WO1996030539A1

WO1996030539A1 - Allergene d'acarien obtenu grace au genie genetique et son procede de fabrication

Info

Publication number: WO1996030539A1
Application number: PCT/JP1996/000791
Authority: WO
Inventors: Chiharu Nishiyama; Toshifumi Yuuki; Yasushi Okumura
Original assignee: Asahi Breweries, Ltd.; Torii Pharmaceutical Co., Ltd.; The Nikka Whisky Distilling Co., Ltd.
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 1996-10-03
Also published as: US6187311B1; EP0819763A4; JP3316535B2; EP0819763B1; DE69633857D1; DE69633857T2; AU5120196A; ES2229263T3; AU689382B2; EP0819763A1

Description

明細書

ダニァレルゲンの改変体およびその製造法技術分野

本発明は、遣伝子工学によるヒヨウヒダニの主要アレルゲン (Der f 〖1) を改変した改変アレルゲン、その製造法に関するものであり、この製造法により製造された改変ァレルゲンは、ァレルキー疾患の治療薬として応用できる。

背景技術

アレルキー疾患の多くは、その疾患の原因抗原に感作されることにより、血'清および組織においてアレルゲンに特異的な I g E抗体が産生され、再びその抗原：こ暴露されることによって、各組糨上て抗原と 1 g E抗体が抗原抗体反応を起こし、その際生じる種々レっ症状によるものと考えられている。待に、肥満細胞およ好塩基球上の 1 g E抗休に抗原が桔合し、 i g E抗体間に架撟か起こることによって、肥満細胞あるいは好塩基球から種々の化学伝達物質が放出されて、即時型反応が生しると考えられている。

このアレルギー疾患を治療する方法として、抗原が 1 g E抗体に結合することを制御する方法が考えられている。抗原が 1 g E抗体に結合することを抑制すれば、肥満細胞あるいは好塩基球上の I g E抗体間の架橋が起こらず化学伝達物質の放出が抑制されて治療効果が得られるものと考えられている。

一方、気管支喘息、小児喘息、トビ-性皮 jf炎などのアレルキー疾患は、室塵中に生息しているダニに対するァレルギ一が主な原因であることが明らかになっており、 E31にいくつかのダニ主要アレルゲンタンパク質が同定されている（プラノ ·：■>ミルズ（Platts-rtUls) ら、ザ . ジャーナル . オフ' . ァレルギ一 · ァンド · クリニカル ' ィムノロジ一（j. Allergy Clin. Immunol. , 80巻、 55頁、 19 87年）。また、精製ダニ主要アレルゲンを多量に調製する方法も既に開示されている（結城ら、アレルギ— （Japanese J. Allergology). 39卷、 557頁、 1990年および特願平 3-254683) 。さらに、前述の精製ダニ主要アレルゲンの一部を改変したアレルゲンおよびその製造法も出願されている（特願平 5- 139793) 。

しかしながら、これまで報告されている同定されたダニ主要ァレルゲンタンバク質においては、ァレルゲンとしての活性が高いために減感作療法を行った場合にァレルギ一反応であるアナフイラキシーショックを起こす欠点があった。一方、 1 g E抗体との結合活性もしくはアレルゲン活性が低下し、かつ抗原（ Der f I I ) と I g E抗体の結合を阻害する改変ダニ主要アレルゲンが得られれば, 抗原投与によるァレルギ一反応のァナフィラキシ一ショフクが生じることがなく . 抗原に特異的であるために他の免疫系に影響を及ぼさない特徴を有する有効なァレルギ一冶療薬を提供できる。改変ダニ主要アレルゲンとしては、既に特願平 5- 139793、特願平 5-275897がある。前者で：よ、改変したアミノ酸残基によって立体構造が大きく変化したため、免疫原性の維持および安定性の点で問題が残っており、後者では改変する部位の特定が十分ではなく、かつ置換するアミノ酸がァラニンのみであるため、構造変化を最小にしてかつァレルゲン性を低下させる点で十分ではなかった。

本発明者等は、既に開示されているダニ主要アレル V'ン Der f ! 1の特定部分のァミノ酸をそのァミノ酸と極めて類似したァミノ酸に置換し、搆造変化を最小にした状態で、 1 g Ε詰合活性を変化させ得ることを見出した。その改変ダニ主要アレルゲンの中には、抗原（Der f I I ) が I g Eに結合することを IS害する活性が、野生型と差異のないものがあることを見いだした。

本発明の目的は、遺伝子工学を用いてダニ主要アレルゲン Der f Πのアミノ酸残基を他のァミノ酸残基に置換した改変ダニ主要ァレルゲンを多量に ¾製する方法を提供することである。すなわち、本発明は、ダニマレルゲンに起因するァレルギ—疾患の治療薬に応用できる物質を製造することを目的とする

発明の開示

本発明は、コナヒヨウヒダニ主要アレルゲン（Der f I I ) を遺伝子工学的に改変し、そのァミノ酸残基を他のァミノ酸残基に置換した改変ダニ主要アレルゲン、 Der f I Iをコードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転換した原核生物または真核生物を培養し、培養物から改変ダニ主要ァレルゲンを取得することを特徴とする。

ダニ主要アレルゲン Der f I Iは、 6個のシスティン残基を有し、ジスルフィド結合によって分子内架橋を 3力所（ァミノ酸残基 8番目と 1 1 9番目、 2 1番目と 2 7番目および 7 3番目と 7 8番目）所有することが既に開示されている（西山ら、ィンターナショナル · ァーカイブス · ォブ . アレルギー · アンド · ィムノロジ— ( I n terna t i ona l Arch i ves o f A l l ergy and I mmun i l ogy ) 、 101巻、 159頁' 1993年）。また、遣伝子工学的手法を用いて分子内に存在するジスルフィド結合を 3力所から 2力所に減らした置換体を作製して I g Eとの桔合活性に与える影響が開示されている（特願平 5 - 139793) 。これによれば、 8番目と 1 1 9番目のジスルフィド桔合が桔合活性に大きく影響するとされている。

本発明者等は、さらに検討を重ね 7 3番目のシスティンと了 3番目のシスティンがジスルフィド桔合している領域も I g E桔合に閲与していることを見いだした。また、置換するアミノ酸もァラニンのみではなく、本来のアミノ酸に極めて近い性質を有するァノ酸、洌えば 7番目のァスパラギン該をグルタミン酸あるいはァスパギンに変更しても大幅に I g E結合能を低下できることを見いだした。また、 1 9番目のァスパラギン酸にあってはグルタミン酸に変更しても I g E結合能の低下は認められないが、ァスパラギンに変更すると大幅に i g E結合能が低下し、このァミノ酸残基にあつて電荷の有無が大きな影響をもつことを見いだした。加えて、例えば 9番目のァラニンでいえば、口イシ二に置換すると ¾合活性は 3 0 %程度であるのに対し、本発明で示すようにプロリンに変更することにより 1 0 %以下まで結合活性を低下させ得ることを見いだし。これら桔合活性が大きく変化した改変体のうち、ダニアレルギーを生せしめたマウスを用いた動物実!^により、有効な改変休を見いだした。これにより、クニアレルギ一患者の减慼作治療に有効てある改変体を見いだし本発明を完成し。

本発明の置換休は合目的な任意の方法で製造することができるか、部位特異的変異の方法が望ましい。部位特異的変異を行う手法は既に確立されており、様々な方法があるが P C R法を用いるのが簡便である（伊藤ら、ジーン（Gene) 102 巻、 67頁、 1991年）。例えば配列表 1 — aに示した D N A鎮より番目のァスパラギン駿残基をグルタミン酸残基に置換する方法を 1例として示すと次の通りである。

配列表 1から 7番目のァスバラギン酸残基に対応するコドンは G A Tである。このコドンをグルタミン酸残基に対応するコドン、例えば G A Gに置き換えることとした。そのためにァスパラギン酸残基周辺の D N A配列と同一でかつァスパラギン酸残基のコドン（G A T ) のみグルタミン酸残基のコドン（G A G ) に置換したォリゴヌクレオチドを合成した（表 1 、 F— D 7 E) 。この合成は、既知の合成法によって合成することができるが、自動合成機を用いる事が便利である (例えば Model 381 DNA Synthesizer; Applied Biosystems 社製）。

P C R法による増幅のための ί寿型 D N Aは配列表 1に示した Der f IIの c DN Aを含んでいれば任意の D N A钹が利用できる力ここでは p F L T 1 1 (図 1 ) を使用した。铸型とする p F L T 1 1に対し、 p F L T 1 1上、 Der f 11をクロ一二ングしている部位の下流側にある Hind 11 ,5識配列を含む領域と同じ己列の合成ヌクレオチド R 1 (表 1 ) と前途の合成ヌクレオチド F— D 7 Eをプライマ一として用い P C R反応を行った。

P C R反応後、得られる增幅 D N A断片はダイデォキシ法 (サンガー danger) ら、ジャーナル ' ォブ ' モレキュラー ' バイオロジー（J. ,1ο 1. Biol .)、 162巻、 729-773頁、 1982年）などを用いてその塩基配列を決定できる。

かくして、確かに変異が導入されていることを確 ¾した置換 D N Aは適当な発現ベクターのクローニング部位に挿入して、改変 Der f IIを発現させる事ができる。この発現には大腸菌で安定的に存在するプラスミドベクターならば任意であるが、例えば p G EM E X 1 (Promega社製）を用いるのが便利である。本べクターは発現プコモータに T 7プロモータを用いており、その発現量が多く組換え蛋白は大腸菌中で封入体として蓄積することが知られている。これらの一連の操作は従来用いられてきた種々の方法を使用することができる（マニアチス（Mani atis) ら、モレキュラー · クローニンク ·' (Molecular Cloning) 、コールド · スブリング ·ハーバー · ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory) 、 1982 年）。

また本 D N Aは適当なベクター、例えば Y E p 1 3 (ブローチ（Broach) ら、ジーン（Gene) 、 8巻、 121— 133頁、 1979年）などを用いて、酵母中で発現させることができる。本発明に従った改変 Der f 11遺伝子を伴う発現カセットを持つ酵母ベクターを用い、適当な酵母細胞を形質転換することができる。この目的のため、本発明に従った D N A配列は、大腸菌プロモータではなく、真核性プロモ一タ、例えば厶 P 8 (大竹ら、ァグリカルチュラル ' アンド ' バイオロジカル ' ケミストリー（Agric. Biol. Chem.) 、 52巻、 2753— 2762頁、 1988年）などの制御下におかなければならない。

このようにして、ダニ主要アレルゲン Der f I Iの N末端側から第 7番目、第 9 番目、第 1 9番目、第 1 2 8番目、第 1 2 9番目のァミノ酸をそれぞれァラニンを除く別種のアミノ酸に置換した改変プラスミドを作製し、それぞれを大腸菌で発現させた。

次に、改変 De_r f I Iの I g E抗体結合活性を定量的に測定した。それに先だつて、それぞれの改変 Der f I I蛋白の精製が必要となる。その概略を以下に示す。発現誘導後のホス卜大腸菌 BL21の菌体を回収し、超音波により菌体を破砕後、遠心分離にて封入体の形で存在する Der f Π蛋白を回収した。 6 Μ尿素で封入体を可溶化した後、 20mMト ' I ス塩酸緩衝液（p H 8. 5) に折して尿素を除去すると共に蛋白の再生を行った。次に、陰ィォン交換ク πマトグラフィ一により Der f I I画分を分離精製した。すなわち、. 再生画分を DEAE - Toyopear l (Tosoh社製）力ラムに吸着させ、 NaC 雇度 80mMで溶出させると、 Der f I Iは単一の蛋白として瑢出された。

こうして得られた精製改変 Der f I Iを用い I g E抗体結合活性を定量的に測定した。このためには R A S T— E I Aキット（Pharmac i a社製）を用いるのが便利である。先ず、 0. 1 M ほう酸緩衝液（p H 8. 5〉で希釈した精製改変 Der f I I ；容液にブロムシアン活性化濾紙 1枚を浸し室温て一夜静置して、蛋白を瀘纸に結合させた。洗浄した後、キント付属の锾衝液で 4倍希釈したダニアレルギ —患者血清 50 1 に濾紙を浸し、 37 で 2時間静置して血清中のヒト抗 Der f I I I g E抗体と濾紙に,結合している抗原を桔合させた。この後、キッ卜の反応プロトコールに従い反応を進めた。全反応終了後の試料の 420n_m の吸光度が 1 g E抗体結合能の指標となる。この結果を相対値として図 2に示す。この中で特に注目すべきは、 7番目及び 1 9番目のァスパラギン酸をァラニン、ァスバラギン、グルタミン酸に置換した改変体である。 7番目に関しては、いずれのアミノ酸に置換しても I g Eとの結合能は、本来のァスパラギン酸であるものと比較して大幅に低下していることから、 7番目のアミノ酸はァスパラギン酸であることが I g E結合に必須であることがわかる。一方、 1 9番目に閭してはァラニン、グルタミンに置換した改変体では結合能の大幅な低下が認められるが、グルタミン酸に置換した改変体ではほとんどその結合能が低下していない。このことから、この位置では酸性アミノ酸であることが I g E結合能に必要と考えられる。 9番目のァラニンについては、口イシンに置換した改変体では本来の約 30 %の合能を持つているのに対し、プロリンに置換した改変休では 10 %以下に結合活性が低下していることから、蛋白の構造変化に大きく寄与するァミノへの置換はその結合能を低下させることが判明した。

次に、これら I g E結合活性が低下した改変体を用いた動物実験を行い、减感作治療に有効か否かを確かめた。すなわち、 7週齢の雄 A / ' Jマウスに Der f I I を 100 i gのフコイントアジュバンドと共に腹腔内に投与して Der f I I感作マウスを作成した。いて作成した感作マウスに改変体を lmg/m lの量を週 2回、 3週間経投与し免疫療法を行った。対照は生理食塩水を同量投与し。最終の投与の 1週間後にマウスを小動物用吸入チヤンバーに入れ霧化し 7こ 5 1の Der f I Iを 30分間吸入させた。吸入終了後 24時間後にマウスを放血致死させ、気管を通じ肺内を 1 m lの P B Sで洗浄した。この肺胞洗浄液（以下、 B A L Fと略す）について塗末標本を作製し、ディフクィソク染色した。標本を倍率 400倍にて検鏡し、一定視野あたりの白血球（マクロファージ、好中球、好酸球、ェンバ球）数を測定し、気道炎症の程度の指標とした。感作していないマウスでは抗原吸入後の B Aし F中の白血球はマク口ファージ以外ほとんど観察されないのに対し、免疫したマウスで ^非免疫群に比較して多数の好中球、リンパ球が確認され、全白血球数は約 2. 5倍となった。すなわち、感怍マウスにおいては抗原の吸入により気道内炎症が惹起されたことを確認した。これに対して、野生型 Der f Πあるいはその置換体を投与した群では、全白血球数が減少しており、減慼作が成立していることが明らかとなった。従って、 I g Ε結合活性の低下したァナフイラキシーショソクの可能性が少ない Der f Π改変休はアレルギー疾患の治療に有効であることが明かである。

図面の簡単な説明

図 1は、 P C R法による增幅のため使用した p F L T 1 1を示す図。

図 2は、実施例 2において反応液の 420nmにおける吸収を測定し、この値を抗原 Der f I Iとヒト I g E結合活性として評価を行った結果を示すグラフである。

* 1

5 発明を実施するための最良の形態

次に、実施例に基づき本発明を一層具体的に説明する。

実施例 1 Der f IIアミノ酸置換変異体の発現ベクターの構築

Der f IIの目的のァミノ酸残基を他のァミノ酸に置換した変異体を発現するべクタ一は P C R法を用いた部位特異的変異で作製した。 P C R法を行うにあたり合成したオリゴヌクレオチドは、表 1に示すとおりである。

表 1 置換体作製に用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列

ォリゴヌクレオチド配列'

(突然変異休） de

10 F-D7E I spTG 1 u> 5' -GCCATATGGATCAAGTCGATGCTAAAGAGTGTGC-3'

F-D7N (AspTAsnJ 5' -GCCAT TGGATCAAGTCGATGCTAAAAATTGT3C -3^:

F-D7 (AspTLysj 5' -GCCATATGGATCAAGTCGATGTTAAAAAATGTGC-3'

R-A9P (.Ua9Pro) 5' -CATTGTTGGGACAATCTTT-3'

-D19E(As_P19Glu) 5' -GTGGCAACCTTCGACCATTAC-3'

R-D19N(Aspl9Asn) 5' -GTGGCAACCGTTGACCATTAC-3^;

R-D19 (As_P19Lys> 5' -CCGTGGCAACCTTTGACCATTAC-3'

R-R128D(Argl28As_P) 5' -CGAAGCTTAATCATCGATTTTAG-3'

- 128 (Argl28Lysi 5' -CGAAGCTTAATCTTTGATTTT 3'

R-D129\(Aspi29Asn' 5' -CGAAGCTTAATTACCGA-3'

0 Hind III

Rl 5' -ATCAAGCTGGGATTTAGGTG-3'

Fl 5' -CCCCGCGCGTTGGCCGATTC-3'

F2 5' -GCCCGGGAGTTCTCGATCCC-3'

5 gl ¹¹

F3 5* -CCGATTCATTAATGCAGCCC-3'

* ：ァミノ酸置換体のミスマッチは太字で示し、制限酵素の認識部位は下線で示した。

Der f IIの N末端側から 7番目の Aspを Gluまたは Asnに変異させる場合、合成才リゴヌクレオチドは、変異させる目的のァミノ酸のコドンを Gluまたは Aspのコドンとする以外は野生型 Der f IIと同じ配列とし、さらに開始コドンの上流に制限酵素 Nde 1の認識配列を新たに導入するように設計した。 ί寿型とする野生型 Der f IIの発現ベクター PFLTII (特願平 5- 139793) に対し、 pFLTll上、 Der f IIをク口—ユングしている部位の下流側にある Hind III ¾識配列を含む領域と相補的な配列の合成ヌクレオチド R1と、前述の合成ヌクレオチド F-D7E、あるいは- D7N をプライマーとして用い P C R反応を行った。 P C R反応溶液は以下に示すとおり、 ί寿型となるプラスミド pFLTllを 1 ngに、 2種類のブライマ—、 F- D7Eと R 1 、あるいは F-D7Nと R 1 を 1 ずつ加え、 TaqD N Aボリメラーセ（東洋紡）添付の lOx反応溶液、および 25mM MgCl₂溶液を 1 ずつ、 d A T P、 d C T F'、 d GT P、 d T T Pをそれぞれ反応溶液 100 1 に対して柊屠度 200 となるように添加し、蒸留水で反応溶液の容量を 100 1 とした後、 TaqD N Aボリメラーゼを 2.5ュニノト加えた。この溶液を 94 で 1分間保持して縛型の 2本镇 D N Aを変性させ 1本鎖とした後、 37'Cにて 2分間保持して 1本钹の铸型にブライマーをアニーリングし、 ^く 72て 3分間の反応でボリメラーゼによる相補鎖 D N Aの合成を行う。以上の工程を 2 5サイクル橾り返して目的 D N' Aフラグメントの增幅を行つた。

得られた D N Aフラグメントを Nde 1および Hind ΠΙで切断後、ブラスミド pG EME1- ANde I (特願平 5- 139793) の Nde し Hind 111部位に挿入してそれぞれ変異'本の発現ベクター _PFLT11-D7E、 D7N とした。一方、 9番目のアミノ酸や 19番目のアミノ酸を置換する場合は、次に示す二段階の P C R反応を行った。すなわち、表 1に示すとおり変異を導入するァミノ酸残基のコドンのみを目的のコドンとし、それ以外は野生型 Der f IIと同じ配列の合成ヌクレオチド R-A9P、 R-D19Nを作製し、これらのいずれかと pFLTllの Bgl II切断部位より約 40bp上流と同じ配列の合成ヌクレオチド F 1をプライマ一とし、 pFLTllを铸型として用いて P C R反応を行った。同時に、 pFLTll上の Bgl II部位を同酵素で切断不可能な配列となるように設計した F 2と前述の R 1をブライマ一として用い、同じく pFLTllを铸型として P C R反応を行った。

P C R反応で得られたこれら 2種類の D N Aフラグメント 10ngずつを、先の P C R反応溶液からプライマーとボリメラーゼを除いた溶液中に加え、 94でで 10分間反応させた後、 30分間で 37'cまで緩やかに冷却し、最後に 37てで 15分間保持することにより 2本のフラグメントのァ二一リングを行った。続いて Taqボリメラーゼ 2.5ュニットを加え、 60'Cて 3分間保持することにより、 2本の D MAフラグメントの伸長を行った。ここに、先の 2種類のブライマ一 R 1 と F 1を 0.5/ g すつ加えた後、 P C R反応を 20サイクル行ってフラグメントを增幅した。以上の操作で、同じ長さの 2種類の D N Aフラグメントが得られる。一つは、 Bgl i 識配列を持ち、目的のアミノ酸部位に変異が導入されたもので、もう一つは目的のアミノ酸の配列が野生型と同じて、 Bgl 11¾識配列が切断不可能に変異したもである。これらを Bgl IIおよひ' Hind IIIで切断後、同じく Bgl IIと Hind IIIで ¾理した pGE EXl - ANde Iに連結するこ上により目的の変異が導入されたべクタ一のみが得られた。このようにして 9番目と 19番目のアミノ酸をそれぞれ Pro、 As nに置換した変異型 Der f IIの発現ベクター、 pFLTll-A9P、 pFLTl 1 - を作製し 128番目と 129番目のアミノ酸を置換した Der f II変異体 R128D、 R128K、 D129N を作製する場合、了番目のアミノ酸の置換体と同様の P C R法で行つ。ただしプライマーはそれぞれ R-R128D、 R- 128K, または R-D129Nと、 Der f Πの開始コドンより約 130b_P上流と同じ配列の F 3 という組合せて用い、それ以外の条件は D7E等の場合と同一てある。この P C R増幅断片を A9P等の場合と同様、 Bgl II、 Hind illで切断し、 pGEME - ANde こ挿入した。

実施例 2 R A S T - E I A法による Der f IIァミノ酸置換変異体の 1 g E結合能の比較

実施例 1 で作製した Der f II変異体の発現べクタ— （pFLTll- D7E、 _PFLT11-D7N. PFLT11-A9P. PFLT11-D19N) のそれぞれにより形質転換した大腸菌 BL21をアンビシリン入り寒天培地（ 1 %バクトトリフ 'トン、 0.5%ィ一ストエキストラクト、 0,5%塩化ナトリウム、 1.5%バクトァガー（以上すベて単位は（WZV) 、 50 " gZmlアンビシリン、 p H7.4) 上に生育させた後に生じたコロニーを適宜アンビシリン入り L液体培地（アンビシリン入り L寒天培地より寒天を除いたもの） 5 miへ接種した。 30でで一晩振盪培養した後、これをアンビシリン入り L液休培地 500mlに添加してさらに 30てで振盪培養を行った。この培養液の、 600nmに於ける吸光度が 0.4に達したところでイソプロビル— /9—チォガラクトビラノシド（ I P TG) を O.lmflとなるように加えさらに 5時間振 if培養を継続することにより、目的蛋白質の発現誘導を行った。次に各 Der f II変異体を発現した大腸菌 BL21の菌体を遠心分離で回収し、超音波破砕で菌体を破壤した後、再び遠心分離を行つて封入体となっている Der f II変異体を回収した。尿素を含む锾衝液（ 6 M尿素、 lOOmMトリス塩酸、 10mMエチレンジァミン 4酢酸（E DTA) 、 p H7.5) で封入体を可溶化した後、トリス锾衝液（20mMトリス塩酸、 p H8.5) に透折することにより再生を行った。この溶液を、上記トリス緩衝液て平衡化したイオン交換力ラム D E A E— トヨパール（東ソ一）へ供した後、塩化ナトリゥムの濯度勾配（ 0から lOOmM) にて;容出を斤った。塩港度約 80mMにて;容出された画分を S D S— P AGEに供した結果、分子量約 14,000の単一バンドが観察され、これを精製標ロロとした。

野生型 Der f IIおよび各変異体についてヒト I g E結合活性をフアルマシア社製 R A S T— E I Aキットを用いて測定した。操作は以下に示すとおり、まず 0.1 Mほう酸锾衝液（p H8.5) にて希釈した抗原溶液 50 1にブロモシアンで活性化した濾紙 1枚を浸積し、室温でー晚放置することにより濾紙に抗原を吸着させた。つぎに抗原溶液を除き、 0.1M炭酸水素ナトリゥム溶液 500 〖で濾紙の洗浄を行つた後、 1 M —ェタノールァミン（ p H 9.0) 250 I中に濾紙を ¾し、室温で 3 ϋ寺間静置して濾紙上への非特異的吸着を防ぐブロノキング操作を行った。エタノールァミン溶液を除き、 0.1M炭酸水素ナトリゥム溶液 500 1で 1回、 0.1M酢酸ナトリゥム緩衝液（Ρ Η4.0) 500 " 1で 3回、キント付属の瑷衝液 500 で 2 回の、計 6回洗浄を行った後、同じくキッ卜付属の锾衝液で 4倍に希釈したァレルギー患者血清 50 1を添加し、 37 で 2時間静置して血清中の抗 Der f II - I g Eと濂紙に吸着している抗原を結合させた。

抗原抗体反応後血'清を除き、キント付厲の洗浄液 2.5ml中に濾紙を 10分間浸して洗浄する操作を 3回操り返した後、キット付属の^ - D-ガラクトシダーゼ摞識した抗ヒト I g E -ゥサギ I g G瑢液 50 1を加えて室温にて 16〜20時間静置することにより、抗原に吸着している I g Eとの結合反応を行った。 g孝素標識抗体溶液を除いて前述と同様の方法で瀘紙を洗浄し、基質であるキノト付属の 0 - ニトロフヱノール— — D—ガラクトペラノシド溶液 200 1を加えて 37てで 2時間反応させた。最後にキント付属の停止液 2 mlを加えて酵素反応を停止した後、同反応液の 420nmにおける吸収を測定し、この値を抗原 Der f IIとヒト 1 g E結合活性として評価を行った。この結果は、図 2に示すとおりである。 D7E、 D7N、 A9P、 D19Nの各 Der f II変異体は、野生型と比べて 1 g E結合活性の著しい低下が認められた。すなわち、 Alaへの置換の実験から Der f IIのヒト I g Eェビト —プを形成するのに重要であると考えられたアミノ酸 Asp7、 Aspl9を、 Aspのような負電荷を持たない Asnに置換することによつても、 Ala置換体と同様に著しく 1 g E結合活性が低下することが判明した。 As_P7については、 Asp同様負電荷を持つアミノ酸てある Glu に置換しても、 I g E結合活性が低下し Γ：。また、 Der f 11の ΐ忍識部位、あるいはその近傍に存在すると考えられる A 1 を側鑌搆造の全く異なる Proに置換することにより、変異体 A9L (Ala9を Leuに置換し変異体）より更に I g 合活性が大きく低下した変異体を作製すること:こ成功した。

実施例 3 Der f IIアミノ酸置換変異休の减感作療法における有効性評価試験 [材料と方法]

-免疫

7週齢の AZ J系マウス 24匹に、 2週間間隔て 3回にわたり 10 のリコンピナント Der I II (以下 rDer f IIとする）と 100 ' 1のフロイン卜アンュノ、 'ントを腹腔内投与した。

-試钹群

免疫を行った 24匹のマウスを 1群 6匹からなる、対照群、 rDer f II投与群、 D7N投与群、および D19N投与群の 4群に分けた。さらに陰性対照として、免疫を一再行わなかった 3匹のマウスを非免疫群とした。

- rDer f IIおよびそのアミノ酸残基置換体（D7N、 D19N) の投与

最終免疫の 2週間後から対照群にはリン酸锾衝生理食塩水（以下 P B S) 、 rD er f Π投与群には 1 mg/ml rDer f II、 D7N投与群には 1 mg/ml D7N、 D19N投与群には l mg/ml D19Nをそれぞれ 1回 20 1、週 2回、 3週間にわたり点袅投与した。非免疫群には何等処置を施さなかった。 •遅発週延型気道炎症誘発試験

点袅投与終了の翌週、マゥスを小動物用吸入チヤンバーの中に入れて筏化した 5mg/mlの rDer f 11を 30分間吸入させた。吸入終了から 24時間後に番カ物を放血致死させ、気管を通じて肺内を 1 mlの P B Sで洗浄した。この肺洗浄液（以下 B A L F) 1について塗末標本を作製し、ディフクィック染色を施した。標本を倍率 400倍で検鏡して一定視野あたりの白血球（マクロファージ、好中球、好酸球、リンパ球）数を測定し、気道炎症の程度の指標とした。

[結果]

• rDer f 11吸入後の B Aし F中の白血球数

非免疫群では B A L F中にマクロファージ以外の白血球はほとんど見ら Hなかつたのに対し、免疫を行った対照群ては多数の好中球、リンパ球が確 ¾された。対照群の全白血球数は非免疫群の約 2.5倍に達し、前者において抗原の吸入により激しい気道内炎症が惹起されたことが確 ίδされた。これに対し rDer f IIもしくはそのアミノ酸残基置換体である D7 D19Nを投与した群では好中球数および全白血球数が対照群よりも低下し、これらの点異により減感作が成立したことが確 ¾された。その結果を表 2に示す。

表 2 +1 白血球数（=摞準誤差）

験群マクロファージ好中球好酸球リンパ球非免疫 0.3土 0. 3 0.0 0.2±0.2 対称 47.1±2.4 60.0±13. 5 K7±l.l 2.8±1.3 rDer f II 42.7±8.7 9 3.7±2.2 4.1 + 1.4

D7N 46.8±7.4 5 2.910.8

D19N 45.9±6.6 33.9± 7. 7 3.0±1.5 3.1 ±1.7 産業上の利用の可能性

遣伝子工学的に作成した本発明に従う改変 Der f 11は、最小限の変異（ 1 2 9 アミノ酸中 1 アミノ ¾) て、その I g E抗体結合活性が低下し、安全性の高いダ二に起因する各種のァレルギ一疾患の治療に使用できる。

【配列表】

配列番号： 1 - a

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：謹

镇の数：ニ本鑌

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c謹 to mRNA

配列の特徴

起源：テ'ノレマトフアコ"ィテ'スファリナェ (Derma tophagoides f arinae) 特徴を決定した方法： E

配列

1 Asp Gin Va ] Asp Val Lys Asp Cys A 1 a Asn Asn G 1 u lie し ys Lys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA 17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys He lie His Arg Gly 49 ATG GTC GAT GGT TGC CAT GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu G 1 u Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys

97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu 61 u lie Asp

145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro Gly He Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Val Lys Cys Pro Leu 193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT GTC AAA TGT CCA TTG

81 Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp lie Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT ATC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA 97 He Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val L s Leu lie Gly 289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT ATC GGT

113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Gly Lys lie Arg 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAT GGT AAA ATC CGT

129 Asp

385 GAT TAA 配列番号： 1 - b

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎮状

配列の種類： cDNA to m NA

配列の特徴

源：テ.' トフアコ"イデスファリナェ (Derma tophagoides farinae) 特徴を決定した方法： E

配列

1 Asp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu 1 ie Lys Lys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC A AAA GTA

17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys I le lie His Arg Gly 49 ATG GTC GAT GGT TGC CAT GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys 97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr Ala Lys lie Glu He Lys Ala Ser し eu Asp Gly Leu Glu lie Asp 145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro Gly lie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met し ys Cys Pro Leu

193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG

81 Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp lie し ys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys

241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT ATC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA

97 He Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu ile Gly 289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT ATC GG"

113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAT GGT AAA ATC CGT 129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： i - c

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

鑌の数：ニ本钹

トポロジー：直鎮状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列の特徴

起源：デルマトファゴイデスファリナェ (Dermatophagoides farinae) 特徴を決定した方法： E

配列

1 Asp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu lie Lys し ys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA 17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys He He His Arg Gly

49 ATG GTC GAT GGT TGC CAT GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys

97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr A] a Lys I le Glu lie Lys la Ser Leu Asp Gly Leu G 1 u lie Asp

145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro G 1 y l ie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe ;1e t lys Cys Pro し en 193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG

81 al Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala L s Fyr Ihr Trp Asn Val Pro Lys 241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA

97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT

113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala I le Ala Thr His Ala Lys lie Arg 337 GAT ΑΛΤ GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC CGT

129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： 1 (D 7 E)

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

镇の数：ニ本鑌トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列の特徴

：テレマトフアコつァスファリナェ Dermatophagoides farinae) 特徴を決定した方法： E

配列

1 Asp Gin Val Asp a 1 し ys G 1 u Cys Ala Asn Asn G 1 u ί le L s し Val

1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAG TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Va 1 Asp Gly Cys His 1 y Ser Asp Pro Cys [ 1 e 1 le His Arg G 1

49 ATG GTC GAT GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu G 1 u Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys

97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu G 1 u lie Asp

145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro Gly lie Asp Thr Asn A 1 a Cys His Phe .let L s Cys Pro Leu 193 GTT CCC GGT ATC CAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG

81 Val Lys Gly Gin Gin lyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys

241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA 97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 89 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT

113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Arg 37 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC CGT 129 As 本

385 GAT TAA 配列番号： 2 ( D 7 N)

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：

镇の数：ニ本鑌

トボ口ジ一：直鎖状

配列の種類： cDNA t m NA

配列の特徴

起源：デルマトファゴィデヌ. ァリナェ (Dermatophagoides Jarjnae) 特徴を決定した方法： E

配列

1 Asp Gin Va 1 Asp Va 1 Lys Asn C s la Asn Asn Glu l ie し ys し ys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA AAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Asp 1 v Cys His G ! y Ser Asp Pro Cys l ie 【le H i s Arg Gly 49 ATG GTC GAT GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC M CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu ^la Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Ihr Lys

97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr 1 a Lys I le Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp G 1 y Leu Glu l ie Asp

145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro Gly I le Asp Thr Asn Ala Cys His Phe et Lys Cys Pro Leu 193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG 81 Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAft

113 Asp Asn Gly Val Leu Ala C s Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Arg 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC CGT 129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： 3 ( D 7 K)

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トボロシー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列の特徴

起？京：デルマトファゴイデスファリナェ（ erma tophago ides f arinae) 特; ¾を決定した方法： E

配列

1 Asp G 1 n Val Asp Val し ys Lys Cys Ala Asn Asn G 1 u lie Lys Lys Val 1 GAT CAft GTC GAT GTT AAA AAA TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys He lie His Arg Gly 49 ATG GTC GAT GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp A 1 a Asn Gin Asn Thr Lys 97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr Ala Lys lie Glu He Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu He Asp 145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro Gly l ie Asp Thr Asn la Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu 193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG

81 al Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA

97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT 113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Arg 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC AC GCT AAA ATC CGT

129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： 4 ( A 9 P )

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

镇の数：ニ本鑌

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to ITIRNA

配列の特徴

起源：デルマトファゴイデスファリナェ (Derwatophagoides farinae) 特徴を決定した方法： E 配列

1 Asp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys Pro Asn Asn Glu lie Lys Lys Val

1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT CCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys lie He His Arg Gly

49 ATG GTC GAT GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys

97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr 1 a Lys lie Glu lie Lys 1 a Ser Leu Asp Gly Leu G 1 u ί 1 e Asp

145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro Gly lie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu 193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG

8Ί Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp A 1 a Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA

97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn al Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly

289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT

113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala l ie Ala Thr His Ala Lys l ie Arg

337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC CGT

129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： 5 ( D 1 9 E) 配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直钹状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列の特徴

配列

1 Asp Gin Val Asp Va 1 L s Asp Cys A】a Asn Asn Glu lie Lys Lys Va 1 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 et Va 1 Glu Gly Cys His G ί y Ser Asp Pro Cys [ 1 e 11 His 4rg Gl y 49 ATG GTC GAA GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn G I n Asn Thr Lys 97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AC ACT AAA

49 Thr Ala し ys l ie Glu lie Lys Ala Ser し eu Asp G 1 y leu Glu l ie Asp 145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

81 al Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 41 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA

97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 89 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AftA CTT GTT GGT 113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys He Arg 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC CGT 129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： 6 (D 1 9 N)

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

镇の数：ニ本鑌

トポロジー：直镇状

配列の種類： cDNA to RIRNA

配列の特徴

配列

1 Asp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys A 1 a Asn Asn Glu lie Lys Lys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Asn Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg Gly 49 ATG GTC AAC GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

49 Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu lie Asp 145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT 65 Val Pro Gly lie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu 193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG

81 Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA

97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT 113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Arg 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC CGT

129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： Ί (D 1 9 Κ )

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

镇の数：ニ本鑌

トポロジー：直鎮状

配列の種類： cDNA to niRNA

配列の特徴

起源：デルマトファゴイデスファリナェ（ rm tophag ides fajinae) 特徴を決定した方法： E

配列

1 sp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu lie Lys Lys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Lys Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg Gly 49 ATG GTC AAA GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys

97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr Ala lys lie G 1 u lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu lie Asp

145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

81 Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 241 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA 97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT

113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys He Arg 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC C C GCT AAA ATC CGT

129 Asp ***

385 GAT TAA 配列番号： 8 (R 1 2 8 E)

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本鎮

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA 配列の特徴

起源：テルマトファゴイデスファリナェ (Derma tophagoides farinae) 特徴を决定した方法： E

配列

1 sp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu lie Lys Lys Val

1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys He lie His Arg Gly

49 ATG GTC GAT GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys

97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA

49 Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu lie Asp 145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

65 Val Pro Gly lie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu

193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG 81 Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 41 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA

97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 89 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT 13 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Asp 37 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC GAT 29 Asp *** 385 GAT TAA 配列番号： 9 (R 1 2 8 K)

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎮状

配列の種類： cDNA to m NA

配列の特徴

配列

1 Asp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys I a Asn Asn G 1 u I le Lys Lys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg Gly

49 ATG GTC GAT GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu G 1 u Ala Leu Phe Asp A 1 a Asn Gin Asn Thr Lys

9i AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT A

49 Thr Ala Lys I le G 1 u lie Lys Ala Ser Leu Asp G 1 y Leu Glu lie Asp 145 ACC GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT 65 Val Pro Gly lie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu 193 GTT CCC GGT ATC GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG

81 Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 41 GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCG AAA o

97 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 289 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT 113 Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Lys 337 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC AAA

129 Asp ***

385 GAT TAA

0

配列番号： 1 0 (D 1 2 9 N)

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

镇の数：二本鎖

5 トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列の特徴

起 iZS ：デルマトフアコイデスファリナェ（Dermatophagoides— f arinaej 特徴を决定した方法： E

配列

1 Asp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys A 1 a Asn Asn Glu lie Lys し ys Val 1 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

17 Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys He lie His Arg Gly5 49 ATG GTC GAT GGT TGC CAC GGT TCT GAT CCA TGC ATC ATC CAT CGT GGT

33 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys 97 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA S2

02

VV1 1VV S8£

ST

丄 3：) 31V VV 100 3V3 33V 133 I1V 133 391 I3D Dll XID 1DD 1VV 1 9 IS

a] 1 sAn ei s!H ^JM1 31 I ^W! siQ eiy na /iig us\/ dsy gn 丄 33 丄丄 3 113 VVf DID tDV I1D DID I1D 3 V WD 131 VVV V03 V3D XIV 682

13

USV JSS OJJ eiv an 16 01

VVV 303 DID IfV 301 VOV 1VI V V 33D It 1V1 WO VVD 133 VVf X1D s/ίつ OJJ Ι ΕΛ us¾i dJi jqx αίχ SAI eiv dsy αΛ ujr) ujg siq JB^ 18

311 V33 X31 VVV 3IV 111 XVO 3D1 133 1VV 33V 丄\?3 31V IDD 333 113 S6I S naつ oaj SAi si s! s,<3 BJV US¾/ JIU ^{ds S}II ^Λ【3 ^0Jd 1^ΒΛ S9

1V9 L1V VV9 113 IDO 1VD 3X3 DDV 33D VVV 31V WD UV VVV 130 30V ds\/ an "13 n9つ ds\f nai jd_S eiv δΑ an njg a\\ s m 6^

96d DA 6€S0C/96OAi

Claims

請求の範囲

1. ダニ主要アレルゲン Der f IIをコードする遺伝子が配列表の配列番号： 1 - aまたは 1 - bまたは 1 - cで示される D N A配列を有し、 Ϊ亥ダニ主要ァレルゲン Der f IIの N末端側から第 7番目、第 9番目、第 1 9番目、第 1 2 8番目または第 1 2 9番目のァミノ酸をァラニンを除く別種のァミノ酸に置換した改変 Der f IIをコ一ドする遺伝子を含む複製ベクターで形質転換した原核生物または真核生物を培養し、培養物から改変したダニ主要アレルゲンを採取することを特徴とする改変ダニ主要ァレルゲンの製造法。

2. 請求項 1 に記載の製造法により製造された改変したダニアレルゲン。

3. 配列表の己列番号 1 (D7E 2 (D7N')、 3 (D7K), 4 (A9P)、 5 (D19E)、

6 (D19N)、 7 (D19K)、 3 (R128D)、 9 (R128K)または 1 0 (D129N)に示すアミノ酸配列を舍むボリペプチド。

4. 請求項 3に記載の t、ずれか一^？のボリぺプチドをコ一ドする D N A镇。

5. 請求項 2に記載の改変したダニァレルゲンからなるダニアレルギー治療剤。

6 · 請求項 3に記載のボリぺプチドからなるダニァレルギ一治療剤。

7. 請求項 2に記載の改変したダニアレルゲンからなるダニアレルギー予防剤。

8. 請求項 3に記載のボリぺプチドからなるダニアレルギー予防剤。