DE2612015A1 - Arzneimittel zur erhoehung der immunologischen abwehr und verfahren zur herstellung von menschlichem serum- praelabium - Google Patents
Arzneimittel zur erhoehung der immunologischen abwehr und verfahren zur herstellung von menschlichem serum- praelabiumInfo
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Description
Arzneimittel zur Erhöhung der immunologischer Abwehr
und Verfahren zur Herstellung von .nenschlichcm
Serum-Präarpumin \
Die Thymusdrüse ist als Endocrindrüse bekannt, die eine wesentliche
Funktion im immunologischen Abwehrsysteni der Körpers hat.
Neuerdings wurde gezeigt, daß rohe Extrakte von Kälberthymusdrüsen
eine als Thymosine bezeichnete Familie von Hormonen enthält,
die Molekulargewichte zwischen etwa 3200-70 000 Daltons
haben. (Vgl. z.B. N. Trainin "Physiological Reviews", Bd. 54, Sei Seite 272 (1974) und A. White "Ann.N.Y. Acad.Sci.", Bd. 29,
Seite 253 (1975).
Es wird angenommen, daß diese Hormone wirken, indem sie die Reifungsgeschwindigkeit
untauglicher ("incompetent"), bisher unidentifizierter Vorläuferzellen zu brauchbaren Lymphocyten (Τ-Zellen)
regulieren und so wirksame Abwehrmittel gegen fremde Eindringlinge werden. Weiterhin werden Vorläuferzellen anderer Arten,
wie Erythroid, in ihrer Produktion und Reifung durch Thymosinpräparate stimuliert. Neuerdings wurde ein relativ roher
60984?/ 101?
thymosinhaltiger Kälberthymusextrakt zur Erhöhung der immunologischen
Fähigkeit eines jungen Mädchens mit angeborener, gestörter Immunität .verwendet (vgl. D.W. Wara et al "Wem Eng. 3. Fled.", Bd.
292, Seite 70 (1975)). Ein neuerer Bericht hat uieittr die Verbesserung
im hämatologischen Gesamtzustand (erhöhte Anzahl weißer und roter Zellen) bei mit einem Thymosinpraparat behandelten Patienten
beschrieben (vgl. 3. Alexsandrowicz et al "Proc.Intl.
Congress Immunol.", Brighton, England, 22.-24. 3uli 1974).
Weiter wurde berichtet (vgl. z.B. 3.F. Bach et al "Immunology",
Bd. 25, Seite 353 (1973)), daß in frischer; Schweineblut eine
thymosinartige Wirksamkeit festgestellt worden ist. Der dafür verantwortliche
Faktor hat vermutlich ein !Molekulargewicht von etwa
1000 Daltons.
Die vorliegende Erfindung richtet sich Verfahren und pharmazeutische
Präparate, die zur Erhöhung der immunologischen Stärke bzw. Fähigkeit geeignet sind.
In den Prioritätsanmeldungen Ser.Na 561 409 und 597 116
wird die Isolierung und Kennzeichnung eines Proteins mit thymushormonartigen
Eigenschaften einer erhöhten immunologischen Fähigkeit beschrieben. Es wird angegeben, daß dieses Protein
ein Molekulargewicht von etwa 56700 Daltons und etwa das folgende Verhältnis von Aminosäuren hat:
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Aminosäure M0I-/O
Asparaginsäure | 6,6 | und es ist aus v/ier Unter |
Threonin | 9,5 | |
Serin | 9,3 | |
Glutamin-säure ί | iü,3 | |
Prolin | 6,6 | |
Glycin | 8,3 | |
Alanin | 9,7 | |
1/2 Cystin | 0,9 | |
Ualin | 9,5 | |
Methionin | 0,7 | |
Isoleucin | 4,0 | |
Leucin | 5,9 | |
Tyrosin | 2,3 | |
Phenylalanin | 3,9 | |
Tryptoohan | 1,u | |
Lysin | 6,3 | |
Histidin | 3,1 | |
Arginin | 3,2 | |
Das genannte Protein hat uieiter Glycin | und Histidin als N-end- | |
ständige Aminosäuren, einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,0 | ||
(dfi^-nun als etwa 4,5 bestimmt wurde), | ||
einheiten zusammengesetzt. |
Es uiurde nun weiter gefunden, daß dieses Protein
identisch ist mit menschlichen Serumpräalbumin, einem in menschlichem
Serum natürlich vorkommenden Protein, das bereits isoliert, gereinigt und durch- Aufstellung der Aminosäuresequenz
identifiziert worden ist (vgl» Y. Kautia, "3.Biol.Chem.", 249,
6796-6805 (1974)).
Die Identifizierung des vorliegenden Proteins als menschliches
Präalbumin erfolgte durch einen Vergleich seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften mit einer im Handel verfügbaren
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Probe und durch Querreaktionsfähigkeit mit menschlichem Präalburninantikörper.
Obgleich menschliches Präalbumin bereits Geschrieben u/urde, wurde
gelehrt, daß es nur als spezifischer Träger für verschiedene ausgewählte kleinere Moleküle wirkt, und es ist nicht erkannt worden,
daß es irgendeine intrinsische biologische Wirksamkeit zeiqt. Überraschenderuieise wurde nun gefunden, daß menschliches Präalbumin
starke thymushormonartige Eigenschaften zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit hat. Die Untersuchung handelsüblicher
Proben von menschlichem Präalbumin in ausgewählten biologischen Versuchen, die im folgenden beschrieben werden, zeigt tatsächlich,
daß diese Materialien die oben genannte, biener unerkannte biologische
Wirksamkeit besitzen.
Die vorliegende Erfindung richtet sich daher einerseits auf ein Verfahren zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit durch Verabreichung
einer wirksamen Menge von menschlichem Serumpräalbumin an einen Patienten, der dieser Behandlung bedarf.
Die vorliegende Erfindung richtet sich weiter auf pharmazeutische Präparate zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit, die eine
therapeutisch wirksame Menge an menschlichem Serumpräalbumin in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen
Träger enthalten.
Außerdem richtet sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Isolierung und Reinigung von menschlichem Serumpräalbumin aus der
menschlichen Blutfraktion Cohn IV-1.
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Die in der vorliegenden Anmeldung verwendete Bezeichnung "immunologische
Fähigkeit" bedeutet das Maß des Ansprechens der die Immunität umfassenden physiologischen Mechanismen. Die Immunität
verleiht ihrem Träger dir! Fähigkeit zum Neutralisieren. Eliminieren
oder Umwandeln fremder Materialien, u/ie Bakterien, Viren und
Fungi sowie Zellen anderer Lebewesenarten ohne Schaden für den Träger.
Diese Bezeichnung ist in der Immunologiewissenschaft bekannt und
akzeptiert (vgl. z.B. G.A. Bellanti "Immunology", W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa. (1971)). Man kennt z-juai breite Arten von
Immunität, nämlich die Humoralimminität auf der Basis der Produktion löslicher, zirkulierenden Antikörper, und die durch die Zellen
vermittelte Immunität, die auf der Produktion und dem Funktionieren spezifischer Arten von Lymphoidzellen (Lymphocyten) beruht.
Reife Lymphocyten nehmen souiohl an der Humoral- als auch an der
durch die Zellen vermittelten Immunität teil (vgl. P.G.H. Gell
und P.R.A. Coombs "Clinical Aspects of Immunology", 2.Aufl.,
F.A. Davis Co., Philadelphia (1968)j 3.F.A.P. Miller und D. Gsaba
"Physiological Reviews" 47, 137 (1967); N. Trainin "Physiological Reviews" _54, 272 (1974); A. White "Anm.N.Y.Acad.Soi." ,29, 253,
(1975)).
Ohne an irgendeinen Wirkungsmechnismus gebunden werden zu wollen
wird angenommen, daß das vorliegende Material wirkt, indem es sowohl
die Anzahl als auch die Geschwindigkeit der Reifung immunologisch fähiger Lymphocyten aus unfähigen Vorlauferzellen erhöht.
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Die Uerstärkung der immunologischen Fähigkeit kann durch verschiedene
Wege gezeigt werden, wobei sowohl in vitro als auch in vivo Untersuchungen an Kleintieren der in der Immunologietechnik
bekannten Art angewendet werden. Dabei können z.B. die folgenden Untersuchungen besonders erwähnt werden:
1. In vitro azathioprinsensitive Rosettenuntersuchung (in vitro
Rosettenuntersuchung)
2. in vivo azathioprin.-ensitive Rosettenuntersuchung
3. Antikörpersynthese in vivo
4. Antikörpersynthese in vitro
5. Proliferation von Lymphoidgewebe
6. Gemischte Lymphocytenreaktion
7. Blastogenese mil Concanavalin A
8. In vitro spontane Rosettenuntersuchung
9. Produktion cytotoxischer Lymphocyten
10. In vitro Autosensibilisierung mit Lymphocyten
11. In viso Autosensibilisierung mit Lymphocyten
Wie aus den Beispielen hervorgeht, ist erfindungsgemäß jede der
obigen Untersuchungen angewendet worden, um die Erhöhung der immunologischen Fähigkeit durch menschliches Präalbumin darzustellen.
Die obigen Untersuchungen beziehen sich auf eine oder mehrere der folgenden allgemeinen Klassen von klinischer Signifikanz, für welche
die immunologische Fähigkeit vermutlich ein Faktor ist:
Stimulierung der Antikörpersynthese (insbesondere Untersuchung 3
und 4)
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Ersatz- und Restorationstherapie (insbesondere Versuch 5-9)
Autoimmunerkrankungen (insbesondere Versuch 10 und 11).
Der Versuch für eine schnelle und genaue Anzeige der Wirksamkeit zur Erhöhung der immunologischen Fähigkeit ist die bekannte, oben
genannte in vitro -Rosettenuntersuchung (vgl. 3.P. Bach "Proc.Natl.
Acad.Sci. U.S.A.", Bd. 68, Seite 2334 (1971)), bei welchem die Sensibilität von rosettenbildenden Milzzellen gegen Azathioprin
/6-(1 -Methyl-4-nitro-5-imidazolyl)-mercaptopurin7 gemessen wird.
Dieser Versuch zeigt eine gute Korrelation mit der Anzahl immunologisch
fähiger Lymphoc/ten der T-Klasse. Diese Lymphocytenklasse
wirkt nämlich gemeinsam mit 3 Lymphocytan in der Antikörpersynthese,
und sie sind die Hauptzellen, die die durch die Zellen vermittelte Immunität regulieren. Es gibt viele Beu/eise für die
Bedeutung dieser Untersuchung zur Bestimmung des immunologischen Zustandes (vgl. 3.F. Bach "The Mode of Action of Immunisuppressive
Agents" North Holland/American Elsevier Publishing Co., Amsterdam/
New York, (1975)).
Somit kann menschliches Präalbumin klinisch zur Behandlung von Patienten in Fällen geeignet sein, so die immunologische Fähigkeit
als wesentlicher Faktor angenommen wird, z.B. Autoimmunerkrankungen
(luie Lupus erythematosus, ulcerative Colitis, autoimmune hämolytische
Anaemie, Thyrotoxicose, Rheumatoidarthritis, Lebercirrhose),
Thymusaplasie und -dysplasie, verstärkte Immunität bei infektiösen
Störungen (z.B. bakteriale, virale und fungale Störungen), morbus Hodgkin, hypogammaglobulinämisches Syndrom, besonderes
Wachstum von mißgebildeten Zellen ("aberrant cell proliferative conditions"),
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verminderte immunolgische Fähigkeit aufgrund eines zeitweiligen Absinkens der Hormonproduktion der Thymusdrüse, bei chemisch oder
radiologisch induzierten immuna-suppressiven Zuständen usiü.
Es wurde gefunuan, daß ein in der im folgenden beschriebenen Weise
hergestellten, von Verunreinigungen praktisch freies menschliches Präalbumin beim in v/itro Rosettenversuch eine Wirksamkeit unter
1 Nanogramm zeigt.
Obgleich es für viele Zwecke wünschenswert ist, praktisch reines menschliches Präablumin in einem zur therapeutischen Verabreichung
geeigneten Präparat zu verwenden, so macht es die mühsame Reinigung und Herstellung des reinen Materials in großen Mengen, die
mit einem erheblichen Verlust an Material und entsprechenden Kosten
und Mühen verbunden sind, zweckmäßig, für viele therapeutische Zwecke weniger reine, menschliches Präalbumin enthaltende Fraktionen
zu verwenden, vorausgesetzt, diese sind frei von cytotoxischen Verunreinigungen. So wurde gefunden, daß teilweise gereinigte
Fraktionen mit einer Wirksamkeit im in vitro Rosettsnversuch von etwa 0,01-0,20 Mikrogramm für therapeutische Zwecke
äußerst geeignet sind.
Menschliches Präalbumin entweder in praktisch reiner Form oder als Komponente einer teilweise gereinigten, von cytotoxischen
Verunreinigungen freien Fraktion kann in Form üblicher pharmazeutischer oder medizinischer Präparate durch Mischen mit pharmazeutisch
annehmbaren, nicht-toxischen Streckmitteln hergestellt werden. Das Material kann z.B. mit organischen oder anorganischen
inerten pharmazeutischen Trägern zur parenteralen Verabreichung,
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z.B. intramuskulär, subkutan oder intravenös, in Form von z.B. flüssigen Lösungen, Suspensionen usuj. in Einheits- oder unterteilten
Dosen gemischt werden.
Die das erfindungsgemäße Material enthaltenden pharmazeutischen
Präparate können den üblichen pharmazeutischen Maßnahmen, nie Sterilisation (z.C. durch Milliporenfiltration) unterworfen werden
und die üblichen pharmazeutischen Zusätze, wie Konservierungsmittel,
Stabilisatoren, Emulgatoren, Massen/Binde-Mittel, Salze zur Einstellung'des osmotischen Druckes oder Puffer, enthalten.
Die Präparate können auch andere therapeutisch wertvolle Materialien
oder Materialien enthalten, die die Wirkungsdauer der erfindungsgemäßen Verbindung verlängern. Die Verfahren zur Herstellung solcher
Dosierungsformen sind bekannt oder dem Fachmann offensichtlich.
Eine eingehende Zusammenfassung dieser Formulierungstechniken findet sich z.B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von
E.W. Martin. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der das erfindungsgemäße Material enthaltenden Formulierungen besteht in
der Rekonstituierung won lyophilisiertem menschlichem Präalbumin. So kann menschliches, in der im folgenden beschriebenen Weise
hergestelltes Präalbumin entweder allein oder mit anderen festen Streckmitteln sterilisiert und lyophilisiert werden und bis zum
Gebrauch in einer sterilen Ampulle gelagert werden. Unmittelbar vor der Verabreichung wird die gewünschte Menge an Lösungsmittel,
wie Wasser, wasserhaltige Konservierungsmittel oder eine Lösung verschiedener Streckmittel in Wasser, zum Lösen des menschlichen
Präalbumins zugefügt.
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In jedem Fall enthält das zu verabreichende pharmazeutische Präparat
eine zur Behandlung der betreffenden Erkrankung therapeutisch wirksame Menge an menschlichem Präalbumin.
Die Dosierungweise kann aus einzelnen oder geteilten i:osen bestehen,
ist in jedem Fall jedoch notwendj gerweise von den Bedürfnissen
des zu behandelnden Patienten und dem Urteil des behandelnder, Mediziners abhängig. Als allgemeine Richtlinie für die meisten
Zwecke ujird jedoch das erfindungsgemäöe, praktisch reine Material
in einer Menge von etwa 10 pg/kg/Tag bis etuia 20 /ug/ kg/Tag, vorzugsweise
etwa 100 pg/kg/Tag bis etwa 3 ,-ug/kg/Tsg, verabreicht.
Anders ausgedrückt würde dies für einen durchschnittlichen erwachsenen Patienten (70 kg) etwa 0,7 ng/Tag bis etwa 1,4 mg/Tag,
vorzugsweise etwa 7 ng/Tag bis etwa 0,2 mg/Tag, betragen; man kann,
die Dosierung auch aufgrund der Ergebnisse der anfänglichen täglichen
Behandlung bei den obigen Vierten bestimmen. Eine weniger reine Fraktion wird notwendigerweise in entsprechend höherer Dosis
verabreicht.
Menschliches Präalbumin wird entweder als Komponente einer teilweise
gereinigten, von cytotoxischen Verunreinigungen freien Fraktion oder in praktisch reiner Form isoliert, wobei von menschlichem
Blut oder einer leicht verfügbaren menschlichen Blutfraktion in einem mehrstufigen Reinigungsverfahren ausgegangen wird*
Eine besonders wertvolle Quelle von menschlichem Präalburrin ist
die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte menschliche Blutfraktion,
die während der Fraktionierung von menschlichem Blut erhalten und gewöhnlich als Abfallfraktion verwarfen wird. Diese Fraktion ist
somit in großen Kengen aus Blutquellen erhältlich und relativ
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billig. Durchschnittlich zeigt die Cohn IV-1 Fraktion beim in
vitro Rosettenversuch eine Wirksamkeit von etwa 24 Mikrogramm. Ausgedrückt als Wirksamkeit im Rosettenversuch stellt die Cohn
IV-1 Fraktion eine etuia 10-fache Reinigung aus rohem menschlichem
Serum dar. Somit ist reines menschliches Präalbumin mit einer Wirksamkeit im Rosettenversuch unter 1 Nanogramm, gewöhnlich
0,2-1,0 IManogramm, eine 24000-120000-fache Verbesserung der Wirksamkeit
im Vergleich zur Cohn IV-1 Fraktion und eine 240 000-1 200 000-fache Verbesserung der Wirksamkeit im Vergleich mit
rohem menschlichem Serum. Diese verbesserte Wirkc-amkeit" beruht
vermutlich teilweise auf der Entfernung einer im Serum normalerweise
anwesenden Inhibitorfraktion. Das zur Erzielung eines so
bemerkenswerten Maßes an verbesserter Wirksamkeit notwendige, komplexe Reinigungsverfahren, das das erhaltene Material praktisch
rein macht, ist im folgenden beschrieben.
Das Verfahren zur Reinigung von menschlichem Präalbumin, ausgehend
von der Cohn IV-1 Fraktion, umfaßt die folgenden Stufen.
1) a. Molekularfiltration zwecks Ausschluß von hoch molekularem
Material und niedrig molekularem Material oder b. Ammoniumsulfatfraktionierung
2) Gelchromatographie
3) Wiederholung von Stufe 2 oder frei fließende Elektrophorese
4) Präparative Gelelektrophorese und
5) Gelchromatographie
Während jsder Stufe des Reinigungsverfahrens werden die verschiedenen
gebildeten Fraktionen routinemäßig untersucht, vorzugsweise nach dem in vitro Rosettenversuch, um die thymushormonartige Wirksamkeit
zu bestimmen. Die den wesentlichen Anteil dieser Wirksam-
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- 12 - 2 6 12 0 1b
keit enthaltende(n) Fraktion oder Fraktionen uierden in dan späteren
Stufen weiter behandelt, wodurch die aktiven Fraktionen zu immer kleineren Volumen konzentriert werden, mährend man die
aktive Komponente von ip^ktit'en Verunreinigungen abtrennt, bis man
das gewünschte Material in praktisch reiner Form erhält.
Obgleich die bevorzugten Ausführungsformen dar obigen Reinigungsstufen
in Beispiel 1 und 9 beschrieben werden, wird hier eine kurze Beschreibung des Reinigungsverfahrens gegeben:
Die rohe Cohn IV-1 Fraktion kann wahlweise gegebenenfalls lyophilisiert
uierden. Dies erfolgt gewöhnlich durch Suspendieren derselben in destilliertem oder deionisiertem Wasser, Rühren zum Lösen von
Klumpen und anschließende entfernung des Lösungsmittels und anderer
flüchtiger Materialien unter vermindertem Druck-.
Das lyophilisierte Material hat eine größere Stabilität und kann in der Kälte längere Zeit gelagert werden. Vor der Reinigung wird
die rohe oder lyophilisierte Cohn IV-1 Fraktion als wässrige Lösung
hergestellt und vorzugsweise zur Entfernung von Sediment zentrifugiert.
Zur Molekularfiltration wird destilliertes oder deionisiertes
Wasser als Lösungsmittel verwendet, wobei der pH-Wert vorzugsweise auf etwa 7,G eingestellt wird; zur Ammoniumsulfatfraktionierung
wird ein wässriger Puffer verwendet.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird
die (rohe oder vorzugsweise lyophilisierte) Cohn IV-1 Fraktion in
Lösung in destilliertem oder deionisiertem Wasser zwei Molekularfiltrationen
unterworfen, um Komponenten mit Molekulargewichten
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wesentlich oberhalb und unterhalb desjenigen der gewünschten Komponente
zu entfernen. Bei einem geeigneten Molekularfiltrationsv/erfahrens
wird anfänglich die oben genannte Lösung durch einen Hohlfaserfraktionator
mit geeignetem Membranfilter geleitet, um Komponenten
mit hohem Molekulargewicht (über etica 60-7C üüO Daltons
in Abhängigkeit von Filtrationsdruck) zu entfernen. Geeignete Hohlfaserfraktionatoren sind (in Abhängigkeit vom S;Jbstratvoiumen)
die Fraktionierungsvorrichtungen "Amicon DC-2" und "DC-30", Bei Verwendung des DC-2 Fraktionators ist ein geeignetes. Membranfilter
das Material "Amicon HIDX-50". Mit dem DC-30 Fraktionator
ist "Amicon HIOX-50" als Filter geeignet.
Das Filtrat aus der obigen Molekularfiltrav..".on wird zur Entfernung
niedrig molekularer Materialien einer weiteren Molekularfiltration
unterworfen. So führt der Durchgang durch einen ähnlichen
Hohlfaserfraktionatar, der mit einer Membran zum Zurückhalten von
Material eines.Molekulargewichtes von etwa 10 000 Daltons oder
mehr versehen ist, zum gewünschten Material mit einem Molekulargewicht von etwa 56 700 Daltons, das aus dem zurückgehaltenen
Material isoliert wird. Ein geeignetes Filter zu diesem Zweck in Verbindung mit der DC-2 Vorrichtung ist "Amicon HIüP-10" und
mit der DC-30 Vorrichtung "Amicon HIOSM".
Das Filtrationsverfahren kann auch umgekehrt werden, so daß zuerst
die niedrig molekularen und dann die hoch molekularen Verunreinigungen
entfernt werden. Das erstgenannte Verfahren wird jedoch bevorzugt.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird die rohe oder
vorzugsweise lyophilisierte Cohn IV-1 Fraktion einer Ammoniumsul-
609842/1012
fatfraktionierung unterworfen. Durch dieses Uerfahren wird eine
wesentlich höhere (etwa S-fache) Ausbeute an gewünschtem Material
im l/ergleich zum oben beschriebenen Rolekularfraktionierungsuarfahren
erhalten.
Die Cohn IV-1 Fraktion wird zuerst in einem geeigneten Puffer mit
einem pH-Wert zwischen etoa 7,8-8,2, wie Tris-(hydroxymethyl)-ai^inomethan-natriuraazid
(gewöhnlich als Tris-natriumazid bekannt) gelöst und zur Entfernung von Sediment vorzugsweise zentrifugiert«
Dann wird die Lösung bei einer Temperatur zwischen etu/a 0-5 C.
nacheinander mit Anteilen an Ammoniumsulfat zum "Aussalzen" verschiedener Fraktionen behandelt. Nach jeder Ammoniun;sulfatzugabe
wird der gebildete Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, die dann weiter mit Ammoniumsulfat behandelt wird»
Die das gewünschte Material enthaltende Fraktion wird "ausgesalzen"
oder ausgefällt, wenn Ammoniumsulfat zugefügt wird, um den Ammoniumsulfatgehalt der Lösung von etwa 4G-;£iger auf etwa 60-^iige
Sättigung zu bringen. Die zum Erreichen des entsprechenden
Sättigungsgrades notwendige Ammoniumsulfatmenge kann aus Löslichkeitstabellen
leicht bestimmt werden.
vorzugsweise Der das gewünschte Material enthaltende Miederschlag wird/nach
bekannten Verfahren, z.B. Diafiltration, oder vorzugsweise durch
Dialyse einer Lösung des Niederschlages in dest. Wasser
entsalzt. Dann wird das entsalzte Material zur Vorbereitung für die nächste Stufe z.B. durch Lyaphilisierung aus dem gefrorsnen
Zustand konzentriert.
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In der nächsten Stufe ujird das gewünschte Material aus der vorangehenden
Molekularfiltration oder Ammoniumsulfatfraktionierung
einer Chromatographie suf einer Polysancharidgelkolonne unterworfen,
die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht
fraktioniert. Geeignete Kolonnen sind z.B. aus vernetzten Dextranen hergestellt, wie "Sephadex G-75", G-100, G-150 oder
G-2D0 (der Firma Pharmacia Fine Chemicals). Eir bevorzugtes Material
ist "Sephadex G-150", da es eine optimale Trennung der Komücnenten
ergibt, wie durch Untersuchung der Kurve von K gegen
a ν
log des Molekulargewichtes bestimmt wird (vgl. Andrews "Biochem.3.",
Bd. 91, Seite 222 (196^)). Eine solche Gelchramatographie erfolgt
zweckmäßig, indem man einen wässrigen CIu1" erungspuf f er mit einem
pH-Werl von etwa 7,8-0,2, vorzugsweise etwa 8,0, durch die böladcne
Kolonne leitet. Ein geeigneter Puffer ist Tris-NaCl-NaN . Die
Temperatur sollte zwischen etwa 0-10 C, vorzugsweise etwa bei 5 C, liegen. Die Eluierungsfraktionen werden aus der Gelchromatographie
gesammelt, und die die gewünschte Komponente enthaltende(n) Fraktion(en) kann durch UU Absorption, eluiertes Gesamtprotein
und/oder Biobestimmung bestimmt werden. Die Kolonne kann so
kalibriert sein, daß die den gewünschten Molekulargewichtsbereich enthaltende Eluierungsfraktion leicht bestimmt werden kann (vgl.
Andrews, ibid.).
Die gewünschte(n) Fraktion(en) werden vorzugsweise durch Dialyse
oder insbesondere Diafiltration entsalzten und in Vorbereitung auf die nächste Stufe z.B. durch Lyophilisierung konzentriert.
Die Diafiltration erfolgt unter Druck (z.B. 4,9-5,6 kg/cm2 Stickstoff)
durch eine Membran mit entsprechender Porengröße, so daß
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das gewünschte Material zurückgehalten wird. Geeignete Membrane sind z.B. "Amicon UM-05r' und UM-10 mit einem Bereich für abgetrennte
Molekulargewichte von 500 bziu. 10 000. Andere verwendbare
Membrane sind »Amicon UM-2", PM-10 oder UM-20E.
In der nächsten Stufe wird das obige Material aus der Gelchromatographie
entweder durch dieselbe oder eins ähnliche Gelkolonne zurückgeführt oder einc.r frei fließenden Elektrophorese unterworfen;
diese erfolgt nach per se in der Technik bekannten l/erfahren,
Der pH-Wert sollte zwischen etwa 5,0-5,5, vorzugsweise bei etwa 5,25, liegen. Ein bevorzuger Puffer zur Einstellung eines solchen
pH-Wertes ist Natriumacetat-Essigsäure. Die gewünschte Komponente wird wiederum durch UV Absorption, Gesamtprotein und/oder Bioversuchsverfahren
und/oder durch Verwendung einer kalibrierten Kolonne lokalisiert.
Dann wird das gewünschte Material aus der vorangehenden Stufe einer präparativen Gelelektrophorese auf einer Polyacryiamidscheibe
in der für solche Verfahren üblichen Weise unterworfen. Diese Elektrophorese erfolgt vorzugsweise so, daß das Trennungsgel und der Eluierungspuffer einen pH-Wert zwischen etwa 8,5-9,5,
vorzugsweise etwa 6,9, haben. Ein bevorzugter Puffer zur Einstellung
eines solchen pH-Wertes ist Tris-HCl. Normalerweise erhält man nach diesem Verfahren ein elektrophoretisch homogenes menschliches
Präalbumin. Die Homogenität der erhaltenen Komponente wird durch analytische Standardverfahren, z.B. durch Anwendung einer
analytischen Scheiben-Gel-Elektrophorese oder isoelektrischer Einstellung bestimmt; die Hormonwirksamkeit wird durch Bioversuche
bestimmt. Als abschließende Stufe wird das Material von Polyacrylsäure und restlichen Salzen wie oben durch Chromatographie auf
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einer Mikropolysaccharidkülonne, vorzugsweise "Sephadex G-75",
befreit. Die erste, aus der Kolonne eluierende Spitze enthält, gemäß Beurteilung aus den oben genannten Kriterien, das aktive
Material,· das Produkt selbst kann durch Lyophilisierung erhalten werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung sowohl von praktisch
reinem als auch teilweise gereinigtem menschlichen Präalbumin sowie die angewendeten Bioversuche und die daraus erhaltenen
Ergebnisse» ohne eine Beschränkung darzustellen.
Die oben und in den Beispielen zitierten Literaturstellen werden hiermit in die vorliegende Anmeldung .iiii aufgenommen.
B e i 3 ρ i e 1 1_
Reinigung von mensdiicheni Präalbumin aus Cohn IV-1 Fraktion
4 kg menschliche Blutfraktion Cohn IV-1 (Firma Cutter Laboratories)
wurden in 20 1 zweifach destilliertem Wasser bei 5 C. 4 Stunden gerührt und lyophilisiert; so erhielt man 1105 g trockenes fiaterial,
das in 10 Volumen deionisiertem Wasser suspendiert wurde. Der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,0 eingestellt und
die Mischung 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Das Sediment wurde sntfernt und das überstehende Material durch eine HI0X-5Q
Patrone in einer "Amicon DC-30" Vorrichtung geleitet. Die niedriger
molekulare Fraktion aus dieser Stufe wurde dann durch eine HI05H
Patrone in derselben Vorrichtung geleitet. Wach Lyophilisierung
des zurückgehaltenen Materials erhielt man 50 g Material, das in 1-g-Anteilen (nach Lösen im unten genannten Puffer) in einer
5 χ 90 cm "G-75 Sephadex" Kolonne (Firma Pharmacia Fine Chemicals^
die mit 5 0 mi-ϊ Tris-100 mM NaCl-0,02 % Natriumazidpuf fer äqui-
libriert war, bei pH 8,0 und 5 C. chromatographiert wurde.
6 0 9 8 4 2/101?
Die Chromatographie u/urde durch Messungen der optischen Dichte
bei 280 nm Übermacht, der Inhalt jedes Rohres wurde lyophilisiert
und zur Bestimmung von Gesamtprotein diafiltriert und dann einem
in vitro Rosettenversuch unterworfen. Über 90 % der eluierten
Wirksamkeit wurden in einer auf dieser Kolonne leicht verzögerten Fraktion mit einbin K Wert von 0,055 gewonnen, was einem unge-
av
fähren Molekulargewichtbereich von etwa 50 000-70 000 Daltons entsprach.
Dieses Material (Gesamtmenge als allen 1-g-Versuchen =
20 g) wurde dann bei pH 5,25 in einem Acetatpufforsystem (25 mM
f\i'aOAc - 7 raf-'l HOAc) einer frei fließenden Elektrophorese unterworfen.
Wie oben wurde der l/erlauf durch optische Dichte, Gesamtprotein
und Bioversuch überwacht« Das Material aus der Kombination der aktiven Fraktionen wurde weiter durch präparative Poiyacrylamidgeleiektrophorese
unter Verwendung eines lü-^'igen vernetzten
Gels gereinigt. Der Spacer und die Probegele waren 0,060 M in Tris, mit HCl auf pH 6,6-6,8 eingestellt. Das Sepaiatorgel
war 0,375 Pl in Tris, mit HCl auf pH 8,9 eingestellt. Der
Elektrodenbehälterpuffer war 0,024 R in Tris und 0,192 M in Glycin,
bei einem pH-Wert von 8,2-8,4. Der Eluierungspuffer war 0,375 Π in
in Tris, mit HCl auf pH 8,8-9,0 eingestellt. Die Aktivität wurde in einer zwischen dem Spurfarbstoff (Bromphenol Blau) und der
Albuminfraktion wandernden Fraktion eluiert. Dieses Material (etwa 100 mg insgesamt) war in einem Analysesystem bei pH 8,9 elektrophoretisch
homogen.
Die Wiederholung der Sephadex-Chromatographie in obiger Weise auf
einer Mikrokolonne (0,8 χ 76 cm) lieferte praktisch reines Präalbumin
als weißen Feststoff.
609847/1012
Der S9n Wert, bestimmt durch Sedimentationsgeschwindigkeit in einer
einer Spinco Ultrazentifuge, Modell E, betrug 4,07, und das durch Sedimentationsgleichgewicht bestimmte Molekulargewicht des Moleküls
betrug 56 700 Daltons. Nach Behandlung mit 5Γ1 Guanidiniumhydrochlorid
- 0,8 % Dithiothreit - 0.01M Phosphatpuffer bai pH 5,2,
anschließende Behandlung mit 5M Harnstoff - 0,1 % Natriumdodecylsulfat
- 1 % Dithiothreit - 0,011^ Phosphatpuffer bei pH 7,4 und
Elektrophorese bei pH 7,0 in einem natriumdodecylsulfathaltigen Acrylamidgel betrug das Molekulargewicht des nicht dissoziierten
Materials 52 000 Daltons: es gab eine teilweise Dissoziierung in vier Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von je etwa 13 500
Daltons.
("focusing")
Das Protein war nach isoelektrischer Ednstelkng/in einem Ampholine
enthaltenden Polyacrylamidgel mit einem pH Bereich von 3-10 homogen und besaß einen ungefähren isoelektrischen Punkt von A,5. Die
durch Dansylierung erhaltene Analyse auf IM-endständige Verbindungen
zeigte die Anwesenheit von Derivaten entsprechend Dansylglycin und o«—Dansylhistidin. Die Aminosäurezusammensetzung wurde durch Hydrolyse
des Proteins und Chromatographie in einer Durrum Aminosäureanalysevorrichtung unter Standardbedingungen bestimmt und lieferte
das folgende Ergebnis:
60984?/101?
Aminosäure
Hal-%
Asparaginsäure 6,6
Threonin 9,5
Serin 9,3
Glutaminsäure 10,J
Prolin 6,6
Glycin · 8.3
Alanin 9,7
1/2 Cystin 0,9
Valin 9,5
Methionin 0,7
Isoleucin 4,0
Leucin 5,9
Tyrosin 2,3
Phenylalanin 3,9
Tryptophan 1 ,0
Lysin 6,3
Histidin 3,1
Arginin 3,2
Die Identität wurde weiter durch l/ergleich mit authentischen Proben
von menschlichem Präalbumin bestimmt.
In vitro Rosettenversuch während Reinigung von menschlichem Präalbumin
Der in vitro Rosettenversuch u/urde im wesentlichen gemäß CF. Bach
et al "Proc.Natl.Acad.Sci." U.S.A., Bd. 68, Seite 2734 (1974)
durchgeführt. Das genaue Protokoll war wie folgt: A. Herstellung der Azathioprinnatriumsalzgrundlösung
277 mg Azathioprin (fteie Säure; Firma Imuran, Burroughs Wellcome)
wurde in 25 ecm Wasser in einem Meßkolben gelöst. Zum Lösen des gesamten Pulvers wurde etwa 1 ecm 1 l\l NaOH unter Rühren eingetropft.
Die endgültige Lösung wurde 1:100 in Hank's ausgeglichener Salzlösung, pH 7,2, hergestellt aus pulverisiertem Medium (Firma
Difco Labs., Detroit, Mich.) verdünnt und lieferte eine Lösung,
609842/1012
die 0,106 rng/ccm Azathioprinnatriumsalz, pH 8,2, enthielt. Diese
Lösung wurde durch ein Milliporenfilter zuiecks Sterilisation filtriert.
Die endgültige Lösung wurde in der Dunkelheit in einem. Kühlschrank gelagert. Die Stabilität wurde durch Hessen der opti- %
sehen Dichte bei 280 und 330 nm untersucht.
B. Für den Versuch selbst wurden Milzzellen von 6-8 Wochen alten
männlichen C57B1/6 Simcnsen Mäusen verwendet, denen 7-30 Tage vor
dem Schlachten die Thymusdrüse entfernt worden war. Die einzelnen Milzen wurden homogenisiert und in kalter Hank's ausgeglichener
Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden bei 200 χ g 10 Minuten
in einer gekühlten Zentrifuge tablettiert. Es wurde eine endgültige gepoolte Suspension aus 40-60 χ 10 nukleatierten Zeilen pro ecm
hergestellt.
Kontrollreihe; zur Bestimmung der Sensibilität der thymectomisierten
Milzzellen gegen Azathioprinnatriumsalz wurde das Azathioprinnatriumsalz zwischen 25 ,ug/Röhrchen bis 1,56 ,ug/Röhrchen unter
Verwendung 2facher serieller Verdünnungen von 0,25 ecm Grundlösung
(Teil A) in Hank's Salzlösung titriert. 0,1 ecm der oben hergestellten
Miizzellensuspension wurden jeder Verdünnung (4,6 χ 10 Zellen/Röhrchen) zugefügt.
Testreihe; Testfraktionen von menschlichem Präalbumin (0,125 ecm
Aliquote) wurden seriell 2-fach in Hank's Salzlösung verdünnt. Deder Verdünnung der Testfraktion wurden 2,5 Mikrogramm Azathioprinnatriumsalz
in 0,125 ecm Hank's Salzlösung (siehe oben) und 0,1 ecm Hilzzellensuspension zugefügt.
Die Materialien von Kontroll- und Testreihe wurden 60 Minuten in einem Wasserbad bei 37°C. bebrütet. 0,2 ecm 2 Tage vorher herge-
609842/ 1012
stellter 50-^iger Schafserythrocyten (SRBC) in Alsever Lösung
(Forma Grand Island Biological Co., "Gibco", Grand Island, N.Y.)
wurden in 15 ccn« Hank's Salzlösung verdünnt. 0,125 ecm dieser
SRBC Suspension wurden jedem Röhrchen der Kontroll- und Teetreihe
zugefügt, und die Zellen wurden in einer gekühlten Zentrifuge bei 200 χ g 5 Minuten tablettiert. Die tablettierten Zellen wurden bei
40C. 90 Minuten gekühl«", vorsichtig erneut 5 Minuten auf einem
Rotator suspendiert und die Rosetten in einem Malessez Hämocytenzähler gezählt.
Die spezifische Wirksamkeit wurde durch die Mindestproteinmenge in der Testfraktion bestimmt, die eine Rosettenbildung um 50 %
oder mehr in Anwesenheit von 2,5 ,ug/Röhrchen Azathioprinnatriumsalz
inhibierte. Die spezifische Wirksamkeit der während der Reinigung (Beispiel 1) erhaltenen Fraktionen wird in der folgenden
Tabelle zusammen mit einem relativen Reinigungsfaktor unter Verwendung der Cohn IV-1 Fraktion als Bezug gezeigt.
Stufe Fraktion
1 Cohn Fraktion IU-I
2 auf DC-30 HIOSM Patrone zurück gehaltenes Material
3 Chromatographie auf Sephadex G-75, pH 8, Fraktion 2
4 frei fließende Elektrophorese, pH 5,25, Fraktion 2
5 präparative Polyacrylamidgelelektrophorese, pH 8,9, Fraktion 1
6 Chromatographie auf Mikro-Sephadex G-75, Fraktion 1
Wirksamk.im Rosettenvers. ( /Ug Protein) |
Reimgungs faktor |
24 | 1 |
3 | 8 |
0,1 | 240 |
0,01 | 2400 |
0,002 | 12000 |
0,0004 | 60000 |
609842/1012
Die obige Tabelle erläutert die Verwendung des in vitro Rosettenversuches
zur Überwachung der Reinigung von menschlichem Präalbumin und zeigt, daß eine 60 000-fache Reinigung (bezogen auf die
Aktivität) der Cohn IV-1 Fraktion erreicht wurde.
Beisp iel 3
Stimulierung der Antikörpersynthese
Werden normale Tiere oder solche, deren immunologisches Ansprechen
experimentell unterdrückt wurde, mit einem fremden Antigen, z.B. einem aus einer anderen Spezies erhaltenen Protein, injiziert, dann
erfolgt die Stimulierung eines immunologischen Abujehrmechanismus,
z.B. die Synthese von .".ntikörpern mit der Fähigkeit zum "Neutralisieren"
des Fremdmaterials.
Protokoll: Normale Mäuse (C57B1/6 Stamm) wurden durch eine einzige
intravenöse Injektion mit Schafserythrocyten (SRBC) als Antigenstimulanz
behandelt. Gleichzeitig erhielten die Testmäuse intravenös eine Menge an menschlichem Präalbumin (entsprechende Fraktion
gemäß Darstellung in der Tabelle von Beispiel 2). Die Kontrollmäuse erhielten das Antigen und Rinderserumalbumin (BSA).
Nach 7 Tagen wurden die Tiere getötet, die Milzen herausgeschnitten ten, und jede Milz wurde zur in vitro Antikörperbestimmung gemäß
dem Verfahren von H.K. Derne et al "Science" Bd. 140, Seite 405
(1963) verwendet. Das Antikörperanspiechen ist als Anzahl plättchenbildender Zellen (PFC) pro 10 Milzzellen ausgedrückt.
A. Die folgende Tabelle zeigt die Antikörperbildung unter Verwendung
einer menschlichen Präalbuminfraktion ("Hormon") entsprechend Stufe 2 der Tabelle von Beispiel 2. Es wurden sowohl 19S(IgM)
als auch 7S(IgG) Antikörper bestimmt.
'6 09842/1012
injiziertes Material
24 - | 2612015 |
P FC/1 O6 | Milzzellen |
19S(IqM) | 7S(IqG) |
33 | 2 |
105 | 114 |
193 | 112 |
249 | 173 |
276 | 310 |
1 | 1 |
3 | 1 |
120 | 119 |
154 | 76 |
156 | 152 |
Kochsalzlösung SRBC
SRBC + 10 /Ug Hormon
SRBC + 100 ,ug Hormon SRBC + 400 /Ug Hormon
Kochsalzlösung + 400 ,ug Hormon
Kochsalzlösung + 400 /Ug BSA
SRBC + 10 ,ug BSA SRBC + 100 ,ug BSA SRBC + 400 ,ug BSA
Die Daten zeigen, daß die Verabreichung von menschlichem Präalbumin
die Fähigkeit der Milzzellen zum Synthetisieren von 7S und 19S Antikörpern wesentlich erhöhte.
B. Die Wirkung von menschlichern Präalbumin ("Hormon") auf die Antikörpersynthese
kann auch in einem in vitro Versuch gezeigt werden. Dabei wurden iiilzzellen von C57B1/6G Mäusen gezüchtet und dann
entweder mit Schafserythrocyten, Schafserythrocyten plus Hormon oder Hormon allein behandelt. Das in diesem Versuch verwendete
Hormon stammte aus Stufe 3. der Tabelle von Beispiel 2. Das Antikörperansprechen
wurde nach 5-tägiger Züchtung gemessen. Es wurden nur die 19S Antikörper gemessen. Die Ergebnisse finden sich in
der folgenden Tabelle:
609 8 42/1012
Der Milzzellkultur zugefügtes 19S Antikörperansprechen
. Material (PFC/iO Milzzellen)
46
SRBC 1332
SRBC * 10 /Ug Hormon 2097
SRBC + 50 /ug Hormon 1964
50 /ug Hormon · 58
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das menschliche Präalbuminpräparat
bei in vitro Zugabe zur Stimulierung der IgM(i9S) Antikörpersynthese
aktiv ist.
Beispiel 4
Beispiel 4
Wirkung von menschlichem Präalbumin bei neonatal thymektornisierten
Mäusen
Bekanntlich bewirkt die neonatale ThymektGtnie einen "immunologischen
Krüppel". Die operierten Tiere wachsen nicht normal, u/erden mager und haben wenig Widerstand gegen Infaktionen; sie
können im Ansprechen auf eine Reizung durch spezifische Antigene keine Antikörper bilden und haben keine durch die Zellen vermittelte
Immunität, d.h. können einen Hautpfropf aus einem allogenen Stamm derselben Spezies nicht abstoßen. Gewöhnlich sterben solche
operierten Tiere innerhalb von 5-10 Wochen nach der Operation an allgemeinen Infektionen, was von dem Maß abhängt, in welchem
die Umgebung, in welcher sie untergebracht sind, frei von infektiösen Mitteln ist. Dieses neonatale Thymectomiesyndrom ist in
vielen Spezies nachgewiesen worden und zeigt sich auch bei Kindern, die entweder ohne Thymusdrüse oder mit einer Thymusaplasie oder
-dysplasie geboren wurden (3.F.A.P. Miller et al "Physiol.Revs.",
Bd. 47, Seite 137 (1967) und N, Trainin "Physiol.Revs.", Bd. 54, Seite 272 (1974)).
60984271012
Protokoll: C57B1/Ka Mäuse wurden innerhalb von 24 Stunden nach
der Geburt nach chirurgisch sterilen Verfahren thymektomisiert und unter Bedingungen gehalten, die von spezifischen infektiösen
Pathogenen frei u/aren. Gruppen von jeu/eils 10 dieser neonatal
thymektomisierten Mäuse wurden in der im folgenden angegebenen
Weise behandelt. Als Kontrollprotein wurde Rinderserumalbumin (BSA)
verwendet.
A. Antikörpersynthese
Beginnend 9 Wochen nach der Thymektomie murde jede Haus intraperitoneal
ein über den anderen Tag (ingesamt 8 Injektionen) mit 1 mg pro Injektion pro Maus menschlichem Präalhuminpräparat
("Hormon1') oder BSA injiziert. Dss für diesen Versuch verwendete
Hormon stammte aus Stufe 2 der Tabelle von Beispiel 2. Die Ti^re
wurden 1 Woche nach der letzten Hormoninjektion und 5 Tage nach einer einzigen intraperitonealen Injektion des Antigens, nämlich
Schafserythrocyten, geschlachtet. Die Antikörpertiter (19S) wurden
nach dem l/erfahren von R. I. Mishell "3 .Exp.Med.", Bd. 126, Seite
423 (1967) bestimmt, wobei die folgenden Ergebnisse erzielt wurden:
19S Antikprperansprechen (PFC/1D Milzzellen)
hormonbeh. Hause BSA behandl.Hause
58 650 9 500
Die obige Tabelle zeigt, daß die Verabreichung des menschlichen Präalbuminpräparates den neonatal thymektomisierten Hausen dia
Fähigkeit zum Synthetisieren von 19S Antikörpern im Ansprechen auf eine Reizung mit Schafserythrocyten, einem thymusabhängigen Antigen,
wiedergab.
609842/101 2
B. Gemischte Lymphocytenreaktion
Wenn Lymphoidzellen von Mäusen eines spezifischen Stammen in vitro
mit Lymphoidzellen von Mäusen eines nicht verwandten Stammes gemischt werden, dann bewirkt die vom iamunologischen Standpunkt aus
"fremde" Natur der Ζθΐΐβη auf einander ein proliferierendes Ansprechen
jeder Zelle. Wie im folgenden gezeigt, kann man verhindern, daß sich eine von zwei Zellpopulationen proliferiert oder
einer Blastogenese unterliegt, indem man einer Zellpopulation vor dem Mischen ein die Zellteilung inhibierendes Mittel zufügt.. Die
Fähigkeit der Zellen, die Fremdzellen zu erkennen, ist eine
Reflektion eines durch die Zellen vermittelten, immunologischen Ansprechons. Dies ist die sog. gemischte "Einbahn"-iymphocyten~
reaktiun.
Lymphoidzellen von neonatal thymektomisiertsn Mäusen oder von
genetisch thymuslosen (nackten) Mäusen sind zu einer derartigen Erkennung unfähig, d.h. sie reagieren in der gemischten Lymphocytenreaktion
beim Bebrüten mit Lymphoidzellen von erwachsenen Mäusen eines anderen Stammes nicht.
Es wurde das von A.L. Goldstein et al "D.Immunoli1 , Bd. 106,
Seite 773 (1971) beschriebene Protokoll verwendet.
Die im folgenden gezeigten Daten wurden mit Lyipphknotenzellen von
neonatal thymektomisierten C57B1/Ka Mäusen erhalten, die im Alter von 4 Wochen mit einzelnen subkutanen Injektionen über eine Dauer
von 1 Wochen aus jeweils 1 mg "Hormon" (entsprechend Stufe 2 der Tabelle von Beispiel 2) behandelt worden waren. Eine Kontrollgruppe
von- neonatal thymektomisierten C57Bl6/«a Mäusen erhielt ähnliche Dosen an 1 mg Rinderserumalbumin. Die Tiere wurden geschlachtet
•6 09842/1012
und die Lymphknoten (mesenterial, axillar und inguinal) und
die Milzen herausgeschnitten. Zellsuspensionen der Lymphknoten jeder Maus wurden in der gemischten Lymphocytenreaktion unter
Verwendung gleicher Zahlen von C57B16/Ka Lymphknotenzellen (A) und
allogenen (BLA) Zellen (B) getestet. Die "Hintergrund"-Einverleibung für jede Zellart wurde getrennt erhalten und vom gemischten
Zellreaktinnswert subtrahiert, wodurch man die Differenz in Zählungen pro min (Δ CPM) aus der Reaktion der beiden Zellarten
erhielt. Es wurden die folgenden Daten erhalten: Behandlung H-Thymidineinuerleibung
umalbumin | B) | Δ | CPM* | S timulierunqsi.no ex | |
Rinderser | 11 | 596 | 28,4 | ||
Hormon | B - (A + B |
18 | 358 | 48,8 | |
* = A χ A χ |
|||||
Wie ersichtlich, zeigten die Lymphknotenzellen aus den mit dem menschlichen Präalbuminpräparat behandelten Tieren eine etwa 2-fache
Erhöhung des Stimulierungsinex. Diese Daten zeigen, daß
die Zellen aus neonatal thymektomisierten, mit diesem Präparat behandelten Mäusen in ihrer immunologischen Fähigkeit deutlich
verbessert waren, was aus ihrer Fähigkeit zum "Erkennen" der · Lmyphknotenzellen eines histoinverträglichen Stammes von Mäusen
hervorgeht.
Proliferation won Lymfhaidgeiuebe
Mäuse, denen innerhalb von 24-48 Stunden nach der Geburt die Thymusdrüse
entfernt wurde (neonatale Thymektomie) wurde, oder genetisch athymische (nackte) Mäuse entwickeln kein normales Lymphoidgewebe.
Das heißt, ihre Lymphknoten und die Milz (die Lymphoidorgane) sind
609842/1012
klein und zeigen einen Mangel an Lymphocyten. Dies spiegelt die
Tatsache, daß im frühen Leben die Thymusdrüse eine große Anzahl von Lymphoidzellen produziert, die zu den peripheren Lymphoidor-
ganen geleitet ujsrden und diRse besiedeln,
(proliferieren) wenn sich diese Zellen fortpflanzen/. Dies führt normalerweise zum
Wachstum und der Reifung normaler Lymphoiclstrukturen.
Protokoll:' genetisch athymicche (nackte) Mäuse von 4 Wochen erhielten
8 tägliche subkutane Injektionen aus 1 mg menschlichem Präalbuminpräparat ("Hormon") entsprechend Stufe 2 der Tabelle von
Beispiel 2 über eine Dauer von 2 Wochen vor ihrer Tötung. Die Kontrollmäuse erhielten Injektionen von 1 mg Rinderserumalbumin.
Die Lymphknoten (rrRsenterial, inguinal und axillar) wurden herausgeschnitten,
abgetupft, gepoolt und die Anzahl der gesäten Lymphoidzellen
gezählt. Die Daten waren wie folgt:
Gewebe Rinderserumalbumin Hormon
Milz 1,02 χ 108 1,8 χ 108
Lymphknoten 21,3 χ 1O6 41,5 χ 1 O8
Bekanntlich wird die Fortpflanzung von Lymphoidzellen in normalen
Mäusen thymusreguliert. Die genetisch thymuslose (nackte) Maus hat wenig, unentwickeltes Lymphoidgewebe. Die obigen Daten zeigen
bei mit menschlichem Präalbumin behandelten Mäusen eine Erhöhung der Anzahl der Lymphknotenzel
d.h. eine 200-fache Erhöhung.
d.h. eine 200-fache Erhöhung.
der Anzahl der Lymphknotenzellen um einen Faktor von ~2 χ 10 ,
609842/1 01 ?
Stimulierung durch Mitogene: Blastogenese nach Zugabe von
Concanavalin A
Da Lymphoidzellen "nackter" Mäuse immunologisch nicht ansprechen, reagieren sie auch nicht auf Concanavalin A, ein Mitogen, das
bekanntlich auf immunologisch fähige T-Zellen unter Beschleunigung
ihrer Reifung und Differentiation wirkt.
Protokoll: Die Behandlung car nackten Mäuse erfolgte ujie bei der
Fortpflanzung des Lymphoidgewebes (Beispiel 5) unter Verwendung
desselben Präparates und derselben Menge an menschlichem Präalbumin. Der verwendete l/ersuch ist von H. N. Clarnan, 11J. Immun öl. ",
Bd. 112, Seite 960 (1974) beschrieben und beruht auf der Einverleibung von H-Thy^idin in in vitro bebrütete Lymphoidzellen mit
und ohne Zugabe von Concanavalin A (Miles-Yeda, Kankakee, 111.)
Es wurden die folgenden Daten erhalten: CPM*
Zellen von mit BSA behandelten Mäusen + ^1n
Phosphat-Ringar-Puffer + Concanavalin A
Zellen von hormonbehandelten Mäusen + -ig
Phosphat-Ringer-Puffer + Concanavalin A
* = Durchschnitt des pro Bebrütungsrohr einverleibten H-Thymidins
Die Injektion des menschlichen Präalbuminpräparates erhöhte das mitogene Ansprechen der Zellen auf Concanavalin A um etwa das
4-Fache. Somit erhöhte die Verabreichung dieses Materials an nackte
Mäuse die Anzahl der Gastzellen, die in ihrem Ansprechen auf das Mitogen die Eigenschaften von T-Zellen zeigen.
609842/10 12
In vitro Reifung menschlicher Lymphocyten zu immunologisch
fähigen T-Zellen
Die Anzahl der spontan Rosetten bildenden Erythrocytenzellen in den peripheren Blutlymphocyten ist ein Index für die immunolcgische
Fähigkeit des Trägers, da dieser Index die Anzahl zirkulierenden, immunologisch fähiger T-Zellen widerspiegelt.
Bei normalen Lebewesen beträgt die Anzahl der E Rosetten-Zallen im
peripheren Blut gewöhnlich 65-80 % der gesamten Lymphocytenpopulation. Werte unter diesem Bereich trifft man oft bei immunologisch
geschädigten Zuständen einschließlich bösartiger Erkrankungen, Thymusaplasie oder -dysplasie, Rheumatoidarthritis ustu.
Protokoll: Lymphocyten wurden aus menschlichem peripheren Blut auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten abgetrennt (vgl. A. Boyun,
"Scan.3.Clin.Lab.Invest.", Bd. 21: Zusatz 97 (1968)). T-Lymphocyten
wurden durch spontane Rosettenbildung mit Schafserythrocyten identifiziert (vgl. Z. Bentwich et al "Clin.Immunol.Immunopath,",
Bd. 1, Seite 511 (1973)). Eine V/eränderung von + 10 % (auf einer
Skala von 100 %) wurdB als signifikant angesehen. Es wurden die
folgenden Daten erhalten:
609842/1012
Einfluß won menschlichem Präalbumin (Hormon entsprechend Stufe 3 der Tabelle
von Beispiel 2) in vitro auf dBn Prozentsatz spontan Rosetten bildender
Erythrocyten (ti) Zellen in peripheren Blutlymphocy ten normaler Individuen und
Patienten mit morbus Hodqkin
Lymphocyten von anfängl.Prozent- + 50 /ug + Inhibitor- + RI5* + 50 /ug
7 normalen Indi- satz an E-Rosett. u""—^1" mi,n«^ai/4. ur.„mr,n /
viduen
1 2 |
70 65 |
3 | 61 |
σι 4 ο co 5 |
66 66 68 |
^ 7 | 72 |
-* Lymphocyten von ^6 Patienten mit ^ morbus Hodgkin 1 |
67 |
2 | 62 |
3 | 48 |
4 | 55 |
5 | 62 |
6 | 43 |
+ 50 /ug Hormon |
+ Inhibitor- Milzextrakt (RIS)* |
+ RIS* + 50 Hormon |
70 65 |
n.d.** n.d. |
n.d.** n.d. |
68 | n.d. | n.d. |
55 | n.d. | n.d. |
60 | 47 | 68 |
69 | 48 | 64 |
69 | 50 | 71 |
n.d. · n.d. n.d. n.d. 66
54 ^
54 ^
* =10 ug Protein/Bestimmungsröhrchen _λ
** = nicht durchgeführt 5^
66 | n.d. |
72 | n.d. |
70 | n.d. |
70 | n.d. |
78 | 43 |
70 | 50 |
Die abigen Ergebnisse legen nahe, daß die in vitro Bebrütung
abgetrennter peripherer Blutlymphocyten von Patienten mit einem
niedrigeren als normalen Prozentsatz an spontan Rosetten bildenden E Zellen mit dem menschlichen Präölbuminpräparat den Prozentsatz
dieser Zellen erhöht. Diese Daten wurden interpretiert als Anzeichen, daß eine unzureichende Thymushorrnonkonzentration
die Grundlage für die niedrigere Anzahl Rosetten bildender E Zellen bei diesen klinischen Erkrankungen ist. Im Gegensatz dazu sind
bei den Patienten offenbar Vorlauferzellen anwesend, da die Bebrütung
dieser Zellen mit zugefügtem menschlichen Präalbuminpräparat die Anzahl der spontan Rosetten bildenden E Zellen erhöhte.
Patienten mit morbus Hodgkin zeigen häufig niedrigere als normale Zahlen spontan Rosetten bildender E Zellen. Die obigen Daten zeigen,
daß die peripheren Lymphocyten von 5 aus 6 morbus Hodgkin Patienten nach Bebrütung mit menschlichem Präalbuminpräparat eine
wesentliche Erhöhung des Prozentsatzes an spontan Rosetten bildenden E Zellen zeigten.
Weiterhin wirkte das menschliche Präalbuminpräparat der Inhibitorwirkung
eines Milzextraktes von Hodgkin-Patienten auf die Anzahl spontan Rosetten bildender E Zellen in den peripheren Blutlymphocyten
normaler Individuen und in einem Patienten mit morbus Hodgkin entgegen.
In vivo Wirksamkeit von menschlichem Präalbuminpräparat Der in Beispiel 2 ausgeführte Versuch mit Rosetten bildenden
Zellen wurde auch in Versuchen angewendet, bei welchen ein hochgradig gereinigtes menschliches Präalbuminpräparat (entsprechend
60984?/ 1012
Stufe 6 der Tabelle von Beispiel 2) in vivo verabreicht wurde.
Dabei wurde wie folgt verfahren:
Das zu unteruschende Präparat wurde normalen erwachsenen C57B1/6
Mäusen mit einem Alter vun 6-8 Wochen verabreicht, die 2 Wochen
vor dem Uersuch thymektomisiert morden waren. An jeweils drei aufeinanderfolgenden
Tagen wurden tägliche Injektionen intraperitoneal in Dosen von 2-4 /ug pro Maus gegeben.
24 Stunden nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet, die
Milzen schnell entfernt, es wurden Zellsuspension«?n hergestellt und im Rosettenversuch verwendet. Dabei erhielt man die folgenden
Daten:
Endpunkt
normale, nicht thymektomis.f-1aus 0,78 /ug Azathioprin
thymektomis., mit Kochsalzlösung
injiz. Maus 25 /Ug Azathioprin
thymektomis., mit 2 .ug Präparat
injiz. Haus ' 0,195 /Ug Azathioprin
thymektomis., mit 4 /ug Präparat
injizi. Maus ' 0,058 /Ug Azathioprin
Die obigen Daten zeigen, daß den Milzzellen thymektotnisierter
Mäuse die immunologische Fähigkeit durch Verabreichung des Präparates wiedergegeben wurde. Es wird darauf hingewiesen, daß die
Injektion des gereinigten menschlichen Präalbuminpräparates den Milzzellen thymektomisierter Mäuse eine Sensibilität gegen die
Inhibitorwirkung von Azathioprin, bezogen auf die Anzahl Rosetten bildender Milzzellen, gleich derjenigen von Milzzellen normaler
Mäuse wiedergab. Die absolute Wirksamkeit des in diesem Uersuch verwendeten Präparates beträgt beim in vitro Uersuch 0,4 ng.
609842/1012
Andere Reinigung von menschlichem Präalbumin aus Cohn IV-1 Fraktion
100 g (Naßgeuiicht) Cohn IV-1 Fraktion UJUrden mit 500 ecm dest.
Wasser 4 Stunden bei 2-5 C. gerührt. D?nn wurde die Suspension'
lyophilisiert und lieferce eitua 40 g eiries trockenen Pulvers.
Dieses Material wurde dann in 1000 ecm 50 mM Tris-100 mM Natriumchlorid
- 0,02 % Natriumazid-Puffer, pH 8,0, gelöst und 3 Stunden
bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde die Leimung bei 120.00 χ g
30 Minuten bei 2-5°C.zentrifugiert. Die klare grünliche überstehende Flüssigkeit in einem geeigneten, von Eis umgebenen Behälter
wurde dann zu 40 % mit Ammoniumsulfat (durch Zugabe von 243 g
Ammoniumsulfat zu 1000 ecm der überstehenden Flüssigkeit) gesättigt.
Die Suspension wurde sich über Nacht bei 5 C. absetzen gelassen und der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt. Dann luurde
die überstehende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat zu 60 % gesättigt, indem man 132 g Ammoniumsulfat zu 1000 ecm der überstehenden
Flüssigkeit zugab und den Niederschlag wie oben aammelte. Dieser
uiurde dann im Mindestvolumen kaltem dest. Wasser gelöst und in
der Kälte erschöpfend gegen dest. Wasser dialysiert und lyophilisiert, wodurch man 17 g Material erhielt.
Das obige Material wurde in 1-g-Aliquoten auf eine 5 χ 90 cm
Sephadex G-150 Kolonne (gesamtes Bettvolumen 1760 ecm), die mit
50 mM Tris -100 mM Natriumchlorid - 0,02 % Natriumazid, pH 8,0,
äquilibriert mar, gegeben, und die Kolonne mit demselben Puffer
eluiert. Das im Molekulargeujichtsbereich von 40 000-70 000 DaI-tons
eluierende Material uiurde gesammelt, durch Diafiltration durch eine UM-10 Amicon Membran bei 4,9-5,6 cm / kg Stickstoffdruck
entsalzt und lyophilisiert. Das insgesamt aus allen
'609 842/10 12
1_g_\/ersUchen auf der Sephadex-Kolonne erhaltene Material betrug
Nach erneuter Chromatographie dieses Materials in 1-g-Aliquoten
wie oben unter Verwendung derselben Sephadex-Kolunne und anschließender Diafiltration und Lyophilisierung "Jie oben erhielt man 2 g
Material.
Die folgende Tabelle zeigt das Gewicht des Materials und seine Wirksamkeit im in vitro Rosetten Versuch gemäß Beispiel 2.
Material | Trockengew. Q |
Wirksamkeit -Roset tenversuch; /Ug |
Cohn IV-I Fraktion | 40 | 12 |
40-60 >q Ammoniumsulfat- niederschlag |
17 | 1,6 |
G-150, Fraktion 3 | 4 | 0,2ü |
G-150, Fraktion 3, Wiederholung | 2 | 0,02 |
Das Material aus dem obigen Verfahren kann wie in Beispiel 1 einer
präparation Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Chromatographie
auf einer Mikrokolonne unteriuorf en werden und liefert das srfindungsgemäße,
von Verunreinigungen praktisch freie Material, das beim in vitro Resetten-Versuch gemäß Beispiel 2 eine Wirksamkeit
von etwa 0,2-1,0 ng zeigt.
In vitro Wirkung von menschlichem Präalbumin auf die beschleunigte
Reifung immunologisch fähiger Zellen
Unreife Thymocyten von normalen Mäusen sind gewöhnlich keine T
Zellen mit wesentlicher cytotoxischer Wirksamkeit. Die beschleunigte Reifung dieser Thymocyten zu Lymphocyten mit cytotoxischer
Wirksamkeit ist ein Zeichen der verbesserten immunologischen Fähigkeit.
609 8 42/1012
Protokoll: 1 χ 10 Thymocyten von C57B1/6 Mäusen wurden mit
5 χ 10 bestrahlten Balb/c Mäusemilzzellen mit und ohne 5 /ug
Material entsprechend der letzten Stufe der Tabelle von Beispiel 9
oder 5 /U BSA 5 Tage lang gezüchtet. Die Cytatoxizität wurde auf
P815 Y(H-2 ) Zellen gemessen, die mit " Cr gekennzeichnet waren.
/o Cr Freisetzung Thymocyten + Balb/c + 5 /Ug BSA . 15
Thymocyten + Balb/c + 5 /Ug menschl.
Präalbuminpräparat ' 45
Die Daten zeigen, daß Lymphoidzellen, die normaleru/eise keine
cytotoxische Wirksamkeit zeigen, aufgrund ihrer in vitro Behandlung mit menschlichem PräalDuminpräparat eine deutliche Cytotoxizität
entwickeln.
Wie im obigen Beispiel 5 gezeigt, sind Lympnaidzellen "nackter"
Mäuse gewöhnlich immunologisch nicht ansprechend. Nun wurde die Wirkung eines menschlichen Präalbuminpräparates auf die Bewirkung
eines immunologischen Ansprechens von in vitro bebrüteten Milzzellen nackter Mäuse durchgeführt. Das Versuchssystem war die
gemischte Lymphocytenreaktion von Beispiel 4.
Protokoll: 5x10 Milzzellen von nu/nu Mäusen (Balb/c Grundlage)
wurden mit 5 χ 10 bestrahlten F1 (BaIb χ C57/K6) Mäusemilzzellen
3 Tage gezüchtet, wobei während der letzten 4 Stunden mit Tritium behandeltes Thymidin zugefügt wurde. Es wurde eine Konzentration
von 2 /ug/Röhrchen menschliches Präalbuminpräparat (Hormon) entsprechend
der letzten Stufe der Tabelle von Beispiel 9 verwendet. Die Werte sind der Durchschnitt + S.E. von drei Versuchen.
60984?/101?
Zellquelle syngen allogen
nu/nu Milz 1241+74 1027+95 6725+75 1567+67
Die Daten zeigsn., daß - obgleich Milzzellen nackter Mäuse, die' mit
RindtfrserumalbuTiin bebrütet sind, in der gemischten Lymphocytenreaktion
nicht ansprechen - ähnliche, mit 2 /ug Hormonpräparat
pro 5 χ 10 Milzzellen bebrütete Zellen den Zellen tatsächlich die Fähigkeit tür Wirkung in der gemischten Lymphocytenreaktion
verliehen. Somit wandelte das Hormon immunologisch nicht ansprechende Zellen in Zellen mit immunologischer Wirteamk-'.ifc um.
Lymphocyten-autosensibilisierung in vitro
Wenn man Lymphoj-dz-llen eines Tieres in vitro oder in einer geschlossenen
Kammer mit Nicht-Lymphoidzellen desselben Tieres bebrüten
läßt, dann tritt da.s als Autosensibilisierung bezeichnete Phänomen
auf. Das heißt, die immunologisch aktiven Lymphoidzellen können erkennen, daß die andere Zellart nicht identisch, sondern in diesem
Sinn fremd ist. Die Tatsache, daß die eintritt, kann untersucht werden, indem man das Maß an Cytotoxizität dieser sensibilisierten
Lymphocyten auswertet. Dies erfolgt durch Messen des Ausmaßes
an Lysis oder "Abtätung" von Zellen (Zielzellen), gegen welche die Lymphocyten sensibilisiert worden sind, indem man die sensibilisierten
Zellen mit den mit einem Isotop, gewöhnlich eines radioaktiv gekennzeichneten Chromsalz, gekennzeichneten Zielzellen
mischt. Nach der Bebrütung und aufgrund der Lysis der Zielzellen wird die Radioaktivität der gekennzeichneten Zellen in das Medium
freigesetzt, wo ihre Menge gemessen werden kann. Der Prozentsatz an freigesetzter Gesamtradioaktivität wird als Haß für die Cytotoxizität
der sensibilisierten Lymphoidzellen angenommen (vgl.
M. Takasugi und E.Klein "Transplantation", _9:219 (1970)).
609842/1012
J nachträglich 1
Protokoll: Herstellung von peripheren Blutlymphocyten
Die Lymphocyten wurden vom Gesamtblut nach dem Verfahren des Ficoll-Isopaque-Gradienten entfernt (vgl. A.Boyoum "Scand.G.Clin.
Lab.Inv." Bd. 21, Zusatz 97, Seite 77 (1968)).
Kulturmedien; Fibroblastmonnschichen und Zielzellen wurden in
Earle's Medium plus 10 % Kalbsfötusserum (Gibco) gezüchtet. Die
Lymphocytensensibilisierung und Cytotoxizitätsuntersuchung erfolgten
in RPMI 1640 Medium (Gibco), das mit 10 % menschlichsm, AB positivem Serum, 2 mM Glutamin und 4 mM Hepes Puffer (Gibco) ergänzt
war.
In vitro Sensibilisierunq der Lymphocyten: Normale, zwischen ihrem
dritten und zehnte-, in vitro Durchgang verwendete Hautfibroblasten
wurden in Kuxturflaschen aus Kunststoffgewebe (25 cm , Falcon,
Oxnard, USA) eingesetzt. Kurz bevor sie zusammenliefen, wurden die Monoschichten mit einer Röntgenstrahlenmaschine (Siemens,
stabilipan 15 mA, 22 KU, Filter Al 1 mm, Dosis 362 R/min, Abstand
40 cm) bestrahlt (4000 R). Aliquote der Lymphoidzellen (von 1q
bis 1,5 χ 10 ) wurden in die Flaschen mit und ohne Monoschichten gegossene Das Kulturmedium wurde am Tag 3 ersetzt. Am Tag 6
wurden die Lymphocyten durch Pipettieren gewonnen und mit frischem
Medium gewaschen. Nur ein geringer Prozentsatz der Lymphoidzellen blieb fest an die sensibilisierende Monoschicht gebunden. Die
gesammelten Lymphocyten wurden zweimal gewaschen und zur Bestimmung ihrer Uiabilität in Anwesenheit von Trypanblau gezählt.
Durch Zellen vermittelte Cytotoxizitätsbestimmunq: Die Lymptricyten
wurden nach dem Verfahren von M. Taka|uS* und E.Klein "Transplantation",
Bd. 9, Seite 219 (1970) getestet. 400 Zielzellen
("well") (Hautfibroblasten) wurden in ein Volumen von 20 /ul pro Loch /
6098^2/1012
eingeführt. Nach Bebriitung über Nacht mären 50 % der Zellen gebunden.
Die Lymphocyten wurden in ein Uolumen von 20 ,ul gegeben und
die Reaktion nach 48 Stunden abgebrochen. Die Anzahl der verbleibenden Zielzellen wurde nach Waschen mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung, pH 7,4, Fixieren mit Methanol und Anfärben der Platten mit "Giemsa" (Gibco) festgestellt. Die Zellanzahl in den
Löchernm die vorher ohne die sensibilisierenden Monoschichten
gezüchteten Lymphocyten ausgesetzt waren, wurde als Grundlage für die Auswertung der Cytotoxizität angenommen. Die Zellanzahl
in mit sensibilisierten Lymphocyten beimpften Löchern und in solchen mit Kontrollmedium wurde mit diesem Wert verglichen.
Die Wirkung des "Hormons" (entsprechend de^ Präparat von Stufe 4
der Tauelle in Beispiel 2) auf die oben beschriebene Autosensibilisierung
wurde wie folgt getestet?
10 yug Hormon in 0,1 ecm RPMI 1640 Medium wurde zu Sensibilisierungsflaschen
zugefügt, die 4 ecm Kulturmedium enthielten.
In den ersten beiden Untersuchungen (CC.) war das Hormon während
der 6-tägigen Sensibilisierung anwesend. Beim verbleibenden Versuch (G.K.) war das Hormon nur während der ersten 3 Tage anwesend,
dann wurde das Medium ersetzt. Die Lymphocyten wurden entfernt und wie oben auf ihre cytotoxische Wirkung getestet. Die Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
609842/1012
Lymphoc. sensib. Zugabe
Ursprung Fibro- won
Ursprung Fibro- won
Ι/Γ
200/1
Zellanzahl/Loch
L/T : 100/1
L/T ; 50/1
Durch- Durch- Durch-
blasten Hormon* sehn.+S.E. % Vermind. sehn.+S.E. % Vermind. sehn.+S.E. % Vermind.
CC | .** CC | P | cc | |
CC | P | — | ||
CC | • | P | cc | |
CC | ti | P | cc CK.. |
|
6098. | cc cc CK |
* | CK. | |
CK | -- | |||
CK | . | <0,001 | ||
O | XXX | <0,01 | ||
ro | XX | <0,05 | ||
X | £0,05 | |||
587 + 17 | 4 | 427+27 | ry si λ r\ | 505+21 | 7 |
730+41 | 544+25 | 0 | 531+21 | 2 | |
760+13 | 3 | 542+17 | 544+18 | ||
736+33 | 543+44 | 0 | 554+ θ. | -2 | |
360+31 | 5 | 333+29 | 7ΛΛΛΛ | 446+24 | A Q Λ Χ |
504+39 | 503+36 | -2 | 544+11 | 0 | |
529+36 | 32xxx | 491+18 | 522+23 | ||
330+18 | 10 | 228 + 16 | 17* | 353 + 14 | 17χχ |
432+17 | 249+13 | 10 | 459+17 | 3 | |
482+30 | 276+1IIi | 474+23 | |||
* 10/ug Hormon im Sensibilisierungsloch
bilsierung in l/ersuch 1 und 2 anwesend der ersten 3 Tage anwesend
■** Kennzeichnung der Spenderzellen § Verhältnis von Lymphocyten/Zielzellen
während 6-tägiger Sensiin l/ersuch 3 nur mährend
Aus den Daten geht herv/or, daß die Zugabe uon 10 yug des Hormonpräparates
entweder während der gesamten 6-tägigen Sensibilisierung oder nur während der ersten 3 Tage derselben zu den
Löchern in beiden Fällen das Auftreten cytotoxiocher Zellen
verhinderte. Das heißt, daß das Hormonpräparat das Auftreten des Autosensibilisierungsphänomens abblockte. Die Daten zeigen
dj.e potentielle Verwendbarkeit des Präparates bei der Verhinderung
oder Besserung eines andauernden Autosensibilisierungsverfahrens, das ein etiologischer Faktor bei Autoimmunerkrankungen
sein kann.
Lymphocytenautosensibilisierung in vivo
Protokoll: Es wurde das l/erfahran von Beispiel 12 zur Untersuchung
der Wirkung des Hormonpräparates auf die in vivo Autosensibilisierung angewendet. Weiter wurde die wesentliche Rolle der Thymusdrüse
und ihrer Hormone untersucht, die diese Autosensibilisierung
beeinflussen. Das l/erfahren unterscheidet sich von der obigen
in vitro Autosensibilisierung, indem die Autosensibilisierung erreicht wurde, indem man die Zielzellen (MC57M Fibrosarkomtumcrzellen
von Mäusen desselben Stammes), die mit Gastmilzzellen gemischt waren, in eine zellimpermeable Milliporenkammer gab und
diese dann in die Peritonealhöhlung von normalen C57B1/6 Mäusen
oder Mäusen desselben Stammes einsetzte, die im Alter von 1 f-ionat
thymektomisiert worden waren. Das Hormonpräparat wurde in vivo verabreicht; 20 ug wurden 1 Stunde vor und 6 Stunden nach
der Kammerimplantation und dann jedem Tag bis zum Tag 4 der Sensibilisierung
injiziert. Am Tag 5 wurden die Tiere geschlachtet: die Zellen, meist Lymphocyten, wurden aus jeder Kammer gewonnen
609842/1012
51
und unter Verwendung von mit Cr gekennzeichneten Fibroblasten (von Mäusen desselben Stammes) als Zielzellen auf Cytotoxizität untersucht. Es uiurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
und unter Verwendung von mit Cr gekennzeichneten Fibroblasten (von Mäusen desselben Stammes) als Zielzellen auf Cytotoxizität untersucht. Es uiurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
Kammer füllung Zellanzahl/Lach % Verminderung
Durchschn.+S.E.
Tx + Hormon* - 429+13 -2+
Tx 294+ 7 . · 30+++
intakt (Geschwister
desselben Wurfes) 393+ 9 6+
b 420+20
a + + + ρ < 0,001; ■-+ P <0,01; + P >
0,05
b es wurden frisch hergestellte Milzzellen als Kontrollen
verwendet
verwendet
* entsprecnend Stufe 4 der Tabelle von Beispiel 2
Die obigen Daten zeigen, daß die in vivo Injektion des Hormonpräparates
bei thymektomisierten Mäusen die Entwicklung einer
Autosensiblisierung der Lymphocyten von Mäusefibrosarkomzellen enthaltenden Kammer wirksam abblockte. Diese Daten zusammen mit den obigen Beispiel für das Abblocken der in vitro Autosensibilisierung durch das Hormon zeigen weiter die potentielle Brauchbarkeit des Hormonpräparates bei Erkrankungen beim Menschen, in welchen eine etiologische Komponente die Autoimmunisation, d.h. die Unfähigkeit, sein "Selbst" zu erkennen, ist.
Autosensiblisierung der Lymphocyten von Mäusefibrosarkomzellen enthaltenden Kammer wirksam abblockte. Diese Daten zusammen mit den obigen Beispiel für das Abblocken der in vitro Autosensibilisierung durch das Hormon zeigen weiter die potentielle Brauchbarkeit des Hormonpräparates bei Erkrankungen beim Menschen, in welchen eine etiologische Komponente die Autoimmunisation, d.h. die Unfähigkeit, sein "Selbst" zu erkennen, ist.
Es folgen repräsentative pharmazeutische erfindungsgemäQe Präparate
(pro Dosis), dargestellt für ein Präparat entsprechend
der letzten Stufe der Tabelle von Beispiel 9.
der letzten Stufe der Tabelle von Beispiel 9.
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A. menschliches Präalbuminpräparat Natriumchlorid
Wasser zur Injektion q.s.
B. menschliches Präalbuminpräparat
monobasisches Natriumphosphatmonohydrat
dibasisches Natriumphosphat Natriumchlorid
Wasser zur Injektion q.s. .
C. menschliches Präalbuminpräparat Mannit
Wasser zur Injektion q.s*
D. menschliches Präalbuminpräparat monobasisches Natriumphosphatmanohydrat
dibasisches Natriumphosphat Mannit
Wasser zur Injektion q.s.
Alle festen Bestandteile uiurden in Wasser gelöst und in einer
sterilen Phiole lyophilisiert. Vor der Verabreichung wurde Wasser zum Lösen der Feststoffe zugefügt. Für zu mehrfachen Dosen verwendbare
Phiolen wird es bevorzugt, daß man Wasser verwendet, das ein Konservierungsmittel, wie 1,2 mg Methylparaben/ccm und 0,12
mg Propylparaben/ccm, enthält. Rekonstituierte Präparate können bei 40C. bis zu 2 Wochen gelagert u/erden.
26 | 12015 | 25 mg | ecm |
1,0 | mg | 1,0 | |
9,0 | mg | ||
1,0 | ecm | ||
1,0 | mg | ||
5,4 | η, «3 | ||
8,66 | mg | ||
2,52 | mg | ||
1,0 | ecm | ||
1,0 | mg | ||
100 | mg | ||
1,0 | ecm | ||
1,0 | mg | ||
5,4 | mg | ||
3,66 | mg |
609842/1012
Claims (1)
- Patentansprüchei,- Pharmazeutisches Präparat zur Erhöhung deX immunologischen Abwehr, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an menschlichem Serum-Präalbumin in Miscnung mit einem nharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger.f2>- Verfahren zur Herstellung eines uon Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte menschliche Blutfraktiona. einer molekularen Filtration auf einem Kohlfaser-fraktionator zwecks Ausschluß eines Material mit einem Molekulargewicht über etwa 6C-7Q QOQ Daltons und unter etwa 10 QOu Daltons;b. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidgelkolonne,die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert ;c. einer Wiederholung der Stufe .(b) oder einer Freiflußelektrophorese,d. einer präparativen Gelelektrophorese auf einer Polyacrylamidscheibe unde. einer Chromatographie auf einem Mikro-Polysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,unterwirft.3.- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn IV-1 Fraktion for Stufe (a) lyophilisiert wird.609842/10 124.- l/erfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) das Material mit hohem Molekulargewicht vor dem
niedrig molekularen Material entfernt wird.5,- Vorfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) und (e) als Polysaccharidgel ein vernetztes Dextran verwendet wird.6,- Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daiJ in Stufe (b) und (e) ein Eluierungspuffer mit ainem pH-Wert zu/ischen etwa 7,8-8,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen
etwa 0-1D0C. liegt.7.- Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) eine Wiederholung von Stufe (b) ist.8.- Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Freiflußelektrophorese in Stufe (c) bei einem pH-Wert zwischen etu/a 5,0-5,5 angewendet wird.9.- Verfahren nach Anspruch 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) die präparative Palyacrylamidscheiben-Gelelektrophorese ein Separatnrgel und einen Eluierungspuffer mit einem
pH-Wert zwischen etwa 8,5-9,5 verwendet.10,- Verfahren nach Anspruch 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daßdie gewünschte(n) Fraktion(en) aus jeder Stufe durch Bezug aufden Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder durchBestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wild (werden)11.- Verfahren zur Herstellung eines von cytotoxischen Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte
menschliche Blutfraktion609842/1012a. einer molekularen Filtration auf einem Hohlfaserfraktionator zum Ausschluß des Materials mit einem Molekulargewicht über etwa 60-70 000 Daltons und unter etwa 10 000 Daltons undb. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidyelkülonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,unterwirft.12,- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn IW.1 Fraktion vor Stufe (a) lyophilisiert wird.13.- Verfahren nach Anspruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) das Material mit hohem Molekulargewicht vor dem niedrig molekularen Material entfernt wird.14.- Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein vernetztes Dextran als Polysaccharidgel verwendet wird.15.- Verfahren nach Anspruch 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein Eluierungspuffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-8,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen etwa 0-100C. liegt.16,- Verfahren nach Anspruch 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die gewünschte(n) Fraktion(en) aus jeder Stufe durch Bezug auf den Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder Bestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wird (weiden).17.- Verfahren zur Herstellung eines von Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte mensdiiche Blutfraktion'60984 2/1012a. einer Ammoniumsulfatfraktionierung,b. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten ncch dem Molekulargewichtfraktioniert,c. einer Wiederholung von Stufe (b) oder einer Freiflußelektrophorese,d. einer präparativen Polyacrylamidscheiben-Gelelektrophorese unde. einer Chromatographie auf einer Mikropolysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,unterwirft.18,- Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn-IV-1 Fraktion vor Stufe (a) lyophilisiert wird.19,- Verfahren nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) die Arnmoniumsulfatfraktionierung die aufeinander folgende Zugabe von Ammoniumsulfat zu einer Lösung aus roher oder lyophilisierter Cohn-IV-1 Fraktion in u/ässrigem Puffer bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-8,2 und einer Temperatur zwischen etwa 0-5 C, wobei jede derartige Zugabe zur Bildung eines Niederschlag und einer überstehenden Flüssigkeit führt» und die Abtrennung des Niederschlages von der überstehenden Flüssigkeit nach jeder Zugabe umfaßt.20.- Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Niederschlag aus einer Ammoniumsulfatzugabe, die den Ammoniumsulfatgehalt der wässrigen Lösung von etwa 40-^igac auf etwa 60-;bige Sättigung erhöht, in der nächsten Stufe verwendet wird.609842/101 221.- Verfahren nach Anspruch 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) und (e) ein vernetztes Dextran als Polysaccharidgel verwendet i"ird.22,- l/erfahren nach Anspruch 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) und (e) ein Eluierungspuffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-8,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen etwa 0-10°C. liegt.23,- Verfahren nach Anspruch 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe (c) eine Wiederholung von Stufe (b) ist.24,- Verfahren nach Anspruch 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) d.i°. präparative Polyacrylscheiben-Gelelektrophorese ein Separatargel und ein en Eluierungspuffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 8,5-9.5 verwendet.25.- Verfahren nach Anspruch 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Stufe (a) und nach Stufe (b) erhaltene Material vor der Verwendung in der nächsten Stufe entsalzt und lyophilisiert wird.26,- Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Stufe (a) erhaltene Material durch Dialyse entsalzt und das nach Stufe (b) erhaltene f.aterial durch Diafiltration entsalzt mird,27.- Verfahren, nach Anspruch 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die gewünschte(n) Fraktion(en) aus jeder Stufe durch Bezug auf den Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder Bestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wird (werden) .609842/101?28.- Verfahren zur Herstellung eines von cytotoxischen Verunreinigungen praktisch freien menschlichen Serum-Präalbumins, dadurch gekennzeichnet daßmman die als Cohn IV-1 Fraktion bekannte mensch-1iche Blutfraktiona. einer Ammoniunisulfatfraktionierung undb. einer Chromatographie auf einer Polysaccharidgelkolonne, die die darauf aufgebrachten Komponenten nach dem Molekulargewicht fraktioniert,unterwirft.29,- Uerfehren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn IV-1 Fraktion vor Stufe (a) lyophilisiert wird.30,- Verfahren nach Anspruch 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) die Ammoniumsulfatfraktionierung die aufeinander folgende Zugabe von Ammoniumsulfat zu einer Lösung aus roher oder lyophilisierter Cohn IV-1 Fraktion in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 7,3-8,2 und bei einer Temperatur zwischen etwa 0-5°C, wobei jede Zugabe zur Bildung eines Niederschlages und einer überstehenden Flüssigkeit führt, und die Trennung des Niederschlages von der überstehenden Flüssigkeit jeder Zugabe umfaßt.31.- Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der aus einer Ammoniumsulfatzugabe, die den Amrnoniumsulfatgehalt der wässrigen Lösung von etwa 40 % Sättigung auf etwa 60 % Sättigung erhöhte, erhaltene Niederschlag in der nächsten Stufe verwendet wird.32,- Verfahren nach Anspruch 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein vernetztes Dextran als Polysaccharidgel ver-809842/1012wendet wird.33.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein Eiuierungspuffer p>it einem pH-Wert zwischen etwa 7,8-b,2 verwendet wird und die Temperatur zwischen etwa 0-10 0-100C. liegt.34.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe (b) zwei Mal nacheinander durchgeführt uiixd.35.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Stufe (a) und das nach Stufe (b) erhaltene Material vor Verwendung in der nächsten Stijfe entsalzt unü lyophilisiert wirde36.- Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß dasnach Stufe (a) erhaltene Material durch Dialyse entsalzt und dasnach Stufe (b) erhaltene Material durch Diafiltration entsalzt wird.37.- Verfahren nach Anspruch 28 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß die aus jeder Stufe gewünschte(n) Fraktion(en) durch Bezug auf den Molekulargewichtsbereich ihrer Komponenten und/oder Bestimmung der thymushormonartigen Wirksamkeit bestimmt wird (werden).Der Patentanwalt:609842/1012
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