CN104130311A - 一种抗肿瘤肽变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤活性肽变体，该蛋白变体相对于野生型具有更强的抑制肿瘤细胞生长的效果。这些变体蛋白质和它们的衍生物可以用于包括肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的治疗。

Description

一种抗肿瘤肽变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及抗肿瘤肽变体。
背景技术
ND100是由1Ala、1Glu、1Gly、1Leu、2Pro、1Thr、1Tyr组成的八肽。体外及体内试验均表明ND100具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用来制备抗肿瘤药物，用于治疗肿瘤。
在现有技术中，为了提高多肽的活性，针对多肽序列进行特异性的改变，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该多肽的生物活性，申请人通过大量的实验，针对多肽序列进行了氨基酸的改变，从而获得了比原始多肽本身具有更高抑制活性的变体。
发明详述
本发明涉及的多肽，序列如下：
NC：AlaGluGlyLeuProProThrTyr；
(NC1)：AlaGluGlyLeuProProThrIle；
(NC2)：AlaSerGlyLeuProProThrTyr；
(NC3)：AlaGluGlyLeuProSerThrTyr；
(NC4)：AlaGluGlyGlyLeuProProThrTyr；
(NC5)：AlaGluGlyGlyLeuProProProThrTyr；
(NC6)：GlyAlaGluGlyLeuProProProThrTyr；
(NC7)：AlaGlyGlyLeuProProThrTyr；
(NC8)：GlyAlaGlyGlyLeuProProThrTyr；
(NC9)：AlaGlyGlyLeuProSerThrTyr；
(NC10)：GlyAlaGlyGlyLeuProSerThrTyr；
(NC11)：GlyAlaGlyGlyLeuProProProThrTyr；
(NC12)：AlaGlyGlyLeuProProProThrTyr；
(NC13)：AlaGlyGlyLeuProProProThrIle；
对照1：AlaGluGlyLeuProGlyThrTyr；
对照2：AlaLeuGlyLeuProProThrTyr；
本发明的多肽合成后，可以做成游离态形式，也可以做成阳离子盐，如：TFA盐(三氟乙酸盐)，HCl盐(盐酸盐)，醋酸盐形式。
本发明的多肽，可以选择和一种或多种药物载体组合，制成多种药物剂型，用于治疗。这些药物剂型涵盖：注射溶液、片剂、霜剂、胶囊、软膏、洗剂、舌含片等剂型局部或全身给药。
具体实施方式
实施例1：本发明多肽的人工化学合成
本发明的肽的制备采用液相合成法和活化酯逐个增长法，将本发明的肽的C端的第二个氨基酸的氨基用Boc基(叔丁氧羰酰基)保护，羧基用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)活化，然后在KHCO3溶液中与C端第一个氨基酸在30℃水浴，反应2天。抽去有机溶剂，在冰浴中用2mol/LHCl调pH3～4(沉淀最多时)，用乙酸乙酯抽提，饱和NaCl洗3次，无水Na2SO4干燥，抽干，无水乙醚研磨，得带保护基的二肽。用50％TFA(三氟醋酸)处理，脱去Boc基，再与N端带Boc保护基，C端用HOSu活化的C端的第三个氨基酸缩合，用同样的方法逐个接上氨基酸，最后用催化氢化法脱去Glu侧链上的保护基，用50％TFA脱去本发明肽N端的Boc基，得粗肽，粗肽用HPLC进行分离纯化，可得98％纯度的本发明的多肽。经过电喷雾质谱测定，其序列与目标序列完全一致。
实施例2：ND100的抗肿瘤活性
(1)体外活性测定：
采用细胞培养和细胞计数的方法，人肝癌细胞7721、胃癌细胞MKN、肺癌细胞A549以各自常规的培养基，视不同情况加入10％左右的小牛血清，用T-25培养瓶在37℃，5％CO2培养箱中单层培养。
当细胞生长成单层后消化，用含1％小牛血清的培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，37℃、5％CO2培养箱中培养4h后，加入不同剂量的本申请的多肽，对照组和实验组均设三个重复孔，对照组加入10μl的PBS，试验组加入不同剂量的本申请的多肽，继续培养72小时后，吸出培养液，用PBS洗，然后每孔加入200μl消化液消化，待细胞变圆后，加入800μl的PBS，在倒置显微镜下用血球计数板计数。
抑制率结果如下：
(2)体内活性测定：
30只健康昆明种小白鼠，体重20±2克，平均分三组，每组10只，雌雄各半。将已接种人肝癌细胞7721、胃癌细胞MKN、肺癌细胞A549的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，连续注射7天后，于停药3天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。对于肺癌，植瘤24hr后，给药组、生理盐水和CTX组样品连续注射10天后，于停药4天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。
检测结果显示，15mg/kg剂量的NC的抑瘤率分别为：肝癌77％，肺癌78％，胃癌75％。而NC1-13的三种癌症的抑瘤率相近，大约分别为肝癌99％，肺癌98％，胃癌96％。而对照1和对照2几乎没有抑瘤率。
从以上结果可以看出，NC1-13可以作为药物用于制备抗肿瘤药。具有较好的应用前景。

Claims (4)

1.一种抗肿瘤肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1-14所示。
2.如权利要求1所述的肿瘤肽变体在制备抑制肿瘤药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为肝癌、胃癌或肺癌。
4.一种抗肿瘤药物制剂，它含有权利要求2所述的肿瘤肽变体以及药学上合适的载体。
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