MX2010010136A - Metodo para detectar celulas de cancer de higado usando anticuerpo anti-glipicano 3. - Google Patents

Abstract

Se describe un método de inmunoensayo in vitro para detectar la ocurrencia de una célula de cáncer de hígado en un sujeto. En el método, para la detección de la expresión del antígeno glipicano-3 en un tejido de cáncer de hígado, se emplea una combinación de un tratamiento de activación de antígeno por un método de activación de antígeno térmicamente inducida y un tratamiento de activación de antígeno por un método de activación de antígeno de proteasa. Por lo tanto, en el método, es posible detectar la diferencia en el nivel o modo de la expresión de antígeno plipicano-3 por un método de tinción inmunohistoquímica. El método permite la clasificación diferencial de una muestra que se ha determinado como que expresa altamente glipicano-3 por un método HIER convencional de acuerdo con el nivel de expresión de glipicano-3.

Description

METODO PARA. DETECTAR CELULAS DE CANCER DE HIGAD ANTICUERPO ANTI -GLIPICANO 3 Campo de la Invención La presente invención se refiere a un m oensayo in-vitro para detectar la presencia de ncer de hígado en un sujeto.

Antecedentes de la Invención Puesto que el glipicano 3 se expresa altat r de hígado con frecuencia, el análisis del p sión de glipicano 3 en cáncer de hígado se piens blemente útil para la identificación funci cano 3 en el cáncer de hígado; el tratam osis de cáncer de hígado, y la predicción prono r de hígado. Para el análisis de expresión ge ínas, se usa ampliamente inmunohisto ida a la información morfológica; 3. el rciona información biológica y patológ tante; y 4. se debe tomar cuidado diferente os usuales debido a que el método usa r gicos. Además, la tinción inmunohistoquimica la ventaja que se puede usar en la diagnosis pa servación morfológica de interés usando una dad de muestras tal como secciones recién con ras citológicas, y secciones en parafina de os .

Entre los métodos inmunohistoquimic otinción basada en la técnica de anticuerpos enz utilizar tejidos incrustados en parafina, fij lina, usados en diagnosis patológica usual y se aplica a un intervalo muy amplio. Sin em que se tome cuidado suficiente, por ejemplo, La fijación en formalina usada en inves lógica es útil para mantener la morfología pe fijación ideal desde el punto de vista de man idad para los anticuerpos. De esta manera, tambié ol o similar en lugar de formalina como un fija go, aún no se ha establecido un método de fija excelente en mantener la morfología y pueda cons idad de cada antígeno para los anticuerp iguiente, la fijación con formalina es un método ij ación, ampliamente usado, aunque tiene el pro ner la afinidad para los anticuerpos.

De esta manera, se han propuesto algunos debilitar la influencia de la fijación en form antenimiento de la afinidad para los anticuer ra estrategia posible es seleccionar un anticu ozca un epítopo no susceptible a la fija planteamiento carece de diversidad de epíto ccionar un epitopo adecuado.

Un segundo método es mejorar la sensibilid otinción para detectar de este modo un antígen ede visualizar por un método usual. El método má n método que comprende adicionar metal pesado a DAB ( tetraclorhidrato de 3 , 3 ' -diaminobe ímente usado para el revelado de color otinción. Sin embargo, este método no se puede incremente significativamente la sensibilidad. Un como el método ABC (complejo de avidina-pe inilada) o el método LSAB (anticuerpo biotin ptavidina marcada) , se ha intentado el cual' c ar la sensibilidad al hacer reaccionar repetida uerpo secundario biotinilado y ABC o avidina mar a con secciones. Sin embargo, se ha confir o convencional tal como el método ABC per osis de tejidos tumorales como que son posi les o tejidos no tumorales como que son negat a lo cual se pueden diferenciar tejidos tumo os no tumorales, en tanto que el uso del ente sensible proporciona detección de aún una de antígenos en- te idos no tumorales y por fallar en hacer esta diferenciación dependi de antígenos. Además, el método altamente sensib ién tiene el problema de tinción incrementada, d o a que tiene alta sensibilidad.

Un tercer método es recuperar la reactivid eno cuya reactividad con los anticuerpos ído debido a la fijación en formalina. En u ducido en la década de 1970, que comprende iones con proteasa (método de recuperación de rido como "método HIER" o "método de recuper opo inducida por calor") en la década de ntamiento usando un microondas, ebullición, clave permite supuestamente que un epitopo s cuerpos como resultado de hidrolizar el antígen amiento de alta temperatura. También se ha dete esión de glipicano 3 en cáncer de hígado, hast el método HIER (Documentos 1 a 5 no de P ento 1 de patente) . Sin embargo, puesto cuerpos anti-glipicano 3 exhiben reactividad cru células epiteliales de los vasos sanguíneos o si ticos, este planteamiento requiere que este tr licado que bloquea la reacción con un lisado de ado de célula hepática normal, se realice por a excluir esta reactividad cruzada (Documento te) . De esta manera, el método HIER an M, Deboer G, Shi W, Miyoshi E, Filmus J. roenterology 125 (1) , 89-97 Documento 2 no de Patente Yamauchi N, Wat inuma M, Ohashi K, Midorikawa Y, Morishita Y, anara J, Mori M, Makuuchi M, Hippo Y, Kodama T, Duratani H, Fukayama M. , (2005) Mod Pathol 18 (12 Documento 3 no de Patente Libbrecht L, S iman D, Vander Borght S, Pirenne J, Nevens F, Ver Pelt J, Roskams T., (2006) Am J Surg Pathol -ll Documento 4 no de Patente Grozdanov PN, Yov a MD., (2006) Lab Invest 86 (12), 1272-84 Documento 5 no de Patente Llovet, J.M., C ach, E., Roayaie, S., Fiel, M.I., Schwartz, M. , Khitrov, G., Zhang, W. , Villanueva, A., Battist rcionar un método capaz de detectar de manera e n de expresión de glipicano 3 en tejidos de c o s para Solucionar los Problemas Los presentes inventores han contemp nte invención al encontrar que el tratami eración de antígeno basado en el método de recu epítopo inducida por calor y el tratami eración de antígeno basado en el método de recu pítopo inducida por proteasa, se pueden combin ción de la expresión del antígeno glipicano 3 en áncer de hígado para detectar de este modo la di l nivel de expresión o el patrón de exprés eno glipicano 3 por el método de ohistoquímica. Esto permite que las muestras, qu minado por el método HIER convencional como que stadas en parafina del mismo sujeto, las prepa j ido identificables que se preparan del sujeto, crustan en parafina y se unen a un soporte trahs (b) someter el conjunto de las preparac o a tratamiento de desparafinización; (c) someter una de las preparaciones de ificables en el conjunto tratado en el paso miento de recuperación de antígeno basado en e ecuperación de epítopo inducida por calor, en t omete la otra preparación de tejido a tratam eración de antígeno basado en el método de recu ítopo inducida por proteasa; (d) poner en contacto un anticuerpo anti-g las preparaciones bajo condiciones apropiadas ción de un complejo del anticuerpo anti-glipica lipicano 3 presente en las preparaciones de o un autoclave; [4] el método de acuerdo a cualquiera de [1 onde la proteasa usada en el método de recuper po inducida por proteasa se selecciona del g iste de pepsina, tripsina, y proteasa K; [5] el método de acuerdo con cualquiera en donde la reacción de detección para det lejo es reacción enzimática; [6] el método de acuerdo con cualquiera en donde el anticuerpo anti-glipicano 3 es un an se une a un polipéptido C-terminal de glipicano 3 [7] el método de acuerdo a [6] , en éptido C-terminal de glipicano 3 es un polipép iste de aminoácidos en las posiciones 359 a 580 d EQ ID NO: 1 o un polipéptido que consiste de ami s posiciones 375 a 580 en el mismo; iente fórmula: IRCp=PR+ (SI-Cp) +SP nde IRCp representa una puntuación del n sión de glipicano 3; PR representa un valor numérico determi ificar la proporción de células de la cual se de le o bajo microscopio; SI-Cp representa un valor numérico determ ficar la intensidad de tinción con la cual se de lejo en los citoplasmas de las células en el camp microscopio; y SP representa un valor numérico determi ificar la proporción de células que exhiben leta de membrana en las membranas celulares de ce mpo visual bajo microscopio; lejo bajo microscopio; SI-Cm representa un valor numérico determ ificar la intensidad de tinción con la cual se de lejo en las membranas celulares de células en l bajo microscopio; y SP representa un valor numérico determi ificar la proporción de células que exhiben leta de membrana en las membranas celulares de cé mpo visual bajo microscopio; [13] un método para clasificar células de c o presentes en un sujeto en base a las punt ladas por los métodos de acuerdo a [11] y [12] ; [14] un método para determinar si o no adm gente anti-cáncer que contiene un anticuerp cano 3 a un sujeto en base a las puntuaciones ca los métodos de acuerdo a [11] y [12] ; y Las Figuras 3A-3D son diagramas que mues itados de las preparaciones de tinción deriv los trasplantados de células HuH-7 y HepG2 ; Las Figuras 4A-4F son diagramas que mues itados de las preparaciones de tinción prepa ras clínicas de cáncer de hígado humano; La Figura 5A es un diagrama que muestra e umoral de un anticuerpo hGC33 en modelos d lantados con cáncer de hígado humano; La Figura 5B es un diagrama que muestra e umoral de un anticuerpo hGC33 en modelos d lantados con cáncer de hígado humano; La Figura 5C es un diagrama que muestra e umoral de un anticuerpo hGC33 en modelos lantados con cáncer de hígado humano; y La Figura 5D es un diagrama que muestra e nte se refiere a una preparación biológica ar ida de individuos, fluidos corporales, (por e, suero, plasma y fluido espinal) , cultivos de iones de tejido, o similares. Los ejemplos pre a preparación biológica usada incluyen prepa adas de sujetos. Las preparaciones derivadas de preferentemente tejidos obtenidos del suje rentemente los tejidos hepáticos del sujeto. La todo conocido en la técnica, se usa preferenteme étodo para recolectar los tejidos de hígado. La ígado se refiere a un método que comprendé tamente una aguja larga, delgada en el hígado ficie de la piel para recolectar los tejidos del itio de punción con la aguja usualmente estás e llas en el tórax derecho inferior. Antes ción, se confirma la seguridad del sitio de a suficiente las preparaciones de tejido. A r en cortes delgados, se fijan las preparac o. De manera específica,, las preparaciones de^ t ifican por la deshidratación o desnaturaliza ínas en células/tejidos para aniquilar de es amente las células que constituyen los teji os resultantes tienen una estructura estábil ubilizada. Primero, las preparaciones de tejid fijar se cortan usando una herramienta de co lo, cuchilla quirúrgica) en fragmentos que t o y una forma adecuada para preparar s stadas en parafina. De manera subsiguien éritos se sumergen en un fijador, un reactivo us r a cabo la fijación. El fijador us réntemente formalina, más preferentemente f iguada, neutral. La concentración de la f comprenden presión normal y temperatura ambie o requerido para la fijación se puede selecc a apropiada dentro del intervalo de 1 hora a rentemente 2 horas a 3 días, de manera más pref a 24 horas, de manera aún más preferente 4 ho . Las preparaciones fijadas de esta manera se s apropiadamente en un amortiguador de fosfato o te varias horas (el tiempo se puede sel iadamente dentro del intervalo de 2 horas a 4 rentemente 3 horas a 24 horas, más preferent a 16 horas) .

Entonces, de las preparaciones de tejido, eden preparar secciones usando preferentemente e cciones congeladas o el método de secciones de p muestras preferibles del método de secciones co yen un método que comprende congelar los tejido ífica, las preparaciones ele tejido se deshid gir secuencialmente las preparaciones de t I al 70%, etanol al 80% y etanol al 100%. E rido para la inmersión y el número de inmers seleccionar apropiadamente dentro de los inte ra a varios días y 1 vez a 3 veces. Además, la i uede realizar a temperatura ambiente o a 4°G. sión a 4°C, se prefiere un tiempo más prolo sión (por ejemplo, durante la noche) de guiente, la fase líquida se reemplaza por ces, la preparaciones de tejido se incru ina. El tiempo requerido para el reemplazo de da por xileno se puede seleccionar apropiadament intervalo de 1 hora a varias horas . dimiento, el reemplazo se realiza a temperatura 4°C. Para el reemplaza a 4°C, se prefiere un ti el uso de un aparato incrustador en parafi lo, EG1160, Leica Microsystems) que áticamente la reacción de incrustación en parafi Las preparaciones de tejido incrustadas en parafina se unen a un andamiaje para pre ue" , que entonces se corta usando un microtomo e dos del espesor deseado seleccionado de espesore t?. Las secciones delgadas de tejido cortadas a se dejan reposar en el portaobjetos como un Sparente para la unión. En este caso, el portaob ste con 0.01% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich Co ir el desprendimiento de las secciones de ién se puede usar de manera preferente el sec iones unidas de tejido se secan en aire durante u iado seleccionado de entre varios minutos a 1 ah En la presente invención, se prepara un con raciones de tejido, identificables . En la ción también, las "dos preparaciones de ificables" se refieren a dos preparaciones d radas como secciones adyacentes, a menos ifique de otro modo. Además, las dos prepara o que no se preparan como secciones adyacentes nente de células o tejidos cuyas construcci ificables entre las dos preparaciones de tej ables a las "dos preparaciones de ificables" . Los ejemplos preferibles de raciones de tejido que se componen de células o S construcciones son identificables entre raciones de tejido incluyen: (1) secciones que c las derivadas de células idénticas localiz ciones idénticas en las coordenadas del plano iones de tejido; y (2) secciones cuya propo plica el método de recuperación de epítopo indu asa (método PIER) a una de las dos prepara o, en tanto que se aplica el método de recuper po inducida por calor, (método HIER) a ación. Entonces, se digitaliza la diferencia en nción entre estas después de la reacción del ant El método de recuperación de epítopo indu utiliza de manera apropiada método de calen o un microondas, método de calentamiento que lave, o método de calentamiento basado en tratam ición, o similar. Cuando la temperatura de ebull za a una salida de 780 W para mantener la temper olución a aproximadamente 98 °C, el tiempo requer ecuperación que incluye el tratamiento se selec a apropiada de entre 5 minutos y 60 minutos y lo, 10 minutos. El tiempo de recuperación de ant tar un complejo de antígeno-anticuerpo, desc nte .

La proteasa usada en el método de recuper po inducida por proteasa no se limita, de icular en su tipo u origen, y en general la nible se puede seleccionar apropiadamente para ejemplos preferibles de la proteasa usada ina con una concentración de 0.05% en ácido cío N, tripsina con una concentración de 0.1% que ionalmente CaCl2 al 0.1% en amortiguador Tris (pH asa K con una concentración de 1 a 50 Mg/m iguador Tris-HCl 10 mM (pH 7.8) que contiene ED S al 0.5%. Adicionalmente, cuando se usa la pro de su solución de reacción se selecciona apropi ntre 6.5 y 9.5 y se puede usar de manera a ivo SH o un inhibidor de quimiotripsina o trip , por ejemplo, 1 minuto y 5 horas y es, por e e nutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, horas. Después del término del tratami eración, las preparaciones de tejido tratadas a se lavan con un amortiguador de rentemente, se usa PBS (solución salina amortig to) como el amortiguador de lavado. Además, ta usar de manera preferente amortiguador de Tris -ciones de lavado adoptan usualmente un mét ende realizar el lavado a temperatura ambiente d os tres veces. Sin embargo, se puede cambiar d iada el tiempo y temperatura de lavado. uerpo Anti-glipicano 3 Se puede usar, preferentemente, c uerpo anti-glipicano 3, en el método de la ción en tanto que el anticuerpo tenga la acti -glipicano 3 se describen en los Documentos 1 te, y aquellos expertos en la técnica pueden iadamente el anticuerpo anti -glipicano 3 deseado métodos .

La unión del anticuerpo anti-glipican icano 3 se puede detectar preferentemente por u eneral conocido por los expertos en la técn lo, se puede usar ELISA (ensayo inmunosorbente zima) , EIA (ensayo enzimático) , RIA (radioinmuno uoroinmunoensayo . Estos métodos se describen en al "Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlo , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988" .

Los ejemplos de un método para valorar la a ión del anticuerpo a células que expresan el yen los métodos descritos en p. 359-420 en Anti atory Manual. (Ed Harlow, David Lañe, Cold Sprin nces se adicionan los anticuerpos de prue uerpos unidos a células se detectan usando ant dos con enzimas, que reconocen los anticue a. De manera alternativa, en FACS, se preparan s ión de los anticuerpos de prueba, y se pueden de títulos de anticuerpo a las células forzadas a itígeno para comparar de este modo la actividad estos a las células.

El formato FACS puede valorar un antígeno e a superficie de células no unidas al porta lo, placa de ELISA) suspendidas en un amorti ar así como la unión del anticuerpo al antíg los de un citómetro de flujo usado en este yen: FACSCantoMR II, FACSAriaMR, FACSArray**, FACS y FACSCaliburMR (todos de BD Biosciences) ; y EPI Sort, Cytomics FC 500, EPICS XL- CL ADC, EPICSX dos con FITC, seguido por ensayo usando FACSCal iences) . La intensidad de fluorescencia, obte iza usando Software CELL QUEST (BD Bioscienc do a este método, la actividad de unión del an ntígeno se puede determinar al: analizar, us are CELL QUEST, la intensidad de fluorescencia l ensayo FACSCalibur; y al comparar el val trico (valor Geo-Medio del sujeto) obtenido dimiento, con un valor Geo-Medio de control o un anticuerpo de control como un anticuerpo p fórmula de cálculo para determinar los edios (media geométrica) se describe en la io del Software CELL QUEST (BD biosciences ión de Preparaciones de Tejido con Anticuer icano 3 La preparación de tejido sometida al tratam za durante la noche a 4°C o a 37°C durante 1 h go, las condiciones de reacción se pueden iadamente dentro de un intervalo apropiado ocimiento de un epítopo en el anticuerpo uerpo y la formación de un complejo antígeno-ant ejemplo, la temperatura de reacción se puede o del intervalo de 4°C a 50 °C, y el tiempo de ede cambiar entre 1 minuto y 7 dias . Para la re temperaturas, se prefiere un tiempo más prolo ión. Después del término de la reacción de an rio, las preparaciones de tejido se lavan iguador de lavado. De manera preferente, s ción salina amortiguada con fosfato) , c iguador de lavado. Además, también se puede a preferente un amortiguador de Tris-HC ciones de lavado adoptan usualmente un mét ribles del material marcador incluyen: escentes tal como FITC (isotiocianato de flúore (Amersham Biosciences) , y Alexa488 {Molecular ) ; enzimas tal como peroxidasa y fosfatasa alc oloidal .

La reacción con el anticuerpo secundario se bajo condiciones apropiadas para la formació ejo antígeno-anticuerpo por el anticuerpo anti-g el anticuerpo secundario que reconoce el anticuer cano 3. Usualmente la reacción se realiza a tem nte. o 37°C durante 30 minutos a 1 hora. Sin emba ciones de reacción se pueden cambiar apropi o de un intervalo apropiado para la formació lejo antígeno-anticuerpo por el anticuerpo anti-g el anticuerpo secundario. Por ejemplo, la temper ión se puede cambiar dentro del intervalo de 4°C ende realizar el lavado a temperatura ambiente d os tres veces. Sin embargo, se pueden cambiar d iada el tiempo y la temperatura de lavado.

Entonces, las preparaciones de tejido som eacción de anticuerpo secundario se hacen reacci sustancia para visualizar el material marcador. C peroxidasa como el material marcador para el an dario, las preparaciones de te ido se incuban ión de reacción obtenida por mezclado, inmedi és de la incubación, de cantidades iguales ión acuosa de peróxido d Ie hidrógeno al 0.02 ión de DAB (diaminobencidina) ajustada ntración de 0.1 % con un amortiguador de Tris-H 7.2). Además de DAB, se pueden seleccionar d iada sustancias cromogénicas tal como DAB-Ni s de DAKO) . Durante el transcurso de la incuba ntración de 0.4 mM y BCIP a una concentración de isuelven en un amortiguador de carbonato de sod 9.8) que contiene MgCl2 10 mM y NaCl ionalmente, además de BCIP y NBT, se pueden ra apropiada Rojo Permanente, Rojo Rápido, o os de DA O) . Antes de la incubación, las preparac o se pueden pre-incubar a temperatura ambiente d to a varias horas con un amortiguador de Tris-H 9.5) que contiene cloruro de levamisol (inhibi tasa alcalina endógena; Nacalai Tesque) ntración de 1 mM, cloruro de sodio 0.1 M, y el sio 50 mM. Durante el transcurso de la incuba raciones de tejido se observan bajo micros rvalos. En el punto en el tiempo cuando se obse sitos de formazan púrpura, un producto final de r eacción se termina al lavar las preparaciones d escentes tal como FITC ( isotiocianato ele flúore (Amersham Biosciences) , y Alexa488 (Molecular ) , como el material marcador para el an dario, es innecesario el paso de reacción de s isualización . Una luz emitida por irradiación con longitud de onda de excitación del material fluo uede detectar . de manera apropiada por el US scopio de fluorescencia. ificación de Tejidos de Cáncer de Hígado y Predi o Terapéutico Se conoce que glipicano 3 libera su po inal en suero en la digestión en tejidos de c o (Documento 3 de Patente) . De esta manera, c un anticuerpo que se une a este péptido pa inal de glipicano 3 liberado en el suelo en la di 1 método de la presente invención, este anticuer do a los propósitos para lograr de este modo ción del polipéptido parcial de glipicano 3 an uperficie celular, a pesar de sí o no se stión, y la digestión del polipéptido par icano 3 que está anclado en la superficie célul e se digiera y libere en el suero en la digestió Se ha encontrado que los anticuerpos anti-g n útiles para el tratamiento y prevención de c o (Documento 3 de Patente) . La actividad aniquil as, exhibida por este anticuerpo anti-glip éutico, se ejerce principalmente por la a óxica dependiente de anticuerpo (actividad ADC idad citotóxica dependiente de complemento (a que se inicia por la unión de células efe lementos al dominio Fe del anticuerpo anti-gli con el polipéptido parcial C-terminal anclad icano 3 en tejidos de cáncer de hígado es el e éptido entre los aminoácidos en las posiciones 3 a molécula de glipicano 3 representada por SEQ ID los aminoácidos en las posiciones 374 y 375 d mento 3 de Patente) . De esta manera, los ejem uerpo anti-glipicano 3 que se une al polipéptido minal, preferentemente usado en la presente i yen anticuerpos que se unen a un polipépt iste de aminoácidos en las posiciones 359 a 58 ula de glipicano 3 representada por SEQ ID NO: éptido que consiste de los aminoácidos en las po 580 del mismo.

Por otra parte, cuando el efecto terapéu cuerpo anti-glipicano 3 terapéutico se predice punto de vista de madurez de la molécula de glip nticuerpo anti-glipicano 3 que se une al pol rez. Por otra parte, el anticuerpo anti-glipica ne al polipéptido parcial N-terminal de la mol icano-3 detecta una molécula inmadura de glipican etecta una molécula madurada de glipicano-3. D cífica, las moléculas de glipicano-3 detectadas o de la presente invención y las células de c o que expresan estas moléculas de glipicano-3 s ificar en base al grado de madurez por el uso uerpos, es decir, el anticuerpo que se éptido parcial C-terminal de la molécula de gli anticuerpo que se une al polipéptido pare nal .

Más adelante en la presente, este mé ficación se describirá de manera más específ uerpos, es decir, el anticuerpo anti-glipicano al polipéptido parcial, C- terminal de la mol a molécula de glipicano-3 como otro anticuerpo p molécula de glipicano-3 detectado usando el an -glipicano-3 que se une al polipéptido parcial N- a molécula de glipicano-3, se puede evaluar ula más inmadura desde el punto de vista del gra ez, y las células de cáncer de hígado que expré ula de glipicano-3 se pueden evaluar como cél uras. Además, una molécula de glipicano-3 qu detectar usando el anticuerpo anti-glipicano- al polipéptido parcial N-terminal de la mol icano-3 pero se detecta usando el anticuerp icano-3 que se une al polipéptido parcial C-teri olécula de glipicano-3 se puede evaluar como una adura desde el punto de vista del grado de su :ma células de cáncer de hígado que expresan esta mol icano-3 se pueden evaluar como células más madura al, n-terminal y un anticuerpo secundario que nticuerpo anti-glipicano-3 que se une al pol ial, c-terminal se marcan con enzimas o fluoresce entes clases. Como resultado, estos dos ant -glipicano-3 se pueden usar en la detección ración de tejido. alización de Reactividad con Anticuerpo anti-Gli La presente invención proporciona un mét alizar la diferencia en el grado y patrón de d microscopio de un complejo de antígeno-an do de glipicano-3 y un anticuerpo anti-glipica a la diferencia entre las reacciones de recuper eno (es decir, método de recuperación de cida por calor y método de recuperación de cida por proteasa) .

En un aspecto, la digitalización se re ficar la intensidad de tinción con la cual se de le o en los citoplasmas de las células en el camp microscopio; y SP representa un valor numérico determi ificar la proporción de células que exhiben leta de membrana en las membranas celulares de cé mpo visual bajo microscopio.

Las puntuaciones de PR se · calculan tal que mpo visual bajo microscopio usando un lente obje mento de 4 o 10, (i) cuando es cero la proporción de célula s se detecta el complejo, la puntuación de la m (ii) cuando esta proporción es menor de ación de la muestra es 1, (iii) cuando esta proporción es igual a ó m tra es O, (ii) cuando se observa ligeramente r tiva, a pesar de ser oscura, usando un lente obje umento de 10 en el microscopio, la puntuació tra es 1, (iii) cuando se observa ligeramente r tiva usando un lente objetivo con un aumento uación de la muestra es 4, (iv) cuando la respuesta positiva s ocer de manera suficiente aún usando un lente n aumento de 4, la puntuación de la muestra es 3 (v) cuando se reconoce claramente la r tiva fuerte y se observa usando un lente objetiv nto de 4 , la puntuación de la muestra es 4.

Las puntuaciones de SP se calculan tal que etección del complejo en las membranas celu (iv) cuando 50 % o más de las células que esta positiva exhiben tinción completa de memb uación de la muestra es 2.

En otro aspecto, la digitalización se rea ulo de acuerdo a la siguiente fórmula (2) : IRCm=PR+ (Sl-Cm) +SP onde IRCm representa una puntuación de localiz rana de glipicano-3; PR representa un valor numérico determi ificar la proporción de células de la cual se de lejo bajo microscopio; Sl-Cm representa un valor numérico determ ificar la intensidad de tinción con la cual se de lejo en las membranas celulares de células en al bajo microscopio; y (ii) cuando esta proporción es menor de ación de la muestra es 1, (iii) cuando esta proporción es igual a o m y menor que 50 %, la puntuación de la muestra es (iv) cuando esta proporción es igual a o m , la puntuación de la muestra es 3.

Las puntuaciones de Sl-Cm se calculan tal as membranas celulares de células en el campo vis scopio, (i) cuando es cero la proporción de célula s se detecta el complejo usando un lente objetiv to de 4 o 10 en el microscopio/ la puntuació tra es 0, (ii) cuando se observa ligeramente r tiva, aunque oscura, usando un lente objetivo (v) cuando la respuesta positiva fuerte se menté y se observa usando un lente objetivo co to de 4, la puntuación de la muestra es 4.

Las puntuaciones de SP se calculan tal que etección del complejo en las membranas celu ias en el campo visual bajo microscopio, (i) cuando las membranas celulares no esta positiva, la puntuación de la muestra es 0, (ii) cuando menos de 20% de las células que esta positiva exhiben tinción completa de memb ación de la muestra es 1, (iii) cuando 20% o más y menos de 50% ias que exhiben respuesta positiva exhiben leta de membrana, la puntuación de la muestra es (iv) cuando 50% o más de las células que esta positiva exhiben tinción completa de memb ación que refleja la ubicación de la expre icano 3 en la membrana celular. El mé talización de la presente invención permite las de cáncer de hígado presentes en un su ifiquen en base al nivel de expresión o al p sión de glipicano 3. Como se muestra en los riores, se confirmó que se lleva a cabo d tiva la clasificación usando las preparaciones d ente recolectadas de pacientes con cáncer de s se confirmó que la clasificación también se de manera efectiva en los modelos animales de c o en los cuales se trasplanta HuH-7 o Hep edad de células de cáncer de hígado cuyo esión de glipicano 3 se ha determinado.

En la presente invención, los result istrar un anticuerpo anti -glipicano 3 terapé diferencia en las puntuaciones digitalizadas de presente invención. El método de digitaliz do a la presente invención proporciona predic o terapéutico de un agente terapéutico para , c o que contiene un anticuerpo anti-glipicano 3 diente activo, en cáncer de hígado. Adicionalm o de digitalización de acuerdo a la presente i determinar en la dosis requerida del anticuer icano 3 terapéutico, necesaria para obtener e do en el tratamiento de cáncer de hígado u uerpo anti-glipicano 3. los Más adelante en la presente, la presente i escribirá más específicamente con referencia a e embargo, no se propone que la presente inve te a estos ejemplos. 7 y se sub-cultivó en Medio Eagle Modificado de ma-Aldrich Co.) que contiene FBS al 10% (BIO vo HepG2 y se sub-cultivó en Medio Eagle Esencia a-Aldrich Co.) que contiene 10% de FBS, 1 m ato de Sodio MEM (Invitrogen Corp.)/ y 1 m o cidos No Esenciales MEM (Invitrogen Corp.). edición de nivel de expresión de GPC3 .

) Método de medición Los niveles de expresión de GPC3 de las 7 y HepG2 se midieron usando un anticuerpo mo -GPC3 humano de ratón (nombre de clon: GC33, des 06/006693) y Equipo QIFI (DakoCytomation) . El m ción se llevó a cabo de acuerdo a un método des strucción incluida en la presente.

El anticuerpo GC33 usado se disolvió a te ente y luego se ajustó a 1 mg/ml con PBS . Un f omplementó con 1 mi de FACS-PBS y se centrifug a 4°C durante 1 minuto para fraccionar las célula ias se re- suspendieron en 98 µ? de FACS-PBS.

Adicionalmente , los siguientes proced ién se realizaron en paralelo con los proced ritos anteriormente: se adicionó 1 mi de FACS^P cuentas de calibración y cuentas de ajuste incl ??\ que entonces se lavaron por centrifugació 4°C durante 1 minuto. Las cuentas se suspendier e FACS-PBS. Las células y las cuentas se comple anera separadas con 2 µ? de anticuerpo anti- marcado con FITC incluido en QIFIKIT y se some ción a 4°C durante 45 minutos. Entonces, cada sol ión se complementó con 1 mi de FACS-PBS y se ce 00 rpm a 4°C durante 1 minuto. Las células precip cuentas se suspendieron de manera separada en etamente automático EPICS-XL. En base a lo es de MFI y a los valores de capacidad de uerpo (ABC) de las cuentas de calibración, se recta óptima usando Microsoft Office Excel osoft Corporation) . El valor de MFI de cada lar se asignó a esta línea recta de calibrac minar su valor ABC. Un valor determinado al sus ABC de la muestra que contiene el mIgG2 ionar de aquel de la muestra que contiene el an hecho reaccionar se usó como el número de s a anticuerpo.

Como resultado, el nivel de expresión de g HuH-7 fue 1.25xl05 moléculas por célula. El sión del glipicano 3 en HepG2 fue de 9.67xl05 m élula .

Preparación de modelos de ratón en los cu vió un frasco de los contenidos en 1 mi ladas y se diluyó adicionalmente con 4 mi de a) se administraron de manera intraperiton ntado a ratones SCID macho de 5 semanas de ed , Inc.). El anticuerpo anti-asialo GM1 (Wa cal Industries, Ltd.) se preparó al disolver u os contenidos en 1 mi de agua destilada y d onalmente la solución con 4 mi de solución sa ente día, se trasplantaron subcutáneamente 10 suspensión celular (es decir, 5xl06 células po s regiones abdominales . de los ratones .

Estudio del método para preparar secciones d al Injertos uniformes de tejido recolect os trasplantados con HepG2 preparados en el pá uadriseccionaron usando una cuchilla quirúrgic ormaldehído a una concentración de 2%) que con araformaldehído y luego se lavó con PBS (solució iguada con fosfato, 10 mM, pH 7.4) a 4°C. D guiente, el fragmento se deshidrató en acetona oche a 4°C y a temperatura ambiente durante 2 h entó se purificó adicionalmente con benzoato d te 1 hora y con xileno durante 1 hora, luego se rafina de la misma manera como antes y se almace do B) .

Las preparaciones incrustadas en p radas en los métodos A y B se cortaron en un m tato en cortes delgados inmediatamente antes d aran a la tinción inmunohistológica . Los co on en aire, seguido por tratamiento de desparáfi ción.

Entonces, se sumergió un fragmento diferen en un microtomo criostato en cortes delgados ones delgadas se secaron en aire y luego se alm °C (método C) .

El fragmento restante se incrustó a 4° esto Tissue-Tek OCT y se congeló en un baño acetona. El bloque congelado se cortó en un m tato en una pluralidad de secciones delgadas ones se secaron entonces en aire y se fijaron entes métodos diferentes: una de las secciones araformaldehído al 4% a 4°C durante 30 minutos se fijó una sección diferente en la sección en a durante 10 minutos (método E) ; y se fijó una ente en formalina amortiguada neutral al ratura ambiente durante 30 minutos (método ones fijadas por los métodos D, E, y F se te 5 minutos tres veces con solución salina amo ivos necesarios para la tinción. El método de ti a cabo de acuerdo a un método descrito ucción incluida en el equipo. No se llevó a eración de antígeno debido a que fue corto el t ión. Un complejo de antígeno-anticuerpo formado anscurso de esta tinción inmunohistoquímica se v vés de reacción de peroxidasa-diaminobenzidina ( hematoxilina en la contra-tinción . En este conté uerpos de control usados para los anticuerpos p n IgG2 de ratón para GC33 e IgGl para 1G12. Se casos por método, y los resultados se muestra 1 > 1 D: fijación de 24 horas , tratamie eración de antígeno usando tratamiento de protea E: fijación de 7 días, sin tratami eración de antígeno F:~ fijación de 7 días, tratamiento de recu tígeno usando autoclave Se graduó la capacidad de tinción otinción de acuerdo a los siguientes par derando los grados de PR (proporción de ivas) , en el campo visual bajo microscopio u objetivo con un aumento de 4 o 10, (i) cuando la proporción de células de la tectó el complejo., fue igual a o menor que 50%, de la preparación se determinó como ML" , (ii) cuando esta proporción de células s se detectó el complejo fue igual a o mayor q derándo SI (puntuaciones de intensidad de tinció (i) la puntuación de SI de una prepara ió tinción ligeramente positiva se determinó com (ii) la puntuación de SI de una prepara ió tinción débilmente positiva se determinó como (iii) la puntuación de SI de una prepara ió tinción débilmente positiva con tinción moder uertemente positiva se determinó "+3", (iv) la puntuación de SI de una prepara ió tinción moderadamente positiva se determinó, (v) la puntuación de SI de una prepara ió tinción fuertemente positiva se determinó co derando SP (capacidad de tinción de membrana cel mpo visual bajo microscopio usando un lente obje mento de 4 o 10, stas células se tiñeron de manera circunferen ación de SP de la preparación se determinó como En las Figuras 1A-1D se muestra una image l con cada grado ( +1, +2, +4, y +5) de las punt I. La Figura 1A muestra la preparación con SI d a IB muestra la preparación con SI de +2; la F ra la preparación con SI de +4; y la Figura ID reparación con SI de +5. Además, se muestra as 2A-2B una imagen teñida con cada grado ( +1, de las puntuaciones de SP. La Figura 2A mu ración con SP de I, y la Figura 2B mué ración con SI de III.

Los grados de SI y SP de las prepa radas por cualquiera de los métodos C a F es bajos, indicando que no se obtuvo una ientemente teñida. Para la segunda e L a MH. En los términos de la diferencia uerpo GC33 y el anticuerpo 1G12, el anticue ió una imagen teñida más fuerte en todos los gr ia del anticuerpo 1G12. studio del tiempo de fijación para preparar secc o tumoral y método de recuperación de antígeno Se estudiaron injertos uniformes de ectados de modelos trasplantados con HepG2 , pr l párrafo (3) , para el tiempo de fijación como, s o de fijación usando formalina amortiguada ne n el método A descrito en el párrafo (4) se aju y 7 días para preparar las prepar onalmente, las preparaciones preparadas en cad ij ación se recuperaron respectivamente por cualq métodos de recuperación usando un autocl ondas, o una proteasa descrita más adelant irei Bioscience) para preparar adicionalme raciones .

Las secciones de tejido preparadas de est saron en la tinción inmunohistoquimica mostr nte. Es usaron un anticuerpo GC33 (IgG2a) uerpo 1G12 (BioMosaic ,' IgGl) como anticuerpos p ncentraciones de 2.5 µ9/p?1 y 1.0 9/t?1/ respecti la tinción, se usaron reactivos incluidos en e ~ 2 como reactivos necesarios para la tinción. E nción se llevó a cabo de acuerdo a un método des nstrucción incluida en el equipo. La recuper eno no se llevó a cabo debido a que fue corto e fijación. Un complejo de antigeno-anticuerpo te el transcurso de esta tinción inmunohistoqu lizo a través de la reacción de per nobenzidina (DAB) . Se usó hematoxilina en la raciones sometidas a tratamiento de recupera eno en base al método de proteasa exhibieron c nción más excelente en el grado de PR y las punt y SP que aquella de las otras preparaciones som miento de recuperación de antígeno.

A: fijación de 24 horas, sin tratami eración de antígeno B: fijación de 24 horas, tratamie G: fijación de 7 días, tratamiento -de recu tígeno usando microondas H: fijación de 7 días, tratamiento de recu tígeno usando tratamiento de proteasa inción inmunohistoquímica de secciones de tejido Preparación y tinción de preparaciones de tejid Injertos de tejido recolectados de los lantados, preparados en el párrafo (2) se sumerg liña amortiguada neutral al 10% durante 7 dí ión. De manera subsiguiente, las preparaciones d stadas en parafina de las secciones de te raron de acuerdo a un método normal . Las prepa oque se cortaron en cortes delgados y estas secc o se usaron en tinción inmunohistoquímica mostr nte .

Se usó un anticuerpo GC33 (IgG2a) os usando proteasa incluida en el equipo) miento de autoclave realizado a 121°C durante 10 olución de Recuperación de Antígeno (DakoCyto da 10 veces. Un complejo de anticuerpo-antígeno te el transcurso de esta tinción inmunohistoqu lizo a través de reacción de peroxidasa-diaminob . Se usó hematoxilina en la contra- tinción. xto, un anticuerpo de control usado para el an rio fue IgG2 de ratón.

Evaluación de resultados de tinción La capacidad de tinción en la inmunotinció ticuerpo anti-glipicano humano 3 de ratón se parámetros (proporción de células positiv sidad de tinción: SI, y patrón de tinción de ar: SP) mostrados a continuación.

Específicamente, cada parámetro se digita ación de la muestra es 1, (iii) cuando esta proporción es igual a o m y menor que 50 %, la puntuación de la muestra és (iv) cuando esta proporción es igual a o m la puntuación de la muestra es 3 ; puntuaciones de SI-Cp (intensidad de lásmica) que reflejan la capacidad de tin lasma se calcularon tal que: en los citopla as en el campo visual bajo microscopio, (i) cuando es cero la proporción de célula s se detecta el complejo, usando un lente obje mento de 4 o 10 en el microscopio, la puntuaci ra es 0, (ii) cuando se observa ligeramente r iva, aunque oscura, usando un lente objetivo to de 10 en el microscopio, la puntuación de la to de 4, la puntuación de la muestra es 4; untuaciones de Sl-Cm (intensidad de tinción de ar) que reflejan la capacidad de tinción de ar se calcularon tal que : en las membranas celu as en el campo visual bajo microscopio, (i) cuando es cero la proporción de célula s se detecta el complejo usando un lente objetiv to de 4 o 10 en el microscopio, la puntuació ra es 0, (ii) cuando se observa ligeramente r iva, aunque oscura, usando un lente objetivo to de 10 en el microscopio, la puntuación de la (iii) cuando se observa una respuesta a a un lente objetivo con un aumento de ientemente reconocible usando un lente objetiv membranas celulares de células en el campo vis scopio, (i) cuando las membranas celulares no esta positiva, la puntuación de la muestra es 0, (ii) cuando menos de 20 % de las cél en respuesta positiva exhiben tinción comp ana, la puntuación de la muestra es 1, (iii) cuando 2Ó % o más y menos de 50 % as que exhiben repuesta positiva exhiben eta de membrana, la puntuación de la muestra es (iv) cuando 50 % o más de las células que esta positiva exhiben tinción completa de memb ación de la muestra es 3. ntuación total calculada usando Sl-Cm se indicó ntuación total calculada usando SI-Cp se indicó ) Evaluación de Capacidad de Tinción al tratamiento de recuperación de epítopo indu asa; la Figura 3C muestra una imagen teñida ración obtenida al someter una sección prepa o trasplantado con HepG2 al tratamiento de recu pítopo inducida con calor usando un autoclav a 3D muestra una imagen teñida de una pre ida al someter una sección preparada del lantado con HepG2 a el tratamiento de recuper po inducida por proteasa.

Además, en la Tabla 3 se muestran las punt s parámetros de tinción individual. Los valores lados de las preparaciones de tejido derivadas os animales trasplantados con HuH-7 y HepG2 fuer no se observó diferencia en los valores entre . Además, sus valores de IRCm fueron todos 5, vó diferencia en los valores entre estos (Ta Por otra parte, las puntuaciones de los pa inción individuales de las preparaciones de das con proteasa derivadas de los modelos lantados con HuH-7 y HepG2 también se muestra 3. Se observó que las preparaciones de tejido roteasa tienden a producir mayores puntuaciones Cp que aquellas obtenidas de las preparaciones utoclave. En términos de las puntuaciones ladas de los parámetros de tinción individual es de IRcP obtenidos de las preparaciones de lantadas con HuH-7 y HepG2 fueron 4 ctivamente. Adicionalmente, los valores de IRCm o s preparaciones de tejido trasplantadas con fueron 4 y 9, respectivamente (Tabla 3 y Fig Como se muestra en la fotografía más baja de las , la tinción de la preparación de tejido tra eno basada en tratamiento con proteasa, en com l tratamiento en autoclave, es un método que ref amente la diferencia en el nivel de expré cano 3. Además, se mostró que el tratamiento de uperior al tratamiento de autoclave desde el de la capacidad de tinción de las membranas c s preparaciones de tejido. !o 2 o de recuperación de antígeno de prote otinción de GPC3 usando preparación de te noma hepatocelular humano Tinción Inmunohistoquímica de Muestras de C ocelular Humano Métodos para Preparar y Teñir Preparaciones Se sumergieron muestras de carcinoma hepat o en formalina amortiguada, neutral al 10 % du ío 1, se evalúo la capacidad de tinción otinción usando el anticuerpo anti-GPC3 humano acuerdo a tres parámetros (proporción de ivas : PR, intensidad de tinción: SI, y patrón de mbrana celular: SP) mostrados posteriormente.

De manera específica, cada parámetro se di os siguientes métodos: puntuaciones de PR (proporción de células posit laron tal que: en el campo visual bajo mic o un lente objetivo con un aumento de 4 o 10, (i) cuando es cero la proporción de célula s se detecta el complejo, la puntuación de la mu (ii) cuando esta proporción es menor de 2 ación de la muestra es 1, (iii) cuando esta proporción es igual a o m mento de 4 o 10 en el microscopio, la puntuaci ra es 0, (ii) cuando se observa ligeramente r iva, a pesar de ser oscura, usando un lente obje mento de 10 en el microscopio, la puntuació ra es 1, (iii) cuando se observa ligeramente r iva usando un lente objetivo con un aumento d ación de la muestra es 2, (iv) cuando se puede reconocer de manera su esta positiva aun usando un lente objetivo to de 4, la puntuación de la muestra es 3, y (v) cuando la respuesta positiva fuerte se menté y se observa usando un lente objetivo to de 4, la puntuación de la muestra es 4 ; untuaciones de Sl-Cm (intensidad de tinción de ito de 10 en el microscopio, la puntuación de la (iii) cuando se observa una respuesta a a un lente objetivo con un aumento de ientemente reconocible usando un lente objetivo to de 10, la puntuación de la muestra es 2, (iv) cuando se puede reconocer suficiente esta positiva aún usando un lente objetivo to de 4, la puntuación de la muestra es 3, (v) cuando se reconoce claramente la r iva fuerte y se observa usando un lente objetiv to de 4, la puntuación de la muestra es 4; y alcularon las puntuaciones de SP (patrón de ti ana celular) se calcularon tal que: en la detec ejo en las membranas celulares de células en l bajo microscopio, esta positiva exhiben tinción completa de memb ación de la muestra es 3.

Además, también se evalúo el grado de ti ífica (de fondo) (determinada de la capacidad de lulas inflamatorias o estromas) .

Resultados y Conclusión En las Figuras 4A-4F se muestran imágenes s preparaciones sometidas a tratamiento de recu ntígeno. La Figura 4A muestra una imagen teñida ración obtenida al someter una sección prepara ra del caso A a tratamiento de recuperación de ida por calor usando un autoclave; la Figura 4B magen teñida de una preparación obtenida al som on preparada de la muestra del caso A a tratam eración de epítopo inducida con proteasa; la F ra una imagen teñida de una preparación obte lave; y la Figura 4F muestra una imagen teñida ración obtenida al someter una sección prepara ra del caso C a tratamiento de recuperación de ida con proteasa.

Como se muestra en las Figuras 4A-4F y en as regiones de carcinoma hepatocelular en el n una puntuación de PR de ' 3 (50 % o más de la re ivo) en todas las preparaciones de tejido trat lave de los casos A, B y C. Además, no ización de membrana en los casos A y B con réspe idad y patrón de la tinción de membrana (SI-Cm , en tanto que en el caso C se observó la expr embrana con puntuaciones de SI-Cm=l y SP-Cm=2. xto, todos los casos tendieron a exhibir r iva no específica a células inflamatorias o e se muestra en la fotografía del caso B en las rametro Método de recuperación Caso A Caso B de antígeno Proteasa 1 3 Autoclave 0 0 Proteasa 1 2 Por otra parte, las puntuaciones de PR raciones de tejido tratadas con proteasa fueron % de la región fue positiva) en el caso A, 2 región fue positiva) en el caso B, y 3 (50 m n fue positiva) en el caso C. Además , las punt caso A fueron SI-Cm=l y SP-Cm=l con respect sidad y patrón de la tinción de membrana. Ade aciones del caso B fueron SI-Cm=3 y SP-C sión distinta en la membrana se observó en el ca aciones de SI-Cm=4 y SP-Cm=3. Diferente raciones de tejido tratadas en autoclave, se asa también es superior a esto en la capac on de membrana celular. Adicionalmente, se demo todo de proteasa produce sólo mínima respuesta pecífica y por lo tanto puede capturar más prec spuesta positiva específica a un anticuerpo anti ío 3 encia de Fármaco de Anticuerpo anti-GPC3 en Mo Trasplantados con Variedad de Células de Ca o Humano que Expresan GPC3 ariedad Celular Las células usadas en el trasplante fueron y células HepG2. Las células HuH-7 se mantu ltivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco ch Co.), que contiene al 10 % de FBS (BIONE as HepG2 se mantuvieron y sub-cultivaron en Med ial Mínimo (Sigma-Aldrich Co.), que contiene istraron intraperitonealmente 100 µ? de un an asíalo G 1 (Wako Puré Chemical Industries. o se disolvió en 5 mi de PBS) por adelantado a (machos de 5 semanas de edad, CLEA Japan, Inc. lantaron subcutáneamente 100 µ? de cada su ar a las regiones abdominales de los ratones . D ífica, se administraron 5xl06 células por rat enes tumorales se calcularon de acuerdo a la s ión, y los modelos se consideraron como lecen en el punto en el tiempo cuando el promedi enes tumorales alcanzó 117 a 330 mm3 : Ecuación 1: Volumen tumoral=Eje principalxE enor/2 reparación de Anticuerpo que se va a Administrar En el día de la administración, se aj uerpo monoclonal GPC3 anti-humano humanizado (n ribe en el párrafo (2) o 26 días después del t os modelos de ratón trasplantados con célul arados , de esta manera, la muestra de admini arada en el párrafo (3) precedente se administ S de 10 ml/kg de las venas de la cola durante 3 na base de una vez por semana. Se admini ículo) esterilizado en filtro como un control ne dosis de 10 ml/kg de las venas de la cola d as en una base de una vez por semana de la mism antes. Todos los grupos se compusieron de 5 a 6 grupo .

Evaluación de Efecto Antitumoral El efecto antitumoral del anticuerpo hGC3 los de ratón trasplantados con cáncer de hígado valúo en base al cambio dependiente en tiempo enes tumorales (Figura 5A) y los volúmenes hú idíente en tiempo en los volúmenes tumorales d istrado con 5 mg/kg de anticuerpo hGC33. El pun ? cuando se administró el anticuerpo hGC33 se i lecha. En el diagrama, el símbolo * represent i P de significación es P<0.05 en la prueba de di ificativa. Además, el símbolo ** representa que significación es P<0.0001 en la prueba de di ificativa. La Figura 5B es un diagrama que mu io dependiente en tiempo en los volúmenes tumo modelos de ratón trasplantados con HuH-7. E esenta el cambio dependiente en tiempo en los v rales del grupo administrado con vehículo; el esenta el cambio dependiente, en tiempo en los v rales del grupo administrado con 1 mg/kg de an 3; y el círculo representa el cambio depend o en los volúmenes tumorales del grupo administ lantados con HepG2. En el diagrama, el sí esenta que el nivel P de significación es P<0. ba de diferencia significativa. Adem s, el sí esenta que el nivel P de significación es P<0.00 ba de diferencia significativa. La Figura 5 rama que muestra los volúmenes húmedos de los es de 1 semana desde el día de administración modelos de ratón trasplantados con HuH-7. En el d ímbolo * representa que el nivel P de signific 05 en la prueba de diferencia significativa. Ad olo ** representa que el nivel P de signific 0001 en la prueba de diferencia significativa.

Se usó el paquete pre-clínico SAS (SAS In ) , en el análisis estadístico. Los volúmenes t idos en el día de medición final se usaron para rueba de diferencia significativa por el mé De esta manera, se demostró que el anticuer efecto antitumoral en modelos de ratón trasplant as HepG2 determinados para exhibir un alto sion del antígeno y el patrón de expresión de loc embrana celular como resultado de analizar, por onistoquímica, preparaciones de tejido prepar o de recuperación de epítopo inducida por prot aste, se demostró que el anticuerpo exhibe baj umoral en modelos de ratón trasplantados con célu minados de los resultados de análisis que tienen de expresión del antígeno. Esta diferencia usión que no se puede alcanzar por el análisis bas o convencional de recuperación de epítopo indu . De esta manera se mostró que la eficiencia de fá uerpo GPC3 se puede determinar de manera efe nar el método convencional de recuperación de

Claims (1)

1. J 76 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ama como propiedad lo contenido en las si indicaciones : 1. Método de inmunoensayo in vitro para det encia de células de cáncer de hígado en un eterizado porque comprende los pasos de: proporcionar un conjunto de al me raciones de tejido, identificables , como S stadas en parafina del mismo sujeto, las prepa tificables de tejido que se preparan del sujeto, crustan en parafina y se unen a un soporte trans b) someter el conjunto de las preparac o a tratamiento de desparafinización; (c) someter una de las preparaciones identi icano 3 presente en las preparaciones de tejido, i paso (c) ; y (e) detectar la presencia del complejo, o está presente el complejo, el sujeto se dia que tiene células de cáncer de hígado. 2. Método de conformidad con la reivindic Cterizado porque el método de recuperación de cida por calor es calentar usando microondas. 3. Método de conformidad con la reivindic terizado porque el método de recuperación de cida por calor es calentar usando un autoclave. 4. Método de conformidad con cualquiera indicaciones 1 a 3, caracterizado porque la a en el método de recuperación de epítopo indu easa se selecciona del grupo que consiste de sina, y proteasa K. un polipéptido que consiste de aminoácidos ciones 359 a 580 descritas en SEQ ID NO: péptido que consiste de aminoácidos en las posici 0 en el mismo. 8. Método de conformidad con la reivindica aracterizado porque el anticuerpo anti-glipicaño cuerpo GC33. 9. Método de conformidad con cualquiera indicaciones 1 a 5, caracterizado porque el an -glipicano 3 es un anticuerpo 1G12. . 10. Método de conformidad con cualquiera indicaciones 1 a 9, caracterizado porque en el p resencia del complejo se digitaliza para detecció 11. Método de conformidad con la reivindica Cterizado porque la digitalización se realiza por cuerdo a la siguiente fórmula: lejo en los citoplasmas de las células en el camp microscopio; y SP representa un valor numérico determ ificar la proporción de células que exhiben leta de membrana en las membranas celulares de cé ampo visual bajo microscopio . 12. Método de conformidad con la reivindica cterizado porque la digitalización se realiza por cuerdo a la siguiente fórmula: IRCm=PR+ (Sl-Cm) +SP nde IRCm representa una puntuación de localiz rana de glipicano 3; PR representa un valor numérico determi ificar la proporción de células de las cuales se mplejo bajo microscopio; do presentes en un sujeto, caracterizado porgue as puntuaciones calculadas por los métodos de co las reivindicaciones 11 y 12. 14. Método para determinar si o no admini te anti-cáncer que contiene un anticuerpo anti-g . un sujeto, caracterizado porque se basa aciones calculadas por los métodos de conform reivindicaciones 11 y 12. 15. Método para determinar una dosis de u -cáncer que contiene un anticuerpo anti-glipicano miento de cáncer de hígado en un sujeto, carac e se basa en las puntuaciones calculadas por los nformidad con las reivindicaciones.il y 12.