KR20120079492A - 재조합 영지버섯 면역조절 단백질 ｒＬＺ?８ 및 그의 용도 - Google Patents

재조합 영지버섯 면역조절 단백질 ｒＬＺ?８ 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

재조합 영지버섯 면역조절 단백질(rLZ-8) 설계 박테리아를 효율적인 수준으로 발현시키는 방법을 제안한다; 수율을 향상시키고, 현재의 소규모 생산과 낮은 효율성과 같은 문제점을 극복하기 위해, 100 L 규모의 제조법과 정제 기술을 제공한다; 위상 조정용 결정에 존재하는 브롬 이온의 변칙 신호를 이용하여 단일변칙회절(SAD)에 의해 측정된, LZ-8의 1.8 Å X-레이 구조를 제공한다; rLZ-8의 항종양 효과 및 백혈구 증가 기능을 공표시킨다; 유세포 분석(flow cytometry assay)의 결과는 rLZ-8이 백혈병 세포 NB4, K562, 및 HL-60에 대해 강한 치사 효과를 가지고, 아폽토시스(apoptosis, 세포자살) 유세포 분석의 검출로 인해 rLZ-8이 생체외 조건에서 백혈병 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있음을 입증하였다; 용혈 실험, 흰쥐(rat) 골수 실험 및 에리트로포이에틴(erythropoietin) 응집 실험 모두에서, 정상 세포에 대한 영향이 없음을 확인하였다; 종양 함유 생쥐(tumor-bearing mice)에 대한 실험은 rLZ-8이 생체내 조건에서 에를리히 복수종 종양(Ehrlich ascites tumor) S180 및 H22 이식 간암 세포 성장을 억제할 수 있음을 보여주었다; 그리고, 형광 표지 분석은 rLZ-8이 종양 세포의 특이적 결합의 아폽토시스를 유도하여 종양 세포를 죽일 수 있음을 보여주었다.

Description

재조합 영지버섯 면역조절 단백질 ｒＬＺ?８ 및 그의 용도{RECOMBINANT GANODERMA LUCIDIUM IMMUNOMODULATORY PROTEIN RLZ-8 AND USES THEREOF}
본 발명은 항종양, 백혈구 증강, 및 면역 억제를 위한 재조합 영지버섯 면역조절 단백질의 의학적 용도를 포함하는 의용공학(biomedical engineering) 분야에 관한 것이다.
기존 연구들에 따르면, 영지버섯(Ganoderma Lucidum)에서 얻은 특정 종류의 단백질들이 제어, 적혈구 응집, 부착 분자의 유전자 조절, 알레르기 반응 억제 및 면역성 항종양 효과를 포함하는 광범위한 면역조절 활성을 나타낸다.
1989년에 일본인 키노 등은 영지 균사체 추출물로부터 작은 분자의 단백질을 분리 및 정제하였고(Kohsuke Kino 등, J. Bio. Chem. 1989, 1:472-478), 상기 단백질을 LZ-8로 명명하였다. LZ-8의 아미노산 배열 및 면역의 생리활성도 테스트하였으며, 그 결과에 따르면 LZ-8 단백질의 배열은 110개의 아미노산 잔기들로 구성되고, 분자량이 12.4 KD이며, 등전점이 4.4이다.
LZ-8의 결정 구조는 이미 공지되어 있으며, 그 주요한 특징들은 하기와 같다: LZ-8의 결정 구조는 2.8 Å 해상도(resolution)로 해석(solve)되었다. 상기 결정은 P212121 공간군에 속하며, 단위 격자는 a=33.19 Å, b=86.99 Å, c=92.13 Å, 그리고 α=β=γ=90°이다. LZ-8의 전체 구조는 N-말단의 이량화 도메인과 C-말단의 FNIII 도메인으로 이루어진다. 상기 N-말단의 도메인은 도메인 교환을 통한 이량화 반응을 지속하여 이량체 구조를 유지하고 덤벨 형태의 이량체를 생성하는 α-헬릭스 및 β-스트랜드로 구성된다. 상기 C-말단의 FNIII 도메인은 면역글로블린 비슷한 β-샌드위치 구조에 속하고, β-스트랜드들 A-B-E 및 G-F-C-D 각각에 의해 형성된 두 장의 베타-시트들(I 및 II)의 샌드위치를 포함하며, β-스트랜드의 아미노산 배열은 다음과 같다: A. 21-TPNWGRG-27; B. 34-IDTVTFP-39; C. 48-YTYRVAV-54; D. 57-RNLGVKP-63; E. 72-SQKVN-76; F. 91-TIQVFVVDPD-100; G. 102-NNDFIIAQW-110. (도 13의 아미노산 서열 참조)
재조합 인간 과립구 집락자극인자(G-CSF)는 암환자들이 화학요법 후에 호중구 감소증으로부터의 회복을 촉진시키기 위해 사용되는 유일한 임상 유전자 공학 제제로서, 고강도의 치료법을 허용한다.
수년간 환자들이 임상에서 사용하였기에 G-CSF의 효능은 입증되었지만, 그것의 모든 제품들에는 하기와 같은 거부반응이 명시되어 있다: "여러분과 여러분의 자녀가 경험할 수 있는 일반적인 부작용은 뼈와 근육의 통증, 발열, 피부 발진, 구역질입니다. 심각한 알레르기성 반응도 발생할 수 있으며, 이러한 반응들은 전신 발진, 호흡 곤란, 천명(wheezing), 혈압 강하, 입 또는 눈 주위의 부기(swelling), 심박 급속증, 또는 발한을 초래할 수 있습니다".
영지버섯 면역 조절 단백질의 주요 기능은 말초 림프구 및 비장 세포의 증생(hyperplasia)을 자극하고, 인간과 동물 모두의 대식 세포가 인터류킨(interlukin), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor) 및 인터페론(interferon) 등과 같은 다양한 세포 인자들을 분비하게 하고, 원인 인자의 침입을 막아 건강을 지키고, 면역 조절 기능을 얻는 데 있다. 본 발명은 rLZ-8이 전신 알레르기 반응 및 장기 이식 후의 면역 거부반응을 효과적으로 방지할 수 있음을 제안한다.
본 출원인은 다음과 같은 rLZ-8에 관한 연구들을 수행하였다.
rLZ-8 설계 박테리아를 효율적인 수준으로 발현시키는 방법을 제안한다; 수율을 향상시키고, 현재의 소규모 생산과 낮은 효율성과 같은 문제점을 극복하기 위해, 100 L 규모의 제조법과 정제 기술을 제공한다; 위상 조정용 결정에 존재하는 브롬 이온의 변칙 신호를 이용하여 단일 변칙 회절(single anomalous diffraction, SAD)에 의해 측정된, LZ-8의 1.8 Å X-레이 구조를 제공한다; rLZ-8의 항종양 효과 및 백혈구 증가 기능을 공표시킨다; 유세포 분석(flow cytometry assay)의 결과는 rLZ-8이 백혈병 세포 NB4, K562, 및 HL-60에 대해 강한 치사 효과를 가지고, 아폽토시스(apoptosis, 세포자살) 유세포 분석의 검출로 인해 rLZ-8이 생체외 조건에서 백혈병 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있음을 입증하였다; 용혈 실험, 흰쥐(rat) 골수 실험 및 에리트로포이에틴(erythropoietin) 응집 실험 모두에서, 정상 세포에 대한 영향이 없음을 확인하였다; 종양 함유 생쥐(tumor-bearing mice)에 대한 실험은 rLZ-8이 생체내 조건에서 에를리히 복수종 종양(Ehrlich ascites tumor) S180 및 H22 이식 간암 세포 성장을 억제할 수 있음을 보여주었다; 그리고, 형광 표지 분석은 rLZ-8이 종양 세포의 특이적 결합의 아폽토시스를 유도하여 종양 세포를 죽일 수 있음을 보여주었다.
재조합 LZ-8은 여러 가지 원인의 백혈구 감소증을 치료 및 예방하는데 매우 효과적이었고, 전신 알레르기 반응 및 장기 이식 후의 면역 거부반응을 효과적으로 방지할 수 있다.
본 발명의 결과에 따르면, 재조합 LZ-8은 여러 가지 원인의 백혈구 감소증을 치료 및 예방하는데 매우 효과적이었고, 투약량, 효능 및 임상 거부반응에 있어서 현존하는 모든 임상 약품들보다 더 우수함을 보여주었다. 동물 실험에서 재조합 LZ-8의 부작용은 G-CSF의 부작용보다 훨씬 더 낮은 결과를 보여주었다.
LZ-8에 관한 종래 연구에 따르면, LZ-8은 면역 조절 경로를 통해 종양 세포를 사멸시키는 것으로 제안하고 있으나, 본 발명의 출원인들은 rLZ-8이 간접 면역 조절 경로보다는 오히려 직접적으로 HL-60, NB4 및 K562 종양 세포들을 사멸시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
도 1은 재조합 LZ-8(rLZ-8)의 결정 구조이다. 남색, 황색 두 가지 색깔은 각각 하나의 rLZ-8 개체를 나타낸다. A, B, C, D, E, F 및 G 는 각각 일곱 개의 β-strand를 나타낸다. C-term과 N-term은 각각 rLZ-8의 C- 말단과 N-말단을 나타낸다.
도 2는 생체외 조건에서 NB4 종양 세포에 대한 rLZ-8의 결과물이다. A는 정상 대조 그룹, B는 양성 약물 대조 그룹, C 내지 J는 각각 순서대로 rLZ-8를 0.78 ug?ml-1，1.56 ㎍?㎖-1，3.125 ㎍?㎖-1，6.25 ㎍?㎖-1，12.5 ㎍?㎖-1，25 ㎍?㎖-1，50 ㎍?㎖-1，100 ㎍?㎖-1 투여한 그룹이다.
도 3은 생체외 조건에서 K562 종양 세포에 대한 rLZ-8의 결과물이다. A는 정상 대조 그룹, B는 양성 약물 대조 그룹, C 내지 H는 각각 순서대로 rLZ-8를 3.125 ㎍?㎖-1，6.25 ㎍?㎖-1，12.5 ㎍?㎖-1，25 ㎍?㎖-1，50 ㎍?㎖-1，100㎍?㎖-1 투여한 그룹이다.
도 4a는 PI 단일 염색 테스트에서 K562 세포들의 rLZ-8-유도성 아폽토시스(apoptosis)를 나타낸 결과이다. C1은 K562 정상 대조 그룹, I1은 rLZ-8 투약량 그룹(K562，0.1 ㎍/㎖）, I2는 rLZ-8 투약량 그룹(K562，0.5 ㎍/㎖), I3는 rLZ-8 투약량 그룹(K562，2.5 ㎍/㎖) 이다.
도 4b는 PI 단일 염색 테스트에서 NB4 세포들의 rLZ-8-유도성 아폽토시스를 나타낸 결과이다. C2는 NB4 정상 대조 그룹, I1은 rLZ-8 투약량 그룹（NB4，0.1 ㎍/㎖）, I2는 rLZ-8 투약량 그룹 （NB4，0.5 ㎍/㎖), I3는 rLZ-8 투약량 그룹（NB4，2.5 ㎍/㎖）이다.
도 5a는 Annexin V/PI 이중 염색 테스트에서 NB4 세포들의 rLZ-8-유도성 아폽토시스를 나타낸 결과이다. C1은 NB4 정상 대조 그룹, P1은 양성 약물 그룹, I1은 rLZ-8 투약량 그룹（NB4，0.1 ㎍/㎖）, I2는 rLZ-8 투약량 그룹（NB4，0.5 ㎍/㎖）, I3는 rLZ-8 투약량 그룹（NB4，2.5 ㎍/㎖）이다.
도 5b는 Annexin V/PI 이중 염색 테스트에서 HL60 세포들의 rLZ-8-유도성 아폽토시스를 나타낸 결과이다. C2은 HL-60 정상 대조 그룹, P2는 양성 약물 그룹, H1은 rLZ-8 투약량 그룹（HL-60，0.1 ㎍/㎖）, H2는 rLZ-8 투약량 그룹（HL-60，0.5 ㎍/㎖）, H3는 rLZ-8 투약량 그룹（HL-60，2.5 ㎍/㎖）이다.
도 6은 접종한 S180 에를리히 복수종 종양 세포(S180 Ehrlich ascites tumor cells)들과 생쥐의 체중 변화를 도시한 것이다.
도 7은 접종한 H22 종양 세포들과 생쥐의 체중 변화를 도시한 것이다.
도 8은 FITC-rLZ-8(100 ng?㎖-1)의 흰쥐 심근 조직 표지자 실험결과(dark, DIC field)(DF, BF)이다.
도 9는 FITC-rLZ-8(100 ng?㎖-1)의 토끼 연골세포 표지자 실험결과(dark, DIC field)(DF, BF) 이다.
도 10은 FITC-rLZ-8(100 ng?㎖)의 HL-60 세포 표지자 실험결과(dark, DIC field)(DF, BF)이다.
도 11은 rLZ-8의 영향을 받은 흰쥐의 척수조영술 결과이다. A는 정상 대조 그룹, B는 rLZ-8 투약 그룹（15 ㎎?㎏-1）, C는 rLZ-8 투약 그룹（30 ㎎?㎏-1), D는 rLZ-8 투약 그룹（60 ㎎?㎏-1）이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 rLZ-8의 염기서열 목록이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 rLZ-8 단백질의 아미노산 서열목록이다.
본 발명은 항종양, 백혈구 증강 및 면역 억제를 위한 재조합 영지버섯 면역조절 단백질의 의학적 용도를 포함하는 의용공학(biomedical engineering) 분야에 관한 것이다. 본 발명에서, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 유전자 암호 선호성 때문에, 최초의 영지버섯 면역 조절 단백질 유전자 서열에 기반한 LZ-8 전체 유전자 합성 인코딩 서열을 재설계하여, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 재조합 LZ-8(rLZ-8)을 발현시킨다(도 12 및 도 13 참조).
이러한 독특함의 구조적 원리를 규명하기 위해, LZ-8의 결정 구조는 X-레이 회절로 해석하였다. 현적 증기 확산법(hanging drop vapor diffusion method)을 이용하여 289K에서 상기 결정을 성장시켰고, 배양 조건은 1.75 M 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 0.1 M Tris-HCl, pH 6.0 및 6.4% 폴리에틸렌 글리콜 400(polyethylene glycol 400)이다. rLZ-8의 X-레이 회절 데이타를 1.80 Å 해상도에서 수집하였고, 상기 데이타를 MOSFLM11 프로그램으로 가공처리하여, SCALA12 및 CCP4. omain으로 측정하였다. 상기 N-말단 도메인은 도메인 교환을 통한 이량화 반을을 지속하여 이량체 구조를 유지하고 덤벨 형태의 이량체를 형성하는α-헬릭스 및 β-스트랜드로 구성된다. 상기 C-말단의 FNIII 도메인은 면역글로블린 비슷한 β-샌드위치 구조에 속하고, 두 장의 β-시트들(I 및 II)의 샌드위치 구조를 포함한다.
생체외 항종양 분석에서, K562 및 NB4 세포 각각을 24-오리피스 접시(24-orifice plate)에서 혼합하고, rLZ-8을 각기 다른 농도로 공급한 뒤, rLZ-8의 유의적 직접 세포독성 효과를 MTT로 검사하고 현미경하에서 관찰하였다. 생체내 종양 억제 분석에서, rLZ-8 치료 그룹들 각각에 10일간 연속해서 꼬리 정맥 주사로 투약하였다. 투약 전후로 각각 10일간 눈 정맥총으로부터 혈액을 뽑고, 백혈구(WBC) 수를 테스트하였다. 투약 종료 다음날, 모든 생쥐들을 경추 탈골로 죽여서 해부하고, 종양을 꺼내서 그 무게를 측정한 뒤, 억제율을 계산하였다. rLZ-8의 실험 투약량은 생체내 및 생체외 조건에서 매우 효과적인 항종양 활성을 가짐을 보여주였다.
본 발명에서, 플루오로크롬(Fluorchrome, 플루오레세인-5-이소티오시아네이트, Fluorescein-5-Isothiocyanate, FITC)를 사용하여 rLZ-8를 표지하여 FITC-rLZ-8을 형성한 후, 이를 HL60 세포, 흰쥐(rat) 심근 조직 및 토끼 연골 세포로 해치(hatch)하였으며, 세포들을 수거하여 세척하였으며, 이후 FITC-rLZ-8와 함께 1시간 및 6시간 배양하여 형광 현미경하에서 관찰하면, 강한 녹색 형광을 갖는 HL-60 세포는 흰쥐(rat) 심근 조직과 토끼 연골 세포와 비교할 때, 유의적 차이가 있다. 이러한 결과는 특정 수용체가 rLZ-8에 의해 인식될 수 있음을 보여준다. rLZ-8의 C-말단의 FNIII 도메인 상에 당사슬 결합 자리(carbohydrate chain binding site)가 2개 있고, 정상 세포의 표면 상에서는 어떠한 올리고당 결합들이 결코 발견되지 않기 때문에, 상기 인식 메카니즘이 HL-60 세포 표면상의 올리고당 결합과 관련이 있다는 것으로 추론할 수 있다. 이를 근거로 하여, 본 발명은 rLZ-8의 특이적 사멸 효과가 세포 표면상의 수용체를 인식하는 것과 관련이 있을 수 있다는 것을 제안하였다.
항종양 메카니즘을 더 연구하기 위해, 요오드화 프로피디움(propidium iodode, PI) 염색 및 ANNEXIN V&FITC 염색을 이용하여 rLZ-8 처리 K562 및 HL60 세포들의 아폽토시스 비율을 유세포분석기로 측정하였고, 그 결과로부터 세포의 아폽토시스는 rLZ-8이 종양 세포들을 죽이는 방법들 중 하나라는 결론을 이끌어냈다.
본 발명은 rLZ-8이 백혈구 감소증의 예방 및 치료에서 약간의 효과를 가짐을 밝혀냈다. "저-인터류킨 흰쥐(low-interleukin rat) 모델에 대한 rLZ-8의 효과" 분석에서, 성공적인 모델링 후에 각 투약량의 rLZ-8 및 양성 약물(Genlei™ Scimax™) 치료를 상기 그룹들에게 제공하였고, 정상 대조 그룹과 CP 그룹들에게는 동일하게 일반 식염수를 제공하였다. 치료 3일째, 7일째 및 14일째에 흰쥐 꼬리로부터 정맥혈을 각각 뽑아 백혈구 수를 테스트하였다. 약 효능을 분석하기 위해 치료 전과 후의 백혈구 변화를 비교하였다. 상기 CP 그룹과 비교했을 때, 치료 3일째에 rLZ-8 약물 그룹의 흰쥐에서 백혈구가 유의적으로 더 높았고, 그 차이는 매우 유의적이며, 치료 7일째에는 정상이 되었다.
방사선에 의한 백혈구 감소증의 생쥐(mice) 모델 치료에서, 상기 생쥐들에게 7.5 Gy의 감마선(γ-ray, 180 mV, 15mA)을 조사한 후, 이들을 7개 그룹(n=10)으로 나누었다. 모델링과 더불어, 각 그룹의 생쥐들에게 9일간 Genlei™ Scimax™ 과 rLZ-8를 투여하고, 5일째, 7일째 및 9일째에 꼬리에서 혈액을 뽑아 백혈구 수를 테스트하고, 비장의 무게를 측정하여 비장 지수를 계산하였다. 상기 백혈구 감소증의 예방 분석에서도 동일한 방법을 사용하였고, 대조 그룹을 제외한 각 그룹은 사전 투약을 받았다. 상기 두 분석 결과에 따르면, rLZ-8는 방사선에 의한 백혈구 감소증을 예방 및 치료할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 rLZ-8이 용혈 반응, 응고 및 흰쥐(rat)의 척수조영술에 비정상적인 영향을 미칠 수 없다는 것을 입증하였다. 본 발명은 rLZ-8이 BSA에 의해 자극된 흰쥐(rat)의 전신 알레르기 반응을 치료하기 위해 면역억제인자로서 사용될 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명은 약학 제제의 rLZ-8 핵심 성분들이 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 및 허용가능한 임의의 약학 보조제를 함유한다는 것을 포함한다. rLZ-8 약학 제제는 경구 전달체 및 비-장내(non-intestinal) 약물 전달체일 수 있다.
[ 실시예 1]
재조합 영지버섯 면역조절 단백질의 획득
1.1 합성 rLZ-8 유전자, 설계 박테리아의 구조, 스크리닝
피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 유전 코드 선호성 때문에, 최초의 영지버섯 면역 조절 단백질 유전자 서열에 기반한 LZ-8 전체 유전자 합성 인코딩 서열을 재설계하였고, 효모 α-인자 선도 펩티드 코딩 서열(yeast α-factor leader peptide)과 연결되어 융합 유전자가 되며, α-LZ-8 유전자를 pMD18-T 운반체로 복제한 뒤, 올바른 유전자 배열의 운반체들을 선형화하여 효소 유전자 게놈으로 이식하였고, MM 및 MD 접시에서 고효율의 Mut+ 염색약을 사용함으로써 메탄올 스크리닝하였다.
1.2 rLZ-8 설계 박테리아의 발현
발효 규모, 온도, 회전 속도, pH 값, 액체 부피, 메탄올의 보충 및 기타 검출물 등을 이용하여, 100 L 발효기 규모의 발현 rLZ-8 조건에서 효소의 최적화 공정을 확립하였다. 본 출원인들은 rLZ-8의 물리 및 화학적 성질들에 따라 실험 발효 배지 방식을 설계하였다. 상기 rLZ-8 생산량은 약 800 ㎎?L-1이다.
1.3 rLZ-8의 정제 공정
발효 브로스(broth) 원심 분리기 → 상층액 튜브 분리기 → 한외여과 → 양이온 교환 칼럼 정제 → 목적(target) 단백질 제조용 AKTA 단백질 정제 워크스테이션 → 강 음이온 교환 크로마토그래피 정제 → 소수성 상호작용 칼럼 → 겔 여과 크로마토그래피
1.4 RLZ-8 순도 및 분자량 측정
RP-HPLC를 이용한 분리 및 정제의 순도 분석에서 rLZ-8의 순도는 > 99%이다. 재조합 rLZ-8 발현물의 분자량은 레이저-비행 질량 분석(laser-flight mass spectrometry)에서 12,722 Da이다.
1.5 rLZ-8 고차원 공간 구조 측정
부유 증기 확산법(suspension vapor diffusion method)을 이용하여 0.2cm × 0.2cm × 0.2cm의 단결정을 얻었다. MacChessF2 빔라인에서 셀레늄 결정들은 1.8 Å 해상도 결정 회절 데이타를 얻었다. 비-셀레늄 모결정은 MarResearch 345dtd 영상 일반 회절 데이타 수집 시스템 상에서 1.8 Å 해상도 결정 회절 데이타를 얻었다. 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8의 서브 유닛의 단량체 구조는 α-헬릭스, β-스트랜드 및 2장의 β-시트들로 구성된다.
[ 실시예 2]
인간 전골수구성 백혈병 NB4 세포들에 대한 rLZ -8의 사멸 효과
여과 및 제균 후, IMDM 배양 배지를 이용하여 각각 0.78 ug?ml-1, 1.56 ug?ml-1, 3.125 ug?ml-1, 6.25 ug?ml-1, 12.5 ug?ml-1, 25 ug?ml-1, 50 ug?ml-1, 100 ug?ml- 1 인 8개의 농도를 제조하였다.
96-오리피스 배양 배지 접시(96-orifice culture medium plate)에는 실험 오리피스에 NB4 종양 세포 0.1 ml와 저농도에서 고농도에 이르는 rLZ-8 0.1 ml를 혼합하고; 음성 대조 그룹의 경우에는 NB4 종양 세포와 배양 배지 각각 0.1 ml를 혼합하고; 양성 약물 대조 그룹의 경우에는 삼산화 비소(As2O3)를 혼합하고; 각 그룹에 6-개구 다중 천공(six-aperture multipunches)을 만든다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 48 시간 놓아둔 뒤, 종료 4시간 전에 MTT 15 ul(5mg?ml-1)를 첨가하고 나서, 0.1 mol?L-1의 염산이소프로필알콜(hydrochloric acid isopropyl alcohol) 100 ul를 첨가하여 세포 배양을 종료한 후, 효소-결합 면역 흡착에서 OD570nm 값을 테스트하였다.
표 1 및 도 1에 따르면, OD570nm 광학 흡수값에서 rLZ-8 약물 그룹과 NB4 정상 대조 그룹은 유의적 차이가 있고, rLZ-8이 생체외 조건에서 NB4 종양 세포에 대해 강한 치사 효과를 가짐을 보여준다.
Figure pat00001

[ 실시예3 ]
인간 만성 골수성 백혈병 K562 세포에 대한 rLZ -8의 치사 효과
rLZ-8을 살균한 후, IMDM 배양 배지를 이용하여 3.125 ug?ml-1, 6.25 ug?ml-1, 12.5 ug?ml-1, 25 ug ml-1, 50 ug?ml-1, 100 ug?ml- 1 인 6개 농도의 rLZ-8 시료들을 제조하였다.
96-오리피스 배양 배지 접시(96-orifice culture medium plate)에는 실험 개구(pilot aperture) 이외에 K562 종양 세포 0.1 ml와 저농도에서 고농도에 이르는 rLZ-8 0.1 ml를 혼합하고; 음성 대조 그룹의 경우에는 K562 종양 세포와 배양 배지가 각각 0.1 ml를 혼합하고; 양성 약물 대조 그룹의 경우에는 삼산화 비소(As2O3)를 혼합한다; 각 그룹에 6-개구 다중 천공(six-aperture multipunches)을 만든다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 48시간 두고, 종료 4시간 전에 MTT 15 ul(5 mg?ml-1)를 첨가하고 나서, 0.1 mol?L-1의 염산이소프로필알콜 100 ul를 첨가하여 세포 배양을 종료한 후, 효소 면역 흡착제 검출기상에서 OD570nm 값을 테스트하였다.
표 2와 도 3에 따르면, OD570nm 광학 흡수값에서 rLZ-8 약물 그룹과 K562 정상 대조 그룹이 유의적 차이가 있고, 이것은 rLZ-8이 생체외 조건에서 K562 종양 세포에 대해 강한 치사 효과를 가짐을 보여준다.
Figure pat00002

[ 실시예 4]
혈액 종양 세포의 세포자살에 대한 rLZ -8의 영향
1. PI 단일 염색된 유세포 분석
형광 현미경(모델명 Leica ASLMD), K562 및 NB4를 사용하였다. rLZ-8을 고, 중 및 저의 3개 투약량 그룹으로 각각 분류한 뒤, 2% FCS를 함유하는 IMDM 배양 배지를 이용하여 2.5 ug?ml-1, 0.5 ug?ml-1 및 0.1 ug?ml-1의 rLZ-8 제제들을 제조하였다. 브롬화 프로피디움(PI, Propidium bromide)의 농도는 50 ug?ml-1이다.
K562 세포들은 정상 대조 그룹, rLZ-8 저-투약량 그룹(0.1 ug?ml-1), rLZ-8 중-투약량 그룹(0.5 ug?ml-1) 및 rLZ-8 고-투약량 그룹(2.5 ug?ml-1)으로 정한다. NB4 세포들은 정상 대조 그룹, rLZ-8 저-투약량 그룹(0.1 ug?ml-1), rLZ-8 중-투약량 그룹(0.5 ug?ml-1), rLZ-8 고-투약량 그룹(2.5 ug?ml-1)으로 정한다.
K562와 NB4 세포들 각각을 24-오리피스 접시(24-orifice plate)에서 혼합하고, 여러 농도의 rLZ-8을 각 오리피스당 1 ml의 분량(1 ml/orifice)으로 공급하며, 각 그룹에 3-오피리스 다중 천공(3-orifice multipunches)을 만든다. 이들을 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에 24시간 놓아 두고, 각 농축물로부터 세포들을 수거하여 PBS로 2회 세척한 후, 세포 밀도를 1×106/ml로 조절한 다음, 70% 에탄올 속에 냉장상태(-20 ℃)로 밤새 보관하였다. 상기 세포를 고정시킨 후에 PBS로 2회 세척하고, 실온에서 PI(최종 밀도 50 ug?ml-1)를 첨가하고, 10분간 배일성 해칭(lucifuged hatching)시키고, 1000 rpm?min-1의 속도로 5분간 원심분리한 후, 일회성의 400 ul PBS로 상층액을 제거하고 재현탁시켜 침전시켰다. 그리고 1시간 후에 컴퓨터로 테스트하였다.
표 3과 도 4에 따르면, K562 및 NB4 정상 대조 그룹과 비교시, rLZ-8 약물 대조 그룹의 아폽토시스(apoptosis)비율이 증가함을 보여주는데, 이것으로부터 세포의 아폽토시스가 rLZ-8이 종양 세포를 죽이는 방법들 중 하나라는 결론을 이끌어 낼 수 있다.
Figure pat00003

2. Annexin V- FITC 유세포 분석 키트의 세포 아폽토시스 ( apoptosis ) 테스트
FACS 칼리버 유세포 분석기(미국 Becton-Dickinson Company 제품), NB4 및 HL-60을 사용하였다. 2% FCS를 함유하는 IMDM 배양 배지를 사용하여 0.1 ug?ml-1, 0.5 ug?ml-1, 2.5 ug?ml-1 농도의 rLZ-8 제제들을 제조하고, 삼산화비소(As2O3) 0.5 ug?ml-1, AnnexinV-FITC 키트, 완충 용액 4×, 요오드화 프로피디움 용액(PI) 20 ug?ml-1 0.2 ml, 재조합 인간 Annexin V/FITC 0.1ml를 사용하였다.
NB4 세포들은 정상 대조 그룹, 양성 약물 그룹(As2O3 0.5 ug?ml-1), 단백질 저-투약량 그룹(0.1 ug?ml-1), 중-투약량 그룹(0.5 ug?ml-1), 고-투약량 그룹(2.5 ug?ml-1)으로 정한다. 그리고, HL-60 세포들은 정상 대조 그룹, 단백질 저-투약량 그룹(0.1 ug?ml-1), 중-투약량 그룹(0.5 ug?ml-1), 고-투약량 그룹(2.5 ug?ml-1)으로 정한다.
NB4와 HL-60 세포를 24-오리피스 접시(24-orifice plate)에서 혼합하고, 다양한 농도의 rLZ-8를 1 ml/hole의 분량으로 공급하며, 각 그룹에 3-오리피스 다중 천공(3-orifice multipunches)을 만든다. 이들을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 24시간 동안 넣어둔 뒤, 각 농축물의 세포들을 수거하여 미리 냉각한 PBS(4℃)로 상기 세포들을 2회 세척한 후, 250 ul의 결합 완충 용액(binding buffer soultion)으로 상기 세포들을 재현탁화하여 세포 밀도를 1×106?ml로 조절한 후, 100 ul를 5 ml 유관으로 꺼내고, 뒤이어 Annexin V/FITC 5 ul 및 20 ug?ml-1 PI 용액 10 ul를 첨가하여 혼합한 후, 이를 실온에 방치하고 15분간 배일성 해칭(lucifuged hatching)을 한 다음, 유세포 분석으로 PBS 400 ul를 첨가한다.
도 5 및 표 4에 따르면, NB4-rLZ-8 그룹과 HL-60-rLZ-8 그룹의 아폽토시스 비율이 정상 대조 그룹보다 유의적으로 더 높고, HL-60-rLZ-8 그룹의 아폽토시스 또한 rLZ-8 농도 증가에 따라 증가함을 보여준다.
Figure pat00004

[ 실시예 5]
생쥐 S180 에를리히 복수종 종양에 대한 rLZ -8의 억제 효과
생쥐(mice, 18-22g)들을 지린 대학교 동물 연구소(Jilin University Laboratory Animal center)에서 제공받아 수컷과 암컷의 수가 동일하게 배분하고, 생쥐 에를리히 복수종 세포 균주(Mice Ehrich ascites cells strain)는 본 연구소에서 제공되는 S180을 사용하였으며, 시클로포스파미드(cyclophosphamide, CTX)는 장쑤 헝루이 의약 주식회사(Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.)의 제품으로, 제품 번호가 06101921이다. S180 복수종 종양과 고형 종양의 실험 그룹을 정상 대조 그룹, 음성 대조 그룹, 양성 대조 그룹, rLZ-8 저-투약량 치료 그룹(0.25 mg?kg-1), rLZ-8 중-투약량 치료 그룹(0.5 mg?kg-1), rLZ-8 고-투약량 치료 그룹(1 mg?kg-1)으로 나누었다. 각 그룹당 10 마리의 생쥐를 할당하였다.
잘 자란 S180 세포들을 선택하고, 이들을 살균 식염수로 적당하게 희석하여 세포수 107?L-1의 종양 세포 현탁액을 얻고, 이를 각 생쥐의 오른쪽 겨드랑이에 0.2 ml의 양으로 피하 접종하였다(단, 정상 대조 그룹은 제외한다). 접종 24시간 후에 치료를 실시하였다. 정상 대조 그룹과 음성 대조 그룹에게는 개체당 하루에 식염수 0.2 ml(0.2 ml?each-1?d-1)를 복강내 주사 투여하고, 양성 대조 그룹에게는 kg당 시클로포스파미드 20 mg(20 mg?kg-1)를 개체당 하루에 0.2 ml(0.2 ml?each-1?d-1)로 복강내 주사 투여하였다. rLZ-8 치료 그룹들에게는 각 투약량을 개체당 하루에 0.2 ml(0.2 ml?each-1?d-1)로 10일 연속해서 꼬리 정맥 주사 투여하였다. 약물 치료 10일 전과 후에 각각 눈 정맥총으로부터 혈액을 뽑아낸 후, 이 혈액들을 지린 대학교 제1병원 임상 연구소(Jilin University No 1 Hospital clinical laboratory)에 보내서 백혈구 수를 테스트 및 분석하였다. 약물 투여 종료 다음날, 모든 생쥐들을 경추 탈골로 죽여서 해부하고, 종양을 꺼내서 종양 무게를 측정하고, 하기 식을 이용하여 억제율을 계산한다:
억제율(%) = (대조 그룹의 평균 종양 무게 - 실험 그룹의 평균 종양 무게)/대조 그룹의 평균 종양 무게 × 100%
잘 자란 S180 세포들을 선택하고, 이들을 살균 식염수로 적당하게 희석하여 세포수 107?L-1의 종양 세포 현탁액을 얻고, 이 현탁액 0.2 ml를 각 생쥐의 복강내 접종을 하였다(단, 정상 대조 그룹은 제외한다). 접종 24시간 후에 치료를 실시하였다. 정상 대조 그룹과 음성 대조 그룹에게는 개체당 하루에 식염수 0.2 ml(0.2 ml?each-1?d-1)를 복강내 주사 투여하고, 양성 대조 그룹에게는 kg당 시클로포스파미드 20 mg(20 mg?kg-1)를 개체당 하루에 0.2 ml(0.2 ml?each-1?d-1)로 복강내 주사 투여하였다. rLZ-8 치료 그룹들에게는 각 투약량을 개체당 하루에 0.2 ml(0.2 ml?each-1?d-1)로 10일 연속해서 꼬리 정맥 주사 투여하였다. 매일 체중을 측정하여 생쥐의 체중 변화를 관찰하고, 체중 증가 곡선을 그렸다.
표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 3개 투약량의 rLZ-8은 S180의 성장을 억제할 수 있고, 억제율은 16.8%, 25.7% 및 45.5%이다. rLZ-8 치료 그룹의 종양 무게는 상기 음성 대조 그룹과 비교할 때 매우 유의적인 차이(p<0.01)가 있다.
표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 약물 치료 전 생쥐의 백혈구 수는 모든 그룹에 있어 동일한 수준이었고, 음성 대조군과 비교했을 때 차이를 보여주지 않았다(p>0.05). 치료 10일 후, 상기 음성 대조 그룹의 백혈구 수는 정상 대조 그룹, rLZ-8 저-투약량 그룹 및 rLZ-8 중-투약량 그룹의 백혈구 수보다 더 높았으며, 음성 대조 그룹은 차이를 보여주지 않았고(p>0.05), 고-투약량 그룹과 정상 대조 그룹도 차이가 없었으며(p>0.05), 양성 대조 그룹의 백혈구 수는 유의적으로 감소하였고, 정상 대조 그룹 및 음성 대조 그룹을 비교하였을 때, 큰 차이가 있었다(p<0.01).
Figure pat00005

Figure pat00006

S180 복수종 종양 억제 실험 결과:
본 실험 결과에 따르면, 모든 그룹들에서 생쥐 복수종이 기본적으로 동일한 시기에 나타났고, 음성 대조 그룹의 생쥐 체중은 급격하게 증가하였으나, 생존 시간은 감소하였다. 도 6으로부터, rLZ-8 그룹 내 생쥐들의 평균 체중은 상기 정상 그룹보다 증가하는 경향을 보이나, 상기 음성 대조 그룹보다는 비교적 더 작음을 알 수 있었다. 이는 rLZ-8이 어느 정도 생쥐의 복막 S180 종양 세포 성장을 억제하였음을 나타낸다.
[ 실시예 6] rLZ -8의 생쥐 간암 세포 H22 억제 실험
생쥐(mice, 18-22g)들을 지린 대학교 동물 연구소(Jilin University Laboratory Animal center)에서 제공받아 수컷과 암컷의 수가 동일하게 배분하였다. 우리 연구소에서 제공되는 생쥐 간암 세포 균주 H22를 사용하였으며, 시클로포스파미드(CTX)는 장쑤 헝루이 의약 주식회사(Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd.)의 제품으로, 제품 번호가 06101921이다.
H22 간암 세포의 실험 그룹은 정상 대조 그룹, 음성 대조 그룹, 양성 대조 그룹, rLZ-8 저-투약량 치료 그룹(0.25 mg?kg-1), rLZ-8 중-투약량 치료 그룹(0.5 mg?kg-1), rLZ-8 고-투약량 치료 그룹(1 mg?kg-1)으로 나누었다. 각 그룹당 10 마리의 생쥐를 할당하였다.
H22 피하 종양 억제 실험 방법:
잘 자란 H22 세포들을 선택하고, 살균 식염수로 적당하게 희석하여 세포수 107?L-1의 종양 세포 현탁액을 얻고, 이 현탁액 0.2 ml를 각 생쥐의 오른쪽 겨드랑이에 피하 접종하였다(단, 정상 대조 그룹은 제외한다). 접종 24시간 후에 치료를 실시하였다. 정상 대조 그룹과 음성 대조 그룹에게는 개체당 하루에 식염수 0.2 ml를 복강내 주사 투여하고, 양성 대조 그룹에게는 kg당 시클로포스파미드 20 mg(20 mg?kg-1)를 개체당 하루에 0.2 ml(0.2ml?each-1?d-1)로 복강내 주사 투여하였다. rLZ-8 치료 그룹들에게는 각 투약량을 개체당 하루에 0.2 ml(0.2 ml?each-1?d-1)로 10일 연속해서 꼬리 정맥 주사 투여하였다. 약물 치료 10일 전후에 각각 눈 정맥총으로부터 혈액을 뽑아낸 후, 이 혈액들을 지린 대학교 제 1 병원 임상 연구소(Jilin University No. 1 Hospital clinical laboratory)에 보내서 백혈구 수를 테스트 및 분석하였다. 약물 투여 종료 다음날, 모든 생쥐들을 경추 탈골로 죽여서 해부하고, 종양을 꺼내서 무게를 측정하고, 하기 식을 이용하여 억제율을 계산하였다:
억제율(%) = (대조 그룹의 평균 종양 무게 - 실험 그룹의 평균 종양 무게) / 대조 그룹의 평균 종양 무게 × 100%
H22 복수종 종양 억제 실험 방법:
잘 자란 H22 세포들을 선택하고, 살균 식염수로 적당하게 희석하여 세포수 107?L-1의 종양 세포 현탁액을 얻은 다음, 이 현탁액 0.2 ml를 각 생쥐의 복강내 접종하였다(단, 정상 대조 그룹은 제외한다). 접종 24시간 후에 치료를 실시하였다. 정상 대조 그룹과 음성 대조 그룹에게는 개체당 하루에 식염수 0.2 ml(0.2ml?each-1?d-1)를 복강내 주사 투여하였고, 양성 대조 그룹에게는 kg당 시클로포스파미드 20 mg(20 mg?kg-1_)를 개체당 하루에 0.2 ml(0.2ml?each-1?d-1)로 복강내 주사 투여하였다. rLZ-8 치료 그룹들에게는 각 투약량을 개체당 하루에 0.2 ml(0.2ml?each-1?d-1)로 10일 연속해서 꼬리 정맥 주사 투여하였다. 매일 체중을 측정하여 생쥐의 체중 변화를 관찰하고, 체중 증가 곡선을 그렸다.
H22 피하 종양 억제 결과:
표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, rLZ-8 투약 세 그룹들은 S180의 성장을 억제할 수 있고, 그 억제율은 16.7%, 30.0%, 42.5%이었다. rLZ-8 치료 그룹의 종양 무게를 음성 대조 그룹과 비교하였을 때, 매우 유의적인 차이가 있다(p<0.01).
Figure pat00007

표 8에 따르면, 약물 치료 전에 이들 그룹들 내 생쥐들의 백혈구 수는 동일한 수준이었고, 음성 대조 그룹과 비교하였을 때 차이를 보여주지 않았다(p>0.05). 치료 10일 후, 음성 대조 그룹의 백혈구 수는 정상 대조 그룹보다 더 높았고, rLZ-8 저-투약량 그룹 및 rLZ-8 중-투약량 그룹의 백혈구 수와 음성 대조 그룹의 백혈구 수는 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 고-투약량 그룹은 상기 정상 대조 그룹과 비교하였을 때 차이를 보이지 않았고(p>0.05), 양성 대조 그룹의 백혈구 수는 유의적으로 감소하였으며, 상기 정상 대조 그룹과 음성 대조 그룹을 비교하였을 때, 유의적 차이가 있었다(p<0.01).
Figure pat00008

H22 복수종 종양 억제 실험 결과:
상기 결과에 따르면, rLZ-8 그룹의 생쥐들은 음성 대조 그룹의 생쥐들보다 더 오래 생존하였고, 상기 음성 대조 그룹의 생쥐들은 식욕 감소를 보여주었으나, 급격한 체중 증가와 활동성 저하가 동반되었다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, rLZ-8 그룹내 생쥐들의 체중 증가는 평균적으로 상기 정상 그룹보다 더 컸으나, 상기 음성 대조 그룹보다는 더 적었다. 이것은 rLZ-8이 생쥐 복막의 H22 종양 세포 성장을 어느 정도 억제함을 나타낸다.
[ 실시예 7]
rLZ -8 형광 표지와 정상 조직 세포 및 HL -60 세포에 대한 영향
1. FITC 표지의 rLZ -8 형광
플루오로크롬(플루오레세인-5-이소시아네이트, FITC; GL Biochem, 상해); 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide); 카보네이트 완충 용액(pH 8～9.5)(Na2CO3 4.3g과 NaHCO3 8.6g에 ddH2O를 500 ml가 될 때까지 첨가함); 인산완충식염수(PBS), 탈염화 Hiprep 26/10 탈염화 칼럼; AKTA 정제기 및 Hitachi 모델의 분광계를 사용하였다.
정제된 rLZ-8(7.5 mg?ml-1) 20 ml와 카보네이트 완충액(pH 8.3)을 밤새 투석을 위하여 혼합하고, FITC 3.75 mg을 칭량한 후, 여기에 디메틸설폭사이드(DMSO) 3.75 ml를 첨가하여 FITC-DMSO 용액을 얻는다. 먼저, rLZ-8을 50 ml 비이커에 넣고 나서, FITC-DMSO 용액 방울들을 rLZ-8 용액 내에서 혼합하면서 PBS로 30 ml까지 맞춘 다음, 마그네틱 교반기로 실온에서 4시간 동안 교반하고 배일성(lucifuging)을 수행한 다음, AKTA 정제 시스템에서 탈염화 Hiprep 26/10 칼럼을 탈염화시켜 유리 플루오레세인을 제거하고, PBS 75ml로 용리(elution)하고, 280 nm 및 495 nm에서 피크를 검출하였다.
상기 제조한 FITC-rLZ-8(10배 희석됨)을 220nm~520nm에서 스캔하여 A495 = 0.445, A280 = 0.67을 얻었고, 택 효율(tag efficiency, F/P=3.80)을 계산하였다.
2. 흰쥐( rat ) 심근 조직에 대한 표지 효과
라이카(Leica) CM1850 냉동 육절기, 위스타르 흰쥐(Wistar rat), 형광 현미경 80i(Nikon 제품), 등장성 PBS 완충액(pH 7.2), 소태아혈청(FBS, Gibco 제품) 및 FITC-rLZ-8(실험실 제조)을 사용하였다. 흰쥐의 목을 잘라 죽인 다음, 심장을 빼내고, 온도가 -20℃로 떨어질 때까지 상기 빼낸 심장을 냉동 마이크로톰(microtome)에 넣어 두고, 37℃에서 1시간 동안 해칭하고, FITC-rLZ-8 용액(100 ng?ml-1)의 심근 및 PBS 제제를 형광 현미경하에서 관찰하였고, 블랭크 대조군을 만들었다.
심근 조직의 형광 현미경 관찰에서는 가시 형광이 없고, 블랭크 대조 그룹과 비교하였을 때 차이가 없었다(도 8 참조).
3. 토끼 연골 세포의 1차 배양에 대한 표지 효과
일본산 흰토끼(수컷, 2.5 kg) 4마리, 수술 기구, 0.25% 트립소겐(trypsogen) + 0.02% EDTA, 0.2% 콜라게나제, D-행크스(D-Hanks), IMDM 배지(50 ml?ml-1, 비타민 C, 이중항체), 0.025 mg?ml-1 폴리-리신(poly-lysine) 용액 및 주사용 살균수(WFI)를 사용하였다.
실험용 동물들을 고정시켜 공기 색전증으로 죽이고, 복부 가죽을 벗겨 사지를 노출시킨 다음, 근막을 가위로 잘라 장골로부터 척추를 분리하고, 대충 전지해서 무릎, 엉덩이 및 어깨뼈 전체를 조심스레 제거하여 D-행크스(D-Hanks)에 담근다. 조직을 담은 비이커를 초청정 유닛(super-clean unit)으로 옮기고, 전지 및 세정 후에 상기 조직을 2차 살균 D-행크스 컵으로 옮긴다. 나이프를 조립하여 얇은 연골층을 잘라내고, 굽은 집게를 사용하여 상기 연골층을 6cm 배양 인큐베이터로 옮긴 후, D-행크스로 3회 세척한 다음, D-행크스 대부분을 버리고, 안과 가위로 상기 연골을 1mm 조각으로 절단하고, D-행크스 대부분을 버리며, 스푼으로 떠서 10cm2 배양 플라스크로 다시 옮기고, 소화(digestion)를 위해 37℃에서 30분간 트립소겐 EDTA와 혼합한다. 콜라게나제로 상기 트립소겐을 대체하고, 이를 37℃의 해칭 인큐베이터 내에 두고, 4-4.5 시간에 걸쳐 1시간 마다 꺼내서 5분 동안 진탕시켜 소화를 끝낸다. 이를 세포 현탁 용액으로 제조하고, FBS 15%를 함유한 IMDM 3ml와 혼합한 뒤, 상기 혼합물 5×104?ml- 1를 상기 배양 플라스크에 접종하였다.
상기 세포를 24-오리피스 접시(24-orifice plate)에 0.5 ml/hole의 양으로 접종하고, 블랭크 대조 그룹을 만들고, 최종 농도가 0.25 ug?ml-1인 FITC-rLZ-8 0.5 ml로 37℃에서 1시간 동안 해칭한 후, 상기 세포들을 1.5 ml EP 원심 분리기로 옮겨 원심분리(1000 rpm?min-1, 7분)하고, 등장성 PBS로 3회 세척한 다음, EP 튜브를 0.1 ml PBS와 혼합하여 상기 세포들을 재현탁시키고, 형광 현미경하에서 상기 현탁액을 관찰하였다.
형광 현미경 관찰시, 손상되지 않은 토끼의 연골 세포 형태는 녹색 형광이 없고, 상기 대조 그룹과 비교하였을 때 유의적 차이가 없었다. 실험 그룹의 사진은 도 9에서 볼 수 있다.
4. HL -60 세포의 표지 효과
형광 현미경 80i(Nikon 제품), IMDM 세포 배양 배지(Hyclone 제품), 소태아혈청(FBS, Gibco 제품) 및 FITC-rLZ-8 및 등장성 PBS 완충액(pH 7.2)(실험실 제조)을 사용하였다.
24-홀 접시(24-hole plate)에 HL-60 세포 2×106 접종하고, 각 홀당 0.5ml 되도록 하고, 100 ng?ml-1I의 FITC-rLZ8를 포함하도록 제조된 IMDM(2% FBS) 배양 배지를 사용하고, 각 홀당 0.5ml 해칭(37℃)하고, 대조 그룹, 1시간 실험 그룹(1h) 및 6시간 실험 그룹(6h)을 설정하고, 1 시간 및 6 시간에 상기 세포들을 각각 꺼내 1.5 ml EP 튜브 내에서 혼합하며, 상기 혼합물을 1000 rpm?min-1의 속도로 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이를 PBS로 3회 세척하고, 세척한 다음 재현탁시켰다.
도 10에서, 형광 현미경 하에 FITC-rLZ-8과 1시간 및 6시간 배양한 HL-60 세포는 강한 녹색 형광을 나타내고, 6시간 그룹에서는 세포 응집이 있었으나, 반면 블랭크 대조 그룹은 녹색 형광이 없었으며, 전자와 비교하였을 때 유의적 차이가 있다.
[ 실시예 8]
생쥐( mice ) 백혈구에서 rLZ -8의 예방 효과
살균 식염수로 rLZ-8 제제를 준비하여, 5 ug?kg-1, 2.5 ug?kg-1, 1.25 ug?kg-1, 0.62 ug?kg-1 투약 그룹으로 나눈다.
Genlei™ Scimax™ [재조합 인간 과립구 집락자극인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF)주사액]은 제품번호가 20060403이고, 75 ug/vial(바이알)을 살균 일반 식염수를 이용하여 3.2 ug?kg-1, 0.2 ml/vial제제로 제조하였다.
주사제용 시클로포스파미드(CP)(제품 번호 050216, 200 mg/vial)는 살균 일반 식염수를 이용하여 12.5 mg?kg-1, 0.2 ml/vial 제제로 제조하였다.
실험 그룹은 정상 대조 그룹, 수개의 단백질 투약 그룹, 양성 대조 그룹(Genlei™ Scimax™)으로 나눈다.
동일한 일반 식염수가 제공되는 상기 정상 대조 그룹을 제외하고는, 각 그룹내 생쥐들에게는 3일 연속해서 kg당 시클로포스파미드 1.25 ug(1.25 ug?kg-1)를 0.2 ml/vial 로 꼬리 정맥 주사 투여하였다. 3일째에, 생쥐 꼬리 정맥 혈액을 채취하여 지린 대학교 제1병원 연구소(Jilin University First Hospital laboratory)에 보내서, 백혈구 수를 분석하였다. 성공적인 모델링 후, 상기 그룹들에게 각 투약량의 rLZ-8 및 양성 약물(Genlei™ Scimax™) 치료를 실시하였고, 상기 정상 대조 그룹과 CP 그룹에게는 일반 식염수를 동일하게 제공하였다. 치료 3일째, 7일째 및 14일째에 생쥐 꼬리에서 정맥 혈액을 각각 뽑아 지린 대학교 제1병원(Jilin University First Hospital)에 보내서, 백혈구 수를 테스트 하였다. 약물 효능 분석을 위해 치료 전과 후에 백혈구 변화를 비교하였다.
표 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 CP 그룹과 비교하였을 때, 치료 3일째에 생쥐의 rLZ-8 약물 그룹은 상당히 더 높은 백혈구를 가졌고, 그 차이는 매우 유의적이며, 치료 7일째에는 회복되었다.
Figure pat00009

[ 실시예 9]
흰쥐( rat ) 백혈구에서 rLZ 의 치료 효과
살균 식염수로 rLZ-8 제제를 준비하여, 20 ug?kg-1, 10 ug?kg-1, 5 ug?kg-1, 2.5 ug?kg-1, 1.25 ug?kg-1, 0.625 ug?kg-1, 0.31 ug?kg-1 투약 그룹으로 나눈다.
Genlei™ Scimax™ [재조합 인간 과립구 집락자극인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF)주사액]은 제품번호가 20060403이고, 75 ug/vial 을 살균된 일반 식염수를 이용하여 9.45 ug?ml-1, 0.1 ml/vial 제제로 제조하였다.
시클로포스파미드(CP)(제품 번호 050216, 200 mg/vial)는 살균한 일반 식염수을 이용하여 20 mg?ml-1, 0.1 ml/vial, 즉 49 mg?kg-1 제제로 제조하였다.
실험 그룹은 정상 대조군 그룹, 단백질 저-투약량 그룹, 단백질 중-투약량 그룹, 단백질 고-투약량 그룹, 양성 대조군 그룹(Genlei™ Scimax™ )으로 설정하였다.
동일한 일반 식염수가 제공되는 상기 정상 대조 그룹을 제외하고는, 각 그룹내 흰쥐들에게 3일 연속해서 시클로포스파미드 20 mg?ml-1, 0.1 ml/vial 을 꼬리 정맥 주사 투여하였다. 3일째에 흰쥐 꼬리 정맥 혈액을 채취하여 지린 대학교 제1병원 연구소(Jilin University First Hospital laboratory)에 보내서, 백혈구 수를 분석하였다. 성공적인 모델링 후, 상기 그룹들에게 각 투약량의 rLZ-8 및 양성 약물(Genlei™ Scimax™) 치료를 실시하였고, 상기 정상 대조 그룹과 CP 그룹에게는 동일한 일반 식염수를 제공하였다. 치료 3일째, 7일째 및 14일째에 흰쥐 꼬리에서 정맥 혈액을 각각 뽑아 지린 대학교 제1병원(Jilin University First Hospital)에 보내서, 백혈구 수를 테스트하였다. 약물 효능 분석을 위해 치료 전과 후에 백혈구 변화를 비교하였다.
표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 CP 그룹과 비교하였을 때, 치료 3일째에 rLZ-8 약물 그룹의 흰쥐에서 백혈구가 유의적으로 더 높았고, 그 차이는 매우 유의적이며, 치료 7일째에 정상으로 회복되었다.
Figure pat00010

[ 실시예 10]
방사능에 의한 생쥐( mice ) 모델에서 rLZ -8의 예방 효과
살균 식염수로 rLZ-8 제제를 준비하여, 5 ug?kg-1, 2.5 ug?kg-1, 1.25 ug?kg-1, 0.62 ug?kg-1 투약 그룹으로 나눈다. 분량은 0.2 ml/vial 이다.
Genlei™ Scimax™ [재조합 인간 과립구 집락자극인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF) 주사액]은 제품번호가 20060403이다. 150 ug/vial 을 살균된 일반 식염수를 이용하여 3.2 ug?kg-1, 0.2 ml/vial 제제로 제조하였다.
생쥐(mice)들에게 7.5 Gy의 감마선(γ-ray, 180 mV, 15 mA)을 조사하고 나서, 이들을 7개의 그룹(n=10)으로 나누었다: (A) 음성 대조 그룹, (B) 5 ug?kg-1 투약량 그룹, (C) 2.5 ug?kg-1 투약량 그룹, (D) 1.25 ug?kg-1 투약량 그룹, (E) 0.62 ug?kg-1 투약량 그룹, (F) 양성 대조 그룹(Genlei™ Scimax™ ), (G) 모델 그룹. 모델링 5일 전에, 각 그룹내 생쥐들에게 5일간 Genlei™ Scimax™ 및 rLZ-8를 투여하였고, 5일째에 생쥐들에게 5일 동안 방사선을 조사한 뒤, 7일째에 꼬리에서 혈액을 뽑아 백혈구 수를 테스트하고, 비장의 무게를 측정하고, 비장 지수를 계산하였다.
표 12에 보여지는 바와 같이, 각 rLZ-8 투약량 그룹에서 백혈구의 양은 모델 그룹과 유의적 차이(p<0.05)를 갖는다. 표 11에 보여지는 바와 같이, rLZ-8은 비장 성장을 촉진하고, 각 rLZ-8 투약량 그룹의 비장 지수 및 집락 형성 단위-비장(colony-forming unit-spleen)은 모델 그룹보다 더 높다.
Figure pat00011

Figure pat00012

[ 실시예 11]
방사능에 의한 생쥐( mice ) 모델에서 rLZ -8의 치료 효과
살균 식염수로 rLZ-8 제제를 준비하여, 5 ug?kg-1, 2.5 ug?kg-1, 1.25 ug?kg-1, 0.62 ug?kg-1 투약 그룹으로 나눈다. 분량은 0.2 ml/vial 이다.
Genlei™ Scimax™ [재조합 인간 과립구 집락자극인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF)주사액]은 제품번호가 20060403이다. 150 ug/vial 을 살균된 일반 식염수를 이용하여 3.2 ug?kg-1, 0.2 ml/vial 제제로 제조하였다.
생쥐들(mice)에게 7.5 Gy의 감마선(γ-ray, 180 mV, 15 mA)을 조사하고 나서, 이들을 7개의 그룹(n=10)으로 나누었다: (A) 음성 대조 그룹, (B) 5 ug?kg-1 투약량 그룹, (C) 2.5 ug?kg-1 투약량 그룹, (D) 1.25 ug?kg-1 투약량 그룹, (E) 0.62 ug?kg-1 투약량 그룹, (F) 양성 대조 그룹(Genlei™ Scimax™ ), (G) 모델 그룹. 모델링과 함께, 각 그룹내 생쥐들에게 Genlei™ Scimax™ 및 rLZ-8를 9일간 투여하고, 꼬리에서 혈액을 뽑아 백혈구 수를 테스트하고, 비장의 무게를 측정하고, 비장 지수를 계산하였다.
표 12에서 보여지는 바와 같이, 각 rLZ-8 투약 그룹의 백혈구 양은 모델 그룹과 유의적 차이를 갖는다(p<0.05). 표 13에서 보여지는 바와 같이, rLZ-8은 비장 성장을 촉진하고, 각 rLZ-8 투약량 그룹의 비장 지수 및 집락 형성 단위-비장(colony-forming unit-spleen)은 모델 그룹보다 더 높았다(p<0.05).
Figure pat00013

[ 실시예 12]
생쥐( mice )의 전신 알레르기 반응에 대한 rLZ -8의 억제 효과
식염수, 수산화알루미늄 및 PBS 완충액으로 rLZ-8 700 ug?ml- 1를 제조한다. 수컷 생쥐(mice)들을, 15개 vial, 4개 그룹으로 나누었다: 2개의 rLZ-8 투약 그룹, 양성 그룹 및 정상 대조 그룹이다. 투약 전략은 하기와 같다: rLZ-8 투약 그룹들에 있어서, 3주 동안 주 2회로 0.1 ml/10g의 양을 생쥐에게 주사하고, 주사를 시작한 첫 번째 주에, 생쥐들에게 1 mg BSA 및 0.2 ml 수산화물의 혼합물을 제공하고, 17일째 감작(sensitization) 후에 1 mg의 BSA 0.2 ml를 주사하고, 생쥐들의 반응을 관찰하였다; 정상 대조 그룹에 있어서, 동일한 양의 식염수를 주사하였다. 양성 반응의 기준은 틱(tic)이나 사망이고, 음성 반응의 기준은 정상 상태이다.
표 14에 나타난 바와 같이, rLZ-8은 BSA에 의해 생쥐에 발생되는 전신 알레르기 반응을 억제할 수 있었다.
Figure pat00014

[ 실시예 13]
rLZ -8 용혈 테스트
5% 포도당 용액을 이용하여 rLZ-8을 1mg?ml-1의 제제로 제조하였다. 인간 혈액 4 ml를 1000 rpm/min의 속도로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 5% 포도당 용액을 약 10배의 부피로 적혈구 침강물에 첨가하여 진탕시키고, 1000 rpm/min의 속도로 20분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 상기 상층액의 색이 유의적으로 붉은 색을 띠지 않을 때까지 2-3회 세척을 반복한다. 상기 얻어진 적혈구를 5% 포도당 용액을 이용하여 실험용으로 2% 현탁액을 제조하였다.
깨끗한 시험관을 28개를 준비해서 각 시험관에 번호를 매긴다: rLZ-8 약물 그룹에 1-5 번, 음성 대조 그룹(5% 포도당 용액)에 6번, 양성 대조 시험관(증류수)에 7번을 붙인 다음, 병렬로 비교 시험관을 총 4줄로 구성한다. 2% 적혈구 현탁액, 5% 포도당 또는 증류수를 번갈아 가면서 공급하여 진탕시킨 뒤, 배양을 위해 37℃±0.5℃의 인큐베이터에 즉시 넣는다. 매 15분 마다 관찰하고, 1시간이 지나면 3시간에 한번 관찰을 한다. 관찰 종료 후, 상기 튜브들의 모든 용액들을 원심 분리 시험관에 넣고, 1500 rpm으로 25분간 원심분리한다. 상기 상층액을 제거하고, 블랭크 증류수 시험관의 흡광도를 읽고, 용혈율을 계산한다.
표 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 1-5번의 약물 그룹의 rLZ-8 용혈율은 < 5%이고, 용혈 반응에 대한 어떠한 징후도 없다.
Figure pat00015

[ 실시예 14]
흰쥐( rat ) 척수 조영상에 대한 rLZ -8의 영향
체중이 대략 100 g 정도인 와스테르 흰쥐(Waster rat) 9마리를 준비한다. 살균 식염수 용액을 이용하여 rLZ-8을 60 mg?kg-1, 30 mg?kg-1, 15 mg?kg-1의 3개의 투약량 그룹으로 제조하였다.
정상 대조군 그룹(흰쥐 3마리), 단백질 저-투약량 그룹(흰쥐 2마리), 단백질 중-투약량 그룹(흰쥐 2마리), 및 단백질 고-투약량 그룹(흰쥐 2마리)을 정한다. rLZ-8 약물 그룹의 흰쥐들에게 rLZ-8의 투여량을 달리하여 각각 하루에 1번 꼬리 정맥 주사를 놓았고, 상기 정상 대조 그룹에게는 동량의 식염수를 제공하였다. 주사한 지 7일째에, 표본(smears)을 위해 오른쪽 대퇴 골수를 확인하였다.
상기 흰쥐의 골수 표본을 상기 정상 대조 그룹과 비교할 때, 비정상적인 것은 나타나지 않았다.
[ 실시예 15]
rLZ -8의 인간 적혈구 응집 효과
A, B, O 및 AB 형 혈액을 건강한 지원자들로부터 각각 2 ml씩을 얻었고, SRBC(양 적혈구)를 준비하였다. 상기 적혈구를 1200 rpm?min-1의 속도로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 이를 PBS 5 ml로 세척하며, 상기 과정을 3-5회 반복한 다음, 0.01 mol/L PBS를 사용하여 1.5%의 현탁 제제를 제조한다. 일반 식염수를 사용하여 최종 농도를 50 ug?ml-1, 25 ug?ml-1, 12.5 ug?ml-1, 6.25 ug?ml-1, 3.13 ug?ml-1, 1.56 ug?ml-1, 0.78 ug?ml-1, 0.39 ug?ml-1, 0.20 ug?ml-1, 0.10 ug?ml-1, 0.05 ug?ml-1, 0.03 ug?ml-1로 조절한 rLZ-8를 제조한다. 식물 응집소(plant aggutinin, PHA) 제제도 상기와 동일하다.
실험 대상을 rLZ-8 농도별 그룹들, 양성 약물 대조 및 정상 대조 그룹으로 나누었다.
96-오리피스 적혈구응집반응판(96-orifice Hemagglutination board) 상에, A형 혈액 1.5% 및 적혈구 25 ul/hole를 첨가한 후, 0.2%의 젤라틴(75 ul/hole)를 첨가하였다. 최종 농도가 상기 언급한 농도가 될 때까지, 약물 그룹들에 여러 농도의 rLZ-8을 첨가한다. 양성 약물 대조 그룹은 PHA 25 ul/hole이고, 정상 대조 그룹은 PBS 25 ul/hole이다. 6개의 병렬 대조군들이 각 그룹에 있다. 통상의 실온하에서 30초간 진탕(shaking)시키고, 37℃에서 배양하고, 1시간 후에 상기 실험 대상들을 관찰하였다. B 형, AB 형 및 O 형 혈액에 대한 실험방법도 상기 SRBC(양 적혈구)와 동일하다.
하기 표 16은 양성 약물 PHA가 4 타입의 인간 적혈구와 양 적혈구 상에서 응집함을 보여준다. rLZ-8은 4 타입의 인간 적혈구에서는 응집하지 않으나, 12.5 ug?ml-1 - 50 ug?ml-1 농도에서는 SRBC가 활발한 응집현상을 보여준다.
Figure pat00016

[ 실시예 16]
재조합 영지버섯 면역조절 단백질 항종양 제제
상기 약리 실험을 통해, 재조합 영지버섯 면역조절 단백질 rLZ-8의 항종양 및 인터류킨 증가 효과는 매우 유의적이고, 부작용 없이 비독성임을 입증하였다. 그러므로, 상기 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8은 항종양 제제로서 약학 용도에 적합하고 안전하다.
본 발명의 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8은 항암제로 적용시 경구용 그리고 비-장내 약물 전달체로 제공될 수 있다. 복용량은 증상, 나이, 체중 및 기타 인자에 따라 결정될 수 있다. 성인의 경우, 사람당 경구 투여량은 10-1000 mg으로 1일 수회 복용되고, 비-장내 전달체 투여량은 10-100 mg으로 1일 수회 투여된다.
본 발명에서, 경구용 정제, 알약 및 캡슐(하드 및 소프트 캡슐 포함)이 사용될 수 있고, 이들 제제는 상기 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8과 적어도 하나의 비활성 희석제(가령, 락토오스, 만노스 알코올, 포도당, 전분, 폴리비닐피롤리돈(poly vinyl pyrrolidone))를 포함하고, 또한 상기 비활성 희석제 이외에 가령 윤활제, 붕괴제, 안정제와 같은 허용 가능한 첨가제를 포함할 수도 있다. 필요한 경우, 정제 또는 알약은 위내 또는 장내-용해성 코팅 물질로 도포될 수 있다. 비-장내 주사제는 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8과 적어도 하나의 비활성 물 희석제(가령, 희석된 주사수 및 일반 식염수)를 포함하고, 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8은 동결 건조된 분말로 제조될 수도 있으며, 사용 전에 상기 분말을 주사제용 비활성 희석수에 용해시킬 수 있다.
(1) 제조예 1
재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8 1000 mg을 준비하고, 이를 살균 식염수 100 ml에 용해시켜 골고루 혼합한 후, rLZ-8 10mg/ml/vial 농도 주사액병에 소포장한다. 상기 주사액병을 밀봉 및 살균처리하여 제품화한다. 기타 항목들은 중화인민공화국 약전(2005년)의 주사액 조건을 따른다.
(2) 제조예 2
재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8 100 g 및 의학용 전분 0.5 kg을 준비한다. 공지된 기술과 장비에 따라, 상기 재료들을 캡슐 형태(rLZ-8 10 mg/tablets)로 제조하였고 기타 항목들은 중화인민공화국 약전(2005년)의 캡슐 조건을 따른다.
(3) 제조예 3
재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 rLZ-8 100 g, 미세결정성 셀룰로스(microcrystalline cellulose) 560 g, 락토즈 무수물(anhydrous lactose) 380 g, 및 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate) 200 g을 준비하고, 공지된 기술과 장비에 따라, 상기 재료들을 정제당 rLZ-8 10mg을 포함하는(10mg/tablet) 알약/정제로 제조하였고, 기타 항목들은 중화인민공화국 약전(2005년)의 정제 조건을 따른다.
(4) 제조예 4
재조합 영지버섯 면역 조절 단백질 적당량을 준비하고, 기타 항목들은 중화인민공화국 약전(2005년)의 경구용 액제 조건을 따르며, 공지된 기술 및 장비에 따라 경구용 액제를 제조한다.

Claims (24)

  1. 하기의 SEQ 1(서열번호 1)로 표시되는 염기서열을 가지고, 재조합 면역조절 단백질 r-LZ-8을 암호화하는 핵산 분자.
    [SEQ1] ATGTCTGATACTGCTTTGATCTTCAGATTGGCTTGGGATGTTAAGAAGTTGTCTTTTGATTACACTCCAAACTGGGGTAGAGGTAACCCAAACAACTTCATTGATACTGTTACTTTTCCTAAGGTTTTGACTGATAAGGCTTACACTTACAGAGTTGCTGTTTCTGGTAGAAACTTGGGTGTTAAGCCATCTTACGCTGTTGAATCTGATGGTTCTCAAAAGGTTAACTTCTTGGAATACAACTCTGGTTACGGTATTGCTGATACTAACACTATTCAAGTTTTCGTTGTTGATCCAGATACTAACAACGATTTCATTATCGCTCAATGGAACTAGTAA
  2. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 숙주세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)임을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
  5. 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 코딩하는 재조합 면역조절 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 면역조절 단백질은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 발현되는 것임을 특징으로 하는 재조합 면역조절 단백질.
  7. 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 코딩하는 종양 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 면역조절 단백질이 치료하는 종양은 백혈병, 폐암, 췌장암, 간암, 장암, 림프종, 전립선암, 자궁암, 골암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 종양 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 재조합 면역조절 단백질은 K 562 종양 세포, NB4 종양 세포, HL-60 종양 세포 및 H22 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양세포의 사멸 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 종양 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  10. 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 코딩하는 백혈구 감소증 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 골수 이식 및 골수이형성증에 의해 유발되는 것임을 특징으로 하는 백혈구 감소증 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  12. 제10항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 재생불량성 빈혈에 수반되는 선천성 호중구감소증, 특발성 호중구감소증, 주기성 호중구감소증 및 호중성 과립구감소증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 백혈구 감소증 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  13. 제10항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 방사능 중독 또는 공업 중독에 의해 유발되는 것임을 특징으로 하는 백혈구 감소증 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  14. 제10항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 장티푸스, 바이러스 감염, 마이코플라스마 폐렴 및 전염성 폐렴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전염병에 의해 유발되는 것임을 특징으로 하는 백혈구 감소증 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  15. 제10항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 약물에 의해 유발되는 것임을 특징으로 하는 백혈구 감소증 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  16. 제10항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 화학요법, 방사능요법 및 골수 이식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료요법에 의한 것임을 특징으로 하는 백혈구 감소증 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  17. 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 코딩하는 전신 알레르기 반응 치료용 재조합 면역조절 단백질.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 재조합 면역조절 단백질은 억제 또는 제어된 항원 표출에 항원 보급을 수행하여 면역 반응 억제를 하는 것을 특징으로 하는 재조합 면역조절 단백질.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 면역 반응 억제는 이식 거부 반응을 치료하고 면역억제 내성을 전환시키는 것을 특징으로 하는 재조합 면역조절 단백질.
  20. 제 5항의 재조합 면역조절 단백질(rLZ-8) 및 3-비트(bit) 약제를 함유하는 허용가능한 보조제를 포함하는 약물 제제의 핵심 성분용 단백질 약품인 면역조절용 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 재조합된 면역 조절 단백질(rLZ-8) 약학 제제는 경구용 전달체, 비-장내 약품 전달체 또는 둘 다 일 수 있는 면역조절용 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 경구용 전달체는 경구용 액제, 정제, 알약, 및 캡슐로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형임을 특징으로 하는 면역조절용 조성물.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 비-장내 약물 전달체는 외용 또는 주사제임을 특징으로 하는 면역조절용 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 주사제는 주사용 동결 분말 또는 주사제용 물임을 특징으로 하는 면역조절용 조성물.
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