CN111920802A - 穿心莲内酯在制备防治成人t细胞白血病药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用，属于医药领域。本发明提供的穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用，试验结果表明，穿心莲内酯对ATL细胞具有较好的靶向细胞毒作用，且对正常细胞株HEK 293的毒性较低；穿心莲内酯还可以抑制HTLV‑1致病关键基因HBZ的表达，促进ATL细胞凋亡，阻滞ATL细胞在细胞周期的G2/M期或SubG1期；穿心莲内酯还可以抑制ATL细胞的成瘤风险，并促进已成瘤细胞的坏死。本发明提供的穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用中取得了良好的预防和治疗效果且安全无后遗症。

Description

穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用。

背景技术

成人T细胞白血病(ATL)是一种由人T细胞淋巴瘤病毒Ⅰ型(Human T-lymphotropicvirus 1，HTLV-1)引起的成熟活化T细胞恶性肿瘤。该疾病临床主要表现为皮肤浸润，淋巴结肿大和花瓣状细胞核。由于其自身的化疗抵抗和严重的免疫抑制，预后较差。

在人体内，HTLV-1存在于不同类型的细胞中，如CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、内皮细胞和单核细胞。然而，只有CD4+T细胞经历HTLV-1依赖性细胞转化。因此被认为是HTLV-1病毒的主要细胞靶点。HTLV-1主要是通过血液传播、母婴传播和性传播三种途径。目前，全世界范围内HTLV-1感染者大约2000万人，主要流行区域是日本，美拉尼西亚，南美洲，撒哈拉以南非洲的部分地区，加勒比海地区，澳大利亚中部地区和中东地区。在我国集中分布于东南沿海福建省及台湾地区。随着人口流动的增多，HTLV-1感染人群在我国有扩大的趋势。

迄今为止，对ATL进行的几种化疗方案治疗效率低，中间生存时间不超过8个月，只有10％的病人存活超过两年。采用LSG15化疗方案，即环磷酰胺+长春新碱+多柔比星+泼尼松+长春地辛+依托泊苷+卡铂联合化疗方案，配合使用粒细胞集落刺激因子，鞘内注射甲氨蝶呤与泼尼松等对症进行治疗，取得了一定的疗效，但是往往产生耐药性。ATL治疗的最新进展是针对CC趋化因子受体4(CCR4)的靶向治疗，CCR4主要在调节性Treg细胞和辅助性Th2细胞中表达，诱导这些白细胞归巢到炎症部位。CCR4在ATL高度表达，约90％的HTLV-1感染者为CCR4阳性，但CCR4阳性ATL患者预后比CCR4阴性ATL患者差。自体造血干细胞移植也取得一定的疗效。自体造血干细胞移植(Allo-HSCT)通过强大的免疫应答和其用供体细胞代替造血系统消除了HTLV-1整合受体ATL的克隆，可能是治疗ATL的有效方法。但是后期研究发现虽然Allo-SCT在ATL治疗的初步病例有一定的疗效，但是在一些免疫功能低下的患者中显示高毒性和高达40％移植相关的死亡率。Allo-SCT适合年轻的ATL患者，但是找到与患者相匹配的人类白血病抗原HLA比较难，虽然治愈率高但是却有高风险。因此迫切需要新的治疗策略。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用。本发明穿心莲内酯制备的药物可以抑制HTLV-1致病关键基因HBZ的表达，抑制ATL细胞的成瘤风险，并促进已成瘤细胞的坏死，具有良好的防治成人T细胞白血病的功效，且穿心莲内酯为天然药物成分，安全无耐药性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用。

优选的，所述成人T细胞白血病的细胞类型为ATL-ED型。

优选的，所述穿心莲内酯防治成人T细胞白血病的分子靶点为I型人T细胞白血病病毒的HBZ基因。

本发明提供了穿心莲内酯在制备促进ATL细胞凋亡药物中的应用。

本发明提供了穿心莲内酯在制备阻滞ATL细胞在细胞周期的G2/M期或SubG1期药物中的应用。

有益效果：

本发明提供了穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用。试验结果表明，穿心莲内酯对ATL细胞具有较好的靶向细胞毒作用，且对正常细胞株HEK 293的毒性较低；穿心莲内酯还可以抑制HTLV-1致病关键基因HBZ的表达，促进ATL细胞凋亡，阻滞ATL细胞在细胞周期的G2/M期或SubG1期；穿心莲内酯还可以抑制ATL细胞的成瘤风险，并促进已成瘤细胞的坏死。本发明提供的穿心莲内酯在制备预防和/或治疗成人T细胞白血病药物的应用中取得了良好的防治效果且安全无后遗症。

附图说明

图1为实施例2Hoechst 33258染色法检测穿心莲内酯对ATL-ED细胞凋亡的影响；

图2为实施例2双染法检测穿心莲内酯剂量对不同ATL细胞凋亡的影响；A：ATL-ED细胞；B：TL-om1细胞；C：ATL-2细胞；

图3为实施例4穿心莲内酯对ATL细胞HBZ表达的影响；

图4为实施例5口服穿心莲内酯对ATL细胞成瘤性的抑制作用；

图5为实施例5口服穿心莲内酯对ATL肿瘤细胞坏死的影响。

具体实施方式

本发明提供了穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物中的应用。本发明对药物的剂型、药物的敷料和药物的制备方法无特殊要求，采用本领域技术人员熟知的即可。在本发明中，所述成人T细胞白血病的细胞类型优选为ATL-ED型。在本发明中，所述穿心莲内酯防治成人T细胞白血病的分子靶点为I型人T细胞白血病病毒的HBZ基因，所述HBZ基因基因的登录号为KF053885.1。

本发明提供了穿心莲内酯在制备促进ATL细胞凋亡药物中的应用。

本发明还提供了穿心莲内酯在制备阻滞ATL细胞在细胞周期的G2/M期或SubG1期药物中的应用。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

穿心莲内酯对ATL细胞的抑制作用

采用CCK-8法(碧云天生物技术公司(上海)试剂盒)检测穿心莲内酯对不同种类ATL细胞活力的影响，评价穿心莲内酯对ATL细胞的抑制作用，检测结果见表1。

具体步骤如下：

(1)细胞准备：取对数生长期的成人T细胞白血病细胞株ATL-ED、ATL-2(两个细胞株均从日本熊本大学Matsuoka购买)，以及急性T细胞白血病细胞株Jurkat(购自上海细胞生物公司)和正常细胞株HEK 293(购自上海细胞生物公司)等细胞，按10000个/孔接种96孔板，每孔加90μl，置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养24h；

(2)药物准备：培养24h后加入经系列稀释后的穿心莲内酯，其终浓度分别为5μM、10μM、20μM、40μM和80μM。

(3)CCK-8测定：药物处理后24h、48h、72h后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，37℃避光孵育1h；采用酶标仪检测450nm波长和650nm参比波长处检测每孔的吸光度值；

(4)计算生存率：生存率(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％；

(5)计算IC₅₀值。

其中，实验组为添加了细胞、CCK溶液和药物溶液的孔，对照组为添加了细胞、CCK溶液的孔，空白组为添加了培养基、CCK溶液的孔。

不同浓度穿心莲内酯对各种细胞活力的抑制结果见表1。计算对各细胞的IC₅₀值，见表5。

表1穿心莲内酯对各种细胞生存率(％)(均值±SD)的影响

浓度(μM)

0

5

10

20

40

80

ATL-ED

100±3

37±15

21±6

15±4

14±6

8±4

ATL-2

100±3

140±5

114±4

103±4

76±4

39±6

Jurkat

100±4

130±23

67±6

7±2

2±2

1±0.4

HEK293

100±12

106±7

104±13

64±3

20±5

1.5±0.8

对比例1

藤黄酸对ATL细胞的抑制作用，方法同实施例1。藤黄酸的终浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM和3.2μM，结果见表2。计算对各细胞的IC₅₀值，见表5。

表2藤黄酸对各种细胞生存率(％)(均值±SD)的影响

浓度(μM)

0

0.2

0.4

0.8

1.6

3.2

ATL-ED

100±3

34±9

4±1

1±1

0.6±1

0±0.5

ATL-2

100±1

19±1

21±1

22±1

10±1

0.7±0.6

Jurkat

100±3

11±5

3±0.6

0±0.7

0.5±1.3

1.6±1

HEK293

100±6

3±1

0.6±0.4

0±0

0±0

0±0

对比例2

丹参酮IIA对ATL细胞的抑制作用，方法同实施例1。丹参酮IIA的终浓度分别为3.75μM、7.5μM、15μM、30μM和60μM，结果见表3。计算对各细胞的IC₅₀值，见表5。

表3丹参酮IIA对各种细胞生存率(％)(均值±SD)的影响

浓度(μM)

0

3.75

7.5

15

30

60

ATL-ED

100±3

34±9

4±1

1±1

0.6±1

0±0.5

ATL-2

100±1

19±1

21±1

22±1

10±1

0.7±0.6

Jurkat

100±3

11±5

3±0.6

0±0.7

0.5±1.3

1.6±1

HEK293

100±6

3±1

0.6±0.4

0±0

0±0

0±0

对比例3

色胺酮对ATL细胞的抑制作用，方法同实施例1。色胺酮的终浓度分别为2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM，结果见表4。计算对各细胞的IC₅₀值，见表5。

表4色胺酮对各种细胞生存率(％)(均值±SD)的影响

浓度(μM)

0

2.5

5

10

20

40

ATL-ED

100±3

89±5

69±3

68±3

40±2

20±2

ATL-2

100±3

152±5

184±6

172±8

123±3

99±12

Jurkat

100±6

93±13

77±23

46±3

33±4

28±2

HEK293

100±5

131±7

75±11

58±10

42±4

36±1

表5不同药物对不同的细胞株IC₅₀值(μM)的确定

结果分析：由表5可知，穿心莲内酯对ATL-ED细胞具有较好的细胞毒作用，并且对正常细胞株HEK 293和急性T细胞白血病细胞的毒性较低，显示其对于ATL细胞具有靶向细胞毒作用；藤黄酸对ATL细胞、正常细胞和急性T细胞白血病细胞的毒性很大，不适合用于治疗成人T细胞白血病；色胺酮和丹参酮IIA对ATL细胞、正常细胞和急性T细胞白血病细胞的毒性均较小，对ATL细胞不具有靶向细胞毒作用。

实施例2

穿心莲内酯对ATL细胞凋亡的影响

(1)Hoechst 33258染色法

取对数生长期的ATL-ED细胞接种于内置盖玻片的6孔板，细胞浓度为3×10⁵/ml，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。培养24h后，更换为含不同浓度穿心莲内酯的培养基继续培养24h。其中，穿心莲内酯的浓度分别为0μM(对照)、5μM、10μM和20μM。

吸尽培养液，每孔加固定液500μl固定15min，后用PBS洗两遍；每孔加入浓度为5mg/ml的Hoechst 33258染色液(购自碧云天生物技术公司)置培养箱中孵育15min，用PBS洗两遍，将孔中的盖玻片取出，盖在已滴加甘油的载玻片上；置于激发波长为350nm的荧光显微镜下观察并拍照，结果见图1。

结果分析：由图1可知，对照组的细胞核Hoechest着色后形态呈圆形，淡蓝色；随着穿心莲内酯药物浓度的增加，细胞逐渐变为亮蓝色，说明穿心莲内酯能诱导细胞凋亡。

(2)采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测穿心莲内酯对ATL细胞凋亡的影响

取对数生长期的ATL-ED、TL-Om1(从日本熊本大学Matsuoka购买)、ATL-2细胞，接种于六孔板，细胞密度为3×10⁵/孔，37℃，5％CO₂培养箱培养24h；吸出培养基，更换为含不同浓度穿心莲内酯(0、5、10、20μM)的培养基培养24h和48h，收集细胞，用PBS洗涤两次，1000rpm离心5min，弃上清，PBS重悬细胞，移入1.5ml离心管中待测。

采用AnnexinV-FITC/PI试剂盒(购自碧云天生物技术公司)进行检测，检测步骤如下：

从对照组(无药物处理)细胞取四份，每份重悬于1×结合液，细胞密度为1×10⁶细胞/ml。一份不做染色处理，作为染料双阴组(PI-AV-)；一份加入5μlAnnexinV-FITC，作为AnnexinV+单阳组；一份加入5μl PI，作为PI+单阳组；最后一份加入5μlAnnexinV-FITC和5μl PI，作为AnnexinV+PI+双阳组。轻轻涡旋细胞，在室温下避光孵育15min。

采用BD FACSCaliburTM Flow cytometer流式细胞仪，先测定双阴管和单阳管，调节荧光补偿，设置十字门。

样品按照双阳组方法处理，对测定结果进行分析，结果如图2所示。

结果分析：用药24h、48h后，随着药物浓度的增加，ATL-ED与TL-om1细胞凋亡率呈剂量依赖性增加。当作用24h时，药物对ATL-ED与TL-om1细胞凋亡率由对照组(2.84±0.01)％和(13.21±0.98)％上升到20μM的(34.29±0.96)％和(20.34±0.26)％。作用48h时，细胞凋亡率从对照组的(7.29±0.28)％和(13.91±0.49)％上升到20μM的(85.80±3.6)％和(64.85±0.85)％。同时穿心莲内酯也能诱导ATL-2细胞凋亡，并且具有明显的浓度依赖性。

实施例3

穿心莲内酯对ATL细胞周期的影响

为了考察穿心莲内酯诱导的ATL生长抑制和细胞凋亡是否由于细胞周期停滞，采用不同浓度的穿心莲内酯处理ATL细胞，以核酸荧光染料(购自碧云天生物技术公司)染色后，流式细胞仪检测细胞周期的比例，结果如表6～8。

表6穿心莲内酯加药24h对ATL-ED细胞周期各时期百分比含量

由表6可知，穿心莲内酯能够使ATL-ED细胞阻滞在G2/M期，伴随着G0/G1、S期比例下降。对照组的G2/M期细胞数量为32.05％，浓度为10μmol/l的穿心莲内酯处理24小时后上升到47.15％。浓度为20μmol/l的穿心莲内酯处理24小时后，虽然G2/M期比例变化不明显，但是出现了亚二倍体凋亡峰，SubG1分数由对照组的4.28％上升到9.79％。

表7穿心莲内酯加药24h对TL-om1细胞周期各时期百分比含量

由表7可知，穿心莲内酯作用TL-om1细胞24h，周期阻滞不是很明显，但是随着浓度的增加，出现亚二倍体凋亡峰。SubG1分数由对照组的0.02％上升到10.34％。

表8穿心莲内酯加药48h对ATL-2细胞周期各时期百分比含量

由表8可知，穿心莲内酯处理ATL-2细胞后，对细胞周期的影响不明显。

实施例4

穿心莲内酯对ATL细胞HBZ表达的影响

ATL细胞是由于HTLV-1感染而白血病化的细胞。HBZ由HTLV1基因组的负链RNA编码，在ATL发展过程中稳定表达，可促进成人T细胞白血病的发生和恶化。

本发明通过RT-PCR(诺唯赞生物科技有限公司(南京)试剂盒)检测穿心莲内酯对ATL细胞表达HBZ的影响。所采用的正向引物序列如ATGGCGGCCTCAGG(SEQ ID No.1)，反向引物序列如GCTTTCTCCCC TGGAGGGCC(SEQ ID No.2)，结果如图3所示。

由图3可知，穿心莲内酯作用于ATL-ED细胞48h后，HBZ mRNA的表达量下调，说明穿心莲内酯能够下调HBZ基因的表达从而调控白血病细胞的恶性增殖，抑制成人T细胞白血病的发生。

实施例5

穿心莲内酯对ATL细胞成瘤性的影响

为了研究穿心莲内酯对ATL细胞肿瘤形成的抑制作用，采用高度免疫缺陷的NCG小鼠为模型(促进肿瘤在体内形成)，观察穿心莲内酯对ATL-T细胞的成瘤抑制作用。

在6周龄的NCG雌性小鼠背部皮下注射ATL-ED细胞(1×10⁷个细胞)后，分为两组，每组6只。其中一组为对照组，另一组为治疗组。治疗组小鼠按体重每日灌胃给药,剂量50mg/kg。28日后处死小鼠称重，取肿瘤组织，结果如图4。由图4可知，治疗小鼠体内肿瘤体积较对照组出现了大幅度下降，说明穿心莲内酯可以有效地抑制ATL细胞在体内肿瘤的发生。

为了进一步研究穿心莲内酯对ATL细胞形成肿瘤的影响，对小鼠肿瘤组织进行了组织切片，之后通过瑞氏染色(购自碧云天生物技术公司)，观察肿瘤组织中ATL细胞的生长情况，结果如图5所示。由图5可知，在治疗组小鼠的肿瘤组织切片中发现了大量的肿瘤细胞坏死，而对照组的小鼠肿瘤组织未出现此现象。因此，穿心莲内酯不仅可以抑制ATL-ED细胞肿瘤的形成，而且可以导致ATL肿瘤的细胞坏死。

由上述实施例可知，穿心莲内酯可以抑制HTLV-1致病关键基因HBZ的表达，抑制ATL细胞的成瘤风险，并促进已成瘤细胞的坏死，具有良好的防治成人T细胞白血病的功效，且穿心莲内酯为天然药物成分，安全无耐药性。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcggcct cagg 14

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctttctccc ctggagggcc 20

Claims (5)

1.穿心莲内酯在制备防治成人T细胞白血病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成人T细胞白血病的细胞类型为ATL-ED型。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述穿心莲内酯防治成人T细胞白血病的分子靶点为I型人T细胞白血病病毒的HBZ基因。

4.穿心莲内酯在制备促进ATL细胞凋亡药物中的应用。

5.穿心莲内酯在制备阻滞ATL细胞在细胞周期的G2/M期或SubG1期药物中的应用。

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