CN102453079B

CN102453079B - 特异性结合碱性成纤维细胞生长因子受体的肽

Info

Publication number: CN102453079B
Application number: CN 201010525955
Authority: CN
Inventors: 李校堃; 吴晓萍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2010-11-01
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2030-11-01
Also published as: CN102453079A

Abstract

本发明公开了特异性结合碱性成纤维细胞生长因子受体的肽，其包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro，其可用于抑制高表达bFGF受体的细胞增殖并阻断bFGF诱导的Erk1和Erk2激酶活化，从而可用于治疗黑素瘤等肿瘤。本发明还公开了包含该肽的药物组合物和制备方法等。

Description

特异性结合碱性成纤维细胞生长因子受体的肽

技术领域

本发明属于肽技术领域，具体而言，本发明涉及特异性结合碱性成纤维细胞生长因子受体的肽，其可用于抑制高表达bFGF受体的细胞增殖并阻断bFGF诱导的Erk1和Erk2激酶活化，从而可用于治疗黑素瘤等肿瘤。本发明还涉及了包含该肽的药物组合物和制备方法等。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子，即bFGF（basic fibroblast growth factor），又称FGF-2，是成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）家族的成员之一。bFGF 通过结合和活化细胞表面受体而激活胞内信号转导通路, 介导细胞增殖等生物反应，是广谱的促有丝分裂原。bFGF在体内分布广泛且具有多种重要的生物学功能，其时空表达及表达水平受到严谨的调控。研究表明，bFGF及其受体表达的异常上调与肿瘤等疾病密切相关。（参见 Beenken A, Mohammadi M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nat Rev Drug Discov. 2009, 8(3): 235-253； Korc M, Friesel RE. The role of fibroblast growth factors in tumor growth. Curr Cancer Drug Targets. 2009, 9(5): 639-651； Rusnati M, Presta M. Fibroblast growth factors/fibroblast growth factor receptors as targets for the development of anti-angiogenesis strategies. Curr Pharm Des. 2007, 13(20): 2025-2044；以及， Cronauer MV, Schulz WA, Seifert HH, Ackermann R, Burchardt M, Fibroblast growth factors and their receptors in urological cancers: basic research and clinical implications. Eur Urol. 2003, 43(3): 309-319）。

经过长期艰苦的研究，并结合一些筛选的运气，本发明人获得了一种肽，令人惊讶的是，其能够有效而且特异地结合碱性成纤维细胞生长因子受体，阻断bFGF所介导的细胞增殖，可用于抑制高表达bFGF受体的细胞增殖并阻断bFGF诱导的Erk1和Erk2激酶活化，从而可用于治疗黑素瘤等肿瘤。该肽可以采用现有技术合成，成本低，但是效果好，适用范围广。

发明内容

本发明的目的在于提供特异性结合碱性成纤维细胞生长因子受体的肽，优选是特异结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的肽，其可用于抑制高表达bFGF受体的细胞增殖并阻断bFGF诱导的Erk1和Erk2激酶活化，从而可用于治疗黑素瘤等肿瘤；另外，该肽可以采用现有技术合成，成本低，但是效果好，适用范围广。

具体而言，在第一个方面，本发明提供了包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽或其药学上可接受的盐或酯。所述肽优选可以是由序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro组成的肽，也可以是在Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro肽的N末端和/或C末端增加一个或多个（如，一个或几个，优选如一个至五个）氨基酸残基，更优选在Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro肽的C末端增加一个或多个（如，一个或几个，优选如一个至五个）氨基酸残基。对于在C末端增加氨基酸残基的情况，在本发明的具体实施方式中，所述肽的具体实例是序列为Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser的肽。

本文中的肽中各氨基酸残基之间通常是通过肽键相连的，尽管其他键相连的肽也涵盖在本发明的范围内。优选在本发明的第一方面中，包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽中任意两个相邻的氨基酸都是通过肽键相连的。

本文中所使用的肽及氨基酸、氨基酸残基和化学基团的表示方法均为所属领域公认的表示方法。其中氨基酸或氨基酸残基的缩写可参照表1中定义，这些缩写可以指L-型的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸。在本发明的具体实施方式中，氨基酸或氨基酸残基指L-型的氨基酸或氨基酸残基。其中，氨基酸或氨基酸残基可以根据其侧链性质的相似性而分成以下组：疏水性氨基酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、亲水性氨基酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族侧链的氨基酸（G、A、V、L、I、P）、含羟基侧链的氨基酸（S、T、Y）、含硫原子侧链的氨基酸（C、M）、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸（D、N、E、Q）、含碱性基团侧链的氨基酸（R、K、H）、含芳香族侧链的氨基酸（H、F、Y、W）。通常，处于同组中的氨基酸或氨基酸残基具有相似的性质。

表1 氨基酸缩写表

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因此，根据氨基酸残基的相似性，本发明还提供了类似于Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽。例如，可以通过将Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro中一个或几个氨基酸残基替换成与其侧链性质相似的氨基酸，然后通过噬菌体展示技术来筛选出特异结合碱性成纤维细胞生长因子受体的肽，如特异结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的肽。又如，也可以通过将Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro肽的N末端和/或C末端增加一个或多个（如，一个或几个，优选如一个至五个）氨基酸，然后通过噬菌体展示技术来筛选出特异结合碱性成纤维细胞生长因子受体的肽，如特异结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的肽。因此，本发明也优选提供类似于Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽，其能够通过噬菌体展示来筛选得到。这些肽也涵盖在本发明的保护范围内。

对于本发明的肽，可以是进行合适的修饰而产生的肽，修饰包括但不限于，环化，制备成多聚体，对末端氨基、羧基或侧链基团修饰以形成药学上可接受的酯，包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽与高分子物质形成的缀合物、融合蛋白，或这些修饰的组合等。在本文中，“药学上可接受的酯”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的酯。通常，酯化修饰后能降低机体中的蛋白酶对肽的水解。对本发明的肽的末端氨基、羧基或侧链基团进行修饰可以形成药学上可接受的酯。对氨基酸侧链基团的修饰包括但不限于苏氨酸、丝氨酸侧链羟基与羧酸发生的酯化反应。N末端氨基基团的修饰包括但不限于脱-氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。C末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。优选末端基团用蛋白质化学领域的技术人员已知的保护性基团保护起来，如乙酰基、三氟乙酰基、Fmoc（9-芴基-甲氧羰基）、Boc（叔丁氧羰基）、Alloc（烯丙氧羰基）、C_1-6 烷基、C_2-8 烯基、C _7-9 芳烷基等。在本发明中，优选不对包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽的N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸侧链基团进行修饰，即N末端的化学基团仍旧为第一个氨基酸上的α-氨基（-NH₂），C末端的化学基团是C末端氨基酸的羧基（-COOH）。本发明的具体实施方式也优选对C末端的羧基进行酰氨化，即C末端的化学基团是-CO NH₂。

使用本领域已知的方法，包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽与高分子物质可以形成缀合物，其中，高分子物质通常是药学上可接受的水溶性多聚物部分。该缀合物一般能显示出延长肽的循环半衰期的效应。合适的水溶性多聚物包括聚乙二醇 (PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C_l-10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯吡咯烷酮) PEG、三甲氧基PEG、单甲氧基-PEG丙醛、 PEG丙醛、二-琥珀酰亚胺碳酸PEG、丙烯乙二醇同聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙烯多羟基化合物(如, 甘油)、单甲氧基-PEG丁醛、 PEG丁醛、单甲氧基-PEG乙醛、PEG 乙醛、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丙酸、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸、聚乙烯醇、右旋糖苷、纤维素或其他糖类的多聚物。合适的PEG可具有约600至约60,000的分子量，包括如, 5,000道尔顿, 12,000道尔顿, 20,000道尔顿, 30,000道尔顿,和40,000道尔顿, 其可以是直链的或分支的。PEG化可通过现有技术中已知的PEG化反应来进行(如参见, Delgado 等的 Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan 和Spreafico的 Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994), 和Francis 等的Int J Hematol 68: 1 (1998))。例如, PEG化可用反应性聚乙二醇分子由酰化反应或由烷基化反应来进行。在可选的方法中，缀合物由缩合活化的PEG来形成，其中PEG末端的羟基或氨基被活化的接头分子替代(如参见, Karasiewicz等, US5382657A)。缀合物也可以是包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽同其它蛋白交联形成的缀合物。所述其它蛋白优选人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc 部分。例如，本发明的肽可以与牛血清白蛋白交联形成肽缀合物。

包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽也可以与其它肽或蛋白质形成融合肽或融合蛋白。优选其中所述蛋白质为人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc 部分。白蛋白可以通过遗传工程方式偶连到包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽上以延长半衰期。其中，人白蛋白是最普通的天然产生的人循环系统中的血蛋白，能在体内维持循环超过20天。研究表明，通过遗传工程方式融合到人白蛋白上的治疗蛋白具有较长的半衰期。另外研究表明，对于Fc部分，所得的融合蛋白可增加循环半衰期 (参见US5750 375A, US5843725, 美国专利第6,291, 646号; Barouch等, Journal of Immunology, 61:1875-1882 (1998); Barouch等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(8) : 4192-4197 (4月 11,2000) ; 和 Kim等, Transplant Proc., 30 (8): 4031-4036(1998))。

在本文中，“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。这些盐一般能够增加多肽的溶解性，而且所形成的盐基本上不改变多肽的活性。本发明的多肽可以单独使用，也可以以药学上可接受的盐形式使用。

在第二方面，本发明提供了组合物，其包括本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯，以及药学上可接受的载体。本文中使用的“药学上可接受的载体” 指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、膜剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放的形式)、粉剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂和乳液剂、消毒的注射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如，以片剂或胶囊口服给药，上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药物学可接受的惰性载体组合在一起，如乙醇、等渗葡萄糖溶液、甘油、生理盐水或其组合。组合物中还可以添加辅料，如人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸和金属阳离子等多肽保护剂等。在本发明的具体实施方式中，本发明的肽直接用缓冲液（如，PBS）稀释成组成物。

优选在本发明的第二方面中，所述组合物是药物组合物，即达到药用纯度、制剂等要求的组合物。药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。本发明的药物组合物优选胃肠道外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况（如，病人的病情、体重等）而方便地确定。对于一般的成人，本发明的药物组合物的剂量，以包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽计，可以是每kg成人体重1ng – 10g。对于注射给药模式来说，优选的剂量是每kg体重 100ng - 10mg，更优选的是每kg 1mg - 1mg，最优选的是每kg 10mg - 100mg。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备特异性结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的组合物中的应用。其中，所述组合物可以是药物组合物，也可以是只适于体外应用的组合物，优选是药物组合物。

在本文中，术语“特异”或“特异性”指的是更倾向于的意思，量化来看，其成一个数量级以上（即，十倍以上）的倾向性优势。在本发明的具体实施方式中，展示本发明的肽的噬菌体结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞（如，Balb/c 3T3细胞）比不表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞（如，Cos-7细胞）的倾向性优势要大16倍，超过一个数量级。因此优选在本发明第三方面中，表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞是Balb/c 3T3细胞。

另外，在本发明的具体实施方式中，本发明的肽是唯一特异性结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的活性成分，因此也优选提供，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯作为唯一特异性结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的活性成分在制备特异性结合表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的组合物中的应用。

在第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制细胞增殖的组合物中的应用。其中所述组合物可以是药物组合物，也可以是只适于体外应用的组合物，优选是药物组合物。

优选在本发明的第四方面中，细胞增殖是由碱性成纤维细胞生长因子诱导的。本发明人经研究发现，本发明的肽可以特异性地抑制由碱性成纤维细胞生长因子诱导的肿瘤细胞的增殖，因此也优选在本发明的第四方面中，细胞是肿瘤细胞，在本发明的具体实施方式中，细胞是黑素瘤细胞，如B16-F10细胞。

另外，在本发明的具体实施方式中，本发明的肽是唯一抑制增殖活性成分，因此也优选提供，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯作为唯一抑制增殖活性成分在制备抑制细胞（如，肿瘤细胞，更优选如黑素瘤细胞）增殖的组合物中的应用。

在第五方面，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗Erk1和Erk2激酶活化的药物或试剂中的应用。在本文中，如无相反指示，药物可以与药物组合物互换使用；试剂指的是只适于体外应用的组合物。

优选在本发明的第五方面中，Erk1和Erk2激酶是Balb/c 3T3细胞或黑素瘤细胞（如B16-F10细胞）中的Erk1和Erk2激酶。本发明人经研究发现，本发明的肽可以特异性地阻断Balb/c 3T3细胞和黑素瘤细胞（如B16-F10细胞）中的Erk1和Erk2激酶的活化，而且其是作为唯一阻断活性成分使用的。因此也优选提供，本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯作为唯一阻断活性成分在制备抗Erk1和Erk2激酶活化的药物或试剂中的应用。

在第六方面，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤的药物中的应用。本发明人经研究发现，本发明的肽不但能够单独抑制肿瘤细胞本身的增殖，而且能够单独抗Erk1和Erk2激酶的活化，通过降低Erk1和Erk2的磷酸化水平从而潜在地阻断肿瘤细胞的增殖途径，因此综合各个方面的生理效应，本发明的肽可用于预防和/或治疗肿瘤。优选在本发明的第五方面中，肿瘤是黑素瘤。

在第七方面，本发明提供了制备本发明第一方面所述的肽的方法，其包括，合成包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽，优选是固相合成包括序列Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽，例如，合成序列为Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的肽或序列为Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser的肽。通过化学方法合成已知结构的肽对于所属领域技术人员来说都是显而易见的。详细的方案可参照以下文献所述的方法进行，如用固相法合成多肽可参考J.M. Steward和J.D. Young的《Solid Phase Peptide Synthesis》(第二版，Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois(1984))和J. Meienhofer的《Hormonal Proteins and Peptides》（第2卷，Academic Press，纽约(1973)）等；用液相法合成多肽可参考E. Schroder和K. Lubke的《The Peptides》（第1卷，Academic Press，纽约(1965) ）等。目前肽有着很成熟的自动合成技术，如可以采用市售的自动合成仪来合成。

优选在本发明第七方面中，合成Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro肽后的肽优选进一步纯化，如进行HPLC纯化。本发明的肽优选是纯化的肽，即纯化到≥80％纯度，优选≥90％纯度，更优选≥95％纯度，尤其优选达到药物纯的状态，即纯度是大于等于98％的纯度，而且不含感染源和热源。优选本发明的肽实质上不含有其它多肽或蛋白质，尤其是动物来源的那些肽或蛋白质。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细的描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。另外本发明引用的公开文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式

实施例1噬菌体展示的肽对表达或不表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的结合特异性

检测利用常规噬菌体展示技术筛选获得的噬菌体上展示的肽与细胞株Balb/c 3T3（其细胞表面高表达碱性成纤维细胞生长因子受体）和Cos-7（其细胞表面缺失碱性成纤维细胞生长因子受体）（均可购自ATCC）的结合特异性。简而言之，将孔中分别加有Balb/c 3T3和Cos-7细胞的平板用PBSM于37℃和5%二氧化碳的条件下封闭1小时，然后用0.05%PBST洗涤三次，每孔分别加入不同稀释度的展示肽的M13噬菌体克隆（委托SBS基因技术公司（北京）测序，其展示的肽序列为Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro）和PBS（作为对照），于室温孵育1小时。经PBST洗涤后，加入HRP-抗M13单克隆抗体于室温孵育1小时。经PBST洗涤后，加入TMB溶液，避光显色20分钟，加2M硫酸终止反应，并测定450nm/630nm处的吸光值。结果显示，展示肽序列为Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro的噬菌体结合Balb/c 3T3的解离常数Kd值为1.56Χ10¹⁰pfu，只有结合Cos-7细胞的Kd（2.50Χ10¹¹pfu）的十六分之一。这表明，展示Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro序列的噬菌体结合高表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的能力是不表达碱性成纤维细胞生长因子受体的细胞的16倍，具备结合特异性。

实施例2 肽的合成

通过固相肽合成方法，使用413A型自动肽合成仪（购自Perkin Elmer公司）来合成如以下序列所示的肽：Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser，其中的氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的具体过程如下：首先，保护氨基酸单体上的反应性基团：氨基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护；并对以下特定氨基酸进行侧链保护：对Ser和Tyr的侧链保护基为叔丁基，对Arg的侧链保护基为2，3，6-三甲基-4-甲氧苯横酰基(Mtr)。然后，以N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活化试剂，使受保护的氨基酸依次偶联，偶联每次40分钟。在15％乙二硫醇/ 二甲硫醚/茴香醚(体积比为1∶1∶1)存在的情况下，肽与三氟乙酸(85％)在室温反应120分钟，从而从聚合体支持物上切割下来，同时脱除保护基并将C末端酰胺化。接着用无水乙醚沉淀肽，然后用无水乙醚多次洗涤，充分除去硫醇。在水/叔丁醇(1∶1)中沉淀，冷冻干燥，得到粗肽。粗肽在30分钟内以反向HPLC纯化，以37-42％乙晴/0.9％TFA梯度进行。然后进行浓缩、冻干。由此得到合成肽Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser，经HPLC检测，其纯度≥98％。

实施例3 肽对肿瘤细胞存活率的影响

将黑素瘤细胞株B16-F10（可购自ATCC）置于96孔板的孔中，每孔5000个细胞。其中，B16-F10细胞在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24小时后，弃去培养基，加入含0.4%胎牛血清的DMEM培养基中继续培养24小时。弃去培养基，分别在各孔中等体积加入含30ng/ml bFGF、以及不同稀释度（1nM，10nM，100nM，1000nM）的实施例2制备的肽和30ng/ml bFGF的混合物的DMEM培养基，孵育48小时。根据MTT法，即用噻唑兰显色检测活细胞的数量。结果发现，当单独加入30ng/ml bFGF的时候，B16-F10细胞株有显著增殖；当加入不同稀释度的实施例2制备的肽和30ng/ml bFGF的混合物的时候，B16-F10细胞受30ng/ml bFGF影响而增殖的幅度明显减少，减少的量是呈肽剂量依赖性的，当肽浓度达到10nM时，增殖抑制率接近90%。

实施例4 肽对MAP激酶活化的影响

检测实施例2制备的肽对bFGF 刺激的黑素瘤B16-F10细胞中MAPK通路的Erk1/ Erk2信号分子活化水平的影响。简而言之，B16-F10细胞在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24小时后，弃去培养基，加入含0.4%胎牛血清的DMEM培养基继续培养24小时。先用不同稀释度的实施例2制备的肽与细胞混合预处理5分钟，对照组（阳性和阴性）都加等体积PBS。然后，用肽预处理的细胞和阳性对照组细胞中都分别加入30ng/ml bFGF刺激20分钟，阴性对照组加入等体积PBS。经PBS洗涤后，加入SDS-PAGE电泳上样缓冲液裂解细胞，然后进行10%SDS-PAGE电泳。电泳后，转膜至PVDF膜上，先加入抗pErk1/pErk2的兔单克隆抗体，然后加入HRP偶连的羊抗兔抗体，在ECL检测系统中观察免疫印迹的结果。结果显示，实施例2制备的肽以剂量依赖性的方式抑制bFGF诱导的Erk1和Erk2的活化（磷酸化），当肽的浓度达到10nM时，bFGF诱导的Erk1和Erk2活化完全被抑制。

实施例5 肽的体内抗肿瘤效果

黑素瘤细胞B16-F10皮下注射7周龄大的雌性C57BL/6小鼠，每只注射5Χ10⁵个细胞。7天后所有小鼠都可观察到肿瘤产生，然后每隔一天腹膜内注射剂量为0.5或2.5mg/kg的实施例2制备的肽，一共注射5次，对照组注射PBS。测量并计算瘤体的体积，同时通过显微镜观察用抗pErk1/pErk2的兔单克隆抗体处理的肿瘤组织的切片。结果显示，实施例2制备的肽呈剂量依赖性抑制小鼠的肿瘤生长，在第16天时，剂量为0.5 mg/kg的肽的抑瘤率为38%，而剂量为2.5 mg/kg的肽的抑瘤率为82%。免疫染色的结果也显示，与对照组相比，实施例2制备的肽的治疗组中pErk1/pErk2阳性细胞数显著减少，且呈剂量依赖性。这些结果都表明，实施例2制备的肽可有效抑制瘤体细胞Erk1和Erk2的活化。

Claims

1.序列为Leu-Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser的肽或其药学上可接受的盐或酯。

2.组合物，其包括权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐或酯，以及药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备特异性结合表达bFGF受体的细胞的组合物中的应用。

4.权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制细胞增殖的组合物中的应用。

5.权利要求4所述的应用，其中细胞增殖是由碱性成纤维细胞生长因子诱导的。

6.权利要求4或5所述的应用，其中细胞是肿瘤细胞。

7.权利要求6所述的应用，其中细胞是黑素瘤细胞。

8.权利要求1或2所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗Erk1和Erk2激酶活化的药物或试剂中的应用。

9.权利要求1或2所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤的药物中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其中肿瘤是黑素瘤。