RU2665802C2 - Слитый белок на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы и сывороточного альбумина человека, способ его получения, а также его применение - Google Patents
Слитый белок на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы и сывороточного альбумина человека, способ его получения, а также его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2665802C2 RU2665802C2 RU2016118398A RU2016118398A RU2665802C2 RU 2665802 C2 RU2665802 C2 RU 2665802C2 RU 2016118398 A RU2016118398 A RU 2016118398A RU 2016118398 A RU2016118398 A RU 2016118398A RU 2665802 C2 RU2665802 C2 RU 2665802C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rlz
- hsa
- fusion protein
- protein
- treatment
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 241000222336 Ganoderma Species 0.000 title claims abstract description 20
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 14
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 27
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 18
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 11
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 8
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 claims description 4
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 26
- 101000616283 Ganoderma lucidum Immunomodulatory protein Ling Zhi-8 Proteins 0.000 description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 21
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 8
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical group CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 3
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 1H-imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 208000003468 Ehrlich Tumor Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001480597 Ganoderma tsugae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101150116986 THPO gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004977 anhydrous lactose Drugs 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003809 bile pigment Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003777 experimental drug Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- -1 sTNF-αR Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
- A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
- A61K36/074—Ganoderma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/38—Albumins
- A61K38/385—Serum albumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению слитого белка, состоящего из иммунорегуляторного белка гандермы и человеческого сывороточного альбумина (HSA), и может быть использовано в медицине для лечения лейкопении и как противоопухолевое средство. Получен слитый белок rLZ-8-HSA, в котором С-конец иммунорегуляторного белка ганодермы соединен с человеческим сывороточным альбумином через связывающий пептид. Изобретение позволяет улучшить биологическую активность слитого белка ганодермы rLZ-8-HSA и увеличить периодом его полураспада in vivo по сравнению с rLZ-8. 9 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл.
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники, которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к конструированию, экспрессии, очистке и применению рекомбинантного слитого белка, а более конкретно к способу получения и применения слитого белка на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческого сывороточного альбумина, который используется для лечения заболеваний, таких как лейкопения и опухоли, вызванные химиотерапией.
Описание предшествующего уровня техники
Иммунорегуляторный белок ганодермы (LZ-8) получают из мицелия Ganoderma tsugae. Структура рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы содержит: важный N-концевой домен для образования димера и С-концевой домен FNIII; где N-концевой домен rLZ-8 включает α-спираль и β-нить, α-спираль и β-нить N-конца мономера LZ-8 образуют важный гантелевидный димер, связывающий домен через пространство обмена с соответствующими доменами другого LZ-8. Сообщалось, что LZ-8 обладает биологической активностью по иммунорегулированию (ссылаясь на китайский патент CN201110222012.5) и уничтожению опухолевых клеток (ссылаясь на китайский патент ZL200810050206.X).
Обычно основными причинами короткого периода полураспада белковых препаратов являются: 1) гидролиз является одним из способов метаболизма для большинства белков, и наличие белковых ферментов в тканях организма снижает активность белка; 2) почки являются наиболее важным органом в процессе расщепления и метаболизма низкомолекулярного белка; большинство белков, с относительной молекулярной массой менее 69000 Да, могут быть экскретированы путем клубочковой фильтрации; 3) печень играет важную роль в процессе метаболизма белковых лекарственных средств, где лекарственное средство доставляется в клетки печени путем диффузии и переноса носителями, а затем разрушается под действием микросомальных ферментов Р450, протеаз или лизосом в цитозоли; пептиды и белки с более крупными молекулами, абсорбируются клетками печени через эндоцитоз, опосредованный рецептором, прежде чем разрушаются клетками печени. Молекулярная масса димера составляет менее 26 кДа; скорость клиренса может быть высокой; и фармакокинетические параметры являются сложными, чтобы удовлетворить требования фармацевтических разработок. Таким образом, только за счет продолжительного времени действия LZ-8 in vivo путем слияния на уровне генов и других технических методов может быть заложен прочный фундамент для клинического применения. Для того чтобы продлить период полураспада белковых лекарственных препаратов в последние годы исследователи, в основном, проводили исследования с точки зрения аспектов, таких как слияние с альбумином, химическая модификация, микрокапсуляция, конструирование мутантов и гликозилирование. По мере развития исследований, появляются новые разновидности белковых лекарственных препаратов длительного действия.
Технология слияния генов соединяет различные гены, для экспрессии слитого белка со сложными функциями. С помощью технологии слияния генов молекулярные массы пептидных и белковых лекарственных средств увеличиваются или сродство между лекарственным средством и рецептором изменяется таким образом, чтобы продлить период полураспада лекарственных средств. Принцип построения слитого белка является следующим: удаление стоп-кодона кодирующего гена белка, а затем присоединение кодирующего гена другого белка со стоп-кодоном так, чтобы реализовать слияние кодирующих генов двух белков для одновременной экспрессии двух белков. Ген слитого белка обладает высокой стабильностью и может регулироваться и экспрессироваться, его продукт однороден, воздействия на активность белковых и пептидных лекарственных средств малы, и т.д., что обычно обеспечивает подходящий метод для изучения пролонгированного действия пептидных и белковых лекарственных средств.
Традиционно широко изученные слитые гены являются генами сывороточного альбумина человека, генами иммуноглобулина человека (IgG4, IgG1) и т.д. Сывороточный альбумин человека (HSA для краткости) представляет собой белок в плазме крови человека, его не-гликозилированный одноцепочечный полипептид содержит 585 аминокислот, а молекулярная масса составляет 66 кДа. Концентрация HSA в плазме составляет 42 г/л, что составляет приблизительно 60% от общего количества белков плазмы. Человеческий сывороточный альбумин в жидкостях организма, способен транспортировать жирные кислоты, желчные пигменты, аминокислоты, стероидные гормоны, ионы металлов, различные терапевтические молекулы и т.д.; в то время как поддерживается нормальное кровяное давление. Клинически, сывороточный альбумин человека применим для лечения шока и ожога, и может быть использован в качестве вспомогательного средства при потере крови, вызванной хирургическим вмешательством, несчастного случая или кровотечений; сывороточный альбумин человека также может быть использован в качестве компатибилизатора плазмы.
Человеческий иммуноглобулин (IgG) является наиболее распространенным белком в крови человека, период полураспада которого составляет 21 день. Сообщалось, что слияние Fc-фрагмента IgG и других белков может значительно увеличить биологическую активность и период полураспада других белков in vivo, где большинство исследователей выбирают Fc-фрагменты IgG1 и IgG4 в качестве объектов для слияния. Метод широко использовался в некоторых клинически важных клеточных факторах, и растворимых рецепторах, таких как sTNF-αR, LFA3, CTLA-4, IL-2 и IFN-α, со значительным успехом.
С учетом вышеизложенного уровня техники, настоящее изобретение использует технологию рекомбинации генов для слияния иммунорегуляторного белка ганодермы с альбумином сыворотки крови человека и Fc-фрагментом иммуноглобулина человека IgG, соответственно, с тем, чтобы сконструировать эукариотическую экспрессирующую систему. После экспрессии и очистки получают целевой белок, и проводят соответствующие исследования биологической активности и фармацевтические исследования для целевого белка. Результат показывает, что иммунорегуляторный белок ганодермы (LZ-8) значительно отличается от слитого белка HSA в фармацевтической и биологической активности, а также патологическим применением.
СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является предоставление слитого белка на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодремы и сывороточного альбумина человека, и способа его получения, таким образом, чтобы изучить его применение в лечении заболеваний, таких как лейкопения, вызванная химиотерапией и противоопухолевыми препаратами.
Последовательность слитого белка: в соответствии с настоящим изобретением, слитый белок rLZ-8-HSA иммунорегуляторного белка ганодермы (LZ-8) и HSA состоит из иммунорегуляторного белка ганодермы и HSA; его аминокислотная последовательность представляет собой:
SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSMKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:1), в которой аминокислотная последовательность связывающего пептида, соединяющего C-конец иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческий сывороточный альбумин представляет собой GGGGSS.
В соответствии с настоящим изобретением, слитый белок rLZ-8-Fc1 иммунорегуляторного белка ганодермы (LZ-8) и Fc-фрагмента человеческого IgG1 состоит из иммунорегуляторного белка ганодермы и Fc-фрагмента IgG1; где его аминокислотная последовательность представляет собой:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO.2), аминокислотная последовательность связывающего пептида, соединяющего C-конец иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческий сывороточный альбумин представляет собой GGGGSS.
В соответствии с настоящим изобретением, слитый белок RLZ-8-Fc4 иммунорегуляторного белка ганодермы (LZ-8) и Fc-фрагмента человеческого IgG4 состоит из иммунорегуляторного белка ганодермы и Fc-фрагмента IgG4; где его аминокислотная последовательность представляет собой:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSYTQRFKDKAKLTAVTSANTAYMELSSLTNEDSAVYYCSIIYFDYADFIMDYWGQGTTVTVSTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQXSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLXGKEYKCKVSXKGLPSSIEKTISXAXGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSXWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO.3), аминокислотная последовательность связывающего пептида, соединяющего C-конец иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческий сывороточный альбумин представляет собой GGGGSS.
Конструирование инженерных штаммов, а также экспрессия и очистка целевого белка являются такими, как указано далее: соответственно образование носителей нуклеотидных последовательностей слитого белка на основе LZ-8; использование технологии электротрансформации для получения клетки-хозяина с помощью Pichia pastoris как внеклеточной экспрессии слитого белка; где условия ферментации Pichia pastoris оптимизированы и показатель экспрессии слитого белка улучшен; очистка целевого продукта с помощью таких методов, как аффинная колоночная хроматография с «гравитационным элюированием», молекулярное сито, метод аффинной хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов (IMAC), хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC), анионообменная хроматография, где степень чистоты различных полученных слитых белков составляет выше 99%, что предоставляет неочищенные лекарственные препараты для последующих фармакологических экспериментов.
Фармакологические эксперименты являются такими, как указано далее: использование различных слитых белков, в качестве контрастов rLZ-8 для экспериментов по активности, где путем применения метода ELISA результат теста показывает, что биологическая активность слитого белка rLZ-8-HSA выше, чем биологическая активность rLZ-8, который не является слитым, и существует значительная разница, которая является статистически значимой; однако биологические активности rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 ниже, чем показатель активности rLZ-8, который не является слитым, и существует значительная разница; используя различные слитые белки, в качестве контрастов rLZ-8 для экспериментов по периоду полураспада in vivo, в которых в соответствии с методом ELISA, периоды полураспада различных слитых белков in vivo все значительно повышаются приблизительно до 3 раз относительно периода полураспада rLZ-8; в то же время, используя различные слитые белки в качестве контрастов rLZ-8 для экспериментов по лечению лейкопении, и подсчета белых клеток крови с помощью анализатора клеток цельной крови животных, в которых результат теста показывает, что существует значительное различие между различными слитыми белками и rLZ-8 в лечении лейкопении; причем при одинаковой дозировке, слитый белок rLZ-8-HSA имеет наиболее короткий цикл для стимуляции роста лейкоцитов; и при одинаковом цикле лечения, слитый белок rLZ-8-HSA способствует большему росту белых кровяных клеток. Поэтому HSA больше подходит в качестве партнера слияния для rLZ-8, который способен существенно расширить возможности применения LZ-8 в лечении лейкопении. Согласно экспериментам по ингибированию роста клеток меланомы слитого белка rLZ-8-HSA, показано, что при одинаковой дозировке (в дозировке LZ-8), слитый белок rLZ-8-HSA эффективно ингибирует рост клеток меланомы, что значительно отличается от лечебного эффекта rLZ-8, который не является слитым. В то же время, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления слитого белка rLZ-8-HSA для ингибирования роста опухолевых клеток печени, можно видеть, что при одинаковом цикле лечения, показатель эффективности лечения слитого белка rLZ-8-HSA значительно улучшен, что является неожиданным для изобретателя. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительный вариант слитого белка rLZ-8-HSA для лечения тромбоцитопении также предоставляется. Соответственно, по сравнению с модельной группой, лекарственный препарат rLZ-8-HSA значительно стимулирует пролиферацию тромбоцитов мыши в начале кормления, где разность является чрезвычайно важной. В середине срока кормления, его эффект возвращается к нормальному уровню. Достаточный эффект также наблюдается при лечении экспериментальных животных моделей с тромбоцитопенией, вызванной инъекцией антитромбоцитарной сыворотки.
Благоприятные эффекты настоящего изобретения заключаются в следующем. В соответствии с настоящим изобретением, период полураспада in vivo предложенного слитого белка значительно увеличивается по сравнению с rLZ-8. Слитый белок, сконструированный с помощью технологии слияния генов, будет иметь сниженную биологическую активность целевого белка после того, как получится слитый белок. Однако, в соответствии с настоящим изобретением, биологическая активность слитого белка rLZ-8-HSA, как было экспериментально доказано, является значительно лучше, чем биологическая активность rLZ-8, который не является слитым. К тому же, в соответствии с настоящим изобретением, ферментация слитого белка rLZ-8-HSA с использованием инженерного штамма Pichia pastoris проста в технике исполнения, имеет высокий выход, единственный продукт экспрессии, и не требует усилий в очистке, что обеспечивает благоприятные условия для промышленного производства. Существуют проблемы, такие как продукт экспрессии легко разлагается в процессе ферментации из-за экспрессирующей системы Pichia pastoris. Таким образом, настоящее изобретение контролирует условия ферментации, для значительного уменьшения разложения целевых продуктов в процессе ферментативной экспрессии Pichia pastoris, и повышения выхода. С помощью экспериментов in vivo, настоящее изобретение доказывает, что по сравнению с rLZ-8, который не является слитым, период полураспада in vivo значительно продлевается, в то время как самые низкие дозировки и время начала болезни в изучении лечения лейкопении также улучшены. Меланома и опухоль печени исследованы в качестве примеров противоопухолевого действия, и представлены эксперименты in vivo и in vitro, соответственно. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления меланомы и опухоли печени, терапевтические эффекты в двух экспериментальных методах являются значительно более высокими, чем от rLZ-8, который не является слитым, что является неожиданным для изобретателя. В соответствии с предпочтительным вариантом лечения тромбоцитопении, по сравнению с модельной группой, препарат rLZ-8-HSA значительно стимулирует пролиферацию тромбоцитов мыши в начале кормления, где разность является чрезвычайно важной. В середине срока кормления, его эффект возвращается к нормальному уровню, который является обычно лучшим эффектом слитого белка rLZ-8.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 иллюстрирует индуцирование экспрессии различных слитых белков в 66 ч и 72 ч; где образец дорожки 1 представляет собой белковый маркер; образец дорожки 2 представляет собой стандартный HSA; образец дорожки 3 представляет собой rLZ-8; образец дорожки 4 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-HSA после индуцирования в течение 72 ч; образец дорожки 5 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-HSA после индуцирования в течение 66 ч; образец дорожки 6 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc1 после индуцирования в течение 72 ч; образец дорожки 7 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc1 после индуцирования в течение 66 ч; образец дорожки 8 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc4 после индуцирования в течение 72 ч; образец дорожки 9 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc4 после индуцирования в течение 66 ч.
Фиг. 2 представляет собой Вестерн-блоттинг идентифицирующую карту различных слитых белков;
где образец дорожки 1 представляет собой белковый маркер; образец дорожки 2 представляет собой rLZ-8; образец дорожки 3 представляет собой rLZ-8-HSA; образец дорожки 4 представляет собой rLZ-8-Fc1; образец дорожки 5 представляет собой rLZ-8-Fc4.
Фиг. 3 представляет собой хроматографическую карту слитого белка rLZ-8-HSA после очистки с помощью молекулярного сита.
Фиг.4 иллюстрирует сравнения периодов полураспада in vivo различных слитых белков и rLZ-8.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предпочтительный вариант осуществления 1: конструирование и экспрессия инженерных штаммов слитого белка rLZ-8
Конструирование: последовательности целевых фрагментов rLZ8-HSA, rLZ8-Fc1 и rLZ8-Fc4 соответственно синтезируют в соответствии с предпочтительным использованием дрожжевых кодонов, и хранят в плазмиде puc57; конструируют праймер, содержащий маскированные сайты рестрикционного фермента StuI и KpnI; праймер синтезируют следующим образом:
| (1) LZ-8-HSA: | 5' CATAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3' |
| 5' CGGGGTACCGAATTCCTATTACA 3' | |
| (2) LZ-8-Fc1: | 5' GTTAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3' |
| 5' TAGGGTACCTCATTTACCAGGGG 3' | |
| (3) LZ-8-Fc4: | 5' CCGAGGCCTTCTGATACTGCTT 3' |
| 5' GATGGTACCTCACGGAGCATGAG 3' |
Получение целевых фрагментов посредством ПЦР, где условия для ПЦР представляют собой: во-первых, 95°С в течение 30 сек; затем 95°С в течение 30 сек, 58°С в течение 30 сек и 72°С в течение 2 мин, при этом вышеуказанные процессы повторяют 30 раз; и, наконец, 72°С в течение 10 мин, и поддерживание при 16°С.
Идентификация с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, что фрагменты, соответственно, на 2184bp (LZ-8-HSA), 1064bp (LZ-8-Fc1) и 774bp (LZ-8-Fc4); обработка носителя pPICZa и целевых фрагментов согласно иллюстративному материалу набора для «бесшовного» клонирования и сборки GENEART (Seamless Cloning and Assembly Kit), где молярное соотношение носителя и фрагментов составляет 1:3, где носитель и фрагменты взаимодействуют 5× с буфером и 10× со смесью ферментов в течение 30 минут; превращение 10 мкл продукта присоединения в компетентную кишечную бактерию DH5 альфа; после культивирования при 37°С в течение 30 мин, нанесение продукта присоединения на планшет LB с устойчивостью к блеомицину; выбор одной бактериальной колонии для культивирования при 37°С и встряхивании в течение ночи; центрифугирование бактериальной жидкости при 12000g, и удаление надосадочной жидкости; извлечение рекомбинантной плазмиды с использованием набора для экстракции малых плазмид и анализ ее последовательности; использование двойного ферментативного переваривания и электрофореза, чтобы идентифицировать, верен ли преобразователь; и, наконец, использование праймеров 5'AOX и 3'AOX для проверки правильности последовательности.
Линеаризация рекомбинантной плазмиды с помощью фермента SacI при 37°С в течение приблизительно 1 ч; добавление 33 раза Pichia pastoris для инокулирования в YPD при 30°С, и культивирование с использованием шейкера при 300 об/мин. в течение ночи; увеличение до 500 мл; когда OD600 достигает приблизительно 1,3, получение компетентных дрожжей; выдерживание в ледяной бане в течение 30 минут и ресуспендирование с помощью стерилизованной воды, охлажденной в ледяной бане; центрифугирование при 1500g и температуре 4°С в течение 5 минут, и разделение по 80 мкл компетентных дрожжей на пробирку; добавление 10 мгк линеаризованной плазмиды; выдерживание в ледяной бане в течение 5 мин; перенос в электротрансформирующее устройство и проведение электротрансформации при 1,5 кВ, 50 мкФ, 25 мА; шейкер-культивирование при 30°С в течение 2 ч, нанесение на планшет YPDS с устойчивостью к блеомицину зеоцину, и культивирование при 30°С в течение 3-х дней.
Скрининг: в асептических условиях, отбор 20 моно-клонов каждого слитого белка на планшете YPDS с устойчивостью к блеомицину зеоцину и помещение в 10 мл жидкой культуральной основы YPD для культивирования при 30°C с использованием встряхиваемой колбы при 300 об/мин в течение 12 ч; центрифугирование при 1500g в течение 5 мин и удаление надосадочной жидкости; перемещение в культуральную основу BMGY для культивирования при 30°С с использованием встряхиваемой колбы при 300 об/мин в течение 18 ч; центрифугирование при 1500g в течение 5 мин и удаление надосадочной жидкости; перемещение в культуральную основу BMGY (с 1% метанола) и при добавление 1% метанола один раз в 24 ч; обеспечение индуцирования экспрессии в течение 72 ч; центрифугирование при 1500g в течение 5 мин, и сохранение надосадочной жидкости при -20°С; количественное и качественное описание экспрессии целевых белков посредством SDS-электрофореза и идентификация Вестерн-блоттингом, с тем, чтобы отобрать инженерные штаммы с экспрессией на высоком уровне.
Предпочтительный вариант осуществления 2: способы очистки слитых белков
Так как слитый белок имеет общую структуру LZ-8, способы очистки, такие как аффинная колоночная хроматография с «гравитационным элюированием», молекулярное сито, метод аффинной хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов (IMAC), хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC), анионообменная хроматография исследованы в соответствии с характеристиками структуры, где конкретные методы такие как указано далее.
Способы очистки rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 заключаются в следующем.
Микрофильтрация: центрифугирование ферментационной жидкости при 10000 об/мин для получения надосадочной жидкости, затем очистка (микро-фильтрация) с помощью колонки с полыми волокнами с диаметром отверстий 100 Кд, с тем, чтобы удалить низкомолекулярные соли и сахара, для получения 8 л желтой прозрачной жидкости, содержащей пигмент, нуклеиновые кислоты и белки.
Аффинная колоночная хроматография с «гравитационным элюированием» rProtein Gravitrap: приготовление буферного раствора фазы A: 0,22 M фосфатный буферный раствор, рН 7,7, и 0,15 М хлорид натрия; приготовление буферного раствора фазы B: 0,1 М цитратный буферный раствор, рН 4,0, 0,22 мкм вакуумная фильтрация, дегазация ультразвуком; уравновешивание хроматографической колонки с помощью фосфатного буферного раствора фазы A, где его объем составляет 10 мл; соответственно отбор образца 10 мл предварительно обработанной rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 ферментативной жидкости и смешивание два раза; (обработка образца: 90 мл ферментативной жидкости и 10 мл 10× фосфатного буферного раствора, 0,22 мкм фильтрация и стерилизованное хранение), промывание хроматографической колонки с помощью фосфатного буферного раствора фазы A, элюирование без смешивания; промывание элюированного образца цитратным буферным раствором фазы B, где его объем составляет 10 мл; ожидание в течение 2 мин, и удаление 1 мл объема в хроматографической колонке; получение образцов с помощью 1,5 мл трубки для центрифугирования, и хранение для анализа; регенерация хроматографической колонки после использования в течение 5 раз, добавление 5 мл 6 М гуанидина гидрохлорида, ожидание в течение 2 мин и промывание хроматографической колонки с помощью фазы А.
Хроматография на молекулярных ситах: использование колонки с наполнителем Superdex 75 (GE, XK16/70, где ее внутренний диаметр 16 мм, высота ее составляет 70 см), где высота наполнения составляет 60 см; анализ с помощью 100 мкл 1%-ного ацетона, где эффективность колонки составляет приблизительно 10000 согласно результату; отбор пробы белка со скоростью потока 2 мг/мл и концентрацией 5 мл, затем элюирование с помощью буферного раствора NaH2PO4-Na2HPO4 (50 мм) с рН 7,5 (показан на фиг.3.); отбор пробы в пике сбора, и проведение электрофореза и анализов ВЭЖХ.
Результаты: после тонкой очистки, чистота белка составляет выше 99% в соответствии с анализом ВЭЖХ, электрофорез SDS-PAGE имеет одну полосу.
Способ очистки rLZ-8-HSA включает стадии:
стадия (1): очистка rLZ-8-HSA с помощью метода аффинной хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов (IMAC), где наполнитель IMAC Sepharose 6Fast Flow 1 приобретают у GE; наполнение колонки XK50/30 с высотой наполнения 15 см; замена жидкости для хранения чистой водой; прохождение 0,1 М раствора сульфата меди через хроматографическую колонку, где объем сульфата меди равен объему колонки и вымывание ионов меди, которые не адсорбируются очищенной водой, где объем очищенной воды равен четырем объемам колонки; затем уравновешивание хроматографической колонки с использованием буферного раствора А: 20 ммоль/л фосфат, 0,6 моль/л хлорид натрия и рН 7,3, где надосадочную жидкость, содержащую человеческий сывороточный альбумин, добавляют в фосфат и хлорид натрия для получения 20 ммоль/л фосфата, 0,6 моль/л хлорида натрия, и рН 7,3; затем отбор пробы с помощью хроматографической системы AKTA™ Purify со скоростью потока 50 мл/мин; после отбора пробы, промывка с использованием буферного раствора A, пока степень поглощения не достигнет основной точки; элюирование целевого белка с помощью буферного раствора B: 20 ммоль/л фосфат, 0,6 моль/л хлорид натрия, 0,3 М иминазол и рН 7,5; сбор пика элюирования буферного раствора B;
стадия (2): очистка с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC), где пик элюирования буферного раствора В собранный на стадии (1) очищают с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием; наполнение хроматографической колонки, имеющей диаметр 5 см с использованием фенильной гидрофобной среды для хроматографии Phenyl Sepharose™ 6Fast Flow (высокозамещенной) (от GE), где высота колонки составляет 15 см; где перед использованием, среда уравновешивается с помощью буферного раствора C: 50 ммоль/л фосфат, 0,5 М хлорид натрия, и рН 6,5, и объем буферного раствора C составляет 3 объема колонки; добавление деионизированной воды в буферный раствор B, содержащий целевой белок, который получают на стадии (1), разведение до концентрации 0,5 М NaCl, и доведение значения рН до 6,5 с помощью фосфорной кислоты; отбор проб с использованием хроматографической системы AKTA™ Purify со скоростью потока 50 мл/мин; после отбора проб элюирование с использованием буферного раствора C: 50 ммоль/л фосфат, 0,5 М раствор хлорида натрия и рН 6,5, где объем буферного раствора C составляет 2 объема колонки; сбор элюата пика и элюирование пика с помощью буферного раствора C; элюирование смешанной части с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием с использованием деионизированной водой, имеющей объем равный двум объемам колонки и слив жидкости элюата; добавление собранной жидкости из гидрофобной хроматографической колонки в тетраборат натрия и раствор хлорида кальция с конечной концентрацией 0,1 М, доведение рН до 9,0 и обработка в течение 0,5-24 ч, затем центрифугирование при 10000 об/мин в течение 20 мин, сбор надосадочной жидкости, и обессоливание с помощью ультрафильтрационной мембраны MILLIPORE 10K; и
стадия (3): доочистка образца с помощью анионообменной хроматографии, загрузка наполнителя Q Sepharose™ High Preformance в хроматографическую колонку с диаметром 2,6 см и высотой 15 см, где объем наполнения составляет 80 мл; промывка с помощью деионизированной воды, где ее объем составляет два объема колонки; затем уравновешивание с использованием буферного раствора E (50 мМpb, рН 7,0), имеющего объем, равный пяти объемам колонки; после отбора проб, промывка буферным раствором E, где его объем составляет два объема колонки; затем элюирование с помощью 0-0,5M NaCl с градиентом, составляющим 10 объемов колонки, и сбор основного пика.
Результаты: после тонкой очистки, чистота белка выше 99% в соответствии с анализом ВЭЖХ, электрофорез SDS-PAGE имеет одну полосу.
Предпочтительный вариант осуществления 3: сравнение различных слитых белков по промотированию пролиферации клеток селезенки мыши
Анализ воздействий слитых белков на пролиферацию клеток селезенки мыши с помощью метода WST-1, который иллюстрирует силу биологической активности, где в соответствии с настоящим изобретением, используются самки мышей BALB/C, вес которых контролируется на 20-22 г; умерщвление мышей путем смещения их шейных позвонков, изъятие селезенок в стерильных условиях, и помещение в планшет с 5×106/мл DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка; вскрытие селезенки с помощью пинцета, фильтрация суспензии ткани с помощью марли для удаления тканевых блоков, и получение клеточной суспензии из клеток селезенки; добавление 100 мкл суспензии ткани в 900 мкл 2% ледяной уксусной кислоты для подсчета с помощью микроскопа; доведение концентрации клеток до 5×106/мл с использованием DMEM, содержащей 2% сыворотки теленка; соответственно получение слитых белков и rLZ-8 с тем же градиентом молярной концентрации, где имеются 3 градиентных концентрации, каждая концентрация занимает 9 лунок со 100 мкл на лунку; добавление суспензии ткани с концентрацией 5×106/мл со 100 мкл на лунку; встряхивание для равномерного смешивания, а затем помещение в инкубационное устройство при 37°C, 5% CO2 для инкубирования в течение 24 ч; после инкубации, добавление WST-1 с 20 мкл на лунку; помещение в инкубационное устройство при 37°С, 5% СО2 для инкубирования в течение 3 часов, а затем анализ OD450 (с помощью BIO-RAD); где результаты представлены в таблице 1.
| Таблица 1 Биологическая активность различных слитых белков по промотированию клеточной пролиферации (х±s n=9) |
||||
| Белок Концентрация |
rLZ-8 | rLZ-8-Fc1 | rLZ-8-Fc4 | rLZ-8-HSA |
| 5,0×10-9 моль/л | 0,739±0,23 | 0,543±0,26 | 0,452±0,43 | 0,936±0,31* |
| 10,0×10-9 моль/л | 1,197±0,31 | 0,937±0,29 | 0,840±0,27 | 1,680±0,38* |
| 15,0×10-9 моль/л | 1,567±0,27 | 1,114±0,31 | 0,929±0,21 | 2,373±0,35* |
| Примечание: сравнение с rLZ-8, *р<0,05 | ||||
Что качается таблицы 1, с увеличением концентрации белка, воздействие слитых белков на пролиферацию клеток селезенки также увеличивается. При одной и той же концентрации белка, можно сделать вывод из сравнения воздействия на пролиферацию различных слитых белков и rLZ-8, что rLZ-8-HSA лучше, чем rLZ-8 в промотировании пролиферации клеток селезенки, и имеется существенное различие, которое является статистически значимым. Тем не менее, эффекты промотирования rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 на пролиферацию клеток селезенки мыши значительно уменьшаются. Согласно экспериментальным результатам, что активные точки не подвергаются воздействию при слиянии LZ-8 и HSA, в то время как после слияния LZ-8 и IgG-Fc1 или IgG-Fc4, активность белка уменьшается, что затрудняет активность LZ-8.
Предпочтительный вариант осуществления 4: анализ периодов полураспада различных слитых белков
Использование мышей BALB/C общим весом приблизительно 18-22 г в экспериментах, причем каждая группа состоит из 10 мышей; внутривенно вводят 100 г/кг (исходя из дозы LZ-8) слитого белка, соответственно отбирают пробы крови через 2, 4, 6, 8 и 10 ч после инъекции, рисуя кривую концентрации лекарственного лекарства в единицу времени (как показано на фиг. 4) с использованием полученных результатов, где показано результатами эксперимента, что период полураспада слитого белка значительно продлен (Р<0,0001) судя по rLZ-8, который не является слитым, концентрация его в крови значительно продлена, а период полураспада rLZ-8 у мышей увеличен.
Предпочтительный вариант осуществления 5: исследование слитого белка rLZ-8-HSA в лечении
Использование крыс Wistar в опытах, где используют 18 крыс весом приблизительно 100 г. Способ получения реагентов включает в себя этапы: растворения rLZ-8 в стерильном физиологическом растворе, и разбавления до получения групп дозировок 60 мкг/кг, 30 мкг/кг и 15 мкг/кг; растворения слитого белка rLZ-8-HSA в стерильном физиологическом растворе, и разбавления до получения групп дозировок 60 мкг/кг, 30 мкг/кг и 15 мкг/кг (исходя из дозы LZ-8); разбавления GenLei®Scimax® [инъекция рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ)], номер партии: 20130403, 75 мкг/ампула, до получения 13,5 мкг/мл и 0,1 мл на крысу с помощью стерильного физиологического раствора; разбавления инъекции Циклофосфамида (CP), номер партии 13020225, 200 мг/ампула, до получения 20 мг/мл и 0,1 мл на крысу с помощью стерильного физиологического раствора, или 20 мг/кг.
Эксперимент имеет группу с низкой дозировкой rLZ-8, группу со средней дозировкой rLZ-8, группу c высокой дозировкой rLZ-8, группу c низкой дозировкой rLZ-8-HSA, группу со средней дозировкой rLZ-8-HSA, группу c высокой дозировкой rLZ-8-HSA, и группу с позитивным контролем с использованием лекарственного средства (использование GenLei®Scimax®). Крысам каждой группы вводили с помощью инъекции циклофосфамид в хвостовую вену в течение трех дней, за исключением того, что стерильный физиологический раствор вводят здоровой контрольной группе, дозировка составляет 20 мг/мл и 0,1 мл на крысу. На третий день отбирают кровь из хвостовой вены, и подсчитывают лейкоциты с помощью цитоанализатора. После успешного моделирования на крыс каждой группы соответственно воздействуют с помощью rLZ-8, трех видов слитых белков, или положительного лекарственного средства (GenLei®Scimax®) с соответствующей дозировкой, и такую же дозировку стерильного физиологического раствора вводят крысам здоровой контрольной группы и СР-группы. Кровь отбирают из хвостовой вены на первый, третий и седьмой дни лечения, и лейкоциты подсчитывают с использованием цитоанализатора. Медицинская эффективность анализируется согласно количественному различию между лейкоцитами до и после воздействия.
| Таблица 2 Влияние rLZ-8 на модели крыс с лейкопенией (n=10) |
||||
| группа | количество лейкоцитов до | на первый день лечения | на третий день лечения | на седьмой день лечения |
| здоровая контрольная группа | 14,11×109/л | 14,36×109/л | 13,8×109/л | 12,13×109/л |
| CP-контрольная группа | 5,1×109/л | 5,3×109/л | 5,8×109/л | 9,27×109/л |
| GenLei® Scimax® |
4,55×109/л | 6,4×109/л | 11,83×109/л* | 11,17×109/л |
| rLZ-8 (низкая дозировка) |
3,71×109/л | 4,6×109/л | 9,3×109/л* | 11,2×109/л |
| rLZ-8 (средняя дозировка) |
3,12×109/л | 5,1×109/л | 9,7×109/л* | 12,78×109/л |
| rLZ-8 (высокая дозировка) |
4,09×109/л | 5,4×109/л | 9,6×109/л* | 14,5×109/л |
| rLZ-8-HSA (низкая дозировка) |
3,11×109/л | 8,5×109/л* | 10,8×109/л** | 13,2×109/л |
| rLZ-8-HSA (средняя дозировка) |
2,89×109/л | 9,2×109/л* | 11,98×109/л** | 13,4×109/л |
| rLZ-8-HSA (высокая дозировка) |
3,33×109/л | 8,4×109/л* | 14,4×109/л** | 15,5×109/л |
| Примечание: сравнение с CP-контрольной группой, *р<0,05, **р<0,01 | ||||
В таблице 2 проиллюстрировано, что на первый день воздействия количество лейкоцитов у крыс групп rLZ-8-HSA значительно возрастает по сравнению с крысами СР-группы, а на седьмой день воздействия, количество лейкоцитов в основном приближается к нормальному уровню. На первый день воздействия количество лейкоцитов у крыс групп rLZ-8-HSA значительно увеличивается по сравнению с крысами контрольной группы GenLei®Scimax®, а на седьмой день воздействия количество лейкоцитов в основном приближается к нормальному уровню. Следует подчеркнуть, что при сравнении с группами rLZ-8 при той же дозировке, группы rLZ-8-HSA имеют достаточный эффект пролиферации лейкоцитов с первого дня лечения, где количество лейкоцитов примерно в 2 раза больше, чем количество лейкоцитов групп rLZ-8; при одинаковом периоде воздействия, эффект пролиферации лейкоцитов группы с низкой дозировкой rLZ-8-HSA превосходит эффект пролиферации лейкоцитов группы с высокой дозировкой rLZ-8 и других групп rLZ-8.
Предпочтительный вариант осуществления 6: Ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA на меланому
Эксперимент in vivo: анализ ингибирующего действия слитого белка rLZ-8-HSA на меланому с помощью метода WST-1, получение суспензии ткани меланомы; добавление 100 мкл тканевой суспензии в 900 мкл 2% ледяной уксусной кислоты и подсчет с помощью микроскопа; доведение концентрации ткани до 2×105/мл с помощью DMEM, содержащей 2% сыворотки теленка; соответственно получение слитого белка rLZ-8-HSA и rLZ-8 с тем же градиентом молярной концентрации, где имеются 3 градиентные концентрации, каждая концентрация занимает 9 лунок со 100 мкл на лунку; добавление суспензии ткани с концентрацией 2×105/мл со 100 мкл на лунку; встряхивание для равномерного смешивания, а затем помещение в инкубационное устройство при 37°C, 5% CO2 для инкубирования в течение 24 ч; после инкубации, добавление WST-1 с 20 мкл на лунку; помещение в инкубационное устройство при 37°С, 5% СО2 для инкубирования в течение 3 часов, а затем анализ OD450 (с помощью BIO-RAD); где результаты представлены в таблице 3.
| Таблица 3 Ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA на меланому (х±s, n=9) |
||
| Белок Концентрация |
rLZ-8 | rLZ-8-HSA |
| 5,0×10-9 моль/л | 0,427±0,44 | 0,411±0,31* |
| 10,0×10-9 моль/л | 0,372±0,21 | 0,212±0,29* |
| 15,0×10-9 моль/л | 0,302±0,24 | 0,118±0,11** |
| Примечание: сравнение с rLZ-8, *р<0,05, **р<0,05 | ||
Эксперимент in vivo: во-первых, установление формы опухоли мыши, где клетки меланомы мыши B16-F10 культивируют с помощью DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубационном устройстве при 37°С в СО2; медленная подкожная инъекция 200 мкл клеточной суспензии B16-F10 (содержащей от 1×107 клеток) с помощью 1 мл шприца в дорсальную и вентральную кожу мыши с тем, чтобы установить форму трансплантированной опухоли мыши.
Разделение на группы и способ лечения: 24 ч после инъекции опухолевых клеток, инъекция в хвостовую вену для групп rLZ-8 (123 мкг/кг, 246 мкг/кг и 492 мкг/кг), групп rLZ-8-HSA (123 мкг/кг, 246 мкг/кг и 492 мкг/кг, исходя из LZ-8), и группы дакарбазина (2,5 мг/кг) или группы физиологического раствора, где rLZ-8 и rLZ-8-HSA инъецируют один раз в день, дакарбазин непрерывно инъецируют в течение 5 дней, а затем инъецируют снова через 3 недели, где цикл лечения включает 28 дней; в процессе эксперимента, наблюдение за активными состояниями мыши, взвешивание один раз каждые семь дней, и отбор проб крови хвостовой вены мыши один раз в 2 недели; отделение тел опухолей по окончании эксперимента, взвешивание тел опухолей и регистрация; вычисление степени ингибирования лекарственных средств, использованных при лечении, на рост опухоли in situ в соответствии с формулой, что степень ингибирования опухоли=(средний вес опухоли в группе физиологического раствора - средний вес опухоли группы, получавшей лечение)/средний вес опухоли группы физиологического раствора.
Ссылаясь на экспериментальные результаты: после взвешивания тел опухолей, вычисляется средний вес опухоли каждой группы; в соответствии с таблицей 4, показано, что через 28 дней, масса опухоли группы с высокой дозировкой rLZ-8-HSA меньше масс опухолей других групп; в пределах групп rLZ-8 или групп rLZ-8-HSA, чем больше концентрация лекарственного средства, тем меньше будет вес опухоли. Различие между группами rLZ-8-HSA и отрицательной контрольной группой является чрезвычайно важным. Разница между группой с низкой дозировкой, группой со средней дозировкой и группой с высокой дозировкой rLZ-8 является также значительной (n=10, P<0,05). Разница между группой с низкой дозировкой, группой со средней дозировкой и группой с высокой дозировкой rLZ-8-HSA является также значительной (n=10, Р<0,05).
| Таблица 4 Влияние rLZ-8 на массу опухоли B16-F10 in situ |
|||
| Способ кормления Группа |
Непрерывное кормление в течение 28 дней | ||
| Количество животных | Масса опухоли (г) | степень ингибирования опухоли (%) | |
| физиологический раствор | 10 | 1,24±0,53 | _____ |
| дакарбазин | 10 | 0,52±0,12** | 62,57±0,27 |
| низкая дозировка rLZ-8 | 10 | 0,53±0,21**## | 56,72±0,41 |
| средняя дозировка rLZ-8 | 10 | 0,43±0,17**## | 64,91±0,77 |
| высокая дозировка rLZ-8 | 10 | 0,25±0,04** | 83,04±0,51## |
| низкая дозировка rLZ-8-HSA | 10 | 0,35±0,11**## | 71,77±0,31## |
| средняя дозировка rLZ-8-HSA | 10 | 0,27±0,14**## | 78,22±0,47## |
| высокая дозировка rLZ-8-HSA | 10 | 0,13±0,05** | 89,51±0,88## |
| Примечание: сравнение с контрольной группой, *Р<0,05, **Р <0,01, причем эксперимент повторяют три раза, суммарные результаты имеют тенденцию быть одинаковыми, и таблица 4 является результатом только одного эксперимента; сравнение с группой дакарбазина, # P<0,05, ## P<0,01, причем эксперимент повторяют три раза, суммарные результаты имеют тенденцию быть одинаковыми, и таблица 4 является результатом только одного эксперимента. | |||
Предпочтительный вариант осуществления 7: ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA на асцитную опухоль Эрлиха S180 мыши
Эксперимент in vitro: анализ ингибирующего действия слитого белка rLZ-8-HSA на асцитную опухоль Эрлиха S180 мыши с помощью метода WST-1, получение суспензии ткани мышиной асцитной опухоли Эрлиха S180; добавление 100 мкл тканевой суспензии в 900 мкл 2% ледяной уксусной кислоты и подсчет с помощью микроскопа; доведение концентрации ткани до 2×105/мл с использованием DMEM, содержащей 2% сыворотки теленка; соответственно получение слитого белка rLZ-8-HSA и rLZ-8 с тем же градиентом молярной концентрации, где имеются 3 градиентные концентрации, каждая концентрация занимает 9 лунок со 100 мкл на лунку; добавление суспензии ткани с концентрацией 2×105/мл со 100 мкл на лунку; встряхивание для равномерного смешивания, а затем помещение в инкубационное устройство при 37°C, 5% CO2 для инкубирования в течение 24 ч; после инкубации, добавление WST-1 с 20 мкл на лунку; помещение в инкубационное устройство при 37°С, 5% СО2 для инкубирования в течение 3 часов, а затем анализ OD450 (с помощью BIO-RAD); где результаты представлены в таблице 5.
| Таблица 5 Ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA асцитную опухоль Эрлиха S180 мыши (х±s, n=9) |
||
| Белок Концентрация |
rLZ-8 | rLZ-8-HSA |
| 5,0×10-9 моль/л | 0,453±0,23 | 0,408±0,21* |
| 10,0×10-9 моль/л | 0,366±0,31 | 0,233±0,18* |
| 15,0×10-9 моль/л | 0,345±0,27 | 0,127±0,15** |
| Примечание: сравнение с группами rLZ-8, *р<0,05, **р<0,05 | ||
Эксперимент in vivo: экспериментальный материал: мыши весом 18-22 г из Центра лабораторных животных Цзилиньского университета; штаммы клеток асцитной опухоли Эрлиха предоставлены лабораторией изобретателя; Цитоксан (CTX) от Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd, номер партии которого 06101921; экспериментальные группы асцитной опухоли S180 и солидной опухоли соответственно содержат здоровую контрольную группу, группу отрицательного контроля, группу положительного контроля, группу с низкой дозировкой rLZ-8 (0,25 мг/кг), группу со средней дозировкой rLZ-8 (0,5 мг/кг), группу с высокой дозировкой rLZ-8 (1 мг/кг), группу с низкой дозировкой rLZ-8-HSA (0,25 мг/кг), группу со средней дозировкой rLZ-8-HSA (0,5 мг/кг) и группу с высокой дозировкой rLZ-8-HSA (1мг/кг), где дозировку в группах rLZ-8-HSA судят исходя из дозировки LZ-8, причем каждая группа включает в себя 10 мышей.
Экспериментальный метод: экспериментальный метод подкожного ингибирования опухоли S180: отбор хорошо растущих клеток S180, разбавление с помощью подходящего количества стерильного физиологического раствора для приготовления суспензии клеток опухоли, клетки которой определены как 107 л-1, подкожная инъекция в правую подмышку каждой мыши с дозировкой 20 мл (за исключением здоровой контрольной группы); лечение мышей через 24 часа; внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора для здоровой контрольной группы и группы отрицательного контроля с дозировкой 0,2 мл на мышь в день; внутрибрюшинная инъекция 20 мг/кг циклофосфамида для положительной контрольной группы с дозировкой 0,2 мл на мышь в день; проведение инъецирования в хвостовую вену для групп rLZ-8 с соответствующими дозировками, 0,2 мл на мышь в день и сроком 10 дней; перед инъекцией и 10 дней после инъекции, отбор образца крови из орбитального венозного сплетения мыши и подсчет белых клеток крови клинической лабораторией Первой больницы Цзилиньского университета; на следующий день после инъекции, умерщвление всех мышей путем смещения шейных позвонков, препарирование и изъятие опухолевых блоков, взвешивание и расчет степени ингибирования опухоли в соответствии со следующей формулой:
Степень ингибирования опухоли (%)=(средний вес опухоли в контрольных группах - средний вес опухоли в экспериментальных группах)/средний вес опухоли в контрольных группах × 100%.
Результат эксперимента: экспериментальные результаты подкожного ингибирования опухоли S180: ссылаясь на таблицу 6, три группы rLZ-8 все способны ингибировать рост S180, где их степень ингибирования опухоли составляет соответственно 16,8%, 25,7% и 45,5%. По сравнению с группой отрицательного контроля, массы опухолей групп rLZ-8 имеют существенную разницу (P<0,01). По сравнению с группой отрицательного контроля, массы опухолей групп rLZ-8-HSA имеют существенную разницу (P<0,01). В то же время, по сравнению с группами rLZ-8, массы опухолей групп rLZ-8-HSA также имеют существенное различие (P<0,01).
| Таблица 6 Ингибирующее действие rLZ-8 на трансплантированную опухоль S180 мыши (х±s, n=10) |
||
| Группа | Масса опухоли (г) | степень ингибирования опухоли (%) |
| отрицательный контроль | 1,01±0,03 | _____ |
| CTX | 0,36±0,02* | 64,3 |
| низкая дозировка rLZ-8 | 0,83±0,03* | 17,8 |
| средняя дозировка rLZ-8 | 0,74±0,02* | 26,7 |
| высокая дозировка rLZ-8 | 0,57±0,03* | 43,5 |
| низкая дозировка rLZ-8-HSA | 0,73±0,03*# | 27,7 |
| средняя дозировка rLZ-8-HSA | 0,44±0,05*# | 56,4 |
| высокая дозировка rLZ-8-HSA | 0,21±0,08**## | 29,3 |
| Примечание: сравнение с группой отрицательного контроля, *Р<0,05, **Р<0,01; сравнение с группами rLZ-8, #P<0,05, ##P<0,01. | ||
Предпочтительный вариант осуществления 8: фармакодинамический эксперимент с слитым белком rLZ-8-HSA по лечению тромбоцитопении мышей, вызванной циклофосфамидом
Экспериментальное лекарственное средство: приготовление групп дозировок 19,25 мкг/кг и 9,625 мкг/кг рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы (rLZ-8) со стерильной водой для инъекций, и 0,2 мл на мышь, а также приготовление групп дозировок 19,25 мкг/кг и 9,625 мкг/кг (исходя из LZ-8) слитого белка rLZ-8-HSA рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы.
Лекарственное средство положительного контроля: тромбопоэтин (THPO) от Shenyang 3SBio Inc., с дозировкой 770 мкг×кг-1/день и 0,2 мл на мышь.
Химиотерапевтическое лекарственное средство: циклофосфамид (Cy) от Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd, номер партии которого 12112121, 200 мг/флакон; приготовление до получения 100 мкг/кг, 0,2 мл на мышь с помощью стерильной воды для инъекций.
Разведение тромбоцитов: мочевина: 1,3 г; цитрат натрия: 0,5 г; формальдегид: 0,1 мл; добавление дистиллированной воды до 100 мл для смешивания, а затем фильтрация для дальнейшего использования.
Экспериментальный метод: разделение экспериментальных животных на 5 групп, причем каждая группа содержит 10 мышей с 5 самцами и 5 самками; за исключением здоровой контрольной группы (инъецировали физиологический раствор, имеющий одинаковый объем), внутрибрюшинное введение с помощью инъекции циклофосфамида мышам с дозировкой 100 мг/кг, 0,2 мл на мышь в день, в течение трех дней; когда количество тромбоцитов уменьшалось до уровня ниже 300×109/л, подкожное введение с помощью инъекции rLZ-8, слитого белка rLZ-8-HAS (19,25 мкг/кг, 9,625 мкг/кг, 0,2 мл на мышь в день), и положительного лекарственного средства (THPO 770 мкг/кг, 0,2 мл на мышь в день) в соответствии с указанными выше группами с соответствующими дозировками, и введение с помощью инъекции физиологического раствора, имеющего объем равный объему в здоровой контрольной группе и группе СР; соответственно отбор проб крови из хвостовой вены мыши на 3 день, 7 день и 14 день после лечения, подсчет тромбоцитов с помощью линзы с сильным увеличением, где его результаты приведены в таблице 7.
Экспериментальный результат: по сравнению с группой CP, число тромбоцитов мышей из групп, подвергнутых лечению, значительно увеличилось на третий день, и вернулось к нормальному уровню на седьмой день, причем существует значительная разница (р<0,05); число тромбоцитов мышей из групп rLZ-8-HSA значительно увеличилось и вернулось к нормальному уровню на третий день, причем существует значительная разница (р<0,05) по сравнению с группой СР, которая является статистически значимой.
| Таблица 7 Экспериментальные результаты rLZ-8 при лечении тромбоцитопении мышей (х±s, n=10) (единица измерения: ×109/л) |
|||||
| группа | до | после | 3 день | 7 день | 14 день |
| здоровая контрольная группа | 838±0,11 | 946±0,18 | 870±0,23 | 760±0,31 | 965±0,70 |
| CP-контрольная группа | 850±0,34 | 239±0,12 | 256±0,93 | 301±0,30 | 323±0,67 |
| THPO | 851±0,34 | 284±0,19 | 390±0,38 | 420±0,32 | 689±0,65 |
| rLZ-8 (9,625 мкг/кг) | 839±0,40 | 201±0,41 | 483±0,45 | 585±0,78 | 898±0,61* |
| rLZ-8 (19,25 мкг/кг) | 946±0,45 | 226±0,78 | 501±0,48 | 680±0,28 | 1021±0,31** |
| rLZ-8-HSA (9,625 мкг/кг) | 843±0,65 | 261±0,52 | 624±0,43* | 697±0,43* | 929±0,61** |
| rLZ-8-HSA (19,25 мкг/кг) | 852±0,82 | 246±0,36 | 760±0,38* | 978±0,67* | 1035±0,78** |
| Примечание: существует значительная разница по сравнению с группой СР, где *р<0,05, **р<0,01 | |||||
Предпочтительный вариант осуществления 9: получение противоопухолевый композиции rLZ-8-HSA
1) В соответствии с приведенными выше фармакологическими экспериментами доказано, что противоопухолевое действие rLZ-8-HSA является чрезвычайно эффективным по поддержанию уровня белых кровяных телец в организме без побочных токсических эффектов. Поэтому, считается, что rLZ-8-HSA подходит для медицины и является безопасным.
2) В соответствии с настоящим изобретением, применение rLZ-8-HSA в качестве противоопухолевого лекарственного средства может быть в форме для перорального применения и в форме для парентерального применения. Их дозировка зависит от таких факторов, как симптомы, возраст и вес. Для формы для перорального применения для взрослого, 10-1000 мг за раз и несколько раз в день; для формы для парентерального введения, 10-100 мг за раз и несколько раз в день.
3) Настоящее изобретение включает в себя пероральные таблетки и капсулы с гранулами (включая твердые и мягкие капсулы), причем вышеуказанные формы содержат rLZ-8 и, по меньшей мере, один инертный разбавитель (например, лактоза, маннит, глюкоза, крахмал, поливинилпирролидон). Кроме инертного разбавителя, фармацевтически приемлемые добавки, такие как смазывающие вещества, дезинтегрирующие вещества и стабилизаторы также могут быть добавлены. При необходимости таблетки или гранулы могут быть покрыты с помощью кишечно- или желудочно-растворимого вещества в один или более слоев. Непарентеральные инъекции содержат rLZ-8-HSA и, по меньшей мере, один инертный разбавитель (такой как дистиллированная вода, физиологический раствор). Или rLZ-8-HSA может быть получен в виде лиофилизированных порошков, которые растворяют в инертном растворителе для инъекций перед использованием.
(1) Приготовление 1
Растворение 1000 мг в rLZ-8-HSA в 100 мл стерильного физиологического раствора, равномерное смешивание и разделение rLZ-8-HSA во флаконы для лекарственного средства с концентрацией 10 мг/мл/ампула, запечатывание и стерилизация для образования конечного продукта; причем другие мероприятия находятся в соответствии с требованиями к инъекционной жидкости Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.
(2) Приготовление 2
Приготовление капсул с использованием 100 г rLZ-8-HSA и 0,5 кг фармацевтического крахмала с использованием обычных технологий и устройств для получения капсул, где rLZ-8-HSA делят на гранулы по 10 мг/гранула, причем другие мероприятия находятся в соответствии с требованиями к капсулам Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.
(3) Приготовление 3
Приготовление таблеток с использованием 100 г rLZ-8-HSA, 560 г микрокристаллической целлюлозы, 380 г безводной лактозы и 200 г стеарата магния с использованием обычных технологий и устройств для получения таблеток, где rLZ-8-HSA делят на 10 мг/таблетка, причем другие мероприятия находятся в соответствии с требованиями к таблеткам Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.
(4) Приготовление 4
Приготовление жидкой лекарственной формы для перорального применения с соответствующим количеством rLZ-8-HSA с использованием обычных технологий и устройств для получения жидкой лекарственной формы для перорального применения в соответствии с требованиями к жидким лекарственным формам для перорального применения Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.
Claims (10)
1. Слитый белок rLZ-8-HSA рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческого сывороточного альбумина, имеющий улучшенную биологическую активность и увеличенный период полураспада in vivo по сравнению с rLZ-8, где С-конец иммунорегуляторного белка ганодермы соединен с человеческим сывороточным альбумином через связывающий пептид, и аминокислотная последовательность слитого белка представляет собой SEQ ID NO.1.
2. Применение слитого белка rLZ-8-HSA по п. 1 для получения лекарственного средства для лечения лейкопении, вызванной химиотерапией.
3. Применение слитого белка rLZ-8-HSA по п. 1 для получения лекарственного средства для лечения меланомы.
4. Применение слитого белка rLZ-8-HSA по п. 1 для получения лекарственного средства для лечения опухоли печени.
5. Применение слитого белка rLZ-8-HSA по п. 1 для получения лекарственного средства для лечения тромбоцитопении.
6. Лекарственное средство для лечения лейкопении, вызванной химиотерапией, содержащее слитый белок по п. 1.
7. Лекарственное средство для лечения меланомы, содержащее слитый белок по п. 1.
8. Лекарственное средство для лечения опухоли печени, содержащее слитый белок по п. 1.
9. Лекарственное средство для лечения тромбоцитопении, вызванной химиотерапией, содержащее слитый белок по п. 1.
10. Лекарственное средство по любому из пп. 6-9, где лекарственное средство вводят в форме для перорального применения и в форме для парентерального применения; причем форма для перорального применения включает жидкую лекарственную форму для перорального применения, таблетки, пилюли и капсулы; форма для парентерального применения включает лекарственные средства для местного применения и инъекции.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310479016.0 | 2013-10-15 | ||
| CN201310479016.0A CN103524628B (zh) | 2013-10-15 | 2013-10-15 | 重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法与应用 |
| PCT/CN2014/082031 WO2015055026A1 (zh) | 2013-10-15 | 2014-07-11 | 重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016118398A RU2016118398A (ru) | 2017-11-17 |
| RU2665802C2 true RU2665802C2 (ru) | 2018-09-04 |
Family
ID=49927016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016118398A RU2665802C2 (ru) | 2013-10-15 | 2014-07-11 | Слитый белок на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы и сывороточного альбумина человека, способ его получения, а также его применение |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160289280A1 (ru) |
| EP (1) | EP3034515B1 (ru) |
| JP (1) | JP6475698B2 (ru) |
| CN (1) | CN103524628B (ru) |
| AU (1) | AU2014336815B2 (ru) |
| CA (1) | CA2927632A1 (ru) |
| RU (1) | RU2665802C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015055026A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI608846B (zh) | 2014-03-13 | 2017-12-21 | 益生生技開發股份有限公司 | 用於改善化學治療所造成之不良副作用的組合療法 |
| CN107118263B (zh) * | 2017-04-08 | 2020-07-03 | 张喜田 | 重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用 |
| CN111484547B (zh) * | 2020-04-28 | 2022-09-20 | 上海市农业科学院 | 一种抗肿瘤蛋白ael1、融合蛋白和抗肿瘤制剂及应用 |
| CN112516288B (zh) * | 2020-12-22 | 2023-04-18 | 西藏阿那达生物医药科技有限责任公司 | N-糖基化修饰之灵芝免疫调节蛋白的应用 |
| WO2023016419A1 (zh) * | 2021-08-09 | 2023-02-16 | 长春钻智制药有限公司 | 重组灵芝免疫调节蛋白新突变体及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040063635A1 (en) * | 2002-07-01 | 2004-04-01 | Zailin Yu | Recombinant human albumin fusion proteins with long-lasting biological effects |
| RU2004117638A (ru) * | 2004-06-09 | 2005-11-20 | Институт цитологии и генетики Сибирского отделени Российской академии наук (СО РАН) (RU) | Состав, обладающий противоопухолевой, гепатопротекторной и иммуностимулирующей активностью |
| CN102274487A (zh) * | 2008-01-03 | 2011-12-14 | 张喜田 | 重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗化疗药所致白细胞减少症药物中的应用 |
| KR20120079492A (ko) * | 2010-12-06 | 2012-07-13 | 시티옌 쨩 | 재조합 영지버섯 면역조절 단백질 ｒＬＺ?８ 및 그의 용도 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8629096B2 (en) * | 2005-09-23 | 2014-01-14 | Yeastern Biotech Co., Ltd. | Compositions comprising fungal immunomodulatory protein and use thereof |
| CN101475632B (zh) * | 2008-01-03 | 2012-01-04 | 张喜田 | 具有抗肿瘤作用的重组灵芝免疫调节蛋白及其药物制剂 |
| CN101463089B (zh) * | 2009-01-08 | 2012-07-04 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用 |
| CN101612385B (zh) * | 2009-05-25 | 2012-06-20 | 张喜田 | rLZ-8在治疗血小板减少症中的应用及其制剂 |
| CN102199201B (zh) * | 2011-03-22 | 2013-05-01 | 上海交通大学 | 灵芝属内重组的真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用 |
| EP3290442A1 (en) * | 2011-11-04 | 2018-03-07 | Novartis AG | Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) half-life extender constructs |
-
2013
- 2013-10-15 CN CN201310479016.0A patent/CN103524628B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-07-11 EP EP14854197.2A patent/EP3034515B1/en not_active Not-in-force
- 2014-07-11 RU RU2016118398A patent/RU2665802C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-07-11 CA CA2927632A patent/CA2927632A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-11 US US14/914,258 patent/US20160289280A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-11 JP JP2016517518A patent/JP6475698B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-07-11 AU AU2014336815A patent/AU2014336815B2/en not_active Ceased
- 2014-07-11 WO PCT/CN2014/082031 patent/WO2015055026A1/zh active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040063635A1 (en) * | 2002-07-01 | 2004-04-01 | Zailin Yu | Recombinant human albumin fusion proteins with long-lasting biological effects |
| RU2004117638A (ru) * | 2004-06-09 | 2005-11-20 | Институт цитологии и генетики Сибирского отделени Российской академии наук (СО РАН) (RU) | Состав, обладающий противоопухолевой, гепатопротекторной и иммуностимулирующей активностью |
| CN102274487A (zh) * | 2008-01-03 | 2011-12-14 | 张喜田 | 重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗化疗药所致白细胞减少症药物中的应用 |
| KR20120079492A (ko) * | 2010-12-06 | 2012-07-13 | 시티옌 쨩 | 재조합 영지버섯 면역조절 단백질 ｒＬＺ?８ 및 그의 용도 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PUCHTA A. Et al. Factor VII retains function when fused to albumin orannexin V via a repeated activation site, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2009, V. 7, Iss. Supplement s2. * |
| YU DAN, Preliminary Study on Recombinant protein Ganoderma Lucidum Immunoregulatory (rLZ-8) anti-mouse ascites hepatoma cell line S1800 part of search, CHINA MASTER'S THESES FULL-TEXT DATABASE MEDICINE AND HEALTH SCIENCES, 2009, p. E072 - 131. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2014336815A1 (en) | 2016-04-07 |
| CN103524628A (zh) | 2014-01-22 |
| JP6475698B2 (ja) | 2019-02-27 |
| JP2016539080A (ja) | 2016-12-15 |
| WO2015055026A1 (zh) | 2015-04-23 |
| US20160289280A1 (en) | 2016-10-06 |
| EP3034515A1 (en) | 2016-06-22 |
| AU2014336815B2 (en) | 2016-11-10 |
| RU2016118398A (ru) | 2017-11-17 |
| EP3034515B1 (en) | 2018-08-29 |
| CA2927632A1 (en) | 2015-04-23 |
| EP3034515A4 (en) | 2016-11-16 |
| CN103524628B (zh) | 2015-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2665802C2 (ru) | Слитый белок на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы и сывороточного альбумина человека, способ его получения, а также его применение | |
| EP0486525B1 (en) | Stabilized protein or peptide conjugates | |
| KR100545720B1 (ko) | 당화된 면역글로불린 및 이를 포함하는 면역접합체 | |
| CN1280137A (zh) | 促红血球生成素偶联物 | |
| JP7153726B2 (ja) | Ｈｍ－３融合タンパク質及びその適用 | |
| CN109071678B (zh) | 神经生长因子融合蛋白、制备方法及其用途 | |
| CN106632682A (zh) | 融合蛋白ifn-elp及其应用 | |
| WO2021008454A1 (zh) | 基于铁蛋白重链亚基的药物载体 | |
| TWI579299B (zh) | 去整合蛋白變異體及其醫藥用途 | |
| JP2008543304A (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子イソ型（ＨｕｍａｎＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ＣｏｌｏｎｙＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒＩｓｏｆｏｒｍｓ） | |
| CN109111517B (zh) | 一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用 | |
| JP4004088B2 (ja) | 免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 | |
| EP3539570B1 (en) | Pegylated endostatin analogue and application thereof | |
| JPH0550273B2 (ru) | ||
| KR100521309B1 (ko) | 당쇄화된 인간 과립구 형성인자 | |
| EP2857417B1 (en) | Highly glycosylated long-acting human growth hormone protein and production method for same | |
| US7592309B2 (en) | Method of using a peptide having analgesic and antitumor activity from scorpion | |
| CA3139833A1 (en) | Il-2 mutant protein proliferating immune cells | |
| CN101880326B (zh) | 干扰素‑β复合物 | |
| KR100531670B1 (ko) | 인체 인터페론 알파의 제조방법 | |
| KR20040083268A (ko) | 안정성이 증가된 인간 과립구 콜로니 자극인자 융합체 및이의 제조방법 | |
| EP0331743B1 (en) | Protein derived from living body | |
| CN101017166A (zh) | 人rtn4b蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN1789284A (zh) | 人白细胞介素8拮抗蛋白及其制备方法 | |
| US20080171696A1 (en) | Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190712 |