JP2009533035A - 原核細胞において発現させたＰｒｏＤｅｒｐ１ - Google Patents

Abstract

本発明は、デルマトファゴイデス・プテロニッシナス由来の主要タンパク質アレルゲンＤｅｒ ｐ１の前駆体型であるＰｒｏＤｅｒ ｐ１の低アレルギー性組換え誘導体を作製するための新規な方法、およびそのような方法によって作製された誘導体に関する。本発明はさらに、特定のアレルゲンに対するアレルギー応答の予防および／または軽減に有効な免疫原性組成物およびワクチンを製剤化する際の前記低アレルギー性ＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体の使用にも関する。本発明はまた、新規なＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質および核酸配列にも関する。

Description

本発明は、デルマトファゴイデス・プテロニッシナス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）由来の主要タンパク質アレルゲンＤｅｒ ｐ１の前駆体型であるＰｒｏＤｅｒ ｐ１の低アレルギー性組換え誘導体を作製するための新規な方法、およびそのような方法によって作製された誘導体に関する。本発明はさらに、特定のアレルゲンに対するアレルギー応答の予防および／または軽減に有効な免疫原性組成物およびワクチンを製剤化する際の前記低アレルギー性ＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体の使用にも関する。本発明はまた、新規なＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質および核酸配列にも関する。

ヒトにおけるアレルギー応答は一般的であり、様々なアレルゲンによって引き起こされ得る。アレルギー性の個体はアレルゲンに敏感であり、血清中に高レベルのアレルゲン特異的ＩｇＥが存在することを特徴とし、かつ、Ｔｈ２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３）を産生するアレルゲン特異的Ｔ細胞集団を有する。アレルゲンの存在下でＩｇＥが肥満細胞および好塩基球の表面に存在するＦｃεＲＩ受容体に結合すると、細胞が急速に脱顆粒され、続いて、ヒスタミンならびに炎症反応の他の前もって形成された媒介物質および新しく形成された媒介物質が放出される。これに加えて、Ｔ細胞想起応答の刺激によりＩＬ−４およびＩＬ−１３が産生され、これらは共に協力して、Ｂ細胞応答をさらにアレルゲン特異的ＩｇＥ産生へとスイッチする。早期および晩期のアレルギー応答発生に関する詳細については、Ｊｏｏｓｔ Ｖａｎ Ｎｅｅｖｅｎら、１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１７巻、５２６頁を参照されたい。非アレルギー性個体において、同じ抗原に対する免疫応答は、ＩＦＮ−γなどのＴｈ１型サイトカインをさらに含む場合がある。これらのサイトカインは、高レベルのアレルゲン特異的ＩｇＥを含めて、高レベルのＴｈ２型免疫応答を阻害することによってアレルギー応答の発生を妨げることができる。この点に関して重要なことは、ＩｇＥ合成が、Ｂ細胞上のＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）受容体へのＩｇＥ／アレルゲン複合体の結合によって媒介される阻害性のフィードバック機序によって制御され得るということである（Ｌｕｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１年、１４６巻（７号）、２１２２〜９頁；Ｙｕら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻（６４８３号）、７５３〜６頁）。細胞に結合されたＣＤ２３を欠く系では、ＩｇＥ合成のこの阻害は起こらない。

気管支喘息、アトピー性皮膚炎、および通年性鼻炎などアレルゲンに対抗するＩｇＥによって媒介されるＩ型アレルギー性疾患は、世界人口の２０％超に発症する。このようなアレルギー応答の治療における現在の戦略としては、抗ヒスタミン処置によってヒスタミン放出の症状作用を妨げるための手段、および／または抗炎症性コルチコステロイドの局所投与が挙げられる。開発中である他の戦略としては、肥満細胞の脱顆粒を防ぐために宿主の免疫系を使用するものが挙げられる（Ｓｔａｎｗｏｒｔｈら、ＥＰ ０４７７２３１ Ｂ１）。他の形態の免疫療法が説明されている（Ｈｏｙｎｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９３年、１７８巻、１７８３〜１７８８頁；Ｈｏｌｔら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９４年、３４４巻、４５６〜４５８頁）。

即時の症状ならびに晩期の症状は薬理学的処置によって寛解され得るが、アレルゲン特異的な免疫療法が、Ｉ型アレルギーに対する唯一の治癒的アプローチである。しかし、この方法に関連したいくつかの問題が、依然として解決されないでいる。第１に、免疫療法は、バッチごとに異種性であり得る全アレルゲン抽出物を用いて現在使用されている。さらに、これらのアレルゲン混合物は個々の患者のプロファイル用に設計されておらず、不必要な毒性タンパク質を含む場合がある。第２に、高用量で天然のアレルゲンを投与すると、重度のアナフィラキシー反応を引き起こす場合があり、したがって、免疫療法を成功させる、アレルゲンの最適に効率的な高用量に到達することができないことが多い。第１の問題は、アレルゲン抽出物と比べてより良く特徴付けられ、かつ再現性のより良い組換えアレルゲンを用いた代替ワクチン接種を通じて取り組まれている。第２の問題、すなわち、アレルゲン抽出物を繰り返し注射することによって誘導されるアナフィラキシー反応のリスクは、欠失または変異誘発によってＩｇＥ反応性が改変された、組換え「低アレルゲン」の使用によって最小限に抑えることができる（Ａｋｄｉｓ，ＣＡおよびＢｌａｓｅｒ，Ｋ、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００年、１２１巻、２６１〜２６９頁）。

アレルギーを治療および予防するための製剤が説明されており、これらは、ＩｇＥの産生を下方調節し、かつ、Ｔｈ２型の応答からＴｈ１型の応答に変化させる（ＩＬ−４を産生するＤｅｒ ｐ１特異的Ｔ細胞とＩＦＮ−γを産生するＤｅｒ ｐ１特異的Ｔ細胞の比率の減少によって、あるいは、ＩＬ−５とＩＦＮ−γの比率の減少によって測定される）ことによって、アレルゲンに対する細胞性応答を改変するための手段を提供する。これは、例えば、ＷＯ ９９／２５８２３に記載されているように、酵素活性を低下させたｒｅｃＤｅｒ ｐ１などの組換えアレルゲンの使用によって実現することができる。しかし、これらの組換えアレルゲンの免疫原性は、ＩｇＥ合成誘導の点で、野生型ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の免疫原性と同様であると考えられている。

ＩｇＥ結合活性を低下させた非アナフィラキシー型のアレルゲンが報告されている。アレルゲン操作により、アミノ酸残基の部位特異的変異誘発または特定のアミノ酸配列の欠失によって、アレルゲンタンパク質のＩｇＥ結合能力を低下させることが可能になった。同時に、Ｔ細胞エピトープは維持されているため、Ｔ細胞活性化能力は引き続き保存されている。このことは、結果は様々であるものの、様々なアレルゲンに対するいくつかのアプローチによって示されている。チモシー牧草花粉アレルゲン Ｐｈｌ ｐ ５ｂ（Ｓｃｈｒａｍｍ Ｇら、１９９９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、２４０６〜１４頁）、主要な室内チリダニアレルゲンＤｅｒｆ２（Ｔａｋａｉら、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６７巻、６６５０〜６６５６頁）、ＤｅｒＰ２（ＳｍｉｔｈおよびＣｈａｐｍａｎ １９９６年、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３巻、３９９〜４０５頁）、およびＤｅｒｆ１（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋら、２００１年、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４巻、４５４〜６０頁）に関する例が公開されている。１つの研究では、ジスルフィド架橋に関与するシステイン残基のレベルでの点変異の導入による、Ｄｅｒｆ１低アレルゲンの作製を報告している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年、１２４巻（４号）、４５４〜６０頁、Ｔａｋａｉ Ｔ、Ｙａｓｕｈａｒａ Ｔ、Ｙｏｋｏｔａ Ｔ、Ｏｋｕｍｕｒａ Ｙ）．しかし、野生型ＰｒｏＤｅｒｆ１をピー・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）により分泌されることに成功した場合、一方で、分子内ジスルフィド結合に関するシステイン変異体は分泌されなかった。

Ｄｅｒ ｐ１アレルゲン
室内チリダニのデルマトファゴイデス・プテロニッシナスに由来するアレルゲンは、アレルギー性過敏反応に関連する主要な原因因子の１つである。デルマトファゴイデス・プテロニッシナスのグループ１アレルゲンであるＤｅｒ ｐ１は、主要アレルゲンであり、８０〜１００％のチリダニアレルギー性血清中のＩｇＥに結合する（Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍ．Ｄ．ら、（１９８３年）、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７２巻、２７〜３３頁；Ｋｒｉｌｌｉｓ，Ｓ．ら、（１９８４年）、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４巻、１３２〜４１頁）。Ｄｅｒ ｐ１は、ダニの中腸で産生され、そこでの役割は、食物の消化に関係している可能性が高い。最大０．２ｎｇのタンパク分解性に活性なＤｅｒ ｐ１が各糞塊中に組み込まれる。糞塊はそれぞれ直径約１０〜４０μｍであり、したがって、ヒトの気道中に容易に吸い込まれる。このタンパク質は、しばしば、ハウスダスト中に高濃度（ダスト１ｇ当たり１００ｎｇ〜１００００ｎｇ）で存在するが（Ｐｌａｔｔｓ−ＭｉｌｌｓおよびＣｈａｐｍａｎ（１９８７年）、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８０巻、７５５〜７５頁；Ｗａｈｎ，Ｕ．ら、（１９９７年）、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９９巻、７６３〜６９頁）、Ｄｅｒ ｐ１は、単に糞便物質だけでなく、ある範囲の粒子に結合していると考えられている（ＤｅＬｕｃａら（１９９９年）、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０３巻、１７４〜７５頁）。１００ｎｇのレベルが過敏化に関連付けられており、また、用量増加に伴ってリスクが増大する。

Ｄｅｒ ｐ１をコードするｃＤＮＡはクローン化され、かつ配列決定されている（Ｃｈｕａ，Ｋ．ら、（１９８８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７巻、１７５〜８２頁；Ｔｈｏｍａｓら、（１９８８年）、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８５巻、１２７〜２９頁；Ｃｈｕａ，Ｋ．ら、（１９９３年）、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０１巻、３６４〜８頁）。Ｄｅｒ ｐ１は、成熟タンパク質中にアミノ酸残基２２２個を含むことが公知であり、また、算出された分子量は２５ＫＤａである。Ｄｅｒ ｐ１ をコードするｃＤＮＡ配列から、多くの哺乳動物プロテイナーゼおよび植物プロテイナーゼと同様に、Ｄｅｒ ｐ１が、１８アミノ酸のシグナルペプチドおよび８０アミノ酸のＮ末端プロ配列を含む３２０アミノ酸残基からなる前駆体型で合成されることが明らかになっている。ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の成熟プロセスは公知ではないが、プロ領域のタンパク分解除去によって、または自己触媒的プロセッシングを介して酵素が活性化されると考えられている。精製したＤｅｒ ｐ１調製物を室温で一晩貯蔵すると、自己タンパク分解による分解が原因で、酵素活性をほぼ完全に喪失する（Ｍａｃｈａｄｏら、１９９６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６巻、２９７２〜２９８０頁）。

Ｄｅｒ ｐ１配列は、システインプロテイナーゼ原型であるパパインの配列との３０％の相同性を示し（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、（１９９７年）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ、２７巻（１号）：１０〜２１頁）、かつ、酵素的に活性な領域、最も顕著には、Ｃｙｓ３４−Ｈｉｓ１７０イオン対においてより際立った相同性を有する（Ｔｏｐｈａｍら、前掲）。活性部位のシステイン残基およびヒスチジン残基を含めて、パパインのタンパク質分解活性に関係があるとされている残基の大半が、Ｄｅｒ ｐ１において保存されている。Ｄｅｒ ｐ１のシステインプロテアーゼ活性が一般に認められているが、研究により、たとえ１つしか活性部位を有していなくても、独自の混合したシステイン／セリンプロテアーゼ活性を示すことが明らかにされた（Ｈｅｗｉｔｔ，Ｃ．Ｒ．Ａ．ら、（１９９７年）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ、２７巻、２０１〜２０７頁）。好ましい切断部位は、システインプロテアーゼ活性に対してはグルタミン酸であり、セリンプロテアーゼ活性に対してはアルギニンである。

Ｄｅｒ ｐ１は、ＩｇＥ合成の調節に関与しているＣＤ２３（ＦｃεＲ ＩＩ）、すなわち低親和性ＩｇＥ受容体を切断し（Ｈｅｗｉｔｔ．Ｃ．ら、（１９９５年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２巻、１５３７〜１５４４頁；Ｓｃｈｕｌｚ，Ｏ．ら、（１９９７年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻、５８４〜５８８頁）、それによって、ＩｇＥ産生を刺激することが示された。その一方で、これは、ＣＤ２５、すなわちＩＬ−２受容体のαサブユニットを切断する（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｏ．ら、（１９９８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８７巻、２７１〜２７５頁）。ＩＬ−２は、Ｔｈ１免疫応答の伝達に関与するサイトカインであるため、その受容体の消化は、Ｔｈ２応答への偏りをもたらす。Ｄｅｒ ｐ１のタンパク質分解活性はまた、ヒトＴ細胞からのＴｈ２サイトカイン放出を亢進させ（Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ，Ａ．Ｍ．ら、（２００１年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、１２１１〜１２１６頁）、かつ、バイスタンダーアレルゲンに対するアジュバント活性を与える（Ｇｈｏｕｇｈ Ｌ．ら、（２００１年）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３１巻、１５９４〜１５９８頁）ことも示されている。

グループＩアレルゲンの組換え発現
グループＩアレルゲンには、Ｄｅｒ ｐ１および室内チリダニのデルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）に由来する主要アレルゲンであるＤｅｒ ｆ １の両方が含まれる。Ｄｅｒ ｆ １は、Ｄｅｒ ｐ１に著しく類似した配列を有し、同様にシステインプロテアーゼファミリーに属する。組換えＤｅｒ ｆ １は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において成功裡に作製された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．ら、（２０００年）、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２２巻、１０８〜１１４頁）。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において作製された生成物は天然のＤｅｒ ｆ １と同じアミノ酸配列を有し、さらに、天然のＤｅｒ ｆ １と同一の酵素特性および抗原特性を示した。

一方、ピンポイント発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質としてイー・コリにおいて成熟Ｄｅｒ ｐ１を発現させると、触媒的に不活性なタンパク質が得られた（Ｓｃｏｂｉｅ Ｇ．ら、（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２巻、４４８頁）。この生成物は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のパネルに対していくらかの免疫反応性を示したが、触媒活性の証拠はまったく示さなかった。活性な酵素を得るために、パパインでの使用に成功していた可溶化、変性、および復元のプロトコル（Ｔａｙｌｏｒ Ｍ．Ａ．Ｊ．ら、（１９９２年）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．５巻、４５５〜４５９頁）を採用したが、これはＤｅｒ ｐ１では成功しなかった。したがって、著者らは、このタンパク質をイー・コリにおいて適切にフォールディングさせるためにプロ配列を組み入れること、および酵素的に活性なＤｅｒ ｐ１を得ることが重要であると結論付けている。

ＷＯ２００４／０７６４８１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｓ．ａ．）では、変異型であるか否かを問わず、Ｄｅｒ ｐ１／ＰｒｏＤｅｒ ｐ１／ＰｒｅＰｒｏＤｅｒ ｐ１がマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質として発現された場合に、タンパク質発現の実質的な改善がイー・コリにおいて達成されたことを開示している。野生型ＭＢＰ−ＰｒｏＤｅｒ ｐ１融合タンパク質は、システイン残基変異を有するＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体と比較して、顕著なＩｇＥ結合活性を示した。

一実施形態では、本発明は、天然のアレルゲンのアレルゲン活性と比べてアレルゲン活性が有意に低いデルマトファゴイデス・プテロニッシナスＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体を作製するための方法であって、原核宿主細胞におけるＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする配列の発現を含む方法に関する。

他の実施形態では、本発明は、原核細胞においてＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現することができる発現ベクターで形質転換された原核宿主細胞を、前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程と、前記タンパク質を回収する工程とを含む方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、原核細胞においてＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現することができる発現ベクターで形質転換された原核宿主細胞を、前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程と、前記タンパク質を回収する工程と、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の精製とを含む方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、原核細胞においてＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現することができる発現ベクターで形質転換された原核宿主細胞を、前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程と、前記タンパク質を回収する工程と、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の精製と、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質を変性させ、かつ復元する工程、および／またはＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の熱処理とを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、原核宿主細胞がイー・コリである、本明細書において説明する方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、発現ベクターが毒素／解毒薬プラスミドである方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列が野生型配列（配列番号３）に対応する方法に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列が以下の変異（Ｄｅｒ ｐ１ナンバリング：
所望によりアルギニンまたはリシンに変わる、システイン３１残基の変異、
所望によりアラニンに変わる、システイン３４残基の変異、
所望によりアルギニンまたはリシンに変わる、システイン６５残基の変異、
所望によりアルギニンまたはリシンに変わる、システイン７１残基の変異、
所望によりアルギニンまたはリシンに変わる、システイン１０３残基の変異、
所望によりアルギニンまたはリシンに変わる、システイン１１７残基の変異、
ヒスチジン１７０残基の変異、および
プロペプチドと成熟分子の間の切断部位の変異、所望により残基ＮＡＥＴの欠失
のうち１つまたは複数を含む方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列が以下の３つの変異（Ｄｅｒ ｐ１ナンバリング）、すなわち、システイン７１残基の変異、システイン１０３残基の変異、およびシステイン１１７残基の変異を含む、前述の方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列が、アミノ酸残基１４７〜１６０（Ｄｅｒ ｐ１ナンバリング）または残基２２７〜２４０（ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ナンバリング）の欠失をさらに含む、前述の方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列が、野生型配列のＣ末端および／またはＮ末端に１個〜１０個の付加的なアミノ酸を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質が配列番号１の配列を有する、前述の方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１が融合タンパク質として発現されない、前述の方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする配列が、真核生物発現のために最適化されたコドン使用パターンを有する、前述の方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、本明細書において説明する方法のいずれか１つに記載のプロセスによって得ることができる、天然のアレルゲンのアレルゲン活性と比べてアレルゲン活性が有意に低いデルマトファゴイデス・プテロニッシナスＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体に関する。

別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換えタンパク質および所望によりアジュバントを含む免疫原性組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、アジュバントがＴｈ１型免疫応答の優先的な刺激因子である免疫原性組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリエチレンのエーテルもしくはエステルのうち１種もしくは複数種、またはこれらのアジュバントのうち２種以上の組合せを含む免疫原性組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、アレルゲンが水中油型エマルジョンビヒクルまたは油中水型エマルジョンビヒクル中で提供される免疫原性組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、アレルギー応答に苦しむ患者を治療する、またはアレルギー応答に感受性のある患者を予防する方法であって、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換えタンパク質またはＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を前記個体に投与する工程を含む方法に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１の配列を有するＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体、配列番号１の配列をコードする単離核酸分子、および、配列番号２の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離核酸分子に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１核酸配列を含む発現ベクターに関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１核酸配列で、またはＰｒｏＤｅｒ ｐ１核酸配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。

前述の要約した説明および以下の詳細な説明の両方とも、例示的かつ説明的であり、また、特許請求の範囲の本発明のさらなる説明を提供すると意図されることを理解されたい。

添付図は、本発明のさらなる理解を実現するために含まれ、また、本明細書に組み入れられ、かつ本明細書の一部分を構成し、本発明のいくつかの実施形態を例示し、また、その説明と一緒になって、本発明の原理を説明するのに役立つ。

本発明者らは、以下に、原核細胞において発現させた組換えＰｒｏＤｅｒ ｐ１のＩｇＥ反応性が、哺乳動物細胞において発現されたＤｅｒ ｐ１およびＰｒｏＤｅｒ ｐ１と比べて大幅に低下していることを見い出した。特異的なモノクローナル抗体に基づいたＤｅｒ ｐ１ ＥＬＩＳＡにより、細菌によって産生されたアレルゲン変種に立体配置的エピトープが存在しないことが裏付けられた。しかし、単離されたＰｒｏＤｅｒ ｐ１は、Ｄｅｒ ｐ１に特異的なＴ細胞反応性を維持していた。さらに、融合タンパク質を使用せずに、イー・コリにおいてＰｒｏＤｅｒ ｐ１の高い発現レベルを得ることが可能であった。

したがって、本発明の一実施形態は、天然のアレルゲンのアレルゲン活性と比べてアレルゲン活性が有意に低いＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体を作製するための方法であって、原核細胞におけるＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列の発現を含む方法を提供する。「天然の」という用語は、本明細書において、室内チリダニによって産生される形態のアレルゲンを意味するために使用される。

本発明の方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８２年〜１９８９年において説明されているような従来の組換え技術によって実施することができる。具体的には、この方法は、
（ａ）原核細胞においてＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現することができる発現ベクターで形質転換された原核宿主細胞を、前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程と、
（ｂ）前記タンパク質を回収する工程と
を含んでもよい。

「形質転換する」という用語は、本明細書において、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓ．Ｍ．ＫｉｎｇｓｍａｎおよびＡ．Ｊ．Ｋｉｎｇｓｍａｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オックスフォード、英国、１９８８年に記載されているような従来の技術を用いて、適切なプラスミドベクターまたはウイルスベクターによる形質転換、トランスフェクション、または感染によって宿主細胞中に外来ＤＮＡを導入することを意味するために使用される。「形質転換された」または「形質転換体」という用語は、本明細書において、対象の外来遺伝子を含み、かつ発現する、結果として生じる宿主細胞に適用される。

発現ベクターは、組込み型発現ベクターでも複製可能な発現ベクターでもよい。発現ベクターは、原核宿主細胞と適合性のあるベクターを切断して、無傷のレプリコンを有する直線状ＤＮＡセグメントを提供し、かつ、前記直線状セグメントを、前記直線状セグメントと一緒になって、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質をコードするＤＮＡポリマーなど所望の生成物をコードする１つまたは複数のＤＮＡ分子とライゲーション条件下で組み合わせることによって調製することができる。したがって、ＤＮＡポリマーは、所望に応じて、前もって形成されても、ベクターの構築中に形成されてもよい。

任意の適切な原核（細菌）宿主細胞が、タンパク質発現のために使用され得る。一実施形態では、本方法において使用される原核宿主細胞はイー・コリである。

選択された原核宿主細胞において使用するのに適した任意のベクターが、本発明の方法において使用され得る。適切なベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、および組換えウイルスが挙げられる。一実施形態によれば、プラスミド毒素−解毒薬系、例えばｐＳｔａｂｙ１発現ベクター（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）が使用され得る。典型的には、プラスミド毒素−解毒薬系は、通常は構成的プロモーターの制御下で、プラスミドＤＮＡ中の解毒薬遺伝子を使用する。典型的には、毒性産物（または毒物）をコードする遺伝子が、プラスミドが導入される予定の細菌の染色体中に導入される。毒遺伝子の発現は一般に、プラスミドが細菌中に存在する場合に毒素が発現されることができないように、解毒薬タンパク質によって抑制されているプロモーターの制御下にある。しかし、プラスミドが細菌から失われた場合には、解毒薬が分解される可能性があり、また、毒素の産生が誘導されて、細胞死を引き起こす可能性がある。この系は、プラスミドが失われた様式を問わず、プラスミドを持たない細胞すべてを集団から排除し、それによって、プラスミド維持を確実にすることを狙いとしている。

複製可能な発現ベクターの調製は、例えば前述のＭａｎｉａｔｉｓらの著書で説明されている手順により、ＤＮＡの制限、重合、およびライゲーションのための適切な酵素を用いて慣例的に実施することができる。組換え宿主細胞は、形質転換条件下で、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする複製可能な発現ベクターで原核宿主細胞を形質転換させることによって調製することができる。適切な形質転換条件は慣例的であり、例えば、前述のＭａｎｉａｔｉｓらの著書または「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第２巻、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ、１９８５年に記載されている。

形質転換条件の選択は、宿主細胞に基づいて決定される。したがって、イー・コリなどの細菌宿主は、ＣａＣｌ_２溶液（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９７３年、６９巻、２１１０頁）またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ_２、酢酸カリウム、およびグリセロールの混合物を含む溶液で処理され、次いで、３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ、およびグリセロールで処理されてよい。

ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換された宿主細胞の培養は、例えば前述のＭａｎｉａｔｉｓらの著書および「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」で説明されているようにして、慣例的に実施する。すなわち、典型的には、細胞に栄養物を与え、４５℃より低い温度で培養する。

産生物は従来の方法によって回収されてよい。例えば、宿主細胞を物理的、化学的、または酵素的に溶解し、かつ、結果として生じる溶解物からタンパク質産生物を単離してよい。従来のタンパク質単離および精製技術としては、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、および、例えばモノクローナル抗体アフイニティーカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。

本発明の一実施形態によれば、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１は、封入体内の不溶性タンパク質として産生され得る。封入体は、典型的には、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の抽出のために、例えば遠心分離によって単離される。抽出プロセスは、タンパク質を可溶化する工程を含んでよい。封入体からのタンパク質の抽出は、尿素の存在下、例えば、４〜８Ｍの範囲の尿素、例えば約６Ｍの尿素の存在下で実施してよい。所望により、抽出媒体は、塩化ナトリウム、例えば２００〜４００ｍＭ ＮａＣｌ、例えば約３００ｍＭ ＮａＣｌをさらに含んでよい。典型的には、抽出はｐＨ７〜８、例えばｐＨ約７．５で実施される。抽出されたタンパク質は、所望により変性条件下で、Ｎｉ２＋カラムを用いて精製してよい。次いで、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質は、例えば尿素を除去するために透析をすることによって、復元することができる。

本発明の方法によって作製されたＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質は、さらに熱処理することができる。例えば、温度約１００℃で、数分間、例えば約５分間、タンパク質を熱処理してよい。タンパク質は、所望により、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴなどの還元剤の存在下で熱処理される。このタイプの処理は、典型的には、タンパク質の立体配置的なＩｇＥ結合エピトープの安定性に対して不利益な作用を有し、したがって、結果として生じるタンパク質のＩｇＥ反応性をさらに低下させる可能性がある。したがって、熱処理は、タンパク質を変性させるために使用することができる。

本発明に従って発現されたＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列は、野生型配列に対応してもよく、または、本明細書において説明する変異配列であってもよい。一実施形態によれば、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質は、融合タンパク質（例えば、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはβ−ガラクトシダーゼとの融合物）として発現されない。言い換えると、原核細胞によって発現されるタンパク質は、単にＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の配列からなる。しかし、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の配列は、本明細書において論じるように、野生型配列と比べて、いくつかの付加的なアミノ酸をＮ末端またはＣ末端のいずれかに含んでよく、これは融合タンパク質とはみなされない。

低アレルギー性変異体を組換えによって作製する前に、野生型配列に変異を導入してもよい。例えば、産生されるＰｒｏＤｅｒ ｐ１誘導体のアレルゲン活性をさらに低下させるために、配列を変異させてよい。このような変異は、野生型配列に対する置換、欠失、もしくは付加、または、タンパク質の三次元立体配置が失われるようなタンパク質の三次元構造の改変を含んでよい。これは、例えば、ジスルフィド架橋形成に関与するシステイン残基を欠失させることによって、または、タンパク質の三次構造が実質的に改変されるように残基を欠失させるか、もしくは付加することによって、実現することができる。

２つのシステイン残基の間の相互作用を改変する作用を有する変異を生じさせてよい。典型的には、成熟Ｄｅｒ ｐ１の４位、３１位、３４位、６５位、７１位、１０３位、および１１７位の１つの変異（それぞれ、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の８４位、１１１位、１１４位、１４５位、１５１位、１８３位、および１９７位に対応する）である。このような変異タンパク質は、２つまたはそれ以上の（３つ、４つ、５つ、または６つすべての）システイン変異、例えば、４位および３１位、４位および６５位、４位および７１位、４位および１０３位、３１位および６５位、もしくは４位および３１位および６５位の変異、または、７１位および１０３位、７１位および１１７位、１０３位および１１７位、３１位および１１７位、６５位および１１７位、もしくは７１位および１０３位および１１７位の変異を含み、それによって、様々なジスルフィド架橋に影響を及ぼし得る。誘導体は、上記の位置のいずれかに１つの単一変異を含んでよい。一実施形態では、変異は、Ｃｙｓ４（あるいは、またはさらに、Ｃｙｓ４のジスルフィド結合相手であると考えられているＣｙｓ１１７）を伴う。Ｃｙｓ変異は、欠失でも、他の１９種の天然アミノ酸のいずれかへの置換でもよい。例えば、システインからアルギニンまたはリシンへの置換などの置換により、正電荷を持つアミノ酸残基を導入して、結果として生じるタンパク質の三次元構造をさらに不安定化させてもよい。変異は、ヒスチジン１７０残基の変異でもよい。

本発明の一実施形態では、誘導体は、システイン残基７１、１０３、および１１７すべてが、所望によりアラニンに変異されている三重変異を含む。別の態様では、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列のアミノ酸２２７〜２４０が欠失している。これらのアミノ酸は、Ｄｅｒ ｐ１配列の１４７〜１６０に対応する。さらに別の態様では、Ｄｅｒ ｐ１タンパク質の配列のＣｙｓ４位のシステイン残基がアルギニン残基に置換されている。別の態様では、システイン残基は、（成熟Ｄｅｒ ｐ１における配列を参照することにより算出した）以下の位置のうちいずれかでアルギニン残基に置換されている。すなわち、Ｄｅｒ ｐ１タンパク質の配列のＣｙｓ３１、Ｃｙｓ６５、Ｃｙｓ７１、Ｃｙｓ１０３、またはＣｙｓ１１７である。

本発明の一実施形態では、コード性ｃＤＮＡを、野生型ＰｒｏＤｅｒ ｐ１アミノ酸配列と比べて、Ｃ末端、Ｎ末端、またはＣ末端とＮ末端の両方で付加的なアミノ酸残基をコードするように変異させる。したがって、組換えＰｒｏＤｅｒ ｐ１ アミノ酸配列は、野生型配列のＣ末端および／またはＮ末端に１〜１０個の付加的なアミノ酸残基、例えば、一方の末端または両方の末端に２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個までの付加的なアミノ酸残基を含んでよい。このような付加的なアミノ酸は、融合タンパク質の範囲に入らない。これらの余分なアミノ酸は、連続した６個のヒスチジン（ヒスチジンタグ）など一続きのヒスチジン残基を含んでもよく、またはそれらに加えて存在してもよい。このような一続きのヒスチジン残基は、組換えタンパク質の精製を助けるために含まれてよい。

本発明の別の実施形態によれば、組換えアミノ酸配列は、天然の配列のＮ末端に３個の付加的なアミノ酸残基を含む。例えば、組換えタンパク質の配列は、天然の配列、または１つもしくは複数の保存的置換を含むこの配列の変種のＮ末端に付加的なアミノ酸配列ＭＡＳを含んでよい。

本発明の別の実施形態によれば、組換えアミノ酸配列は、天然の配列のＣ末端に５個の付加的なアミノ酸残基を含む。例えば、組換えタンパク質の配列は、天然の配列、または１つもしくは複数の保存的置換を含むこの配列の変種のＣ末端に付加的なアミノ酸配列ＲＲＲＥＬを含んでよい。さらに別の態様では、組換えタンパク質は、本明細書において説明するもののように、Ｎ末端の３個の付加的なアミノ酸残基配列およびＣ末端の５個の付加的なアミノ酸残基配列の両方を含む。

したがって、本発明は、配列番号１で説明した配列からなるＰｒｏＤｅｒ ｐ１誘導体を提供する。この配列は、Ｎ末端およびＣ末端の両方に付加的な配列を含む。別の実施形態では、誘導体配列は、６ヒスチジンタグをさらに含んでよい。

ＰｒｏＤｅｒ ｐ１の変異型は、Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９８２年、２９９巻、７５６〜７５８頁もしくはＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ １９８２年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０巻、６４８７〜６５００頁によって説明されているものなど従来の方法により、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質をコードするｃＤＮＡを部位特異的に変異誘発することによって、またはＣｈａｎおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８４年、１２巻、２４０７〜２４１９頁、もしくはＧ．Ｗｉｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、１９８４年、１２巻、２２４〜２２５頁によって説明されているような欠失変異誘発によって調製することができる。

本発明の別の実施形態は、本明細書において開示する配列番号１をコードする単離核酸、例えば配列番号２の配列を有する単離核酸を提供する。ヌクレオチド配列は、典型的にはＤＮＡ配列であり、標準的なＤＮＡ合成技術によって、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５年、２４巻、５０９０〜５０９８頁によって説明されている酵素的ライゲーションにより、化学合成により、ｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素重合により、またはこれらの技術の組合せにより、合成することができる。核酸配列は、意図された発現宿主、すなわち原核宿主細胞において使用されるコドン使用パターンを再現するように最適化したコドン使用パターンを有してよい。

ＤＮＡの酵素重合は、一般に５０ｍｌ以下の容量において、１０℃〜３７℃の温度で、ヌクレオシド３リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを必要に応じて含む適切な緩衝液中、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）などのＤＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。ＤＮＡ断片の酵素的ライゲーションは、一般に５０ｍｌ以下の容量において、４℃〜周囲温度の温度で、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．０１Ｍジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＡＴＰ、および０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンなど適切な緩衝液中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを用いて実施することができる。ＤＮＡポリマーまたは断片の化学合成は、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｈ．Ｇ．ＧａｓｓｅｎおよびＡ．Ｌａｎｇ編）、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８２年）、または他の科学論文、例えば、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、Ｈ．Ｗ．Ｄ．Ｍａｔｔｈｅｓ、Ｍ．Ｓｉｎｇｈ、Ｂ．Ｓ．Ｓｐｒｏａｔ、およびＲ．Ｃ．Ｔｉｔｍａｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８２年、１０巻、６２４３頁、Ｂ．Ｓ．ＳｐｒｏａｔおよびＷ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８３年、２４巻、５７７１頁、Ｍ．Ｄ．ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ．Ｈ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８０年、２１巻、７１９頁、Ｍ．Ｄ．ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８１年、１０３巻、３１８５頁、Ｓ．Ｐ．Ａｄａｍｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８３年、１０５巻、６６１頁、Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ、Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ、Ｊ．ＭｃＭａｎｎｕｓ、およびＨ．Ｋｏｅｓｔｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年、１２巻、４５３９頁、ならびに Ｈ．Ｗ．Ｄ．Ｍａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８４年、３巻、８０１頁において説明されているものなどの固相技術を用いて、従来のホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホルアミダイト化学反応によって実施することができる。

あるいは、コード配列は、公知の技術（例えば、相補的なｃＤＮＡ鎖を作製するためのｍＲＮＡの逆転写）および市販のｃＤＮＡ キットを用いて、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ｍＲＮＡから誘導することができる。

ＤＮＡコードは４種の文字（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）を有し、これらを用いて、生物の遺伝子においてコードされるタンパク質のアミノ酸を表す３文字「コドン」を書く。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直鎖状配列は、これらの遺伝子にコードされたタンパク質中のアミノ酸の直鎖状配列に翻訳される。コードは著しく縮重しており、６１種のコドンが２０種の天然アミノ酸をコードし、また、３種のコドンは「停止」シグナルを表している。したがって、大半のアミノ酸は、複数のコドンによってコードされており、実際、いくつかのアミノ酸は４種以上の異なるコドンにコードされている。

所与のアミノ酸をコードするのに複数のコドンが利用可能である場合、生物のコドン使用パターンは高度に非ランダムであることが観察されている。異なる種は、コドン選択において異なるバイアスを示し、さらに、コドン利用は、高レベルで発現される遺伝子と低レベルで発現される遺伝子とでは、単一の種でも著しく異なっている場合がある。このバイアスは、ウイルス、植物、細菌、昆虫細胞、および哺乳動物細胞において様々であり、いくつかの種は、他の種よりも強い、ランダムコドン選択から離れたバイアスを示す。例えば、ヒトおよび他の哺乳動物は、ある種の細菌またはウイルスよりもバイアスの強さが低い。これらの理由から、イー・コリにおいて発現される哺乳動物遺伝子または哺乳動物細胞において発現されるウイルス遺伝子が、効率的な発現には不適切なコドン分布を有している確率がかなり高い。しかし、イー・コリ発現に適したコドン使用パターンを有する遺伝子も、ヒトにおいて効率的に発現される場合がある。発現が起こる予定の宿主中でめったに観察されないコドンクラスターが異種ＤＮＡ配列中に存在する場合、その宿主において異種発現レベルが低いことが予測されると考えられている。

宿主中で稀なコドンから宿主に好まれるものへのコドン変更（「コドン最適化」）により、異種発現レベルを増大させたいくつかの例がある。例えば、ＢＰＶ（ウシ乳頭腫ウイルス）後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は、哺乳動物コドン使用パターン用にコドン最適化されており、これは、哺乳動物（Ｃｏｓ−１）細胞培養において野生型ＨＰＶ配列よりも増大した発現レベルを与えることが示されている（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ １９９９年、７３巻、４９７２〜４９８２頁）。この研究において、哺乳動物よりもＢＰＶにおいて２倍を超える頻度で存在する（使用比率＞２）全ＢＰＶコドンおよび使用比率が１．５より大きい大半のコドンは、優先的に使用される哺乳動物コドンによって保存的に置換された。ＷＯ９７／３１１１５、ＷＯ９７／４８３７０、およびＷＯ９８／３４６４０（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｉｎｃ．）では、ＨＩＶ遺伝子またはそのセグメントのコドン最適化が、タンパク質発現の増大をもたらし、かつ、最適化によって適応させた対象の宿主哺乳動物においてＤＮＡワクチンとしてコドン最適化配列を使用した場合に免疫原性を改善することが示された。したがって、本発明の一実施形態では、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする核酸配列は、真核生物での発現、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現など哺乳動物での発現用に最適化されたコドン使用パターンを有する。

別の実施形態によれば、本発明は、本明細書の方法によって得ることができる、天然のアレルゲンのアレルゲン活性と比べてアレルゲン活性が有意に低いＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体に関する。本発明の方法によって作製したＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体のアレルゲン活性、および結果としてのアレルゲン活性の低下は、例えば、実施例のセクションで詳述する方法により、ヒスタミン放出活性またはＩｇＥ結合反応性に基づいて、天然のタンパク質と比較することができる。

「実質的に低下したアレルゲン活性」とは、残存するＩｇＥ結合活性によって測定されるアレルゲン活性が、天然のタンパク質の活性の最大５０％まで、例えば、最大２０％まで、最大１０％まで、最大５％まで、または５％未満まで低下することを意味する。あるいは、「実質的に低下したアレルゲン活性」は、変異体のヒスタミン放出活性を測定することによって評価することもできる。活性の実質的な低下は、天然のタンパク質と比べて少なくとも１００倍、例えば１０００倍、例えば１００００倍の低下が認められる場合である。

組換え誘導体の免疫原性は、様々な免疫学的アッセイにより、天然のアレルゲンの免疫原性と比較することができる。誘導体アレルゲンおよび天然のアレルゲンの交差反応性は、誘導体アレルゲンまたは天然のアレルゲンのいずれかでワクチン接種した後にｉｎ ｖｉｔｒｏのＴ細胞アッセイを行うことによって分析することができる。例えば、ワクチン接種された動物から単離した脾臓Ｔ細胞を、組換え誘導体アレルゲンまたは天然のアレルゲンのいずれかでｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激し、続いて、市販のＥＬＩＳＡアッセイを用いてサイトカイン産生を測定してよく、または、トリチウム標識チミジンを組み込むことによって、アレルゲン特異的Ｔ細胞の増殖を経時的に分析してもよい。免疫原性は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定してもよい。ＥＬＩＳＡアッセイの詳細は、当業者が容易に決定することができる。

少なくとも２つのタイプのＥＬＩＳＡアッセイが想定される。第１に、野生型Ｄｅｒ ｐ１で免疫化したマウスの血清によるＰｒｏＤｅｒ ｐ１ 誘導体の認識を評価するもの、第２に、ＨＤＭアレルギー性患者の血清による野生型Ｄｅｒ ｐ１アレルゲンの認識によるもの。典型的には、４℃で一晩、精製した野生型Ｄｅｒ ｐ１または変異Ｄｅｒ ｐ１約５００ｎｇで各ウェルをコーティングする。ブロッキング溶液（例えば、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．１％）と共にインキュベートした後、血清の連続希釈物を約３７℃で約１時間、インキュベートしてよい。典型的には少なくとも５回、これらのウェルを洗浄し、かつ、アルカリホスファターゼと結合させた抗ＩｇＧ抗体と共にインキュベートすることによって、ＩｇＧ総量を明らかにすることができる。

本発明の方法によって得ることができる組換え型のＰｒｏＤｅｒ ｐ１は、予防用ワクチンまたは治療用ワクチンとして使用することができる。前記アレルゲン誘導体は、未改変の野生型アレルゲンと比べて以下の利点を有する場合がある：１）野生型アレルゲンによって刺激される免疫応答と比べて、Ｔｈ１型の局面の免疫応答を増大させて（例えば、より高レベルのＩｇＧ２ａ）、それによって、ワクチン接種された宿主のアレルギー性潜在能力を抑制する、２）引き続きＴ細胞反応性を保持しつつ、低いアレルゲン性を有し、したがって、高用量の免疫原の全身投与により適している、３）天然のＤｅｒ ｐ１の結合に際してＩｇＥと競合する、Ｄｅｒ ｐ１特異的ＩｇＧを誘導すると考えられる、４）エアロゾル化したアレルゲン抽出物に曝露した後でさえ、気道好酸球増加症にならないよう効率的に保護する。このような誘導体は、医薬品中で使用するのに、より具体的には、アレルギー反応の治療または予防に適している、治療的および予防的ワクチン製剤中で使用するのに適している。

本発明の方法に従って作製された低アレルギー性ＰｒｏＤｅｒ ｐ１誘導体を含む医薬組成物、免疫原性組成物、およびワクチン組成物もまた、提供される。

本発明の医薬組成物は、アジュバント化合物、またはタンパク質によって誘導される免疫応答を増大させるのに役立ち得る他の物質を含んでよい。

本発明のワクチン組成物は、免疫保護的な量の本発明の方法によって作製された組換え型ＰｒｏＤｅｒ ｐ１を含んでよい。「免疫保護的な」という用語は、アレルギー疾患が回避または緩和されるように、後続の抗原投与に対する免疫応答を誘発するのに必要な量を意味する。本発明のワクチンでは、タンパク質の水溶液を直接使用することができる。あるいは、事前に凍結乾燥したタンパク質または事前に凍結乾燥していないタンパク質を、様々な公知のアジュバントのいずれかと混合するか、吸着させるか、または共有結合させてよい。

適切なアジュバントが市販されており、例えば、フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ミシガン州）、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、ローウェー、ニュージャージー州）、ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）やリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、カルシウム、鉄、または亜鉛の塩、アシル化チロシンの不溶性懸濁液、アシル化糖、陽イオン性または陰イオン性に誘導体化した多糖、ポリホスファゼン、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリルリピドＡおよびクイル（ｑｕｉｌ）Ａである。ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７、もしくはインターロイキン?１２などのサイトカインおよびケモカインもまた、アジュバントとして使用され得る。

本発明の製剤において、アジュバント組成物が、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導することが望ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を促進する傾向がある。応答が主にＴｈ１型である一実施形態によれば、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより大規模に上昇する。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインのファミリーの総説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７巻、１４５〜１７３頁、１９８９年を参照されたい。

したがって、主にＴｈ１型の応答を誘発するために使用され得る適切なアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡの組合せ物、例えば、アルミニウム塩と一緒にされた３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。３Ｄ−ＭＰＬ、またはＷＯ９８５０３９９、ＷＯ０１３４６１７、およびＷＯ０３０６５８０６において開示されているアミノアルキルグルコサミニドホスファートなど他のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドもまた、単独で使用して主にＴｈ１型の応答を生じさせることができる。Ｔｈ１型免疫応答を優先的に誘導し得る他の公知のアジュバントとしては、ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばＷＯ ９６／０２５５５に記載されている。他の適切なアジュバントは、ＥＰ１３２２６５６およびＵＳ ２００４／００９７７１９に記載されているようなＣｐＲを含むオリゴヌクレオチドなど他のＴＬＲ９リガンドである。免疫賦活性ＤＮＡ配列は、例えばＳａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３巻、３５２頁、１９９６年によっても説明されている。ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドもまた、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて使用することができる。例えば、増強された系は、ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ ００／０９１５９およびＷＯ ００／６２８００において開示されているＣｐＧおよびＱＳ２１の組合せを含む。製剤は、水中油型エマルジョンおよび／またはトコフェロールをさらに含んでよい。

使用され得る別のアジュバントはサポニン、例えばＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、フレーミングハム、マサチューセッツ州）であり、これは、単独または他のアジュバントと組み合わせて使用され得る。例えば、１つのアジュバント系は、ＷＯ ９４／００１５３で説明されているようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せなど、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、またはＷＯ ９６／３３７３９で説明されているような、ＱＳ２１がコレステロールで抑制されている反応性のより低い組成物を使用する。他の適切な製剤は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでよい。特に強力なアジュバント製剤は、ＷＯ ９５／１７２１０で説明されているように、水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ、およびトコフェロールを含んでよい。別の実施形態では、アジュバントは、リポソーム組成物中に配合されてよい。

他の適切なアジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア、米国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ、ハミルトン、マサチューセッツ州）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、ハミルトン、マサチューセッツ州）、および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスファート（ＡＧＰ）が挙げられる。

したがって、本明細書において開示するＰｒｏＤｅｒ ｐ１低アレルギー性誘導体およびアジュバントを含む免疫原性組成物であって、アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリエチレンのエーテルもしくはエステルのうち１種もしくは複数種、またはこれらのアジュバントのうち２種以上の組合せを含む、免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物内のＰｒｏＤｅｒ ｐ１低アレルギー性誘導体は、水中油型エマルジョンビヒクルまたは油中水型エマルジョンビヒクル中で提供され得る。

ワクチン製剤は、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ Ｍ．Ｊ編）（１９９５年）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に一般に説明されている。リポソーム内への封入は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４２３５８７７号によって説明されている。高分子へのタンパク質の結合は、例えば、Ｌｉｋｈｉｔｅの米国特許第４３７２９４５号およびＡｒｍｏｒらの米国特許第４４７４７５７号によって開示されている。

典型的には、各ワクチン用量中に存在する本発明のタンパク質の量は、典型的なワクチンにおける顕著な有害副作用を伴わずに、免疫保護的応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特異的免疫原が使用されるか、およびワクチンにアジュバントが加えられるか否かに応じて変動すると考えられる。一般に、各用量はタンパク質１〜１０００μｇ、好ましくは１〜２００μｇを含むと予想される。個々のワクチンに対して最適な量は、対象における抗体力価および他の応答を観察する標準的研究によって確定することができる。本発明のワクチンは、成人または幼児に投与することができる。しかし、実質的なＴｈ２型記憶応答が確立される前の誕生直後に個体にワクチン接種することが好ましい。初回ワクチン接種後、対象は約４週間後に追加免疫を受けてよく、続いて、アレルギー応答のリスクが存在する間は、約６カ月毎に繰り返し追加免疫を受けてよい。

ワクチンおよび医薬組成物は、密閉されたアンプルやバイアルなど単位投与または多回投与用の容器に入れて提供され得る。典型的には、このような容器は、使用するまで製剤の無菌性を維持するために、気密密閉される。一般に、製剤は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤として保存され得る。あるいは、ワクチンまたは医薬組成物は、使用する直前に無菌液状担体の添加のみを必要とする凍結乾燥させた状態で保存してもよい。

本発明はまた、本発明の方法に従ってＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体を作製する工程と、そのタンパク質を精製する工程と、結果として生じるタンパク質を適切なアジュバント、希釈剤、または他の製薬上許容される賦形剤と混合する工程とを含む、ワクチンを製造するための方法も提供する。

本発明はまた、本発明の方法によって作製したタンパク質を製薬上許容される賦形剤と混合する工程を含む、ワクチン製剤を製造するための方法も提供する。

本発明の別の実施形態は、アレルギーに感受性のある、またはアレルギーに苦しんでいる患者を免疫治療的に治療するためのワクチンを製造するための、本発明の方法によって作製したタンパク質の使用である。本明細書において開示する免疫原性組成物の薬学的に有効な量を前記患者に投与する工程を含む、アレルギーに感受性のある、またはアレルギーに苦しんでいる患者を治療する方法もまた、本発明によって企図される。

本発明の別の実施形態は、ヒトのアレルギー疾患（特に、室内チリダニアレルギー）を予防または緩和する方法であって、本発明の方法によって作製したアレルゲン、または本発明によるワクチンの免疫原的に有効な量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

以下の実施例は、本発明をさらに例示する。本実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明のさらなる理解を実現する。
実施例

本発明は、本発明を明瞭にすることを意図する以下の実施例によってさらに例示される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして意図されず、解釈もされない。本発明の多数の修正および変形は、本明細書の教示に鑑みて可能であり、したがって、本発明の範囲内である。以下の実施例は、標準的な技術を用いて実施され、そのような標準的技術は、詳細に記述した場合を除き、当業者に周知であり、常用的である。

イー・コリ発現ベクターにおけるＰｒｏＤｅｒ ｐ１のクローニング
ｐＮＩＶ４８４６プラスミドに由来する、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードするカセットを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：５’ＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＣＣ３’（配列番号４）（フォワードプライマー、太字の下線部はＮｈｅ Ｉ制限部位）および５’ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＣＧＴＡＣＧＧＧ３’（配列番号５）（リバースプライマー、太字の下線部はＮｏｔ Ｉ制限部位）。増幅した断片をＮｈｅＩ−ＮｏｔＩで消化して９２０ｂｐ断片を作製し、かつ、ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩで制限されたｐＳｔａｂｙ１発現ベクター（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）中に導入した。結果として生じるプラスミドは、（Ｈｉｓ）６配列タグの上流にＰｒｏＤｅｒ ｐ１ カセットを含む。

ＣＹＳ２１イー・コリ細胞（Ｄｅｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）中にエレクトロポレーションすることによって、このＤＮＡ構築物を形質転換した。ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ ｃＤＮＡの存在および同一性をＤＮＡ配列決定によって確認した。最後に、ＣＹＳ２１クローンから精製した組換えプラスミドを、マニュアルの指示に従ってＳＥ１イー・コリ細胞（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）中に形質転換した。

イー・コリからのＰｒｏＤｅｒ ｐ１の発現および精製
ｐＳｔａｂｙ１−ＰｒｏＤｅｒ ｐ１プラスミドを含む組換えＳＥ１細菌を一晩前培養することによって、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢを入れた５００ｍＬフラスコ２個に播種し、かつ、光学濃度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）が０．５に達するまで、振盪しながら３７℃で培養物を増殖させた。細胞培養物を１ｍＭイソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、Ｄｕｃｈｅｆａ）に調整することによってタンパク質産生を誘導し、また、さらに２時間、３７℃で細胞を振盪した。これらの細胞を遠心分離（９５００ｇで１５分間）によって回収し、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）１ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）およびＡＥＢＳＦ １ｍＭ（ＩＣＮ）を補った冷Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）４０ｍｌ中に再懸濁し、かつ、１８００バールで細胞破砕機（Ｃｅｌｌ Ｄ）に２回通過させることによって溶解した。

細胞溶解物を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して封入体を単離した。沈殿物をトリス緩衝液（５０ｍＭ ｐＨ７．５）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％で洗浄し、続いて、３回の洗浄工程を経て界面活性剤を除去した。続いて、４℃で一晩、５０ｍＭトリス緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ７．５）４０ｍｌでＰｒｏＤｅｒ ｐ１を抽出した。超遠心分離（１４９０００ｇ、４５分）後、抽出緩衝液で平衡化したＮｉ２＋キレート高速カラム（２．６×６ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ Ａｍｅｒｓｈａｍ）に３ｍｌ／分で抽出物の上清を添加した。このカラムを出発緩衝液で洗浄した。タンパク質溶出は段階的に進行して、緩衝液中のイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌ）濃度が上昇した（０ｍＭから４００ｍＭ）。精製されたＰｒｏＤｅｒ ｐ１（２００ｍＭイミダゾールで溶出）を含む画分を集めた。２工程の透析によって尿素を除去することによって（６Ｍ尿素から２Ｍ尿素、２Ｍ尿素からＰＢＳ）、ＰｒｏＤｅｒ ｐ１を復元した。限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の再生セルロース限外ろ過膜、ＮＭＷＬ １０ｋＤａ）によって組換えアレルゲンを濃縮し、−２０℃で保存した。

Ｄｅｒ ｐ１ ＥＬＩＳＡ
Ｄｅｒ ｐ１に特異的なモノクローナル抗体５Ｈ８および４Ｃ１（Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シャーロッツビル、バージニア州、米国）を用いるＥＬＩＳＡキットによって、組換えＰｒｏＤｅｒ ｐ１を検出した。このアッセイで使用した標準Ｄｅｒ ｐ１（ＵＶＡ ９３／０３）は、濃度２．５μｇ／ｍＬであった。

ＩｇＥ結合活性
４℃で一晩、天然Ｄｅｒ ｐ１または組換えＰｒｏＤｅｒ ｐ１（５００ｎｇ／ウェル）でイムノプレートをコーティングした。次いで、ウェル当たり１００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを５回洗浄し、かつ、３７℃で１時間、１％ＢＳＡを添加した同じ緩衝液１５０μＬに浸した。次いで、ディー・プテロニッシナスに対してアレルギー性の患者から得た、８分の１に希釈した血清を３７℃で１時間インキュベートした。血清の特異的な抗ディー・プテロニッシナスＩｇＥ値（ＲＡＳＴアッセイ）は、上限カットオフ値の１００ｋＵ／Ｌを上回っていた。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液でプレートを５回洗浄し、かつ、マウス抗ヒトＩｇＥ抗体（ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中で１／２０００に希釈、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、バーミンガム、アラバマ州、米国）およびアルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中で１／７５００に希釈、Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベーションした後、アレルゲン−ＩｇＥ複合体を検出した。ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）中に溶解したｐ−ニトロフェニルホスファート基質（Ｓｉｇｍａ）を用いて、酵素活性を測定した。Ｂｉｏｒａｄ Ｎｏｖａｐａｔｈ ＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ_{４１０ｎｍ}を測定した。

Ｔ細胞の反応性
Ｄｅｒｐ １で免疫化したマウスの脾臓細胞を、ピー・パストリスまたはコリで産生させたＰｒｏＤｅｒ ｐ１の段階希釈物で、刺激した。７２時間後、１μＣｉ／ウェルの［^３Ｈ］−チミジンで細胞を１６時間パルス標識した。細胞を回収し、シンチレーション計数によって^３Ｈ−チミジン取込みを測定した。

結果
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）中で産生させたＰｒｏＤｅｒ ｐ１と比べて、この発現系によって産生させたＰｒｏＤｅｒ ｐ１は、Ｎ末端およびＣ末端にそれぞれ３個および１１個の余分なアミノ酸残基を有する（太字の下線部で示す）。

ｐＳｔａｂｙ１を用いてイー・コリで発現されるコドン最適化ＰｒｏＤｅｒＰ１の核酸配列を以下に示す（余分な配列を太字の下線部で示す）。

配列番号２

図１Ａ、ＢおよびＣに示されるように、組換えイー・コリＰｒｏＤｅｒＰ１のＩｇＥ反応性は、哺乳動物細胞にて産生されるＤｅｒｐ１およびＰｒｏＤｅｒＰ１と比べて大幅に減少した。図２はＤｅｒｐ１のエライザの結果を示しており、細菌中で産生されるアレルゲン変種にて立体配置的エピトープの存在しないことを確認する。しかしながら、図３に示されるように、封入体より単離されたＰｒｏＤｅｒ ｐ１はＤｅｒｐ１特異的Ｔ細胞反応性を維持した。

配列
配列番号１

配列番号２

配列番号３（ヌクレオチド配列）：
配列番号７（アミノ酸配列）：

この優先権を主張する特許出願はすべて出典明示によりその内容を本明細書の一部とする。本願発明は本願明細書に記載の特定の実施形態により特定される範囲に限定されるものではない。実際、本願明細書に記載の発明に加えて、種々の修飾が上述した記載から当業者に明らかになるであろう。かかる修飾は特許請求の範囲内にあることを意図とする。本願明細書に引用されている特許、特許出願および公開公報の開示をその出典を明示することで本願明細書の一部とする。

２４種の血清を用いて実施したイー・コリ組換えＰｒｏＤｅｒ ｐ１のＩｇＥ反応性を示すグラフである。 ＩｇＥ阻害アッセイを示すグラフである。プレートを天然Ｄｅｒ ｐ１でコーティングした（５００ｎｇ／ウェル）。ダニアレルギーを有する患者（ＲＡＳＴ値＞１００ｋＵ／Ｌ）に由来する２０種のヒト血清のプールを、阻害物質としてのＣＨＯまたはイー・コリにおいて産生させた様々な濃度（０〜２００μｇ／ｍｌ）のＤｅｒ ｐ１またはＰｒｏＤｅｒ ｐ１と共に、４８℃で一晩プレインキュベートした。次いで、血清をＥＬＩＳＡプレートに添加し、前述したようにしてＩｇＥ結合活性を測定した。 ラット好塩基球性白血病細胞メディエーター放出アッセイを示すグラフである。ヒトＦｃεＲＩを発現するラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ ＳＸ−３８（Ｋｉｎｅｔ教授、Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ボストン、米国）から受領）を、ディー・プテロニッシナスに対してアレルギー性の患者に由来する４種の血清の段階希釈物（ＲＡＳＴ値＞１００ｋＵ／Ｌ、２倍希釈で１／３〜１／９６）で１７時間感作した。イー・コリにおいて産生された天然Ｄｅｒ ｐ１またはＰｒｏＤｅｒ ｐ１の精製物１０ｎｇの脱顆粒培地（フェノールレッドを含まず、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むＲＰＭＩ １６４０）溶液を３７℃で３０分間添加することによって、ＲＢＬ細胞の誘発を誘導した。対照として、アレルゲンの不在下で細胞を同様にインキュベートして、自発的放出を測定した。０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を培地に添加することによって、総放出を得た。β−ヘキソサミニダーゼ放出活性を決定するために、上清５０μｌおよびｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中２ｍＭ）５０μｌを、別々の９６ウェルプレート中で、３７℃で３時間、混合した。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）１５０μｌを添加することによって反応を終結させ、かつ４０５ｎｍでの吸光度を測定した。総放出から自発的放出を引いた量に対するパーセンテージとして結果を表した。 Ｄｅｒ ｐ１ ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフであり、細菌において産生されたアレルゲン変種に立体配置的エピトープが存在しないことを裏付ける。 封入体から単離されたＰｒｏＤｅｒ ｐ１がどのようにＤｅｒ ｐ１に特異的なＴ細胞反応性を維持するかを示すグラフである。

Claims (42)

1. 天然のアレルゲンの活性と比べてアレルゲン活性が低いデルマトファゴイデス・プテロニッシナスＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体を作製するための方法であって、原核宿主細胞にてＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする配列を発現させることを含む方法。
2. （ａ）原核細胞においてＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現能を有する発現ベクターで形質転換された原核宿主細胞を、前記ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程と、
   （ｂ）前記ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質を回収する工程と
   を含む、請求項１記載の方法。
3. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の精製を含む、請求項２記載の方法。
4. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質を変性させ、かつ復元する工程を含む、請求項２記載の方法。
5. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１タンパク質の熱処理を含む、請求項２記載の方法。
6. 原核宿主細胞がイー・コリである、請求項１記載の方法。
7. 発現ベクターが毒素／解毒薬プラスミドである、請求項２記載の方法。
8. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする配列が野生型配列（配列番号３）に対応する、請求項１記載の方法。
9. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする配列が、以下の変異（Ｄｅｒ ｐ１ナンバリング）：
   （ａ）システイン３１残基の変異；
   （ｂ）システイン３４残基の変異；
   （ｃ）システイン６５残基の変異；
   （ｄ）システイン７１残基の変異；
   （ｅ）システイン１０３残基の変異；
   （ｆ）システイン１１７残基の変異；
   （ｇ）ヒスチジン１７０残基の変異；および
   （ｈ）プロペプチドと成熟分子の間の切断部位の変異
   のうち少なくとも１つを含む、請求項１記載の方法。
10. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列が以下の３つの変異、すなわちシステイン７１残基の変異、システイン１０３残基の変異、およびシステイン１１７残基の変異を含む、請求項９記載の方法。
11. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列が、アミノ酸残基１４７〜１６０（Ｄｅｒ ｐ１ナンバリング）または残基２２７〜２４０（ＰｒｏＤｅｒ ｐ１ナンバリング）の欠失をさらに含む、請求項９または１０記載の方法。
12. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする配列が、野生型ＰｒｏＤｅｒ ｐ１配列のＣ末端およびＮ末端の一方または両方に１個〜１０個の付加的なアミノ酸を含む、請求項１記載の方法。
13. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１が配列番号１のタンパク質の配列を有する、請求項１２記載の方法。
14. ＰｒｏＤｅｒ ｐ１をコードする配列が、真核生物発現のために最適化されたコドン使用パターンを有する、請求項１記載の方法。
15. 請求項２に記載の方法によって得ることができる、天然のアレルゲンのアレルゲン活性と比べてアレルゲン活性が低いデルマトファゴイデス・プテロニッシナスＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体。
16. 請求項１５に記載の組換えタンパク質を含む免疫原性組成物。
17. 請求項１５に記載の組換えタンパク質およびアジュバントを含む免疫原性組成物。
18. アジュバントがＴｈ１型免疫応答の優先的な刺激因子である、請求項１７記載の免疫原性組成物。
19. アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリエチレンエーテル、およびポリエチレンエステルの群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１７記載の免疫原性組成物。
20. 組換えタンパク質が水中油型エマルジョンビヒクルまたは油中水型エマルジョンビヒクル中で提供される、請求項１６記載の免疫原性組成物。
21. アレルギー応答に苦しむ患者を治療する方法であって、請求項１５に記載の組換えタンパク質を前記個体に投与する工程を含む方法。
22. アレルギー応答に苦しむ患者を治療する方法であって、請求項１６に記載の免疫原性組成物を前記個体に投与する工程を含む方法。
23. アレルギー応答に感受性のある患者を予防する方法であって、請求項１５に記載の組換えタンパク質を前記個体に投与する工程を含む方法。
24. アレルギー応答に感受性のある患者を予防する方法であって、請求項１６に記載の免疫原性組成物を前記個体に投与する工程を含む方法。
25. 配列番号１の配列を含むＰｒｏＤｅｒ ｐ１組換え誘導体。
26. 配列番号１の配列をコードする単離核酸分子。
27. 配列番号２の配列を含む単離核酸分子。
28. 請求項２６に記載の核酸を含む発現ベクター。
29. 請求項２６に記載の核酸配列で形質転換された宿主細胞。
30. 請求項２８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
31. システイン３１残基の変異がシステインからアルギニンへの変異である、請求項９記載の方法。
32. システイン３１残基の変異がシステインからリシンへの変異である、請求項９記載の方法。
33. システイン３４残基の変異がシステインからアラニンへの変異である、請求項９記載の方法。
34. システイン６５残基の変異がシステインからアルギニンへの変異である、請求項９記載の方法。
35. システイン６５残基の変異がシステインからリシンへの変異である、請求項９記載の方法。
36. システイン７１残基の変異がシステインからアルギニンへの変異である、請求項９記載の方法。
37. システイン７１残基の変異がシステインからリシンへの変異である、請求項９記載の方法。
38. システイン１０３残基の変異がシステインからアルギニンへの変異である、請求項９記載の方法。
39. システイン１０３残基の変異がシステインからリシンへの変異である、請求項９記載の方法。
40. システイン１１７残基の変異がシステインからアルギニンへの変異である、請求項９記載の方法。
41. システイン１１７残基の変異がシステインからリシンへの変異である、請求項９記載の方法。
42. プロペプチドと成熟分子の間の切断部位の変異が、残基ＮＡＥＴの欠失である、請求項９記載方法。

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