CN102399264A

CN102399264A - 碱性成纤维细胞生长因子结合短肽衍生物及其应用

Info

Publication number: CN102399264A
Application number: CN201110231721XA
Authority: CN
Inventors: 吴建章; 李校堃; 吴晓萍; 梁广; 叶辉; 蔡跃飘; 陈玲姿
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2012-04-04

Abstract

本发明属于药物化学、多肽生物技术领域，涉及能结合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的短肽衍生物P15，其序列为N’-PILQA GLGGGS-NH₂-C’，具体涉及其序列、在基础研究和医药领域方面的应用。本发明也包括P15的各种肽衍生物，如P21，其序列为N’-PLLQA TA GGGS-NH₂-C’。P15和P21都能够通过结合bFGF，具有较好的抑制bFGF诱导的NIH3T3和Bable/C 3T3细胞增殖抑制活性，同时也能明显抑制bFGF诱导的肺癌A549和神经胶质瘤U251细胞的增殖，具有开发为抗肿瘤肽类药物的前景。

Description

碱性成纤维细胞生长因子结合短肽衍生物及其应用

技术领域：

本发明属于药物化学、多肽生物技术领域，涉及能结合碱性成纤维细胞生长因子的短肽衍生物，具体涉及其序列、在基础研究和医药领域方面的应用。

背景技术：

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，或FGF2)结合和激活相应受体(FGFR)，在促有丝分裂和非促有丝分裂生物学功能方面起重要作用。但相继发现结肠癌、前列腺癌、纤维瘤、横纹肌肉瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤等多种肿瘤与与bFGF表达的异常上调密切相关。因此，bFGF被视为肿瘤等疾病的治疗靶标之一而备受关注。以bFGF为靶标的拮抗药物能阻断bFGF的信号传递，抑制肿瘤组织新生血管的生成，抑制肿瘤细胞等的生长、分裂和转移，从而达到治疗相关肿瘤的目的。

作用于bFGF的抑制剂主要是带负电荷的有机小分子和寡糖类拮抗剂，如Suramin、PI-88和PNU145156E等，它们主要是模拟肝素，通过分子上的负电荷和bFGF上的带正电荷的碱性氨基酸位点以氢键结合等作用，这些位点主要是bFGF表面上肝素结合位点(Arg121、Lys126、Asn28)和受体结合位点(Arg108)两个区域。而人体内多种蛋白表面都带正电荷，也可能会与这些拮抗剂作用，因此它们的特异靶向性差，毒副作用大，至今无此类拮抗剂药物上市。

而肽类拮抗剂药物相对于以上有机小分子拮抗剂药物来讲，具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等多种优点，因此已经成为研究的热点。已经有多种小肽以及肽衍生物药物上市，例如在SARS期间作为预防和治疗药物的胸腺五肽和在生长抑素基础上改造的抗肿瘤药物奥曲肽等。有关bFGF的肽类拮抗剂报道极少，尚未发现其肽衍生物类拮抗剂的报道。目前FGFR抑制剂方面国外相关专利有：US 2002/0119931 A1。国内相关专利有：201010525954.6。相比生长抑制素、催产素等其它研究比较成熟的小肽类药物来说，bFGF肽类拮抗药物还处于非常年轻的上升阶段，有很大的开拓空间。而bFGF与一些疾病的相关性以及bFGF拮抗剂对相关疾病的治疗潜能，预示着bFGF拮抗肽抑制剂的研究有着非常诱人的前景。

发明内容：

本发明的目的在于提供了bFGF的结合短肽衍生物，可应用于bFGF与其受体相互作用研究方面的应用，主要是在药物方面的应用，尤其是在治疗与体内bFGF高表达相关肿瘤疾病方面的应用。

具体而言，本发明所指bFGF结合短肽衍生物，其序列为N’-PILQAGLGGGS-NH₂-C’，其对应的三字符序列为，N’-Pro-Ile-Leu-Gln-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-NH₂-C’，其C末端丝氨酸的羧基被酰胺化，所述氨基酸残基可以指L-型的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸，其中本发明实施例中所述P15为其全部残基为L-型氨基酸的短肽衍生物。

本发明所指“bFGF的结合短肽衍生物N’-PILQA GLGGGS-NH₂-C’”的衍生物，包括但不限于以下所述衍生化而成的肽衍生物：①将其中一个或几个氨基酸残基替换成与其侧链性质相似的氨基酸；②将其中一个或几个编码氨基酸残基替换成非编码氨基酸，包括但不限于D-型氨基酸或β-氨基酸或N-甲基氨基酸；③N末端氨基基团的修饰包括但不限于脱-氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰；④C末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、或低级烷基酰胺、或肽醇化、或二烷基酰胺、或低级烷基酯修饰、或连接其它基团成肽缀合物；⑤同时进行①、②、③、④中的任意两种或任意三种或同时四种衍生化。

N’-PILQA GLGGGS-NH₂-C’的衍生物优选以下但不限于以下衍生物，其序列为N’-PLLQA TA GGGS-NH₂-C’，其对应的三字符序列为N’-Pro-Leu-Leu-Gln-Ala-Thr-Ala-Gly-Gly-Gly-Ser-NH₂-C’，其全部残基为L-型氨基酸，C末端丝氨酸的羧基被酰胺化，在实施例中该肽衍生物命名为P21。

本文中“药学上可接受的酯”指对氨基酸侧链基团的修饰，包括但不限于苏氨酸、丝氨酸侧链羟基与羧酸发生酯化反应后的产物。

在本文中，“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。这些盐一般能够增加多肽的溶解性，而且所形成的盐基本上不改变多肽的活性。本发明的多肽可以单独使用，也可以以药学上可接受的盐形式使用。

bFGF与其结合短肽衍生物的结合力可以采用放射性配基结合分析法进行测定，具体如下：待高表达bFGF受体的Balb/c 3T3细胞在培养皿中生长至汇合，洗涤后与¹²⁵I标记的bFGF及不同浓度的结合短肽衍生物孵育，洗涤后用γ计数仪进行放射性计数，检测是否随着结合短肽衍生物浓度的增加，与Balb/c 3T3细胞表面受体结合的¹²⁵I标记bFGF的数量减少，证实结合短肽衍生物可通过与bFGF结合，阻止bFGF与其受体的相互作用。

在本文中，“在碱性成纤维细胞生长因子与其受体相互作用研究方面的应用”、“为活性成分的药物的应用”、“在治疗与体内碱性成纤维细胞生长因子高表达相关肿瘤疾病方面的应用”所述如下。bFGF的高亲和受体FGFR1(IIIc)D3的255-261位和FGFR2(IIIc)D3的256-262位具有完全相同的氨基酸序列，即N’-PILQAGL-C’，推测该序列有可能是结合bFGF的有效短肽序列；本课题组在前期工作中用过噬菌体展示技术发现了可以特异结合bFGF的短肽，其序列为N’-PLLQATLGGGS-NH₂-C’；以上两种短肽序列有着非常的相似性。因此，本课题组合成了PILQAGL的短肽衍生物P15(其序列为N’-PILQAGLGGGS-NH₂-C’)；选择表达较多bFGF受体的NIH3T3和Bable/C 3T3两种细胞，进行了bFGF诱导的细胞增殖抑制实验，发现P15能够较好的抑制bFGF诱导的Bable/C 3T3细胞的增殖。P15的衍生物P21(其序列为N’-PLLQA TAGGGS-NH₂-C’)也具有较好地抑制bFGF诱导的NIH3T3和Bable/C 3T3细胞增殖抑制活性，且对NIH3T3细胞的增殖抑制作用具有较好的量效关系。P15和P21都是通过结合bFGF，从而拮抗bFGF与其受体相互作用，从而抑制bFGF信号通路，从而达到抑制bFGF诱导的细胞增殖活性。bFGF在多种肿瘤细胞中具有高表达的特征，bFGF拮抗剂通过结合bFGF从而抑制bFGF对其受体的激活，从而抑制bFGF引起的肿瘤细胞增殖，达到治疗相关肿瘤疾病的目的。本文所指bFGF结合肽衍生物实际也就是bFGF拮抗剂，能够抑制bFGF高表达肿瘤细胞的增殖，可以进一步开发为治疗相关肿瘤的拮抗肽药物。本文所指bFGF结合肽衍生物可以治疗bFGF高表达相关肿瘤，相关肿瘤包括但不限于以下肿瘤：结肠癌、前列腺癌、纤维瘤、肉瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、胃癌。本文实施例中，P15和P21可以明显抑制bFGF诱导的肺癌A549和神经胶质瘤U251细胞的增殖，具有开发为抗肿瘤肽类药物的前景。

在本文中，“药物组合物”指本发明所述bFGF结合肽及肽衍生物或其可药用盐及溶剂化物与现已上市的抗肿瘤药物联合使用，制备得到的防治肿瘤疾病类药物的组合物，已上市的抗肿瘤药物包括但不限于紫杉醇类、喜树碱类、铂类、长春花碱类。该类药物组合物可以采用的“制剂形式”包括注射剂片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

在本文中，也提供了本发明所述的bFGF结合肽及肽衍生物的制备方法，优选合成方法是Fmoc固相法合成，通过化学方法合成已知结构的肽对于所属领域技术人员来说都是显而易见的。详细的方案可参照以下文献所述的方法进行，如用固相法合成多肽可参考J.M.Steward和J.D.Young的《Solid Phase PeptideSynthesis》(第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois(1984))和J.Meienhofer的《Hormonal Proteins and Peptides》(第2卷，Academic Press，纽约(1973))等；用液相法合成多肽可参考E.Schroder和K.Lubke的《The Peptides》(第1卷，Academic Press，纽约(1965))等。目前肽有着很成熟的自动合成技术，如可以采用市售的自动合成仪来合成。目前肽有着很成熟的自动合成技术，如可以采用市售的自动合成仪来合成。

本发明的有益效果为，提供了bFGF结合短肽及短肽衍生物，它们能够通过作用于bFGF，抑制bFGF高表达相关肿瘤细胞的增殖，具有开发为bFGF拮抗肽类抗肿瘤药物的前景。

为了便于理解，下面下将通过具体的实施例对本发明进行详细的描述。需要指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

附图说明：

图1P21对bFGF诱导的NIH3T3细胞的增殖抑制活性

测试时包括：空白组，不加bFGF和肽；阴性组，只加bFGF(20ng/mL)，不加肽；加药测试组，加bFGF(20ng/mL)，加不同浓度(0.25、1.00、4.00、16.00μM)的肽衍生物P21溶液，肽溶液设置1μM，5μM，10μM三个浓度。空白组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的PBS。抑制率的计算＝[OD(阴性组)-OD(测试组)]/[OD(阴性组)-OD(空白组)]*100％。

图2P21(4μM)对bFGF诱导的细胞增殖抑制活性

测试时每种细胞均包括：空白组，不加bFGF和肽；阴性组，只加bFGF(20ng/mL)，不加肽；加药测试组，加bFGF(20ng/mL)，加入4μM的衍生物P21溶液。空白组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的PBS。抑制率的计算＝[OD(阴性组)-OD(测试组)]/[OD(阴性组)-OD(空白组)]*100％。

图3P15(4μM)对bFGF诱导的细胞增殖抑制活性

测试时每种细胞均包括：空白组，不加bFGF和肽；阴性组，只加bFGF(20ng/mL)，不加肽；加药测试组，加bFGF(20ng/mL)，加入4μM的衍生物P15溶液。空白组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的PBS。抑制率的计算＝[OD(阴性组)-OD(测试组)]/[OD(阴性组)-OD(空白组)]*100％。

图4P15的MS谱图

图5P21的MS谱图

具体实施方式：

本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。

实施例1

肽的合成

通过固相肽合成方法，使用413A型自动肽合成仪(购自Perkin Elmer公司)来合成如以下序列所示的肽：N’-Pro-Ile-Leu-Gln-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-NH2-C’，其中的氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的具体过程如下：以Rink Amide-AM Resin树脂为载体；Fmoc作为氨基酸α-氨基的保护基；反应溶剂用DMF；活化剂为HBTu：0.5M(DMF)和NMM(N-甲基吗啉)，2M(DMF)；用含有20％哌啶的DMF为脱保护剂；裂解液是95％TFA和5％(H2O+EDT+Tis)。用无水乙醚沉淀肽。在水/叔丁醇(1∶1)中沉淀，冷冻干燥，得到粗肽。粗肽在30分钟内以反向HPLC纯化，以37-42％乙晴/0.9％TFA梯度进行。然后进行浓缩、冻干。经HPLC检测，其纯度≥98％。P15和P21的MS谱图分别见图4和图5。

实施例2

P21对bFGF诱导的NIH3T3细胞的增殖抑制活性

选择表达较多bFGF受体的NIH3T3细胞，将细胞以6000个/孔接种在96孔培养板内，每孔100μl，10％FBS(进口)的DMEM低糖培养基；过夜后，换用0.1％FBS的DMEM低糖培养基培养24小时；加入bFGF与P21的混合液，bFGF终浓度为20ng/ml，肽的终浓度分别为0.25、1.00、4.00、16.00μM。48小时后，MTT法测定490nm下的OD值，计算抑制率。测试时包括：空白组，不加bFGF和肽；阴性组，只加bFGF(20ng/mL)，不加肽；加药测试组；空白组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的PBS。抑制率的计算公式＝[OD(阴性组)-OD(测试组)]/[OD(阴性组)-OD(空白组)]*100％。其抑制活性数据见图1，P21在4μM时对NIH3T3细胞增殖的抑制率就达60％，在所测试的4个浓度下具有较好的量效关系。

实施例3

P21对bFGF诱导的细胞增殖抑制活性

选择表达较多bFGF受体的Balb/c 3T3、肺癌(A549)细胞和神经胶质瘤(U251)细胞，将细胞以6000个/孔分别接种在96孔培养板内，每孔100μl，培养基用10％FBS的DMEM高糖培养基；过夜后，换用0.1％FBS的培养基培养24小时；加入bFGF与P21的混合液，bFGF终浓度为20ng/ml，肽的终浓度均为4.00μM。48小时后，MTT法测定490nm下的OD值，计算抑制率。测试时包括：空白组，不加bFGF和肽；阴性组，只加bFGF(20ng/mL)，不加肽；加药测试组；空白组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的PBS。抑制率的计算公式＝[OD(阴性组)-OD(测试组)]/[OD(阴性组)-OD(空白组)]*100％。对细胞增殖的抑制活性数据见图2，P21在4μM时对U251和A549就有非常好的抑制细胞增殖活性，P21具有较好的研发为治疗bFGF高表达肿瘤疾病药物的前景。

实施例4

P15对bFGF诱导的细胞增殖抑制活性

选择表达较多bFGF受体的Balb/c 3T3、肺癌(A549)细胞和神经胶质瘤(U251)细胞，将细胞以6000个/孔分别接种在96孔培养板内，每孔100μl，培养基用10％FBS的DMEM高糖培养基；过夜后，换用0.1％FBS的培养基培养24小时；加入bFGF与P15的混合液，bFGF终浓度为20ng/ml，肽的终浓度均为4.00μM。48小时后，MTT法测定490nm下的OD值，计算抑制率。测试时包括：空白组，不加bFGF和肽；阴性组，只加bFGF(20ng/mL)，不加肽；加药测试组；空白组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的PBS。抑制率的计算公式＝[OD(阴性组)-OD(测试组)]/[OD(阴性组)-OD(空白组)]*100％。对细胞增殖的抑制活性数据见图3，P15在4μM时对三种细胞均具有很好的抑制bFGF诱导的细胞增殖活性，其中对肿瘤细胞U251和A549的抑制活性，说明P15具有较好的研发为治疗bFGF高表达肿瘤疾病药物的前景。

Claims

1.一种碱性成纤维细胞生长因子结合短肽衍生物或其药学上可接受的盐或酯，碱性成纤维细胞生长因子结合短肽衍生物的氨基酸序列为N’-PILQAGLGGGS-NH₂-C’，其氨基酸残基可以指L-型的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸，其C末端丝氨酸的羧基被酰胺化。

2.权利要求1所述短肽衍生物N’-PILQA GLGGGS-NH₂-C’的衍生物，其特征在于，包括但不限于以下所述衍生化而成的肽衍生物：①将其中一个或几个氨基酸残基替换成与其侧链性质相似的氨基酸；②将其中一个或几个编码氨基酸残基替换成非编码氨基酸，包括但不限于D-型氨基酸或β-氨基酸或N-甲基氨基酸；③N末端氨基基团的修饰包括但不限于脱-氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰；④C末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、或低级烷基酰胺、或肽醇化、或二烷基酰胺、或低级烷基酯修饰、或连接其它基团成肽缀合物；⑤同时进行①、②、③、④中的任意两种或任意三种或同时四种衍生化。

3.权利要求1和2所述短肽衍生物，优选以下但不限于以下肽衍生物：

命名为P15的肽衍生物其序列为N’-PILQA GLGGGS-NH₂-C’，其氨基酸残基均为L型氨基酸，其C末端丝氨酸的羧基被酰胺化。

4.权利要求1所述短肽及短肽衍生物在碱性成纤维细胞生长因子与其受体相互作用研究方面的应用。

5.以权利要求1所述短肽及短肽衍生物为活性成分的药物的应用。

6.权利要求1所述短肽及短肽衍生物通过拮抗体内碱性成纤维细胞生长因子，在治疗与体内碱性成纤维细胞生长因子高表达相关肿瘤疾病方面的应用。

7.一种用于治疗肿瘤疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的权利要求1所述的肽衍生物或其可药用盐及其药用辅料。

8.根据权利要求书6所述的药物组合物，其特征是：所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。