ES2229263T3 - Sustancia alergena para acaridos obtenida mediante ingenieria genetica y proceso para la produccion de la misma. - Google Patents
Sustancia alergena para acaridos obtenida mediante ingenieria genetica y proceso para la produccion de la misma.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UN ALERGENO DE ACARIDO PRINCIPAL PRODUCIDO MEDIANTE INGENIERIA GENETICA QUE INCLUYE INCUBAR UN ORGANISMO PROCARIOTA O EUCARIOTA QUE SE HA TRANSFORMADO MEDIANTE UN VECTOR DE REPLICACION QUE CONTIENE UN GEN QUE CODIFICA PARA EL ALERGENO DE ACARIDO PRINCIPAL DER F II, EN EL CUAL, EN UN GEN QUE CODIFICA PARA EL ALERGENO DE ACARIDO PRINCIPAL DER F II Y QUE POSEE UNA SECUENCIA DE ADN ESPECIFICA, SE HA SUSTITUIDO UN AMINOACIDO EN UNA POSICION ESPECIFICA DEL ALERGENO DE ACARIDO PRINCIPAL DER F II POR OTRO AMINOACIDO DISTINTO DE LA ALANINA, Y RECOGER A PARTIR DEL CULTIVO EL ALERGENO DE ACARIDO PRINCIPAL PRODUCIDO MEDIANTE INGENIERIA GENETICA; EL ALERGENO DE ACARIDO PRODUCIDO DE ESTA MANERA; Y UN POLIPEPTIDO Y UNA CADENA DE ADN QUE CONTIENE UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS ESPECIFICA. EL ALERGENO DE DERMATOFAGOIDES PRINCIPAL PRODUCIDO MEDIANTE INGENIERIA GENETICA (DER F II) PUEDE UTILIZARSE EN UN REMEDIO PARA ENFERMEDADES ALERGICAS.
Description
Sustancia alérgena para acáridos obtenida
mediante ingeniería genética y proceso para la producción de la
misma.
La presente invención se refiere a un alérgeno
modificado que es obtenido mediante la modificación de un alérgeno
principal (Der f II) de ácaros presentes en el polvillo casero
mediante ingeniería genética, y se refiere asimismo a un método
para la producción de dicho alérgeno modificado. Dicho alérgeno
modificado obtenido mediante el método de producción puede ser
utilizado como producto medicinal para el tratamiento de
enfermedades alérgicas.
Se considera que numerosas enfermedades alérgicas
se deben a varios tipos de síntomas que son desarrollados por la
sensibilización de un antígeno que produce dichas enfermedades, en
las que se produce un anticuerpo de IgE específico para alérgeno en
suero sanguíneo y tejido, dicho anticuerpo es expuesto nuevamente
al antígeno, y el mencionado anticuerpo reacciona con dicho
antígeno en cada tejido. De manera particular, una reacción de tipo
inmediata es producida por la combinación de dichos antígenos con
los anticuerpos de IgE en mastocitos y basófilos, seguida por el
entrecruzamiento de los mencionados anticuerpos de IgE, y la
liberación subsiguiente de numerosos tipos de mediadores químicos
desde los mastocitos o basófilos.
Existe un método para llevar a cabo el control de
la unión entre el antígeno y el anticuerpo de IgE como un método
para el tratamiento de enfermedades alérgicas. Si la unión entre el
antígeno y el anticuerpo IgE es controlada, el entrecruzamiento
entre dichos anticuerpos IgE en los mastocitos o basófilos y la
liberación de mediadores químicos son controlados produciendo un
efecto en el tratamiento.
Por otro lado, parece que las enfermedades
alérgicas tales como el asma bronquial, asma infantil, dermatitis
atípica y enfermedades similares son causadas de forma principal
por agentes alérgenos de los ácaros que habitan en el polvillo
casero. Numerosos tipos de proteínas de alérgenos de ácaros
principales han sido identificadas como los principales alérgenos
de los ácaros (Platts-Mills y otros, J. Allergy
Clin. Immunol., 80, 755(1987)). Además, se ha dado a conocer
un método de producción masiva de un alérgeno principal de ácaros
purificado (Yuuki y otros, Japanese J. Allergology, 39,
557(1990) y la publicación de patente japonesa Nº
03254683).
Además, dicho alérgeno modificó una parte de los
alérgenos de ácaros principales purificados mencionados
anteriormente y se ha presentado solicitud por un método de
producción del mismo. (Publicación de patente japonesa Nº
06253851).
Sin embargo, las proteínas de los alérgenos
principales de los ácaros, que han sido encontradas e
identificadas, presentan problemas de reacciones alérgicas, a saber
shock anafiláctico, en la terapia de hiposensibilización, debido a
que la actividad de dichos alérgenos es alta.
Por otro lado, si se obtiene el alérgeno de
ácaros principal modificado, que presenta una menor actividad de
unión IgE o menor actividad alergénica que el tipo de alérgenos
naturales e inhibe la unión del antígeno (Der f II) y el anticuerpo
IgE, resulta posible proporcionar una medicina efectiva para el
tratamiento de las enfermedades alérgicas. La medicina no muestra
el shock anafiláctico de la reacción alérgica producida por la
administración del antígeno, y no tiene ningún efecto en el otro
sistema inmunológico dado que dicha medicina es específica para
dicho antígeno. Se han dado a conocer alérgenos principales
modificados de los ácaros en las publicaciones de patentes
japonesas Nº 06253851 y 07095887. En el primer documento, existen
problemas de mantenimiento y estabilidad de la inmunogenicidad
debido a que la estructura molecular está modificada notoriamente
por los substituyentes aminoácidos. En esta última solicitud de
patente, no es suficiente minimizar el cambio estructural y
disminuir la actividad del alérgeno debido a que la posición de
modificación del alérgeno no es satisfactoriamente específica y se
utiliza alanina solamente como un sustituyente de aminoácido.
Los inventores de la presente invención han
encontrado que, cuando un aminoácido o una parte específica del
alérgeno principal (Der f II) de los ácaros, que ha sido descrito
anteriormente en el presente documento, es reemplazado por otro
aminoácido similar para minimizar el cambio de la estructura, la
actividad de unión IgE puede ser modificada. Se ha encontrado que
no existe diferencia entre los alérgenos principales modificados de
los ácaros y aquellos de tipo natural o salvaje en cuanto a la
actividad que inhibe la unión del antígeno (Der f II) a la IgE.
Un objetivo de la presente invención es dar a
conocer un método de producción en masa del alérgeno principal
modificado de los ácaros Der f II en el que las sustituciones de
aminoácidos son llevadas a cabo mediante ingeniería genética. Es
decir, la presente invención tiene como objetivo la producción de
un material que pueda ser utilizado como medicina para el
tratamiento de enfermedades alérgicas.
La presente invención se caracteriza por un
método en el que el alérgeno principal (Der f II) de los ácaros que
están presentes en el polvillo casero (Dermatophagoides
farinae) es modificado mediante ingeniería genética para
reemplazar los residuos de aminoácido con otros residuos
aminoácidos, procariotes o eucariotes siendo transformado con un
vector de duplicación que contiene un gen que codifica al alérgeno
principal modificado de los ácaros. El mencionado Der f II es
cultivado, y dicho alérgeno principal modificado de los ácaros es
obtenido a partir de dicho cultivo.
Se ha dado a conocer que el alérgeno principal de
los ácaros Der f II presenta seis residuos de cisteína, y tiene
tres entrecruzamientos intramoleculares (entre los residuos
aminoácidos 8º y 119º, 21º y 27º, y entre 73º y 78º) mediante
uniones de bisulfuro (Nishiyama y otros, Intecional Archives of
Allergy and Immunology, 101, 159(1993)). Además, el
efecto de las actividades de unión IgE es dado a conocer por la
preparación de un Der f II modificado que es obtenido mediante la
eliminación de una de las uniones de bisulfuro en la técnica de
ingeniería genética molecular (Publicación de patente japonesa Nº
06253851). De acuerdo con el informe, la unión de bisulfuro entre
el 8º y el 119º es la más importante para la actividad de unión
IgE.
Los presentes inventores han investigado de forma
repetida y han descubierto que una zona alrededor de la unión de
bisulfuro entre la cisteína 73ª y la cisteína 78ª tiene un efecto
en la unión IgE. Además, han encontrado que resulta posible
disminuir la capacidad de unión IgE de forma significativa mediante
la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tenga una
propiedad muy cercana al mismo. Por ejemplo, el ácido aspártico 7º
puede ser reemplazado por ácido glutámico o asparraguina así como
la mencionada alanina. A pesar de que el ácido aspártico 19 es
reemplazado por ácido glutámico, no se observan cambios en la
capacidad de unión IgE. Sin embargo, cuando el ácido aspártico es
reemplazado por asparraguina, se observa que la capacidad de unión
IgE se reduce en gran medida y dicha capacidad es afectada por la
carga eléctrica en el residuo aminoácido 19º. Además, por ejemplo,
cuando la alanina 9ª es reemplazada por leucina, la actividad de
unión es del 30% de la actividad original. Por otro lado, cuando la
alanina es reemplazada por prolina tal como se muestra en la
presente invención, se observa que la actividad de unión disminuye
hasta el 10% o menos. Entre los mutantes que tienen una actividad
de unión ampliamente disminuida, los mutantes efectivos se observan
mediante un experimento animal con ratones que desarrollan alergia
a ácaros. De este modo, la presente invención ha sido llevada a
cabo encontrando alérgenos modificados efectivos para un
tratamiento de hiposensibilización para pacientes con alergia a
ácaros.
Los alérgenos modificados de la presente
invención pueden ser producidos mediante cualquier método apropiado
para los objetivos de la presente invención, de forma preferente
mediante un método de mutagénesis dirigida. A pesar de que han sido
establecidos numerosos métodos de mutagénesis dirigida, resulta
práctico el método PCR (reacción en cadena de polimerasa) (Ito y
otros, Gene, 102, 67(1991)). A modo de ejemplo, se
muestra a continuación que el residuo de ácido aspártico 7º de la
proteína Der f II, es reemplazado por un residuo de ácido glutámico
utilizando la cadena de ADN como se muestra en la secuencia Nº
1-a.
El codón correspondiente al residuo de ácido
aspártico 7^{mo} es GAT en la SEQ ID Nº 1. Dicho codón es
reemplazado por un codón correspondiente al ácido glutámico, por
ejemplo GAG. El oligonucleótido que tiene la misma secuencia es el
de la secuencia de ADN próxima al residuo de ácido aspártico, en el
que sólo el codón (GAT) del residuo de ácido aspártico que es
reemplazado por el codón (GAG) del residuo de ácido glutámico, es
sintetizado (Tabla 1, F-D7E). Dicha síntesis puede
ser llevada a cabo mediante un método bien conocido, de forma
conveniente a través de un sintetizador automático (por ejemplo, un
sintetizador de ADN Modelo 381, fabricado por la compañía Applied
Biosystems).
Cualquier fragmento de ADN incluyendo ADNc del
Der f II mostrado en la secuencia Nº1 puede ser utilizado como el
patrón de ADN para amplificación mediante un método PCR. En este
caso se utilizó pFLT 11 (figura 1) como patrón. El oligonucleótido
sintético R 1 (Tabla 1) presenta la misma secuencia que la de la
región que contiene una secuencia del sitio de reconocimiento Hind
III más allá de la zona de codificación Der f II en pFLT 11, se
llevó a cabo PCR utilizando dos oligonucleótidos sintéticos, sobre
F-D7E y R1 como iniciadores.
Después de la PCR, las secuencias de nucleótido
de los fragmentos de ADN amplificado resultantes pueden ser
determinadas mediante método didesoxi (J. Mol. Biol., 162,
729-773(1982)) o métodos similares.
Entonces, el ADN modificado, que había sido
certificado como introductor de una mutación, es insertado en un
sitio de clonación de un vector de expresión apropiado, y puede
expresarse un Der f II modificado. En dicha expresión, puede ser
utilizado cualquier vector plásmido existente de forma estable en
E. coli, y de manera conveniente, por ejemplo, puede ser
utilizado pGEMEX1 (fabricado por Promega Company). En dicho vector,
un estimulador T7 es utilizado como estimulador de expresión, y es
sabido que se produce mucha expresión y la proteína recombinante es
acumulada en E. coli como cuerpo de inclusión. Numerosos
métodos pueden ser utilizados en una cadena que incluya dichas
operaciones (Maniatis y otros, Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982).
El ADN puede ser expresado mediante la
utilización de un vector apropiado tal como el YEpl3 (Broach y
otros, Gene, 8, 121-133(1979)) en
levadura. Utilizando un vector de levadura que presenta un casete
de expresión que acompaña un gen de Der f II modificado que es
obtenido mediante el método de la presente invención, puede
llevarse a cabo la transformación de una célula de levadura
apropiada. Para este objetivo, la secuencia de ADN de la presente
invención no debe ser controlada por un estimulador E. coli,
sino un estimulador eucariota, por ejemplo, delta P8 o similares
(Otake y otros, Agric. Biol. Chem., 52,
2753-2762(1988)).
De este modo, los plásmidos modificados fueron
preparados por la substitución de otros aminoácidos distintos a la
alanina para el aminoácido 7^{mo} del lado terminal N del alérgeno
principal Der f II de ácaros, de forma respectiva, y cada plásmido
fue transformado y expresado en E. coli.
Entonces, la actividad de unión del anticuerpo
IgE del Der f II modificado fue determinada de forma cuantitativa.
Antes de dicha determinación, es necesaria la purificación de cada
proteína de Der f II modificada. El esquema es como se indica a
continuación. Las células del anfitrión E. coli BL 21 que
transporta el plásmido anteriormente mencionado fueron cultivadas
recolectadas después de la expresión. Las células fueron trituradas
de forma hipersónica, y la proteína de Der f II expresada como
cuerpo de inclusión fue recolectada por centrifugación. Después de
la disolución del cuerpo de inclusión con urea 6M, la solución fue
dializada con una solución amortiguadora de 20 mM de Tris
hidrocloruro (pH 8,5) para eliminar la urea y replegar dicha
proteína. Entonces, la fracción de Der f II fue purificada mediante
cromatografía de intercambio de aniones. A saber, la fracción que
incluye la proteína replegada fue adsorbida en una columna de DEAE-
Toyopearl (fabricada por la compañía Tosoh), y eluida con 80 mM de
NaCl para obtener la proteína de Der f II purificada.
Utilizando Der f II pura modificada así
resultante, se determinó de forma cuantitativa la actividad de
unión IgE. Para este objetivo, se utiliza de forma conveniente un
equipo RAST-EIA (fabricado por la compañía
Pharmacia). Primero, se sumergió un disco de filtro de papel
activado con bromocianuro en una solución de 50 \mul de Der f II
modificado que fue diluida con una solución amortiguadora de ácido
bórico 0,1 M (pH 8,5), y se dejó reposar durante la noche, y la
proteína quedó unida al papel de filtro. Después del lavado, dicho
papel de filtro fue sumergido en 50 \mul de suero para pacientes
alérgicos a los ácaros que fue clarificado cuatro veces con
solución amortiguadora acoplado al equipo, fue dejado estar por dos
horas a 37ºC, y el antígeno unido al papel de filtro fue unido al
anticuerpo humano IgE anti Der f II en el suero. Entonces, se llevó
a cabo la reacción de acuerdo con el protocolo de reacción del
equipo. Una vez que la reacción estuvo terminada, 420 nm de la
absorbencia de la muestra fue un índice de la actividad de unión
IgE. Los resultados son mostrados en la figura 2. Las proteínas
modificadas obtenidas mediante la substitución de alanina,
asparraguina y ácido glutámico para el 7º fueron advertidas. En
cuando al 7^{mo} ácido aspártico, aún cuando es reemplazado por
cualquier aminoácido, la capacidad de unión con la IgE disminuye
más en comparación con el Der f II de tipo natural. En
consecuencia, la condición necesaria es que el 7º aminoácido sea
ácido aspártico para la unión IgE.
Entonces, mediante la utilización de las
proteínas modificadas de Der f II que tienen una actividad de unión
IgE disminuida en un experimento animal, la eficiencia fue
confirmada para la hiposensibilización. Fueron administrados de
forma intraperitoneal 10 \mug de Der f II y 100 \mug de
adyuvante de Freund a ratones A/J de siete semanas de edad machos
para sensibilizar con rDer f. Se administró de forma instantánea 1
mg/ml de proteínas modificadas para sensibilizar a dichos ratones
dos veces a la semana durante tres semanas. Se administró la misma
cantidad de una solución salina fisiológica a los controles. Una
semana después de la administración final, los animales fueron
introducidos en una cámara para animales pequeños para inhalar
cinco mg/ml de Der f II mediante nebulización durante 30 minutos.
Después de 24 horas, los ratones fueron sacrificados por sangrado,
seguido por un lavado alveolar bronquial con 1 ml de PBS. Se
realizaron preparaciones de Cytospin a partir de 200 \mul de
fluido de lavado alveolar bronquial (abreviado a continuación como
BALF), y marcadas con Dif-quik (Marca registrada).
Las muestras fueron observadas bajo un microscopio de 400 aumentos
y los leucocitos (macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y
linfocitos) fueron contados dentro del rango del microscopio para
determinar el grado de inflamación de las vías respiratorias. En
los leucocitos de ratones no sensibilizados en BALF tomados después
de la inhalación del antígeno, se observan pocos excepto los
macrófagos. Por otro lado, en los ratones inmunizados, se
observaron numerosos neutrófilos y linfocitos, y el contaje de
leucocitos fue alrededor de 2,5 veces mayor que el contaje de los
grupos no inmunizados. A saber, en los ratones sensibilizados, se
confirmó que la inflamación de las vías respiratorias fue inducida
por la inhalación del antígeno. En contraste, en los ratones
sensibilizados administrados con Der f II de tipo natural o con el
substituyente, el contaje de leucocitos disminuyó de forma
substancial, mostrando la efectiva hiposensibilización. De acuerdo
con ello, se ha demostrado que las proteínas modificadas de Der f
II son agentes seguros y efectivos para el tratamiento de las
enfermedades alérgicas, debido a la escasa posibilidad de que se
produzca un shock anafiláctico que disminuya la actividad de unión
IgE.
La figura 1 muestra pFLT11 que fue utilizado para
la amplificación mediante un método de PCR.
La figura 2 es un gráfico que muestra los
resultados de la absorbencia de la solución de reacción observada a
420 nm en el ejemplo 2, y evaluando los valores como actividades de
unión de las proteínas modificadas de Der f II e IgE humana.
Los siguientes ejemplos muestran la presente
invención en detalle.
Se preparó un vector que desarrolla una variante
en la que el residuo de aminoácido objetivo de Der f II ha sido
substituido por otro aminoácido mediante un método de mutagénesis
dirigida PCR. Antes de llevar a cabo el método PCR, se sintetizaron
oligonucleótidos del modo que se muestra en la Tabla 1.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
*: las negritas muestran desajustes de los substituyentes de
aminoácidos, y el subrayado muestra\cr los sitios de enzimas de
restricción.\cr}
Cuando la 7ª Asp del lado terminal N del Der f II
se cambió por Glu o Asn, se diseñó un oligonucleótido sintetizado
para que tuviera la misma secuencia a la del Der f II de tipo
natural excepto en que un codón del aminoácido objetivo que será
modificado fue cambiado por un codón de Glu o Asp, y para
introducir nuevamente una secuencia de reconocimiento de la enzima
de restricción Nde I en una zona anterior al codón de iniciación.
Se llevó a cabo PCR utilizando el vector de expresión pFLT11
(solicitud de patente japonesa Nº 5-139793)
incluyendo cADN de Der f II de tipo natural como patrón. El
oligonucleótido sintetizado R1 que tiene una secuencia
complementaria a una zona que contiene una secuencia de
reconocimiento Hind III del lado más allá del sitio que clona Der f
II en pFLT11, y los oligonucleótidos antes sintetizados
F-D7E o -D7N fueron utilizados como imprimadores. La
solución de PCR fue preparada mediante la adición de un \mug de
cada uno de los dos imprimadores, F-D7E y R1, o
F-D7N y R1, a un ng del plásmido pFLTll como
patrón; la adición de 10 \mul de una solución de reacción 10x
unida a polimerasa de ADN Taq (TOYOBO), 10 \mul de una solución
de 25 mM de MgCl_{2}; la adición de dATP, dCTP, dGTP y dTTP de
modo que cada una de las concentraciones finales sea 200 \muM eb
100 \mul de solución de reacción; la adición de agua destilada
para ajustar el volumen de la solución de reacción hasta 100
\mul; y la adición de 2,5 unidades de la polimerasa de ADN Taq.
Después, la solución resultante fue dejada a 94ºC durante un minuto
para modificar el ADN de dos cadenas y obtener ADN de cadena única,
y fue dejada a 37ºC durante dos minutos para cocer el imprimador
hasta obtener un patrón de cadena única, y luego la solución fue
reaccionada a 72ºC durante tres minutos para sintetizar un ADN
complementario mediante la polimerasa. Las etapas anteriormente
descritas fueron repetidas 25 ciclos para amplificar los fragmentos
de ADN objetivo.
Después de la digestión de los fragmentos de ADN
resultantes mediante Nde I y Hind III, los fragmentos fueron
insertados en los sitios Nde I/Hind III del plásmido
pGEME1-Ande (solicitud de patente japonesa Nº
5-139793) para obtener vectores de expresión que
incluyen ADNs de los mutantes, pFLT11-D7E y D7N, de
forma respectiva.
Se añadieron 10 ng de cada uno de los dos
fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR a la solución obtenida
mediante la eliminación del imprimador y la polimerasa de la
solución de PCR previa, la mezcla fue reaccionada a 94ºC durante 10
minutos, enfriada de forma gradual hasta 37ºC durante 30 minutos, y
mantenida a 37ºC durante 15 minutos para cocer dichos dos
fragmentos. De forma subsiguiente, se añadieron 2,5 unidades de
polimerasa Taq, y se mantuvieron a 60ºC durante tres minutos para
alargar dichos dos fragmentos de ADN. Entonces, se añadieron 0,5
\mug de cada uno de los dos imprimadores anteriores R1 y F1, se
repitieron 20 ciclos de PCR para amplificar dichos fragmentos.
Mediante dicha operación, se obtuvieron dos tipos de fragmentos que
presentaron la misma longitud. Un fragmento presentó una secuencia
de reconocimiento Bgl II y fue modificada en el residuo aminoácido
objetivo, y el otro fragmento presentó la misma secuencia de
aminoácidos que la del tipo natural y fue modificada para que
resulte imposible irrumpir en la secuencia de reconocimiento Bgl
II. Después de que dichos fragmentos fueron digeridos con Bgl II y
Hind III, fueron unidos a pGEMEX1-\DeltaNde I que
fueron tratados con Bgl II y Hind III, y se obtuvieron únicamente
vectores en los que las mutaciones objetivo fueron
introducidas.
Después de que el E. coli BL21
transformado por cada vector de expresión de los mutantes de Der f
II construidos en el Ejemplo 1 (pFLT11-D7E,
pFLT11-D7N, y pFLT11-A9P) fueron
madurados en un medio de agar conteniendo ampicilina (1%
bactotriptone, 0,5% extracto de levadura, 0,5% cloruro sódico, 1,5%
bactoagar (estas unidades fueron Peso/Volumen), 50 \mug/ml de
ampicilina, pH 7,4), las colonias resultantes fueron inoculadas en
5 ml de un medio líquido L conteniendo ampicilina (el agar fue
eliminado del medio de agar L conteniendo ampicilina). Después de
que las colonias fueron cultivadas con agitación a 30ºC durante una
noche, el medio fue añadido a 500 ml de un medio líquido L
conteniendo ampicilina, y además la solución fue cultivada con
agitación a 30ºC. Cuando la absorbencia de la solución alcanzó el
valor 0,4, se añadió
isopropil-\beta-thiogalactopiranocide
(IPTG) al 0,1 mM, la solución fue cultivada durante cinco horas más
con agitación, y la proteína objetivo fue expresada. Entonces, las
células de E. coli BL21 expresando cada mutante Der f II
fueron recogidas mediante centrifugado, se rompieron dichas células
con un mezclador ultrasónico, y los mutantes de Der f II expresados
como cuerpos de inclusión fueron recogidos mediante centrifugado.
Los cuerpos de inclusión fueron replegados mediante solubilización
en una solución amortiguadora conteniendo urea (urea 6M, 100 mM
ácido tris clorhídrico y 10mM ácido etilendiaminatetraacético
(EDTA), pH 7,5), y mediante diálisis en una solución amortiguadora
Tris (20 mM ácido Tris clorhídrico, pH 8,5). Esta solución fue
proporcionada en una columna de intercambio de iones
DEAE-Toyopearl (TOSOH) que fue equilibrada en la
mencionada solución amortiguadora Tris y fue eluida por un
gradiente de concentración de cloruro sódico (desde 0 mM a 100 mM).
El fragmento eluido a 80 mM aproximadamente de concentración salina
fue sometido a SDS-PAGE, y se obtuvo una muestra
purificada en una única banda de 14.000 de peso molecular de forma
aproximada.
Se determinó la actividad de unión IgE humana del
Der f II de tipo natural y la de cada mutante utilizando el equipo
RAST-EIA fabricado por Pharmacia Company. El método
de operación fue como se describe a continuación. Primero, un
filtro de papel, que fue activado con bromociano, fue sumergido en
50 \mul de una solución de antígeno diluida con una solución
amortiguadora de ácido bórico 0,1 M (pH 8,5), e incubada durante
una noche a temperatura ambiente para adsorber dicho antígeno.
Entonces, la solución de antígeno fue eliminada, el filtro de papel
fue lavado en 500 \mul de una solución de carbonato de hidrógeno
sódico 0,1 M y sumergido en 250 \mul de
\beta-etanolamina 1 M (pH 9,0), e incubada
durante tres horas a temperatura ambiente para impedir la absorción
no específica en el papel mediante una operación de bloqueo. La
solución de etanolamina fue eliminada, el papel de filtro fue lavado
una vez en 500 \mul de una solución de hidrogencarbonato sódico
0,1 M y tres veces en 500 \mul de una solución amortiguadora de
acetato sódico 0,1 M (pH 4), y tres veces en 500 \mul de la
solución amortiguadora añadida al equipo. Añadiendo 50 \mul de
suero para un paciente con alergia, que fue diluido 4 veces con la
solución amortiguadora del equipo, el papel en la solución fue
incubado durante dos horas a 37ºC para combinar el anti Der f
II-IgE en el suero y el antígeno adsorbido en dicho
papel de filtro.
Después de la reacción
antígeno-anticuerpo, el suero fue eliminado, el
papel de filtro fue lavado tres veces sumergiéndolo tres veces
durante diez minutos en 2,5 ml de la solución de lavado del equipo,
se añadieron 50 \mul de una solución humana anti
IgE-conejo IgG marcada con
\beta-D-galactosidasa del equipo,
y la solución resultante fue dejada durante 16 a 20 horas a
temperatura ambiente para combinar el IgE adsorbido con el
antígeno. Después de que la solución de anticuerpo marcada con
enzimas fue eliminada, el papel de filtro fue lavado como ha sido
descrito anteriormente en el presente documento, y se añadieron 200
\mul de substrato
o-nitrofenol-\beta-D-galactopiranosida
del equipo para llevar a cabo una reacción a 37ºC durante dos
horas. Después de añadir 2 ml de una solución del equipo para
interrumpir la reacción enzimática, se determinó la absorbencia a
420 nm de la solución de reacción, y el valor fue evaluado como
actividad de unión del Der f II y la IgE humana. Los resultados son
los mostrados en la figura 2. Puede reconocerse que la actividad de
unión IgE de cada uno de los mutantes Der f II de D7E, y D7N
disminuye de forma notable en comparación con el Der f II de tipo
natural. Concretamente, si el aminoácido Asp 7 que fue considerado
importante en la formación de un determinante antigénico IgE humano
de Der f II a partir del experimento de substitución de la Ala, es
reemplazado con Asn que no presenta una carga negativa a diferencia
de la Asp, se ha encontrado que la actividad de unión IgE humana
disminuye de forma notable como en el caso del Der f II substituido
con Ala. Aún si es reemplazado con Glu que es un aminoácido que
presenta una carga negativa como el caso de la Asp, la unión de
ligamiento IgE también resultó disminuida.
Se administraron diez \mug de Der f II
recombinante (posteriormente abreviado como rDer f II) y 100 \mul
de adyuvante de Freund de forma intraperitoneal tres veces a 24
ratones macho A/J de siete semanas de edad cada dos semanas.
Veinticuatro ratones inmunizados fueron
clasificados en un grupo de control de seis ratones, un grupo de
administración de rDer f II de seis ratones, y un grupo de
administración de D7N de seis ratones. Además, como un grupo de
control de reacción negativa, tres ratones, que no fueron
inmunizados, fueron designados como grupo no inmune.
Dos semanas antes de la inmunización final, se
administraron dos veces por semana durante tres semanas de forma
intranasal 20 \mul de una solución salina fisiológica de
amortiguador de ácido fosfólico (abreviada a continuación como PBS)
al grupo de control, un mg/ml de rDer f II al grupo de
administración de rDer f II, y un mg/ml de D7N al grupo de
administración de D7N, de forma respectiva. El grupo no inmune no
fue tratado.
Una semana después de la administración
intranasal final, los ratones fueron introducidos en un cámara para
animales pequeños para inhalar cinco mg/ml de Der f II nebulizada
durante 30 minutos. Después de 24 horas, los ratones fueron
sacrificados por sangrado, seguido por un lavado alveolar bronquial
con 1 ml de PBS. Se realizaron preparaciones de Cytospin a partir
de 200 \mul de fluido de lavado alveolar bronquial (abreviado a
continuación como BALF), y marcado con Dif-quick
(Marca registrada). Las muestras fueron observadas bajo un
microscopio de 400 aumentos, y se realizó un contaje leucocitario
(macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y linfocitos) dentro del
rango de dicho microscopio para determinar el grado de inflamación
de las vías respiratorias.
En el caso del grupo no inmune, los leucocitos en
BALF se observan escasamente, excepto los macrófagos. En cambio, en
el caso del grupo de control de ratones inmunizados, se observaron
numerosos neutrófilos y linfocitos. En comparación con los grupos
no inmunes, el contaje leucocitario del grupo de control fue de 2,5
veces de forma aproximada. Es decir, en el caso del grupo de
control, se confirmó que la inflamación de las vías respiratorias
fue provocada por la inhalación del antígeno. Por el contrario, en
el caso de los grupos administrados con rDer f II o el
substituyente de residuos de aminoácido, D7N, disminuyó la cantidad
de neutrófilos y todos los leucocitos en comparación con el grupo
de control, de modo que se reconoció la realización de la
hiposensibilización al r Der f II mediante administración
intranasal. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
El Der f II modificado realizado mediante
ingeniería genética de acuerdo con la presente invención puede
disminuir la actividad de unión del anticuerpo IgE en la mutación
mínima (un aminoácido entre 129 aminoácidos) y puede ser utilizado
para el tratamiento de cada tipo de enfermedad alérgica producida
por ácaros con alta seguridad.
SEQ ID Nº:
1-a
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 390
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de secuencia: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
Encadenamiento: doble
\vskip1.000000\baselineskip
Topología: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
Característica
\vskip1.000000\baselineskip
Fuente original: Dermatophagoides
farinae
\vskip1.000000\baselineskip
Método para determinación de característica:
E
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID Nº:
1-b
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 390
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de secuencia: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
Encadenamiento: doble
\vskip1.000000\baselineskip
Topología: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
Característica
\vskip1.000000\baselineskip
Fuente original: Dermatophagoides
farinae
\vskip1.000000\baselineskip
Método para determinación de característica:
E
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID Nº:
1-c
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 390
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de secuencia: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
Encadenamiento: doble
\vskip1.000000\baselineskip
Topología: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
Característica
\vskip1.000000\baselineskip
Fuente original: Dermatophagoides
farinae
\vskip1.000000\baselineskip
Método para determinación de característica:
E
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID Nº:
1(D7E)
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 390
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de secuencia: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
Encadenamiento: doble
\vskip1.000000\baselineskip
Topología: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
Característica
\vskip1.000000\baselineskip
Fuente original: Dermatophagoides
farinae
\vskip1.000000\baselineskip
Método para determinación de característica:
E
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID Nº:
2(D7N)
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 390
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de secuencia: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
Encadenamiento: doble
\vskip1.000000\baselineskip
Topología: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
Característica
\vskip1.000000\baselineskip
Fuente original: Dermatophagoides
farinae
\vskip1.000000\baselineskip
Método para determinación de característica:
E
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID Nº:
3(D7K)
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 390
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de secuencia: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
Encadenamiento: doble
\vskip1.000000\baselineskip
Topología: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
Característica
\vskip1.000000\baselineskip
Fuente original: Dermatophagoides
farinae
\vskip1.000000\baselineskip
Método para determinación de característica:
E
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia
Claims (8)
1. Método para la producción de un alérgeno
principal de ácaros modificado, caracterizado porque
comprende el cultivo de células procariotes o eucariotes, que han
sido transformadas con un vector de duplicación que contiene un
gen, y la recogida del alérgeno principal modificado de los ácaros
a partir de dicho cultivo; en el que dicho gen codifica un alérgeno
Der f II principal modificado de los ácaros, que ha sido
substituido en el 7º aminoácido del lado terminal N de dicho
alérgeno de Der f II principal de los ácaros codificado por las
secuencias de ADN denominada SEQ ID Nº: 1a, 1b ó 1c por otro
aminoácido distinto a la alanina.
2. Polipéptido, que comprende o consiste en un
alérgeno de Der f II modificado de los ácaros, que ha sido
substituido en el 7º aminoácido desde el lado terminal N de dicho
alérgeno de Der f II principal de los ácaros, codificado por las
secuencias de ADN denominada SEQ ID Nº: 1a, 1b ó 1c por otro
aminoácido distinto a la alanina.
3. Polipéptido, que comprende una secuencia de
aminoácidos entre las secuencias SEQ ID Nº: 1 (D7E), SEQ ID Nº: 2
(D7N) y SEQ ID Nº: 3 (D7K).
4. Cadena de ADN que codifica cualquiera de los
polipéptidos según la reivindicación 3.
5. Medicina para el tratamiento de enfermedades
de alergia a los ácaros que comprende el alérgeno modificado de los
ácaros de la reivindicación 2.
6. Medicina para el tratamiento de enfermedades
de alergia a los ácaros que comprende el polipéptido según la
reivindicación 3.
7. Medicina para la prevención de enfermedades de
alergia a los ácaros que comprende el alérgeno modificado de los
ácaros según la reivindicación 2.
8. Medicina para la prevención de enfermedades de
alergia a los ácaros que comprende el polipéptido según la
reivindicación 3.
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