CN113318105B

CN113318105B - 含Binimetinib的用于治疗结肠癌的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN113318105B
Application number: CN202110603000.0A
Authority: CN
Inventors: 钟加滕; 高五集; 贾慧婕; 赵铁锁; 陆漫漫; 张哲莹; 秦宇; 丁爽
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2041-05-31
Also published as: CN113318105A

Abstract

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体公开一种含Binimetinib的用于治疗结肠癌的药物组合物及其应用。实验结果表明，Binimetinib单独使用可以抑制细胞的生长，诱导细胞凋亡；进一步体内外实验表明，Binimetinib与化疗药物5‑FU或TRAIL联合使用，其诱导结肠癌细胞凋亡的效果显著高于任何单独用药组。

Description

含Binimetinib的用于治疗结肠癌的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体公开一种含Binimetinib的用于治疗结肠癌的药物组合物及其应用。

背景技术

结肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有136万新发病例。在男性中，它是仅次于肺癌和前列腺癌的第三种最常见癌症，在女性中仅次于乳腺癌。结肠癌的治疗方式有手术治疗、新辅助放化疗、靶向治疗、生物治疗等。尽管CRC患者的生存率有了明显的改善，但中老年患者的总生存率仍较低，其原因在于患者在治疗过程中肿瘤细胞对化疗药不敏感所致。因此必须寻找新的治疗策略来解决结肠癌患者耐药的情况，达到治疗结肠癌的最佳效果。

MEK(丝裂原活化蛋白激酶激酶，MAPKK)是一种磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激酶。而且MEK蛋白是RAF的下游效应子，由7个不同基因(MEK1、MEK2和MKK3-7)编码。Binimetinib是MEK1和MEK2有效的、非竞争性的、高度选择性的、非ATP竞争性的变构抑制剂。目前，Binimetinib处于临床试验阶段，之前的报道主要集中在Binimetinib治疗肺癌、黑色素瘤等，而在治疗结肠癌方面的报道甚少。

5-FU(5-氟尿嘧啶)是尿嘧啶的氟化类似物，是结肠癌辅助化疗药物的基本成分之一。然而在临床上5-FU的治疗往往是短暂的，5-FU最初能使肿瘤体积缩小，但是大多数患者在接受治疗后并没有实现肿瘤细胞的完全根除。同时在治疗过程中，由于在治疗癌症时使用的剂量较大，往往伴随不同程度、不同类型的副作用，给结肠癌患者治疗造成了很大的困扰。

肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)，又称Apo-2配体(Apo2L)，是TNF细胞因子超家族成员之一。它是一种有效的抗癌药物，因为它能靶向癌细胞，同时保留正常细胞，诱导细胞凋亡。TRAIL诱导细胞凋亡是局限的，而且在临床试验中效果也不理想。

发明内容

为解决现有药物对结肠癌患者治疗效果不佳的问题，本发明提供了Binimetinib在制备治疗结肠癌药物中的应用，Binimetinib还能联合化疗药物5-FU或TRAIL，并提高5-FU、TRAIL对结肠癌的治疗效果。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了Binimetinib在制备治疗结肠癌药物中的应用。

优选地，所述Binimetinib的浓度为20-320μM。

本发明还提供一种用于治疗结肠癌的药物组合物，其特征在于，其由所述Binimetinib与5-氟尿嘧啶按质量比为0.1-3：1组成，或

由所述Binimetinib与重组人TRAIL蛋白按质量比为85-1415：1组成。

上述药物组合物能够用于制备治疗结肠癌的药物。

优选地，所述药物组合物用于制备抑制结肠癌细胞生长并诱导结肠癌细胞凋亡的药物。

优选地，所述药物组合物用于制备抑制皮下瘤生长的药物。

本发明还提供一种用于治疗结肠癌的药物制剂，其以上述Binimetinib或上述药物组合物为活性成分，并辅以药学上可接受的辅料或载体。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

本发明利用MEK抑制剂Binimetinib单独使用或者是联合化疗药物5-FU或TRAIL，用于治疗结肠癌。实验结果表明，Binimetinib单独使用可以抑制结肠癌细胞的生长，诱导细胞凋亡；进一步体内外实验表明，Binimetinib与化疗药物5-FU或TRAIL联合使用，其诱导结肠癌细胞凋亡的效果显著高于任何单独用药组，为临床治疗结直肠癌联合用药提供了一种新思路。

附图说明

图1是单独使用不同浓度的Binimetinib对人结肠癌细胞HCT-116存活率的影响；

图2是单独使用不同浓度的Binimetinib诱导人结肠癌细胞HCT-116发生凋亡的蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-8表达结果；

图3是单独使用不同浓度的Binimetinib诱导人结肠癌细胞HCT-116发生凋亡的蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-8表达的统计结果；

图4是单独使用不同浓度的Binimetinib诱导人结肠癌细胞HCT-116发生凋亡的流式细胞术检测细胞凋亡率的结果；

图5是Binimetinib分别联合化疗药5-FU和TRAIL对人结肠癌细胞HCT-116存活率的影响；

图6是Binimetinib分别联合化疗药5-FU和TRAIL诱导人结肠癌细胞HCT-116的蛋白印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-8表达结果；其中，A、C是Binimetinib联合化疗药5-FU诱导人结肠癌细胞HCT-116的蛋白印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-8表达结果；B、D是Binimetinib联合化疗药TRAIL诱导人结肠癌细胞HCT-116的蛋白印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleavedcaspase-8表达结果；

图7是Binimetinib分别联合化疗药5-FU和TRAIL诱导人结肠癌细胞HCT-116的流式细胞术检测细胞凋亡率的结果；

图8是使用Binimetinib单药及分别联合化疗药5-FU、TRAIL治疗裸鼠后裸鼠皮下瘤情况；

图9是使用Binimetinib单药及分别联合化疗药5-FU、TRAIL治疗裸鼠后裸鼠皮下瘤重量情况；

图10是使用Binimetinib单药及分别联合化疗药5-FU、TRAIL治疗裸鼠后裸鼠皮下瘤大小变化情况；

图11是使用Binimetinib单药及分别联合化疗药5-FU、TRAIL治疗裸鼠后裸鼠体重变化情况。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明所用Binimetinib(比尼替尼)，分子式为C₁₇H₁₅BrF₂N₄O₃，结构式如式(1)所示；所用5-FU(5-氟脲嘧啶)，分子式为C₄H₃FN₂O₂，结构式如式(2)所示；所用TRAIL(重组人类TRAIL)，购买于MCE公司。

本发明提供了Binimetinib在制备治疗结肠癌药物中的应用；其中，Binimetinib能够抑制结肠癌细胞的生长，并诱导结肠癌细胞发生凋亡，且Binimetinib的有效浓度为20-320μM。

本发明还提供一种用于治疗结肠癌的药物组合物，其特征在于，其由Binimetinib与5-FU按质量比为0.1-3：1组成，或由Binimetinib与TRAIL按质量比为85-1415：1组成。

该药物组合物能够用于抑制结肠癌细胞生长并诱导结肠癌细胞凋亡，还能抑制皮下瘤生长。

本发明还提供一种用于治疗结肠癌的药物制剂，其以Binimetinib或上述药物组合物为活性成分，并辅以药学上可接受的辅料或载体。

下面对本发明的效果进行说明。

1、实验试剂及器材

结肠癌细胞HCT-116，American type culture collection(ATCC)公司；培养基、PBS，美国HyClone公司；胎牛血清、胰酶，美国Gibco公司；1％链霉素/青霉素，中国碧云天公司；药物Binimetinib、5-FU、TRAIL，美国MCE公司，按照药物说明书稀释；抗体CleavedCaspase-3、Cleaved caspase-8，美国Cell Signaling公司，按照说明书稀释；凋亡试剂盒，日本同仁公司；

需要说明的是，本发明实施例实验中所使用的药物、试剂、抗体等均可从其他商业途径购买，实验结果仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实验方法按照常规操作步骤操作或按照试剂商提供的实验方法操作。

2、细胞培养

人结肠癌细胞HCT-116用含有10％胎牛血清、1％链霉素/青霉素的DMEM培养基培养，细胞培养条件为：37℃、5％CO₂的孵育箱内。

3、药物浓度

实验中Binimetinib使用的浓度为20-320μM；5-FU固定使用浓度为50μg/ml，TRAIL固定使用浓度为100ng/ml。

4、体外实验

4.1、不同浓度的Binimetinib对人结肠癌细胞HCT-116存活率的影响

选取对数生长、状态良好的HCT-116铺96孔板，每孔约1.2×10⁴个细胞，每个药物浓度设置5个副孔，药物的浓度梯度为：0、20、40、80、160、320μM。

具体步骤如下：弃原培养基，用3ml PBS清洗细胞两次，1ml胰酶消化细胞1min，加入2ml培养基中和胰酶，转移细胞悬液至离心管中，2000rmp、1.5min离心；弃上清，加入新的培养基重悬细胞，取10μl计数，计算出所需细胞悬液。按照每孔100μl铺96孔板，24h细胞贴壁后，稀释Binimetinib 100μl含药物浓度分别0、20、40、80、160、320μM。

药物作用24h后，加入10μl的CCK8，孵育箱孵育2h后，酶标仪450nm处测吸光度值。图1结果显示，随着药物浓度的增加，HCT-116细胞的生存率降低，提示Binimetinib能够抑制HCT-116细胞的生长。

4.2、Binimetinib对结肠癌细胞HCT-116凋亡的影响

取对数生长的HCT-116细胞，消化离心细胞。重悬细胞后，接种至6cm培养皿内，24小时细胞完全贴壁后，药物处理细胞，药物浓度分别为：40、80、160μM，作用16-18h后，进行下一步操作。

提蛋白：药物处理后的细胞，弃上清，PBS清洗2次，加入适量的细胞裂解液，冰上裂解5min后，细胞刮刮取裂解液至EP管内，冰上裂解20min后，4℃、12000rpm、20min离心，收集上清。BCA工作法测蛋白浓度后，上清加入5ⅹ蛋白上样缓冲液稀释成1ⅹ，100℃金属浴煮10min后，上样。

按照蛋白质印迹实验操作步骤，检测凋亡相关cleaved caspase-3的表达。

凋亡检测：按照凋亡试剂盒操作说明书稀释10 ⅹ Annexin V binding Buffer成1 ⅹ Annexin V binding Buffer。

药物处理后的细胞，弃上清，PBS清洗2洗后，胰酶消化细胞，离心。弃上清，加入1ml1 ⅹ Annexin V binding Buffer重悬细胞，离心。弃上清，重复上述步骤一次。加入400μl的1 ⅹ Annexin V binding Buffer重悬细胞。然后分别加入5μl的FITC/PI试剂，避光15min后，上机检测。

图2-4结果显示，随着药物浓度的增加，HCT-116细胞中凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、cleaved caspase-8表达量增加，凋亡细胞数量增多，提示Binimetinib可以诱导HCT-116细胞发生凋亡。

4.3、Binimetinib分别联合化疗药5-FU和TRAIL对人结肠癌细胞HCT-116存活率的影响

选取对数生长、状态良好的HCT-116铺96孔板，每孔约1.2×10⁴个细胞，每个药物浓度设置5个副孔。Binimetinib终浓度为100μM、5-FU终浓度为50μg/ml、TRAIL终浓度为100ng/ml(由于Binimetinib与5-FU按质量比为0.1-3：1及Binimetinib与TRAIL按质量比为85-1415：1混合的效果基本相同，故在此仅选择其中一个比例为例进行效果说明)。每孔加入100μl含药物的培养基。加药顺序为：空白、Binimetinib、5-FU、TRAIL、Binimetinib+5-FU、Binimetinib+TRAIL。

具体步骤如下：弃原培养基，用3ml PBS清洗细胞两次，1ml胰酶消化细胞1min，加入2ml培养基中和胰酶，转移细胞悬液致离心管，2000rmp、1.5min离心。弃上清，加入新的培养基重悬细胞，取10μl计数，计算出所需细胞悬液。按照每孔100μl培养基铺96孔板，共6个药物浓度梯度。24h细胞贴壁后，稀释药物。药物作用24h后，加入10μl的CCK8，孵育箱孵育2h后，酶标仪450nm处测吸光度值。

图5结果显示，与单药组相比，化疗药5-FU/TRAIL联合使用Binimetinib，HCT-116细胞的生长率低。结果提示Binimetinib可以增强化疗药5-FU/TRAIL抑制HCT-116细胞生长的能力。

4.4、Binimetinib分别联合化疗药5-FU和TRAIL对HCT-116细胞凋亡的影响

取对数生长的HCT-116细胞，消化离心细胞。重悬细胞后，接种至6cm培养皿内，铺6个皿。24小时细胞完全贴壁后，药物处理细胞。药物浓度：Binimetinib终浓度为100μM、5-FU终浓度为50μg/ml、TRAIL终浓度为100ng/ml(由于Binimetinib与5-FU按质量比为0.1-3：1及Binimetinib与TRAIL按质量比为85-1415：1混合的效果基本相同，故在此仅选择其中一个比例为例进行效果说明)。加药顺序为：空白、Binimetinib、5-FU、TRAIL、Binimetinib+5-FU、Binimetinib+TRAIL。联合用药作用一段时间后，细胞皱缩，裂解达到40％以后。进行下一步操作。

按照蛋白质印迹实验操作步骤，检测凋亡相关cleaved caspase-8、cleavedcaspase-3的表达。

凋亡检测：按照凋亡试剂盒操作说明书稀释10 ⅹ Annexin V binding Buffer成1 ⅹ Annexin V binding Buffer。药物处理后的细胞，弃上清，PBS清洗2洗后，胰酶消化细胞，离心。弃上清，加入1ml 1 ⅹ Annexin V binding Buffer重悬细胞，离心。弃上清，重复上述步骤一次。加入400μl的1 ⅹ Annexin V binding Buffer重悬细胞。然后分别加入5μl的FITC/PI试剂，避光15min后，上机检测。

图6-7结果显示，与单药相比，Binimetinib联合使用化疗药5-FU、TRAIL，凋亡相关蛋白表达量增加，凋亡细胞量增加。结果提示Binimetinib联合化疗药5-FU/TRAIL诱导HCT-116细胞凋亡的能力增强。

5、体内实验

5.1、Binimetinib联合化疗药5-FU/TRAIL对裸鼠皮下瘤的影响。

在体外实验结果的基础上，进行裸鼠体内功能实验。

在裸鼠的右侧腹股沟皮下注射5×10⁶个HCT-116细胞，建立细胞系异种移植模型。观察裸鼠成瘤情况，待肿瘤生长至大约100mm³时，根据裸鼠体重及肿瘤大小将小鼠随机分为6组，每组3只，给予药物处理，分组如下：对照组(PBS)、5-FU组、TRAIL组、Binimetinib组、5-FU+Binimetinib、TRAIL+Binimetinib组。使用的药物浓度为：Binimetinib(2mg/kg/只，一日两次灌胃)、5-FU(20mg/kg/只，一日一次，腹腔注射)、TRAIL(0.5μg/只，三天一次，腹腔注射)对照组每只裸鼠腹腔注射100μl PBS，治疗组每组每只腹腔注射含有药物的PBS 100μl。每三天测量小鼠的体重、肿瘤的体积。治疗18天后，裸鼠出现消瘦等恶病质后，安乐死裸鼠，裸鼠解剖取肿瘤，肿瘤称重。

图8-11结果显示，药物治疗裸鼠期间，与对照组相比，用药组抑制了裸鼠体重、皮下瘤的生长。联合用药组，抑制裸鼠体重、皮下瘤生长的能力更强。与单独用药组相比，Binimetinib联合化疗药5-FU/TRAIL皮下瘤的大小及体重均较小。结果提示，Binimetinib抑制了裸鼠皮下瘤的生长，同时Binimetinib联合化疗药5-FU/TRAIL抑制皮下瘤生长的能力增强。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种药物组合物在制备治疗结肠癌的药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物是由Binimetinib与重组人TRAIL蛋白按质量比为85-1415：1组成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物用于制备抑制结肠癌细胞生长并诱导结肠癌细胞凋亡的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结肠癌为皮下移植瘤。