JPH0795887A - 改変したダニ主要アレルゲン及びその製造方法 - Google Patents
改変したダニ主要アレルゲン及びその製造方法Info
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- JPH0795887A JPH0795887A JP5275897A JP27589793A JPH0795887A JP H0795887 A JPH0795887 A JP H0795887A JP 5275897 A JP5275897 A JP 5275897A JP 27589793 A JP27589793 A JP 27589793A JP H0795887 A JPH0795887 A JP H0795887A
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- allergen
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆＩＩの特定の
１つのアミノ酸残基をアラニンに置換した改変Ｄｅｒ
ｆＩＩをコードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転
換した原核生物または真核生物を培養し、培養物から改
変したダニ主要アレルゲンを採取することを特徴とする
ダニ主要アレルゲンの製造方法。 【効果】 遺伝子工学を使ってヒョウヒダニ主要アレル
ゲンＤｅｒ ｆＩＩを改変しし、立体構造を大きく変化
させることなくＩｇＥ抗体との結合活性を低下させアナ
フィラキシーショックの課題を解決できるアレルギー治
療用物質を提供することができる。
１つのアミノ酸残基をアラニンに置換した改変Ｄｅｒ
ｆＩＩをコードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転
換した原核生物または真核生物を培養し、培養物から改
変したダニ主要アレルゲンを採取することを特徴とする
ダニ主要アレルゲンの製造方法。 【効果】 遺伝子工学を使ってヒョウヒダニ主要アレル
ゲンＤｅｒ ｆＩＩを改変しし、立体構造を大きく変化
させることなくＩｇＥ抗体との結合活性を低下させアナ
フィラキシーショックの課題を解決できるアレルギー治
療用物質を提供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遣伝子工学によるヒョ
ウヒダニの主要アレルゲン（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）を改変
した改変アレルゲン、その製造方法に関するものであ
り、この製造方法により製造された改変された改変アレ
ルゲンは、アレルギー疾患の治療薬として応用できる。
ウヒダニの主要アレルゲン（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）を改変
した改変アレルゲン、その製造方法に関するものであ
り、この製造方法により製造された改変された改変アレ
ルゲンは、アレルギー疾患の治療薬として応用できる。
【０００２】
【従来の技術】アレルギー疾患の多くは、その疾患の原
因抗原に感作されることにより、血清及び組織でアレル
ゲンに特異的なＩｇＥ抗体が産生され、再びその抗原に
暴露されることにより、各組織上で抗原とＩｇＥ抗体が
抗原抗体反応を起こし、その際に生じる種々の症状によ
るものと考えられている。特に、肥満細胞上のＩｇＥ抗
体に抗原が結合しＩｇＥ抗体間に架橋が起こることによ
って肥満細胞から種々の化学伝達物質が放出されて即時
型あるいは遅発型反応が生じることに起因すると考えら
れている。
因抗原に感作されることにより、血清及び組織でアレル
ゲンに特異的なＩｇＥ抗体が産生され、再びその抗原に
暴露されることにより、各組織上で抗原とＩｇＥ抗体が
抗原抗体反応を起こし、その際に生じる種々の症状によ
るものと考えられている。特に、肥満細胞上のＩｇＥ抗
体に抗原が結合しＩｇＥ抗体間に架橋が起こることによ
って肥満細胞から種々の化学伝達物質が放出されて即時
型あるいは遅発型反応が生じることに起因すると考えら
れている。
【０００３】このアレルギー疾患を治療する方法とし
て、抗原がＩｇＥ抗体に結合することを抑制する方法が
考えられている。抗原がＩｇＥ抗体に結合することを抑
制すれば、肥満細胞上のＩｇＥ抗体間の架橋が起こらな
いため化学物質の放出が抑制されて治療効果が得られる
ものと考えられている。一方、気管支喘息、小児喘息、
アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患は、室内塵中に
生息しているダニに対するアレルギーが主な原因である
ことが明らかになっており、既にいくつかのダニ主要ア
レルゲン蛋白質が同定されている（プラッツミルズ（Ｐ
ｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・
アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー（Ｊ．
Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８０
巻、７５５頁、１９８７年）。また、精製ダニ主要アレ
ルゲンを多量に調製する方法も既に開示されている（結
城ら、アレルギー（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ． Ａｌｌｅ
ｒｇｏｌｏｇｙ）、３９巻、５５７頁、１９９０年及び
特願平３−２５４６８３）。さらに、前述の精製ダニ主
要アレルゲンの一部を改変したアレルゲンおよび製造方
法も出願されている（特願平５−１３９７９３）。
て、抗原がＩｇＥ抗体に結合することを抑制する方法が
考えられている。抗原がＩｇＥ抗体に結合することを抑
制すれば、肥満細胞上のＩｇＥ抗体間の架橋が起こらな
いため化学物質の放出が抑制されて治療効果が得られる
ものと考えられている。一方、気管支喘息、小児喘息、
アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患は、室内塵中に
生息しているダニに対するアレルギーが主な原因である
ことが明らかになっており、既にいくつかのダニ主要ア
レルゲン蛋白質が同定されている（プラッツミルズ（Ｐ
ｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・
アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー（Ｊ．
Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８０
巻、７５５頁、１９８７年）。また、精製ダニ主要アレ
ルゲンを多量に調製する方法も既に開示されている（結
城ら、アレルギー（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ． Ａｌｌｅ
ｒｇｏｌｏｇｙ）、３９巻、５５７頁、１９９０年及び
特願平３−２５４６８３）。さらに、前述の精製ダニ主
要アレルゲンの一部を改変したアレルゲンおよび製造方
法も出願されている（特願平５−１３９７９３）。
【０００４】しかしながら、これまで報告されている同
定されたダニ主要アレルゲンタンパク質あるいは精製ダ
ニ主要アレルゲンにおいては、アレルゲンとしての活性
が高いため減感作療法を行った場合にアレルギー反応で
あるアナフィラキシーショックを起こすケースがあっ
た。一方、ＩｇＥ抗体との結合活性もしくはアレルゲン
活性が低下し、かつ抗原（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）とＩｇＥ
抗体の結合を阻害する改変ダニ主要アレルゲンが得られ
れば抗原投与によるアレルギー反応のアナフィラキシー
ショックが生じることがなく、かつ抗原に特異的である
ために他の免疫系に影響を及ぼさないなどの特徴を有し
ているためアレルギー治療上極めて有効な方法であると
考えられている。改変ダニ主要アレルゲンとしてはすで
に特願平５−１３９７９３があるが、このアレルゲンは
改変したアミノ酸残基によって立体構造が大幅に変わっ
てしまったため免疫原性の維持の点で問題が残ってお
り、ＩｇＥ抗体との結合活性もしくはアレルゲン活性を
大幅に低下させ、かつ免疫原性を維持した改変ダニ主要
アレルゲンを調製することは課題であった。
定されたダニ主要アレルゲンタンパク質あるいは精製ダ
ニ主要アレルゲンにおいては、アレルゲンとしての活性
が高いため減感作療法を行った場合にアレルギー反応で
あるアナフィラキシーショックを起こすケースがあっ
た。一方、ＩｇＥ抗体との結合活性もしくはアレルゲン
活性が低下し、かつ抗原（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）とＩｇＥ
抗体の結合を阻害する改変ダニ主要アレルゲンが得られ
れば抗原投与によるアレルギー反応のアナフィラキシー
ショックが生じることがなく、かつ抗原に特異的である
ために他の免疫系に影響を及ぼさないなどの特徴を有し
ているためアレルギー治療上極めて有効な方法であると
考えられている。改変ダニ主要アレルゲンとしてはすで
に特願平５−１３９７９３があるが、このアレルゲンは
改変したアミノ酸残基によって立体構造が大幅に変わっ
てしまったため免疫原性の維持の点で問題が残ってお
り、ＩｇＥ抗体との結合活性もしくはアレルゲン活性を
大幅に低下させ、かつ免疫原性を維持した改変ダニ主要
アレルゲンを調製することは課題であった。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】本発明者らは、既に
開示されているダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆ ＩＩの
特定の１つのアミノ酸残基をアラニン残基に置換するこ
とにより、ＩｇＥ抗体結合活性を変化させうることを見
いだした。また、その改変ダニ主要アレルゲンの中に
は、抗原（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）がＩｇＥ抗体に結合する
ことを阻害する活性が野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとほとん
ど差異がないものがあることを見いだしたのである。
開示されているダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆ ＩＩの
特定の１つのアミノ酸残基をアラニン残基に置換するこ
とにより、ＩｇＥ抗体結合活性を変化させうることを見
いだした。また、その改変ダニ主要アレルゲンの中に
は、抗原（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）がＩｇＥ抗体に結合する
ことを阻害する活性が野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとほとん
ど差異がないものがあることを見いだしたのである。
【０００６】それ故、本発明の目的は、遺伝子工学を用
いてダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆＩＩの１以上のアミ
ノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した改変ダニ主要ア
レルゲンを多量に調製する方法を提供することである。
すなわち、ダニアレルゲンに起因するアレルギー疾患の
治療薬に応用できる物質を製造することを目的とする。
いてダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆＩＩの１以上のアミ
ノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した改変ダニ主要ア
レルゲンを多量に調製する方法を提供することである。
すなわち、ダニアレルゲンに起因するアレルギー疾患の
治療薬に応用できる物質を製造することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、コナヒョウヒ
ダニ主要アレルゲン（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）を遺伝子工学
的に改変し、その１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸
残基に置換した改変ダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆ Ｉ
Ｉをコードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転換し
た原核生物または真核生物を培養し、培養物から改変ダ
ニ主要アレルゲンを採取することを特徴とする。
ダニ主要アレルゲン（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）を遺伝子工学
的に改変し、その１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸
残基に置換した改変ダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆ Ｉ
Ｉをコードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転換し
た原核生物または真核生物を培養し、培養物から改変ダ
ニ主要アレルゲンを採取することを特徴とする。
【０００８】ダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆ ＩＩは、
６個のシステイン残基を有しジスルフィド結合よって分
子内架橋を３箇所所有すること（アミノ酸残基８番目と
１１９番目、２１番目と２７番目、７３番目と７８番
目）が既に開示されている（西山ら、インターナショナ
ル アーカイブス オブ アレルギー アンド イムノ
ロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｒｃｈｉｖｅ
ｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ），１０１巻，１５９頁，１９９３年）。また、遺
伝子工学的手法を用いて分子内のジスルフィド結合の数
を３箇所から２箇所に減らした置換体の解析、すなわち
Ｄｅｒ ｆ ＩＩの６箇所のシステイン残基のうち、
ジスルフィド結合を形成している２箇所のシステイン残
基をそれぞれセリン残基に置換した３種類（８番目と１
１９番目（Ｃ８／１１９Ｓ）、２１番目と２７番目（Ｃ
２１／２７Ｓ）、７３番目と７８番目（Ｃ７３／７８
Ｓ））の改変体の解析の結果、８番目と１１９番目のジ
スルフィド結合がＤｅｒ ｆＩＩのＩｇＥ抗体結合活性
に大きく影響することも既に開示されている（高井ら、
日本農芸化学会１９９３年度大会要旨集、４８頁、１９
９３年）。このことから、本発明者らはＤｅｒ ｆ Ｉ
Ｉのアミノ酸残基を順次、他のアミノ酸残基に置換する
ことでＩｇＥ抗体結合に大きく影響するアミノ酸残基を
特定できると考え本研究に着手した。ダニ主要アレルゲ
ンＤｅｒ ｆ ＩＩをコードする遺伝子及びその調製法
は、既に結城らにより開示されている（アレルギー（Ｊ
ａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ）３９
巻、５５７頁、１９９０年）。この遺伝子を遺伝子工学
的手法によって改変し、１番目のアスパラギン酸残基か
ら順次、システイン残基を除く他のアミノ酸残基に置換
した。これによって、特定のアミノ酸残基のみ他のアミ
ノ酸残基に置換された改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩが調製で
き、それらのなかから１ｇＥ抗体との結合活性の低下し
たもの、また抗原（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）がＩｇＥ抗体に
結合することを抑制するものを選択し本発明を完成し
た。
６個のシステイン残基を有しジスルフィド結合よって分
子内架橋を３箇所所有すること（アミノ酸残基８番目と
１１９番目、２１番目と２７番目、７３番目と７８番
目）が既に開示されている（西山ら、インターナショナ
ル アーカイブス オブ アレルギー アンド イムノ
ロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｒｃｈｉｖｅ
ｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ），１０１巻，１５９頁，１９９３年）。また、遺
伝子工学的手法を用いて分子内のジスルフィド結合の数
を３箇所から２箇所に減らした置換体の解析、すなわち
Ｄｅｒ ｆ ＩＩの６箇所のシステイン残基のうち、
ジスルフィド結合を形成している２箇所のシステイン残
基をそれぞれセリン残基に置換した３種類（８番目と１
１９番目（Ｃ８／１１９Ｓ）、２１番目と２７番目（Ｃ
２１／２７Ｓ）、７３番目と７８番目（Ｃ７３／７８
Ｓ））の改変体の解析の結果、８番目と１１９番目のジ
スルフィド結合がＤｅｒ ｆＩＩのＩｇＥ抗体結合活性
に大きく影響することも既に開示されている（高井ら、
日本農芸化学会１９９３年度大会要旨集、４８頁、１９
９３年）。このことから、本発明者らはＤｅｒ ｆ Ｉ
Ｉのアミノ酸残基を順次、他のアミノ酸残基に置換する
ことでＩｇＥ抗体結合に大きく影響するアミノ酸残基を
特定できると考え本研究に着手した。ダニ主要アレルゲ
ンＤｅｒ ｆ ＩＩをコードする遺伝子及びその調製法
は、既に結城らにより開示されている（アレルギー（Ｊ
ａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ）３９
巻、５５７頁、１９９０年）。この遺伝子を遺伝子工学
的手法によって改変し、１番目のアスパラギン酸残基か
ら順次、システイン残基を除く他のアミノ酸残基に置換
した。これによって、特定のアミノ酸残基のみ他のアミ
ノ酸残基に置換された改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩが調製で
き、それらのなかから１ｇＥ抗体との結合活性の低下し
たもの、また抗原（Ｄｅｒ ｆ ＩＩ）がＩｇＥ抗体に
結合することを抑制するものを選択し本発明を完成し
た。
【０００９】本発明の置換体は合目的的な任意の方法で
製造することができるが、部位特異的変異の方法が望ま
しい。部位特異的変異をおこなう手法は既に確立されて
おりさまざまな方法があるがＰＣＲ法を用いるのが簡便
である（伊藤ら、ジーン（ｇｅｎｅ）１０２巻、６７
頁、１９９１年）。例えば配列表１−ａに示したＤＮＡ
鎖より１番目のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置
換する方法を一例として示すと次の通りである。配列表
１から１番目のアスパラギン酸残基に対応するコドンは
ＧＡＴである。このコドンをアラニン残基に対応するコ
ドン、例えばＧＣＴに置き換えかえることとした。その
ためにアスパラギン酸残基周辺のＤＮＡ配列と同一でか
つ、アスパラギン酸残基のコドン（ＧＡＴ）のみアラニ
ン残基のコドン（ＧＣＴ）に置換したオリゴヌクレオチ
ドを合成した（表１ Ｆ−Ｄ１Ａ）。この合成は、既知
の合成法によって合成することができるが、自動合成機
を用いることが便利である（例えば ｍｏｄｅｌ３８１
Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。
製造することができるが、部位特異的変異の方法が望ま
しい。部位特異的変異をおこなう手法は既に確立されて
おりさまざまな方法があるがＰＣＲ法を用いるのが簡便
である（伊藤ら、ジーン（ｇｅｎｅ）１０２巻、６７
頁、１９９１年）。例えば配列表１−ａに示したＤＮＡ
鎖より１番目のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置
換する方法を一例として示すと次の通りである。配列表
１から１番目のアスパラギン酸残基に対応するコドンは
ＧＡＴである。このコドンをアラニン残基に対応するコ
ドン、例えばＧＣＴに置き換えかえることとした。その
ためにアスパラギン酸残基周辺のＤＮＡ配列と同一でか
つ、アスパラギン酸残基のコドン（ＧＡＴ）のみアラニ
ン残基のコドン（ＧＣＴ）に置換したオリゴヌクレオチ
ドを合成した（表１ Ｆ−Ｄ１Ａ）。この合成は、既知
の合成法によって合成することができるが、自動合成機
を用いることが便利である（例えば ｍｏｄｅｌ３８１
Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。
【００１０】ＰＣＲ法による増幅のための鋳型ＤＮＡは
配列表１に示したＤｅｒ ｆ ＩＩのｃＤＮＡを含んで
いれば任意のＤＮＡ鎖が利用できるが、ここではｐＦＬ
Ｔ１１（図１）を使用した。鋳型ととするｐＦＬＴ１１
に対し、ｐＦＬＴ１１上、Ｄｅｒ ｆ ＩＩをクローニ
ングしている部位の下流側にあるＨｉｎｄ ＩＩＩ認識
配列を含む領域と同じ配列の合成ヌクレオチドＲ１（表
１）と前述の合成ヌクレオチドＦ−Ｄ１Ａをプライマー
として用いＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、得られ
る増幅ＤＮＡ断片はダイデオキシ法（サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）ら、ジャーナル オブ モレキュラー バイオ
ロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６２巻，７２９
−７７３頁，１９８２年）などを用いてその塩基配列を
決定できる。
配列表１に示したＤｅｒ ｆ ＩＩのｃＤＮＡを含んで
いれば任意のＤＮＡ鎖が利用できるが、ここではｐＦＬ
Ｔ１１（図１）を使用した。鋳型ととするｐＦＬＴ１１
に対し、ｐＦＬＴ１１上、Ｄｅｒ ｆ ＩＩをクローニ
ングしている部位の下流側にあるＨｉｎｄ ＩＩＩ認識
配列を含む領域と同じ配列の合成ヌクレオチドＲ１（表
１）と前述の合成ヌクレオチドＦ−Ｄ１Ａをプライマー
として用いＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、得られ
る増幅ＤＮＡ断片はダイデオキシ法（サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）ら、ジャーナル オブ モレキュラー バイオ
ロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６２巻，７２９
−７７３頁，１９８２年）などを用いてその塩基配列を
決定できる。
【００１１】かくして、確かに変異が導入されているこ
とを確認した置換ＤＮＡは適当な発現ベクターのクロー
ニング部位に挿入して、改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを発現さ
せることができる。この発現には大腸菌で安定的に存在
するプラスミドベクターならば任意であるが、例えば
ｐＧＥＭＥＸ１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いるのが便
利である。本ベクターは発現プロモーターにＴ７プロモ
ーターを用いており、その発現量が非常に多く、組換え
タンパクは大賜菌中で封入体として蓄積することが知ら
れている。これらの一連の操作は従来用いられてきた種
々の方法を使うことが可能である（マニアチス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８２
年）。また本ＤＮＡは適当なベクター、例えばＹＥｐ１
３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ），８巻，１２１−１３３頁，１９７９年）などを用
いて、酵母中で発現させることができる。本発明に従っ
た改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩ遺伝子を伴う発現カセットを持
つ酵母ベクターを用い適当な酵母細胞を形質転換するこ
とができる。この目的のため、本発明に従ったＤＮＡ配
列は、大腸菌プロモーターではなく、強力な真核性プロ
モーター、たとえば△Ｐ８（大竹ら、アグリカルチャラ
ル アンド バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５２巻，２７５３−２７
６２頁，１９８８年）などの制御下におかなければなら
ない。
とを確認した置換ＤＮＡは適当な発現ベクターのクロー
ニング部位に挿入して、改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを発現さ
せることができる。この発現には大腸菌で安定的に存在
するプラスミドベクターならば任意であるが、例えば
ｐＧＥＭＥＸ１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いるのが便
利である。本ベクターは発現プロモーターにＴ７プロモ
ーターを用いており、その発現量が非常に多く、組換え
タンパクは大賜菌中で封入体として蓄積することが知ら
れている。これらの一連の操作は従来用いられてきた種
々の方法を使うことが可能である（マニアチス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８２
年）。また本ＤＮＡは適当なベクター、例えばＹＥｐ１
３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ），８巻，１２１−１３３頁，１９７９年）などを用
いて、酵母中で発現させることができる。本発明に従っ
た改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩ遺伝子を伴う発現カセットを持
つ酵母ベクターを用い適当な酵母細胞を形質転換するこ
とができる。この目的のため、本発明に従ったＤＮＡ配
列は、大腸菌プロモーターではなく、強力な真核性プロ
モーター、たとえば△Ｐ８（大竹ら、アグリカルチャラ
ル アンド バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５２巻，２７５３−２７
６２頁，１９８８年）などの制御下におかなければなら
ない。
【００１２】このようにして、Ｄｅｒ ｆ ＩＩの１番
目のアスパラギン酸残基から１３番目のイソロイシン残
基まで、１２３番目のスレオニン残基から１２９番目の
アスパラギン酸残基まで、それぞれアラニン残基に置換
した（８番目のシステイン残基と９、１２５番目のアラ
ニン残基は除く）、合計１７種類（アミノ酸番号 それ
ぞれ１番目（Ｄ１Ａ）、２番目（Ｑ２Ａ）、３番目（Ｖ
３Ａ）、４番目（Ｄ４Ａ）、５番目（Ｖ５Ａ）、６番目
（Ｋ６Ａ）、７番目（Ｄ７Ａ）、１０番目（Ｎ１０
Ａ）、１１番目（Ｎ１１Ａ）、１２番目（Ｅ１２Ａ）、
１３番目（Ｉ１３Ａ）、１２３番目（Ｔ１２３Ａ）、１
２４番目（Ｈ１２４Ａ）、１２６番目（Ｋ１２６Ａ）、
１２７番目（Ｉ１２７Ａ）、１２８番目（Ｒ１２８
Ａ）、１２９番目（Ｄ１２９Ａ））の置換改変プラスミ
ドを作製し、それぞれを大腸菌で発現させた。
目のアスパラギン酸残基から１３番目のイソロイシン残
基まで、１２３番目のスレオニン残基から１２９番目の
アスパラギン酸残基まで、それぞれアラニン残基に置換
した（８番目のシステイン残基と９、１２５番目のアラ
ニン残基は除く）、合計１７種類（アミノ酸番号 それ
ぞれ１番目（Ｄ１Ａ）、２番目（Ｑ２Ａ）、３番目（Ｖ
３Ａ）、４番目（Ｄ４Ａ）、５番目（Ｖ５Ａ）、６番目
（Ｋ６Ａ）、７番目（Ｄ７Ａ）、１０番目（Ｎ１０
Ａ）、１１番目（Ｎ１１Ａ）、１２番目（Ｅ１２Ａ）、
１３番目（Ｉ１３Ａ）、１２３番目（Ｔ１２３Ａ）、１
２４番目（Ｈ１２４Ａ）、１２６番目（Ｋ１２６Ａ）、
１２７番目（Ｉ１２７Ａ）、１２８番目（Ｒ１２８
Ａ）、１２９番目（Ｄ１２９Ａ））の置換改変プラスミ
ドを作製し、それぞれを大腸菌で発現させた。
【００１３】次に、改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩのＩｇＥ抗体
結合活性を定量的に測定した。それに先だって、それぞ
れの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩのタンパク質精製が必要にな
る。その概略を以下に示す。発現誘導後のホスト大腸菌
ＢＬ２１の菌体を回収し、超音波により菌体を破砕後、
遠心分離して封入体の形で存在するＤｅｒ ｆ ＩＩタ
ンパク質を回収した。６Ｍ尿素で封入体を可溶化した
後、２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に透析
し尿素を除去するとともにタンパク質の再生を行った。
次に、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによりＤ
ｅｒ ｆ ＩＩ画分を分離精製した。すなわち、再生画
分をＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（ＴＯＳＯＨ社）
カラムに吸着させ、ＮａＣｌ濃度８０ｍＭで溶出させる
と、Ｄｅｒｆ ＩＩは単一のタンパク質として溶出され
た。
結合活性を定量的に測定した。それに先だって、それぞ
れの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩのタンパク質精製が必要にな
る。その概略を以下に示す。発現誘導後のホスト大腸菌
ＢＬ２１の菌体を回収し、超音波により菌体を破砕後、
遠心分離して封入体の形で存在するＤｅｒ ｆ ＩＩタ
ンパク質を回収した。６Ｍ尿素で封入体を可溶化した
後、２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に透析
し尿素を除去するとともにタンパク質の再生を行った。
次に、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによりＤ
ｅｒ ｆ ＩＩ画分を分離精製した。すなわち、再生画
分をＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（ＴＯＳＯＨ社）
カラムに吸着させ、ＮａＣｌ濃度８０ｍＭで溶出させる
と、Ｄｅｒｆ ＩＩは単一のタンパク質として溶出され
た。
【００１４】こうして得られた精製改変Ｄｅｒ ｆ Ｉ
Ｉを用いＩｇＥ抗体結合活性を定量的に測定した。これ
にはＲＡＳＴ ＥＩＡ キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）を用いるのが最も簡便である。まず、０．１Ｍほう
酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈した精製改変Ｄｅｒ ｆ
ＩＩ溶液５０μｌにブロモシアン活性化濾紙１枚を浸
し室温で一晩静置して、タンパク質を吸着させた。洗浄
した後、キット付属の緩衝液で４倍希釈したダニアレル
ギー患者血清５０μｌに濾紙を浸し、３７℃で２時間、
静置することで血清中のヒト抗Ｄｅｒ ｆ ＩＩ Ｉｇ
Ｅ抗体と濾紙に吸着している抗原を結合させた。この
後、キットの反応プロトコールに従い反応を進めた。全
反応終了後の試料の４２０ｎｍでの吸光度がＩｇＥ抗体
結合能の指標になる。この結果を相対値として図２に示
す。アラニンに置換してもＩｇＥ抗体結合能に影響を及
ぼさないアミノ酸が存在する一方、Ｄ４Ａ，Ｋ６Ａ、Ｄ
７Ａ、Ｎ１０Ａ，Ｎ１１Ａ、Ｅ１２Ａ，Ｉ１２７Ａとい
った改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩでは、野生型と比べてＩｇＥ
抗体結合活性が５０％以下に低下していることが判明し
た。これらの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩはアレルゲン活性も
低下していることが期待される。
Ｉを用いＩｇＥ抗体結合活性を定量的に測定した。これ
にはＲＡＳＴ ＥＩＡ キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）を用いるのが最も簡便である。まず、０．１Ｍほう
酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈した精製改変Ｄｅｒ ｆ
ＩＩ溶液５０μｌにブロモシアン活性化濾紙１枚を浸
し室温で一晩静置して、タンパク質を吸着させた。洗浄
した後、キット付属の緩衝液で４倍希釈したダニアレル
ギー患者血清５０μｌに濾紙を浸し、３７℃で２時間、
静置することで血清中のヒト抗Ｄｅｒ ｆ ＩＩ Ｉｇ
Ｅ抗体と濾紙に吸着している抗原を結合させた。この
後、キットの反応プロトコールに従い反応を進めた。全
反応終了後の試料の４２０ｎｍでの吸光度がＩｇＥ抗体
結合能の指標になる。この結果を相対値として図２に示
す。アラニンに置換してもＩｇＥ抗体結合能に影響を及
ぼさないアミノ酸が存在する一方、Ｄ４Ａ，Ｋ６Ａ、Ｄ
７Ａ、Ｎ１０Ａ，Ｎ１１Ａ、Ｅ１２Ａ，Ｉ１２７Ａとい
った改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩでは、野生型と比べてＩｇＥ
抗体結合活性が５０％以下に低下していることが判明し
た。これらの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩはアレルゲン活性も
低下していることが期待される。
【００１５】次に、ＩｇＥ抗体結合活性が低下した改変
Ｄｅｒ ｆ ＩＩ（Ｄ４Ａ，Ｋ６Ａ、Ｄ７Ａ）を用い
て、野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体との結合
阻害活性を測定した。方法は前述したＲＡＳＴ−ＥＩＡ
法に従うが、活性化濾紙には一律５０ｎｇ／ｍｌの野生
型Ｄｅｒ ｆ ＩＩを吸着させた。通常のＲＡＳＴ−Ｅ
ＩＡ法では次に患者血清を加えるが、ここでは先に改変
Ｄｅｒ ｆ ＩＩを加えて室温で２〜３時間放置した患
者血清を使用する。この血清溶液を通常のＲＡＳＴ−Ｅ
ＩＡ法と同様に活性化濾紙に添加し、以下は同様に操作
をおこなった。改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩの代わりに野生型
Ｄｅｒ ｆ ＩＩを患者血清に加えた場合、最終の４２
０ｎｍの吸光度は、ほぼブランク値になる。吸光度がブ
ランク値となった場合を１００％阻害としたとき、野生
型Ｄｅｒ ｆ ＩＩ及び改変Ｄｅｒｆ ＩＩの阻害活性
を相対値として図３に示す。用いた改変Ｄｅｒ ｆ Ｉ
Ｉはすべて、野生型とほぼ同等の阻害活性を示した。
Ｄｅｒ ｆ ＩＩ（Ｄ４Ａ，Ｋ６Ａ、Ｄ７Ａ）を用い
て、野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体との結合
阻害活性を測定した。方法は前述したＲＡＳＴ−ＥＩＡ
法に従うが、活性化濾紙には一律５０ｎｇ／ｍｌの野生
型Ｄｅｒ ｆ ＩＩを吸着させた。通常のＲＡＳＴ−Ｅ
ＩＡ法では次に患者血清を加えるが、ここでは先に改変
Ｄｅｒ ｆ ＩＩを加えて室温で２〜３時間放置した患
者血清を使用する。この血清溶液を通常のＲＡＳＴ−Ｅ
ＩＡ法と同様に活性化濾紙に添加し、以下は同様に操作
をおこなった。改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩの代わりに野生型
Ｄｅｒ ｆ ＩＩを患者血清に加えた場合、最終の４２
０ｎｍの吸光度は、ほぼブランク値になる。吸光度がブ
ランク値となった場合を１００％阻害としたとき、野生
型Ｄｅｒ ｆ ＩＩ及び改変Ｄｅｒｆ ＩＩの阻害活性
を相対値として図３に示す。用いた改変Ｄｅｒ ｆ Ｉ
Ｉはすべて、野生型とほぼ同等の阻害活性を示した。
【００１６】遺伝子工学的に調製した本発明に従う改変
Ｄｅｒ ｆ ＩＩは、最小限の変異（１２９アミノ酸中
１アミノ酸）で、そのＩｇＥ抗体結合活性が低下し、ま
た野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩのＩｇＥ抗体結合を阻害し、
大腸菌で大量に調製することができ、ダニに起因する各
種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に使用できる。
Ｄｅｒ ｆ ＩＩは、最小限の変異（１２９アミノ酸中
１アミノ酸）で、そのＩｇＥ抗体結合活性が低下し、ま
た野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩのＩｇＥ抗体結合を阻害し、
大腸菌で大量に調製することができ、ダニに起因する各
種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に使用できる。
【００１７】
【実施例】次にあげる実施例で本発明をより詳細に説明
するが、特許請求の範囲は、この実施例により限定され
るものではない。 実施例１ Ｄｅｒ ｆ ＩＩアミノ酸置換変異体の発現ベクターの
構築 Ｄｅｒ ｆ ＩＩの特定のアミノ酸残基をアラニンに置
換した改変Ｄｅｒ ｆＩＩはＰＣＲ法を用いた部位特異
的変異で作製した。ＰＣＲ法をおこなうにあたり合成し
たオリゴヌクレオチドは、表１に示すとおりである。変
異部位がＤｅｒ ｆ ＩＩのＮ末端側１番目から７番目
のアミノ酸の場合、合成オリゴヌクレオチドは、変異さ
せる目的のアミノ酸のコドンをアラニンのコドンとする
以外は野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩと同じ配列とし、さらに
開始コドンの上流に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を新た
に導入するように設計した（表１；Ｆ−Ｄ１Ａ、Ｆ−Ｑ
２Ａ、Ｆ−Ｖ３Ａ、Ｆ−Ｄ４Ａ、Ｆ−Ｖ５Ａ、Ｆ−Ｋ６
Ａ、Ｆ−Ｄ７Ａ）。鋳型ＤＮＡとしては野生型Ｄｅｒ
ｆ ＩＩの発現ベクターｐＦＬＴ１１（図１）を用い
た。ｐＦＬＴ１１上、Ｄｅｒ ｆ ＩＩをクローニング
している部位の下流側にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を
含む領域と相補的な配列である合成ヌクレオチドＲ１と
前述の変異導入合成ヌクレオチドＦ−Ｄ１Ａ、Ｆ−Ｑ２
Ａ、Ｆ−Ｖ３Ａ、Ｆ−Ｄ４Ａ、Ｆ−Ｖ５Ａ、Ｆ−Ｋ６
Ａ、あるいはＦ−Ｄ７Ａのいずれかをプライマーとして
ＰＣＲ反応をおこなった。
するが、特許請求の範囲は、この実施例により限定され
るものではない。 実施例１ Ｄｅｒ ｆ ＩＩアミノ酸置換変異体の発現ベクターの
構築 Ｄｅｒ ｆ ＩＩの特定のアミノ酸残基をアラニンに置
換した改変Ｄｅｒ ｆＩＩはＰＣＲ法を用いた部位特異
的変異で作製した。ＰＣＲ法をおこなうにあたり合成し
たオリゴヌクレオチドは、表１に示すとおりである。変
異部位がＤｅｒ ｆ ＩＩのＮ末端側１番目から７番目
のアミノ酸の場合、合成オリゴヌクレオチドは、変異さ
せる目的のアミノ酸のコドンをアラニンのコドンとする
以外は野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩと同じ配列とし、さらに
開始コドンの上流に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を新た
に導入するように設計した（表１；Ｆ−Ｄ１Ａ、Ｆ−Ｑ
２Ａ、Ｆ−Ｖ３Ａ、Ｆ−Ｄ４Ａ、Ｆ−Ｖ５Ａ、Ｆ−Ｋ６
Ａ、Ｆ−Ｄ７Ａ）。鋳型ＤＮＡとしては野生型Ｄｅｒ
ｆ ＩＩの発現ベクターｐＦＬＴ１１（図１）を用い
た。ｐＦＬＴ１１上、Ｄｅｒ ｆ ＩＩをクローニング
している部位の下流側にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を
含む領域と相補的な配列である合成ヌクレオチドＲ１と
前述の変異導入合成ヌクレオチドＦ−Ｄ１Ａ、Ｆ−Ｑ２
Ａ、Ｆ−Ｖ３Ａ、Ｆ−Ｄ４Ａ、Ｆ−Ｖ５Ａ、Ｆ−Ｋ６
Ａ、あるいはＦ−Ｄ７Ａのいずれかをプライマーとして
ＰＣＲ反応をおこなった。
【表１】
【００１８】変異部位がＤｅｒ ｆ ＩＩのＣ末端側１
２３番目から１２９番目のアミノ酸の場合、合成オリゴ
ヌクレオチドは、変異させるアミノ酸のコドンをアラニ
ンのコドンとする以外は野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩと相補
的な配列とし、さらに終止コドンの下流に制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩの認識配列を新たに導入するように設計した
（表１；Ｒ−Ｔ１２３Ａ，Ｒ−Ｈ１２４Ａ，Ｒ−Ｋ１２
６Ａ，Ｒ−Ｉ１２７Ａ，Ｒ−Ｒ１２８Ａ，Ｒ−Ｄ１２９
Ａ）。もう一方のプライマーはｐＦＬＴ１１上のＢｇＩ
ＩＩ切断部位より１５ｂｐ上流付近と同じ配列の合成ヌ
クレオチドＦ１を用いた。やはりｐＦＬＴ１を鋳型と
し、Ｆ１とＲ−Ｔ１２３Ａ、Ｒ−Ｈ１２４Ａ、Ｒ−Ｋ１
２６Ａ、Ｒ−Ｉ１２７Ａ，Ｒ−Ｒ１２８Ａ、あるいはＲ
−Ｄ１２９Ａのいずれかをプライマーとして用いＰＣＲ
反応をおこなった。
２３番目から１２９番目のアミノ酸の場合、合成オリゴ
ヌクレオチドは、変異させるアミノ酸のコドンをアラニ
ンのコドンとする以外は野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩと相補
的な配列とし、さらに終止コドンの下流に制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩの認識配列を新たに導入するように設計した
（表１；Ｒ−Ｔ１２３Ａ，Ｒ−Ｈ１２４Ａ，Ｒ−Ｋ１２
６Ａ，Ｒ−Ｉ１２７Ａ，Ｒ−Ｒ１２８Ａ，Ｒ−Ｄ１２９
Ａ）。もう一方のプライマーはｐＦＬＴ１１上のＢｇＩ
ＩＩ切断部位より１５ｂｐ上流付近と同じ配列の合成ヌ
クレオチドＦ１を用いた。やはりｐＦＬＴ１を鋳型と
し、Ｆ１とＲ−Ｔ１２３Ａ、Ｒ−Ｈ１２４Ａ、Ｒ−Ｋ１
２６Ａ、Ｒ−Ｉ１２７Ａ，Ｒ−Ｒ１２８Ａ、あるいはＲ
−Ｄ１２９Ａのいずれかをプライマーとして用いＰＣＲ
反応をおこなった。
【００１９】ＰＣＲ反応溶液は以下に示すとおりであ
る。鋳型となるｐＦＬＴ１１ １ｎｇに、２種類のプラ
イマーを１μｇずつ加え、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡）添付の１０倍濃度反応溶液、および２５ｍＭ
ＭｇＣｌ２溶液を１０μｌずつ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ最終濃度２００ｍＭ
となるように添加し、蒸留水で反応溶液の容量を１００
μｌとした後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５ユニ
ット加えた。この溶液を９４℃で１分保持して鋳型の２
本鎖ＤＮＡを変性させ１本鎖とした後、３７℃にて２分
保持して１本鎖の鋳型にプライマーをアニーリングし、
続く７２℃３分間の反応でポリメラーゼによる相補鎖Ｄ
ＮＡの合成をおこなう。以上の工程を２５サイクル繰り
返して目的ＤＮＡフラグメントの増幅をおこなった。
る。鋳型となるｐＦＬＴ１１ １ｎｇに、２種類のプラ
イマーを１μｇずつ加え、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡）添付の１０倍濃度反応溶液、および２５ｍＭ
ＭｇＣｌ２溶液を１０μｌずつ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ最終濃度２００ｍＭ
となるように添加し、蒸留水で反応溶液の容量を１００
μｌとした後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５ユニ
ット加えた。この溶液を９４℃で１分保持して鋳型の２
本鎖ＤＮＡを変性させ１本鎖とした後、３７℃にて２分
保持して１本鎖の鋳型にプライマーをアニーリングし、
続く７２℃３分間の反応でポリメラーゼによる相補鎖Ｄ
ＮＡの合成をおこなう。以上の工程を２５サイクル繰り
返して目的ＤＮＡフラグメントの増幅をおこなった。
【００２０】変異Ｄｅｒ ｆ ＩＩ遺伝子の大腸菌の発
現にはプラスミドベクターｐＧＥＭＥＸ１（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社）を用いた。変異遺伝子挿入に先だってｐＧＥＭ
ＥＸ１をＮｄｅｌで部分消化しＴ４ ＤＮＡ ポリメラ
ーゼによる末端平滑化後、再ライゲイションし、Ｔ７プ
ロモーター直下のＮｄｅＩサイトは保持しているが、も
う一つのＮｄｅＩサイトを欠失しているプラスミドを作
製した（ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩ）。Ｒ１とＦ−Ｄ
１Ａ、Ｆ−Ｑ２Ａ、Ｆ−Ｖ３Ａ、Ｆ−Ｄ４Ａ、Ｆ−Ｖ５
Ａ、Ｆ−Ｋ６Ａ、あるいはＦ−Ｄ７Ａを用いて増幅した
ＤＮＡフラグメントをＮｄｅｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで切
断後、ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩのＮｄｅＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位に挿入してそれぞれ変異体の発現ベクター
ｐＦＬＴ１１−Ｄ１Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｑ２Ａ、ｐＦＬ
Ｔ１１−Ｖ３Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｄ４Ａ、ｐＦＬＴ１１
−Ｖ５Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｋ６Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｄ７
Ａとした。一方、Ｆ１とＲ−Ｔ１２３Ａ，Ｒ−Ｈ１２４
Ａ，Ｒ−Ｋ１２６Ａ，Ｒ−Ｉ１２７Ａ，Ｒ−Ｒ１２８
Ａ，あるいはＲ−Ｄ１２９Ａのいずれかを用いて増幅し
たＤＮＡフラグメントをＢｇＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で切断後、ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩのＢｇＩＩＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、ｐＦＬＴ１１−Ｔ１２
３Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｈ１２４Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｋ１
２６Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｉ１２７Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｒ
１２８Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｄ１２９Ａとした。
現にはプラスミドベクターｐＧＥＭＥＸ１（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社）を用いた。変異遺伝子挿入に先だってｐＧＥＭ
ＥＸ１をＮｄｅｌで部分消化しＴ４ ＤＮＡ ポリメラ
ーゼによる末端平滑化後、再ライゲイションし、Ｔ７プ
ロモーター直下のＮｄｅＩサイトは保持しているが、も
う一つのＮｄｅＩサイトを欠失しているプラスミドを作
製した（ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩ）。Ｒ１とＦ−Ｄ
１Ａ、Ｆ−Ｑ２Ａ、Ｆ−Ｖ３Ａ、Ｆ−Ｄ４Ａ、Ｆ−Ｖ５
Ａ、Ｆ−Ｋ６Ａ、あるいはＦ−Ｄ７Ａを用いて増幅した
ＤＮＡフラグメントをＮｄｅｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで切
断後、ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩのＮｄｅＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位に挿入してそれぞれ変異体の発現ベクター
ｐＦＬＴ１１−Ｄ１Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｑ２Ａ、ｐＦＬ
Ｔ１１−Ｖ３Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｄ４Ａ、ｐＦＬＴ１１
−Ｖ５Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｋ６Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｄ７
Ａとした。一方、Ｆ１とＲ−Ｔ１２３Ａ，Ｒ−Ｈ１２４
Ａ，Ｒ−Ｋ１２６Ａ，Ｒ−Ｉ１２７Ａ，Ｒ−Ｒ１２８
Ａ，あるいはＲ−Ｄ１２９Ａのいずれかを用いて増幅し
たＤＮＡフラグメントをＢｇＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で切断後、ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩのＢｇＩＩＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、ｐＦＬＴ１１−Ｔ１２
３Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｈ１２４Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｋ１
２６Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｉ１２７Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｒ
１２８Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｄ１２９Ａとした。
【００２１】一方、１０番目から１３番目のアミノ酸を
各々アラニンに置換する場合は、つぎに示す二段階のＰ
ＣＲ反応をおこなった。即ち、表に示すとおり変異を導
入する目的のアミノ酸残基のコドンのみアラニンのコド
ンとし、それ以外は野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩと相補的な
配列の合成ヌクレオチドＲ−Ｎ１０Ａ、Ｒ−Ｎ１１Ａ、
Ｒ−Ｅ１２Ａ、Ｒ−Ｉ１３Ａを作製し、これらのいずれ
かとｐＦＬＴ１１のＢｇＩＩＩ切断部位より ３０ｂｐ
上流付近と同一な配列の合成ヌクレオチドＦ２をプライ
マーとし、ｐＦＬＴ１１を鋳型として用いてＰＣＲ反応
をおこなった。同時に、ｐＦＬＴ１１上のＢｇＩＩＩ部
位を同酵素で切断不可能な配列となるように設計したＦ
３と前述のＲ１をプライマーとして用い、同じくｐＦＬ
Ｔ１１を鋳型としてＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反
応で得られたこれら２種類のＤＮＡフラグメント１０ｎ
ｇずつを、先のＰＣＲ反応溶液からプライマーとポリメ
ラーゼを除いた溶液中に加え、９４℃で１０分間反応さ
せた後、３０分間で３７℃まで緩やかに冷却し最後に３
７℃で１５分保持することにより２本のフラグメントの
アニーリングをおこなった。続いてＴａｑポリメラーゼ
を２．５ユニット加え６０℃で３分保持することによ
り、２本のＤＮＡフラグメントの伸長をおこなった。こ
こに、先の２種類のプライマーＲ１とＦ２を０．５μｇ
ずつ加えた後ＰＣＲ反応を２０サイクルおこなってフラ
グメントを増幅した。以上の操作で、同じ長さの２種類
のＤＮＡフラグメントが得られた。
各々アラニンに置換する場合は、つぎに示す二段階のＰ
ＣＲ反応をおこなった。即ち、表に示すとおり変異を導
入する目的のアミノ酸残基のコドンのみアラニンのコド
ンとし、それ以外は野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩと相補的な
配列の合成ヌクレオチドＲ−Ｎ１０Ａ、Ｒ−Ｎ１１Ａ、
Ｒ−Ｅ１２Ａ、Ｒ−Ｉ１３Ａを作製し、これらのいずれ
かとｐＦＬＴ１１のＢｇＩＩＩ切断部位より ３０ｂｐ
上流付近と同一な配列の合成ヌクレオチドＦ２をプライ
マーとし、ｐＦＬＴ１１を鋳型として用いてＰＣＲ反応
をおこなった。同時に、ｐＦＬＴ１１上のＢｇＩＩＩ部
位を同酵素で切断不可能な配列となるように設計したＦ
３と前述のＲ１をプライマーとして用い、同じくｐＦＬ
Ｔ１１を鋳型としてＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反
応で得られたこれら２種類のＤＮＡフラグメント１０ｎ
ｇずつを、先のＰＣＲ反応溶液からプライマーとポリメ
ラーゼを除いた溶液中に加え、９４℃で１０分間反応さ
せた後、３０分間で３７℃まで緩やかに冷却し最後に３
７℃で１５分保持することにより２本のフラグメントの
アニーリングをおこなった。続いてＴａｑポリメラーゼ
を２．５ユニット加え６０℃で３分保持することによ
り、２本のＤＮＡフラグメントの伸長をおこなった。こ
こに、先の２種類のプライマーＲ１とＦ２を０．５μｇ
ずつ加えた後ＰＣＲ反応を２０サイクルおこなってフラ
グメントを増幅した。以上の操作で、同じ長さの２種類
のＤＮＡフラグメントが得られた。
【００２２】一つは、ＢｇＩＩＩ認識配列を持ち目的の
アミノ酸部位に変異が導入されたもので、もう一つは目
的のアミノ酸の配列が野生型と同じでＢｇＩＩＩ認識配
列が切断不可能に変異したものである。これらをＢｇＩ
ＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断後、同じくＢｇＩＩＩと
ＨｉｎｄＩＩＩ処理した ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩ
に連結することによりアラニン置換変異が導入されたベ
クターのみが得られた。このようにして１０番目から１
３番目までのアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した変
異型Ｄｅｒ ｆ ＩＩの発現ベクター、ｐＦＬＴ１１−
Ｎ１０Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｎ１１Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｅ
１２Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｉ１３Ａを作製した。
アミノ酸部位に変異が導入されたもので、もう一つは目
的のアミノ酸の配列が野生型と同じでＢｇＩＩＩ認識配
列が切断不可能に変異したものである。これらをＢｇＩ
ＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断後、同じくＢｇＩＩＩと
ＨｉｎｄＩＩＩ処理した ｐＧＥＭＥＸ１−△ＮｄｅＩ
に連結することによりアラニン置換変異が導入されたベ
クターのみが得られた。このようにして１０番目から１
３番目までのアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した変
異型Ｄｅｒ ｆ ＩＩの発現ベクター、ｐＦＬＴ１１−
Ｎ１０Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｎ１１Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｅ
１２Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｉ１３Ａを作製した。
【００２３】変異の導入の確認はＤＮＡシーケンシング
によりおこなった。即ち、変異を導入した発現ベクター
ＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７ ｐｒｉｍｅｒあるいはＳＰ６
ｐｒｉｍｅｒを用いてＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅにより反応をおこない、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７０Ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｒにより塩基配列を決定した（スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２１巻、６７
４頁、１９８６年）。
によりおこなった。即ち、変異を導入した発現ベクター
ＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７ ｐｒｉｍｅｒあるいはＳＰ６
ｐｒｉｍｅｒを用いてＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅにより反応をおこない、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７０Ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｒにより塩基配列を決定した（スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２１巻、６７
４頁、１９８６年）。
【００２４】実施例２ ＲＡＳＴ−ＥＩＡ法によるアミノ酸置換改変Ｄｅｒ ｆ
ＩＩのＩｇＥ抗体結合能の比較 実施例１で作成した１７種類のＤｅｒ ｆ ＩＩ変異体
の発現ベクター（ｐＦＬＴ１１，Ｄ１Ａ，ｐＦＬＴ１１
−Ｑ２Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｖ３Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｄ４
Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｖ５Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｋ６Ａ，ｐ
ＦＬＴ１１−Ｄ７Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｎ１０Ａ，ｐＦＬ
Ｔ１１−Ｎ１１Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｅ１２Ａ，ｐＦＬＴ
１１−Ｉ１３Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｔ１２３Ａ，ｐＦＬＴ
１１−Ｈ１２４Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｋ１２６Ａ、ｐＦＬ
Ｔ１１−Ｉ１２７Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｒ１２８Ａ、ｐＦ
ＬＴ１１−Ｄ１２９Ａ）のそれぞれにより形質転換した
大腸菌ＢＬ２１をアンピシリン入りＬ寒天培地（１％バ
クトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、
０．５％塩化ナトリウム、１．５％バクトアガー（以上
すべて単位は（Ｗ／Ｖ）、５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン、ｐＨ７．４）上に生育させた後に生じたコロニーを
適宜アンピシリン入りＬ液体培地（アンピシリン入りＬ
寒天培地より寒天を除いたもの）５ｍｌへ接種した。３
０℃で一晩振盪培養した後、これをアンピシリン入りＬ
液体培地５００ｍｌに添加して更に３０℃で振盪培養を
おこなった。
ＩＩのＩｇＥ抗体結合能の比較 実施例１で作成した１７種類のＤｅｒ ｆ ＩＩ変異体
の発現ベクター（ｐＦＬＴ１１，Ｄ１Ａ，ｐＦＬＴ１１
−Ｑ２Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｖ３Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｄ４
Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｖ５Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｋ６Ａ，ｐ
ＦＬＴ１１−Ｄ７Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｎ１０Ａ，ｐＦＬ
Ｔ１１−Ｎ１１Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｅ１２Ａ，ｐＦＬＴ
１１−Ｉ１３Ａ，ｐＦＬＴ１１−Ｔ１２３Ａ，ｐＦＬＴ
１１−Ｈ１２４Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｋ１２６Ａ、ｐＦＬ
Ｔ１１−Ｉ１２７Ａ、ｐＦＬＴ１１−Ｒ１２８Ａ、ｐＦ
ＬＴ１１−Ｄ１２９Ａ）のそれぞれにより形質転換した
大腸菌ＢＬ２１をアンピシリン入りＬ寒天培地（１％バ
クトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、
０．５％塩化ナトリウム、１．５％バクトアガー（以上
すべて単位は（Ｗ／Ｖ）、５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン、ｐＨ７．４）上に生育させた後に生じたコロニーを
適宜アンピシリン入りＬ液体培地（アンピシリン入りＬ
寒天培地より寒天を除いたもの）５ｍｌへ接種した。３
０℃で一晩振盪培養した後、これをアンピシリン入りＬ
液体培地５００ｍｌに添加して更に３０℃で振盪培養を
おこなった。
【００２５】この培養液の、６００ｎｍに於ける吸光度
が０．４に達したところでイソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭとなるように
加え更に５時間振盪培養を継続することにより、目的タ
ンパク質の発現誘導をおこなった。つぎに各改変Ｄｅｒ
ｆ ＩＩを発現した大腸菌ＢＬ２１の菌体を遠心分離
で回収し、超音波破砕で菌体を破壊した後、再び遠心分
離をおこなって封入体となっている改変Ｄｅｒ ｆ Ｉ
Ｉタンパク質を回収した。尿素を含む緩衝液（６Ｍ尿
素、１００ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭエチレンジアミン
４酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５）で封入体を可溶化し
た後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に透析
することにより再生をおこなった。この後、陰イオン交
換カラムクロマトグラフィーをおこない、改変Ｄｅｒ
ｆ ＩＩを精製した。イオン交換体にはＤＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社）を用いた。
この再生タンパク質溶液を、上記トリス緩衝液で平衡化
したイオン交換カラムへ供し吸着させた後、塩化ナトリ
ウムの濃度勾配（０から１００ｍＭ）にて溶出をおこな
った。塩濃度約８０ｍＭにて溶出された画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供した結果、分子量約１４，０００の単一バ
ンドが観察され、これを精製標品とした。
が０．４に達したところでイソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭとなるように
加え更に５時間振盪培養を継続することにより、目的タ
ンパク質の発現誘導をおこなった。つぎに各改変Ｄｅｒ
ｆ ＩＩを発現した大腸菌ＢＬ２１の菌体を遠心分離
で回収し、超音波破砕で菌体を破壊した後、再び遠心分
離をおこなって封入体となっている改変Ｄｅｒ ｆ Ｉ
Ｉタンパク質を回収した。尿素を含む緩衝液（６Ｍ尿
素、１００ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭエチレンジアミン
４酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５）で封入体を可溶化し
た後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に透析
することにより再生をおこなった。この後、陰イオン交
換カラムクロマトグラフィーをおこない、改変Ｄｅｒ
ｆ ＩＩを精製した。イオン交換体にはＤＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社）を用いた。
この再生タンパク質溶液を、上記トリス緩衝液で平衡化
したイオン交換カラムへ供し吸着させた後、塩化ナトリ
ウムの濃度勾配（０から１００ｍＭ）にて溶出をおこな
った。塩濃度約８０ｍＭにて溶出された画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供した結果、分子量約１４，０００の単一バ
ンドが観察され、これを精製標品とした。
【００２６】野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩ及び各アラニン置
換改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩについてそれぞれヒトＩｇＥ抗
体結合活性をファルマシア社製ＲＡＳＴ−ＥＩＡキット
を用いて測定した。操作は以下に示す通り、まず０．１
Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて希釈した精製標品溶
液５０μｌにブロモシアンで活性化した濾紙を浸積し室
温で一晩放置することにより濾紙にＤｅｒ ｆ ＩＩタ
ンパク質を吸着させた。つぎに標品溶液を除き、０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液５００μｌで瀘紙の洗浄をお
こなった後、１Ｍ β−エタノールアミン（ｐＨ９．
０）２５０μｌ中に濾紙を浸し室温で３時間静置して濾
紙上への非特異的吸着を防ぐブロッキング操作をおこな
った。エタノールアミン溶液を除き、０．１Ｍ炭酸水素
ナトリウム溶液５００μｌで１回、０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ４．０）５００μｌで３回、キット付
属の緩衝液５００μｌで２回の計６回洗浄をおこなった
後、同じくキット付属の緩衝液で４倍に希釈したダニア
レルギー患者血清５０μｌを添加し、３７℃で２時間静
置して血清中の抗Ｄｅｒ ｆ ＩＩ ＩｇＥ抗体と濾紙
に吸着している抗原を結合させた。
換改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩについてそれぞれヒトＩｇＥ抗
体結合活性をファルマシア社製ＲＡＳＴ−ＥＩＡキット
を用いて測定した。操作は以下に示す通り、まず０．１
Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて希釈した精製標品溶
液５０μｌにブロモシアンで活性化した濾紙を浸積し室
温で一晩放置することにより濾紙にＤｅｒ ｆ ＩＩタ
ンパク質を吸着させた。つぎに標品溶液を除き、０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液５００μｌで瀘紙の洗浄をお
こなった後、１Ｍ β−エタノールアミン（ｐＨ９．
０）２５０μｌ中に濾紙を浸し室温で３時間静置して濾
紙上への非特異的吸着を防ぐブロッキング操作をおこな
った。エタノールアミン溶液を除き、０．１Ｍ炭酸水素
ナトリウム溶液５００μｌで１回、０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ４．０）５００μｌで３回、キット付
属の緩衝液５００μｌで２回の計６回洗浄をおこなった
後、同じくキット付属の緩衝液で４倍に希釈したダニア
レルギー患者血清５０μｌを添加し、３７℃で２時間静
置して血清中の抗Ｄｅｒ ｆ ＩＩ ＩｇＥ抗体と濾紙
に吸着している抗原を結合させた。
【００２７】抗原抗体反応後血清を除き、キット付属の
洗浄液２．５ｍｌ中に濾紙を１０分間浸して洗浄する操
作を３回繰り返した後、キット付属のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体ウサギ抗体溶液５０
μｌを加えて室温にて１６−２０時間静置することによ
り抗原に吸着しているＩｇＥ抗体との結合反応をおこな
った。酵素標識抗体溶液を除いて前述と同様の方法で濾
紙を洗浄し、基質であるキット付属のｏ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液２００μｌを加え
て３７℃で２時間反応させた。最後にキット付属の停止
液２ｍｌを加えて酵素反応を停止した後、同反応液の４
２０ｎｍにおける吸光度を測定し、 この値を抗原Ｄｅ
ｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体結合活性として評価をお
こなった。この結果は、図２に示すとおりである。アラ
ニンに置換してもＩｇＥ抗体結合能に影響を及ぼさない
アミノ酸が存在する一方、Ｄ４Ａ，Ｋ６Ａ Ｄ７Ａ，Ｎ
１０Ａ，Ｎ１１Ａ，Ｅ１２Ａ，Ｉ１２７Ａといった改変
Ｄｅｒ ｆ ＩＩでは、野生型と比べてＩｇＥ抗体結合
活性が５０％以下に低下していることが判明した。この
ことから、この患者血清中に存在するＩｇＥ抗体が認識
している領域の形成には、少なくともＤｅｒ ｆ ＩＩ
のＮ末端側４番目のアスパラギン酸、６番目のリジン、
７番目のアスパラギン酸、１０、１１番目のアスパラギ
ン、Ｃ末端側１２７番目のイソロイシンが関与している
と推定される。これらのアミノ酸残基をアラニンに置換
することによりＩｇＥ抗体との結合力が低下し、その程
度は、置換するアミノ酸残基の種類や部位によって異な
ることが期待される。
洗浄液２．５ｍｌ中に濾紙を１０分間浸して洗浄する操
作を３回繰り返した後、キット付属のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体ウサギ抗体溶液５０
μｌを加えて室温にて１６−２０時間静置することによ
り抗原に吸着しているＩｇＥ抗体との結合反応をおこな
った。酵素標識抗体溶液を除いて前述と同様の方法で濾
紙を洗浄し、基質であるキット付属のｏ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液２００μｌを加え
て３７℃で２時間反応させた。最後にキット付属の停止
液２ｍｌを加えて酵素反応を停止した後、同反応液の４
２０ｎｍにおける吸光度を測定し、 この値を抗原Ｄｅ
ｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体結合活性として評価をお
こなった。この結果は、図２に示すとおりである。アラ
ニンに置換してもＩｇＥ抗体結合能に影響を及ぼさない
アミノ酸が存在する一方、Ｄ４Ａ，Ｋ６Ａ Ｄ７Ａ，Ｎ
１０Ａ，Ｎ１１Ａ，Ｅ１２Ａ，Ｉ１２７Ａといった改変
Ｄｅｒ ｆ ＩＩでは、野生型と比べてＩｇＥ抗体結合
活性が５０％以下に低下していることが判明した。この
ことから、この患者血清中に存在するＩｇＥ抗体が認識
している領域の形成には、少なくともＤｅｒ ｆ ＩＩ
のＮ末端側４番目のアスパラギン酸、６番目のリジン、
７番目のアスパラギン酸、１０、１１番目のアスパラギ
ン、Ｃ末端側１２７番目のイソロイシンが関与している
と推定される。これらのアミノ酸残基をアラニンに置換
することによりＩｇＥ抗体との結合力が低下し、その程
度は、置換するアミノ酸残基の種類や部位によって異な
ることが期待される。
【００２８】実施例３ 改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩによる野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩと
ヒトＩｇＥ抗体結合阻害活性 ＲＡＳＴ−ＥＩＡ法を用いて、野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩ
とヒトＩｇＥ抗体間の抗原抗体反応に対する阻害活性を
ヒトＩｇＥ抗体体合活性の大きく低下した改変Ｄｅｒ
ｆ ＩＩ ３種 （Ｄ４Ａ、Ｋ６Ａ、Ｄ７Ａ）について
調べた。方法は実施例２で前述したＲＡＳＴ−ＥＩＡ法
に従うが、濾紙には一律５０ｎｇ／ｍｌの野生型Ｄｅｒ
ｆ ＩＩを吸着させた。異なる濃度の野生型あるいは
改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを患者血清に加えて室温で２〜３
時間放置した。血清濃度は最終的に４倍希釈となるよう
に調製した。この血清溶液を野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩを
吸着している濾紙に添加し、以下同様の方法で反応、吸
光度を測定した。どの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを血清に添
加した場合も、血清をそのまま使用した時に比べて吸光
度が低下した。このことは野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒ
トＩｇＥ抗体結合を改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩが阻害した結
果だと考えられる。吸光度がブランク値になった場合を
１００％とした場合、野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩ及び改変
Ｄｅｒ ｆＩＩの相対阻害活性を図３に示す。測定した
改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩはどれも野生型とほぼ同等の阻害
率を示すことが明らかになった。
ヒトＩｇＥ抗体結合阻害活性 ＲＡＳＴ−ＥＩＡ法を用いて、野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩ
とヒトＩｇＥ抗体間の抗原抗体反応に対する阻害活性を
ヒトＩｇＥ抗体体合活性の大きく低下した改変Ｄｅｒ
ｆ ＩＩ ３種 （Ｄ４Ａ、Ｋ６Ａ、Ｄ７Ａ）について
調べた。方法は実施例２で前述したＲＡＳＴ−ＥＩＡ法
に従うが、濾紙には一律５０ｎｇ／ｍｌの野生型Ｄｅｒ
ｆ ＩＩを吸着させた。異なる濃度の野生型あるいは
改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを患者血清に加えて室温で２〜３
時間放置した。血清濃度は最終的に４倍希釈となるよう
に調製した。この血清溶液を野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩを
吸着している濾紙に添加し、以下同様の方法で反応、吸
光度を測定した。どの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを血清に添
加した場合も、血清をそのまま使用した時に比べて吸光
度が低下した。このことは野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒ
トＩｇＥ抗体結合を改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩが阻害した結
果だと考えられる。吸光度がブランク値になった場合を
１００％とした場合、野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩ及び改変
Ｄｅｒ ｆＩＩの相対阻害活性を図３に示す。測定した
改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩはどれも野生型とほぼ同等の阻害
率を示すことが明らかになった。
【００２９】
【配列表】
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝子工学を使ってヒ
ョウヒダニ主要アレルゲンタンパク質Ｄｅｒ ｆ ＩＩ
を最小限の改変で、そのＩｇＥ抗体結合活性を低下させ
ることが可能になった。また、改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩは
野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体との結合を阻
害した。これらの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩは大腸菌等を用
いて大量に製造することができ、それゆえ、これらの改
変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを用いて各種アレルギー疾患の治療
あるいは診断に利用することができる。
ョウヒダニ主要アレルゲンタンパク質Ｄｅｒ ｆ ＩＩ
を最小限の改変で、そのＩｇＥ抗体結合活性を低下させ
ることが可能になった。また、改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩは
野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体との結合を阻
害した。これらの改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩは大腸菌等を用
いて大量に製造することができ、それゆえ、これらの改
変Ｄｅｒ ｆ ＩＩを用いて各種アレルギー疾患の治療
あるいは診断に利用することができる。
【図１】実施例１において、Ｄｅｒ ｆ ＩＩの特定ア
ミノ酸をアラニンに置換した変異Ｄｅｒ ｆ ＩＩの発
現ベクターｐＦＬＴ１１を構築するまでの工程を示す説
明図である。
ミノ酸をアラニンに置換した変異Ｄｅｒ ｆ ＩＩの発
現ベクターｐＦＬＴ１１を構築するまでの工程を示す説
明図である。
【図２】実施例２において、改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩのヒ
トＩｇＥ抗体との親和性を示した図である。
トＩｇＥ抗体との親和性を示した図である。
【図３】実施例３において、改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩによ
る野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体との結合阻
害活性を示した図である。
る野生型Ｄｅｒ ｆ ＩＩとヒトＩｇＥ抗体との結合阻
害活性を示した図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年５月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】改変したダニ主要アレルゲン及びその製
造方法
造方法
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 結城 敏文 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社中央研究所内 (72)発明者 奥村 康 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社中央研究所内 (72)発明者 渋谷 一郎 干葉県柏市増尾字松山967 ニッカウヰス キー株式会社生産技術研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 ダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆ ＩＩを
コードする遺伝子が配列表の配列番号：１−ａまたは１
−ｂまたは１−ｃで示されるＤＮＡ配列を有し、該ダニ
主要アレルゲンＤｅｒ ｆ ＩＩの特定の１つのアミノ
酸残基をアラニンに置換した改変Ｄｅｒ ｆ ＩＩをコ
ードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転換した原核
生物または真核生物を培養し、培養物から改変したダニ
主要アレルゲンを採取することを特徴とするダニ主要ア
レルゲンの製造法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の製造法により製造され
た改変したダニアレルゲン。 - 【請求項３】 請求項１記載の方法により製造され、配
列表の配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８または２９に示すアミノ酸配列を
含むポリペプチド。 - 【請求項４】請求項３のいずれか１つのポリペプチドを
コードするＤＮＡ鎖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27589793A JP3350794B2 (ja) | 1993-09-29 | 1993-09-29 | 改変したダニ主要アレルゲン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27589793A JP3350794B2 (ja) | 1993-09-29 | 1993-09-29 | 改変したダニ主要アレルゲン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0795887A true JPH0795887A (ja) | 1995-04-11 |
| JP3350794B2 JP3350794B2 (ja) | 2002-11-25 |
Family
ID=17561968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27589793A Expired - Fee Related JP3350794B2 (ja) | 1993-09-29 | 1993-09-29 | 改変したダニ主要アレルゲン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3350794B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030539A1 (fr) * | 1995-03-28 | 1996-10-03 | Asahi Breweries, Ltd. | Allergene d'acarien obtenu grace au genie genetique et son procede de fabrication |
| US6800290B2 (en) * | 2000-09-12 | 2004-10-05 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Variants of allergenic proteins of the group 2 of dermatophagoides |
| US7485708B2 (en) | 1996-09-23 | 2009-02-03 | University Of Arkansas | Nucleic acids encoding ara h 3 polypeptides |
| US7879977B2 (en) | 1998-01-31 | 2011-02-01 | University Of Arkansas | Methods and reagents for decreasing clinical reaction to allergy |
| US8153414B2 (en) | 2000-04-06 | 2012-04-10 | Allertein Therapeutics, Llc | Microbial delivery system |
| US8246945B2 (en) | 2000-04-06 | 2012-08-21 | University Of Arkansas | Methods and reagents for decreasing clinical reaction to allergy |
-
1993
- 1993-09-29 JP JP27589793A patent/JP3350794B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030539A1 (fr) * | 1995-03-28 | 1996-10-03 | Asahi Breweries, Ltd. | Allergene d'acarien obtenu grace au genie genetique et son procede de fabrication |
| AU689382B2 (en) * | 1995-03-28 | 1998-03-26 | Asahi Breweries, Ltd. | Engineered acarid allergen and process for producing the same |
| US7485708B2 (en) | 1996-09-23 | 2009-02-03 | University Of Arkansas | Nucleic acids encoding ara h 3 polypeptides |
| US7879977B2 (en) | 1998-01-31 | 2011-02-01 | University Of Arkansas | Methods and reagents for decreasing clinical reaction to allergy |
| US8153414B2 (en) | 2000-04-06 | 2012-04-10 | Allertein Therapeutics, Llc | Microbial delivery system |
| US8246945B2 (en) | 2000-04-06 | 2012-08-21 | University Of Arkansas | Methods and reagents for decreasing clinical reaction to allergy |
| US8815251B2 (en) | 2000-04-06 | 2014-08-26 | Allertein Therapeutics, Llc | Microbial delivery system |
| US6800290B2 (en) * | 2000-09-12 | 2004-10-05 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Variants of allergenic proteins of the group 2 of dermatophagoides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3350794B2 (ja) | 2002-11-25 |
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