadex G-75", befreit. Die erste, aus der Kolonne eluierende Spitze enthält, gemäß Beurteilung aus den oben genannten Kriterien, das aktive Material,· das Produkt selbst kann durch Lyophilisierung erhalten werden.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung sowohl von praktisch reinem als auch teilweise gereinigtem menschlichen Präalbumin sowie die angewendeten Bioversuche und die daraus erhaltenen Ergebnisse» ohne eine Beschränkung darzustellen.

Die oben und in den Beispielen zitierten Literaturstellen werden hiermit in die vorliegende Anmeldung .iiii aufgenommen.

B e i 3 ρ i e 1 1_

Reinigung von mensdiicheni Präalbumin aus Cohn IV-1 Fraktion

4 kg menschliche Blutfraktion Cohn IV-1 (Firma Cutter Laboratories) wurden in 20 1 zweifach destilliertem Wasser bei 5 C. 4 Stunden gerührt und lyophilisiert; so erhielt man 1105 g trockenes fiaterial, das in 10 Volumen deionisiertem Wasser suspendiert wurde. Der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,0 eingestellt und die Mischung 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Das Sediment wurde sntfernt und das überstehende Material durch eine HI0X-5Q Patrone in einer "Amicon DC-30" Vorrichtung geleitet. Die niedriger molekulare Fraktion aus dieser Stufe wurde dann durch eine HI05H Patrone in derselben Vorrichtung geleitet. Wach Lyophilisierung des zurückgehaltenen Materials erhielt man 50 g Material, das in 1-g-Anteilen (nach Lösen im unten genannten Puffer) in einer

5 χ 90 cm "G-75 Sephadex" Kolonne (Firma Pharmacia Fine Chemicals^ die mit 5 0 mi-ϊ Tris-100 mM NaCl-0,02 % Natriumazidpuf fer äqui-

libriert war, bei pH 8,0 und 5 C. chromatographiert wurde.

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Die Chromatographie u/urde durch Messungen der optischen Dichte bei 280 nm Übermacht, der Inhalt jedes Rohres wurde lyophilisiert und zur Bestimmung von Gesamtprotein diafiltriert und dann einem in vitro Rosettenversuch unterworfen. Über 90 % der eluierten Wirksamkeit wurden in einer auf dieser Kolonne leicht verzögerten Fraktion mit einbin K Wert von 0,055 gewonnen, was einem unge-

av

fähren Molekulargewichtbereich von etwa 50 000-70 000 Daltons entsprach. Dieses Material (Gesamtmenge als allen 1-g-Versuchen = 20 g) wurde dann bei pH 5,25 in einem Acetatpufforsystem (25 mM f\i'aOAc - 7 raf-'l HOAc) einer frei fließenden Elektrophorese unterworfen. Wie oben wurde der l/erlauf durch optische Dichte, Gesamtprotein und Bioversuch überwacht« Das Material aus der Kombination der aktiven Fraktionen wurde weiter durch präparative Poiyacrylamidgeleiektrophorese unter Verwendung eines lü-^'igen vernetzten Gels gereinigt. Der Spacer und die Probegele waren 0,060 M in Tris, mit HCl auf pH 6,6-6,8 eingestellt. Das Sepaiatorgel war 0,375 Pl in Tris, mit HCl auf pH 8,9 eingestellt. Der Elektrodenbehälterpuffer war 0,024 R in Tris und 0,192 M in Glycin, bei einem pH-Wert von 8,2-8,4. Der Eluierungspuffer war 0,375 Π in in Tris, mit HCl auf pH 8,8-9,0 eingestellt. Die Aktivität wurde in einer zwischen dem Spurfarbstoff (Bromphenol Blau) und der Albuminfraktion wandernden Fraktion eluiert. Dieses Material (etwa 100 mg insgesamt) war in einem Analysesystem bei pH 8,9 elektrophoretisch homogen.

Die Wiederholung der Sephadex-Chromatographie in obiger Weise auf einer Mikrokolonne (0,8 χ 76 cm) lieferte praktisch reines Präalbumin als weißen Feststoff.

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Der S_9n Wert, bestimmt durch Sedimentationsgeschwindigkeit in einer einer Spinco Ultrazentifuge, Modell E, betrug 4,07, und das durch Sedimentationsgleichgewicht bestimmte Molekulargewicht des Moleküls betrug 56 700 Daltons. Nach Behandlung mit 5Γ1 Guanidiniumhydrochlorid - 0,8 % Dithiothreit - 0.01M Phosphatpuffer bai pH 5,2, anschließende Behandlung mit 5M Harnstoff - 0,1 % Natriumdodecylsulfat - 1 % Dithiothreit - 0,011^ Phosphatpuffer bei pH 7,4 und Elektrophorese bei pH 7,0 in einem natriumdodecylsulfathaltigen Acrylamidgel betrug das Molekulargewicht des nicht dissoziierten Materials 52 000 Daltons: es gab eine teilweise Dissoziierung in vier Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von je etwa 13 500 Daltons.

("focusing")

Das Protein war nach isoelektrischer Ednstelkng/in einem Ampholine enthaltenden Polyacrylamidgel mit einem pH Bereich von 3-10 homogen und besaß einen ungefähren isoelektrischen Punkt von A,5. Die durch Dansylierung erhaltene Analyse auf IM-endständige Verbindungen zeigte die Anwesenheit von Derivaten entsprechend Dansylglycin und o«—Dansylhistidin. Die Aminosäurezusammensetzung wurde durch Hydrolyse des Proteins und Chromatographie in einer Durrum Aminosäureanalysevorrichtung unter Standardbedingungen bestimmt und lieferte das folgende Ergebnis:

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Aminosäure Hal-%

Asparaginsäure 6,6

Threonin 9,5

Serin 9,3

Glutaminsäure 10,J

Prolin 6,6

Glycin · 8.3

Alanin 9,7

1/2 Cystin 0,9

Valin 9,5

Methionin 0,7

Isoleucin 4,0

Leucin 5,9

Tyrosin 2,3

Phenylalanin 3,9

Tryptophan 1 ,0

Lysin 6,3

Histidin 3,1

Arginin 3,2

Die Identität wurde weiter durch l/ergleich mit authentischen Proben von menschlichem Präalbumin bestimmt.

Beispiel 2

In vitro Rosettenversuch während Reinigung von menschlichem Präalbumin

Der in vitro Rosettenversuch u/urde im wesentlichen gemäß CF. Bach et al "Proc.Natl.Acad.Sci." U.S.A., Bd. 68, Seite 2734 (1974) durchgeführt. Das genaue Protokoll war wie folgt: A. Herstellung der Azathioprinnatriumsalzgrundlösung 277 mg Azathioprin (fteie Säure; Firma Imuran, Burroughs Wellcome) wurde in 25 ecm Wasser in einem Meßkolben gelöst. Zum Lösen des gesamten Pulvers wurde etwa 1 ecm 1 l\l NaOH unter Rühren eingetropft. Die endgültige Lösung wurde 1:100 in Hank's ausgeglichener Salzlösung, pH 7,2, hergestellt aus pulverisiertem Medium (Firma Difco Labs., Detroit, Mich.) verdünnt und lieferte eine Lösung,

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die 0,106 rng/ccm Azathioprinnatriumsalz, pH 8,2, enthielt. Diese Lösung wurde durch ein Milliporenfilter zuiecks Sterilisation filtriert. Die endgültige Lösung wurde in der Dunkelheit in einem. Kühlschrank gelagert. Die Stabilität wurde durch Hessen der opti- ^% sehen Dichte bei 280 und 330 nm untersucht.

B. Für den Versuch selbst wurden Milzzellen von 6-8 Wochen alten männlichen C57B1/6 Simcnsen Mäusen verwendet, denen 7-30 Tage vor dem Schlachten die Thymusdrüse entfernt worden war. Die einzelnen Milzen wurden homogenisiert und in kalter Hank's ausgeglichener Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden bei 200 χ g 10 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge tablettiert. Es wurde eine endgültige gepoolte Suspension aus 40-60 χ 10 nukleatierten Zeilen pro ecm hergestellt.

Kontrollreihe; zur Bestimmung der Sensibilität der thymectomisierten Milzzellen gegen Azathioprinnatriumsalz wurde das Azathioprinnatriumsalz zwischen 25 ,ug/Röhrchen bis 1,56 ,ug/Röhrchen unter Verwendung 2facher serieller Verdünnungen von 0,25 ecm Grundlösung (Teil A) in Hank's Salzlösung titriert. 0,1 ecm der oben hergestellten Miizzellensuspension wurden jeder Verdünnung (4,6 χ 10 Zellen/Röhrchen) zugefügt.

Testreihe; Testfraktionen von menschlichem Präalbumin (0,125 ecm Aliquote) wurden seriell 2-fach in Hank's Salzlösung verdünnt. Deder Verdünnung der Testfraktion wurden 2,5 Mikrogramm Azathioprinnatriumsalz in 0,125 ecm Hank's Salzlösung (siehe oben) und 0,1 ecm Hilzzellensuspension zugefügt.

Die Materialien von Kontroll- und Testreihe wurden 60 Minuten in einem Wasserbad bei 37°C. bebrütet. 0,2 ecm 2 Tage vorher herge-

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stellter 50-^iger Schafserythrocyten (SRBC) in Alsever Lösung (Forma Grand Island Biological Co., "Gibco", Grand Island, N.Y.) wurden in 15 ccn« Hank's Salzlösung verdünnt. 0,125 ecm dieser SRBC Suspension wurden jedem Röhrchen der Kontroll- und Teetreihe zugefügt, und die Zellen wurden in einer gekühlten Zentrifuge bei 200 χ g 5 Minuten tablettiert. Die tablettierten Zellen wurden bei 4⁰C. 90 Minuten gekühl«", vorsichtig erneut 5 Minuten auf einem Rotator suspendiert und die Rosetten in einem Malessez Hämocytenzähler gezählt.

Die spezifische Wirksamkeit wurde durch die Mindestproteinmenge in der Testfraktion bestimmt, die eine Rosettenbildung um 50 % oder mehr in Anwesenheit von 2,5 ,ug/Röhrchen Azathioprinnatriumsalz inhibierte. Die spezifische Wirksamkeit der während der Reinigung (Beispiel 1) erhaltenen Fraktionen wird in der folgenden Tabelle zusammen mit einem relativen Reinigungsfaktor unter Verwendung der Cohn IV-1 Fraktion als Bezug gezeigt. Stufe Fraktion

1 Cohn Fraktion IU-I

2 auf DC-30 HIOSM Patrone zurück gehaltenes Material

3 Chromatographie auf Sephadex G-75, pH 8, Fraktion 2

4 frei fließende Elektrophorese, pH 5,25, Fraktion 2

5 präparative Polyacrylamidgelelektrophorese, pH 8,9, Fraktion 1

6 Chromatographie auf Mikro-Sephadex G-75, Fraktion 1

Wirksamk.im Rosettenvers. ( /Ug Protein)	Reimgungs faktor
24	1
3	8
0,1	240
0,01	2400
0,002	12000
0,0004	60000

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Die obige Tabelle erläutert die Verwendung des in vitro Rosettenversuches zur Überwachung der Reinigung von menschlichem Präalbumin und zeigt, daß eine 60 000-fache Reinigung (bezogen auf die Aktivität) der Cohn IV-1 Fraktion erreicht wurde.

Beisp iel 3

Stimulierung der Antikörpersynthese

Werden normale Tiere oder solche, deren immunologisches Ansprechen experimentell unterdrückt wurde, mit einem fremden Antigen, z.B. einem aus einer anderen Spezies erhaltenen Protein, injiziert, dann erfolgt die Stimulierung eines immunologischen Abujehrmechanismus, z.B. die Synthese von .".ntikörpern mit der Fähigkeit zum "Neutralisieren" des Fremdmaterials.

Protokoll: Normale Mäuse (C57B1/6 Stamm) wurden durch eine einzige intravenöse Injektion mit Schafserythrocyten (SRBC) als Antigenstimulanz behandelt. Gleichzeitig erhielten die Testmäuse intravenös eine Menge an menschlichem Präalbumin (entsprechende Fraktion gemäß Darstellung in der Tabelle von Beispiel 2). Die Kontrollmäuse erhielten das Antigen und Rinderserumalbumin (BSA). Nach 7 Tagen wurden die Tiere getötet, die Milzen herausgeschnitten ten, und jede Milz wurde zur in vitro Antikörperbestimmung gemäß dem Verfahren von H.K. Derne et al "Science" Bd. 140, Seite 405 (1963) verwendet. Das Antikörperanspiechen ist als Anzahl plättchenbildender Zellen (PFC) pro 10 Milzzellen ausgedrückt.

A. Die folgende Tabelle zeigt die Antikörperbildung unter Verwendung einer menschlichen Präalbuminfraktion ("Hormon") entsprechend Stufe 2 der Tabelle von Beispiel 2. Es wurden sowohl 19S(IgM) als auch 7S(IgG) Antikörper bestimmt.

'6 09842/1012

injiziertes Material

24 -	2612015
P FC/1 O⁶	Milzzellen
19S(IqM)	7S(IqG)
33	2
105	114
193	112
249	173
276	310
1	1
3	1
120	119
154	76
156	152

Kochsalzlösung SRBC

SRBC + 10 /Ug Hormon SRBC + 100 ,ug Hormon SRBC + 400 /Ug Hormon

Kochsalzlösung + 400 ,ug Hormon

Kochsalzlösung + 400 /Ug BSA

SRBC + 10 ,ug BSA SRBC + 100 ,ug BSA SRBC + 400 ,ug BSA

Die Daten zeigen, daß die Verabreichung von menschlichem Präalbumin die Fähigkeit der Milzzellen zum Synthetisieren von 7S und 19S Antikörpern wesentlich erhöhte.

B. Die Wirkung von menschlichern Präalbumin ("Hormon") auf die Antikörpersynthese kann auch in einem in vitro Versuch gezeigt werden. Dabei wurden iiilzzellen von C57B1/6G Mäusen gezüchtet und dann entweder mit Schafserythrocyten, Schafserythrocyten plus Hormon oder Hormon allein behandelt. Das in diesem Versuch verwendete Hormon stammte aus Stufe 3. der Tabelle von Beispiel 2. Das Antikörperansprechen wurde nach 5-tägiger Züchtung gemessen. Es wurden nur die 19S Antikörper gemessen. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:

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Der Milzzellkultur zugefügtes 19S Antikörperansprechen . Material (PFC/iO Milzzellen)

46

SRBC 1332

SRBC * 10 /Ug Hormon 2097

SRBC + 50 /ug Hormon 1964

50 /ug Hormon · 58

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das menschliche Präalbuminpräparat bei in vitro Zugabe zur Stimulierung der IgM(i9S) Antikörpersynthese aktiv ist.
Beispiel 4

Wirkung von menschlichem Präalbumin bei neonatal thymektornisierten Mäusen

Bekanntlich bewirkt die neonatale ThymektGtnie einen "immunologischen Krüppel". Die operierten Tiere wachsen nicht normal, u/erden mager und haben wenig Widerstand gegen Infaktionen; sie können im Ansprechen auf eine Reizung durch spezifische Antigene keine Antikörper bilden und haben keine durch die Zellen vermittelte Immunität, d.h. können einen Hautpfropf aus einem allogenen Stamm derselben Spezies nicht abstoßen. Gewöhnlich sterben solche operierten Tiere innerhalb von 5-10 Wochen nach der Operation an allgemeinen Infektionen, was von dem Maß abhängt, in welchem die Umgebung, in welcher sie untergebracht sind, frei von infektiösen Mitteln ist. Dieses neonatale Thymectomiesyndrom ist in vielen Spezies nachgewiesen worden und zeigt sich auch bei Kindern, die entweder ohne Thymusdrüse oder mit einer Thymusaplasie oder -dysplasie geboren wurden (3.F.A.P. Miller et al "Physiol.Revs.", Bd. 47, Seite 137 (1967) und N, Trainin "Physiol.Revs.", Bd. 54, Seite 272 (1974)).

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Protokoll: C57B1/Ka Mäuse wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt nach chirurgisch sterilen Verfahren thymektomisiert und unter Bedingungen gehalten, die von spezifischen infektiösen Pathogenen frei u/aren. Gruppen von jeu/eils 10 dieser neonatal thymektomisierten Mäuse wurden in der im folgenden angegebenen Weise behandelt. Als Kontrollprotein wurde Rinderserumalbumin (BSA) verwendet.

A. Antikörpersynthese

Beginnend 9 Wochen nach der Thymektomie murde jede Haus intraperitoneal ein über den anderen Tag (ingesamt 8 Injektionen) mit 1 mg pro Injektion pro Maus menschlichem Präalhuminpräparat ("Hormon¹') oder BSA injiziert. Dss für diesen Versuch verwendete Hormon stammte aus Stufe 2 der Tabelle von Beispiel 2. Die Ti^re wurden 1 Woche nach der letzten Hormoninjektion und 5 Tage nach einer einzigen intraperitonealen Injektion des Antigens, nämlich Schafserythrocyten, geschlachtet. Die Antikörpertiter (19S) wurden nach dem l/erfahren von R. I. Mishell "3 .Exp.Med.", Bd. 126, Seite 423 (1967) bestimmt, wobei die folgenden Ergebnisse erzielt wurden:

19S Antikprperansprechen (PFC/1D Milzzellen) hormonbeh. Hause BSA behandl.Hause

58 650 9 500

Die obige Tabelle zeigt, daß die Verabreichung des menschlichen Präalbuminpräparates den neonatal thymektomisierten Hausen dia Fähigkeit zum Synthetisieren von 19S Antikörpern im Ansprechen auf eine Reizung mit Schafserythrocyten, einem thymusabhängigen Antigen, wiedergab.

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B. Gemischte Lymphocytenreaktion

Wenn Lymphoidzellen von Mäusen eines spezifischen Stammen in vitro mit Lymphoidzellen von Mäusen eines nicht verwandten Stammes gemischt werden, dann bewirkt die vom iamunologischen Standpunkt aus "fremde" Natur der Ζθΐΐβη auf einander ein proliferierendes Ansprechen jeder Zelle. Wie im folgenden gezeigt, kann man verhindern, daß sich eine von zwei Zellpopulationen proliferiert oder einer Blastogenese unterliegt, indem man einer Zellpopulation vor dem Mischen ein die Zellteilung inhibierendes Mittel zufügt.. Die Fähigkeit der Zellen, die Fremdzellen zu erkennen, ist eine Reflektion eines durch die Zellen vermittelten, immunologischen Ansprechons. Dies ist die sog. gemischte "Einbahn"-iymphocyten~ reaktiun.

Lymphoidzellen von neonatal thymektomisiertsn Mäusen oder von genetisch thymuslosen (nackten) Mäusen sind zu einer derartigen Erkennung unfähig, d.h. sie reagieren in der gemischten Lymphocytenreaktion beim Bebrüten mit Lymphoidzellen von erwachsenen Mäusen eines anderen Stammes nicht.

Es wurde das von A.L. Goldstein et al "D.Immunoli¹ , Bd. 106, Seite 773 (1971) beschriebene Protokoll verwendet.

Die im folgenden gezeigten Daten wurden mit Lyipphknotenzellen von neonatal thymektomisierten C57B1/Ka Mäusen erhalten, die im Alter von 4 Wochen mit einzelnen subkutanen Injektionen über eine Dauer von 1 Wochen aus jeweils 1 mg "Hormon" (entsprechend Stufe 2 der Tabelle von Beispiel 2) behandelt worden waren. Eine Kontrollgruppe von- neonatal thymektomisierten C57Bl6/«a Mäusen erhielt ähnliche Dosen an 1 mg Rinderserumalbumin. Die Tiere wurden geschlachtet

•6 09842/1012

und die Lymphknoten (mesenterial, axillar und inguinal) und die Milzen herausgeschnitten. Zellsuspensionen der Lymphknoten jeder Maus wurden in der gemischten Lymphocytenreaktion unter Verwendung gleicher Zahlen von C57B16/Ka Lymphknotenzellen (A) und allogenen (BLA) Zellen (B) getestet. Die "Hintergrund"-Einverleibung für jede Zellart wurde getrennt erhalten und vom gemischten Zellreaktinnswert subtrahiert, wodurch man die Differenz in Zählungen pro min (Δ CPM) aus der Reaktion der beiden Zellarten erhielt. Es wurden die folgenden Daten erhalten: Behandlung H-Thymidineinuerleibung

	umalbumin	B)	Δ	CPM*	S timulierunqsi.no ex
Rinderser		11	596	28,4
Hormon	B - (A + B	18	358	48,8
* = A χ A χ

Wie ersichtlich, zeigten die Lymphknotenzellen aus den mit dem menschlichen Präalbuminpräparat behandelten Tieren eine etwa 2-fache Erhöhung des Stimulierungsinex. Diese Daten zeigen, daß die Zellen aus neonatal thymektomisierten, mit diesem Präparat behandelten Mäusen in ihrer immunologischen Fähigkeit deutlich verbessert waren, was aus ihrer Fähigkeit zum "Erkennen" der · Lmyphknotenzellen eines histoinverträglichen Stammes von Mäusen hervorgeht.

Beispiel 5

Proliferation won Lymfhaidgeiuebe

Mäuse, denen innerhalb von 24-48 Stunden nach der Geburt die Thymusdrüse entfernt wurde (neonatale Thymektomie) wurde, oder genetisch athymische (nackte) Mäuse entwickeln kein normales Lymphoidgewebe. Das heißt, ihre Lymphknoten und die Milz (die Lymphoidorgane) sind

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klein und zeigen einen Mangel an Lymphocyten. Dies spiegelt die Tatsache, daß im frühen Leben die Thymusdrüse eine große Anzahl von Lymphoidzellen produziert, die zu den peripheren Lymphoidor-

ganen geleitet ujsrden und diRse besiedeln,

(proliferieren) wenn sich diese Zellen fortpflanzen/. Dies führt normalerweise zum

Wachstum und der Reifung normaler Lymphoiclstrukturen.

Protokoll:' genetisch athymicche (nackte) Mäuse von 4 Wochen erhielten 8 tägliche subkutane Injektionen aus 1 mg menschlichem Präalbuminpräparat ("Hormon") entsprechend Stufe 2 der Tabelle von Beispiel 2 über eine Dauer von 2 Wochen vor ihrer Tötung. Die Kontrollmäuse erhielten Injektionen von 1 mg Rinderserumalbumin. Die Lymphknoten (rrRsenterial, inguinal und axillar) wurden herausgeschnitten, abgetupft, gepoolt und die Anzahl der gesäten Lymphoidzellen gezählt. Die Daten waren wie folgt:

Gewebe Rinderserumalbumin Hormon

Anzahl der Zellen Anzahl der Zellen

Milz 1,02 χ 10⁸ 1,8 χ 10⁸

Lymphknoten 21,3 χ 1O⁶ 41,5 χ 1 O⁸

Bekanntlich wird die Fortpflanzung von Lymphoidzellen in normalen Mäusen thymusreguliert. Die genetisch thymuslose (nackte) Maus hat wenig, unentwickeltes Lymphoidgewebe. Die obigen Daten zeigen bei mit menschlichem Präalbumin behandelten Mäusen eine Erhöhung der Anzahl der Lymphknotenzel
d.h. eine 200-fache Erhöhung.

der Anzahl der Lymphknotenzellen um einen Faktor von ~2 χ 10 ,

609842/1 01 ?

Beispiel 6

Stimulierung durch Mitogene: Blastogenese nach Zugabe von Concanavalin A

Da Lymphoidzellen "nackter" Mäuse immunologisch nicht ansprechen, reagieren sie auch nicht auf Concanavalin A, ein Mitogen, das bekanntlich auf immunologisch fähige T-Zellen unter Beschleunigung ihrer Reifung und Differentiation wirkt.

Protokoll: Die Behandlung car nackten Mäuse erfolgte ujie bei der Fortpflanzung des Lymphoidgewebes (Beispiel 5) unter Verwendung desselben Präparates und derselben Menge an menschlichem Präalbumin. Der verwendete l/ersuch ist von H. N. Clarnan, ¹¹J. Immun öl. ", Bd. 112, Seite 960 (1974) beschrieben und beruht auf der Einverleibung von H-Thy^idin in in vitro bebrütete Lymphoidzellen mit und ohne Zugabe von Concanavalin A (Miles-Yeda, Kankakee, 111.) Es wurden die folgenden Daten erhalten: CPM*

Zellen von mit BSA behandelten Mäusen + ^_1n

Phosphat-Ringar-Puffer + Concanavalin A

Zellen von hormonbehandelten Mäusen + -_ig

Phosphat-Ringer-Puffer + Concanavalin A

* = Durchschnitt des pro Bebrütungsrohr einverleibten H-Thymidins

Die Injektion des menschlichen Präalbuminpräparates erhöhte das mitogene Ansprechen der Zellen auf Concanavalin A um etwa das 4-Fache. Somit erhöhte die Verabreichung dieses Materials an nackte Mäuse die Anzahl der Gastzellen, die in ihrem Ansprechen auf das Mitogen die Eigenschaften von T-Zellen zeigen.

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Beispiel 7

In vitro Reifung menschlicher Lymphocyten zu immunologisch fähigen T-Zellen

Die Anzahl der spontan Rosetten bildenden Erythrocytenzellen in den peripheren Blutlymphocyten ist ein Index für die immunolcgische Fähigkeit des Trägers, da dieser Index die Anzahl zirkulierenden, immunologisch fähiger T-Zellen widerspiegelt.

Bei normalen Lebewesen beträgt die Anzahl der E Rosetten-Zallen im peripheren Blut gewöhnlich 65-80 % der gesamten Lymphocytenpopulation. Werte unter diesem Bereich trifft man oft bei immunologisch geschädigten Zuständen einschließlich bösartiger Erkrankungen, Thymusaplasie oder -dysplasie, Rheumatoidarthritis ustu.

Protokoll: Lymphocyten wurden aus menschlichem peripheren Blut auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten abgetrennt (vgl. A. Boyun, "Scan.3.Clin.Lab.Invest.", Bd. 21: Zusatz 97 (1968)). T-Lymphocyten wurden durch spontane Rosettenbildung mit Schafserythrocyten identifiziert (vgl. Z. Bentwich et al "Clin.Immunol.Immunopath,", Bd. 1, Seite 511 (1973)). Eine V/eränderung von + 10 % (auf einer Skala von 100 %) wurdB als signifikant angesehen. Es wurden die folgenden Daten erhalten:

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Einfluß won menschlichem Präalbumin (Hormon entsprechend Stufe 3 der Tabelle von Beispiel 2) in vitro auf dBn Prozentsatz spontan Rosetten bildender Erythrocyten (ti) Zellen in peripheren Blutlymphocy ten normaler Individuen und Patienten mit morbus Hodqkin

Lymphocyten von anfängl.Prozent- + 50 /ug + Inhibitor- + RI5* + 50 /ug 7 normalen Indi- satz an E-Rosett. ^u""—^¹" mi,n«^ai/4. ur.„mr,n / viduen

1 2	70 65
3	61
σι 4 ο co 5	66 66 68
^ 7	72
-* Lymphocyten von ^6 Patienten mit ^ morbus Hodgkin 1	67
2	62
3	48
4	55
5	62
6	43

+ 50 /ug Hormon	+ Inhibitor- Milzextrakt (RIS)*	+ RIS* + 50 Hormon
70 65	n.d.** n.d.	n.d.** n.d.
68	n.d.	n.d.
55	n.d.	n.d.
60	47	68
69	48	64
69	50	71

n.d. · n.d. n.d. n.d. 66
54 ^

* =10 ug Protein/Bestimmungsröhrchen _λ

** = nicht durchgeführt ⁵^

66	n.d.
72	n.d.
70	n.d.
70	n.d.
78	43
70	50

Die abigen Ergebnisse legen nahe, daß die in vitro Bebrütung abgetrennter peripherer Blutlymphocyten von Patienten mit einem niedrigeren als normalen Prozentsatz an spontan Rosetten bildenden E Zellen mit dem menschlichen Präölbuminpräparat den Prozentsatz dieser Zellen erhöht. Diese Daten wurden interpretiert als Anzeichen, daß eine unzureichende Thymushorrnonkonzentration die Grundlage für die niedrigere Anzahl Rosetten bildender E Zellen bei diesen klinischen Erkrankungen ist. Im Gegensatz dazu sind bei den Patienten offenbar Vorlauferzellen anwesend, da die Bebrütung dieser Zellen mit zugefügtem menschlichen Präalbuminpräparat die Anzahl der spontan Rosetten bildenden E Zellen erhöhte.

Patienten mit morbus Hodgkin zeigen häufig niedrigere als normale Zahlen spontan Rosetten bildender E Zellen. Die obigen Daten zeigen, daß die peripheren Lymphocyten von 5 aus 6 morbus Hodgkin Patienten nach Bebrütung mit menschlichem Präalbuminpräparat eine wesentliche Erhöhung des Prozentsatzes an spontan Rosetten bildenden E Zellen zeigten.

Weiterhin wirkte das menschliche Präalbuminpräparat der Inhibitorwirkung eines Milzextraktes von Hodgkin-Patienten auf die Anzahl spontan Rosetten bildender E Zellen in den peripheren Blutlymphocyten normaler Individuen und in einem Patienten mit morbus Hodgkin entgegen.

Beispiel 8

In vivo Wirksamkeit von menschlichem Präalbuminpräparat Der in Beispiel 2 ausgeführte Versuch mit Rosetten bildenden Zellen wurde auch in Versuchen angewendet, bei welchen ein hochgradig gereinigtes menschliches Präalbuminpräparat (entsprechend

60984?/ 1012

Stufe 6 der Tabelle von Beispiel 2) in vivo verabreicht wurde. Dabei wurde wie folgt verfahren:

Das zu unteruschende Präparat wurde normalen erwachsenen C57B1/6 Mäusen mit einem Alter vun 6-8 Wochen verabreicht, die 2 Wochen vor dem Uersuch thymektomisiert morden waren. An jeweils drei aufeinanderfolgenden Tagen wurden tägliche Injektionen intraperitoneal in Dosen von 2-4 /ug pro Maus gegeben.

24 Stunden nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet, die Milzen schnell entfernt, es wurden Zellsuspension«?n hergestellt und im Rosettenversuch verwendet. Dabei erhielt man die folgenden

Daten:

Endpunkt

normale, nicht thymektomis.f-1aus 0,78 /ug Azathioprin

thymektomis., mit Kochsalzlösung

injiz. Maus 25 /Ug Azathioprin

thymektomis., mit 2 .ug Präparat

injiz. Haus ' 0,195 /Ug Azathioprin

thymektomis., mit 4 /ug Präparat

injizi. Maus ' 0,058 /Ug Azathioprin

Die obigen Daten zeigen, daß den Milzzellen thymektotnisierter Mäuse die immunologische Fähigkeit durch Verabreichung des Präparates wiedergegeben wurde. Es wird darauf hingewiesen, daß die Injektion des gereinigten menschlichen Präalbuminpräparates den Milzzellen thymektomisierter Mäuse eine Sensibilität gegen die Inhibitorwirkung von Azathioprin, bezogen auf die Anzahl Rosetten bildender Milzzellen, gleich derjenigen von Milzzellen normaler Mäuse wiedergab. Die absolute Wirksamkeit des in diesem Uersuch verwendeten Präparates beträgt beim in vitro Uersuch 0,4 ng.

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Beispiel 9

Andere Reinigung von menschlichem Präalbumin aus Cohn IV-1 Fraktion 100 g (Naßgeuiicht) Cohn IV-1 Fraktion UJUrden mit 500 ecm dest. Wasser 4 Stunden bei 2-5 C. gerührt. D?nn wurde die Suspension' lyophilisiert und lieferce eitua 40 g eiries trockenen Pulvers. Dieses Material wurde dann in 1000 ecm 50 mM Tris-100 mM Natriumchlorid - 0,02 % Natriumazid-Puffer, pH 8,0, gelöst und 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde die Leimung bei 120.00 χ g 30 Minuten bei 2-5°C.zentrifugiert. Die klare grünliche überstehende Flüssigkeit in einem geeigneten, von Eis umgebenen Behälter wurde dann zu 40 % mit Ammoniumsulfat (durch Zugabe von 243 g Ammoniumsulfat zu 1000 ecm der überstehenden Flüssigkeit) gesättigt. Die Suspension wurde sich über Nacht bei 5 C. absetzen gelassen und der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt. Dann luurde die überstehende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat zu 60 % gesättigt, indem man 132 g Ammoniumsulfat zu 1000 ecm der überstehenden Flüssigkeit zugab und den Niederschlag wie oben aammelte. Dieser uiurde dann im Mindestvolumen kaltem dest. Wasser gelöst und in der Kälte erschöpfend gegen dest. Wasser dialysiert und lyophilisiert, wodurch man 17 g Material erhielt.

Das obige Material wurde in 1-g-Aliquoten auf eine 5 χ 90 cm Sephadex G-150 Kolonne (gesamtes Bettvolumen ¹760 ecm), die mit 50 mM Tris -100 mM Natriumchlorid - 0,02 % Natriumazid, pH 8,0, äquilibriert mar, gegeben, und die Kolonne mit demselben Puffer eluiert. Das im Molekulargeujichtsbereich von 40 000-70 000 DaI-tons eluierende Material uiurde gesammelt, durch Diafiltration durch eine UM-10 Amicon Membran bei 4,9-5,6 cm / kg Stickstoffdruck entsalzt und lyophilisiert. Das insgesamt aus allen

'609 842/10 12

1_g_\/_ersUchen auf der Sephadex-Kolonne erhaltene Material betrug

Nach erneuter Chromatographie dieses Materials in 1-g-Aliquoten wie oben unter Verwendung derselben Sephadex-Kolunne und anschließender Diafiltration und Lyophilisierung "Jie oben erhielt man 2 g Material.

Die folgende Tabelle zeigt das Gewicht des Materials und seine Wirksamkeit im in vitro Rosetten Versuch gemäß Beispiel 2.

Material	Trockengew. Q	Wirksamkeit -Roset tenversuch; /Ug
Cohn IV-I Fraktion	40	12
40-60 >q Ammoniumsulfat- niederschlag	17	1,6
G-150, Fraktion 3	4	0,2ü
G-150, Fraktion 3, Wiederholung	2	0,02

Das Material aus dem obigen Verfahren kann wie in Beispiel 1 einer präparation Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Chromatographie auf einer Mikrokolonne unteriuorf en werden und liefert das srfindungsgemäße, von Verunreinigungen praktisch freie Material, das beim in vitro Resetten-Versuch gemäß Beispiel 2 eine Wirksamkeit von etwa 0,2-1,0 ng zeigt.

Beispiel 1_0

In vitro Wirkung von menschlichem Präalbumin auf die beschleunigte Reifung immunologisch fähiger Zellen

Unreife Thymocyten von normalen Mäusen sind gewöhnlich keine T Zellen mit wesentlicher cytotoxischer Wirksamkeit. Die beschleunigte Reifung dieser Thymocyten zu Lymphocyten mit cytotoxischer Wirksamkeit ist ein Zeichen der verbesserten immunologischen Fähigkeit.

609 8 42/1012

Protokoll: 1 χ 10 Thymocyten von C57B1/6 Mäusen wurden mit 5 χ 10 bestrahlten Balb/c Mäusemilzzellen mit und ohne 5 /ug Material entsprechend der letzten Stufe der Tabelle von Beispiel 9 oder 5 /U BSA 5 Tage lang gezüchtet. Die Cytatoxizität wurde auf P815 Y(H-2 ) Zellen gemessen, die mit " _Cr gekennzeichnet waren.

/o Cr Freisetzung Thymocyten + Balb/c + 5 /Ug BSA . 15

Thymocyten + Balb/c + 5 /Ug menschl. Präalbuminpräparat ' 45

Die Daten zeigen, daß Lymphoidzellen, die normaleru/eise keine cytotoxische Wirksamkeit zeigen, aufgrund ihrer in vitro Behandlung mit menschlichem PräalDuminpräparat eine deutliche Cytotoxizität entwickeln.

Beispiel 1J_

Wie im obigen Beispiel 5 gezeigt, sind Lympnaidzellen "nackter" Mäuse gewöhnlich immunologisch nicht ansprechend. Nun wurde die Wirkung eines menschlichen Präalbuminpräparates auf die Bewirkung eines immunologischen Ansprechens von in vitro bebrüteten Milzzellen nackter Mäuse durchgeführt. Das Versuchssystem war die gemischte Lymphocytenreaktion von Beispiel 4.

Protokoll: 5x10 Milzzellen von nu/nu Mäusen (Balb/c Grundlage) wurden mit 5 χ 10 bestrahlten F₁ (BaIb χ C57/K6) Mäusemilzzellen 3 Tage gezüchtet, wobei während der letzten 4 Stunden mit Tritium behandeltes Thymidin zugefügt wurde. Es wurde eine Konzentration von 2 /ug/Röhrchen menschliches Präalbuminpräparat (Hormon) entsprechend der letzten Stufe der Tabelle von Beispiel 9 verwendet. Die Werte sind der Durchschnitt + S.E. von drei Versuchen.

60984?/101?

Zellquelle syngen allogen

Hormon BSA Hormon BSA

nu/nu Milz 1241+74 1027+95 6725+75 1567+67

Die Daten zeigsn., daß - obgleich Milzzellen nackter Mäuse, die' mit RindtfrserumalbuTiin bebrütet sind, in der gemischten Lymphocytenreaktion nicht ansprechen - ähnliche, mit 2 /ug Hormonpräparat pro 5 χ 10 Milzzellen bebrütete Zellen den Zellen tatsächlich die Fähigkeit tür Wirkung in der gemischten Lymphocytenreaktion verliehen. Somit wandelte das Hormon immunologisch nicht ansprechende Zellen in Zellen mit immunologischer Wirteamk-'.ifc um.

Beispiel 1_2

Lymphocyten-autosensibilisierung in vitro

Wenn man Lymphoj-dz-llen eines Tieres in vitro oder in einer geschlossenen Kammer mit Nicht-Lymphoidzellen desselben Tieres bebrüten läßt, dann tritt da.s als Autosensibilisierung bezeichnete Phänomen auf. Das heißt, die immunologisch aktiven Lymphoidzellen können erkennen, daß die andere Zellart nicht identisch, sondern in diesem Sinn fremd ist. Die Tatsache, daß die eintritt, kann untersucht werden, indem man das Maß an Cytotoxizität dieser sensibilisierten Lymphocyten auswertet. Dies erfolgt durch Messen des Ausmaßes an Lysis oder "Abtätung" von Zellen (Zielzellen), gegen welche die Lymphocyten sensibilisiert worden sind, indem man die sensibilisierten Zellen mit den mit einem Isotop, gewöhnlich eines radioaktiv gekennzeichneten Chromsalz, gekennzeichneten Zielzellen mischt. Nach der Bebrütung und aufgrund der Lysis der Zielzellen wird die Radioaktivität der gekennzeichneten Zellen in das Medium freigesetzt, wo ihre Menge gemessen werden kann. Der Prozentsatz an freigesetzter Gesamtradioaktivität wird als Haß für die Cytotoxizität der sensibilisierten Lymphoidzellen angenommen (vgl.

M. Takasugi und E.Klein "Transplantation", _9:219 (1970)).

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J nachträglich 1

Protokoll: Herstellung von peripheren Blutlymphocyten Die Lymphocyten wurden vom Gesamtblut nach dem Verfahren des Ficoll-Isopaque-Gradienten entfernt (vgl. A.Boyoum "Scand.G.Clin. Lab.Inv." Bd. 21, Zusatz 97, Seite 77 (1968)). Kulturmedien; Fibroblastmonnschichen und Zielzellen wurden in Earle's Medium plus 10 % Kalbsfötusserum (Gibco) gezüchtet. Die Lymphocytensensibilisierung und Cytotoxizitätsuntersuchung erfolgten in RPMI 1640 Medium (Gibco), das mit 10 % menschlichsm, AB positivem Serum, 2 mM Glutamin und 4 mM Hepes Puffer (Gibco) ergänzt war.

In vitro Sensibilisierunq der Lymphocyten: Normale, zwischen ihrem dritten und zehnte-, in vitro Durchgang verwendete Hautfibroblasten wurden in Kuxturflaschen aus Kunststoffgewebe (25 cm , Falcon, Oxnard, USA) eingesetzt. Kurz bevor sie zusammenliefen, wurden die Monoschichten mit einer Röntgenstrahlenmaschine (Siemens, stabilipan 15 mA, 22 KU, Filter Al 1 mm, Dosis 362 R/min, Abstand 40 cm) bestrahlt (4000 R). Aliquote der Lymphoidzellen (von 1q bis 1,5 χ 10 ) wurden in die Flaschen mit und ohne Monoschichten gegossene Das Kulturmedium wurde am Tag 3 ersetzt. Am Tag 6 wurden die Lymphocyten durch Pipettieren gewonnen und mit frischem Medium gewaschen. Nur ein geringer Prozentsatz der Lymphoidzellen blieb fest an die sensibilisierende Monoschicht gebunden. Die gesammelten Lymphocyten wurden zweimal gewaschen und zur Bestimmung ihrer Uiabilität in Anwesenheit von Trypanblau gezählt.

Durch Zellen vermittelte Cytotoxizitätsbestimmunq: Die Lymptricyten wurden nach dem Verfahren von M. Taka|uS* und E.Klein "Transplantation", Bd. 9, Seite 219 (1970) getestet. 400 Zielzellen

("well") (Hautfibroblasten) wurden in ein Volumen von 20 /ul pro Loch /

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eingeführt. Nach Bebriitung über Nacht mären 50 % der Zellen gebunden. Die Lymphocyten wurden in ein Uolumen von 20 ,ul gegeben und die Reaktion nach 48 Stunden abgebrochen. Die Anzahl der verbleibenden Zielzellen wurde nach Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, Fixieren mit Methanol und Anfärben der Platten mit "Giemsa" (Gibco) festgestellt. Die Zellanzahl in den Löchernm die vorher ohne die sensibilisierenden Monoschichten gezüchteten Lymphocyten ausgesetzt waren, wurde als Grundlage für die Auswertung der Cytotoxizität angenommen. Die Zellanzahl in mit sensibilisierten Lymphocyten beimpften Löchern und in solchen mit Kontrollmedium wurde mit diesem Wert verglichen.

Die Wirkung des "Hormons" (entsprechend de^ Präparat von Stufe 4 der Tauelle in Beispiel 2) auf die oben beschriebene Autosensibilisierung wurde wie folgt getestet?

10 yug Hormon in 0,1 ecm RPMI 1640 Medium wurde zu Sensibilisierungsflaschen zugefügt, die 4 ecm Kulturmedium enthielten.

In den ersten beiden Untersuchungen (CC.) war das Hormon während der 6-tägigen Sensibilisierung anwesend. Beim verbleibenden Versuch (G.K.) war das Hormon nur während der ersten 3 Tage anwesend, dann wurde das Medium ersetzt. Die Lymphocyten wurden entfernt und wie oben auf ihre cytotoxische Wirkung getestet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

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Lymphoc. sensib. Zugabe
Ursprung Fibro- won

Ι/Γ

200/1

Zellanzahl/Loch

L/T : 100/1

L/T ; 50/1

Durch- Durch- Durch-

blasten Hormon* sehn.+S.E. % Vermind. sehn.+S.E. % Vermind. sehn.+S.E. % Vermind.

	CC	.** CC	P	cc
	CC		P	—
	CC	•	P	cc
	CC	ti	P	cc CK..
6098.	cc cc CK	*	CK.
	CK		--
	CK	.	<0,001
O	XXX	<0,01
ro	XX	<0,05
	X	£0,05

587 + 17	4	427+27	ry si λ r\	505+21	7
730+41		544+25	0	531+21	2
760+13	3	542+17		544+18
736+33		543+44	0	554+ θ.	-2
360+31	5	333+29	7ΛΛΛΛ	446+24	A Q Λ Χ
504+39		503+36	-2	544+11	0
529+36	₃₂xxx	491+18		522+23
330+18	10	228 + 16	17*	353 + 14	₁₇χχ
432+17		249+13	10	459+17	3
482+30	276+¹IIi		474+23

* 10/ug Hormon im Sensibilisierungsloch bilsierung in l/ersuch 1 und 2 anwesend der ersten 3 Tage anwesend

■** Kennzeichnung der Spenderzellen § Verhältnis von Lymphocyten/Zielzellen

während 6-tägiger Sensiin l/ersuch 3 nur mährend

Aus den Daten geht herv/or, daß die Zugabe uon 10 yug des Hormonpräparates entweder während der gesamten 6-tägigen Sensibilisierung oder nur während der ersten 3 Tage derselben zu den Löchern in beiden Fällen das Auftreten cytotoxiocher Zellen verhinderte. Das heißt, daß das Hormonpräparat das Auftreten des Autosensibilisierungsphänomens abblockte. Die Daten zeigen dj.e potentielle Verwendbarkeit des Präparates bei der Verhinderung oder Besserung eines andauernden Autosensibilisierungsverfahrens, das ein etiologischer Faktor bei Autoimmunerkrankungen sein kann.

Beispiel 1_3

Lymphocytenautosensibilisierung in vivo

Protokoll: Es wurde das l/erfahran von Beispiel 12 zur Untersuchung der Wirkung des Hormonpräparates auf die in vivo Autosensibilisierung angewendet. Weiter wurde die wesentliche Rolle der Thymusdrüse und ihrer Hormone untersucht, die diese Autosensibilisierung beeinflussen. Das l/erfahren unterscheidet sich von der obigen in vitro Autosensibilisierung, indem die Autosensibilisierung erreicht wurde, indem man die Zielzellen (MC57M Fibrosarkomtumcrzellen von Mäusen desselben Stammes), die mit Gastmilzzellen gemischt waren, in eine zellimpermeable Milliporenkammer gab und diese dann in die Peritonealhöhlung von normalen C57B1/6 Mäusen oder Mäusen desselben Stammes einsetzte, die im Alter von 1 f-ionat thymektomisiert worden waren. Das Hormonpräparat wurde in vivo verabreicht; 20 ug wurden 1 Stunde vor und 6 Stunden nach der Kammerimplantation und dann jedem Tag bis zum Tag 4 der Sensibilisierung injiziert. Am Tag 5 wurden die Tiere geschlachtet: die Zellen, meist Lymphocyten, wurden aus jeder Kammer gewonnen

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und unter Verwendung von mit Cr gekennzeichneten Fibroblasten (von Mäusen desselben Stammes) als Zielzellen auf Cytotoxizität untersucht. Es uiurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Kammer füllung Zellanzahl/Lach % Verminderung

Durchschn.+S.E.

Tx + Hormon* - 429+13 -2⁺

Tx 294+ 7 . · 30⁺⁺⁺

intakt (Geschwister

desselben Wurfes) 393+ 9 6⁺

b 420+20

a + + + ρ < 0,001; ■-+ P <0,01; + P > 0,05

b es wurden frisch hergestellte Milzzellen als Kontrollen
verwendet

* entsprecnend Stufe 4 der Tabelle von Beispiel 2

Die obigen Daten zeigen, daß die in vivo Injektion des Hormonpräparates bei thymektomisierten Mäusen die Entwicklung einer
Autosensiblisierung der Lymphocyten von Mäusefibrosarkomzellen enthaltenden Kammer wirksam abblockte. Diese Daten zusammen mit den obigen Beispiel für das Abblocken der in vitro Autosensibilisierung durch das Hormon zeigen weiter die potentielle Brauchbarkeit des Hormonpräparates bei Erkrankungen beim Menschen, in welchen eine etiologische Komponente die Autoimmunisation, d.h. die Unfähigkeit, sein "Selbst" zu erkennen, ist.

Beispiel 1_4

Es folgen repräsentative pharmazeutische erfindungsgemäQe Präparate (pro Dosis), dargestellt für ein Präparat entsprechend
der letzten Stufe der Tabelle von Beispiel 9.

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A. menschliches Präalbuminpräparat Natriumchlorid

Wasser zur Injektion q.s.

B. menschliches Präalbuminpräparat

monobasisches Natriumphosphatmonohydrat dibasisches Natriumphosphat Natriumchlorid

Wasser zur Injektion q.s. .

C. menschliches Präalbuminpräparat Mannit

Wasser zur Injektion q.s*

D. menschliches Präalbuminpräparat monobasisches Natriumphosphatmanohydrat dibasisches Natriumphosphat Mannit

Wasser zur Injektion q.s.

Alle festen Bestandteile uiurden in Wasser gelöst und in einer sterilen Phiole lyophilisiert. Vor der Verabreichung wurde Wasser zum Lösen der Feststoffe zugefügt. Für zu mehrfachen Dosen verwendbare Phiolen wird es bevorzugt, daß man Wasser verwendet, das ein Konservierungsmittel, wie 1,2 mg Methylparaben/ccm und 0,12 mg Propylparaben/ccm, enthält. Rekonstituierte Präparate können bei 4⁰C. bis zu 2 Wochen gelagert u/erden.

26	12015	25 mg	ecm
1,0	mg	1,0
9,0	mg
1,0	ecm
1,0	mg
5,4	η, «3
8,66	mg
2,52	mg
1,0	ecm
1,0	mg
100	mg
1,0	ecm
1,0	mg
5,4	mg
3,66	mg

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Claims

Patentansprüche

i,- Pharmazeutisches Präparat zur Erhöhung deX immunologischen Abwehr, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an menschlichem Serum-Präalbumin in Miscnung mit einem nharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger.

f2>- Verfahren zur Herstellung eines uon Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte menschliche Blutfraktion

a. einer molekularen Filtration auf einem Kohlfaser-fraktionator zwecks Ausschluß eines Material mit einem Molekulargewicht über etwa 6C-7Q QOQ Daltons und unter etwa 10 QOu Daltons;

b. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidgelkolonne,

die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert ;

c. einer Wiederholung der Stufe .(b) oder einer Freiflußelektrophorese,

d. einer präparativen Gelelektrophorese auf einer Polyacrylamidscheibe und

e. einer Chromatographie auf einem Mikro-Polysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,

unterwirft.

3.- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn IV-1 Fraktion for Stufe (a) lyophilisiert wird.

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4.- l/erfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) das Material mit hohem Molekulargewicht vor dem
niedrig molekularen Material entfernt wird.

5,- Vorfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) und (e) als Polysaccharidgel ein vernetztes Dextran verwendet wird.

6,- Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daiJ in Stufe (b) und (e) ein Eluierungspuffer mit ainem pH-Wert zu/ischen etwa 7,8-8,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen
etwa 0-1D⁰C. liegt.

7.- Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) eine Wiederholung von Stufe (b) ist.

8.- Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Freiflußelektrophorese in Stufe (c) bei einem pH-Wert zwischen etu/a 5,0-5,5 angewendet wird.

9.- Verfahren nach Anspruch 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) die präparative Palyacrylamidscheiben-Gelelektrophorese ein Separatnrgel und einen Eluierungspuffer mit einem
pH-Wert zwischen etwa 8,5-9,5 verwendet.

10,- Verfahren nach Anspruch 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß

die gewünschte(n) Fraktion(en) aus jeder Stufe durch Bezug auf

den Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder durch

Bestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wild (werden)

11.- Verfahren zur Herstellung eines von cytotoxischen Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte
menschliche Blutfraktion

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a. einer molekularen Filtration auf einem Hohlfaserfraktionator zum Ausschluß des Materials mit einem Molekulargewicht über etwa 60-70 000 Daltons und unter etwa 10 000 Daltons und

b. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidyelkülonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,

unterwirft.

12,- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn IW.1 Fraktion vor Stufe (a) lyophilisiert wird.

13.- Verfahren nach Anspruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) das Material mit hohem Molekulargewicht vor dem niedrig molekularen Material entfernt wird.

14.- Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein vernetztes Dextran als Polysaccharidgel verwendet wird.

15.- Verfahren nach Anspruch 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein Eluierungspuffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-8,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen etwa 0-10⁰C. liegt.

16,- Verfahren nach Anspruch 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die gewünschte(n) Fraktion(en) aus jeder Stufe durch Bezug auf den Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder Bestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wird (weiden).

17.- Verfahren zur Herstellung eines von Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte mensdiiche Blutfraktion

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a. einer Ammoniumsulfatfraktionierung,

b. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten ncch dem Molekulargewichtfraktioniert,

c. einer Wiederholung von Stufe (b) oder einer Freiflußelektrophorese,

d. einer präparativen Polyacrylamidscheiben-Gelelektrophorese und

e. einer Chromatographie auf einer Mikropolysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,

unterwirft.

18,- Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn-IV-1 Fraktion vor Stufe (a) lyophilisiert wird.

19,- Verfahren nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) die Arnmoniumsulfatfraktionierung die aufeinander folgende Zugabe von Ammoniumsulfat zu einer Lösung aus roher oder lyophilisierter Cohn-IV-1 Fraktion in u/ässrigem Puffer bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-8,2 und einer Temperatur zwischen etwa 0-5 C, wobei jede derartige Zugabe zur Bildung eines Niederschlag und einer überstehenden Flüssigkeit führt» und die Abtrennung des Niederschlages von der überstehenden Flüssigkeit nach jeder Zugabe umfaßt.

20.- Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Niederschlag aus einer Ammoniumsulfatzugabe, die den Ammoniumsulfatgehalt der wässrigen Lösung von etwa 40-^igac auf etwa 60-;bige Sättigung erhöht, in der nächsten Stufe verwendet wird.

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21.- Verfahren nach Anspruch 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) und (e) ein vernetztes Dextran als Polysaccharidgel verwendet i"ird.

22,- l/erfahren nach Anspruch 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) und (e) ein Eluierungspuffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-8,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen etwa 0-10°C. liegt.

23,- Verfahren nach Anspruch 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe (c) eine Wiederholung von Stufe (b) ist.

24,- Verfahren nach Anspruch 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) d.i°. präparative Polyacrylscheiben-Gelelektrophorese ein Separatargel und ein en Eluierungspuffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 8,5-9.5 verwendet.

25.- Verfahren nach Anspruch 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Stufe (a) und nach Stufe (b) erhaltene Material vor der Verwendung in der nächsten Stufe entsalzt und lyophilisiert wird.

26,- Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Stufe (a) erhaltene Material durch Dialyse entsalzt und das nach Stufe (b) erhaltene f.aterial durch Diafiltration entsalzt mird,

27.- Verfahren, nach Anspruch 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die gewünschte(n) Fraktion(en) aus jeder Stufe durch Bezug auf den Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder Bestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wird (werden) .

609842/101?

28.- Verfahren zur Herstellung eines von cytotoxischen Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet daßmman die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte mensch-1iche Blutfraktion

a. einer Ammoniunisulfatfraktionierung und

b. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,

unterwirft.

29,- Uerfehren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn IV-1 Fraktion vor Stufe (a) lyophilisiert wird.

30,- Verfahren nach Anspruch 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) die Ammoniumsulfatfraktionierung die aufeinander folgende Zugabe von Ammoniumsulfat zu einer Lösung aus roher oder lyophilisierter Cohn IV-1 Fraktion in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 7,3-8,2 und bei einer Temperatur zwischen etwa 0-5°C, wobei jede Zugabe zur Bildung eines Niederschlages und einer überstehenden Flüssigkeit führt, und die Trennung des Niederschlages von der überstehenden Flüssigkeit jeder Zugabe umfaßt.

31.- Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der aus einer Ammoniumsulfatzugabe, die den Amrnoniumsulfatgehalt der wässrigen Lösung von etwa 40 % Sättigung auf etwa 60 % Sättigung erhöhte, erhaltene Niederschlag in der nächsten Stufe verwendet wird.

32,- Verfahren nach Anspruch 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein vernetztes Dextran als Polysaccharidgel ver-

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wendet wird.

33.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein Eiuierungspuffer p>it einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-b,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen etwa 0-10 0-10⁰C. liegt.

34.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe (b) zwei Mal nacheinander durchgeführt uiixd.

35.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Stufe (a) und das nach Stufe (b) erhaltene Material vor Verwendung in der nächsten Stijfe entsalzt unü lyophilisiert wirde

36.- Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das

nach Stufe (a) erhaltene Material durch Dialyse entsalzt und das

nach Stufe (b) erhaltene Material durch Diafiltration entsalzt wird.

37.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß die aus jeder Stufe gewünschte(n) Fraktion(en) durch Bezug auf den Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder Bestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wird (werden).

Der Patentanwalt:

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