KR101295324B1 - 세포간 부착분자-1 과의 결합을 통하여 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절하고 이식편 생존율을 증가시킬 수 있는, 인간 세포간 부착분자-1(ICAM-1)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 질환을 치료하기 위하여 이들을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

세포간 부착분자-1 과의 결합을 통하여 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절하는 항체 및 이의 용도{Antibody modulating the differentiation and function of dendritic cells via binding intercellular adhesion molecule-1 and use thereof}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 미국특허청에 2008년 8월 8일자로 출원된 미국특허출원 제61/087,265호에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 상기 미국출원은 본 명세서 내에서 완전히 설명되는 것과 같이 모든 목적을 위해 참고문헌으로서 본원에 포함된다.

기술분야

본 발명은 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절하고 이식편 생존율을 증가시킬 수 있는, 인간 세포간 부착분자-1(human intercellular adhesion molecules-1, ICAM-1)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 질환을 치료하기 위하여 이들을 사용하는 방법을 제공한다.

ICAM-1 은 도메인 1 내지 도메인 5 로 명명되며 N 말단에서 C 말단 방향으로 번호가 매겨진 다섯 개의 세포외 면연글로불린 수퍼패밀리 도메인, 세포막투과 영역 및 세포내 영역으로 구성된, 90 kDa의 타입 I 세포 표면 당단백질이다(Cell. 1990, 61:243-54).

ICAM-1 은 T 세포와 항원 제시 세포 간의 상호작용과 같은 백혈구/백혈구 상호작용을 매개한다. 또한 염증 과정 동안 조직으로의 백혈구 유출을 매개한다(Transplantation. 1999, 67:729-736). 인 비트로 연구는 ICAM-1/백혈구 기능 관련 항원-1(leukocyte function antigen-1, LFA-1)의 상호작용을 방해하는 항체가 T 세포의 내피 세포로의 부착을 방해할 수 있으며, 이들 항체들에 의해 T 세포 활성화 또한 혼합 림프구 내에서 유의적으로 감소할 수 있음을 보여주었다(Proc Natl Acad Sci USA. 1988, 85:3095-3099). 인간 ICAM-1에 대한 쥐의 단클론 항체인 R6-5-D6(enlimomab)을 사용한 원숭이 연구에서는, 신장 동종이식편 생존율이 증가하였고 이식편 내로의 T 세포 침투가 대조군과 비교하여 감소하였다(J Immunol. 1990, 144:4604-4612). 엔리모맙(enlimomab)은 또한 류마티스성 관절염 환자에서 질환 활성을 억제시키는 효과가 있음이 입증되었다(Arthritis Rheum. 1994, 37:992-999; J Rheumatol. 1996, 23:1338-1344). 그러나, 다기관 무작위 연구에 의하면 신장 이식 후의 엔리모맙 유도 치료는 급성 거부반응의 비율 또는 이식편 기능 지연의 위험을 감소시킬 수 없었다(Transplantation. 1999, 67:729-736). 또한, 급성 허혈성 뇌졸중 환자에서의 임상 실험은 엔리모맙에 의한 항-ICAM-1 치료가 효과적이지 않으며 뇌졸중 경과를 실제로 유의적으로 악화시키고 위약(placebo)과 비교했을 때 더 많은 부작용, 일차 감염 및 열을 유도한다는 것을 보여주었다(Neurology. 2001, 57:1428-1434). 엔리모맙은 T 세포 뿐만 아니라 호중구의 혈관 내피 세포로의 부착을 차단하는 기능을 하며, 따라서 호중구의 이동을 방해하는 것은 잠재적으로 감염에 대한 감수성을 증가시킨다고 보고되었다(J Immunol. 1999, 162:2352-2357).

수지상 세포(Dendritic cell, DC)는 다양한 면역 반응을 통합시키는 고도의 특성화된 항원 제시 세포이며(Nature. 1998, 382:245-252), 면역의 개시 및 면역 관용과 관련된 전문적인 항원 제시 세포의 이종 패밀리를 포함한다. 현재까지, 미성숙 수지상 세포는 T 세포를 무기력 상태(anergy)로 유도한다고 알려져 온 반면, LPS(lipopolysaccharide)와 같은 활성 자극제에 의해 성숙 수지상 세포로 형질전환된 수지상 세포는 일차 T 세포 반응을 유도한다고 생각되어 왔다(Blood. 2006, 108:1435-1440). 또한, 독특한 사이토카인 생산 프로파일을 가진 반성숙된 수지상 세포는 면역관용성 기능을 부여할 수 있다(Blood. 2006, 108:1435-1440).

ICAM-1 은 수지상 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 그러나, 현재까지는, 수지상 세포 내의 ICAM-1 이 T 세포-수지상 세포의 상호작용 동안 LFA-1 결합을 위하여 단순한 부착 분자로 기능하는 것으로 여겨져 왔다.

본 발명의 목적은 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절하고 이식편 생존율을 증가시킬 수 있는, 인간 세포간 부착분자-1(ICAM-1)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 질환을 치료하기 위하여 이들을 사용하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 이식된 세포 또는 기관의 거부반응을 억제하거나, 또는 이식된 조혈모세포에 의한 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 항-인간 ICAM-1 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 ICAM-1 의 도메인 1에 결합할 수 있지만 ICAM-1 과 이의 리간드인 LFA-1 간의 상호작용은 차단하지 않는 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 물질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 물질은 항체 또는 이의 단편을 생산하는 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 얻어지는, 하이브리도마 세포 및 상기 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체를 포함한다.

본 발명은 또한 이식된 세포 또는 기관의 거부반응을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 약제학적 조성물은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 면역억제제를 포함한다: ICAM-1 에 결합할 수 있지만 ICAM-1 및 LFA-1 의 상호작용은 방해하지 않는 항체; 및 항체의 단편으로서 ICAM-1 에 결합할 수 있지만 ICAM-1 및 LFA-1 의 상호작용은 방해하지 않는 단편.

나아가, 본 발명은 또한 항체 또는 항체 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 면역억제제를 사용하여 이식된 세포 또는 기관의 거부반응을 억제하거나, 또는 이식된 조혈모세포에 의한 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 단클론 및 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 인간 또는 동물(즉, 비-인간) 항체이다.

본 발명을 다음의 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

본 발명은 면역 반응을 억제할 수 있는 마우스 항-인간 ICAM-1 단클론 항체, MD-2 및 MD-2 의 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이식된 세포 또는 기관의 거부반응을 억제하거나, 또는 이식된 조혈모세포에 의한 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 항-인간 ICAM-1 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 인간 ICAM-1 의 도메인 1에 결합할 수 있지만 ICAM-1 과 이의 리간드인 LFA-1 간의 상호작용은 차단하지 않는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 포함한다.

본 발명은 또한 물질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 항체 또는 이의 단편을 생산하는 세포를 제공한다. 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법은 (a) 인간 ICAM-1 단백질 또는 단백질 단편 또는 인간 ICAM-1 을 발현하는 세포로 동물을 면역화하는 단계, (b) 면역화된 동물로부터 비장 세포(splenocyte)를 추출하는 단계, (c) 동물의 비장 세포를 골수종(myeloma) 세포주와 융합시키는 단계 및 (d) 하이브리도마 세포를 스크리닝하고, ICAM-1 과 LFA-1 간의 상호작용을 방해하지는 않지만 이식된 기관의 거부반응을 억제할 뿐만 아니라 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절할 수 있는 적합한 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함한다.

상기 물질은 인 비트로 배양에 의하거나 또는 상기 물질을 생산하는 세포를 동물에 투여함으로써 얻을 수 있다. 상기 물질은 상기 물질을 생산하는 세포가 복막 내로 투여된 동물의 복수로부터 얻을 수 있다. 상기 물질은 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의하여 배양 상청액 또는 복막으로부터 정제할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의해 얻어지는, 하이브리도마 세포 및 상기 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체를 포함한다.

본 발명은 이식된 세포 또는 기관의 거부반응을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 약제학적 조성물은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 면역억제제를 포함한다: ICAM-1 에 결합할 수 있지만 ICAM-1 및 LFA-1 의 상호작용은 방해하지 않는 항체; 및 항체의 단편으로서 ICAM-1 에 결합할 수 있지만 ICAM-1 및 LFA-1 의 상호작용은 방해하지 않는 단편. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편의 투여는 약학적 조성물을 투여하는 허용된 모든 방식을 사용하여 수행될 수 있다.

나아가, 본 발명은 또한 항체 또는 항체 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 물질을 사용하여 이식된 세포 또는 기관의 거부반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 단클론 및 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 인간 또는 동물 항체이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 ICAM-1에 대한 항체를 사용하여 ICAM-1 을 검출하는 방법을 제공한다. ICAM-1 이 다른 질환 진행 과정에서 염증 마커이기 때문에 이러한 검출은 유용하다. ICAM-1 에 대한 항체는 또한 ICAM-1 을 검출하기 위한 연구용 시약으로서 상업적으로 판매될 수 있다.

인간화 항체는 공여 항체로부터 유래한 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR) 및 인간 항체로부터 유래한 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역을 가지는 항체이다. CDR 은 일반적으로 Kabat 에 의해 정의되나 Chothia 에 의한 정의 또는 Kabat 및 Chothia 정의의 조합에 의해 대체 정의될 수 있다. 따라서, 일반적으로 인간화 항체는 (i) 마우스 항체, 예컨대 MD-2 유래의 세 개의 CDR 을 포함하는 경쇄, 인간 항체(이들은, 예컨대 성숙 인간 항체, 인간 생식세포 서열, 둘 또는 그 이상의 인간 항체 서열의 조합, 또는 인간 항체 서열의 공통 서열에서 유래할 수 있다) 유래의 가변 영역 프레임워크, 및 인간 불변 영역, 및 (ii) 마우스 항체, 예컨대 MD-2 유래의 세 개의 CDR 을 포함하는 중쇄, 인간 항체 유래의 가변 영역 프레임워크 및 인간 불변 영역을 포함한다. 가변 영역 프레임워크는 인간 잔기가 이에 상응하는 마우스 항체의 위치에 존재하는 잔기로 대체된 소수의(보통 1, 2, 3, 4, 5 또는 10 보다 적은) 선택된 위치에서의 복귀 돌연변이(backmutation)를 포함할 수 있다(Queen et al., 미국특허등록 제5,530,101호 및 제5,585,089 을 참조하라). 구체적으로, 프레임워크 내에서 대체될 아미노산은 일반적으로 CDR 과 상호작용할 수 있는 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 대체된 아미노산은 공여 항체 서열 내의 CDR 에 인접하거나, 3-차원 공간에서 측정했을 때 인간화 항체 내 CDR 에서 4-6 옹스트롬 이내에 위치할 수 있다.

하나 또는 그 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 또는 그 이상의 CDR 의 생략도 또한 가능한다. 많은 항체들에서 결합을 위해 하나 또는 두 개의 CDR 이 생략될 수 있다는 것이 과학적 문헌에 개시되어 있다(Padlan et al., FASEB Journal 9: 133-139 (1995); Vajdos et al (Journal of Molecular Biology, vol. 320, pp. 415-428 (2002); Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, (1999); Tamura et al, Journal of Immunology, 2000, 164:1432-1441 (2000)). CDR 내의 어떤 영역의 치환은 불필요한 CDR 을 생략하는 것과 동일한 원칙에 기초하며, 즉 오직 CDR 잔기들의 작은 단위(subset)인 SDR 만이 실제로 항원과 접촉한다.

항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는, 분자적 모델링 및/또는 경험에 의하여, Chothia CDR 밖에 존재하는 Kabat CDR 영역으로부터 이전 연구에 기초하여 확인할 수 있다(예를 들어 CDRH2 내의 H60-H65 잔기는 보통 필요하지 않다). 만약 CDR 또는 이들의 잔기(들)이 생략되는 경우, 이것은 일반적으로 가변 영역 프레임워크 서열을 제공하는 인간 수여 서열 내의 상응하는 위치에 존재하는 아미노산으로 치환된다. 이러한 치환의 개수는 경쟁적 반응의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체 내의 마우스 아미노산의 수를 감소시켜 결과적으로 잠재적인 면역원성을 감소시키므로 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화력의 변화를 일으킬 수 있으며 친화력의 유의적인 감소는 피하는 것이 바람직하다. CDR 내의 치환 위치 및 치환될 아미노산은 경험적으로 선택될 수 있다. 경험적 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 그러나, 일반적으로 경험적 치환은 면역원성을 마우스를 인간으로 치환하여 면역원성을 감소시키는 효과는 가지지 않는다. 경험적 치환은 생성물인 인간화 항체의 친화력을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

일반적으로 ICAM-1 에 충분한 결합 친화력을 가지며 실질적으로 면역원성이 없는 인간화 항체는 상기 원칙에 따라 제조된 소수의 변이체를 개별적으로 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 그러나, 많은 수의 변이체가 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 선별 방법을 사용하여 동시에 스크리닝될 수 있다(Dower et al., WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; 및 Winter, WO92/20791 을 참조하라).

키메라 항체는 마우스(또는 다른 설치류) 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 조합된 항체로서, 유전 공학적 수단에 의한 이들의 구조는 잘 알려져 있다. 이러한 항체는 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하지만, 인간 항체의 약 2/3 정도이다. 마우스, 키메라 및 인간화 항체 내 비인간 서열 존재의 비율은 키메라 항체의 면역원성이 마우스 및 인간화 항체 간의 중간 정도임을 나타낸다.

일반적으로 인간화 및 키메라 항체는 카파 경쇄를 가진 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형이다.

단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)는 동물(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터 또는 닭) 기원일 수 있고, 또는 유전학적으로 제작될 수 있다. 설치류의 단클론 항체는 당업계에 잘 알려진 표준 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 적절한 면역증강제와 함께 복강 내, 정맥 내, 또는 족척(footpad) 내로 ICAM-1 을 다중 면역화한 후 비장 또는 림프절 세포를 추출하고 적절한 불멸 세포주와 융합한 뒤, ICAM-1 과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하는 것을 포함한다. 예컨대, 하기의 실시예를 참조하라. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이에 의해 제조되거나(예컨대, Dower et al., WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; 및Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998 을 참조하라), 형질전환 마우스를 사용하여 제조될 수 있다(예컨대, e.g., Lonberg et al., WO93/12227; 및 Kucherlapati WO91/10741). 키메라 및 인간화 단클론 항체가 본 발명의 구체예로서 바람직하다.

항체는 매우 크며 내부 구조가 복잡한 복합 분자이다(~150,000 의 분자량 또는 약 1320 아미노산). 천연 항체 분자는 두 쌍의 동일한 폴리펩타이드 사슬을 포함하며, 각 쌍은 한 개의 경쇄와 한 개의 중쇄를 가진다. 각 경쇄 및 중쇄는 차례로 두 영역으로 구성된다: 타겟 항원과의 결합과 관련된 가변("V") 영역, 및 면역 시스템의 다른 구성요소와 상호작용하는 불변("C") 영역. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 항원(예컨대, 세포 표면 수용체)에 결합하는 가변 영역을 형성하기 위하여 3-차원적 공간 내에서 서로 접혀진다. 각 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내에는, 상보성 결정 영역("CDR")이라고 부르는 세 개의 짧은 단편이 있다(평균적으로 10 아미노산 길이). 항체 가변 영역 내 여섯 개의 CDR(경쇄에 세 개 및 중쇄에 세 개)은 타겟 항원 위에 고정되는 실제 항체 결합 부위를 형성하기 위하여 3-D 공간 내에 서로 접혀진다. CDR 의 위치와 길이는 명확하게 정의되어 있다(Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987). CDR 내에 포함되지 않은 가변 영역의 부분은 프레임워크라고 부르며, CDR 을 위한 주변 환경을 형성한다.

항체는 특정한 타겟 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다; 즉, 항체는 타겟 단백질을 포함하는 다른 단백질의 혼합물 내에서 타겟 단백질과 우선적으로 결합한다. 특이적 결합은 또한 일반적으로 약 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M 또는 10^-9 M 이하의 해리 상수(a dissociation constant, KD)로 나타낸다.

본 발명의 본연의 단클론 항체는 이들의 하이브리도마로부터 생산될 수 있다. 유전학적으로 제작된 단클론 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화 항체는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 발현될 수 있다. 예를 들어, 이들의 경쇄 및 중쇄 V 영역을 코딩하는 유전자는 오버랩핑 올리고뉴클레오타이드로부터 합성되거나, 프로모터, 인핸서, 폴리 A 영역 등의 필수 조절 영역을 제공하는 발현 벡터(예컨대, Invitrogen 으로부터 상업적으로 이용가능) 안으로 이용가능한 C 영역과 함께 삽입될 수 있다. CMV 프로모터-인핸서의 사용이 바람직하다. 다음으로, 발현 벡터는 리포펙션 또는 전기청공법과 같은 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 CHO 또는 Sp2/0 및 NS0 를 포함하는 비생산성 골수종 세포와 같은 다양한 포유동물 세포주에 형질감염(transfection)될 수 있고, 항체를 발현하는 세포는 적절한 항생제 선별에 의하여 선별될 수 있다.

본 발명의 단클론 항체 또는 다른 항체들이 발현되면, 정밀여과, 한외여과, 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 유기 염료에 기초한 다른 형태의 친화성 크로마토그래피 등과 같은 당업계의 표준 기술에 따라 정제할 수 있다. 약학적 목적을 위해서는 적어도 약 50, 90, 또는 95% 의 균질성을 가지는 실질적으로 순수한 항체가 바람직하며, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 균질성이 있는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 용어, "단리된" 및 "정제된" 은 실질적으로 또는 필수적으로 천연의 환경 및/또는 바람직하지 않은 오염물 내에서 농축된 물질 또는 이들로부터 제거된 물질을 말한다. 예를 들어, 단리된 항체는 다른 항원에 결합하는 다른 항체들로부터 분리되고, 및 자연적으로 관련된 다른 생물학적 물질(예컨대, 다른 핵산, 단백질, 지질, 세포 성분)로부터 분리된다. 본 발명의 항체는 또한 Fv, Fab 및 F(ab')₂ 와 같은 항체 결합 단편; 이중기능적 하이브리드 항체(예컨대, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), 단쇄 항체(Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); 및 변형된 불변영역을 가지는 항체(예컨대, 미국등록특허 제5,624,821호)를 포함한다.

바람직한 구체예로서, 본 발명은 본원에 개시된 항체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 즉, 상기 항체는 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 상기 항체의 약학적 제제(즉, 의약)는 동결건조 또는 수용성 용액의 형태로, 생리학적으로 허용되는 담체 내의 단클론 항체, 선택적으로는 첨가제 또는 안정화제를 포함한다. 허용가능한 담체, 첨가제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에게 독성이 없고, 일반적으로 pH 5.0 내지 8.0, 더욱 일반적으로는 pH 6.0 내지 7.0 에서 인산, 시트르산, 또는 아세트산과 같은 완충액; 등장성을 만들기 위한 염화나트륨, 염화칼슘 등과 같은 염; 항생제, 보존제, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 폴리소르베이트 80과 같은 친수성 폴리머, 아미노산, 탄수화물, 킬레이트제, 슈가, 및 당업계에 잘 알려진 기타 표준 구성요소들을 포함한다.

단클론 항체는 일반적으로 1-100 mg/ml 의 농도, 예컨대 10 mg/ml 에서 존재한다.

또 다른 바람직한 구체예로서, 본 발명은 약학적 제제 내의 항-ICAM-1-단클론 항체를 사용하여 환자, 일반적으로 사람의 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 단클론 항체는 임의의 적절한 경로, 구체적으로 정맥 주사 또는 볼루스 주사에 의한 비경구 투여, 근육 내 투여 또는 피하 투여로 환자에게 투여될 수 있다. 정맥 주사는 최소한 15분 이상, 그러나 30분 이상의 간격, 또는 1, 2, 또는 3 시간 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 단클론 항체는 질환(에컨대, 종양) 부위로 직접 투여되거나, 리포솜과 같은 운반체 안으로 캡슐화될 수 있다. 투여량은 치료될 상태를 완화시키기에 충분한 양으로 하며("치료학적 유효량") 몸무게당 0.1 내지 5 mg/kg, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4 mg/kg 이 좋으나, 10 mg/kg 또는 15 or 20 mg/kg 만큼 많은 양일 수 있다. 고정 단위 투여량은 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg 으로 투여될 수 있고, 또는 상기 투여량은 환자의 표면적, 예컨대 100 mg/m² 에 기초하여 투여될 수 있다.

단클론 항체는, 예를 들어 단클론 항체의 반감기에 따라, 매일, 매주마다, 매주 2회씩, 격주마다, 매월마다 또는 임의의 다른 간격으로 1주, 2주, 4주, 8주, 3-6개월 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 만성 투여와 같이 반복적인 치료도 가능하다. 질환의 발달과정에서 중간 병리학적 표현형 및 이의 합병증을 포함하는, 질환의 증상을 완화하거나 적어도 부분적으로 중단시키는 투여량 및 투여 간격의 투여 요법을(생화학적, 조직학적 및/또는 임상학적) 치료학적으로 유효한 투여요법이라 한다.

ICAM-1 은 잘 알려진 인간 단백질로서, 그 아미노산 서열은 Simmons et al., Nature 331, 624-627 (1988) 및 유전자은행 등록번호 06990.1 에 의해 제공된다. LFA 는 CD11a 및 CD18 의 헤테로다이머이다. 인간 CD11a 의 아미노산 서열은 Larson et al., J. Cell. Biol. 108, 703-712 (1989) 및 유전자은행 등록번호 Y00796.1 에 의해 제공된다. 인간 CD18 의 아미노산 서열은 Kishimoto et al., Cell 48, 681-690 (1987) 및 유전자은행 등록번호 M15395.1 에 의해 제공된다.

본 발명에 대한 더 완벽한 이해와 본 발명에 수반되는 많은 효과들은, 하기의 상세한 설명에 대한 참조에 의하여 도면과 함께 결부시켜 고려함으로써 더 잘 이해되는 것처럼, 쉽게 명확해질 것이다.
도 1은 단색 유세포분석기를 사용하여 인간 ICAM-1-형질감염된 HEK293T 세포의 표면에서 MD-2 및 R6-5-D6 단클론 항체의 반응성을 나타낸 도이다.
도 2는 h1m2345 및 h12m345 ICAM-1 변이체가 형질감염된 HEK293T 세포에서 MD-2 및 R6-5-D6 단클론 항체의 반응성을 나타낸 도이다.
도 3은 MD-2 및 R6-5-D6 항체의 존재 하에 혼합 림프구 반응 후에 티미딘 이입의 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 MD-2 또는 R6-5-D6 항체를 사전 배양한 후에 인간 ICAM-1-양성 DU145 세포 상에서 R6-5-D6 및 MD-2 항체의 반응성을 나타낸 도이다.
도 5는 도면에 표시된 항체를 처리한 후에 수지상 세포의 표면 상의 다양한 분자의 발현 수준과 수지상 세포의 배양 배지 내의 사이토카인의 농도를 나타낸 것이다.
도 6은 인간화 마우스의 말초 혈액에서 CD45⁺ 인간 백혈구 및 CD3⁺ 인간 T 세포의 생성에 대한 동력학을 나타낸 것이다.
도 7은 스트렙토조토신으로 당뇨를 유발한 뒤 랫트 췌도를 이식한 인간화 마우스에서 말초 혈액 글루코스 수준을 나타낸 것이다.
도 8은 도면에 표시된 항체들을 처리한 각 마우스로부터 추출한 췌도-이식된 신장에서 인슐린에 대한 헤마토실린 및 이오신(H&E) 염색 및 면역조직화학적 염색결과를 나타내는 도이다.

본 발명은 하기의 실시예를 참조로 더욱 상세하게 설명된다. 그러나, 이러한 실시예는 어떤 형태로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예 1. 항-인간 ICAM -1 단클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포의 분리

ICAM-1/Fc 단백질을 제조하기 위하여, PHA-활성화된 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 mRNA 를 추출하였고 리더 유전자 단편에 상응하는 cDNA 단편 및 인간 ICAM-1 의 세포외 도메인을 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭하였다. ICAM-1 의 세포외 도메인을 코딩하는 단편은 5' 및 3' 말단에 각각 NheI 및 EcoRI 자리를 도입하여 클로닝하였다. ICAM-1 및 인간 IgG Fc 의 융합 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 상기 단편을 hIgG1 의 힌지 CH2 및 CH3 도메인을 코딩하는, EcoRI 및 XhoI-제한효소 처리된 플라스미드 안에서 연결시켰다. HEK293T 세포에 상기 플라스미드를 일시적으로 형질감염시키고, 단백질 G 컬럼을 사용하여 ICAM-1/Fc 단백질을 배양 상청액으로부터 정제하였다.

Balb/c 마우스에 완전 프로인트(Freund's) 면역증강제로 유화된 ICAM-1/Fc 단백질 100 μg 을 복강 내 투여하였고, 이어서 ICAM-1/Fc 단백질 100 μg 을 불완전 프로인트 면역증강제와 함께 2주 간격으로 2회 면역화하였다. 2주 후, 면역화된 마우스에 ICAM-1/Fc 단백질 100 μg 을 추가 접종하였다. 비장 세포 부유액을 제조하기 위하여, 최종 투여 후 3일 후에 Balb/c 마우스의 비장을 적출하였다. 단클론 항체는 9-아자구아닌에 저항성이 있는 SP2/0-Ag14 마우스 골수종 세포와 인간 ICAM-1/Fc 로 면역화된 Balb/c 의 비장 세포를 융합함으로써 제조하였다. 세포 융합 방법은 Koeler 및 Milstein 방법에 따랐다(Koeler & Milstein Nature, 1975, 256, 495-497). 10⁸ 비장세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 사용하여 10⁷ 골수종 세포와 융합하였다. 세포를 세척하고 20% 우태아 혈청(FBS), 100 μM 하이포잔틴, 0.44 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘(HAT media)을 포함하는 DMEM 배지(Dulbeco's modified Eagle's medium)에 재부유하였다. 상기 세포를 네 개의 96-웰 플레이트에 도입하고 37 ℃, 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였다.

2 주 후 콜로니가 형성되었을 때, 인간 ICAM-1-형질감염된 HEK293T 세포를 사용하여 상청액을 스크리닝 하였다. ICAM-1-형질감염된 세포와 야생형 HEK293T 세포 모두 배양 상청액에서 염색하였고, ICAM-1-형질감염된 293T 세포에 반응하나 야생형 293T 세포에는 반응하지 않는 상청액을 생산하는 세포를 선별하였다. 고반응성 항체를 생산하는 안정적인 하이브리도마 클론을 제조하기 위하여, 양성 웰에서 취한 세포를 한계 희석법에 의해 웰 당 0.5 세포로 서브클로닝하였다.

상기 실험 결과 항-ICAM-1 단클론 항체를 생산하는 세 개의 분리된 하이브리도마 세포주를 분리 및 클로닝하였다. 이들 하이브리도마 세포주 중의 하나는 카파 경쇄를 가진 IgG1 항체를 생산하였고 이를 MD-2 로 명명하였다. MD-2 로 명명한 하이브리도마는 대한민국 서울 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학(우편번호 110-744)에 위치한 암연구소에 2008년 12월 24일자로 기탁하였고, 수탁번호 KCLRF-BP-00198 를 받았다. 상기 기탁은 기탁기관에서 가장 최근에 샘플 방출을 요구받은 후 적어도 5년 동안, 기탁한 날로부터 적어도 30년 동안, 또는 관련 특허의 유효 기간동안, 어느 기간이 가장 길더라도, 공인 미생물기탁기관에 보존될 것이고 돌연변이, 사멸 또는 파괴되는 경우 교체될 것이다. 상기 세포주의 공중의 이용가능성에 대한 모든 제한은 본 출원의 특허권 설정에 따라 최종적으로 제거될 것이다.

도 1에 나타난 바와 같이, ICAM-1-형질감염된 293T 세포는 잘 알려진 항-인간 ICAM-1 항체인 R6-5-D6 뿐만 아니라 MD-2 항체에 의해서도 양성 염색된 반면, 어떤 항체도 야생형 비-형질감염체에는 반응하지 않았다.

대표적인 항체가 분리되면(예컨대, MD-2) ICAM-1 상의 동일한 또는 오버랩핑된 에피토프에 결합하는 다른 항체는 경쟁적 결합 어세이에 의해 확인할 수 있다. 만약 각각이 항원에서 서로의 결합을 경쟁적으로 방해(차단)한다면 두 개의 항체가 동일한 또는 오버랩핑 에피토프에 결합하는 것이다. 즉, 하나의 항체의 1x, 5x, 10x, 20x 또는 100x 과다공급은 경쟁적 결합 어세이(예컨대, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990을 참조하라)로 측정했을 때 적어도 50% 정도로 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 로 다른 항체의 결합을 방해한다. 경쟁적 결합 어세이는 온전한 ICAM-1, 5개의 면역글로불린-유사 도메인을 포함하는 이들의 세포외 영역, 또는 다른 면역글로불린-유사 도메인으로부터 분리된 도메인 1 에 대하여 수행될 수 있다. 대체가능하게는, 동일한 에피토프를 가져서 원형의 단클론 항체 MD-2 와 유사한 성질을 가지는 단클론 항체를 선별하는 과정을 위하여, 본원에 참고문헌으로 포함되는 Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994 의 방법을 사용할 수 있다. 파지 디스플레이를 사용하는 경우, 우선 HGF-결합 단클론 항체를 선별하기 위하여 원형 항체의 중쇄를 (바람직하게는 인간의) 경쇄의 레퍼토리와 함께 짝을 지우고, 다음으로 원형 단클론 항체와 동일한 에피토프를 가진 (바람직하게는 인간의) ICAM-1-결합 단클론 항체를 선별하기 위하여 새로운 경쇄를 (바람직하게는 인간의) 중쇄의 레퍼토리와 함께 짝을 지운다.

MD-2 의 변이체 및 이의 인간화 및 키메라 형태는, 구체적으로 가변 영역 프레임워크 자리에서 아미노산의 치환에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있다. 아미노산 치환이 보존적 또는 비보존적인지 분류하가 위하여, 아미노산을 다음으로 그룹핑할 수 있다: 그룹 I(소수성 측쇄): Met, Ala, Val, Leu, Ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): Cys, Ser, Thr; 그룹 III(산성 측쇄): Asp, Glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): Asn, Gln, His, Lys, Arg; 그룹 V(사슬 배향에 영향을 주는 잔기): Gly, Pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄):Trp, Tyr, Phe. 보존적 치환은 동일 그룹 내의 아미노산 간의 치환과 관련된 것이다. 변이체는 ICAM-1, 구체적으로는 이들의 첫번째 도메인과 결합하는 것, 선택적으로는 MD-2 항체와 경쟁하는 것을 스크리닝할 수 있다. 변이체의 중쇄 및 경쇄는 구체적으로는 CDR 영역 내에서 바람직하게는 MD-2와 같은 참조 항체와 비교하여 적어도 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. 서열 동일성은 카운팅 갭이 없이 카바트 넘버링에 의해 참조 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역과 완전히 정렬된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 비교함으로써 결정할 수 있다.

실시예 2. 항체 결합 도메인의 맵핑

ICAM-1 은 5개의 면역글로불린-유사(Ig-유사) 도메인, 세포막투과 도메인 및 세포질 도메인으로 구성된 구조를 가진다(Cell. 1992, 68:71-81). 구체적인 ICAM-1 Ig-유사 도메인에 결합하는 MD-2 결합 자리의 위치를 알아내기 위하여, 인간 및 쥐 ICAM-1 cDNA 클론을 사용하여, 인간 도메인 1/쥐 세포막투과 및 세포질 도메인을 포함하는 쥐 도메인 2-5을 코딩하는 cDNA(h1m2345) 및 인간 도메인 1-2/쥐 도메인 3-5을 코딩하는 cDNA(h1m2345)의 두 종류의 키메라 cDNA를 제조하였다. 이들 키메라 돌연변이를 제작하기 위하여 오버랩핑 PCR 기술을 사용하였다. 우선 다음의 프라이머를 사용하여 인간 도메인 1(h1) 을 포함하는 cDNA 를 증폭하였다: 5' 프라이머 GAA TTC ATG GCT CCC AGC AGC CCC CGG CCC GCG CT(서열번호 1); 3' 프라이머 AGG TCT CAG CTC CAC CCG TTC TGG AGT CCA GTA CAC GGT GAG GAA G(서열번호 2). 쥐 도메인 2-5, 세포막투과 도메인 및 세포질 도메인(m2345)의 제조를 위한 프라이머는 다음과 같다: 5' 프라이머 CTG GAC TCC AGA ACG G GTG GAG CTG AGA CCT CTG CCA GCC TGG CAG(서열번호 3); 3' 프라이머 GGA TCC GGG AGG TGG GGC TTG TCC CTT GAG TTT TAT GGC(서열번호 4). 이들 두 종류의 cDNA 를 혼합하고 서열번호 1 및 서열번호 4 의 프라이머를 사용하여 재-증폭하였고 최종 산물(h1m2345)을 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하였다. h12m345를 코딩하는 변이체는 다음의 프라이머를 사용하여 h1m2345 에 대한 것과 유사한 방식으로 클로닝하였다: h12 에 대한 5' 프라이머, GAA TTC ATG GCT CCC AGC AGC CCC CGG CCC GCG CT(서열번호 5); h12 에 대한 3' 프라이머 GGT AGC TGG AAG ATC AAA GGT CTG GAG CTG GTA GGG GGC CGA GGT(서열번호 6); m345 에 대한 5' 프라이머, CAG CTC CAG ACC TTT GAT CTT CCA GCT ACC ATC CCA AAG CTC GAC ACC(서열번호 7); m345 에 대한 3' 프라이머 GGA TCC GGG AGG TGG GGC TTG TCC CTT GAG TTT TAT GGC(서열번호 8).

수정된 연결부가 수득되었는지 확인하기 위하여 전체 컨스트럭트를 시퀀싱하였고 다음으로 플라스미드 DNA 를 칼슘 포스페이트 침전법을 사용하여 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 칼슘 포스페이트 및 플라스미드 DNA와 공동침전시킨 HEK293T를 16-20 시간 동안 배양한 후에, 배지를 10 ml 의 새로운 용액으로 대체하고 또다시 24시간 동안 세포를 배양하였다. 다음으로, 형질감염체를 MD-2 또는 R6-5-D6 항체와 함께 아이스에서 염색하였다. 30분 배양 후에, 세포를 5% 우태혈청(fetal calf serum) 및 0.1% 아자이드와 함께 PBS(phosphate buffered saline)에서 세 번 세척하고 FITC-결합된 염소 항-마우스 Ig 항체(2차 항체)와 30분 동안 배양하였다. 세 번 더 세척한 후에, 각 항체와 반응하는 능력을 테스트하기 위하여 유세포 측정 분석을 수행하였다(도 2). 음성 대조군으로서, 2차 항체로만 염색된 세포를 사용하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 전체 인간 ICAM-1 형질감염체는 MD-2 및 R6-5-D6 항체에서 모두 양성적으로 염색된 반면, 어떤 항체도 전체 마우스 ICAM-1 형질감염체에 반응하지 않았으며, 이는 이들 항-인간 ICAM-1 항체가 마우스 ICAM-1 과 교차반응하지 않음을 나타낸다. 키메라 변이체의 경우, MD-2 항체가 키메라 h1m2345 및 h12m345 모두에서 반응한 반면 도메인 2에 결합하는(Cell. 1992, 68:71-81) R6-5-D6 항체는 h12m345 키메라에만 반응하였다. 따라서, 이러한 모든 결과는 MD-2 항체가 도메인 1 상의 에피토프에 특이적이고 R6-5-D6 항체는 도메인 2 를 에피토프로 결합함을 나타낸다.

실시예 3. 혼합 림프구 반응에서 항- ICAM -1 항체의 효과

비록 LFA-1-결합 부위가 ICAM-1의 도메인에 위치한다고 하더라도, 도메인 1의 확인에 있어서 도메인 2 가 필수적인 역할을 한다고 알려져 왔다(Cell. 1992, 68:71-81). 따라서, LFA-1 및 ICAM-1 간의 상호작용을 차단하는 어떤 항체들은 도메인 1에서 맵핑되지만, R6-5-D6 항체와 같이 도메인 2에서 맵핑된 다른 항체들 또한 이러한 상호작용을 방해할 수 있다(Cell. 1992, 68:71-81). 본 발명자들은 LFA-1 및 ICAM-1 상호작용이 MD-2 항체에 영향을 받을 수 있는지를 알아보았다.

관련없는 두 사람에서 유래한 림프구가 서로의 존재 하에 배양될 때, 림프구의 증식이 관찰되는데 이러한 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR)은 ICAM-1/LFA-1 상호작용에 의존적이라고 알려져 왔다(Proc Natl Acad Sci USA. 1988, 85:3095-3099). 따라서, 항-ICAM-1 항체인 MD-2 가 LFA-1 이 ICAM-1 에 부착하는 것을 방해할 수 있는지 알아보기 위하여 MLR 분석을 수행하였다. 신선 혈액 세포를 두 명의 관련없는 공여자로부터 획득하고 말초 혈액 단핵구 세포를 주로 피콜-하이파크(Ficoll-hypaque; Pharmacia, Uppsala, Sweden) 및 2,000 rpm 으로 20분 동안 원심분리하여 수집하였고 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM에 재부유하였다. 실시예 5에 기술한 MACS(magnetic activated cell sorting)를 사용하여 한 공여자로부터 CD4⁺ T 세포를 정제하였다. 다른 공여자로부터의 세포는 코발트 방사선원을 사용하여 2000 cGy 로 방사선 처리하였다. 다음으로 각 공여자로부터의 세포를 혼합한 후에, 혼합된 세포를 바닥이 평평한 96 웰 조직 배양 플레이트에 1 x 10⁶ 세포/웰로 접종하고 항-ICAM-1 항체(20 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 3일 후 배양물을 [³H]티미딘 (0.5 μCi/웰)으로 전기 펄스 처리하고, 16시간 후에 유리 섬유 여과지 위에 수집하고, 다음으로 액체섬광계수관(liquid scintillation β counter)으로 계수하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 항-ICAM-1 차단 항체 R6-5-D6는 MLR 을 억제한 반면, 배양되 세포의 증식은 MD-2 항체에 의해 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 MD-2 항체가 ICAM-1 및 LFA-1 의 상호작용을 차단하는 활성을 가지지 않음을 나타내는 것이다.

실시예 4. MD -2 및 R6 -5- D6 항체의 결합 에피토프 비교

실시예 2의 결과로부터 MD-2 항체의 결합 에피토프는 R6-5-D6 의 결합 에피토프와 다른 형태일 수 있음을 알 수 있었다. 이를 확인하기 위하여, 차례로 하나의 항체의 결합이 다른 항체에 의하여 경쟁을 벌이는 교차폐색(cross-blocking) 연구를 수행하였다(Cell. 1992, 68:71-81). MD-2 또는 R6-5-D6 항체 10, 1, 또는 0.1 μg 을 ICAM-1-양성 DU145 세포와 함께 30분 동안 아이스에서 사전배양하고 FITC-결합된 R6-5-D6 항체 1 μg 과 배양하기 전에 두 번 세척하였다. 사용한 대조군은 어세이에서 경쟁하는 항체가 존재하지 않는 것이다. 세포를 두 번 세척하고 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, FITC-결합된 R6-5-D6 항체의 결합은 비결합된 R6-5-D6 항체와 사전배양함에 의해서 용량 의존적으로 억제되었다. MD-2 항체와 함께 DU145 세포의 사전배양이 R6-5-D6 항체의 결합에 효과가 없었던 것은, MD-2 항체의 에피토프의 결합이 R6-5-D6 항체의 에피토프의 결합과는 다르다는 것을 나타낸다.

실시예 5. 단핵구-유래 수지상 세포의 분화 과정에서 항- ICAM -1 항체의 효과

말초 혈액 단핵 세포를 피콜-하이파크 밀도-원심구배법에 의하여 건강한 공여 혈액으로부터 분리하였다. PBS 로 두 번 세척한 후에, 세포를 1 x 10⁸ cells/ml 의 농도에서 MACS 버퍼 내에 재부유하였고, 다음으로 아이스에서 15분 동안 항-CD14 마그네틱 비드(20 ml/10⁷ cells; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)와 함께 배양하였으며, 이어서 MACS(Milteny-Biotech)를 사용하여 자성 분리하였다. 정제된 CD14⁺ 단핵구를 10% FBS가 포함된 RPMI 내에서 재부유하였고 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 1000 U/ml) 및 IL-4(1000 U/ml)와 함께 6 일 동안 배양하였다. 배양 0일째와 3일 째 배지에 항체(10 mg/ml)를 추가하고 6일 째에 LPS 를 배양 배지에 추가하였다. 하루가 지난 후에, 배양한 세포를 수집하고 유세포 분석기를 통하여 MHC class I, MHC class II, CD80, CD86, CD40, 및 CD83 의 발현을 측정하였다. 배양 배지 내 IL-6, IL-10, IL-12p70, IFN-γ 및 TNF-α 의 양을 측정하기 위하여 ELISA 또한 수행하였다. CD14⁺ 단핵구를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 배양하자 미성숙 수지상 세포로 분화할 수 있었고 LPS 처리는 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하였다. 도 5B는 각 배양 배지 내 사이토카인의 농도 및 도면에 표시된 항원의 평균형광강도(mean fluorescence intensity, MFI)를 나타낸다. 예상한 바와 같이, 미성숙 수지상 세포에의 LPS 의 처리는 MHC class I, MHC class II, CD80, CD86, 및 CD40의 발현 및 사이토카인 생성을 증가시켰다. LPS 자극에 의한 이들 분자들의 표면 발현의 상향 조절 및 사이토카인 생성은 항-ICAM-1 차단 항체인 R6-5-D6의 전처리에 의해서도 억제되지 않았다. 그러나 R6-5-D6 항체와는 달리, LPS 자극에 앞서 MD-2 항체를 전처리한 경우 수지상 세포에서 표면 분자 발현의 상향 조절 및 사이토카인 생성이 억제되었는데, 이는 MD-2 항체가 단핵구-유래 수지상 세포의 성숙을 방해할 수 있음을 나타낸다.

실시예 6. 인간화 마우스의 제조

항-ICAM-1 항체의 인 비보 효과를 측정하기 위하여, Ito, M. et al., Blood. 2002, 100:3175-82 에 기재된 방법에 따라 면역 결핍 마우스에 인간 조혈모세포를 이식하여 인간화 마우스를 제조하였다.

만기 정상 분만 동안 정상 제대혈 세포를 수집하였고 피콜-하이파크 원심분리에 의하여 단핵 세포를 분리하였다. 분리한 단핵 세포는 2mM EDTA 및 5% FBS 를 함유하는 PBS 내에서 3.3 x 10⁸ cells/ml 으로 부유하였고 Fc 차단 항체와 함께 30분 동안 아이스에서 배양하였으며, 이어서 항-CD34 마그네틱 비드(Milteny-Biotech)와 함께 30분 동안 아이스에서 배양하였다. 두 번 세척한 후, MACS 를 사용하여 비드가 부착된 세포를 자성 분리하였다. 두 차례의 자성 분리 후에, 유세포 분석기에 의해 순도를 평가한 결과 수집한 세포의 95% 이하가 CD34⁺ 였다. 8- 내지 12- 주령의 NOD.SCID/γc^null 마우스(Central Institute for Experimental Animals, Japan) 에 코발트 방사선원을 사용하여 240 cGy 으로 방사선 처리하고 1일 후에 1 x 10⁵ 의 CD34⁺ 세포를 꼬리 정맥을 통해 각 마우스에 투여하였다. 순차적으로 이식 4주 및 16주가 지난 후에 안와정맥총(retro-orbital venous plexus)으로부터 말초 혈액을 취하였고 유세포 분석을 위해 항-인간 CD45 및 항-인간 CD3 항체를 염색하였다. 도 6은 세포 이식 후에 도면에 표시된 주에서 마우스의 말초 혈액 내 인간 세포의 키메라 비율을 나타낸다. 모든 마우스에서 인간 백혈구가 검출되었는데 이식 11주 후에 말초 혈액 내 60% 이상의 백혈구가 인간 CD45⁺ 였고(도 6A) 이식 16주 후에 약 10% 의 인간 CD45⁺ 세포가 CD3 를 발현하였다(도 6B).

실시예 7. 이종 췌도 이식의 거부반응을 억제하는 항- ICAM -1 항체의 효과

이식 거부반을을 억제하는 MD-2 항체의 효과를 규명하기 위하여, 췌도 이종이식 모델을 사용하였다. 인간화 마우스에 pH 4.5의 시트르산 완충액에 용해시킨 100 mg/kg 의 스트렙토조토신(Sigma, St. Louis, MO)을 연속 이틀 동안 두 번 복강 내 투입하여 당뇨 상태로 만들었다. 스트렙토조토신 투여 3일 후 ACCU-CHECK 혈당측정기(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 혈중 글루코스 수준 측정하였고, 혈중 글루코스가 > 250 mg/dl 인 동물만 당뇨병 수혜자로 사용하였다. 이식할 췌도는 비유동적 콜라게나제 분해(0.07% 타입 XI 콜라게나제, Sigma) 및 이어서 이전에 개시된 바와 같은(Transplantation. 2000, 69:1567-1571) 불연속적 피콜(Ficoll 400, Pharmacia) 밀도 구배 방법을 사용하여 스프래그-돌리 랫트(Sprague-Dawley rat)에서 분리하였다. 분리 후에는, 원형의 췌도 세포를 5% CO₂ 배양기 내 10% FBS 가 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 에서 밤새 배양한 다음, 스트렙토조토신 투여 4일 후에 각 당뇨병 인간화 마우스의 좌측 신장 피막하 공간에 500 췌도를 이식하였다. 항-ICAM-1 항체(300 μg/mouse) 를 췌도 이식 6일 및 3일 전에 복강 내 투여하였다. 동물 대조군에는 관련없는 마우스 IgG 를 투여하였다. 200 mg/dl 이하의 혈당 글루코스 수준의 회복을 이식 기능의 표지로 사용하였으며, 연속 이틀 동안 > 250 mg/dl 의 수준으로 갑자기 증가한 경우에는 거부반응을 나타낸 것으로 보았다. 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스는 사망하거나 췌도 이식 3주 후에 거부반응을 일으킨 반면, 췌도 이식 전 MD-2 항체를 투여한 모든 마우스의 경우 실험 기간 내내 여전히 200 mg/dl 이하를 유지하였다.

마우스가 병적 상태를 나타냈을 때 이들을 희생시키고 이식 거부반응을 입증하기 위하여 좌측 신장 절제 시료를 조직학적으로 분석하였다. 대조군 마우스는 이식 후 9, 21 및 44일에 희생시켰다. MD-2 항체 처리군에서는, 이식 후 34, 77 및 87일에 마우스를 희생시켰다. 각 마우스로부터 얻은 신장 절제 시료는 10% 중성 포르말린에 고정시켰고, 파라핀 포매 후 일반적인 헤마톡실린-이오신 염색 또는 면역조직화학염색을 위하여 4 μm 두께로 연속적으로 절단하였다. 인슐린 염색을 위하여 인간 인슐린에 대한 일차 염소 항혈청(DAKO, Carpenteria, CA)을 사용하였고 이어서 기질로서 다이아민노벤지딘 및 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 방법을 사용하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군 항체를 투여한 마우스의 피막하 공간에서 단핵 세포의 침윤이 명확히 관찰되었고 면역조직화학적 염색 결과 이들 마우스에서 성공 가능한 췌도는 관찰할 수 없었다. 그러나 대조군과는 달리, MD-2-처리 마우스에서는 여전히 이식편 생존율이 명확하게 관찰되었으며 단핵 세포의 침윤이 관찰되지 않았다. 또한, 이식된 췌도는 인슐린 생산을 계속하였다. 따라서, 이식 전 MD-2 의 처리는 췌도 이종이식의 생존율을 증가시킬 수 있다.

본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 출원은, 각 개별 공개문헌, 특허 및 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고문헌으로 포함되는 것과 같이, 동일한 범위 내에서 모든 목적을 위하여 그 전체가 본 발명에 참고문헌으로 포함된다.

한국세포주연구재단 KCLRFBP00198 20081224

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Claims (20)

1. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 인간 세포간 부착 분자-1(ICAM-1)에 결합하는 항체로서, 상기 중쇄는 수탁번호 KCLRF-BP-00198 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 중쇄로부터 세 개의 CDR 을 포함하고 상기 경쇄는 수탁번호 KCLRF-BP-00198 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 경쇄로부터 세 개의 CDR 을 포함하는 것이며, 상기 항체는 ICAM-1 과의 결합을 통하여 수지상 세포의 분화를 조절하는 것인 항체.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단리된 형태인 항체.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체인 항체.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체인 항체.
   
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 항체는 MD-2(수탁번호 KCLRF-BP-00198)인 항체.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 항체는 MD-2(수탁번호 KCLRF-BP-00198)의 인간화된 또는 키메라 형태인 항체.
   
9. 삭제
10. 제1항의 항체를 포함하는, 이식거부 또는 이식편 대 숙주질환 치료용 약학적 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 항체는 단리된 형태인 약학적 조성물.
12. 제10항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체인 약학적 조성물.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체인 약학적 조성물.
    
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18. 인간 세포간 부착 분자-1(ICAM-1)에 결합하며, ICAM-1 과의 결합을 통하여 수지상 세포의 분화를 조절하는 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00198 로 기탁된 하이브리도마.
    
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