NO343105B1

NO343105B1 - Anti-glypican 3 antistoff, fremgangsmåte for fremstilling derav, cellevekstinhibitor omfattende antistoffet og peptid.

Info

Publication number: NO343105B1
Application number: NO20063539A
Authority: NO
Inventors: Kiyotaka Nakano; Hiroyuki Tsunoda; Takeshi Yoshino; Jun-Ichi Nezu; Tomoyuki Igawa; Hiroko Konishi; Megumi Tanaka; Izumi Sugo; Shigeto Kawai; Takahiro Ishiguro; Yasuko Kinoshita
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-07-09
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2018-11-05
Also published as: WO2006006693A1; CN1842540A; IL172938A; PT1674111E; RU2011115845A; DE602005024502D1; EP1674111B1; ES2353967T3; NZ545720A; CN111925445A; MXPA06002890A; KR101300545B1; EP1674111A4; NO20063539L; EP2314317A3; JP4011100B2; BRPI0506125B1; CA2544692A1; NZ579543A; BRPI0506125A

Abstract

SAMMENDRAG Det tilveiebringes et antistoff som er i stand til å binde til en spesifikk region av glypican 3, så vel som et humanisert antistoff dannet basert på antistoffet. Anti-GPC3 antistoffet beskrevet ovenfor som har høyere ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet sammenlignet med et konvensjonelt antistoff er anvendelig som en celleproliferasjons-inhibitor, et anticancer-middel og et middel for diagnose av kreft.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår et anti-glypican 3 antistoff, fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff, en cellevekst inhibitor og et peptid.

Antistoffet kan anvendes som et anticancer-middel.

Beskrivelse av beslektet teknikk

Glypican 3 (GPC3) er ett av glypican-familien av heparan-sulfat proteoglykaner som er til stede på celleoverflater. Det er foreslått at GPC3 kan medvirke i celledeling ved utvikling eller kreftcellevekst, imidlertid er dens funksjon ennå ikke godt belyst.

Det er funnet at en viss type av antistoff som binder til GPC3 har en cellevekst-hemmende aktivitet via en antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet-(ADCC) aktivitet og en komplement-avhengig cytotoksisitet- (CDC) aktivitet (internasjonal patentsøknad WO 2003/000883). I tillegg har det vært foreslått at GPC3 blir spaltet in vivo og utskilt i blodet som en utskilt form av GPC3 og diagnosen av kreft kan være mulig ved anvendelse av et antistoff som er i stand til å detektere den utskilte form av GPC3 (internasjonale patentsøknader WO 2004/022739, WO 03/100429 og WO 2004/018667).

WO 2004022597 beskriver antistoffer mot N- og C-terminalen til GPC3.

Ved utvikling av et anticancer-middel basert på cytotoksisitet-aktivitet til et antistoff er det foretrukket at antistoffet som skal anvendes har høy ADCC- aktivitet eller CDC-aktivitet. Følgelig er et anti-GPC3 antistoff som har høy cytotoksisitetsaktivitet ønsket som et antistoff som gjenkjenner GPC3.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et anti-GPC3 antistoff som har en høyere ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet sammenlignet med et konvensjonelt antistoff.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnere har lykkes i å oppnå et antistoff som har en høyere cytotoksisitet-aktivitet sammenlignet med den til et konvensjonelt anti-glypican 3 antistoff. Videre analyserte de epitoper for et slikt antistoff og lyktes i bestemmelse av regionene på GPC 3 gjenkjent av antistoffet med en høy cytotoksisitet-aktivitet.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et antistoff som er i stand til å binde til glypican 3,

hvori antistoffet er:

(a) et antistoff omfattende:

(i) en tungkjede variabel region som har CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 123, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 124 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 125; og (ii) en lettkjede variabel region som har CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 143, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158; (b) et antistoff som omfatter som omfatter (i) og som kompetitivt kan hemme bindingen av antistoffet ifølge (a) til glypican 3;

(c) et antistoff som omfatter (ii) og som kompetitivt kan hemme bindingen av antistoffet i (a) til glypican 3;

(d) et antistoff som har den samme bindingsaktiviteten til glypican 3 som antistoffet ifølge hvilket som helst av (a) til (c), hvori én aminosyrerest er substituert, deletert eller addert og/eller innsatt fra aminosyresekvensene beskrevet i (a);

(e) et antistoff som kan binde til en epitop til hvilken antistoffet ifølge (a) er i stand til å binde, hvor nevnte antistoff ifølge (a) omfatter både tungkjede og lettkjede variabel region sekvensene spesifisert i (a); eller

(f) et antistoff som kan binde til et peptid som består av sekvensen av aminosyrerestene 546 – 551 i glypican 3.

Også beskrevet er et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 ifølge hvilken som helst av (1) - (12):

(1) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 123, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 124 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 125;

(2) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 109, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 110 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 111;

(3) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 106, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 107 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 108;

(4) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 132, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 133 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 134;

(5) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 106, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 135 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 136;

(6) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 126, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 127 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 128;

(7) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 129, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 130 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 131;

(8) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 103, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 104 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 105;

(9) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 118, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 121 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 122;

(10) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 115, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 116 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 117;

(11) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 112, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 113 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 114; eller

(12) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 118, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 119 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 120.

Også beskrevet er et antistoff omfattende en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 ifølge hvilken som helst av (1) - (13):

(1) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 143, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(2) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 143, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 145;

(3) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 140, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 141 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 142;

(4) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 167, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 168 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 169;

(5) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 170, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 171;

(6) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 159, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 160 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 161;

(7) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 162, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 147 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 163;

(8) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 164, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 165 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 166;

(9) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 137, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 138 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 139;

(10) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 155, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 156 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 157;

(11) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 149, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 150 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 151;

(12) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 146, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 147 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 148; eller

(13) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 152, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 153 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 154.

Også beskrevet er et antistoff valgt fra gruppen bestående av hvilken som helst av (1) - (13):

(1) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 143, 144 og 158;

(2) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 109, 110 og 111, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 143, 144 og 145;

(3) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 106, 107 og 108, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 140, 141 og 142;

(4) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 132, 133 og 134, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 167, 168 og 169;

(5) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 106, 135 og 136, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 170, 144 og 171;

(6) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 126, 127 og 128, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 159, 160 og 161;

(7) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 129, 130 og 131, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 162, 147 og 163;

(8) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 164, 165 og 166;

(9) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3

omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 103, 104 og 105, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 137, 138 og 139;

(10) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 118, 121 og 122, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 155, 156 og 157;

(11) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 115, 116 og 117, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 149, 150 og 151;

(12) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 112, 113 og 114, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 146, 147 og 148; og (13) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 118, 119 og 120, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 152, 153 og 154.

Også beskrevet er et antistoff som har en tungkjede variabel region ifølge hvilken som helst av (1) - (7):

(1) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 84;

(2) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 85;

(3) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 86;

(4) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 87;

(5) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 88;

(6) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 89; eller

(7) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 90.

Også beskrevet er et antistoff som har en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92.

Fortrinnsvis er antistoffet ifølge oppfinnelsen valgt fra gruppen bestående av antistoffet ifølge hvilken som helst av (1) - (7):

(1) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 84 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92;

(2) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 85 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92;

(3) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 86 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92;

(4) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 87 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92;

(5) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 88 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92;

(6) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 89 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92; og

(7) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 90 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92.

Også beskrevet er et antistoff omfattende en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 ifølge hvilken som helst av (1) - (15):

(1) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 174, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(2) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 175, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(3) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 176, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(4) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 177, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(5) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 178, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(6) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 179, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(7) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 180, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(8) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 181, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(9) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 182, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(10) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 183, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(11) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 184, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(12) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 185, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(13) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 186, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(14) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 187, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158; eller

(15) CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 188, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff valgt fra gruppen bestående av antistoffet i (1) - (15):

(1) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 174, 144 og 158;

(2) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 175, 144 og 158;

(3) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 176, 144 og 158;

(4) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 177, 144 og 158;

(5) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 178, 144 og 158;

(6) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 179, 144 og 158;

(7) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 180, 144 og 158;

(8) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 181, 144 og 158;

(9) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt henholdsvis i SEKV ID NR: 182, 144 og 158;

(10) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 183, 144 og 158;

(11) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 184, 144 og 158;

(12) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 185, 144 og 158;

(13) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 186, 144 og 158;

(14) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 187, 144 og 158; og (15) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 188, 144 og 158.

Også beskrevet er et antistoff som har en lettkjede variabel region valgt fra (1) - (15):

(1) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 191;

(2) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 192;

(3) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 193;

(4) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 194;

(5) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 195;

(6) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 196;

(7) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 197;

(8) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 198;

(9) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 199;

(10) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 200;

(11) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 201;

(12) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 202;

(13) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 203;

(14) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 204; og

(15) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 205.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som har en lettkjede variabel region valgt fra gruppen bestående av (1) - (15):

(15) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 205;

og en tungkjede variabel region valgt fra gruppen bestående av (1) - (7):

(2) en tungkjede variabel region omfattende; aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 85;

(6) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 89; og

Tungkjede variabel regionen, en lettkjede variabel region og

aminosyresekvensen av CDR 1, 2 og 3, så vel som SEKV ID NR er oppsummert i tabellen nedenfor.

Oppfinnelsen omfatter også et antistoff som har en aktivitet ekvivalent med aktiviteten til antistoffet beskrevet ovenfor, hvor én eller flere aminosyrerester er substituert, deletert eller addert og/eller innsatt fra aminosyresekvensene beskrevet ovenfor.

Fortrinnsvis er antistoffet ifølge oppfinnelsen et humanisert antistoff.

Således, i et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et humanisert antistoff i stand til å binde til glypican 3.

Også beskrevet er et antistoff i stand til å binde til et peptid bestående av sekvensen av aminosyrerestene 524 - 563 av glypican 3.

Også beskrevet er et antistoff i stand til å binde til et peptid bestående av sekvensen av aminosyrerestene 537 - 563 av glypican 3. Også beskrevet er et antistoff som ikke binder til et peptid bestående av sekvensen av aminosyrerestene 550 - 563 av glypican 3.

Fortrinnsvis er antistoffet i stand til å binde til et peptid bestående av sekvensen av aminosyrerestene 542 - 551, 544 - 553 eller 546 - 555 av glypican 3 eller et peptid bestående av sekvensen av aminosyrerestene 546 - 551 av glypican 3.

I enda et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff i stand til å binde til en epitop til hvilken et andre antistoff er i stand til å binde, hvor nevnte andre antistoff omfatter en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125, og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 143, 144 og 158. Dvs. antistoffet ifølge oppfinnelsen kan konkurrere i binding til GPC3 med det andre antistoff.

I en foretrukket utførelsesform er antistoffet ifølge oppfinnelsen i stand til å binde til glypican 3 og har en høy CDC-aktivitet mot en celle som uttrykker glypican 3 og/eller har en høy ADCC-aktivitet mot en celle som uttrykker glypican 3.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et polynukleotid som koder for en tungkjede variabel region eller en lettkjede variabel region av antistoffet ifølge oppfinnelsen.

I ett aspekt er polypeptidet ett som har en hvilken som helst av sekvensene angitt i SEKV ID NR: 57, 67, 77-83 eller 91.

Fortrinnsvis har polynukleotidet ifølge oppfinnelsen sekvensen angitt i SEKV ID NR: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 og 77-83.

I enda et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en celle-vekst inhibitor og et anticancer-middel omfattende som aktiv bestanddel antistoffet ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis blir anticancer-midlet ifølge oppfinnelsen anvendt for behandling av hepatom.

Også beskrevet er et peptid omfattende sekvensen av aminosyrerestene 524 -563 av glypican 3, sekvensen av aminosyrerestene 537 - 563 av glypican 3, sekvensen av aminosyrerestene 544 - 553 av glypican 3 eller aminosyresekvensen av aminosyrerestene 546 - 551 av glypican 3.

Det er også tilveiebrakt en vektor som omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer videre en vertcelle som omfatter en slik vektor.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff omfattende:

(a) dyrking av vertcellen ifølge oppfinnelsen,

(b) isolering av et antistoff fra en kultur av (a), og

(c) rensing av antistoffet derav.

Oppfinnelsen vedrører også et antistoff for anvendelse i behandlingen av cancer.

Videre vedrører oppfinnelsen et peptid som omfatter aminosyresekvensen av aminosyrerestene 546 - 551 av glypican 3.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser bindingsaktiviteten av anti-GPC3 antistoff til en CHO-celle, en CHO-celle som uttrykker full-lengde GPC3, HepG2 og HuH-7, som ble evaluert ved strømningscytometri. M1E7 (heltrukket linje) og M11F1 (stiplet linje) ble anvendt i en konsentrasjon på 5 μg/ml.

Fig. 2 er en tabell som viser resultatene av epitop-klassifisering ved kompetitiv ELISA. Graden av kompetitiv hemning mot bindingen av biotinylert anti-GPC3 antistoff er angitt som prosentdel. Epitopene ble klassifisert i 5 grupper, a til e, i henhold til kompetitivt hemningsmønster.

Fig. 3 viser resultatene av evaluering ved Western blotting hvorvidt et anti-GPC3 antistoff binder til det N-terminale fragment på 40 kDa av den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein eller til det C-terminale fragment på 30 kDa derav. Det ble funnet at L9G11 binder til det N-terminale fragment og M3C11 binder til det C-terminale fragment.

Fig. 4 viser resultatene av detektering av en utskilt form av GPC3 til stede i kultursupernatanten av HepG2 ved sandwich ELISA. Den ble sterkt detektert med kombinasjonen av antistoffer som binder til det N-terminale fragment så som M6B1, M18D4 eller M19B11 og den ble ikke sterkt detektert med et antistoff som binder til det C-terminale fragment så som M3C11, M13B3 eller M3B8.

Fig. 5 viser resultatene av immunopresipitering av kultursupernatant av HepG2 ved anvendelse av et anti-GPC3 antistoff og deteksjon av en utskilt form av GPC3. Mediet som kontroll (spor 1 og 3) og kultursupernatant av HepG2 (spor 2 og 4) ble immunopresipitert ved anvendelse av M1E7 (spor 1 og 2) og M10D2 (spor 3 og 4). Sekretorisk GPC3 ble detektert med M10D2 som binder til det N-terminale fragment.

Fig. 6 viser resultatene av analysering av epitopen av antistoffene som binder til det C-terminale fragment av GPC3 ved Western blotting ved anvendelse av et fusjonsprotein av det C-terminale peptid av GPC3 og GST. Den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein (spor 1), GST (spor 2), GC-1 (spor 3), GC-2 (spor 4), GC-3 (spor 5), GC-4 (spor 6) og GC-5 (spor 7) ble underkastet SDS-elektroforese under reduserende betingelser og detektert ved Western blotting ved anvendelse av M3C11 og M11F1.

Fig. 7 viser resultatene av evaluering av CDC-aktivitet til anti-GPC3 mushumant kimært antistoff til en CHO-celle som uttrykker GPC3.

Fig. 8 viser resultatene av evaluering av ADCC-aktivitet til anti-GPC3 mushumant kimært antistoff til en CHO-celle som uttrykker GPC3 og HepG2.

Fig. 9 viser resultatene av evaluering av ADCC-aktivitet til GC33 til en human hepatom-cellelinje, HuH-7, ved anvendelse av en mus benmarg-avledet effektorcelle.

Fig. 10 viser resultatene av evaluering av antitumor-aktivitet til GC33 antistoff til musemodell transplantert med humant hepatom.

Fig. 11 viser resultatene av evaluering av CDC-aktivitet til mus-humant kimært antistoff GC33 til en CHO-celle som uttrykker GPC3.

Fig. 12 viser resultatene av evaluering av ADCC-aktivitet til mus-humant kimært antistoff GC33 til HepG2.

Fig. 13 viser GPC3-avledede sekvenser inneholdt i GST-fusjonsproteiner (GC-4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 og 14) fremstilt for analysering av epitopen av GC33.

Fig. 14 viser resultatene av Western blotting ved anvendelse av GC33 etter separering av GST, GC-7, 8, 9, 11, 12, 13 og 14 ved SDS-PAGE under reduserende betingelser.

Fig. 15 viser resultatene av evaluering av bindingsaktiviteten til humanisert GC33 til GPC3 ved ELISA.

Fig. 16 viser et antistoff-panel som oppsummerer isotyper og resultatene av ELISA, BIAcore, FACS, en epitop-analyse og en immunopresipiteringstest for kloner avledet fra en mus immunisert med en oppløselig form av GPC3.

Fig. 17 viser et antistoff-panel hvor isotyper og resultatene av ELISA, FACS og en epitop-analyse for kloner avledet fra en mus immunisert med GC-3 er oppsummert.

Fig. 18 viser resultatene av evaluering av bindingsaktiviteten til de modifiserte antistoffer til den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein ved ELISA. Gly34 lokalisert ved CDR1 i en humanisert GC33 L-kjede variabel region ble erstattet med hvilken som helst av 17 aminosyrer forskjellig fra Cys og Met.

Fig. 19 viser resultatene av evaluering av CDC-aktivitet til mus-humane kimære antistoffer GC33, M3C11 og M1E7 til en CHO-celle som uttrykker full-lengde GPC3.

Fig. 20 viser resultatene av evaluering av ADCC-aktivitet til mus-humane kimære antistoffer GC33, M3C11 og M1E7 til en human hepatom cellelinje SK-03 som uttrykker full-lengde GPC3.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Antistoff

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antistoffer beskrevet i de følgende (I) til (XI).

(I) Et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt SEKV ID NR: 123, 124 og 125 (GC33), Antistoffet gjenkjenner det C-terminale peptid av glypican 3 (et peptid omfattende den 374. aminosyre til den 580. aminosyre av glypican 3); og er anvendelige som terapeutisk antistoff.

(II) Et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 143, 144 og 158 (GC33). Antistoffet gjenkjenner det C-terminale peptid av glypican 3 (et peptid omfattende fra den 374. aminosyre til den 580. aminosyre av glypican 3); og er anvendelige som terapeutisk antistoff.

(III) Et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 143, 144 og 158 (GC33).

Antistoffet gjenkjenner det C-terminale peptid av glypican 3 (et peptid omfattende fra den 374. aminosyre til den 580. aminosyre av glypican 3); og er anvendelige som et terapeutisk antistoff

(IV) Et antistoff som har en tungkjede variabel region beskrevet i hvilken som helst av de følgende (1) til (7):

(1) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 84 (GC33 VH ver.a),

(2) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 85 (GC33 VH ver.c),

(3) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 86 (GC33 VH ver.f),

(4) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 87 (GC33 VH ver.h),

(5) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 88 (GC33 VH ver.i),

(6) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 89 (GC33 VH ver.j) og

(7) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 90 (GC33 VH ver.k).

Blant antistoffene beskrevet i (1) til (7) er antistoffene beskrevet i (2) til (7) spesielt foretrukket.

(V) Et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a).

(VI) Et antistoff valgt fra gruppen bestående av antistoffene beskrevet i de følgende (1) til (7):

(1) et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 84 (GC33 VH ver.a) og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a),

(2) et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 85 (GC33 VH ver.c) og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a),

(3) et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 86 (GC33 VH ver.f) og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a),

(4) et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 87 (GC33 VH ver.h) og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a),

(5) et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 88 (GC33 VH ver.i) og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a),

(6) et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 89 (GC33 VH ver.j) og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a) og

(7) et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 90 (GC33 VH ver.k) og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a).

(VII) Et antistoff beskrevet i hvilken som helst av de følgende (1) til (15):

(1) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 174, 144 og 158, (2) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 175, 144 og 158, (3) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 176, 144 og 158, (4) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 177, 144 og 158, (5) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 178, 144 og 158, (6) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 179, 144 og 158, (7) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 180, 144 og 158, (8) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 181, 144 og 158, (9) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 182, 144 og 158, (10) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 183, 144 og 158, (11) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 184, 144 og 158, (12) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 185, 144 og 158, (13) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 186, 144 og 158, (14) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 187, 144 og 158 og (15) et antistoff inneholdende lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 188, 144 og 158.

Blant antistoffene beskrevet i (1) til (15) er antistoffet beskrevet i (15) foretrukket.

(VIII) Et antistoff beskrevet i hvilken som helst av de følgende (1) til (15):

(1) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 174, 144 og 158,

(2) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 175, 144 og 158,

(3) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 176, 144 og 158,

(4) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 177, 144 og 158,

(5) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 178, 144 og 158,

(6) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 179, 144 og 158,

(7) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 180, 144 og 158,

(8) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 181, 144 og 158,

(9) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 182, 144 og 158,

(10) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 183, 144 og 158,

(11) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 184, 144 og 158,

(12) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 185, 144 og 158,

(13) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 186, 144 og 158,

(14) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 187, 144 og 158 og

(15) et antistoff inneholdende tungkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og lettkjede variable regioner som har CDR 1, 2 og 3 bestående av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 188, 144 og 158.

(IX) Et antistoff beskrevet i hvilken som helst av de følgende (1) til (15): (1) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 191,

(2) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 192,

(3) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 193,

(4) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 194,

(5) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 195,

(6) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 196,

(7) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 197,

(8) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 198,

(9) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 199,

(10) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 200,

(11) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 201,

(12) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 202,

(13) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 203,

(14) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 204 og

(15) et antistoff som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 205.

(X) Et antistoff som har en lettkjede variabel region valgt fra gruppen bestående av de lettkjede variable regioner beskrevet i de følgende (1) til (15):

(1) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 191,

(2) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 192,

(3) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 193,

(4) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 194,

(5) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 195,

(6) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 196,

(7) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 197,

(8) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 198,

(9) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 199,

(10) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 200,

(11) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 201,

(12) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 202,

(13) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 203,

(14) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 204 og

(15) en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 205 og en tungkjede variabel region valgt fra gruppen bestående av de tungkjede variable regioner beskrevet i de følgende (1) til (7):

(1) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 84,

(2) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 85,

(3) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 86,

(4) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 87,

(5) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 88,

(6) en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 89 og

Blant antistoffene beskrevet ovenfor er antistoffet som har en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 205 og en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 90 foretrukket.

(XI) Et antistoff, hvor én aminosyre er erstattet, deletert, addert og/eller innsatt i aminosyresekvensen beskrevet i hvilken som helst av ovennevnte (I) til (X) og som har en aktivitet ekvivalent med den til antistoffet beskrevet i hvilken som helst av (I) til (X).

Ved foreliggende oppfinnelse betyr aktiviteten ekvivalent med den til antistoffet beskrevet i hvilken som helst av (I) til (X) at bindingsaktiviteten til et humant glypican 3 antistoff eller cytotoksisitet-aktiviteten for en celle som uttrykker human glypican 3 (f.eks. HepG2 eller rekombinante CHO-celler som uttrykker human glypican 3, etc.) er ekvivalent.

Humanisert antistoff

Én foretrukket utførelsesform av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er et humanisert antistoff som binder til glypican 3. Det humaniserte antistoff kan fremstilles ved anvendelse av en kjent metode.

Det humaniserte antistoffet er også referert til som et omformet humant antistoff, som blir fremstilt ved transplantering av den komplementaritets bestemmende region (CDR) av et antistoff fra et ikke-humant pattedyr, for eksempel et mus antistoff, i CDR av et humant antistoff. Den generelle rekombinante DNA-teknologi for fremstilling av slike antistoffer er også kjent (se europeisk patentsøknad EP 125023 og internasjonal patentsøknad WO 96/02576).

Spesifikt, for eksempel i tilfellet hvor CDR er avledet fra et mus antistoff, blir en DNA-sekvens som er utformet for å koble CDR av mus antistoff med rammeverk region (FR) av et humant antistoff, syntetisert ved PCR-metoden ved anvendelse av mange oligonukleotider som primere, som er fremstilt for å ha deler overlappende hverandre ved begge ender av CDR og FR (se metoden beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 98/13388).

Som rammeverk-regionen av et humant antistoff som skal kobles med CDR, blir én som tillater at en komplementaritetsbestemmende region danner et fordelaktig antigen-bindende sete valgt. Hvis nødvendig kan en aminosyre i rammeverkregionen av en variabel region av antistoffet erstattes slik at den komplementaritetsbestemmende region av et omformet humant antistoff kan danne et passende antigen-bindende sete (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

C-regionen av et humant antistoff kan anvendes som C-regionen av et kimært antistoff eller et humanisert antistoff, for eksempel kan C λ1, C λ2, C λ3 og C λ4 anvendes i H-kjeden og C κ og C λ kan anvendes i L-kjeden. C-regionen av et humant antistoff kan også modifiseres for å forbedre stabiliteten til antistoffet eller produksjonen derav. Det humane antistoff som skal anvendes ved humaniseringen kan være hvilken som helst isotype av humant antistoff, for eksempel IgG, IgM, IgA, IgE og IgD, fortrinnsvis, IgG, mer foretrukket IgG1 eller IgG3 og spesielt fortrinnsvis IgG1. Foreliggende oppfinnelse IgG1 er effektiv når et antistoff blir anvendt som et anticancer-middel ved at den har høy cytotoksisitet-aktivitet (Chemical immunology, 65: 88 (1997)).

I tillegg, etter at det humaniserte antistoff er fremstilt, kan en aminosyre i en variabel region (f.eks. FR) eller en konstant region erstattes med en annen aminosyre.

Opprinnelsen av CDR i et humanisert antistoff er ikke spesielt begrenset og CDR kan avledes fra hvilket som helst dyr. For eksempel er det mulig å anvende en sekvens avledet fra et mus antistoff, et rotte antistoff, et kanin antistoff, et kamel antistoff eller lignende. Foretrukket er en CDR- sekvens av et mus antistoff.

Med hensyn til humanisering av et antistoff, er det generelt vanskelig å humanisere det mens agonistaktiviteten til det opprinnelige antistoff opprettholdes. Ved foreliggende oppfinnelse ble imidlertid et humanisert antistoff som har en agonist-aktivitet ekvivalent med den til det opprinnelige mus antistoff vellykket oppnådd. Siden antigenisiteten av det humaniserte antistoff i menneskekroppen blir redusert, er det anvendelig for administrering til mennesker for et terapeutisk formål.

Foretrukne eksempler på det humaniserte anti-glypican 3 antistoff ved foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel et antistoff som har en tungkjede variabel region angitt i SEKV ID NR: 84 (GC33 VH ver.a), SEKV ID NR: 85 (GC33 VH ver.c), SEKV ID NR: 86 (GC33 VH ver.f), SEKV ID NR: 87 (GC33 VH ver.h), SEKV ID NR: 88 (GC33 VH ver.i), SEKV ID NR: 89 (GC33 VH ver.j) eller SEKV ID NR: 90 (GC33 VH ver.k) eller et antistoff som har en lettkjede variabel region angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a). Spesielt foretrukne eksempler omfatter et antistoff som har en tungkjede variabel region angitt i SEKV ID NR: 84 (GC33 VH ver.a), SEKV ID NR: 85 (GC33 VH ver.c), SEKV ID NR: 86 (GC33 VH ver.f), SEKV ID NR: 87 (GC33 VH ver.h), SEKV ID NR: 88 (GC33 VH ver.i), SEKV ID NR: 89 (GC33 VH ver.j) eller SEKV ID NR: 90 (GC33 VH ver.k) og en lettkjede variabel region angitt i SEKV ID NR: 92 (GC33 VL ver.a).

I tillegg omfatter et foretrukket eksempel på det humaniserte anti-glypican 3 antistoff et antistoff som har en tungkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 90 og en lettkjede variabel region inneholdende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 205.

En foretrukket utførelsesform av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er et antistoff som binder til epitopen til hvilken antistoffet angitt i (1):

(1) et antistoff inneholdende en tungkjede variabel region som har aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 62 og en lettkjede variabel region som har aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 73 (GC33).

Antistoffet som binder til epitopen hvortil det ovennevnte antistoffet binder er anvendelig fordi det har spesielt høy cytotoksisitet.

Antistoffet beskrevet i (1) binder til en region fra den 524. aminosyre til den 580. aminosyre av human glypican 3. Spesielt binder det til en region fra den 524. aminosyre til den 563. aminosyre. Antistoffet beskrevet i (1) binder til en region fra den 537. aminosyre til den 563. aminosyre av human glypican 3. Antistoffet beskrevet i (1) binder til en region fra den 544. aminosyre til den 553. aminosyre av human glypican 3. Spesielt binder det til en region fra den 546. aminosyre til den 551. aminosyre.

Antistoffene som gjenkjenner ovennevnte epitoper har høy cytotoksisitet, derfor er de anvendelige ved behandling av en sykdom så som kreft. Spesielt er antistoffet som binder til en region fra den 546. aminosyre til den 551. aminosyre anvendelig ettersom det har spesielt høy cytotoksisitet.

Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse antistoffene som binder til en epitop i en region fra den 524. aminosyre til den 580. aminosyre av human glypican 3, fortrinnsvis en region fra den 524. aminosyre til den 563. aminosyre, mer foretrukket en region fra den 537. aminosyre til den 563. aminosyre, enda mer foretrukket en region fra den 544. aminosyre til den 553. aminosyre, spesielt fortrinnsvis en region fra den 546. aminosyre til den 551. aminosyre.

En annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er et antistoff som gjenkjenner en region fra den 524. aminosyre til den 563. aminosyre av human glypican 3 og ikke gjenkjenner en region fra den 537. aminosyre til den 563. aminosyre.

En ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er et antistoff som gjenkjenner en region fra den 537. aminosyre til den 563. aminosyre av human glypican 3 og som ikke gjenkjenner en region fra den 550. aminosyre til den 563. aminosyre.

Analyse av en epitop gjenkjent av et antistoff kan utføres ved en metode kjent for fagfolk på området, for eksempel ved Western blotting beskrevet i Eksempler nedenfor.

Antistoffet som gjenkjenner ovennevnte regioner som en epitop kan oppnås ved en metode kjent for fagfolk på området. For eksempel kan det oppnås ved fremstilling av et peptid inneholdende en aminosyresekvens av en målregion basert på en aminosyresekvens av human glypican 3 og fremstilling av et antistoff ved anvendelse av peptidet som et immunogen eller ved fremstilling av et antistoff ved en vanlig metode og bestemmelse av en epitop som det oppnådde antistoff gjenkjenner og deretter seleksjon av et antistoff som gjenkjenner målepitopen.

Et foretrukket eksempel på anti-glypican 3 antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er et antistoff som har høy ADCC-aktivitet eller et antistoff som har høy CDC-aktivitet mot en celle som uttrykker glypican 3.

Uttrykket "høy ADCC-aktivitet" eller "høy CDC-aktivitet" som anvendt her betyr at antistoffet ifølge oppfinnelsen har en høyere ADCC-aktivitet eller en høyere CDCaktivitet enn den til et kjent anti-glypican 3 antistoff. Kjente glypican 3 antistoffer omfatter for eksempel M3C11 og M1E07 som er beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 2004/22739.

ADCC-aktivitet eller CDC-aktivitet kan måles ved en metode kjent for fagfolkpå området. For eksempel kan den måles ved krom-frigjøringstest. Spesifikke betingelser for krom-frigjøringstest for å måle ADCC-aktivitet er ikke spesielt begrenset, imidlertid kan den for eksempel måles ved anvendelse av betingelsene beskrevet i eksemplene nedenfor.

Eksempler på cellene som uttrykker glypican 3 omfatter for eksempel en hepatom-cellelinje så som HepG2, en CHO-cellelinje som har et gen som koder for glypican 3 innført deri og lignende. For å måle ADCC-aktiviteten er det foretrukket å anvende en HepG2-cellelinje og for å måle CDC-aktivitet er det foretrukket å anvende en rekombinant CHO-cellelinje som uttrykker GPC3. Den rekombinante CHO-cellelinje som uttrykker GPC3 kan fremstilles ved hvilken som helst metode, imidlertid kan den fremstilles ved for eksempel metoden beskrevet i eksemplene nedenfor.

I tilfellet hvor anti-glypican 3 antistoff blir anvendt som et anticancer-middel er det foretrukket at det har en ADCC-aktivitet på samme nivå som den til et antistoff inneholdende en tungkjede variabel region som har aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 62 og en lettkjede variabel region som har aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 73 (GC33). I tilfellet hvor anti-glypican 3 antistoffet blir anvendt som et anticancer-middel er det foretrukket at det har en CDC-aktivitet på samme nivå som den til et antistoff inneholdende en tungkjede variabel region som har aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 62 og en lettkjede variabel region som har aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 73 (GC33).

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse et antistoff som har høy bindingsaktivitet til glypican 3.

Ved foreliggende oppfinnelse, kan bindingsaktiviteten av antistoffet til glypican 3 måles ved anvendelse av en metode kjent for fagfolk på området. For eksempel kan den måles ved anvendelse av overflate-plasmonresonans med BIAcore.

Spesifikt blir et glypican 3 protein immobilisert på en sensor- chip for å reagere med et antistoff og interaksjon mellom antistoffet og glypican 3 kan beregnes som en reaksjonshastighets-konstant fra målingsverdien. I tillegg, med hensyn til evalueringen av bindingsaktiviteten, kan et enzym- bundet immunosorbent-forsøk (ELISA), en enzym-immunoassay (EIA), en radioimmunoassay (RIA) eller en fluorescerende antistoff-teknikk anvendes. For eksempel i tilfellet hvor et enzymimmunoassay blir anvendt, blir en prøve inneholdende et antistoff som skal testes, for eksempel en kultur-supernatant av en celle som produserer et antistoff som skal testes eller et renset antistoff, satt til en plate som er belagt med et antigen til hvilket antistoffet som skal testes binder. Deretter blir et sekundært antistoff merket med et enzym så som alkalisk fosfatase tilsatt og platen blir inkubert og vasket. Deretter blir et enzymsubstrat så som p-nitrofenylfosfat tilsatt og absorbansen blir målt, hvorved en antigen-bindingsaktivitet kan evalueres. Den øvre grensen for bindingsaktiviteten er ikke spesielt begrenset. Imidlertid kan for eksempel den øvre grensen defineres innen området som er teknisk mulig av fagfolk på området. Det vil forstås at området som er teknisk mulig vil bli utvidet ved utvikling av teknologi.

Videre, ved foreliggende oppfinnelse, kan en aminosyre som skal deamideres eller en aminosyre i nabostilling til en aminosyre som skal deamideres, erstattes med en annen aminosyre for formålet for eksempel å undertrykke deamidering for å øke stabiliteten til antistoffet. Aminosyren som skal deamideres omfatter asparagin og glutamin, fortrinnsvis asparagin. En aminosyre i nabostilling til asparagin er ikke spesielt begrenset og kan være hvilken som helst aminosyre. Det er kjent at en asparagin-glycin-sekvens er spesielt mottagelig for deamidering, således er glycin foretrukket som aminosyren i nabostilling til asparagin. En aminosyre anvendt for erstatning er ikke spesielt begrenset og kan være hvilken som helst aminosyre forskjellig fra asparagin og glutamin. Foretrukket er en aminosyre forskjellig fra valin og prolin. Derfor er det ved foreliggende oppfinnelse, i tilfellet hvor antistoffet er deamidert, foretrukket å erstatte aminosyren med en aminosyre forskjellig fra asparagin, glutamin, valin og prolin. Undertrykking av deamidering ved aminosyreerstatning kan utføres med referanse til, for eksempel internasjonal patentsøknad WO 03/057881. I tilfellet hvor aminosyre-erstatning blir utført for formålet å undertrykke deamidering er det foretrukket at antigen- bindingsaktivitet før erstatning blir opprettholdt.

En annen utførelsesform av stabilisering av antistoffet omfatter erstatning av glutaminsyre med en annen aminosyre. I tillegg ble det ved foreliggende oppfinnelse funnet at, i tilfellet hvor den 6. aminosyre av tungkjeden av et antistoff er glutaminsyre, kan antistoffet stabiliseres betydelig ved erstatning av glutaminsyre med glutamin. Følgelig kan et antistoff stabiliseres ved en metode som omfatter erstatning av glutaminsyren i den 6. stilling av tungkjeden av antistoffet med glutamin. Aminosyre-nummerering av antistoffet er kjent for fagfolk på området (f.eks. Kabat, E. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services 1983).

Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan være et konjugert antistoff hvor antistoffet er konjugert med forskjellige molekyler, så som polyetylenglykol (PEG), radioaktive materialer og toksin. Et slikt konjugert antistoff kan fremstilles ved kjemisk modifikasjon av antistoffet oppnådd som ovenfor. Metoder for modifikasjon av antistoffer er allerede etablert på området. Antistoffet ifølge oppfinnelsen omfatter et slikt konjugert antistoff.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også være et bispesifikt antistoff (se for eksempel Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374). Det bispesifikke antistoff kan gjenkjenne glypican 3 og et annet antigen eller kan gjenkjenne forskjellige epitoper på et GPC3 molekyl.

Videre kan antistoffet ifølge oppfinnelsen bære et visst protein kondensert til N- eller C-terminus av antistoffet (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281）. Proteinet som skal kondenseres til antistoffet kan hensiktsmessig velges av fagfolk på området.

I tillegg omfatter antistoffet ifølge oppfinnelsen et antistoff med forbedret cytotoksisitet. Eksempler på antistoffet med forbedret cytotoksisitet omfatter et antistoff som mangler fucose, et antistoff som har todelende N-acetyl-glukosamin (GlcNAc) bundet til dets sukkerkjede og et antistoff som har endret bindingsaktivitet for Fc λ-reseptor oppnådd ved substituering av én eller flere aminosyrer i Fc-regionen. Slike antistoffer med en forbedret cytotoksisitet kan fremstilles ved en metode kjent på området.

Metode for fremstilling av antistoff

Antistoffet som binder til glypican 3 kan fremstilles ved en metode kjent for fagfolk på området. For eksempel kan et monoklonalt antistoff-produserende hybridom fremstilles som følger stort sett ved anvendelse av kjent teknikk. Dvs. hybridomet kan fremstilles ved immunisering av et pattedyr i henhold til en vanlig immuniseringsmetode ved anvendelse av et glypican 3 protein eller en celle som uttrykker glypican 3 som et sensibiliserende antigen. Den således oppnådde immunocytt blir kondensert med en kjent parental celle ved en vanlig cellefusjonsmetode og deretter blir en monoklonal antistoff-produserende celle selektert ved en vanlig screeningsmetode.

Spesifikt kan et monoklonalt antistoff fremstilles som følger. Først blir glypican 3 protein oppnådd basert på glypican 3 gen/aminosyresekvens vist i SEKV ID NR: 3 og 4, som blir anvendt som et sensibiliserende antigen for å oppnå et antistoff. Mer spesifikt blir gensekvensen som koder for glypican 3 innsatt i et kjent ekspresjonsvektorsystem og en passende vertscelle blir transformert med vektoren og deretter blir humant glypican 3 målprotein renset ved en kjent metode fra vertscellen eller kultur-supernatanten.

Deretter blir det rensede glypican 3 protein anvendt som et sensibiliserende antigen. Alternativt kan et partielt peptid av glypican 3 anvendes som et sensibiliserende antigen. I dette tilfellet kan det partielle peptid også oppnås ved kjemisk syntese i henhold til aminosyresekvensen av human glypican 3.

Et pattedyr som skal immuniseres med et sensibiliserende antigen er ikke spesielt begrenset, men det blir fortrinnsvis valgt i betraktning av kompatibilitet med en parental celle som skal anvendes for cellefusjon. For eksempel blir gnagere så som mus, rotter og hamstere, kaniner eller aper generelt anvendt.

Immunisering av et dyr med et sensibiliserende antigen blir utført i henhold til en kjent metode. For eksempel blir immunisering utført ved en generell metode hvor et pattedyr blir injisert intraperitonealt eller subkutant med et sensibiliserende antigen. Spesifikt blir et sensibiliserende antigen fortynnet med eller suspendert i en passende mengde av PBS (fosfat-bufret saltløsning), fysiologisk saltløsning eller lignende, en passende mengde av et standard adjuvans så som Freund’s complete adjuvant blir blandet med produktet hvis nødvendig og deretter blir løsningen emulgert og blir administrert til et pattedyr mange ganger hver 4 til 21 dager. I tillegg kan en passende bærer også anvendes ved immunisering med et sensibiliserende antigen.

Et pattedyr blir immunisert som beskrevet ovenfor og deretter blir et øket nivå av mål-antistoff i serum bekreftet. Deretter blir immunocytter oppsamlet fra pattedyret og deretter underkastet cellefusjon. En spesielt foretrukket immunocytt er en splenocytt.

Som en parental partnercelle som skal kondenseres med den ovennevnte immunocytt, blir en pattedyr-myelomcelle anvendt. Eksempler på en cellelinje av myelomcellen som fortrinnsvis blir anvendt her omfatter forskjellige kjente cellelinjer så som P3 (P3x63 Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63 Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. og Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) og R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Cellefusjon av ovennevnte immunocytter med myelomceller kan stort sett utføres i henhold til en kjent metode, for eksempel metoden ifølge Kohler og Milstein et al. (Kohler. G. og Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mer spesifikt blir ovennevnte cellefusjon utført i en normal næringskulturløsning i nærvær av for eksempel en cellefusjons-akselerator. Som cellefusjons-akselerator blir for eksempel polyetylenglykol (PEG), et hemagglutinerende virus fra Japan (HVJ) anvendt. Om ønsket kan et adjuvans så som dimetylsulfoksid tilsettes for ytterligere å forbedre fusjons-effektiviteten.

Forholdet av immunocytter til myelomceller kan velges hensiktsmessig. For eksempel er det foretrukket at antallet immunocytter er 1 til 10 ganger større enn det til myelomceller. Kulturløsningen som skal anvendes for ovennevnte cellefusjon omfatter for eksempel en RPMI1640 kulturløsning eller en MEM kulturløsning som er egnet for vekst av ovennevnte myelomcellelinje eller en annen normal kulturløsning som blir anvendt for denne type cellekultur. Videre kan et serum-supplement så som føtalt kalveserum (FCS) anvendes i kombinasjon dermed.

Cellefusjon blir utført som følger. Forutbestemte mengder av ovennevnte immunocytter og myelomceller blir blandet godt i ovennevnte kulturløsning, en PEG-(f.eks. med en gjennomsnittlig molekylvekt på omtrent 1000 til 6000) løsning (en generell konsentrasjon på 30 til 60% (vekt/volum)), som var forhåndsoppvarmet ved omtrent 37 ºC, blir tilsatt og deretter blir løsningen blandet, hvorved en målfusjonscelle (hybridom) blir dannet. Deretter blir en passende kulturløsning tilsatt suksessivt og deretter blir et trinn med fjerning av supernatanten ved sentrifugering gjentatt for å fjerne et reagens for cellefusjon eller lignende som er ufordelaktig for veksten av hybridomet.

Det således oppnådde hybridom blir selektert ved dyrking av hybridomet i en standard selektiv kulturløsning så som en HAT kulturløsning (en kulturløsning inneholdende hypoxantin, aminopterin og thymidin). Dyrkning i ovennevnte HAT kulturløsning blir fortsatt i en tid tilstrekkelig til at cellene (ikke-fuserte celler) forskjellige fra målhybridomet dør (normalt flere dager til flere uker). Deretter blir en standard begrensende fortynningsmetode utført for screening for og monokloning av hybridom som gir et mål-antistoff.

I tillegg til metoden med immunisering av et ikke-humant dyr med et antigen for å oppnå hybridom, kan et ønsket humant antistoff som har en bindingsaktivitet til glypican 3 også oppnås ved sensibilisering av en human lymfocytt med glypican 3 in vitro og la den sensibiliserte lymfocytt smelte sammen med en menneske-avledet myelomcelle som har et permanent delingspotensiale (se JP-B-1-59878). Ved en annen metode blir glypican 3 antigen administrert til et transgent dyr som har hele repertoaret av humane antistoff-gener for å oppnå anti-glypican 3 antistoffproduserende celler, som deretter blir immortalisert og et humant antistoff for glypican 3 kan oppnås fra de immortaliserte anti-glypican 3 antistoff-produserende celler (se internasjonale patentsøknader WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 og WO 94/02602).

Det således fremstilte hybridom som produserer et monoklonalt antistoff kan passasje-dyrkes i en standard kulturløsning eller kan lagres en lang periode i flytende nitrogen.

Ett eksempel på en metode anvendt for å oppnå et monoklonalt antistoff fra hybridomet involverer dyrkning av hybridomet og oppnåelse av et monoklonalt antistoff fra kultur-supernatanten i henhold til en standard metode. En annen metode involverer å administrere hybridomet til et pattedyr som er kompatibelt med hybridomet for å tillate det å proliferere og oppnå et monoklonalt antistoff fra ascites. Førstnevnte metode er egnet for å oppnå et antistoff med høy renhet, mens den sistnevnte metode er egnet for masseproduksjon av antistoffer.

Det er også mulig å fremstille et rekombinant antistoff ved kloning av antistoffgenet fra hybridomet som omfatter genet i en passende vektor, innføring av vektoren i en vert og deretter la verten produsere det rekombinante antistoff ved en genetisk konstruksjonsteknikk (se f.eks. Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).

Spesifikt blir mRNA som koder for den variable (V) region av et anti-glypican 3 antistoff isolert fra et hybridom som produserer anti-glypican 3 antistoff. mRNA blir isolert ved en kjent metode så som guanidin ultrasentrifugeringsmetode (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) eller en AGPC-metode (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) og totalt RNA blir fremstilt og deretter blir mål-mRNA fremstilt ved anvendelse av et mRNA rensnings-sett (Pharmacia) eller lignende. I tillegg kan mRNA også fremstilles direkte ved anvendelse av et QuickPrep mRNA rensnings-sett (Pharmacia).

cDNA av antistoff V-regionen blir syntetisert ved anvendelse av en revers transkriptase fra det således oppnådde mRNA. cDNA kan syntetiseres ved anvendelse av et AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA-syntese- sett (SEIKAGAKU CORPORATION) eller lignende. I tillegg kan for eksempel et 5’-Ampli FINDER RACE sett (Clontech), 5’-RACE metoden ved anvendelse av PCR (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) anvendes for syntetisering og amplifisering av cDNA.

Et mål-DNA-fragment blir renset fra det således oppnådde PCR-produkt og deretter ligert til en vektor DNA. En rekombinant vektor blir fremstilt fra produktet og deretter blir vektoren innført i E. coli eller lignende og en koloni blir selektert, for derved å lage en ønsket rekombinant vektor. Nukleotidsekvensen av mål-DNA blir deretter bestemt ved en kjent metode så som en dideoksynukleotidkjedetermineringsmetode.

Etter at DNA som koder for V-regionen av mål-anti-glypican 3 antistoffet er oppnådd, blir dette DNA innført i en ekspresjonsvektor inneholdende DNA som koder for den konstante region (C-region) av mål-antistoffet.

For å produsere anti-glypican 3-antistoffet anvendt ved foreliggende oppfinnelse, blir antistoffgenet innført i en ekspresjonsvektor slik at genet blir uttrykt under regulering av gen-ekspresjonskontrollregionen omfattende for eksempel en enhancer og en promoter. Deretter blir en vertscelle transformert med ekspresjonsvektoren, for derved å la verten uttrykke antistoffet.

Et antistoff-gen kan uttrykkes ved å innføre et polynukleotid som koder for H-kjeden eller et polynukleotid som koder for L-kjeden separat i en ekspresjonsvektor og deretter samtidig transformere en vertscelle med vektorene eller ved å innføre polynukleotider som koder for H-kjeden og L-kjeden i en enkel ekspresjonsvektor og deretter transformere en vertscelle med vektoren (se internasjonal patentsøknad WO 94/11523).

Polynukleotid

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et polynukleotid som koder for en tungkjede variabel region eller en lettkjede variabel region av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis har polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse en nukleotidsekvens beskrevet i hvilken som helst av SEKV ID NR: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 og 77-83. I tillegg er et polynukleotid som er hybridisert til ovennevnte polynukleotid under stringente betingelser og koder for et antistoff som har en aktivitet ekvivalent med den til antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse, også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset så lenge det koder for antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er en polymer sammensatt av en rekke nukleotider, så som deoksyribonukleinsyrer (DNA) eller ribonukleinsyrer (RNA). Det kan inneholde en base forskjellig fra en naturlig forekommende base. Polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å produsere et antistoff ved en genetisk konstruksjonsteknikk. I tillegg kan polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes som en probe for screening for et antistoff som har en funksjon ekvivalent med den til antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Dvs. et polynukleotid som koder for antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse eller et partielt fragment derav kan anvendes som en probe for å oppnå DNA som er hybridisert til polynukleotidet under stringente betingelser og koder for et antistoff som har en aktivitet ekvivalent med den til antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse ved teknikker så som en hybridiseringsteknikk, en genamplifiseringsteknikk (f.eks. PCR). Slik DNA er også omfattet i polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Hybridiseringsteknikken (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2. ed., 9,47-9,58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) er velkjent for fagfolk på området.

Eksempler på hybridiseringsbetingelsene omfatter for eksempel lav- stringente betingelser. Lav-stringente betingelser er for eksempel betingelser med 42 ºC, 0,1x SSC og 0,1% SDS, fortrinnsvis betingelser med 50 ºC, 0,1x SSC og 0,1% SDS når vasking blir utført etter hybridisering. Mer foretrukne eksempler på hybridiseringsbetingelsene omfatter for eksempel høy-stringente betingelser. Høystringente betingelser er for eksempel betingelser med 65 ºC, 5x SSC og 0,1% SDS. Under disse betingelsene kan det forventes at et polynukleotid som har en høyere homologi effektivt kan oppnås under høyere temperatur. Imidlertid er det mange faktorer som påvirker stringensen av hybridisering, så som temperatur og konsentrasjonen av salt, og fagfolk på området kan oppnå en lignende stringens ved hensiktsmessig å velge disse faktorer.

Et antistoff funksjonelt ekvivalent med antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kodet for av et polynukleotid oppnådd ved en slik hybridiseringsteknikk og gen-amplifiseringsteknikk har vanligvis høy homologi med antistoffet når det gjelder aminosyresekvensen. Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også et antistoff som er funksjonelt ekvivalent med antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse og har høy homologi med aminosyresekvensen av antistoffet. Høy homologi betyr generelt minst 50% eller høyere identitet, fortrinnsvis 75% eller høyere identitet, mer foretrukket 85% eller høyere identitet og enda mer foretrukket 95% eller høyere identitet på aminosyrenivå. For å bestemme homologien av polypeptider kan algoritmen beskrevet i litteraturen (Wilbur, W. J. og Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730) anvendes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en vektor inneholdende polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse. En slik vektor kan anvendes for fremstilling av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Når det gjelder vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel i tilfellet hvor E. coli blir anvendt som en vert, er den ikke spesielt begrenset så lenge den har "ori" for anvendelse i amplifisering i E. coli for å produsere og amplifisere vektoren i en stor mengde i E. coli (f.eks. JM109, DH5 α, HB101 eller XLlBlue) og har et markørgen for selektering av transformert E. coli (f.eks. et medikament-resistensgen som kan identifiseres ved et medikament så som ampicillin, tetracyklin, kanamycin eller kloramfenicol).

Eksempler på vektoren omfatter M13-serien vektorer, pUC-serien vektorer, pBR322, pBluescript, pCR-Script og lignende. I tillegg kan pGEM-T, pDIRECT og pT7 også anvendes for subkloning og ekstraksjon av cDNA så vel som vektorene beskrevet ovenfor.

Som vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse er en ekspresjonsvektor spesielt anvendelig. For eksempel bør en ekspresjonsvektor som skal uttrykkes i E. coli ha de karakteristiske trekk ovenfor for å bli amplifisert i E. coli. I tillegg, i tilfellet hvor E. coli, så som JM109, DH5 α, HB101 eller XL1-Blue blir anvendt som en vertscelle, er det helt nødvendig at vektoren må ha en promoter, for eksempel lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), T7 promoter eller lignende, som effektivt kan uttrykke det ønskede produkt i E. coli. Eksempler på en slik vektor omfatter pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP, pET (i dette tilfellet er verten fortrinnsvis BL21 som uttrykker T7 RNA polymerase) og lignende, så vel som vektorene beskrevet ovenfor.

I tillegg kan vektoren også inneholde en signalsekvens for polypeptidsekresjon. Som signalsekvensen for protein-sekresjon, i tilfellet hvor et polypeptid blir produsert i periplasmaet av E. coli, kan pelB signalsekvens (Lei S. P. et al., J. Bacteriol (1987) 169, 4379) anvendes. Innføring av vektoren i en vertscelle kan utføres ved anvendelse av for eksempel kalsiumklorid-metoden og elektroporeringsmetoden.

I tillegg til E. coli kan for eksempel ekspresjonsvektorer avledet fra pattedyr (f.eks. pcDNA3 (Invitrogen) og pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. (1990) 18(17), p5322), pEF og pCDM8), ekspresjonsvektorer avledet fra insektceller (f.eks. "Bac-to-BAC baculovirus ekspresjonssystem" (GIBCO BRL) og pBacPAK8), ekspresjonsvektorer avledet fra planter (f.eks. pMH1 og pMH2), ekspresjonsvektorer avledet fra dyrevirus (f.eks. pHSV, pMV og pAdexLcw), ekspresjonsvektorer avledet fra retrovirus (f.eks. pZIPneo), ekspresjonsvektorer avledet fra gjær (f.eks. "Pichia Expression Kit " (Invitrogen), pNV11 og SP-Q01) og ekspresjonsvektorer avledet fra Bacillus subtilis (f.eks. pPL608 og pKTH50) anvendes som vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse.

For formålet å uttrykke vektoren i en dyrecelle så som en CHO-celle, COS-celle, en NIH3T3-celle eller lignende, er det nødvendig at vektoren har en promoter nødvendig for ekspresjon i en celle så som SV40-promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMTV-LTR-promoter, EFl α-promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV-promoter eller lignende og mer foretrukket har et markør-gen (så som et medikament- resistens-gen som kan identifiseres med et medikament så som neomycin eller G418) for selektering av transformasjon i cellen. Eksempler på en vektor som har slike karakteristika omfatter for eksempel pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV og pOP13.

Videre for formålet stabilt å uttrykke et gen og samtidig amplifisere genkopiantallet i cellen, blir en vektor (f.eks. pCHOI, etc.) som har DHFR-genet innført i CHO-cellen som mangler nukleinsyre syntesebane for å utfylle mangelen og blir amplifisert med metotrexat (MTX). I tillegg, for formålet transient ekspresjon av et gen, blir transformasjon utført med en vektor (så som pcD) som har replikasjonsorigo for SV40 ved anvendelse av en COS-celle som på kromosomet har et gen som uttrykker SV40 T-antigen. Som replikasjonsorigo, kan et avledet fra et polyoma-virus, et adenovirus, et bovint papilloma-virus (BPV) og lignende også anvendes. Videre, for amplifisering av genkopitallet i vertscellesystemet, kan ekspresjonsvektoren omfatte, som en selekterbar markør, aminoglykosid-transferase- (APH) gen, thymidin-kinase- (TK) gen, E. coli xantin guaninfosforibosyl-transferase- (Ecogpt) gen, dihydrofolat-reduktase-(dhfr) gen og lignende.

For å fremstille antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse blir vektoren innført i en vertscelle. Vertscellen i hvilken vektoren blir innført er ikke spesielt begrenset, men omfatter for eksempel E. coli eller hvilken som helst av forskjellige dyreceller. For eksempel kan vertscellen anvendes som et produksjonssystem for produksjon eller ekspresjon av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Når det gjelder produksjonssystemet for polypeptid-fremstilling, er det et in vitro produksjonssystem og et in vivo produksjonssystem. In vitro produksjonssystemet omfatter et produksjonssystem som anvender eukaryote celler og et produksjonssystem som anvender prokaryote celler.

I tilfellet hvor en eukaryot celle blir anvendt, kan for eksempel en dyrecelle, en plantecelle eller en fungal celle anvendes. Kjente dyreceller omfatter en pattedyrcelle så som en CHO-celle (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), en COS-celle, en 3T3-celle, en myelomcelle, en babyhamster nyre- (BHK) celle, en HeLa-celle og en Vero-celle, en amfibie-celle så som en Xenopus oocytt (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) eller en insektcelle så som Sf9, Sf21 og Tn5. Ved foreliggende oppfinnelse blir CHO-DG44, CHO-DXB11, en COS7 celle, en BHK-celle fortrinnsvis anvendt. Blant dyreceller, for formålet å oppnå en stor mengde ekspresjon, er en CHO-celle spesielt foretrukket. Innføring av vektoren i vertscellen kan utføres ved for eksempel kalsiumfosfat-metoden, DEAE-dekstran-metoden, det kationiske ribozom DOTAP (Boehringer Mannheim), elektroporeringsmetoden, lipofeksjonsmetoden eller lignende.

Som plantecellen er for eksempel en celle avledet fra Nicotiana tabacum kjent som et protein-produksjonssystem, som kan underkastes kallus-kultur. Eksempler på fungale celler omfatter gjær så som slekten Saccharomyces, mer spesifikt Saccharomyces cerevistae og Saccharomyces pombe og filamentøse sopper så som slekten Aspergillus, mer spesifikt Aspergillus niger.

I tilfellet hvor en prokaryot celle blir anvendt kan et produksjonssystem ved anvendelse av en bakteriecelle anvendes. Eksempler på bakterielle celler omfatter Escherichia coli (E. coli) så som JM109, DH5 α og HB101 og Bacillus subtilis.

Fremstilling av rekombinant antistoff

Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved dyrkning av ovennevnte vertsceller. Antistoffet kan oppnås ved dyrkning in vitro av en celle transformert med et ønsket polynukleotid. Dyrkning kan utføres i henhold til en kjent metode. Dyrkningsmedier for dyreceller omfatter for eksempel DMEM, MEM, RPMI 1640 og IMDM. Et serum-supplement så som FBS eller føtalt kalveserum (FCS) kan anvendes i kombinasjon eller serum-fritt medium kan anvendes. pH under dyrkningen er fortrinnsvis ca.6 til 8. Dyrkning blir vanligvis utført ved ca.30 til 40 ºC i ca. 15 til 200 timer, etter behov med mediumbytting, lufting og agitering.

På den annen side omfatter systemer for å produsere et polypeptid in vivo for eksempel et produksjonssystem som anvender et dyr og et produksjonssystem som anvender en plante. Mål-polynukleotid blir innført i et slikt dyr eller plante og polypeptidet blir produsert i kroppen til dyret eller planten og gjenvunnet.

Betegnelsen "vertscelle" som anvendt her omfatter et slikt dyr og en plante.

Når et dyr blir anvendt er produksjonssystemer ved anvendelse av et pattedyr eller et insekt tilgjengelig. Som pattedyr kan geiter, griser, sauer, mus og kveg anvendes (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Et transgent dyr kan også anvendes som et pattedyr.

For eksempel blir mål-polynukleotidet fremstilt som et fusjonsgen med et gen som koder for et polypeptid som naturlig blir produsert i melk så som geit β kasein. Deretter blir DNA-fragmentet inneholdende dette fusjonsgen injisert i et geiteembryo og embryoet blir transplantert til en hunngeit. Mål-antistoffet kan oppnås fra melken produsert av den transgene geit født av geiten som mottok embryoet eller avkommet til denne. For å øke mengden av melk inneholdende antistoffet produsert av den transgene geit kan hormon gis til den transgene geit etter behov (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

I tillegg kan som et insekt for eksempel en silkeorm anvendes. I tilfellet hvor en silkeorm blir anvendt blir en silkeorm infisert med baculovirus i hvilket polynukleotidet som koder for mål-antistoffet er innsatt. Mål-antistoff kan oppnås fra kroppsvæsken til silkeormen (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

I tilfellet hvor en plante blir anvendt kan for eksempel tobakk anvendes. I tilfellet hvor tobakk blir anvendt blir et polynukleotid som koder for mål-antistoffet innsatt i en ekspresjonsvektor for en plante, for eksempel pMON 530 og deretter blir vektoren innført i en bakterie så som Agrobacterium tumefaciens. Deretter blir tobakk, så som Nicotiana tabacum, infisert med bakterien, hvorved mål-antistoffet kan oppnås fra bladene av tobakken (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Det således oppnådde antistoff kan isoleres inne i eller utenfor (dyrkningsmedium, etc.) vertscellen og kan deretter renses til et hovedsakelig rent og ensartet antistoff. Separering og rensning av antistoffet kan utføres ved en separerings- og rensnings-metode vanlig anvendt for rensning av polypeptider. For eksempel kan polypeptider separeres og renses ved hvilke som helst metoder omfattende kolonnekromatografi, filtrering, ultrafiltrering, utsalting, løsningsmiddelutfelling, løsningsmiddel-ekstraksjon, destillering, immunopresipitering, SDS-polyakrylamid gelelektroforese, isoelektrisk fokusering, dialyse, omkrystallisering og en kombinasjon derav.

Eksempler på kromatografi omfatter for eksempel affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob kromatografi, gel-filtrering, revers fase kromatografi, adsorpsjonskromatografi (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Disse kromatografier kan utføres ved anvendelse av væskefase kromatografi så som HPLC og FPLC. Eksempler på en kolonne som kan anvendes for affinitetskromatografi omfatter en protein A kolonne eller en protein G kolonne. Eksempel på protein A kolonnen er Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia).

Videre, før eller etter rensning av antistoffet, kan antistoffet modifiseres eller peptider kan delvis fjernes etter behov ved å la et egnet protein-modifiserende enzym virke. Et protein-modifiserende enzym for dette formål omfatter for eksempel trypsin, chymotrypsin, lysyl-endopeptidase, proteinkinase, glukosidase.

Diagnostisk metode

Det er beskrevet en metode for diagnostisering av en sykdom så som kreft ved detektering av GPC3-protein i en testprøve ved anvendelse av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Deteksjonen anvendt her omfatter kvantitativ deteksjon og ikke-kvantitativ deteksjon. Den ikke-kvantitative deteksjon omfatter for eksempel bare bestemmelse av hvorvidt eller ikke GPC3-protein er til stede, bestemmelse av hvorvidt eller ikke en spesifikk mengde eller mer av GPC3- protein er til stede, bestemmelse for sammenligning av mengden av GPC3- protein med den i en annen prøve (f.eks. en kontrollprøve). Den kvantitative deteksjon omfatter bestemmelse av konsentrasjonen av GPC3-protein, bestemmelse av mengden av GPC3-protein.

Testprøven er ikke spesielt begrenset så lenge det er en prøve som mulig kan inneholde GPC3-protein, imidlertid er det foretrukket med en prøve oppsamlet fra kroppen til en levende organisme så som et pattedyr og mer foretrukket en prøve oppsamlet fra et menneske. Spesifikke eksempler på testprøven kan for eksempel omfatte blod, interstitiell væske, plasma, ekstravaskulær væske, cerebral-væske, leddvæske, pleural-væske, serum, lymfevæske, spytt, fortrinnsvis blod, serum og plasma. I tillegg er en prøve oppnådd fra testprøven så som en kulturløsning av celler oppsamlet fra kroppen av den levende organisme også inkludert i testprøven ifølge foreliggende oppfinnelse.

Kreften som kan diagnostiseres er ikke spesielt begrenset og spesifikke eksempler kan omfatte leverkreft, pankreatisk kreft, lungekreft, kolonkreft, brystkreft, prostatakreft, leukemi og lymfom, fortrinnsvis leverkreft. GPC3 som kan detekteres er ikke spesielt begrenset og kan være enten full-lengde GPC3 eller et fragment derav. I tilfellet hvor et fragment av GPC3 blir detektert, kan det være enten det N-terminale fragment eller det C-terminale fragment, imidlertid er det N-terminale fragment foretrukket. I tillegg kan GPC3-proteinet også være et heparansulfat-tilsatt GPC3 eller et GPC3 kjerneprotein.

Metoden for detektering av GPC3-protein inneholdt i en testprøve er ikke spesielt begrenset, imidlertid blir deteksjon fortrinnsvis utført ved en immunologisk metode ved anvendelse av et anti-GPC3 antistoff. Eksempler på den immunologiske metode omfatter for eksempel en radioimmunoassay, en enzymimmunoassay, en fluorescens-immunoassay, en luminescens-immunoassay, immunopresipitering, en turbidimetrisk immunoassay. Foretrukket er et enzymimmunoassay og spesielt foretrukket er et enzym-bundet immunosorbent forsøk (ELISA) (f.eks. sandwich ELISA). Ovennevnte immunologiske metode så som ELISA kan utføres ved en metode kjent for fagfolk på området.

En generell deteksjonsmetode ved anvendelse av et anti-GPC3 antistoff omfatter immobilisering av et anti-GPC3 antistoff på en bærer, tilsetning av en testprøve dertil, inkubering av bæreren for å la anti-GPC3 antistoff og GPC3 protein binde til hverandre, vasking av bæreren og detektering av GPC3 protein-binding til bæreren via anti-GPC3 antistoff for å detektere GPC3-protein i en testprøve.

Bindingen mellom anti-GPC3 antistoff og GPC3 protein blir generelt utført i en buffer. Buffere anvendt ved oppfinnelsen omfatter for eksempel en fosfatbuffer, en Tris-buffer. Inkubering blir utført under betingelsene generelt anvendt, for eksempel ved 4 ºC til romtemperatur i 1 time til 24 timer. Vasking etter inkubering kan utføres ved hvilken som helst metode så lenge den ikke hemmer bindingen mellom GPC3 proteinet og anti-GPC3 antistoffet, ved anvendelse av for eksempel en buffer inneholdende et overflateaktivt middel så som Tween 20.

Ved metoden for detektering av GPC3 protein , kan en kontrollprøve tilveiebringes i tillegg til en testprøve som skal testes for GPC3-protein.

Kontrollprøvene omfatter en negativ kontrollprøve som ikke inneholder GPC3-protein og en positiv kontrollprøve som inneholder GPC3-protein. I dette tilfellet er det mulig å detektere GPC3-protein i testprøven ved å sammenligne resultatet oppnådd med den negative kontroll- prøven som ikke inneholder GPC3-protein med resultatet oppnådd med den positive kontrollprøven som inneholder GPC3-protein. Det er også mulig kvantitativt å detektere GPC3-protein inneholdt i testprøven ved å oppnå deteksjonsresultater av kontrollprøvene og testprøven som nummeriske verdier og sammenligne disse nummeriske verdier.

En foretrukket utførelsesform for detektering av GPC3 protein-binding til bæreren via et anti-GPC3 antistoff er en metode som anvender et anti-GPC3 antistoff merket med et detekterbart merke. For eksempel kan GPC3-protein detekteres ved å bringe testprøven i kontakt med et anti-GPC3 antistoff immobilisert på bæreren, vasking av bæreren og deretter detektering av GPC3 ved anvendelse av det merkede antistoffet som spesifikt binder til GPC3- protein.

Merking av et anti-GPC3-antistoff kan utføres ved en generelt kjent metode. Eksempler på detekterbart merke kjent for fagfolk på området omfatter en fluorescerende farge, et enzym, et koenzym, en chemiluminescent substans eller en radioaktiv substans. Spesifikke eksempler kan omfatte radioisotoper (<32>P,<14>C,<125>I,<3>H,<131>I og lignende), fluorescein, rhodamin, dansylklorid, umbelliferon, luciferase, peroksidase, alkalisk fosfatase, β-galaktosidase, β-glukosidase, pepperrotperoksidase, glukoamylase, lysozym, sakkarid-oksidase, mikroperoksidase, biotin og lignende. I tilfellet hvor biotin blir anvendt som et detekterbart merke er det foretrukket at et biotin-merket antistoff blir tilsatt og deretter blir avidin konjugert til et enzym så som alkalisk fosfatase videre tilsatt.

Spesifikt blir en løsning inneholdende et anti-GPC3-antistoff satt til en bærer så som en plate for å tillate at anti-GPC3-antistoffet blir immobilisert. Etter vasking blir platen blokkert med for eksempel BSA for å forhindre uspesifikk binding av et protein. Platen blir vasket igjen og deretter blir testprøven satt til platen. Etter inkubering blir platen vasket og deretter blir det merkede anti-GPC3-antistoff tilsatt. Etter passende inkubering blir platen vasket og deretter blir merket anti-GPC3 antistoff igjen på platen detektert. Deteksjon av proteinet kan utføres ved en metode kjent for fagfolk på området. For eksempel i tilfellet hvor antistoffet er merket med en radioaktiv substans kan proteinet detekteres ved væske-scintillasjon eller RIA-metoden. I tilfellet hvor antistoffet er merket med et enzym kan proteinet detekteres ved tilsetning av et substrat og detektering av en enzymatisk forandring av substratet så som fargeutvikling med en absorbans-leser. I tilfellet hvor antistoffet er merket med en fluorescerende substans kan proteinet detekteres ved anvendelse av et fluorometer.

En spesielt foretrukket utførelsesform av metoden for detektering av GPC3-protein er en metode som anvender et anti-GPC3-antistoff merket med biotin og avidin. Spesifikt blir en løsning inneholdende et anti-GPC3 antistoff satt til en bærer så som en plate for å tillate at anti-GPC3-antistoffet blir immobilisert på den. Etter vasking blir platen blokkert med for eksempel BSA for å forhindre uspesifikk binding av et protein, platen blir vasket igjen og deretter blir testprøven satt til platen. Etter inkubering blir platen vasket og deretter blir det biotin-merkede anti-GPC3- antistoff tilsatt. Etter passende inkubering blir platen vasket og deretter blir avidin konjugert til et enzym så som alkalisk fosfatase eller peroksidase tilsatt. Etter inkubering blir platen vasket og deretter blir et substrat av enzymet konjugert til avidin tilsatt.

Deretter blir GPC3-protein detektert ved hjelp av den enzymatiske forandring av substratet som en indikator.

En annen utførelsesform av metoden for detektering av GPC3-protein er en metode som anvender et primært antistoff som spesifikt binder til GPC3-proteinet og et sekundært antistoff som spesifikt binder til det primære antistoff. For eksempel blir testprøven bragt i kontakt med et anti-GPC3-antistoff immobilisert på bæreren, bæreren blir inkubert og vasket og bundet GPC3-protein etter vasking blir detektert med et primært anti-GPC3-antistoff og et sekundært antistoff som spesifikt binder til det primære antistoff. I dette tilfellet er det sekundære antistoff fortrinnsvis merket med et detekterbart merke.

Spesifikt blir en løsning inneholdende et anti-GPC3-antistoff satt til en bærer så som en plate for å tillate at anti-GPC3-antistoffet blir immobilisert på den. Etter vasking blir platen blokkert med for eksempel BSA for å forhindre uspesifikk binding av et protein. Platen blir vasket igjen og deretter blir testprøven satt til platen. Etter inkubering blir platen vasket og deretter blir et primært anti-GPC3-antistoff tilsatt. Etter passende inkubering blir platen vasket og deretter blir et sekundært antistoff som spesifikt binder til det primære antistoff tilsatt. Etter passende inkubering blir platen vasket og deretter blir det sekundære antistoff som er igjen på platen detektert. Deteksjon av det sekundære antistoff kan utføres ved ovennevnte metode.

Farmasøytisk preparat

Det er videre beskrevet et farmasøytisk preparat inneholdende antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Det farmasøytiske preparatet inneholdende antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelig for behandling og/eller forebygging av en sykdom forbundet med celleproliferasjon så som kreft og spesielt er det anvendelig for behandling og/eller forebygging av leverkreft. I tilfellet hvor antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse blir anvendt som et farmasøytisk preparat, kan antistoffet formuleres til en doseform ved en metode kjent for fagfolk på området. For eksempel kan det farmasøytiske preparatet anvendes parenteralt i form av en injeksjon av en steril løsning eller en suspensjon med vann eller en annen farmasøytisk akseptabel løsning. For eksempel kan antistoffet formuleres til en doseform ved passende blanding av det med en farmasøytisk akseptabel bærer eller løsningsmiddel, så som sterilt vann, fysiologisk saltløsning, en planteolje, et emulgeringsmiddel, en suspensjon, et overflateaktivt middel, en stabilisator, et smaksmiddel, et tilsetningsmiddel, en konstituent, et konserveringsmiddel, et bindemiddel for å fremstille en enhetsdoseform nødvendig for generelt akseptert medikament-implementering. Mengden av aktive bestanddeler i disse preparater blir valgt for å tillate administrering av en egnet dose innen det angitte område.

Et sterilt preparat for injeksjon kan formuleres ved anvendelse av en konstituent så som destillert vann for injeksjon i henhold til den generelle medikament-implementering.

Eksempler på den vandige løsningen for injeksjon omfatter for eksempel fysiologisk saltløsning, glukose og andre isotoniske væsker omfattende adjuvantia, så som D-sorbitol, D-mannnose, D-mannitol og natriumklorid. De kan anvendes i kombinasjon med et egnet solubiliseringsmiddel, så som en alkohol, spesifikt etanol, en polyalkohol så som propylenglykol og polyetylenglykol og et ikke-ionisk overflateaktivt middel så som Polysorbat 80 (TM) og HCO-50.

Sesamolje eller soyabønneolje kan anvendes som en oljeaktig væske og kan anvendes i kombinasjon med benzylbenzoat eller benzylalkohol som et solubiliseringsmiddel. Det kan formuleres med en buffer så som en fosfatbuffer eller en natriumacetatbuffer, et smertestillende middel så som prokainhydroklorid, en stabilisator så som benzylalkohol eller fenol eller en antioksidant. Det fremstilte injeksjonspreparat blir generelt fylt i en egnet ampulle.

Administreringsmetoden er fortrinnsvis parenteral og spesifikke eksempler omfatter injeksjon, transnasal administrering, transpulmonal administrering, transdermal administrering og lignende. Injeksjons-formuleringen kan administreres systemisk eller topisk ved intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, intraperitoneal injeksjon, subkutan injeksjon eller lignende.

Administreringsmetoden kan velges som det passer for alderen og symptomene til en pasient. For eksempel kan én dose av det farmasøytiske preparatet inneholdende antistoffet eller polynukleotidet som koder for antistoffet velges fra området 0,0001 mg til 1,000 mg pr. kg kroppsvekt. Alternativt kan for eksempel dosen velges fra området 0,001 mg til 100,000 mg/kropp pr. pasient, selv om det ikke alltid er begrenset til disse nummeriske verdier. Dosen og administreringsmetoden varierer i henhold til kroppsvekt, alder og symptomene til en pasient og blir passende valgt av fagfolk på området.

EKSEMPEL

Foreliggende oppfinnelse vil bli beskrevet mer detaljert med referanse til Eksempler nedenfor. Imidlertid er foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til disse Eksempler.

Eksempel 1

cDNA-kloning av human glypican 3 (GPC3)

Full-lengde cDNA som koder for human GPC3 ble amplifisert ved PCR reaksjon med et Advantage 2 sett (CLONTECH) ved anvendelse av første tråd cDNA fremstilt ved en vanlig metode fra en kolonkreft-cellelinje, Caco2, som templat. Mer spesifikt ble 50 μL av en reaksjonsblanding inneholdende 2 μL av cDNA avledet fra Caco2, 1 μL av en sense primer (GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT: SEKV ID NR: 1), 1 μL av en antisense primer (GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: SEKV ID NR: 2), 5 μL av Advantage 210x PCR-buffer, 8 μL av dNTP mix (1,25 mM) og 1,0 μL av Advantage polymerase Mix underkastet 35 cykler bestående av 94 ºC i 1 minutt, 63 ºC i 30 sekunder og 68 ºC i 3 minutter. Det amplifiserte produkt fra PCR-reaksjonen ble innsatt i en TA vektor, pGEM-T Easy, ved anvendelse av pGEM-T Easy Vector System I (Promega).

Sekvensen ble bekreftet ved anvendelse av en ABI 3100 DNA-sekvenserer. På denne måten ble cDNA som koder for full-lengde human GPC3 isolert. Sekvensen vist i SEKV ID NR: 3 indikerer nukleotidsekvensen av humant GPC3-gen og sekvensen vist i SEKV ID NR: 4 indikerer aminosyresekvensen av humant GPC3-protein.

Eksempel 2

Fremstilling av oppløselig form av GPC3

Som immunoprotein for dannelse av et anti-GPC3-antistoff, ble en oppløselig form av GPC-protein fremstilt, hvor en hydrofob region på den C-terminale side (564-580 aminosyrer) var deletert.

Ved anvendelse av full-lengde human GPC3 cDNA som templat, ble en PCR-reaksjon utført ved anvendelse av en antisense primer (ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C: SEKV ID NR: 5) og en sense primer, til hvilken en EcoRI gjenkjennelse-sekvens og en Kozak-sekvens var tilsatt, (ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C: SEKV ID NR: 6). Det oppnådde PCR-fragment (1711 bp) ble klonet inn i pCXND2-Flag. pCXND2-Flag ble utformet til å uttrykke et Flag-merket protein ved insersjon av regionen for DHFR genekspresjon av pCHOI (Hirata et al., FEBS letter 1994; 356; 244-248) i HindIII-setet av pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108; 193-199) og tilsetning av en Flag merkesekvens nedstrøms for multikloningssetet. Det konstruerte ekspresjonsplasmid DNA ble innført i en CHO-cellelinje, DXB11 og en CHO-cellelinje som sterkt uttrykte den oppløselige form av GPC3 ble oppnådd ved seleksjon med 500 μg/ml Geneticin. Stor-skala dyrkning av CHO-cellelinjen som sterkt uttrykte den oppløselige form av GPC3 ble fremstilt ved anvendelse av en 1700 cm<2>rulleflaske og kultursupernatanten ble gjenvunnet for antistoff-rensning. Kultursupernatanten ble påført på en DEAE sepharose Fast Flow kolonne (Amersham) og etter vasking ble antistoffet eluert med en buffer inneholdende 500 mM NaCl og affinitetsrenset ved anvendelse av Anti-Flag M2 agarose affinitetsgel (SIGMA). Elueringen ble utført med 200 μg/ml FLAG-peptid. Etter at eluatet var konsentrert med Centriprep-10 (Millipore) ble FLAG-peptid fjernet ved gelfiltrering ved anvendelse av Superdex 200 HR 10/30 (Amersham). Til slutt ble filtratet konsentrert ved anvendelse av en DEAE sepharose Fast Flow kolonne og eluert med PBS (inneholdende 500 mM NaCl) uten Tween 20 for å bevirke bufferutveksling.

Eksempel 3

Fremstilling av oppløselig form av GPC3 kjerneprotein

GPC3 blir modifisert av heparansulfat til å bli et makromolekyl. For å eliminere et antistoff mot heparansulfat ved screening for et anti-GPC3-antistoff, ble en oppløselig form av GPC3 kjerneprotein som hadde en punktmutasjon i heparansulfatbindingssetet fremstilt og anvendt for screeningen.

Ved anvendelse av ovennevnte oppløselige form av GPC3 (1-563) som templat, ble cDNA hvor Ser-rester i 495. og 509. stilling var erstattet med Ala, fremstilt ved assembly PCR-metoden, hvor primere ble utformet for å tilsette Hismerke til C-terminus. Det oppnådde cDNA ble klonet inn i pCXND3-vektor. pCXND3 ble konstruert ved insersjon av den DHFR-gen uttrykkende region av pCHOI i HindIII-setet av pCXN2. Konstruert ekspresjonsplasmid DNA ble innført i DXB11 cellelinje og en CHO-cellelinje som sterkt uttrykker en oppløselig form av GPC3 kjerneprotein ble oppnådd ved seleksjon med 500 μg/ml Geneticin.

Storskala-dyrkning ble utført ved anvendelse av en 1700 cm<2>rulleflaske og kultursupernatant ble gjenvunnet for antistoff-rensning. Kultur-supernatanten ble påført på en Q sepharose Fast Flow kolonne (Amersham). Etter vasking ble antistoffet eluert med en fosfatbuffer inneholdende 500 mM NaCl og affinitetsrenset ved anvendelse av en Chelating sepharose Fast Flow kolonne (Amersham).

Antistoffet ble eluert med en gradient av 10 til 150 mM imidazol. Til slutt ble eluatet konsentrert ved anvendelse av en Q sepharose Fast Flow kolonne og eluert med en fosfatbuffer inneholdende 500 mM NaCl.

SDS polyakrylamid-gelelektroforese under reduserende betingelser viste tre bånd ved 70 kDa, 40 kDa og 30 kDa. Resultatet av aminosyre- sekvensering ved anvendelse av en ABI492 proteinsekvenserer (Applied Biosystems) viste at 30 kDa båndet svarte til aminosyresekvensen av 359. og nedstrøms eller 375. og nedstrøms for GPC3, hvilket indikerer at GPC3 ble spaltet mellom Arg358 og Ser359 eller mellom Lys374 og Val375, således ble den separert i 40 kDa av det N-terminale fragment og 30 kDa av det C-terminale fragment.

Eksempel 4

Fremstilling av CHO-cellelinje som uttrykker full-lengde human GPC3

For å oppnå en cellelinje for evaluering av en bindingsaktivitet ved anvendelse av strømningscytometri, ble en CHO-cellelinje som uttrykker full-lengde GPC3 etablert.

Ti mikrogram av en full-lengde human GPC3 gen ekspresjonsvektor og 60 μL av SuperFect (QIAGEN) ble blandet. Etter at et kompleks var dannet, ble geninnføring utført ved tilsetning av det til en CHO-cellelinje, DXB11. Etter 24 timers dyrkning i en CO2-inkubator ble seleksjon startet ved anvendelse av αMEM (GIBCO BRL) inneholdende Geneticin i en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/ml og 10% FBS. De resulterende Geneticin-resistente kolonier ble oppsamlet og cellekloning ble utført ved den begrensende fortynningsmetode. Hver celleklon ble solubilisert og ekspresjon av full-lengde human GPC3 ble bekreftet ved Western blotting ved anvendelse av et anti-GPC3 antistoff. På denne måten ble en stabilt uttrykkende cellelinje oppnådd.

Eksempel 5

Evaluering av bindingsaktivitet ved ELISA

Den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein ble fortynnet til 1 μg/ml med en belegningsbuffer (0,1 mol/L NaHCO3 (pH 9,6), 0,02% (vekt/volum) NaN3) og satt til en immunoplate og fikk stå ved 4 ºC natten over for å belegge platen. Etter at platen var blokkert med en fortynningsbuffer (50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,1), 1 mmol/L MgCl2, 150 mmol/L NaCl, 0,05% (volum/volum) Tween 20, 0,02% (vekt/volum) NaN3, 1% (vekt/volum) BSA), ble et anti-GPC3 antistoff tilsatt og fikk stå ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking med en vaskebuffer (0,05% (volum/volum) Tween 20, PBS) ble et anti-mus IgG antistoff (ZYMED) merket med alkalisk fosfatase tilsatt og fikk stå ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking med vaskebuffer ble SIGMA 104 (SIGMA) fortynnet til 1 mg/ml med en substratbuffer (50 mmol/L NaHCO3 (pH 9,8), 10 mmol/L MgCl2) tilsatt og fikk stå ved romtemperatur i 1 time for fargeutvikling. Deretter ble absorbansen (ved 405 nm, referansebølgelengde 655 nm) målt ved anvendelse av en Benchmark Plus (BIO-RAD).

Eksempel 6

Immunisering med oppløselig form av GPC3 og seleksjon av hybridom

Siden human GPC3 og mus GPC3 viser høy homologi på 94% på aminosyrenivået, ble det betraktet vanskelig å oppnå et anti-GPC3 antistoff hvis en normal mus ble immunisert. Derfor ble en mus med autoimmun sykdom, MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr mus, (nedenfor referert til som MRL/lpr mus, anskaffet fra Charles River Japan, Inc.) anvendt som et immunisert dyr. Immunisering ble startet ved en alder på 7 uker eller 8 uker. For den første immunisering ble en oppløselig form av GPC3 fremstilt med 100 μg/individ og emulgert ved anvendelse av Freund’s complete adjuvant (FCA, Becton Dickinson) og subkutant administrert. To uker senere ble en oppløselig form av GPC3 fremstilt med 50 μg/individ og emulgert ved anvendelse av Freund’s incomplete adjuvant (FIA, Becton Dickinson) og subkutant administrert. Deretter ble en ytterligere immunisering utført hver andre uke 5 ganger totalt. Til to av de immuniserte mus ble en oppløselig form av GPC3 fortynnet med PBS til 50 μg/individ og deretter administrert intravenøst via halen som den endelige immunisering. På den fjerde dag etter den endelige immunisering ble milten tatt ut for å oppnå en miltcelle, som ble blandet med en mus myelomcelle, P3-X63Ag8U1 (P3U1, anskaffet fra ATCC), i et forhold på 2:1. Cellefusjon ble utført ved gradvis tilsetning av PEG 1500 (Roche Diagnostic). RPMI 1640 medium (GIBCO BRL) ble forsiktig tilsatt for å fortynne PEG 1500 og etter at PEG 1500 var fjernet ved sentrifugering ble cellene suspendert i RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS og inokulert i en 96-brønn kulturplate med 100 μL/brønn. Neste dag ble RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS, 1x HAT media supplement (SIGMA) og 0,5x BM-Condimed H1 Hybridom kloningssupplement (Roche Diagnostic) (nedenfor referert til som HAT-medium) tilsatt med 100 μL/brønn. Etter 2, 3 og 5 dager ble halvparten av kulturløsningen erstattet med HAT-medium. Etter 7 dager ble screening utført ved anvendelse av kultursupernatanten. Screeningen ble utført ved ELISA ved anvendelse av en immunoplate belagt med den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein. En positiv klon ble monoklonet ved den begrensende fortynningsmetode. Som et resultat ble 11 kloner av antistoffer (M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, L9G11, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9 og M10D2) som har en sterk bindingsaktivitet mot GPC3 oppnådd.

Eksempel 7

Isotype-bestemmelse og rensning av anti-GPC3 antistoff

Isotype ble bestemt med antigen-avhengig ELISA ved anvendelse av et Immunopure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I (PIERCE). Rensingen av antistoffer ble utført som følger. Kultursupernatant av hybridom dyrket med HAT-medium supplert med FBS (Ultralav IgG) (GIBCO BRL) ble adsorbert til Hi Trap ProteinG HP (Amersham) og vasket med en bindingsbuffer (20 mM natriumfosfat (pH 7,0)).

Antistoffet ble eluert med en elueringsbuffer (0,1 M glycin-HCl (pH 2,7)). Eluatet ble umiddelbart nøytralisert med en nøytraliseringsbuffer (1 M Tris-HCl (pH 9,0)) og dialysert mot PBS dag og natt for buffer-utveksling.

Eksempel 8

Evaluering av bindingsaktivitet ved ELISA

For hensiktsmessig å evaluere bindingsaktiviteten av anti-GPC3 antistoffet således oppnådd, ble konsentrasjons-avhengig binding av antistoffet detektert mot en immunoplate inneholdende den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein immobilisert på den. En 3-ganger fortynningsserie (12 fortynninger totalt) av det rensede antistoff i en konsentrasjon på 10 μg/ml ble tilsatt og et anti-mus IgG antistoff ble tilsatt som det sekundære antistoff. Fargeutvikling ble utført ved anvendelse av SIGMA 104. Siden graden av fargeutvikling varierer avhengig av fargeutviklingstiden ble data målt nøyaktig etter 1 time analysert. Hvert antistoff viste en konsentrasjonsavhengig farge- utvikling. Korrelasjonen mellom konsentrasjonen av antistoff og graden av fargeutvikling ble plottet og en omtrentlig kurve ble oppnådd ved anvendelse av analyseringsprogramvare, GraphPad Purism. Dens EC50-verdi ble bestemt som indeks for bindingsaktiviteten. EC50-verdier for alle kloner er vist i Fig. 16.

Eksempel 9

Evaluering av bindingsaktivitet ved strømningscytometri

Celler ble dissosiert med 1 mM EDTA pH 8,0 (GIBCO)/PBS og suspendert i FACS buffer (1% FBS/PBS) med 1 x 10<6>celler/ml. Suspensjonen ble fordelt til en Multiscreen–HV Filterplate (Millopre) med 100 μL/brønn og supernatanten ble fjernet ved sentrifugering. Et anti-GPC3 antistoff fortynnet til en passende konsentrasjon ble tilsatt og reagert på is i 30 minutter. Cellene ble vasket én gang med FACS buffer og et FITC-merket anti-mus IgG antistoff ble tilsatt og reagert på is i 30 minutter. Etter reaksjonen ble cellene sentrifugert ved 500 rpm i 1 minutt og supernatanten ble fjernet. Cellene ble suspendert i 400 μL av FACS buffer og underkastet strømningscytometri. EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter) ble anvendt som et strømningscytometer. En ”gate” ble satt på den levende cellepopulasjon med histogram for forover spredning og sideveis spredning. Som vist i Fig.1 bandt et anti-GPC3 antistoff (M3C11, M11F1) sterkt til CHO-cellen som uttrykker GPC3 og bandt ikke til den parentale CHO-celle, hvilket indikerer at antistoffet spesifikt binder til GPC3 presentert på cellemembranen. I tillegg viste antistoffet bindingsaktiviteten til en hepatom-cellelinje, HepG2 (anskaffet fra ATCC) og HuH-7 (anskaffet fra Health Science Research Resources Bank), hvilket indikerer at antistoffet spesifikt kan gjenkjenne hepatom. Bindingsaktiviteten til klonene avledet fra mus immunisert med en oppløselig form av GPC3 målt ved strømningscytometri er vist i Fig.16, hvor X-modus verdier av histogrammet ved konsentrasjon av antistoff på 5 μg/ml er angitt.

Eksempel 10

Epitop-klassifisering ved kompetitiv ELISA

De oppnådde antistoffer ble klassifisert i henhold til epitopene ved kompetitiv ELISA. Antistoffene ble biotinylert ved anvendelse av et Biotin merkesett (Roche). Den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein ble fortynnet til 1 μg/ml med belegningsbuffer og satt til en plate med 100 μL/brønn og lagret ved 4 ºC natten over for å belegge platen. Neste dag ble 200 μL substrat- buffer tilsatt for blokkering. Platen fikk stå ved 4 ºC natten over eller lenger og et anti-GPC3 antistoff ble satt til platen med 100 μL/brønn og reagert ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble, uten vasking av platen, 10 μL av 10 μg/ml biotin-merket anti-GPC3 antistoff tilsatt og videre reagert i 1 time. Platen ble vasket med 300 μL/brønn av vaskebuffer 3 ganger. AP-streptavidin-konjugat (ZYMED) ble fortynnet til 1000 ganger med fortynnings-buffer og tilsatt med 100 μL/brønn og reagert ved romtemperatur i 1 time. Platen ble vasket med 300 μL/brønn av vaskebufferen 5 ganger. SIGMA 104 ble fortynnet til 1 mg/ml med substratbuffer og tilsatt med 100 μL/brønn. Etter inkubering i 1 time ved romtemperatur ble absorbansen (ved 405 nm, referanse-bølgelengde 655 nm) målt.

Resultatene av kompetitiv ELISA er vist i Fig.2. For antistoffet som kompetitivt hemmet bindingen av biotinylert antistoff med 50% eller mer, ble det antatt at dets epitoper er lokalisert nær sammen i tre-dimensjonal konformasjon. Som et resultat av klassifisering i henhold til det kompetitive hemningsmønster av fargeutvikling mot binding av de 8 typer av biotinylerte antistoffer, ble de 11 kloner avledet fra musen immunisert med en oppløselig form av GPC3 klassifisert i 5 grupper (a, b, c, d og e) (Fig.16).

Eksempel 11

Epitop-klassifisering ved Western blotting

Den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein ble påført på en 10% SDS-PAGE mini (TEFCO) og elektroporert under reduserende betingelser. Den ble overført til Immobilon-P (Millipore) ved anvendelse av Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD). Etter at membranen kort var vasket med TBS-T (0,05% Tween 20, TBS), ble den ristet i TBS-T inneholdende 5% skummet melk i 1 time. Membranen ble ristet i TBS-T i ca.10 minutter, deretter ble hvert anti-GPC3 antistoff fortynnet med TBS-T inneholdende 1% skummet melk tilsatt og membranen ble ristet i 1 time. Membranen ble vasket med TBS-T og ristet i en løsning av HRP-anti-mus IgG antistoff (Amersham) fortynnet med TBS-T inneholdende 1% skummet melk i 1 time og deretter vasket med TBS-T. Fargeutvikling ble utført ved anvendelse av ECL-Plus (Amersham) og detektert ved anvendelse av Hyperfilm ECL (Amersham).

Som vist i Fig.3 ble L9G11 funnet å være et antistoff som binder til den N-terminale side fordi det bandt til båndet på ca.40 kDa. M3C11 ble funnet å være et antistoff som binder til den C-terminale side fordi det bandt til båndet på ca.30 kDa. Alle antistoffene som tilhører c-, d- eller e-gruppen basert på kompetitiv ELISA bandt til den N-terminale side og alle de som tilhører a- eller b- grupper bandt til den C-terminale side (Fig.16). L9G11 hadde høyere deteksjons-sensitivitet ved Western blotting enn de andre antistoffer som binder til den N-terminale side, hvilket indikerer at dette antistoff er anvendelig for detektering av det N-terminale fragment ved Western blotting.

Eksempel 12

Deteksjon av utskilt form av GPC3

Siden det ble funnet at GPC3 blir spaltet ved den 358. aminosyrerest eller den 374. aminosyrerest, antok oppfinnerene at en utskilt form av GPC3 blir utskilt i blodet til en pasient med leverkreft. Derfor ble et GPC3 sandwich ELISA-system konstruert for å detektere en sekretorisk form av GPC3.

En immunoplate ble belagt med et anti-GPC3 antistoff med 10 μg/ml og blokkert med substratbuffer. Etter at immunoplaten var lagret i flere timer ved romtemperatur eller natten over ved 4 ºC, ble kultursupernatant av HepG2 tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Immunoplaten ble vasket med 300 μL/brønn av vaskebuffer 3 ganger og et biotin-merket anti-GPC3 antistoff fortynnet til 10 μg/ml ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Immunoplaten ble vasket med 300 μL/brønn av vaskebuffer 3 ganger og AP-streptavidin ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Immunoplaten ble vasket med 300 μL/brønn av vaskebuffer 5 ganger. Fargeutvikling ble utført ved anvendelse av AMPAK (DAKO) i henhold til den tilknyttede protokoll og absorbansen ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser. Antistoffene som bandt til den N-terminale side (M6B1, M19B11 og M18D4) og de som bandt til den C-terminale side (M3C11, M13B3 og M3B8) ble samlet for å konstruere fem sandwich ELISA-systemer. Hver av disse kombinasjoner viste en ekvivalent sensitivitet ved standard kurven ved anvendelse av den utskilte form av GPC3. Disse systemer ble evaluert ved anvendelse av kultursupernatant av HepG2. Den utskilte form av GPC3 ble detektert ved en høy konsentrasjon på ca.1 μg/ml med en kombinasjon av antistoffene som bandt til den N-terminale side (Fig.4). Konsentrasjonen detektert med en kombinasjon av antistoffene som bandt til den C-terminale side var lav, hvilket indikerer at det N-terminale fragment var dominant til stede i den utskilte form av GPC3.

Deretter ble kultursupernatant av HepG2 immunopresipitert ved anvendelse av et anti-GPC3 antistoff for å detektere den utskilte form av GPC3. I tilfellet hvor M10D2 som binder til det N-terminale fragment ble anvendt, ble den utskilte form av GPC3 på 40 kDa detektert (Fig.5). På den annen side, i tilfellet hvor M1E7 som binder til det C-terminale fragment ble anvendt, ble den utskilte form av GPC3 ikke detektert. Immunopresipiteringstest ble utført for alle de oppnådde GPC3-antistoffer. Hvert antistoff som binder til det N-terminale fragment detekterte sterkt den utskilte form av GPC3, mens den utskilte form av GPC3 ikke ble detektert eller ble svakt detektert ved anvendelse av antistoffene som binder til det C-terminale fragment (Fig. 16). Antistoffet som kan detektere den utskilte form av GPC3 ved immunopresipitering er forventet å være anvendelig som et antistoff for diagnostisering av hepatom. I tillegg er antistoffet som nesten ikke kan detektere den utskilte form av GPC3 forventet å være anvendelig for utvikling av et terapeutisk antistoff som har en ADCC-aktivitet og en CDC-aktivitet, fordi et slikt antistoff kan migrere til hepatom-lesjonen uten å bli fanget i den utskilte form av GPC3 til stede i blodet.

Eksempel 13

Kloning av variabel region av anti-GPC3 antistoff

En variabel region av anti-GPC3 antistoff ble amplifisert ved RT-PCR metoden ved anvendelse av det totale RNA ekstrahert fra et anti-GPC3 antistoff-produserende hybridom. Det totale RNA ble ekstrahert fra 1 x 10<7>celler av hybridomet ved anvendelse av RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Ved anvendelse av 1 μg av det totale RNA ble det 5’-terminale genfragment amplifisert ved anvendelse av et SMART RACE cDNA amplifiserings-sett (CLONTECH) og hvilke som helst av de følgende syntetiske oligonukleotider:

et syntetisk oligonukleotid MHC-IgG1 komplementært til sekvensen av en mus IgG1 konstant region:

GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG (SEKV ID NR: 7);

et syntetisk oligonukleotid MHC-IgG2a komplementært til sekvensen av mus IgG2a konstant region:

CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG (SEKV ID NR: 8);

et syntetisk oligonukleotid MHC-IgG2b komplementært til sekvensen av mus IgG2b konstant region:

CAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG (SEKV ID NR: 9); og

et syntetisk oligonukleotid kappa komplementært til sekvensen av mus kappa- kjede konstant region:

GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (SEKV ID NR: 10).

En revers transkripsjonsreaksjon ble utført ved 42 ºC i 1 time og 30 minutter. PCR-blanding (50 μL) inneholdt 5 μL av 10x Advantage 2 PCR-buffer, 5 μL av 10x Universal Primer A Mix, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP og dTTP), 1 μL av Advantage 2 Polymerase Mix (alle fra CLONTECH), 2,5 μL av revers transkripsjon reaksjonsprodukt og 10 pmol av det syntetiske oligonukleotid MHC-IgG1, MHC-IgG2a, MHC-IgG2b eller kappa. PCR ble utført med 5 cykler bestående av 94 ºC i 30 sekunder, 94 ºC i 5 sekunder og 72 ºC i 3 minutter, 5 cykler bestående av 94 ºC i 5 sekunder, 70 ºC i 10 sekunder og 72 ºC i 3 minutter og 25 cykler bestående av 94 ºC i 5 sekunder, 68 ºC i 10 sekunder og 72 ºC i 3 minutter. Til slutt ble reaksjonsproduktet oppvarmet ved 72 ºC i 7 minutter. Hvert PCR-produkt ble renset fra agarosegelen ved anvendelse av et QIAquick gelekstraksjons-sett (QIAGEN), klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega) og nukleotidsekvensen ble bestemt.

Nukleotidsekvensene av H-kjede variable regioner av M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2 og L9G11 er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 og 21, aminosyresekvensene derav er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 og 32. Nukleotidsekvensene av L-kjede variable regioner derav er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 og 43, og aminosyresekvensene derav er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 og 54.

Eksempel 14

Epitop-klassifisering ved anvendelse av GST-fusjonsprotein

For å utføre en detaljert analyse av epitopene for antistoffene som binder til det C-terminale fragment, ble fusjonsproteiner av suksessivt forkortede C-terminale peptider av GPC3 med GST, dvs. GC-1 (fra Ser495 til Lys563), GC-2 (fra Gly510 til Lys563), GC-3 (fra Ala524 til Lys563), GC-4 (fra Gly537 til Lys563) og GC-5 (fra Ser550 til Lys563) fremstilt. Den C-terminale region av GPC3 ble klonet inn i pGEX-4T-3 (Amersham) for å konstruere et plasmid DNA hvor den C-terminale region av GPC3 er ligert til den C-terminale side av GST. Plasmidet DNA ble innført i DH5 α, hvorved en transformant ble oppnådd. Deretter ble IPTG tilsatt med 1 mM til en kultur av transformanten i logaritmisk vekstfase for å fremkalle ekspresjon av et GST fusjonsprotein. De bakterielle celler ble oppsamlet etter 2 timers dyrkning. Cellene ble homogenisert ved ultralydbehandling og sentrifugert ved 35.000 rpm i 30 minutter med XL-80 ultrasentrifuge (Beckman, 70.1 Ti rotor). Deretter ble kultursupernatanten gjenvunnet og renset med GST Purification Modules (Amersham). De således rensede GST-fusjonsproteiner ble separert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser og Western blotting ble utført med anti-GPC3 antistoffer (Fig.6). M3C11 og M1E7 detekterte GC-1 og GC-2, mens de ikke detekterte GC-3, GC-4 og GC-5, hvilket indikerer at epitopene av disse antistoffer er inneholdt i regionen av GC-2 og at regionen av GC-3 ikke er tilstrekkelig. M3B8 og M11F1 detekterte GC-1 GC-2, GC-3 og GC-4, mens de ikke detekterte GC-5, hvilket indikerer at epitopene av disse antistoffer er inneholdt i regionen av GC-4 og at regionen av GC-5 ikke er tilstrekkelig. Minimum-regionen av GST-fusjonsprotein til hvilken hvert antistoff kan binde er listet opp i kolonnen med overskrift "Western blotting" i Fig.16.

Eksempel 15

Fremstilling av anti-GPC3 mus-humant kimært antistoff

Sekvensene av H-kjede og L-kjede variable regioner av anti-GPC3 antistoffer ble ligert til sekvensene av human IgG1 og kappa-kjede konstante regioner. PCR ble utført ved anvendelse av et syntetisk oligonukleotid, som er komplementært til den 5’-terminale nukleotidsekvens av H-kjede variabel- region av hvert antistoff og har en Kozak-sekvens og et syntetisk oligonukleotid, som er komplementært til den 3’-terminale nukleotidsekvens og har et NheI-sete. Det oppnådde PCR-produkt ble klonet inn i pB-CH vektor hvor en human IgG1 konstant region var innsatt i pBluescript KS(+) vektor (Toyobo). Mus H-kjede variabel region og den humane H-kjede ( λ1 kjede) konstante region blir ligert via NheI-setet. Det fremstilte H-kjede genfragment ble klonet inn i en ekspresjonsvektor, pCXND3. På den annen side ble PCR utført ved anvendelse av et syntetisk oligonukleotid, som er komplementært til den 5’-terminale nukleotidsekvens av L-kjede variabel region av hvert antistoff og har en Kozak-sekvens og et syntetisk oligonukleotid, som er komplementært til 3’-terminal nukleotidsekvens og har et BsiWI sete. Det oppnådde PCR-produkt ble klonet inn i pB-CL-vektor hvor den humane kappakjede konstante region var innsatt i pBluescript KS(+) vektor (Toyobo). Den humane L-kjede variable region og den konstante region blir ligert via BsiWI-setet. Det fremstilte L-kjede genfragment ble klonet inn i en ekspresjonsvektor, pUCAG. Denne pUCAG-vektor ble oppnådd ved kloning av et 2,6 kbp fragment oppnådd ved fordøyelse av pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) med et restriksjonsenzym BamHI i BamHi-setet av pUC19-vektor (Toyobo).

For å fremstille en ekspresjonsvektor for et anti-GPC3 mus-humant kimært antistoff, ble et genfragment oppnådd ved fordøyelse av pUCAG-vektor inneholdende L-kjede genfragment med et restriksjonsenzym HindIII (Takara Shuzo) og klonet inn i HindIII-setet av pCXND3 inneholdende H-kjede gen. Dette plasmid vil uttrykke et neomycin-resistens gen, DHFR gen og et anti-GPC3 mus-humant kimært antistoff i en dyrecelle.

En CHO-cellelinje (DG44 cellelinje) som stabilt uttrykker antistoffet ble fremstilt som følger. Genet ble innført i cellene ved elektroporeringsmetoden ved anvendelse av Gene Pulser II (Bio-Rad). En blanding oppnådd ved blanding av 25 μg av ekspresjonsvektoren for hvert anti-GPC3 mus-humant kimært antistoff og 0,75 ml av en løsning av CHO-celler suspendert i PBS (1 x 10<7>celle/ml) ble avkjølt på is i 10 minutter og overført til en kyvette. Deretter ble en puls påført med 1,5 kV og en kapasitans på 25 μFD. Etter en 10 minutters gjenvinningsperiode ved romtemperatur ble de elektroporerte celler suspendert i 40 ml CHO-S-SFM II medium (Invitrogen) inneholdende 1x HT supplement (Invitrogen). Suspensjonen ble fortynnet til 50 ganger med samme medium og fordelt til en 96-brønn kulturplate med 100 μL/brønn. Etter 24 timers kultur i en CO2-inkubator (5% CO2), ble Geneticin (Invitrogen) tilsatt med 0,5 mg/ml og cellene ble dyrket i 2 uker. Kultur-supernatant ble tatt fra brønnen som har en Geneticin-resistent transformert cellekoloni og mengden av IgG ble målt ved konsentrasjonsbestemmelse-metoden beskrevet nedenfor. En høyproduserende cellelinje ble suksessivt utvidet for å oppnå en cellelinje som stabilt uttrykker et anti-GPC3 mus-humant kimært antistoff. Cellelinjen ble dyrket i stor skala og kultursupernatanten ble oppsamlet. Rensingen av hvert anti-GPC3 mushumant kimært antistoff ble utført ved anvendelse av Hi Trap ProteinG HP (Amersham).

Eksempel 16

Måling av komplement-avhengig cytotoksisitet-aktivitet (CDC-aktivitet)

16.1 Fremstilling av human albumin veronal buffer (HAVB)

I milli-Q vann ble 12,75 g NaCl (høyeste kvalitet, Wako Pure Chemicals), 0,5625 g Na-Barbital (høyeste kvalitet, Wako Pure Chemicals) og 0,8625 g Barbital (høyeste kvalitet, Wako Pure Chemicals) oppløst til et endelig volum på 200 ml og autoklavert ved 121 ºC i 20 minutter. Deretter ble 100 ml autoklavert varmt milli-Q vann tilsatt. pH var 7,43 (anbefalt pH: 7,5). Løsningen ble anvendt som en 5x veronal buffer. I 50 ml milli-Q vann ble 0,2205 g CaCl2 ·2H2O (høyeste kvalitet, Junsei Chemical) oppløst til en endelig konsentrasjon på 0,03 mol/L, som ble anvendt som en CaCl2-løsning. I 50 ml milli-Q vann ble 1,0165 g MgCl2 ·6H2O (høyeste kvalitet, Junsei Chemical) oppløst til en endelig konsentrasjon på 0,1 mol/L, som ble anvendt som en MgCl2 løsning. I milli-Q vann ble 100 ml av 5x veronal buffer, 4 ml humant serumalbumin (25% Buminat (registrert varemerke), konsentrasjon av humant serumalbumin: 250 mg/ml, Baxter Healthcare), 2,5 ml av CaCl2-løsning, 2,5 ml av MgCl2-løsning, 0,1 g KCl (høyeste kvalitet, Junsei Chemical) 0,5 g glukose (D(+)-glukose, vannfri glukose, høyeste kvalitet, Wako Pure Chemicals) oppløst til et endelig volum på 500 ml, som ble anvendt som HAVB. Etter filter- sterilisering ble HAVB lagret ved en forhåndssatt temperatur på 5 ºC.

16.2 Fremstilling av målcelle

CHO-celle som uttrykker full-lengde human GPC3 fremstilt i Eksempel 4 ble dyrket i�-MEM-medium inneholdende nukleinsyre (+) (GIBCO) supplert med 10% FBS og 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCO). Cellene ble dissosiert fra skålen ved anvendelse av en celle-dissosieringsbuffer (Invitrogen Corp), fordelt til hver brønn av en 96-brønn flatbunnet plate (Falcon) med 1 x 10<4>celler/brønn og dyrket i 3 dager. Etter dyrkningen ble 5,55 MBq av krom-51 tilsatt og cellene ble dyrket i en 5% karbondioksidgass inkubator ved 37 ºC i 1 time. Disse celler ble vasket med HAVB to ganger og 50 μL av HAVB ble tilsatt og anvendt som målcelle.

16.3 Krom-frigjøringstest (CDC-aktivitet)

Hvert kimære antistoff ble fortynnet med HAVB for å fremstille en 40 μg/ml antistoff-løsning. Til målcellen ble satt 50 μL av hver antistoff-løsning og de fikk stå på is i 15 minutter. Deretter ble til hver brønn satt 100 μL av humant serum fra perifert blod til en frisk frivillig, som var fortynnet med HAVB, til en endelig konsentrasjon på 25% (den endelige konsentrasjon av antistoff: 10 μg/ml) og fikk stå i en 5% karbondioksidgass inkubator ved 37 ºC i 90 minutter. Etter at platen var sentrifugert ble 100 μL av supernatanten oppsamlet fra hver brønn, og radioaktiviteten ble målt ved anvendelse av en gammateller. Den spesifikke kromfrigjøringsgrad ble oppnådd ved den følgende formel.

Spesifikk krom-frigjøringsgrad (%) = (A-C) x 100/(B-C)

"A" representerer radioaktiviteten (cpm) i hver brønn, "B" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitet (cpm) i brønnene hvor 100 μL av 2% NP-40 vandig løsning (Nonidet P-40, Code nr.252-23, Nacalai Tesque) og 50 μL av HAVB var satt til målcellen og "C" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitet (cpm) i brønnene hvor 150 μL av HAVB var satt til målcellen. Testen ble utført in triplo og den gjennomsnittlige verdien og standard avvik ble beregnet for CDC-aktivitet (%).

Resultatene er vist i Fig.7. Blant 9 typer av anti-GPC3 kimære antistoffer, viste M3B8 og M11F1, som er et antistoff som gjenkjenner den C-terminale side, sterk CDC-aktivitet mot CHO-celle som uttrykker GPC3, imidlertid ble CDC-aktivitet ikke observert for de andre antistoffer. M3B8 og M11F1 tilhører gruppen betegnet "b" basert på kompetitiv ELISA og er en viktig epitop for å vise at sterk CDC-aktivitet kunne finnes.

Eksempel 17

Måling av ADCC-aktivitet ved anvendelse av PBMC avledet fra humant perifert blod 17.1 Fremstilling av human PBMC-løsning

Heparinisert perifert blod oppnådd fra en frisk frivillig ble fortynnet til 2 ganger med PBS(-) og overlagt på Ficoll-Paque TM PLUS (Amersham). Etter sentrifugering ved 500 x g i 30 minutter ved 20 ºC, ble det midtre lag, som er den mononukleære leukocytt-fraksjon, oppsamlet. Cellene ble vasket 3 ganger, suspendert i 10% FBS/RPMI og anvendt som human PBMC-løsning.

17.2 Fremstilling av målcelle

HepG2-celler dyrket i 10% FBS/RPMI 1640 medium ble dissosiert fra skålen ved anvendelse av Trypsin-EDTA (Invitrogen), fordelt til hver brønn av en 96-brønn U-bunn plate (Falcon) med 1 x 10<4>celler/brønn og dyrket i 2 dager. CHO-celle som uttrykker full-lengde human GPC3 fremstilt i Eksempel 4 ble dyrket i α-MEM nukleinsyre ( ) medium (GIBCO) supplert med 10% FBS og 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCO). Cellene ble dissosiert fra skålen ved anvendelse av en celledissosieringsbuffer (Invitrogen Corp), fordelt til hver brønn av en 96-brønn flatbunnet plate (Falcon) med 1 x 10<4>celler/brønn og dyrket i 3 dager. Krom-51 (5,55 MBq) ble satt til hver celle og cellene ble dyrket i en 5% karbondioksidgass inkubator ved 37 ºC i 1 time. Disse celler ble vasket med mediet én gang og 50 μL av 10% FBS/RPMI 1640 medium ble tilsatt og anvendt som en målcelle.

17.3 Krom-frigjøringstest (ADCC-aktivitet)

Til målcellen ble satt 50 μL av en antistoff-løsning fremstilt i forskjellige konsentrasjoner og reagert på is i 15 minutter. Deretter ble 100 μL av den humane PBMC-løsning tilsatt med 5 x 10<5>celler/brønn og cellene ble dyrket i en 5% karbondioksidgass inkubator ved 37 ºC i 4 timer. Etter dyrkningen ble platen sentrifugert og radioaktiviteten i 100 μL av kultur-supernatanten ble målt ved anvendelse av en gammateller. Den spesifikke krom-frigjøringsgrad ble oppnådd ved den følgende formel.

spesifikk krom-frigjøringsgrad (%) = (A-C) x 100/(B-C)

"A" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitet (cpm) i hver brønn, "B" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitet (cpm) i brønnene hvor 100 μL av 2% NP-40 vandig løsning (Nonidet P-40, Code nr.252-23, Nacalai Tesque) og 50 μL av 10% FBS/RPMI medium var satt til målcellen og "C" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitet (cpm) i brønnene hvor 150 μL av 10% FBS/RPMI-medium var satt til målcellen. Testen ble utført in triplo og den gjennomsnittlige verdien og standard avvik ble beregnet for ADCC-aktivitet (%). Resultatene er vist i Fig.8. Blant 9 typer av anti-GPC3 kimære antistoffer, hadde antistoffene som gjenkjenner den C-terminale side tendens til å vise sterk ADCC-aktivitet.

Eksempel 18

Immunisering med GC-3 og seleksjon av hybridom

Blant de oppnådde anti-GPC3 antistoffer viste bare M11F1 og M3B8 sterk CDC-aktivitet, hvilket indikerer at CDC-aktivitet er epitop-avhengig. For å oppnå et antistoff som har både ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet, ble et GST-fusjonsprotein inneholdende epitopen for M11F1 og M3B8, referert til som GC-3, anvendt for immunisering. En stor mengde av GC-3 ble renset ved ovennevnte metode.

Bufferen ble endret til PBS ved gelfiltrering ved anvendelse av Superdex 75 (Amersham). Det oppnådde produkt ble anvendt som immunoprotein ved anvendelse av tre Balb/c mus (anskaffet fra Charles River Japan, Inc.) og tre MRL/lpr mus immunisert med GC-3 i henhold til ovennevnte metode. For den første immunisering ble GC-3 fremstilt med 100 μg/individ og emulgert ved anvendelse av FCA, som ble subkutant administrert. To uker senere ble GC-3 fremstilt med 50 μg/individ og emulgert ved anvendelse av FIA, som ble subkutant administrert. Etter den femte immunisering ble den endelige immunisering (50 μg/individ) utført for alle mus ved intravenøs administrering av immunoproteinet via halen. Etter cellefusjon ble hybridom screenet ved ELISA ved anvendelse av en immunoplate belagt med den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein. En positiv klon ble monoklonet ved den begrensende fortynningsmetode. Som et resultat ble 5 kloner av antistoffer (GC199, GC202, GC33, GC179 og GC194) som har en sterk bindingsaktivitet mot GPC3 oppnådd.

Antistoffet ble renset fra kultursupernatanten av hybridomet ved anvendelse av Hi Trap proteinG HP og analysert i henhold til ovennevnte metode. EC50-verdien ble beregnet ved ELISA ved anvendelse av en immunoplate belagt med den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein og X-modus verdi av histogram ved 5 μg/ml ble målt ved strømningscytometri (Fig.17). I henhold til epitopklassifisering ved kompetitiv ELISA ble antistoffene klassifisert i gruppen b (GC199, GC202 og GC33) og en ny epitop-gruppe f (GC179 og GC194). Epitopklassifisering ved anvendelse av GST-fusjonsproteiner viste at GC199, GC202 og GC33 detekterte GC-1, GC-2, GC-3 og GC-4, men detekterte ikke GC-5, hvilket indikerer at epitopene for disse antistoffer er inneholdt i regionen av GC-4 på samme måte som epitopene for M11F1 og M3B8 og at regionen av GC-5 ikke er tilstrekkelig. På den annen side detekterte GC179 og GC194 GC-1, GC-2 og GC-3, men detekterte ikke GC-4 og GC-5, hvilket indikerer at epitopene for disse antistoffer er inneholdt i regionen av GC-3 og at regionen av GC-4 ikke er tilstrekkelig. Minimum region av GST-fusjonsprotein til hvilken hvert antistoff kan binde er listet opp i kolonnen med overskriften "Western blotting" i Fig.17.

H-kjede og L-kjede variable regioner av GC199, GC202, GC33, GC179 og GC194 ble klonet i henhold til ovennevnte metode og deres sekvenser ble bestemt. For L-kjeden av GC194, ble 2 typer av sekvenser klonet. Nukleotidsekvensene av Hkjede variable regioner av GC199, GC202, GC33, GC179 og GC194 er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 55, 56, 57, 58 og 59 og aminosyresekvensene derav er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 60, 61, 62, 63 og 64. Nukleotidsekvensene av L-kjede variable regioner av GC199, GC202, GC33, GC179, GC194(1) og GC194(2) er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 65, 66, 67, 68, 69 og 70 og aminosyresekvensene derav er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 71, 72, 73, 74, 75 og 76.

Videre ble disse aminosyresekvenser undersøkt for homologi ved å sammenligne med databasen av aminosyresekvensene av kjente antistoffer, hvorved deres CDR-regioner ble bestemt som følger.

Eksempel 19

Måling av ADCC-aktivitet ved anvendelse av musebenmarg-avledet effektorcelle 19.1 Fremstilling av musebenmarg-avledet effektorcelle-løsning

Benmargceller ble oppsamlet fra lårbenet til en SCID-mus (CLEA Japan, Inc., hann, 10 uker gammel) og suspendert i 10% FBS/RPMI 1640 medium med 5 x 10<5>celler/ml. Mus GM-CSF (PeproTech) og human IL-2 (PeproTech) ble tilsatt med henholdsvis 10 ng/ml og 50 ng/ml, og cellene ble dyrket i en 5% karbondioksidgass inkubator ved 37 ºC i 5 dager. Etter dyrkningen ble cellene skrapet av med en skrape og vasket med mediet én gang. Deretter ble cellene suspendert i 10% FBS/RPMI 1640 medium med 5 x 10<6>celler/ml og anvendt som en musebenmarg-avledet effektorcelle løsning.

19.2 Fremstilling av målcelle

En human hepatom-cellelinje, HuH-7, ble holdt og subdyrket med DMEM-medium (SIGMA) inneholdende 10% FBS (ThermoTrace). Cellene ble dissosiert fra skålen ved anvendelse av celle-dissosieringsbuffer (Invitrogen), fordelt til hver brønn av en 96-brønn U-bunn plate (Falcon) med 1 x 10<4>celler/brønn og dyrket i 1 dag. Etter dyrkningen ble 5,55 MBq av krom-51 tilsatt og cellene ble dyrket i en 5% karbondioksidgass inkubator ved 37 ºC i 1 time. Disse celler ble vasket med mediet én gang og 50 μL av 10% FBS/RPMI 1640 medium ble tilsatt og anvendt som en målcelle.

19.3 Krom-frigjøringstest (ADCC-aktivitet)

Til målcellen ble satt 50 μL av en antistoff-løsning fremstilt i forskjellige konsentrasjoner og fikk reagere på is i 15 minutter. Deretter ble 100 μL av musebenmarg-avledet effektorcelle-løsning (5 x 10<5>celler/brønn) tilsatt og celler ble dyrket i en 5% karbondioksidgass inkubator ved 37 ºC i 4 timer. Etter dyrkningen ble platen sentrifugert og radioaktiviteten i 100 μL av kultur- supernatanten ble målt ved anvendelse av en gammateller. Den spesifikke krom-frigjøringsgrad ble oppnådd ved den følgende formel.

Spesifikk krom-frigjøringsgrad (%) = (A-C) x 100/(B-C)

"A" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitet (cpm) i hver brønn, "B" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitet (cpm) i brønnene hvor 100 μL av 2% NP-40 vandig løsning (Nonidet P-40, Code nr.252-23, Nacalai Tesque) og 50 μL av 10% FBS/RPMI medium var satt til målcellen og "C" representerer den gjennomsnittlige verdien av radioaktivitiet (cpm) i brønnene hvor 150 μL av 10% FBS/RPMI medium var satt til målcellen. Testen ble utført in triplo og den gjennomsnittlige verdien og standard avvik ble beregnet for ADCC-aktivitet (%).

Resultatene er vist i Fig.9. Det ble funnet at GC33 antistoff viser en ADCC-aktivitet når konsentrasjonen av antistoff er 0,1 μg/ml eller høyere og viser sterkere aktivitet enn GC199 antistoff.

Eksempel 20

Antitumor aktivitet til GC33 antistoff til musemodell transplantert med humant hepatom

20.1 Preparering av musemodell transplantert med humant hepatom

En human hepatom-cellelinje, HuH-7, ble fremstilt med 5 x 10<7>celler/ml i en løsning inneholdende DMEM-medium og MATRIGEL (BD Bioscience) i et forhold på 1:1. Dagen før var 100 μL av en anti-asialo GM1 antistoff-løsning (Wako Pure Chemmicals, ett glass ble oppløst med 1 ml destillert vann for injeksjon deretter tilsatt 4 ml fysiologisk saltløsning) intraperitonealt administrert til en SCID mus (hann, 5 uker gammel, CLEA Japan, Inc.). Musen var transplantert med 100 μL av ovennevnte cellesuspensjon (5 x 10<6>celler/mus) subkutant i bukområdet.

20.2 Fremstilling og administrering av antistoff

Ved å starte fra dag 20 etter celletransplantasjonen ble en antistoff- løsning fremstilt på dagen for administrering med 0,5 mg/ml (gruppe av administrering av 5 mg/kg) og med 0,1 mg/ml (gruppe av administrering av 1 mg/kg) med PBS(-) administrert til musemodell transplantert med humane hepatomceller med 10 ml/kg via halevenen én gang pr. uke i 3 uker. Som en negativ kontroll ble PBS(-) (konstituent) administrert med 10 ml/kg via halevenen én gang pr. uke i 3 uker på lignende måte. Begge grupper besto av 6 mus hver.

20.3 Evaluering av antitumor-effekt

Antitumoreffekten av GC33 antistoff på musemodellen transplantert med humane hepatom-celler ble evaluert ved forandringen i tumorvolum med tid og tumorvekt 1 uke etter den endelige administrering. Tumorvolumet ble beregnet med den følgende formel.

Tumorvolum = (største akse) x (mindre akse) x (mindre akse)/2

Som vist i Fig.10 ble en betydelig hemning av tumorvekst observert i GC33 antistoff-gruppen sammenlignet med konstituent-gruppen.

Følgelig ble GC33 vist å ha en antitumor-effekt på musemodellen transplantert med humane hepatomceller.

Eksempel 21

Fremstilling av GC33 mus-humant kimært antistoff

H-kjede og L-kjede av GC33 ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av syntetisk oligonukleotid, som er komplementært til 5’-terminale nukleotidsekvenser og har en Kozak-sekvens og et HindIII-sete og et syntetisk oligonukleotid, som er komplementært til 3’-terminale nukleotidsekvenser og har et BamHI-sete. Etter fordøyelse med HindIII og BamHI ble det oppnådde PCR-produkt klonet inn i en ekspresjonsvektor, HEFg λ1, hvor en human IgG1 konstant region var innsatt og en ekspresjonsvektor, HEFg κ, hvor en human kappa-kjede konstant region var innsatt (Sato et al., Mol Immunol.1994; 371-381). Vektorene ble innført i en CHO-celle (DG44 cellelinje) i henhold til ovennevnte metode og en stabilt uttrykkende cellelinje ble etablert. Antistoffet ble renset fra kultursupernatanten ved anvendelse av Hi Trap ProteinG HP (Amersham). Konsentrasjonen av IgG i kultursupernatanten ble målt ved human IgG sandwich ELISA ved anvendelse av geit anti-human IgG (BIOSOURCE) og geit anti-human IgG alkalisk fosfatase-konjugat (BIOSOURCE) og konsentrasjonen ble bestemt ved sammenligning med kommersielt tilgjengelig human IgG (Cappel).

Eksempel 22

Måling av CDC-aktivitet og ADCC-aktivitet ved anvendelse av GC33 mus-humant kimært antistoff

I henhold til metodene beskrevet i Eksempler 16 og 17, ble CDC- aktiviteter og ADCC-aktiviteter av GC33, M3C11 og M1E7 mus-humane kimære antistoffer målt. Som for målcellen ble CHO-celle som uttrykker full-lengde GPC3 anvendt for å måle CDC-aktivitet og HepG2 ble anvendt for å måle ADCC-aktivitet. Resultatene er vist i henholdsvis Fig.11 og Fig.12. Det ble vist at i hvert testsystem viser GC33 en sterk CDC-aktivitet og ADCC-aktivitet sammenlignet med de andre to antistoffer.

Eksempel 23

Epitop-analyse for GC33

For å bestemme epitopen for GC33 i detalj, ble fusjonsproteiner av et ytterligere kortere C-terminalt peptid av GPC3 og GST fremstilt og analysert ved Western blotting. De fremstilte GPC3-avledede peptidsekvenser inneholdt i GST-fusjonsproteinet er vist i Fig.13. Siden GC33 kan binde til GC-4 (aa 537-563), men ikke kan binde til GC-5 (aa 550-563), ble det antatt at epitopen er lokalisert i en region inneholdende minst en del av aa 537-550 regionen. Først ble peptidene GC-6 (G N S Q Q A T P K D N E I S (SEKV ID NR: 93)), GC-7 (G N S Q Q A T P (SEKV ID NR: 94)), GC-8 (Q Q A T P K D N (SEKV ID NR: 95)) og GC-9 (T P K D N E I S (SEKV ID NR: 96)) fremstilt. Forover oligo DNA og revers oligo DNA ble fremstilt som ble utformet på en slik måte at spaltningssetet av EcoRI gjenkjennelse-sekvens er bundet til 5’-enden og spaltningssetet av SalI gjenkjennelse-sekvens er bundet til 3’-enden. Syntesen av oligo DNA ble utført av Espec Oligo Service. DNA’et ble renset med C-18 patron, fosforylert ved 5’-enden og anvendt for analysen. 25 µL av forover oligo DNA (10 μM) og 25 μL av revers oligo DNA (10 μM) ble blandet og omsatt ved 94 ºC i 5 minutter, ved 37 ºC i 10 minutter og ved romtemperatur i 15 minutter, og fikk deretter stå ved 4 ºC i 10 minutter for å hybridisere forover oligo DNA og revers oligo DNA. Konsentrasjonen av oligoene ble bestemt ved absorbansmåling ved molforholdet av insersjonen til vektoren på 3:1. Oligoene ble klonet inn i EcoRI- og SalI-fordøyet pGEX4T-3 og nukleotidsekvensen ble bekreftet. Et GST-fusjonsprotein ble fremstilt i henhold til ovennevnte metode og renset ved anvendelse av Gluthation Sepharose 4B. De rensede proteinene ble separert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser og analysert ved Western blotting ved anvendelse av GC33. Som et resultat kunne antistoffet GC33 ikke detektere hvilket som helst GST-fusjonsprotein sterkt, hvilket indikerer at en lenger sekvens ved den C-terminale side er nødvendig for bindingen av GC33 (Fig.14). Basert på antagelsen ovenfor ble GC-11 (A T P K D N E I S T (SEKV ID NR: 97)), GC-12 (P K D N E I S T F H (SEKV ID NR: 98)), GC-13 (D N E I S T F H N L (SEKV ID NR: 99)) og GC-14 (E I S T F H N L G N (SEKV ID NR: 100)) fremstilt og evaluert på samme måte. Som et resultat bandt GC-11, GC-12 og GC-13 til GC33 sterkere, hvilket indikerer at epitopen for GC33 er lokalisert i sekvensen fra 544. til 553. (P K D N E I S T F H) ved C-terminus av GPC3.

Eksempel 24

Humanisering av GC33

Antistoff-sekvensdata ble oppnådd fra offentliggjorte Kabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) og fra ImMunoGeneTics Database (IMGT). H-kjede variabel region og L-kjede variabel region ble separat underkastet homologisøk. Som et resultat ble H-kjede variabel region funnet å ha høy homologi med DN13 (Smithson et al., Mol Immunol.1999; 36: 113-124) og L-kjede variabel region ble funnet å ha høy homologi med homo sapiens IGK mRNA for immunoglobulin kappa lettkjede VLJ region, partiell cds, klon: K64 av aksesjonsnummer AB064105. Signalsekvensen av aksesjonsnummer S40357 som har høy homologi med AB064105 ble anvendt som signalsekvens av L-kjeden. Den komplementaritetsbestemmende region (nedenfor referert til som CDR) av GC33 ble transplantert i rammeverk regioner (nedenfor referert til som FR) av disse humane antistoffer for å fremstille et humanisert antistoff.

Spesifikt ble syntetisk oligo DNA på omtrent 50 baser utformet på en slik måte at omtrent 20 baser av dem ble hybridisert og disse syntetiske oligo DNA ble sammensatt ved PCR-metoden for å fremstille gener som koder for hver av de variable regioner. De ble fordøyet ved HindIII setet innsatt i slutten av 5’-terminal syntetisk oligo DNA og BamHi-setet innsatt i slutten av 3’-terminal syntetisk oligo DNA. Fragmentene ble klonet inn i en ekspresjonsvektor, HEFg λ1, hvor en human IgG konstant region ble klonet eller en ekspresjonsvektor, HEFgκ1, hvor en human kappakjede konstant region ble klonet (Sato et. al., Mol Immunol.1994; 371-381). H-kjede og L-kjede av den humaniserte GC33 konstruert som ovenfor ble betegnet ver.a. Bindingsaktiviteten av den humaniserte GC33, hvis H-kjede og L-kjede begge var ver.a (ver.a/ver.a), var lavere enn den til et antistoff med mus GC33 variable regioner (mus/mus). Antistoffer ble konstruert hvor mus GC33 sekvens og ver.a sekvens ble kimært kombinert (mus/ver.a, ver.a/mus) med hensyn til H- kjede og L-kjede og deres bindingsaktiviteter ble evaluert. Som resultat ble en reduksjon i bindingsaktivitet observert i ver.a/mus, hvilket indikerer at reduksjon i bindingsaktivitet på grunn av aminosyre-erstatning kan tilskrives H-kjeden (Fig.15). Deretter ble modifiserte H-kjeder, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k fremstilt. Alle disse humaniserte GC33 viste en bindingsaktivitet ekvivalent med den til et kimært antistoff som har mus GC33 variabel region (Fig.15). Nukleotidsekvensene av de humaniserte GC33 H-kjede variable regioner, ver.a, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 77, 78, 79, 80, 81, 82 og 83 og aminosyresekvensene derav er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 84, 85, 86, 87, 88, 89 og 90. Nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen av en humanisert GC33 L-kjede variabel region, ver.a er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 91 og 92. I humaniserte GC33 H-kjede variable regioner ver.i, ver.j og ver.k, blir den 6. glutaminsyrerest erstattet med glutamin-rest. Varmestabiliteten av disse antistoffer ble betydelig øket.

Eksempel 25

Modifikasjon av humanisert GC33 L-kjede

Som for deamidering av protein er reaksjonshastighetskonstant av deamidering kjent å være avhengig av den primære sekvens. Det er også kjent at Asn-Gly er spesielt mottagelig for deamidering (Rocinson et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98; 944-949). Som for Asn33 i CDR1 av en humanisert GC33 L-kjede ver.a vist i SEKV ID NR: 91, er den primære sekvens Asn-Gly, som er antatt å være meget mottagelig for deamidering.

For å bedømme effekten av deamidering av Asn33 på bindingsaktiviteten, ble et modifisert antistoff fremstilt hvor Asn33 ble erstattet med Asp. En punktmutasjon ble innført ved anvendelse av et Quick Change setedirigert mutagenese-sett (Stratagene). Mer spesifikt ble 50 μL av en reaksjonsblanding inneholdende 125 ng av en sense primer (CTT GTA CAC AGT GAC GGA AAC ACC TAT: SEKV ID NR: 172), 125 ng av en antisense primer (ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: SEKV ID NR: 173), 5 μL av 10x reaksjonsbuffer, 1 μL av dNTP mix, 10 ng av HEFgκ i hvilken en humanisert GC33 L-kjede ver.a var klonet og 1 μL av Pfu Turbo DNA Polymerase, underkastet PCR med 12 cykler bestående av 95 ºC i 30 sekunder, 55 ºC i 1 minutt og 68 ºC i 9 minutter. Deretter ble et restriksjonsenzym, DpnI, tilsatt og fordøyelse ble utført ved 37 ºC i 2 timer og det fordøyede produkt ble innført i XL1-Blue kompetent celle bundet til settet, hvorved en transformant ble oppnådd.

Variabelregionen ble spaltet ut fra klonen hvor hver mutasjon ble riktig innført og klonet inn i HEFgκ igjen. Den ble innført i en COS7-celle ved anvendelse av Fugene 6 (Roche) sammen med HEFg λ1, hvor en humanisert GC33 H-kjede ver.k var klonet. Antistoffet transient uttrykt i cellen ble gjenvunnet fra kultursupernatanten.

Konsentrasjonen av antistoff ble bestemt ved sandwich ELISA ved anvendelse av anti-human IgG antistoff. Bindingsaktiviteten av det modifiserte antistoff ble evaluert ved ELISA ved anvendelse av en immunoplate belagt med den oppløselige form av GPC3 kjerneprotein. Som vist i Fig.18 ble bindingsaktiviteten tapt i det modifiserte antistoff (N33D) hvor Asn33 var erstattet med Asp, hvilket indikerer at effekten av deamidering av Asn33 på bindingsaktiviteten var betydelig.

Som en metode for å undertrykke deamidering av Asn33, er erstatning av Gly34 med en annen aminosyre rapportert (internasjonal patentsøknad WO 03057881A1). I henhold til ovennevnte metode ble G34 erstattet med hvilken som helst av 17 aminosyrer forskjellig fra Cys og Met ved anvendelse av et Quick Change setedirigert mutagenese-sett for å fremstille en serie av modifiserte antistoffer, dvs., G34A, G34D, G34E, G34F, G34H, G34N, G34P, G34Q, G34I, G34K, G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R, G34S og G34T. Disse antistoffer ble transient uttrykt i COS7-celler og bindingsaktiviteten ble evaluert ved anvendelse av kultursupernatant. Det ble funnet at bindingsaktiviteten blir holdt selv hvis G34 blir erstattet med en annen aminosyre, bortsett fra for Pro (G34P) og Val (G34V).

Aminosyresekvensene av lettkjede CDR1 av ovennevnte modifiserte antistoffer er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 174 (G34A), SEKV ID NR: 175 (G34D), SEKV ID NR: 176 (G34E), SEKV ID NR: 177 (G34F), SEKV ID NR: 178 (G34H), SEKV ID NR: 179 (G34N), SEKV ID NR: 180 (G34T), SEKV ID NR: 181 (G34Q), SEKV ID NR: 182 (G34I), SEKV ID NR: 183 (G34K), SEKV ID NR: 184 (G34L), SEKV ID NR: 185 (G34S), SEKV ID NR: 186 (G34W), SEKV ID NR: 187 (G34Y), SEKV ID NR: 188 (G34R), SEKV ID NR: 189 (G34V) og SEKV ID NR: 190 (G34P). Aminosyresekvensene av lettkjede variable regioner av ovennevnte modifiserte antistoffer er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 191 (G34A), SEKV ID NR: 192 (G34D), SEKV ID NR: 193 (G34E), SEKV ID NR: 194 (G34F), SEKV ID NR: 195 (G34H), SEKV ID NR: 196 (G34N), SEKV ID NR: 197 (G34T), SEKV ID NR: 198 (G34Q), SEKV ID NR: 199 (G34I), SEKV ID NR: 200 (G34K), SEKV ID NR: 201 (G34L), SEKV ID NR: 202 (G34S), SEKV ID NR: 203 (G34W), SEKV ID NR: 204 (G34Y), SEKV ID NR: 205 (G34R), SEKV ID NR: 206 (G34V) og SEKV ID NR: 207 (G34P).

Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som en cellevekstinhibitor, et anticancer-middel eller et middel for diagnose av kreft.

Eksempel 26

Fremstilling av human hepatom-cellelinje (SK-03) som uttrykker full-lengde human GPC3

For å oppnå en cellelinje for evaluering av biologisk aktivitet til anti-GPC3 antistoffer, ble en human hepatom-cellelinje som uttrykker full-lengde GPC3 etablert.

Ett mikrogram av full-lengde human GPC3 gen ekspresjonsvektor behandlet med Pvu I ble blandet med 2 μL av FuGENE (Roche) for å tillate kompleksdannelse. Komplekset ble satt til SK-HEP-1 celler (anskaffet fra ATCC) for gen-innføring. Etter inkubering i CO2 inkubator i 24 timer ble GPC3- uttrykkende celler selektert ved anvendelse av Dulbecco’s MEM (D-MEM, SIGMA) inneholdende Geneticin i en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml og 10% FBS. De resulterende Geneticinresistente kolonier ble oppsamlet og celle- kloning ble utført ved den begrensende fortynningsmetode. Ekspresjon av human GPC3 av hver celleklon ble undersøkt ved strømningscytometri ved anvendelse av det kimære antistoff GC33 og FITC-merket geit anti-human IgG antistoff (ICN). På denne måten ble en stabilt uttrykkende cellelinje SK-03 oppnådd.

Eksempel 27

Sammenligning av CDC-aktivitet og ADCC-aktivitet til mus-humane kimære antistoffer

For direkte å sammenligne CDC-aktivitet og ADCC-aktivitet til de mus-humane kimære antistoffer GC33, M3C11 og M1E7 beskrevet i Eksempel 22, ble CDC-aktivitet og ADCC-aktivitet til tre antistoffer målt i samme testsystem i henhold til metoden beskrevet i Eksempler 16 og 17. Når det gjelder målcellen, ble CHO-celle som uttrykker full-lengde GPC3 anvendt for å måle CDC-aktivitet og SK-03 ble anvendt for å måle ADCC-aktivitet. Resultatene er vist i henholdsvis Fig.19 og Fig. 20. Det ble vist at, i hvert testsystem, viser GC33 en sterkere CDC-aktivitet og ADCC-aktivitet sammenlignet med de andre to antistoffer.

Industriell anvendelighet

Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som en cellevekstinhibitor, et anticancer middel og et middel for diagnose av kreft.

Claims

PATENTKRAV

1. Antistoff som er i stand til å binde til glypican 3,

karakterisert ved at antistoffet er:

(a) et antistoff omfattende:

(i) en tungkjede variabel region som har CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 123, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 124 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 125; og

(ii) en lettkjede variabel region som har CDR1 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 143, CDR2 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 144 og CDR3 omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 158;

(b) et antistoff som omfatter (i) og som kompetitivt kan hemme bindingen av antistoffet ifølge (a) til glypican 3;

2. Antistoff ifølge krav 1, som er valgt fra:

3. Antistoff ifølge krav 1 (f), hvor antistoffet som binder til peptidet separert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser analyseres ved Western blotting.

4. Antistoff ifølge krav 1 valgt fra:

(2) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 175, 144 og 158;

(4) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 177, 144 og 158;

(6) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 179, 144 og 158;

(7) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 180, 144 og 158;

(9) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 182, 144 og 158;

(10) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 183, 144 og 158;

(11) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 184, 144 og 158;

(12) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 185, 144 og 158;

(13) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 186, 144 og 158;

(14) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 187, 144 og 158; og

(15) et antistoff omfattende en tungkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 123, 124 og 125 og en lettkjede variabel region som har CDR 1, 2 og 3 omfattende aminosyresekvensen angitt i henholdsvis SEKV ID NR: 188, 144 og 158.

5. Antistoff ifølge krav 1 som har en lettkjede variabel region valgt:

(1) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 191; (2) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 192; (3) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 193; (4) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 194; (5) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 195; (6) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 196; (7) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 197; (8) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 198; (9) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 199; (10) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 200; (11) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 201; (12) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 202; (13) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 203; (14) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 204; og (15) en lettkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 205; og en tungkjede variabel region valgt fra:

(1) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 84; (2) en tungkjede variabel region omfattende; aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 85; (3) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 86; (4) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 87; (5) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 88; (6) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 89; og (7) en tungkjede variabel region omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 90.

6. Antistoff ifølge krav 1 eller 4 som er et humanisert antistoff.

7. Polynukleotid, karakterisert ved at det koder for en tungkjede variabel region eller en lettkjede variabel region av antistoffet ifølge kravene 2, 5 eller 6.

8. Polynukleotid ifølge krav 7 som har hvilken som helst av sekvensene angitt i SEKV ID NR: 57, 67, 77-83 eller 91.

9. Vektor, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid ifølge krav 7 eller 8.

10. Vertcelle, karakterisert ved at den omfatter vektoren ifølge krav 9.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff, karakterisert ved at den omfatter:

(a) dyrking av vertcellen ifølge krav 10,

(b) isolering av et antistoff fra en kultur av (a), og

(c) rensing av antistoffet derav.

12. Cellevekstinhibitor, karakterisert ved at den omfatter antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6 som en aktiv bestanddel.

13. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6 for anvendelse i behandlingen av cancer.

14. Antistoff ifølge krav 13 for anvendelse i behandlingen av hepatom.

15. Peptid, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen av aminosyrerestene 546 -551 av glypican 3.