CN102559613B - 一种恶性疟疾疫苗及其制备方法 - Google Patents

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CN102559613B CN201210005571.5A CN201210005571A CN102559613B CN 102559613 B CN102559613 B CN 102559613B CN 201210005571 A CN201210005571 A CN 201210005571A CN 102559613 B CN102559613 B CN 102559613B
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recombinant
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pfastbaci
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张耀洲
申俊
陈剑清
舒特俊
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TEFEI (TIANJIN) BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

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Abstract

本发明涉及一种恶性疟疾疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明通过构建一种家蚕重组杆状病毒，并运用重组杆状病毒表面展示技术构建表达恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域的重组杆状病毒，以家蚕蛹作为生物反应器生产该重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原生产疫苗。相比传统疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。

Description

一种恶性疟疾疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种恶性疟疾疫苗及其制备方法，尤其涉及恶性疟疾疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。
背景技术
疟疾是当今世界对人类危害最为严重的传染性疾病之一。据WHO最新估计，全球每年发生3亿-5亿起急性感染病例，有100多万人因这一疾病而死亡，其中大多数为非洲撒哈拉以南地区5岁以下的儿童。近年来，由于耐药性疟原虫株和耐药蚊媒的不断产生和扩散，使疟疾控制形势更为严峻。因此，研制有效的疟疾疫苗，成为控制疟疾的发病率和病死率迫切需要解决的课题。
在众多的疟疾疫苗候选抗原中，恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(apical membrane antigen-1，AMA-1)在裂殖子入侵宿主红细胞过程中发挥重要作用，有希望的抗疟原虫感染的疫苗候选分子。随着AMA1分子生物学研究的深入，人们开始研制AMA1亚单位疫苗，目前世界上生物技术常用的生物体是大肠杆菌和酵母，用大肠杆菌表达的AMA1蛋白无免疫原性和保护性，而酵母表达AMA1也不能产生有效的中和抗体。哺乳细胞表达系统(CHO)等表达系统虽然效果好，但因表达量低，同时需大量培养基和牛血清蛋白，成本高，不适合生产需要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的恶性疟疾疫苗。本发明通过构建一种家蚕重组杆状病毒，并运用重组杆状病毒表面展示技术构建表达恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域的重组杆状病毒Bmgp64AMA1，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原生产疫苗，相比传统疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5601。
上述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1) 由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分别通过BamH I /EcoRI和Xho I /HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBacI-gp64；
(2) 由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域基因序列，其5’和3’端分别引入EcoR I和Xho I酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBacI-gp64，构建成重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1；
(3)取步骤(2)所得的重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，培养20~24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定;
(4) 取步骤(3)鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0~4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1。
本发明还提供上述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
上述蛋白的制备方法包括以下步骤：
将上述家蚕杆状病毒Bmgp64AMA1感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；
针刺接种法接入家蚕五龄幼虫或蚕蛹；
收集表达的上述蛋白。
本发明进一步提供上述重组杆状病毒Bmgp64AMA1在制备恶性疟疾疫苗中的应用。
本发明还提供上述蛋白在制备恶性疟疾疫苗中的应用。
本发明实现的技术效果如下：
利用家蚕幼虫、蛹作为生物反应器，家蚕杆状病毒表达系统高效表达具有极高临床应用价值疟疾疫苗的方法，本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的疟疾疫苗应用价值大；
疟疾疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产，家蚕杆状病毒表达系统是真核表达，具有翻译后修饰功能。AMA1胞外域蛋白的免疫原性与其正确构型有关，利用真核表达可以具备较好的免疫原性。
附图说明
图1：融合杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽和跨膜区的表面展示载体pFastBacI-gp64；
图2：含有PfAMA1 ectodomain的融合基因结构示意图；
pPolh：多角体启动子；SP：gp64基因的信号肽序列；PfAMA1 ectodomain：恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域；TM：gp64基因的跨膜区序列；Poly(A)：多腺苷酸化信号；Stu I：酶切位点； Xho I：酶切位点。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
本发明所述恶性疟疾疫苗的制备方法，通过PCR的方法获得恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域基因序列（恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域），将其插入融合gp64信号肽和跨膜区的表面展示载体pFastBacI-gp64中，获得pFastBacI-gp64-AMA1重组质粒，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过转座获得重组Bacmid-AMA1，将其转染家蚕BmN细胞，在细胞内装配形成重组杆状病毒Bmgp64AMA1，并复制扩增，用第三代Bmgp64AMA1接种家蚕幼虫，蛹，经5-7天后收集幼虫体液和蛹体，匀浆、离心、分离纯化，冷冻干燥，无菌条件下制成恶性疟疾疫苗冻干粉实现。
下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。
实施例1：重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1的构建
以杆状病毒gp64序列为模板，分别用引物P1、P2和P3、P4进行PCR扩增gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区序列(TM)，PCR产物通过BamH I/EcoR I和Xho I /HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端，构建展示载体pFstBacI-gp64(载体结构如图1所示)。然后以恶性疟原虫3D7标准株cDNA为模板，用引物P5、P6进行PCR扩增恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域AMA1 ectodomain，PCR产物通过Stu I和Xho I双酶切插入表面展示载体pFastBacI-gp64，构建重组转移载体pFastBacI-gp64-AMA1。该重组转移载体包括多角体启动子（pPolh）、gp64信号肽（SP）和跨膜区（TM）、恶性疟原虫顶端膜抗原AMA1胞外域（PfAMA1 ectodomain），结构如图2所示，将含有PfAMA1 ectodomain（融合有gp64 ）的通过Stu I和Xho I插入到多角体启动子下，利用该多角体启动子启动AMA1融合基因的表达，使融合蛋白N端具有信号肽(SP)，C端具有跨膜区(TM)，由于该启动子属于极晚期基因启动子且为强启动子，即使融合蛋白是对杆状病毒和宿主细胞有毒性的蛋白，由于以该启动子启动融合基因表达时病毒粒子已经形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表达。恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域（PfAMA1）通过杆状病毒囊膜蛋白gp64的信号肽（SP）引导和跨膜区（TM）锚定展示于杆状病毒表面，形成刺猬状（伪病毒），末端的多腺苷酸化信号PolyA对融合蛋白的翻译有重要作用。引物序列设计如下：
                                                 
Figure 332862DEST_PATH_IMAGE001
 (1)gp64信号肽(SP)的扩增
以gp64 DNA为模板，PCR反应参数设计为，94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸30s，30个循环，68℃延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer             10μl
25mmol MgCl2                8μl
2.5 mmol dNTPs               8μl
Psp1                                  1μl
Psp2                                  1μl
模板                                  1μl
KOD-Plus DNA聚合酶     1μl
加无菌双蒸水至            100μl
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。 待反应结束后，电泳鉴定扩增片断, 同时切胶回收目的片断。
(2)gp64跨膜域(TM)的扩增
以gp64 DNA为模板，PCR反应参数设计为，94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸30s，30个循环，68℃延伸5min。
100μl的反应体系同上，所用引物为Ptm3 和Ptm4，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。 待反应结束后，电泳鉴定扩增片断, 同时切胶回收目的片断。
(3)AMA1 ectodomain基因的扩增
以恶性疟原虫3D7标准株cDNA为模板，PCR反应参数为94℃预变性5min，94℃变性45s，53℃退火30s，68℃复性延伸90s，35个循环，68℃延伸10min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer                5μl
2.5mmol MgSO4                2μl
2.5 mmol dNTPs                5μl
Pama1                              1.5μl
Pama2                              1.5μl
模板                                   1μl
KOD-Plus DNA聚合酶      1μl
加无菌双蒸水至               50μl
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计35个循环。 待反应结束后，电泳鉴定扩增片断, 同时切胶回收目的片断。
(4) 重组转移质粒构建
将上述PCR扩增获得的gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区序列(TM)分别通过BamH I、EcoR I和Xho I、HindⅢ(购自Fermentas公司)双酶切插入pFastBacI载体（购自Invitrogen公司）多克隆位点上下游两端，构建展示载体pFstBacI-gp64。然后将AMA1 ectodomain的PCR产物通过Stu I和Xho I (购自Fermentas公司)双酶切插入展示载体pFastBacI-gp64，构建重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1。通过酶切分析、双向测序鉴定基因序列正确。
实施例2：家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1的获得
鉴定重组成功的重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞（购自Invitrogen公司），在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板（购自上海生工生物公司）上进行蓝白斑筛选，避光培养48h后挑取白斑，培养24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定。鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞（购自Invitrogen公司）(方法参照Invitrogen 公司脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent说明书)，发病后（显微镜观察）获得一代病毒悬液4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒株Bmgp64AMA1。
实施例3：AMA1融合蛋白在家蚕5龄幼虫和蛹中的表达
将家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1以10MOI病毒感染BmN细胞进行病毒扩增，按1×10PFU/条针刺接种法接入家蚕五龄幼虫或蚕蛹（购自浙江中奇生物药业股份有限公司），感染5-7天后，采取幼虫体或蛹体匀浆，经高速离心(12000rpm，30min)，取上清，检测重组蛋白的表达。高速离心后的上清加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris HCl，4%SDS，0.15%溴酚蓝，10%甘油)，100℃加热10min，取20μl进行SDS-PAGE分析，结果表明，该家蚕重组杆状病毒已表达AMA1融合蛋白，蛋白测序结果显示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
实施例4：恶性疟疾疫苗的获得
(1)从蚕蛹中分离纯化AMA1融合蛋白(恶性疟疾疫苗)
a．取500g经Bmgp64AMA1感染的蚕蛹样品，4℃解冻后，与1L灭菌ddH2O 混合，匀浆至浆液细致均匀即可；
b．将约1.3L匀浆液加入500ml离心管中，配平，8000rpm离心30min，取上清，小心弃去油脂；
c．将8000rpm离心上清液倒入50ml离心管，配平，12000rpm离心30-120min，取上清，弃油脂；
d．将12000rpm离心上清液倒入50ml离心管，配平，15000rpm离心30-120min，取上清，弃油脂；
e．将15000rpm离心上清液倒入50ml离心管，配平，18000rpm离心30-120min，取上清，弃油脂；
f．18000rpm离心后的上清，在超净台上分装于灭菌的超离管中，用注射器赶走管内气泡，平衡，放入日立CP70MX离心机中，35000rpm离心30-90min；
(2)超滤
收集35000rpm离心后上清液（约500mL），用截留分子量为300KD的中空纤维膜进行超滤，不断加入无菌水，所用无菌水体积约为样品的10倍，整个超滤过程均在4℃环境下操作。
(3)疫苗效果
恶性疟疾疫苗进行动物体中试验，免疫动物为新西兰雄兔（购自天津市奥臣实验动物销售有限公司，11周龄，2.3kg），皮下注射，注射剂量为0.1-50mg/kg，2-4周后检测抗体效价，其保护抗体效价大于1：150，攻毒试验结果显示该剂量（0.1-50mg/kg）疫苗能产生中和抗体并具有明显抵抗病毒的效果。恶性疟疾疫苗进行恶性疟原虫（云南昆明医学院）侵染实验，其保护抗体效价大于1：150，并具有明显抵抗疟原虫侵染的效果。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  特菲（天津）生物医药科技有限公司
     
 
<120>  一种恶性疟疾疫苗及其制备方法
 
<130>  111705-I-CP-TJYU
 
<160>  10   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
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<213>  引物
 
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acgta                                                                65
 
 
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tatgatattg aagaagttca tggttcaggt ataagagtag atttaggaga agatgctgaa      120
 
gtagctggaa ctcaatatag acttccatca gggaaatgtc cagtatttgg taaaggtata      180
 
attattgaga attcaaatac tactttttta acaccggtag ctacgggaaa tcaatattta      240
 
aaagatggag gttttgcttt tcctccaaca gaacctctta tgtcaccaat gacattagat      300
 
gaaatgagac atttttataa agataataaa tatgtaaaaa atttagatga attgacttta      360
 
tgttcaagac atgcaggaaa tatgattcca gataatgata aaaattcaaa ttataaatat      420
 
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gaacataaac caacttatga taaaatgaaa                                      1350
 
 
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<210>  10
<211>  450
<212>  PRT
<213>  PfAMA1胞外域蛋白
 
<400>  10
 
Ile Glu Ile Val Glu Arg Ser Asn Tyr Met Gly Asn Pro Trp Thr Glu
1               5                   10                  15     
 
 
Tyr Met Ala Lys Tyr Asp Ile Glu Glu Val His Gly Ser Gly Ile Arg
            20                  25                  30         
 
 
Val Asp Leu Gly Glu Asp Ala Glu Val Ala Gly Thr Gln Tyr Arg Leu
        35                  40                  45             
 
 
Pro Ser Gly Lys Cys Pro Val Phe Gly Lys Gly Ile Ile Ile Glu Asn
    50                  55                  60                 
 
 
Ser Asn Thr Thr Phe Leu Thr Pro Val Ala Thr Gly Asn Gln Tyr Leu
65                  70                  75                  80 
 
 
Lys Asp Gly Gly Phe Ala Phe Pro Pro Thr Glu Pro Leu Met Ser Pro
                85                  90                  95     
 
 
Met Thr Leu Asp Glu Met Arg His Phe Tyr Lys Asp Asn Lys Tyr Val
            100                 105                 110        
 
 
Lys Asn Leu Asp Glu Leu Thr Leu Cys Ser Arg His Ala Gly Asn Met
        115                 120                 125             
 
 
Ile Pro Asp Asn Asp Lys Asn Ser Asn Tyr Lys Tyr Pro Ala Val Tyr
    130                 135                 140                
 
 
Asp Asp Lys Asp Lys Lys Cys His Ile Leu Tyr Ile Ala Ala Gln Glu
145                 150                 155                 160
 
 
Asn Asn Gly Pro Arg Tyr Cys Asn Lys Asp Glu Ser Lys Arg Asn Ser
                165                 170                 175    
 
 
Met Phe Cys Phe Arg Pro Ala Lys Asp Ile Ser Phe Gln Asn Tyr Thr
            180                 185                 190        
 
 
Tyr Leu Ser Lys Asn Val Val Asp Asn Trp Glu Lys Val Cys Pro Arg
        195                 200                 205            
 
 
Lys Asn Leu Gln Asn Ala Lys Phe Gly Leu Trp Val Asp Gly Asn Cys
    210                 215                 220                
 
 
Glu Asp Ile Pro His Val Asn Glu Phe Pro Ala Ile Asp Leu Phe Glu
225                 230                 235                 240
 
 
Cys Asn Lys Leu Val Phe Glu Leu Ser Ala Ser Asp Gln Pro Lys Gln
                245                 250                 255    
 
 
Tyr Glu Gln His Leu Thr Asp Tyr Glu Lys Ile Lys Glu Gly Phe Lys
            260                 265                 270        
 
 
Asn Lys Asn Ala Ser Met Ile Lys Ser Ala Phe Leu Pro Thr Gly Ala
        275                 280                 285            
 
 
Phe Lys Ala Asp Arg Tyr Lys Ser His Gly Lys Gly Tyr Asn Trp Gly
    290                 295                 300                
 
 
Asn Tyr Asn Thr Glu Thr Gln Lys Cys Glu Ile Phe Asn Val Lys Pro
305                 310                 315                 320
 
 
Thr Cys Leu Ile Asn Asn Ser Ser Tyr Ile Ala Thr Thr Ala Leu Ser
                325                 330                 335    
 
 
His Pro Ile Glu Val Glu Asn Asn Phe Pro Cys Ser Leu Tyr Lys Asp
            340                 345                 350        
 
 
Glu Ile Met Lys Glu Ile Glu Arg Glu Ser Lys Arg Ile Lys Leu Asn
        355                 360                 365            
 
 
Asp Asn Asp Asp Glu Gly Asn Lys Lys Ile Ile Ala Pro Arg Ile Phe
    370                 375                 380                
 
 
Ile Ser Asp Asp Lys Asp Ser Leu Lys Cys Pro Cys Asp Pro Glu Met
385                 390                 395                 400
 
 
Val Ser Asn Ser Thr Cys Arg Phe Phe Val Cys Lys Cys Val Glu Arg
                405                 410                 415    
 
 
Arg Ala Glu Val Thr Ser Asn Asn Glu Val Val Val Lys Glu Glu Tyr
            420                 425                 430        
 
 
Lys Asp Glu Tyr Ala Asp Ile Pro Glu His Lys Pro Thr Tyr Asp Lys
        435                 440                 445            
 
 
Met Lys
    450

Claims (3)

1.一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5601，且所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1属于家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus）。
2.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1) 以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物Pspl和Psp2由PCR扩增获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物Ptm3和Ptm4由PCR扩增获得杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分别通过BamH I/EcoR I和Xho I/HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBacI-gp64；
(2) 以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物Pama5和Pama6由PCR扩增获得恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域基因序列，通过扩增产物5’和3’端的EcoRI和XhoI酶切位点连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBacI-gp64，构建成重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1；
(3)取步骤(2)所得的重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，培养20~24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定;
(4) 取步骤(3)鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0~4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1。
3.一种权利要求1所述重组杆状病毒Bmgp64AMA1在制备恶性疟疾疫苗中的应用。
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