TW200949248A - Method for detection of liver cancer cell using anti-glypican-3 antibody - Google Patents

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200949248 六、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明有關一種用以檢出受檢體中肝癌細胞之存在之 體外免疫分析方法。 本發明包含本案優先全主張之日本特願2008-068316 號之說明書所記載之內容。 〇 【先前技術】 蛋白多醣3頻繁地於肝癌中高表現，故於肝癌中解析 蛋白多醣3之表現輪廓，被認爲對蛋白多醣3於肝癌中之 機能檢定、肝癌之治療或診斷以及肝癌預後預測方面有 用。一般於蛋白質表現解析時，免疫組織化學尤其是酵素 抗體法已廣泛使用於病理診斷。免疫組織化學爲對生體內 物質（抗原）之存在及分布使用抗體或酵素等之生物學試藥 以高感度且特異地檢出之方法。作爲免疫組織化學之特 Ο 徵，具有下列等特徵：1.方法簡便；2.所得生化學之資訊 係以形態資訊使用等而可廣泛應用；3.提供生物學、病理 學上重要之資訊；4.由於使用生物學試藥而有必要注意與 一般方法之差異等。又，免疫組織化學染色亦具有使用新 鮮凍結切片、細胞診斷檢體或固定組織之石蠟切片等廣範 圍檢體而可使用於作爲目的之病理診斷或形態學觀察之優 點。 免疫組織化學中，由於因酵素抗體法之免疫染色係使 用通常病理診斷中使用之福馬林固定石蠟包埋組織，因此 .200949248 其應用範圍非常廣。然而，由於爲福馬林固定組織故而引 起之人工物（antifact)(人爲產生）等若未充分注意處理，則 有染色失敗之情況，有時因福馬林固定及包埋引起之抗原 變化或抗體浸透及反應性變化之結果，而產生僞陽性或僞 陰性。此種僞陽性或僞陰性有時會對染色結果產生解釋錯 誤之結論。 通常的組織學檢索用之福馬林固定雖可用於形態保 〇 持，但自與抗體保持結合性之觀點而言，尙無法稱爲理想 的固定液。因此亦有使用福馬林以外之醇等作爲固定液之 情況，但尙無法確立可以形態保持優異而可保存與所有抗 原之抗體之結合性之固定法。因此，福馬林固定雖保存與 抗體之結合性尙有問題，但仍成爲廣泛使用之現實固定 法。 因此，考慮有多少減弱福馬林固定對保持與抗體結合 性之影響的方法。首先考慮選擇不受福馬林固定之影響之 ® 可辨識抗原決定基之抗體使用於免疫染色之策略。自可辨 識相同抗原之抗體中，藉由於免疫染色中使用可辨識不易 受抗原中福馬林固定影響之抗原決定基之抗體，使僞陰性 得以減低成爲可能。然而，蛋白多醣3於細胞表面表現後 由於經歷蛋白酶等之轉譯後修飾，而限定了可與抗體結合 之抗原決定基，故而用以選擇適當抗原決定基之抗原決定 基並無多樣性。 第二，提高免疫染色感度之一般方法舉例有檢出無法 可見化之抗原之方法。最簡便之方法係於通常免疫染色所 -6 - 200949248 使用之DAB(3,3’-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽）中添加銅等重金 屬之方法，但無法期待顯著之感度上升。雖亦嘗試有 ABC(親和素-生物素化過氧酶複合，avidin_bi〇tyiated peroxidase complex)法或LSaB(經標記之鏈黴親和素生物 素化抗體 ’ labeled streptavidin biotynlated antibody)法等 之藉由重複生物素化二次抗體與ABC或酵素標記之親和 素與切片之反應而提高感度之方法，但隨著反應次數增加 〇 認爲有背景之非特異染色亦增強之傾向。再者如可利用使 用酵素標記之葡聚糖聚合物之EPOS(增強之聚合物單步驟 著色）法或生物素化色醯胺（tyramide)與ABC法組合之 CSA(催化之訊號擴增，catalyzed signal amplification)法 而急遽地提高染色色度。然而，使用ABC法等之以往方 法於福馬林固定組織中檢出抗原時，腫瘤組織係判斷爲陽 性及正常或非腫瘤組織之陰性，基於此種判斷而可辨別腫 瘤組織及非腫瘤組織，但若使用高感度法於非腫瘤組織內 ® 亦檢出有微量抗原，因此亦有無法藉由抗原進行該等辨別 之情況。又，使用高感度法時亦有因高感度亦使背景染色 增強之問題。 第三，有藉由福馬林固定使與抗體之反應性得以減弱 之抗原的反應性賦活化之方法。於1 970年代於藉由使用 導入之蛋白酶消化切片之方法（蛋白酶誘發之抗原決定基 修補法，以下稱爲「PIER法」或「蛋白酶抗原賦活化 法」）中，於免疫染色之前進行以胰蛋白酶、胃蛋白酶等 消化切片。此方法有因使切片本身被消化所引起之切片自 200949248 玻璃剝離或染色結果不穩定性等之問題。 之後，於1990年代開發有熱誘導抗原賦活化法 (Heat-induced epitope retrieval，以下稱爲「HIER 法」或 「熱誘導抗原賦活化法」）。於使用微波、煮沸或高壓蒸 氣鍋加熱時，因高溫處理使抗原水解之結果，變成抗原決 定基可能與抗體結合。蛋白多醣3之於肝癌中表現迄今爲 止亦藉由HIER法檢出（非專利文獻1〜5及專利文獻1)。 ❹ 然而，由於抗蛋白多醣 3與血管或肝竇（Hepatic Sinusoidal)之上皮細胞顯示交叉反應，故有必要預先施以 與源自正常肝細胞之蛋白質萃取物（lysate)之阻斷反應而 使交叉結合除外之繁瑣處理（非專利文獻4)，觀察以使在 原來細胞膜上表現之蛋白多醣3經細胞質性表現等（非專 利文獻2)，以以往所使用之HIER法無法正確地檢出在肝 癌細胞組織上之蛋白多醣3之表現，而有開發代替以往之 HIER法而可正確地檢出該表現之方法之需求。 Y [非專利文獻 1] Capurro M, Wanless IR，Sherman M，

Deboer G, Shi W, Miyoshi E, Filmus J., (2003 )

Gastroenterology 125(1)，8 9-97 [非專利文獻 2] Yamauchi N，Watanabe A，Hishinuma M, Ohashi K, Midorikawa Y, Morishita Y, Niki T， Shibahara J, Mori M, Makuuchi M，Hippo Y, Kodama T, Iwanari H, Aburatani H, Fukayama M., (20 0 5) Mod Pathol 18(12), 1591-8 [非專利文獻 3] Libbrecht L，Severi T，Cassiman D， -8- 200949248

Vander Borght S, Pirenne J, Nevens F, Verslype C, van Pelt J，Roskams T.，(2006) Am J Surg Pathol 30(11)， 1405-11 [非專手[J 文獻 4] Grozdanov PN, Yovchev MI, Dabeva MD.，（2006) Lab Invest 86(12)，1272-84 [非專利文獻 5] Llovet，J.M., Chen, Y·，Wurmbach, E·

Roayaie, S·， Fiel， Μ · I.， Schwartz, M·， Thung， S.N.， ❹ Khitrov, G ., Zhang, W.， Villanueva, A., Battiston， C.，

Mazzaferro, V.，Bruix, J ., Waxman, S ., Friedman, S . L ., (2006) Gastroenterology 131(6)， 1758-1767 [專利文獻 1] W02003100429 [專利文獻 2] W02006006693 [專利文獻 3] W02004022739 【發明內容】 © [發明欲解決之課題] 本發明係鑑於上述情況所完成者，其目的在於提供一 種可正確檢出肝癌組織中蛋白多醣3之表現樣態之方法。 [用以解決課題之手段] 本發明人等發現於肝癌組織中檢出蛋白多醣3抗原之 表現時，藉由組合藉熱誘導抗原賦活化法之抗原賦活化處 理以及藉蛋白酶抗原賦活化法之抗原賦活化處理，而可藉 由免疫組織化學染色法，檢出蛋白多醣3抗原之表現量或 200949248 表現樣態之差異，因而完成本發明。藉此，對於以以往之 HIER方法被認定爲蛋白多醣3爲高表現之檢體，可對應 於蛋白多醣3之表現量而階段性地區別。 亦即，本發明係提供下列之發明： [1] 一種用於在受檢體中檢出肝癌細胞之存在之體外 免疫分析方法，其特徵爲包含下列各步驟： (a) 將自上述受檢體調製後，包埋於石蠟中貼附於透 Φ 過性支撐體上之自同一受檢體至少兩個可視爲相同之一組 組織標本提供爲石蠟包埋切片； (b) 對上述一組組織標本進行脫石蠟處理； (c) 對於實施有上述（b)處理並可視爲相同之一組組織 標本之一方，藉由熱誘導抗原賦活化法施以抗原賦活化處 理，對另一方藉由蛋白酶抗原賦活化法施以抗原賦活化處 理； (d) 在適合於施以前述（c)處理之組織標本中存在之蛋 〇 白多醣3與抗蛋白多醣3抗體形成複合體之條件下，對該 標本接觸抗蛋白多醣3抗體； (e) 檢出複合體之存在，其中於存在有複合體時之受 檢體判定爲存在有肝癌細胞。 [2] 如[1]所述之方法，其中上述熱誘導抗原賦活化 法係藉由微波加熱。 [3] 如[1]所述之方法，其中上述熱誘導抗原賦活化 法係藉由高壓蒸氣鍋加熱。 [4] 如[1]至[3]之任一項所述之方法，其中上述蛋白 -10- 200949248 酶抗原賦活化法中所用之蛋白酶係選自由胃蛋白酶、胰蛋 白酶以及蛋白酶K所組成之組群。 [5] 如[1]至[4]之任一項所述之方法，其中用以檢出 複合體之檢出反應爲酵素反應。 [6] 如[1]至[5]之任一項所述之方法，其中上述抗蛋 白多醣3抗體爲結合於蛋白多醣3之C末端多胜肽之抗 體。 〇 [7]如[6]所述之方法，其中蛋白多醣3之C末端多 胜肽係由序列編號1所記載之第3 5 9號之胺基酸至第580 號之胺基酸所構成之多胜肽、或第375號之胺基酸至第 5 80號之胺基酸所構成之多胜肽。 [8] 如[6]或[7]所述之方法，其中上述抗蛋白多醣3 抗體爲GC33抗體。 [9] 如[1]至[5]之任一項所述之方法，其中上述抗蛋 白多醣3抗體爲1G12抗體。 © [10]如[1]至[9]之任一項所述之方法，其中步驟（e) 中，係對複合體之存在數値化並檢出。 [11]如[10]所述之方法，其中上述數値化係以下式 算出：

IRCp = PR + (SI-Cp) +SP

[式中， IRcP爲蛋白多醣3之表現量分數； PR爲以檢視鏡檢出上述複合體之細胞比例加以分數 化之數値； -11 - 200949248 SI-Cp爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞質中檢出有上 述複合體之染色強度加以分數化之數値； SP爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞膜中顯示完全膜 染色之細胞比例加以分數化之數値]。 [1 2]如[1 0]所述之方法，其中上述數値化係以下式 算出： IRCm = PR + (SI-Cm) +SP 〇 [式中， IRcm爲蛋白多醣3之膜局部化分數； PR爲以檢視鏡檢出上述複合體之細胞比例加以分數 化之數値； SI-Cm爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞膜中檢出有上 述複合體之染色強度加以分數化之數値； SP爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞膜中顯示完全膜 染色之細胞比例加以分數化之數値]。 © [13] —種於受檢體中存在之肝癌細胞之分類方法， 係基於[U]或[12]所述之方法所算出之分數加以分類。 [14] 一種於受檢體中決定是否投與包含抗蛋白多醣 3抗體之抗癌劑之方法，係基於[1 1]或[12]所述之方法所 算出之分數加以決定。 [15] —種對受檢體之肝癌治療中決定包含抗蛋白多 醣3抗體之抗癌劑投與量之方法，係基於[11]或[12]所述 之方法所算出之分數加以決定。 -12- 200949248 【實施方式】 組織標本 本發明書中使用之所謂術語「組織標本」意指由個 體、體液（例如血液、血清、血漿及骨髓液）、組織培養物 或組織切片等所得之任意生物學標本。作爲生物學標本使 用者較好舉例有受檢體標本。較好之受檢體標本爲由受檢 體所得之組織，更好爲受檢體之肝臟組織。至於採取肝臟 〇 組織之方法可較好地使用習知方法之切片檢查（Biopsy)。 所謂肝切片檢查意指以細長針自皮膚表面直接刺穿至肝臟 而採取肝臟組織之方法。通常針所刺穿之部位爲右胸下部 之肋骨間。於術前使用超音波顯查裝置確認穿刺部之安全 性方面，對穿刺部加以消毒。進而以自皮膚到達肝臟表面 爲止作爲麻醉對象，微小切開穿刺部之皮膚後刺穿該穿刺 針。 本發明中，爲了使組織標本於顯微鏡下可藉由透過光 ® 線觀察，將組織標本薄切至顯微鏡所使用之光線可充分透 過程度之薄度。於薄切之前階段將組織標本加以固定。亦 即，藉由於組織·細胞之蛋白質引起脫水或變性並凝固， 而加速構成組織之細胞死亡，使其構造安定化及不溶化。 首先，成爲固定對象之組織標本以手術用刀等之切割物切 取適合製作石蠟包埋切片之大小及形狀之斷片。接著，將 該斷片浸漬於用以實施固定所用之試藥之固定液中。作爲 固定液，可較好地使用甲醛，更好爲中性緩衝之甲醛。中 性緩衝之甲醛濃度係對應於組織標本特性或物性適當選 -13- 200949248 擇。濃度可在1〜5 0%，較好5~25%，更好10〜15 %之間適 當變更使用。浸漬有組織標本之固定液使用真空泵適當脫 氣。固定係將組織標本在常壓及室溫條件下於固定液中放 置數小時而實施。固定所需時間可在1小時至7天之間， 較好2小時至3天之間，又較好在3小時至24小時，更 好在4小時至16小時之範圍內適當選擇。固定後於磷酸 緩衝液等中進而適當浸漬數小時（在2小時至4 8小時，較 〇 好3小時至24小時，更好4小時至1 6小時之範圍適當選 擇之時間）。 接著，自固定所適用之組織標本，使用凍結切片法或 石蠘切片法適當地製作切片。至於凍結切片法之較佳例， 舉例有將組織投入O.C.T·化合物（Miles. Inc.)中而凍結 者，使用冷凍切片機（cryostat)(凍結切片製作裝置）予以薄 切之方法。關於石蠟切片法，藉由將固定所適用之組織標 本浸漬於包埋劑中並固定，藉此賦予均一且適度硬度。作 〇 爲包埋劑，較好使用石蠟。固定所適用之組織標本使用乙 醇加以脫水。具體而言，將組織標本依序浸漬於70%乙 醇、80 %乙醇、100 %乙醇中，藉此使該組織標本脫水。浸 漬所需時間及次數可在1小時至數日以及1次至3次之範 圍內適當選擇。又’亦可於室溫或4°C浸漬’但於4°C浸 漬時，浸漬時間較好爲整夜等之其時間長者。接著其液相 置換成二甲苯後，以石蠟包埋組織標本。其液相置換成二 甲苯所需時間可在1小時至數小時之範圍內適當選擇。此 時，可於室溫置換，亦可於置換’但於4°C置換時， -14- 200949248 置換時間較好爲整夜等之其時間長者。石蠟包埋所需時間 及次數可在1小時至數小時以及1次至4次之範圍內適當 選擇。此時，可於室溫包埋，亦可於4 °C包埋，但於4°C 包埋時，包埋時間較好爲整夜等之其時間長者。又，藉由 使用石蠟包埋反應經自動化處理之石蠟包埋裝置 (EGU60，Leica等），可適當地對組織標本進行石蠟包 埋。 〇 使如上述經石蠟包埋之組織標本黏著於木製底座上藉 此製作「塊體」，此塊體以切片機薄切成選自1至20微 米之所需厚度。經薄切之組織切片藉由靜置於透過性支持 體之載玻片上而予以固著。於此情況下，爲防止組織切片 剝離較好亦適當使用於載玻片上塗佈0.01 %聚-L-賴胺酸 (Sigma)並乾燥之載玻片。經固著之組織切片於選自數分 鐘至1小時之間適當時間內風乾。 本發明中，準備一組如上述所調製之貼附於透過性支 〇 持體上之兩個組織標本。該組織標本宜爲於組織上可視爲 相同之兩個組織標本。所謂「可視爲相同」意指相比較之 兩個組織標本其組織標本所來源之受檢體標本中大致由相 同細胞或組織所構成。例如，以鄰接切片所調製之兩個組 織標本爲可視爲相同之兩個組織標本。於本發明中若無特 別記載，則所謂「可視爲相同之兩個組織標本」意指以鄰 接切片所調製之兩個組織標本’除此之外’即使構成不以 鄰接切片所調製之兩個組織標本之細胞或組織之構成只要 爲該兩個組織標本間可視爲相同’則亦相當於「可視爲相 -15- 200949248 同之兩個組織標本」。作爲細胞或組織之構成於該兩個組 織標本間可視爲相同之情況，較好例示有如下列情況：（1) 組織切片中之平面座標上相同位置中存在有源自相同細胞 之細胞切片之情況；（2)該細胞之切片存在於該平面座標 上之相同位置之比例至少爲50%以4上，較好60%以上，更 好70%以上，又更好80%以上，再更好90%以上，最好爲 95%以上之情況等。 〇 抗原賦活化 本發明方法中，係使與由福馬林固定之抗體之反應性 得以減弱的抗原之反應性加以賦活化。本發明中，對於兩 個組織標本中之一個標本應用蛋白酶抗原賦活化法（PIER 法），對另一標本，應用熱誘導抗原賦活化法（HIER法）， 對與抗體反應時兩者之染色程度差異予以數値化。 熱誘導抗原賦活化法可適當使用由微波加熱方法或由 ® 高壓蒸氣鍋之加熱方法，或由煮沸處理之加熱方法等。以 使液溫保持於98°C之方式以7 8 0W輸出之煮沸處理時，處 理等賦活化所需之時間可自5分鐘至60分鐘監視宜選 擇，例如爲10分鐘。抗原之賦活化處理除在10mM檸檬 酸鈉緩衝液以外亦可在市售之標靶截取溶液（target retrieval solution) (DakoCytomation)等之中進行。於下述 實施例中係使用標靶截取溶液。只要作爲賦活化處理之結 果，可獲得辨識抗蛋白多醣3抗體之抗原中之抗原決定基 與抗體之結合性，而可檢出後述抗原與抗體之複合體者， -16- 200949248 則可使用任一種緩衝液，亦較好地使用水溶液。 於蛋白酶抗原賦活化法中所使用之蛋白酶並未特別限 定其種類或其由來，可適當選擇使用一般可獲得之蛋白 酶。作爲可使用之蛋白酶之例，可適當地舉例0.01N鹽酸 中之0.05 %濃度之胃蛋白酶，或PH7.6之Tris緩衝液中進 而含有0.01 %濃度之CaCl2之0.1 %濃度之胰蛋白酶、含有 10mM EDTA 及 0.5% SDS 之 ρΗ7·8 之 10mM Tris 鹽酸緩衝 〇 液中1〜5 0微克/毫升濃度之蛋白酶K等。再者使用蛋白酶 K時，其反應液之pH係在6.5至9.5之間適當選擇，亦 可適當利用 SH試藥或胰蛋白酶抑制劑或糜蛋白酶抑制 劑。如本說明書實施例中記載之HISTOFAIN HER2套組 (MONO)(NICHIREI生化科學）中所附之蛋白酶亦舉例作爲 較佳之蛋白酶具體例。蛋白酶抗原賦活化通常在37 °C進 行，但反應溫度可在25°C至50°C之範圍內適當變更。蛋 白酶抗原賦活化於37°C進行時，反應時間可在1分鐘至5 〇 小時之間適當選擇，例如可爲1 5分鐘、3 0分鐘、4 5分 鐘、1小時、2小時、3小時、4小時等。賦活化處理結束 後，施以該處理之組織標本以洗淨用緩衝液予以洗淨。洗 淨用緩衝液除較好使用PBS (磷酸鹽緩衝之食鹽水）以外， 亦可適當地使用Tris鹽酸緩衝液。通常作爲洗淨條件， 係採用於室溫洗淨5分鐘進行3次之方法，但亦可適當變 更洗淨時間及溫度。 抗蛋白多醣3抗體 -17- 200949248 本發明方法中所使用之抗蛋白多醣3抗體亦可適當使 用具有結合至蛋白多糖3之活性之任一種抗體。特別適宜 之抗體之例爲下述實施例中所揭示之GC33抗體（專利文 獻2)或1G12抗體（專利文獻1)。又，除了該等已知抗體 以外’藉由使用蛋白多醣3作爲免疫抗原而使非人類動物 免疫’可取得適用於本發明之抗蛋白多醣3抗體。專利文 獻1、專利文獻2中記載有該種抗蛋白多醣3抗體之製作 © 方法，熟悉該項技術者基於該方法亦可能獲得適當所需之 抗蛋白多醣3抗體。 抗蛋白多醣3抗體之與蛋白多醣3之結合可藉由本技 藝者已知之方法適當檢出。例如可使用ELIS A(酵素結合 免疫吸附檢定法）、EIA(酵素免疫測定法）、rie(放射免疫 測定法）或螢光免疫法。該等方法記載於一般教科書「抗 體實驗室手冊’ Harlow編輯，大衛巷，冷泉港實驗室， 1 98 8」中。 ® 作爲測定抗體對表現抗原之細胞之結合活性之方法，

舉例有記載於例如抗體實驗室手冊（Harlow編輯，大衛 巷，冷泉港實驗室，1 98 8)中第359-420頁中之方法。亦 即，可藉由使用細胞作爲抗原藉由ELISA或FACS(螢光 活化細胞分類）之原理適當地評價。於ELISA格式中，抗 體對細胞之結合活性係藉由比較由酵素反應所生成之訊號 等極而定量地評價。亦即，於使抗原強制表現之細胞加以 固定化之ELISA板中添加受檢抗體，利用辨識受檢抗體 之酵素標記抗體，檢出結合於細胞之抗體。或於FACS 200949248 中，作成受檢抗體之連續稀釋，藉由決定使抗原強制表現 之細胞之抗體結合力價（titer)而得以比較對於細胞之結合 活性。 藉由FACS格式，可測定未結合於ELIS A板等之擔體 之再緩衝液等中懸濁之細胞表面上表現之抗原與對該抗原 之抗體之結合。作爲於此等測定中所使用之流式細胞儀， 舉例有例如 FACSCantoTM II 、 FACSAria™ 、 ❹ FACSArray™ > FACSVantage™ ' F A C S C al i b ur TM (以上爲 BD Biosciences)或 EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC 5 00、EPICS XL-MCL ADC、EPICSXL ADC、Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta S C(以上爲 Beckman Coulter)等。 測定抗蛋白多醣3之對抗原之結合活性之較佳方法之 一例，舉例有使用可辨識與表現蛋白多醣3之細胞反應之 受體抗體之二次抗體之方法。表現蛋白多醣3之細胞與受 體抗體之反應，以FITC標記之二次抗體染色後，藉由 ❿ FACSCalibur (BD)進行測定，使用 CELL QUEST 軟體（BD) 解析其螢光強度。依據本方法，藉由FACS Calibur進行測 定時，其螢光強度藉由使用CELL QUEST軟體之解析方 法所得之幾何學平均之値（受檢幾何-平均値）藉由與使用 對照抗體作爲一次抗體時之對照幾何-平均値比較，可判 定抗體對抗原之結合活性。求得幾何-平均値（幾何學平均 値）之計算式記載於CELL QUEST軟體使用者指引（BD Biosciences 公司）中。 -19- 200949248 組織標本與抗蛋白多醣3抗體之反應 對於藉由熱誘導抗原賦活化法施以抗原賦活化處理之 組織標本以及藉由蛋白酶抗原賦活化法施以抗原賦活化處 理之組織標本，以抗蛋白多醣3抗體作爲一次抗體予以反 應。該反應係在適於形成抗蛋白多醣3抗體可辨識抗原中 之抗原決定基之抗原抗體複合體之條件下實施。通常，該 反應係在4 °C實施整夜或在3 7 °C實施1小時，但反應條件 G 可在可適當地形成抗體可辨識抗原中抗原決定基之抗原抗 體複合體之範圍內適當變更。例如，反應溫度可在4 °C至 50 °C之範圍內變更，反應時間可在1分鐘至7天之間變 更。於低溫實施反應時較好以較長時間反應。一次抗體反 應結束後，組織標本藉由洗淨用緩衝液予以洗淨。洗淨用 緩衝液係較好地使用PBS (磷酸鹽緩衝之食鹽水）以外，亦 可適當使用Tris鹽酸緩衝液。通常作爲洗淨條件，可採 用在室溫洗淨5分鐘實施3次之方法，但洗淨時間及溫度 © 可適當變更。 接著，對實施一次抗體反應之組織標本，使可辨識一 次抗體之二次抗體反應。通常使用藉由用以使二次抗體可 見化之標記物質預先加以標記之二次抗體。作爲標記物 質，可適當地舉例有 FITC(螢光素異硫代氫酸酯）或 Cy 2 (Amersham)、A1 e x a 4 8 8 (Μ ο 1 e c u 1 ar Probe)等之營光色 素、過氧酶或鹼磷酸酶等之酵素或金膠體等》 與二次抗體之反應，係在適合於使抗蛋白多醣3抗體 與可辨識該抗蛋白多醣3抗體之二次抗體形成抗原抗體複 -20- 200949248 合體之條件下實施。通常該反應係在室溫或37°C實施30 分鐘至〗小時，但形成該抗蛋白多醣3抗體與二次抗體之 抗原抗體複合體可在適當範圍適當變更。例如反應溫度可 在至50°C之範圍內變更，反應時間可在1分鐘至7天 之間變更。於低溫實施反應時較好以較長時間反應。二次 抗體反應結束後，組織標本以洗淨用緩衝液洗淨。洗淨用 緩衝液係較好地使用PBS(磷酸鹽緩衝之食鹽水）以外，亦 〇 可適當使用Tris鹽酸緩衝液。通常作爲洗淨條件，可採 用在室溫洗淨5分鐘實施3次之方法，但洗淨時間及溫度 可適當變更。 接著，對於施以二次抗體反應之組織標本，使可使標 記物質可見化之物質反應。使用過氧酶作爲二次抗體之標 記物質時，通常可在培育之前與0.02%過氧化氫水溶液與 pH7.2之0.1M Tris鹽酸緩衝調製爲0.1%濃度之DAB(二 胺基聯苯胺）溶液等量混合所得之反應液培育組織標本。 Q DAB以外，亦可適當選擇DAB-Ni或AEC + (以上爲DAKO 公司）等之發色基質。培育過程中，有時以顯微鏡觀察發 色程度，於確認適當發色之階段將組織標本浸漬於PBS 中藉此終止可見化反應。 於使用鹼磷酸酶作爲二次抗體之標記物質之情況下， 以含有BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸）/NBT(硝基藍四唑 鎗）（Zymed)基質溶液（於l〇mM濃度之MgCl2及28mM濃 度之NaCl之pH9.8之50mM碳酸鈉緩衝液中，以〇.4mM 濃度溶解有NBT及以0.38mM濃度溶解有BCIP者）培育 -21 - 200949248 組織標本。又，除BCIP及NBT以外，亦可適宜使用永久 紅、快速紅或Fuchsin + (以上爲DAKO)等。培育之前，亦 可與含ImM濃度之內在性鹼磷酸酶之抑制劑之氯化佐美 索（levamisole)(NACALAI TESQUE 公司）、0.1M 氯化鈉及 5 0mM氯化鎂之0.1M Tris鹽酸緩衝液（pH9.5)，再室溫培 育1分鐘至數小時。於培育過程中，經常以顯微鏡觀察， 於觀察到反應最終產物之紫色甲臍（Formazans)沉澱之階 © 段，組織標本以水洗或以含有2%聚乙烯醇之TBS使反應 停止後，以TBST(含有0.1°/。Tween 20之TBS)洗淨。使 用金膠體作爲二次抗體之標記時，於金粒子上附著有金屬 銀之金膠體藉由銀增感而可見化。銀增感方法爲本技藝已 知者。 使用FITC(螢光素異硫代氰酸酯）或Cy2(Amersham)、 Alexa 488 (Molecular Probe)等之螢光色素作爲二次抗體 之標記物質時，可以不需要可見化物質之反應步驟，可藉 © 由照射該螢光物質之激發波長之光，使用螢光顯微鏡適當 檢出所放出之光。 肝癌組織之分類及治療效果預測 已知蛋白多醣3於肝癌組織中經受消化其N末端部 分游離至血清中（專利文獻3)。因此，本發明方法中，於 使用結合至經如此消化而游離至血清中之蛋白多醣3之N 末端之部分胜肽上之抗體時，該抗體無法與經受消化後留 存於細胞表面上之C末端之部分多胜肽結合。另一方面， -22- 200949248 於本發明方法中，使用結合於c末端之部分多胜肽之抗體 時，該抗體可與經受消化後留存於細胞表面上之C末端之 部分多胜肽結合。亦即本發明中使用之抗蛋白多醣3抗體 藉由依據目的而適當選擇，而與是否經受消化無關地可檢 出留存於細胞表面上之蛋白多醣3之部分多胜肽，亦可檢 出消化之前留存於細胞表面上之經受消化後游離至血清中 之蛋白多醣3之部分多胜肽。 〇 已發現抗蛋白多醣3抗體可用於治療及預防肝癌（專 利文獻3)。可獲得該等治療用抗蛋白多醣3抗體之殺細 胞活性主要係藉由結合於留存在細胞表面上之C末端之部 分多胜肽之抗蛋白多醣3抗體之Fc部分上之效應器與補 體結合而起始之抗體依存性細胞傷害活性（ADCC活性）或 補體依存性細胞傷害活性（CD C)而發揮。因此，由肝臟組 織中是否存在有結合有抗蛋白多醣3抗體之抗原決定基之 觀點而言，由治療用抗蛋白多醣3抗體預測肝癌之治療效 〇 果時，於本發明方法中，可適當使用結合至C末端之部分 多胜肽之抗蛋白多醣3抗體。 蛋白多醣3於肝癌組織中經受消化之部位已被提示爲 以序列編號1表示之蛋白多醣3分子之第358號及第359 號之胺基酸或第3 74號與第3 75號之胺基酸之多胜肽鍵 (專利文獻3)。因此，本發明中較好使用之鍵結於C末端 部分多胜肽之抗蛋白多醣3抗體，舉例有鍵結至由序列編 號1表示之蛋白多醣3分子之第359號至第580號胺基酸 所構成之多胜肽或第375號至第5 80號胺基酸所構成之多 -23- 200949248 胜肽之抗體。 另一方面，由治療用抗蛋白多醣3抗體所產生之治療 效果，自蛋白多醣3分子之成熟化觀點加以預測時’本發 明方法中，可使用鍵結至N末端之部分多胜肽之抗蛋白 多醣3抗體。此情況下，可分別賦予由鍵結至N末端之 部分多胜肽之抗蛋白多醣3抗體所辨識之蛋白多醣3分子 作爲未更成熟化之治療標的分子、表現此等蛋白多醣3分 φ 子之肝癌細胞作爲未更成熟化之治療標的細胞之特性。鍵 結至蛋白多醣3分子之C末端之部分多胜肽之抗蛋白多醣 3抗體可與如何成熟化無關地檢出蛋白多醣3分子。另一 方面，鍵結至蛋白多醣3分子之N末端之部分多胜肽之 抗蛋白多醣3抗體雖可檢出成熟化前之蛋白多醣3分子， 但無法檢出成熟化後之蛋白多醣3分子。亦即，藉由使用 鍵結至蛋白多醣3分子之C末端之部分多胜肽之抗體與鍵 結至N末端之部分多胜肽之抗體之兩種抗體，藉由本發 © 明方法所檢出之蛋白多醣3分子以及表現蛋白多醣3分子 之肝癌細胞變成可依據成熟化度加以分類。 關於此分類方法具體記載如下。作爲一次抗體，準備 鍵結至蛋白多醣3分子之C末端之部分多胜肽之抗蛋白多 醣3抗體與鍵結至蛋白多醣3分子之N末端之部分多胜 肽之抗蛋白多醣3抗體之兩種抗體。自同一受檢者調製兩 個組織標本，對其中一標本供給鍵結至蛋白多醣3分子之 N末端之部分多胜肽之抗蛋白多醣3抗體作爲一次抗體予 以反應，對另一標本供給鍵結至蛋白多醣3分子之C末端 -24- 200949248 之部分多胜肽之抗蛋白多醣3抗體作爲一次抗體予以反 應。使用鍵結至蛋白多醣3分子之N末端之部分多胜肽 之抗蛋白多醣3抗體所檢出之蛋白多醣3分子，由其成熟 化程度之觀點觀之，可評價爲未更成熟化之分子，而表現 此等蛋白多醣3分子之肝癌細胞可評價爲更成熟化之細 胞。又，以鍵結至蛋白多醣3分子之N末端之部分多胜 肽之抗蛋白多醣3抗體雖未檢出，但使用鍵結至蛋白多醣 Φ 3分子之C末端之部分多胜肽之抗蛋白多醣3抗體所檢出 之蛋白多醣3分子，由其成熟化程度之觀點觀之，可評價 爲更成熟化之分子，而表現此等蛋白多醣3分子之肝癌細 胞可評價爲更成熟化之細胞。 鍵結至蛋白多醣3分子之N末端之部分多胜肽之抗 蛋白多醣3抗體與鍵結至蛋白多醣3分子之C末端之部分 多胜肽之抗蛋白多醣3抗體互屬於不同抗體次組群時，或 爲由不同種類之動物所生成者時，可使用一個組織標本進 Ο 行測定。此情況下，可辨識鍵結至N末端之部分多胜肽 之抗蛋白多醣3抗體之二次抗體與可辨識鍵結至C末端之 部分多胜肽之抗蛋白多醣3抗體之二次抗體，藉由以不同 種類之酵素或螢光加以標記，一個組織標本可使用兩種抗 蛋白多醣3抗體加以檢出。 與抗蛋白多醣3抗體之反應性數値化 本發明係基於抗原賦活化反應（亦即熱誘導抗原賦活 化法以及蛋白酶抗原賦活化法）之差異，而提供由蛋白多 -25- 200949248 醣3與抗蛋白多醣3抗體所形成之抗原抗體複合體於顯微 鏡下檢出程度及樣態之差異加以數値化之方法。 於第一樣態中，數値化係依據下式（1)進行： IRCp = PR + (SI-Cp) +SP [式中， IRCp爲蛋白多醣3之表現量分數； PR爲以檢視鏡檢出上述複合體之細胞比例加以分數 〇 化之數値； SI-Cp爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞質中檢出有上 述複合體之染色強度加以分數化之數値； SP爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞膜中顯示完全膜 染色之細胞比例加以分數化之數値]。 PR之分數係以下列算出： (a) 使用4倍或10倍之接物鏡於檢視鏡下之視野中細 胞中： © (i)檢出上述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲 0， (ii) 該比例未達20%之檢體分數設爲1， (iii) 該比例爲20%以上、未達50%之檢體分數設爲 2， (iv) 該比例爲50%以上之檢體分數設爲3。 SI-CP之分數係以下列算出： (b) 於檢視鏡下之視野中細胞之細胞質中： (i)前述顯微鏡使用4倍或10倍之接物鏡時檢出有上 -26- 200949248 述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲0， (ii) 前述顯微鏡使用10倍之接物鏡時爲無法判別但疑 似認爲係陽性反應之檢體分數設爲1， (iii) 使用4倍接物鏡疑似認爲係陽性反應之檢體分數 設爲2， (iv) 即使使用4倍接物鏡亦可充分辨識認爲係陽性反 應之檢體分數設爲3， 〇 (V)以4倍之接物鏡明確辨識認爲係陽性反應之檢體 分數設爲4。 SP之分數係以下列算出： (c)於檢視鏡下視野中細胞之細胞膜中檢出上述複合 體中， (i)於細胞膜中不認爲係陽性反應之檢體分數設爲0， (i i)認爲係陽性反應之細胞中未達2 0 %之細胞顯示完 全膜染色之檢體分數設爲1， © (iii)認爲係陽性反應之細胞中20%以上、未達50%之 細胞顯示完全膜染色之檢體分數設爲2， (iv)認爲係陽性反應之細胞中50%以上之細胞顯示完 全膜染色之檢體分數設爲3。 於另一樣態中，數値化係依據下式（2)進行： IRcm = PR + (SI-Cm) +SP [式中， IRcm爲蛋白多醣3之膜局部化分數； PR爲於檢視鏡下檢出上述複合體之細胞比例加以分 -27- 200949248 數化之數値； SI-Cm爲於檢視鏡下於視野中細胞之細胞膜中檢出有 上述複合體之染色強度加以分數化之數値； SP爲於檢視鏡下於視野中細胞之細胞膜中顯示完全 膜染色之細胞比例加以分數化之數値]。 PR之分數係以下列算出： (a)使用4倍或1 0倍之接物鏡於檢視鏡下之視野中細 ❹ 胞中： (i) 檢出上述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲 0， (ii) 該比例未達20%之檢體分數設爲1， (iii) 該比例爲20%以上、未達50%之檢體分數設爲 2， (iv) 該比例爲50%以上之檢體分數設爲3。 SI-Cm之分數係以下列算出： β (b)於檢視鏡下之視野中細胞之細胞質中： (i) 前述顯微鏡使用4倍或1 〇倍之接物鏡時檢出有上 述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲0， (ii) 前述顯微鏡使用10倍之接物鏡時爲無法判別但疑 似認爲係陽性反應之檢體分數設爲1， (iii) 使用4倍接物鏡無法判但以10倍接物鏡時可 充分辨識認爲係陽性反應之檢體分數設爲2， (iv) 即使使用4倍接物鏡亦可充分辨識認爲係陽性反 應之檢體分數設爲3， -28 - 200949248 (V)以4倍之接物鏡明確辨識認爲係強的陽性反應之 檢體分數設爲4。 S P之分數係以下列算出： (c)於檢視鏡下視野中細胞之細胞膜中檢出上述複合 體中， (i)於細胞膜中不認爲係陽性反應之檢體分數設爲0， (Π)認爲係陽性反應之細胞中未達2 0%之細胞顯示完 © 全膜染色之檢體分數設爲1， (iii) 認爲係陽性反應之細胞中20 %以上、未達50 %之 細胞顯示完全膜染色之檢體分數設爲2， (iv) 認爲係陽性反應之細胞中50%以上之細胞顯示完 全膜染色之檢體分數設爲3。 於此情況中，施加熱誘導抗原賦活化法之組織標本與 施加蛋白酶抗原賦活化法之組織標本各基於上述式（1)及 式（2)加以算出之分數予以決定。基於式（1)所算出之分數 © 爲反映蛋白多醣3之表現量之分數，基於式（2)所算出之 分數爲反映在蛋白多醣3之細胞膜之表現局部存在之分 數。依據本發明之數値化方法，基於蛋白多醣3之表現量 或表現樣態而對受檢體中存在之肝癌細胞加以分類變成可 能。如下述實施例所示，使用實際自肝癌患者所採取之組 織標本確認可有效實施分類。再者，即使於將決定有蛋白 多醣3之表現量之肝癌細胞株的HuH-7或HepG2移植後 之肝癌動物模型中，亦確認可有效實施該分類。 再者於本發明中，對肝癌動物模型投與治療用抗蛋白 -29 - 200949248 多醣3抗體之結果，證實依據本發明方法藉由數値化所分 類之肝癌中若蛋白多醣3之表現量與表現樣態不同’則由 治療用抗蛋白多醣3抗體引起之肝癌治療效果差異互有相 關。亦即，提示有：基於依據本發明予以數値化之分數差 異，可判斷治療用抗蛋白多醣3之治療效果差異。若基於 依據本發明數値化之方法，可預測使用含有抗蛋白多醣3 抗體作爲有效成分之肝癌治療劑之肝癌治療效果。又，若 〇 基於依據本發明數値化之方法，可決定用以在使用抗蛋白 多醣3抗體之肝癌治療中獲得所需效果所必要之治療用抗 蛋白多醣3抗體之必要投與量。 [實施例] 藉由以下實施例更詳細說明本發明，但本發明不限定 於該等實施例。 Ο (實施例1) 使用對小鼠腹部皮下移植表現蛋白多醣3之人類肝癌 細胞株之移植模型之蛋白多醣3之免疫染色 (1)細胞株 使用HuH-7細胞（人類科學硏究資源銀行）、HepG2細 胞（ATCC)作爲肝癌細胞株。HuH-7係於含有10% FBS(BIONET)之杜貝克氏改質鷹氏培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(SIGMA)中維持繼代培養， -30- 200949248

HePG2則於含10% FBS、i毫莫耳/升之MEM丙酮酸鈉 (Invitrogen)、：1 毫莫耳/升 ΜΕΜ·非必須胺基酸（Invitr〇gen) 之最小必須培養基鹰氏培養基（SIGMA)中維持繼代培養。 (2) GPC3表現量之測定 (2-1)測定方法 關於HuH-7細胞及HepG2細胞中GPC3之表現量， 〇 使用小鼠抗人類GPC3單株抗體（選殖株名：GC33，記載 於 W02006/ 006693 )，依據 QIFI-Kit(Dako Cytomation)予 以測定。測定方法係實施附屬之說明書中所記載之方法。 所使用之GC33抗體於室溫溶解後，於PBS中調製成 1毫克/毫升。作爲陰性對照組，使用將凍結乾燥狀態之 mlgG2a(l小瓶量）溶解於5 00微升「日本藥典注射用水 大塚蒸餾水」者。5x1 05個各細胞懸浮於添加有98微升之 0.5w/v% BSA (Sigma-Aldrich)之 CellWASH 細胞洗浄溶液 Φ (BECTON DICKINSON)(以下稱爲 F A C S - P B S )中。分別添 加有2微升及5微升之GC33及mIgG2a之各該懸浮液於 4°C靜置30分鐘。隨後，添加有1毫升之FACS-PBS之各 該懸浮液於4°C提供至在5000rpm離心分離操作1分鐘藉 此分劃細胞。該細胞再懸浮於98微升之FACS-PBS中。 又亦與上述操作並行進行以下操作。藉由於Q IF IKIT 中所附之校正珠粒及設定珠粒（setup bead) 100微升中添加 1毫升FACS-PBS，在4°C於5000rpm離心1分鐘操作而 洗浄。該珠粒懸浮於98微升FACS-PBS中。對於上述細 200949248 胞及珠粒每各2微升添加QIFIKIT中所附之FITC標記山 羊抗小鼠抗體，該細胞及珠粒供應於4°C進行45分鐘反 應。接著添加有1毫升FACS-PBS之上述反應液提供於4 °C在5000rpm離心分離操作1分鐘。經沉降之細胞及珠粒 懸浮於1毫升FACS-PBS中。使用全自動細胞解析裝置 EPICS-XL(Beckman Coulter)，由以使經標記之設定珠粒 測定所產生之2個峰落入測定劃分面內之方式調整輸出。 ❹ 使用全自動細胞解析裝置EPICS-XL，測定將提供至使 GC33抗體反應之細胞樣品、提供至使mIgG2a反應之細 胞樣品以及校正珠粒所發出之各螢光之平均螢光強度（MFI) 値。以校正珠粒之5個MFI値及抗體結合能力（ABC)値作 爲基礎，使用微軟Office Excel 2003 SP2(微軟公司）以最 適直線作圖。將各細胞之MFI値代入該直線之校正線求 得ABC値。自提供至使GC33抗體反應之樣品之ABC値 減去提供至使mIgG2a反應之樣品之ABC値所得之値作爲 © 抗體結合部位數。 其結果，於HuH-7中蛋白多醣3之表現量每細胞爲 1.25xl〇5個分子。於HepG2中蛋白多醣3之表現量每細 胞爲9.67xl05個分子。 (3)對小鼠腹部移植人類肝癌細胞株之移植模型之製 作

HuH_7及HepG2之各細胞於等量含有（1)中所記載之 維持繼代用培養基與 MATRI GEL Matrix(BD Bioscience) -32- 200949248 之溶液中調製成每1毫升5χ107個細胞。將各細胞移植至 小鼠中之前一天，預先將抗ASIALO GM1抗體（和光純 藥’將1小瓶內容物溶解於1毫升蒸餾水中進而以4毫升 生理食鹽水稀釋）1 〇〇微升對雄性5週齡之SCID小鼠（日 本CLEA)於腹腔內進行投與。該抗ASIALO GM1抗體（和 光純藥）係將1小瓶內容物溶解於1毫升蒸餾水中進而以 4毫升生理食鹽水稀釋藉此而調製。隔天，對該小鼠腹部 〇 皮下移植1 00微升之該各細胞懸浮液（亦即每隻小鼠5 X 1 06 個細胞）。 (4)腫瘤組織切片之製作法檢討 自（3)所製作之HepG2移植模型所採取之均一移植組 織片使用手術用刀分成四等分。對其內之一斷片以10%中 性緩衝福馬林固定24小時。經固定化之組織片隨後使用 自動包埋裝置ETP-150C(日本SAKURA FINETEK)進行石 © 蠟包埋，保存於4°C(A法）。 接著，對另一斷片使用含有4%仲甲醛之PLP固定液 (10mM濃度之NaI04、75mM濃度之離胺酸、37.5mM濃度 之磷酸緩衝液、2%濃度之仲甲醛）於4°C固定6小時後， 以PBS (磷酸緩衝生理食鹽水，10mM, PH7.4)於4°C加以 洗淨。接著將該斷片於4°C中隔夜及在室溫下2小時於丙 酮中脫水。進而，該斷片以苯甲酸甲酯清淨化1小時以及 以二甲苯清淨化1小時，包埋於上述同樣的石蠟中，保存 於 4°C(B 法）。 -33- 200949248 以A法及B法製作之石蠟包埋標本恰在應用免疫組 織染色之前，以冷凍切片機加以薄切，經風乾後供應於脫 石蠟處理並染色。 接著，另一斷片使用PLP固定液在4 °C浸漬6至8小 時後，於4°C依序浸潤於含有階段性蔗糖濃度之PBS中 (以10%蔗糖濃度之PBS浸潤4小時，以15%蔗糖濃度之 PBS浸潤4小時，以及以20%蔗糖濃度之PBS浸潤隔 〇 夜）。接著將該斷片包埋於Tissue-Tek OCT化合物（Sakura Finetechnical)中並在乾冰丙酮浴中凍結。經凍結之塊體 以冷凍切片機加以薄切，薄切切片經風乾後保存於· 8〇°C(C 法）。 另一斷片在4°C包埋於Tissue-Tek OCT化合物中並在 乾冰丙酮浴中凍結。經經凍結之塊體以冷凍切片機薄切成 複數切片後，使該切片風乾並以下述不同方法固定化。其 中之一切片於4°C下在4%仲甲醛中固定30分鐘（D法）。 © 另一切片於4 下在丙酮中固.定1〇分鐘（E法）。又另一切 片在室溫下以10%中性緩衝福馬林中固定30分鐘（F法）。 以D法、E法及F法固定之固定化切片使用Tris緩衝生 理食鹽水（TBS，50mM，pH7.4)以5分鐘洗淨三次後，風 乾並保存於-80°C。 如上述所調製之組織切片使用於以下所示之免疫組織 化學染色。作爲一次抗體，分別以濃度2.5微克/毫升及 1.0微克/毫升之濃度使用GC33抗體（IgG2a)及1G12抗體 (BioMosaic，IgGl)。染色之際，染色所必要之試藥係使 -34- 200949248 用LSAB-2套組（Dako Cytomation)同批之試藥。染色方法 係以套組所附之說明書中記載之方法實施。固定化時間爲 短時間故而未實施抗原賦活化。於此免疫組織化學染色過 程中所形成之抗原抗體複合體藉由過氧化酶-二胺基聯苯 胺（DAB)反應而可見化。作爲對比染色則使用蘇木素 (hematoxylin)»又，作爲一次抗體之對照抗體，於GC33 之情況係使用小鼠IgG2及於1G12之情況係使用IgGl。 〇 對各每方法對3例加以評價，其結果示於表1。 [表1] PK SI Sl· GC33 1612 GC33 1G12 GC33 1612 1 地 MH Η L ML ΜΗ Η 1* 2* 3+ *♦ 5+ 1* 2* 3+ 4+ 1 n D) I I m A 0 1 2 α 1 2 0 0 0 t 2 D 0 2 1 0 0 0 2 1 0 3 0 0 B 0 0 0 3 D 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 1 2 0 0 0 a 0 2 1 C 0 0 0 3 0 0 0 3 3 0 0 0 0 3 0 0 a 0 3 0 0 a 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 S 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 3 0 0 E 0 0 0 3 0 0 0 3 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 a 0 0 F 0 0 0 3 0 0 0 3 3 Q 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 3 0 0

A : 24小時固定，無抗原賦活化處理 B: 24小時固定，藉高壓蒸氣鍋進行抗原賦活化處理 C: 24小時固定，藉微波進行抗原賦活化處理 D: 24小時固定，藉蛋白酶處理進行抗原賦活化處理 E: 7天固定，無抗原賦活化處理 F: 7天固定，藉高壓蒸氣鍋進行抗原賦活化處理 於免疫染色中之染色性藉由以下所示之參數加以等級 化。亦即： -35- 200949248 關於PR(陽性細胞率）等級，係以下列決定PR等級： 使用4倍或ίο被接物鏡於檢視鏡下視野中的細胞 中： (i) 檢出上述複合體之細胞比例爲50%以下之標本記爲 「L」， (ii) 檢出上述複合體之細胞比例爲50%以上、未達 7 0 %之標本記爲「M L」， φ (iii)檢出上述複合體之細胞比例爲70%以上、未達 9 0 %之標本記爲「Μ Η」， (iv)檢出上述複合體之細胞比例爲90 %以上之標本記 爲「Η」。 關於SI(染色強度分數）係以下列決定SI分數： (i) 顯示輕微陽性染色之標本記爲「+1」， (ii) 顯示弱陽性染色之標本記爲「+2」， (iii) 伴隨有中度陽性及/或強陽性而顯示弱陽性染色 © 之標本記爲「+3」， (iv) 顯示中度陽性染色之標本記爲^ +4」， (v) 顯示強陽性染色之標本記爲「+5」。 關於SP(細胞膜染色性）係以下列決定SP分數： 使用4倍或1 0被接物鏡於檢視鏡下視野中的細胞 中： (i)細胞僅有細胞膜之一部分經染色之標本記爲 r I j ， (ii)大部分細胞之細胞膜之一部分經染色，一部分的 -36- 200949248 細胞之細胞膜以圓周狀被染色之標本記爲「II」， (Π)大部分細胞之細胞膜以圓周狀被染色之標本記爲 「ΙΠ」。 SI的分數各等級（+1、+2、+4及+5)之標準染色像示 於圖1。A表示SI係+1之標本，B表示SI係+ 2之標本， C表示SI係+4之標本，D表示SI係+5之標本。又，SP 的分數各等級（+ 1、+11及+III)之染色像示於圖2。八表示 〇 SP係I之標本，B表示SI係III之標本。 以C法至F法各方法所調製之標本之SI以及SP等 級均低，顯示無法獲得充分之染色像。又，於該標本中亦 無法保有形態構造。於A法及B法比較中，以B法所調 製之標本判定SI及SP等級均高（SI爲+3至+5，SP爲II 或III)，PR等級亦判定爲90%以上的細胞爲陽性（H)。另 —方面’以A法所調製之標本判定SI爲+3至+5，SP爲I 或II，PR等級亦判定爲L至MH。GC33抗體與1G12抗 ® 體之不同點爲GC33抗體均獲得比1G12抗體更強的染色 像。 (5)腫瘤組織切片製作時之固定化時間及抗原賦活化 法之檢討 自以（3)製作之HepG2移植模型採取之均—移植組織 片之固定化時間以如下方式進行探討。於（4)所記載之A 法中調製以1 0%中性緩衝福馬林以固定時間24小時及7 天所得之標本。又以各固定時間所調製之標本分別藉以下 -37- 200949248 記載之高壓蒸氣鍋、微波、蛋白酶中任一種賦活化法加以 賦活化。標的賦活溶液PH6(DAK0)經10倍稀釋之溶液 中，標本於121 °C進行1〇分鐘高壓蒸氣鍋處理，藉此調製 經高壓蒸氣鍋而賦活化之標本。於相同溶液中使標本於 780W中加熱5分鐘重複4次藉此調製經微波而賦活化之 標本。另外亦調製以 HistofineHer 2 套組 (M0N0)(NICHIREI BIOSCIENCES)所附之 AR 試藥在室溫 ❹ 下反應5分鐘之標本。 如上述所調製之組織切片使用於以下所示之免疫組織 化學染色。作爲一次抗體，分別以濃度2.5微克/毫升及 1.0微克/毫升之濃度使用GC33抗體（IgG2a)及1G12抗體 (BioMosaic，IgGl)。染色之際，染色所必要之試藥係使 用LSAB-2套組（Dako Cytomation)同批之試藥。染色方法 係以套組所附之說明書中記載之方法實施。固定化時間爲 短時間故而未實施抗原賦活化。於此免疫組織化學染色過 ® 程中所形成之抗原抗體複合體藉由過氧化酶-二胺基聯苯 胺（DAB)反應而可見化。作爲對比染色則使用蘇木素 (hematoxylin)。又，作爲一次抗體之對照抗體，於GC33 之情況係使用小鼠IgG2及於1G12之情況係使用IgGl。 對使用各固定化時間及各賦活化反應之標本各以3例加以 評價，其結果示於表2。抗原賦活化法之比較中，微波法 獲得顯示出比高壓蒸氣鍋法些許優異之SI及SP等級結 果。另一方面，藉由蛋白酶法進行抗原賦活化處理之標 本，關於其PR等級以及SI分數且SP分數均顯示優於其 -38- 200949248 他抗原賦活化處理之標本。 [表2] 拽 SI SP GC33 1G12 GC33 1612 6C33 1012 L ML ΜΗ Η L ML ΜΗ Η 1+ ζ+ 3+ 4+ Η 2+ 3， 4+ 5+ I η m 1 S m A 0 1 2 0 1 2 0 0 0 2 0 0 2 1 0 0 0 2 1 0 3 0 0 8 0 0 0 3 0 0 0 3 0 2 1 0 3 0 0 1 2 0 3 0 0 1 2 0 0 ΰ 0 0 3 0 0 α 3 Q t 0 2 α 0 0 1 2 0 1 2 0 \ 2 0 D 0 0 0 8 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 3 0 0 0 1 2 E 2 1 0 α 1 2 0 0 1 2 ρ 0 0 2 0 1 0 0 3 0 0 3 0 0 F 1 0 0 2 0 0 0 8 2 0 1 0 0 0 2 0 1 0 3 0 0 2 1 0 G 0 0 1 2 0 0 0 3 0 2 0 1 0 α 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 Η 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0 0 2 1 α 0 0 3 0 0 2 1 0 3 0 Ο A : 24小時固定，無抗原賦活化處理 B: 24小時固定，藉高壓蒸氣鍋進行抗原賦活化處理 C: 24小時固定，藉微波進行抗原賦活化處理 D: 24小時固定，藉蛋白酶處理進行抗原賦活化處理 E: 7天固定，無抗原賦活化處理 F: 7天固定，藉高壓蒸氣鍋進行抗原賦活化處理 G: 7天固定，藉微波進行抗原賦活化處理

H: 7天固定，藉蛋白酶進行抗原賦活化處理 (6)腫瘤組織切片之免疫組織化學染色 (6_1)組織標本之製作及染色 自（2)所製作之移植模型採取之移植組織片藉由於 1 〇%中性緩衝福馬林中浸漬7天而予以固定，接著依據一 般方法製作該組織片之石蠟包埋塊體標本。自此塊體標本 薄切下來之組織切片使用於以下所示之免疫組織化學染 色。 -39- 200949248 作爲一次抗體，使用GC3 3抗體（IgG2a)。染色之際， 染色所必要之試藥係使用HISTOFINE HER2套組（MONO) (NICHIREI BIOSCIENCES)同批之試藥。除使用 GC33抗 體作爲一次抗體以外，染色方法係以套組所附之說明書中 記載之方法實施。又，作爲抗原賦活化處理，係實施蛋白 酶處理（提供於使用同一套組所附之蛋白酶於室溫反應5 分鐘之處理）或於經 10倍稀釋之標的賦活溶液 〇 (DakoCytomation)中於1 2 1 °C進行1 〇分鐘高壓蒸氣鍋處 理。於此免疫組織化學染色過程中所形成之抗原抗體複合 體藉由過氧化酶-二胺基聯苯胺（DAB)反應而可見化。作爲 對比染色則使用蘇木素（hematoxylin)。又，作爲一次抗體 .之對照抗體，係使用小鼠IgG2。 (6-2)染色結果之評價 使用小鼠抗人類蛋白多醣3抗體以免疫染色所得之染 色性，藉由下述所示之3個參數（陽性細胞率：PR;染色 〇 強度：SI，細胞膜染色圖形：SP)加以評價。 藉由下述方法使各參數數値化。亦即，PR(陽性細胞 率）値係以下列算出PR分數： 使用4倍或10倍之接物鏡於檢視鏡下之視野中的細 胞中： (i) 檢出上述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲 0， (ii) 該比例未達20%之檢體分數設爲1， (iii) 該比例爲20%以上、未達50%之檢體分數設爲 -40- 200949248 2， (iv)該比例爲50%以上之檢體分數設爲3。 反映細胞質染色性之（SI-Cp)(細胞質染色強度）値係以 如下算出SI-Cp分數： 於檢視鏡下之視野中細胞之細胞質中： (i)前述檢視鏡使用4倍或10倍之接物鏡時檢出有上 述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲〇， ❹ (ii)前述檢視鏡使用10倍之接物鏡時爲無法判別但疑 似認爲係陽性反應之檢體分數設爲1， (iii) 使用4倍接物鏡疑似認爲係陽性反應之檢體分數 設爲2， (iv) 即使使用4倍接物鏡亦可充分辨識認爲係陽性反 應之檢體分數設爲3， (v) 以4倍之接物鏡明確辨識認爲係強的陽性反應之 檢體分數設爲4。 ® 反映細胞膜染色性之（SI-Cm)(細胞膜染色強度）値係 以如下算出SI-Cm分數： 於檢視鏡下之視野中細胞之細胞膜中： (i) 前述檢視鏡使用4倍或10倍之接物鏡時檢出有·上 述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲〇， (ii) 前述檢視鏡使用1〇倍之接物鏡時爲無法判別{旦_ 似認爲係陽性反應之檢體分數設爲1， (iii) 前述檢視鏡使用4倍之接物鏡時爲無法 1〇倍接物鏡可充分辨識認爲係陽性反應之檢體分 -41 - 200949248 2， (iv) 即使使用4倍接物鏡亦可充分辨識認爲係陽性反 應之檢體分數設爲3， (v) 以4倍之接物鏡明確辨識認爲係強的陽性反應之 檢體分數設爲4。 SP(細胞膜染色圖形）値係以如下算出SP分數： 於檢視鏡下視野中細胞之細胞膜中檢出上述複合體 ❹ 中， (i) 於細胞膜中不認爲係陽性反應之檢體分數設爲0， (ii) 認爲係陽性反應之細胞中未達20%之細胞顯示完 全膜染色之檢體分數設爲1， (iii) 認爲係陽性反應之細胞中20%以上、未達50%之 細胞顯示完全膜染色之檢體分數設爲2， (iv) 認爲係陽性反應之細胞中5 0%以上之細胞顯示完 全膜染色之檢體分數設爲3。 ® 又，使用SI-Cm算出之總分數記爲IRCm，使用SI-Cp 算出之總分數記爲IRCp。 (6-3)染色性評價 使源自移植有HuH-7及HepG2之動物模型之組織標 本經高壓蒸氣鍋處理時之染色像顯示於圖3。A表示自 HuH-7移植模型所調製之切片藉高壓蒸氣鍋處理進行熱誘 導抗原賦活化處理之標本染色像，B表示自HuH-7移植模 型所調製之切片經蛋白酶抗原賦活化處理之標本染色像， C表示自HepG2移植模型所調製之切片藉高壓蒸氣鍋處 -42- 200949248 理進行熱誘導抗原賦活化處理之標本染色像’ D表示自 HepG2移植模型所調製之切片經蛋白酶抗原賦活化處理之 標本染色像》 又，個別染色參數分數顯示於表3。自源自移植有 HuH-7及HepG2之動物模型之組織標本所算出之IRcP値 均爲7，HuH-7與HepG2之間並未觀察到其値差異。又， 該等之IRCm値均爲5，並未見到兩者間其値之差（表3及 圖 3)。 [表3] 細胞株 每細胞表現量 陽性南 田胞率 細臓染色性等級 高壓蒸氣鍋 蛋白酶 高壓蒸氣鍋 蛋白酶 HuH-7 1.25x10s 90%< 50%> 1 2 HepG2 9.67χ105 90%< 90%< 2 3 另一方面，對源自移植有HuH-7及HepG2之動物模 Φ 型之組織標本施以蛋白酶處理時之個別染色參數之分數亦 示於表3。觀察到自施以蛋白酶處理之組織標本所得之 SI-Cm及SI-Cp之分數與自經高壓蒸氣鍋處理之標本所得 之該等値相比有較高之傾向。自個別染色參數所算出之總 分數，於自移植有HuH-7及HepG2之組織標本所得之 IRcP値分別爲4及8。又，於自移植有HuH-7及HepG2 之組織標本所得之IRCm値分別爲4及9(表3及圖3)。如 於圖3最下段之照片所示，於使經蛋白酶處理之組織標本 .染色之情況，可分別明確區別出未表現蛋白多醣3之細 -43- 200949248 胞、中度表現蛋白多醣3之細胞、強烈表現蛋白多醣3之 細胞。相對於此，於使經高壓蒸氣鍋處理之組織標本染色 之情況，得到定量性。更且，於使經高壓蒸氣鍋處理之組 織標本染色之情況，頻繁地辨識到對炎症細胞等之非特異 反應。 由以上結果顯示，與高壓蒸氣鍋處理比較之藉蛋白酶 處理之抗原賦活化爲可更正確地反映蛋白多醣3表現量差 Ο 異之方法。又，由組織標本之細胞膜染色性之觀點觀之’ 明顯看出與高壓蒸氣鍋處理相較蛋白酶處理者較優。 (實施例2) 使用人類肝癌細胞組織標本於GPC3免疫染色中藉由 蛋白酶引起之抗原賦活化效果 (1)人類肝癌細胞樣品中免疫組織化學染色 (1-1)標本製作及染色方法 人類肝癌細胞樣品於1 〇%中性緩衝福馬林中浸漬一定 時間以上加以固定。接著依據一般方法製作石蠟包埋之塊 體標本。自上述塊體薄切下來之組織切片使用於免疫組織 化學染色。免疫組織化學染色藉由與實施例1同樣方法實 施。 (1_2)染色結果之評價方法 基於實施例1(6-2)所記載，小鼠抗人類GPC3抗體免 疫染色所得之染色性藉由下述所示之3個參數（陽性細胞 -44- 200949248 率：PR，染色強度：SI，細胞膜染色圖形：SP)加以評 價。 藉由下述方法使各參數數値化。亦即，PR(陽性細胞 率）値係以下列算出PR分數： 使用4倍或10倍之接物鏡於檢視鏡下之視野中的細 胞中： (i) 檢出上述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲 φ 〇， (ii) 該比例未達20%之檢體分數設爲1， (iii) 該比例爲20%以上、未達50%之檢體分數設爲 2， (iv) 該比例爲50%以上之檢體分數設爲3。 反映細胞質染色性之（SI-Cp)(細胞質染色強度）値係以 如下算出SI-Cp分數： 於檢視鏡下之視野中細胞之細胞質中： © U)前述檢視鏡使用4倍或10倍之接物鏡時檢出有上 述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲0， (ii) 前述檢視鏡使用10倍之接物鏡時爲無法判別但疑 似認爲係陽性反應之檢體分數設爲1， (iii) 使用4倍接物鏡疑似認爲係陽性反應之檢體分數 設爲2， (iv) 即使使用4倍接物鏡亦可充分辨識認爲係陽性反 應之檢體分數設爲3， (v) 以4倍之接物鏡明確辨識認爲係強的陽性反應之 -45- 200949248 檢體分數設爲4。 反映細胞膜染色性之（SI-Cm)(細胞膜染色強度）値係 以如下算出SI-Cm分數： 於檢視鏡下之視野中細胞之細胞膜中： (i)前述檢視鏡使用4倍或10倍之接物鏡時檢出有上 述複合體之細胞比例爲零之檢體分數設爲〇， (Π)前述檢視鏡使用10倍之接物鏡時爲無法判別但疑 © 似認爲係陽性反應之檢體分數設爲1， (iii) 前述檢視鏡使用4倍之接物鏡時爲無法判但以 1 〇倍接物鏡可充分辨識認爲係陽性反應之檢體分數設爲 2， (iv) 即使使用4倍接物鏡亦可充分辨識認爲係陽性反 應之檢體分數設爲3， (v) 以4倍之接物鏡明確辨識認爲係強的陽性反應之 檢體分數設爲4。 ® SP(細胞膜染色圖形）値係以如下算出SP分數： 於檢視鏡下視野中細胞之細胞膜中檢出上述複合體 中， (i)於細胞膜中不認爲係陽性反應之檢體分數設爲0， (i i)認爲係陽性反應之細胞中未達2 0 %之細胞顯示完 全膜染色之檢體分數設爲1， (i i i)認爲係陽性反應之細胞中2 0 %以上、未達5 0 %之 細胞顯示完全膜染色之檢體分數設爲2， (i v)認爲係陽性反應之細胞中5 0 %以上之細胞顯示完 -46 - 200949248 全膜染色之檢體分數設爲3。 又同時，亦對非特異染色（背景）程度（由炎症性細胞 或間質之染色性加以判斷）進行評價。 (1-3)結果及結論 抗原賦活化處理之標本之染色像示於圖4。A表示自 症狀例A之檢體所調製之切片藉高壓蒸氣鍋處理進行熱 誘導抗原賦活化處理之標本染色像，B表示自症狀例A之 〇 檢體所調製之切片經蛋白酶抗原賦活化處理之標本染色 像，C表示自症狀例B之檢體所調製之切片藉高壓蒸氣鍋 處理進行熱誘導抗原賦活化處理之標本染色像，D表示自 症狀例B之檢體所調製之切片經蛋白酶抗原賦活化處理之 標本染色像，E表示自症狀例C之檢體所調製之切片藉高 壓蒸氣鍋處理進行熱誘導抗原賦活化處理之標本染色像， F表示自症狀例C之檢體所調製之切片經蛋白酶抗原賦活 化處理之標本染色像。 ® 如圖4及表4所示，於經高壓蒸氣鍋處理之組織標本 中，於症狀例A、B、C均於圖中之肝細胞癌區域中，PR 分數爲3(50%以上之區域爲陽性）。又，於膜染色強度及 膜染色圖形中，相對於症狀例A及B之未見到膜局部存 在（SI-Cm = 0以及SP-Cm = 0)，於症狀例C辨識到膜表現， 分數分別爲SI-Cm=l、SP-Cm = 2。又’於任一症狀例中’ 於炎症性細胞或間質中，有辨識到如圖4症狀例B之照片 所示之非特異陽性反應之傾向。 -47- 200949248 [表4] 參數 抗原賦活化法 餓例A 例 B 織例C PR 高壓蒸氣鍋 3 3 3 蛋白酶 1 2 3 SI-CP 高壓蒸氣鍋 3 3 3 蛋白酶 1 2 3 SI-CM 高壓蒸氣鍋 0 0 1 蛋白酶 1 3 4 SP 高壓蒸氣鍋 0 0 2 蛋白酶 1 2 3 另一方面，於經蛋白酶處理之組織標本中，PR分數 於症狀例A爲1 (未達2 0%之區域爲陽性），症狀例B爲 2 (2 0- 5 0%之區域爲陽性），症狀例C爲3(50%以上之區域 爲陽性）。又，關於膜染色強度及膜染色圖形，症狀例A 之各分數爲SI-Cm=l及SP-Cm=l。又，症狀例B之各分 數爲SI-Cm = 3及SP-Cm = 2。於症狀例C中，辨識到明確 地膜表現，其各分數分別爲SI-Cm = 4及SP-Cm = 3。又， 不同於經高壓蒸氣鍋處理之組織標本，經蛋白酶處理之組 織標本幾乎未辨識到非特異陽性反應。 由以上結果提示，與高壓蒸氣鍋處理比較，蛋白酶處 理進行之抗原賦活化法有可能爲在使用臨床肝細胞癌樣品 之GPC3免疫染色中，可更正確地反映GPC3表現量差異 之方法。又’亦可明瞭即使細胞膜染色性，蛋白酶處理也 優異。再者’已提示於蛋白酶處理法，由於非特異陽性反 應爲最小化’故可更明確地捕捉抗GPC3抗體引起之特異 陽性反應。 -48 - 200949248 (實施例3) 抗GPC3抗體對GPC3表現人類肝癌細胞株移植之小 鼠模型之藥效 (1) 細胞株 使用HuH-7細胞及HepG2細胞作爲供移植之細胞。 〇 HuH-7係於含有1 〇% FBS(BIONET)之杜貝克氏改質鹰氏 培養基（SIGMA)中維持繼代培養，HepG2則於含10% FBS、1毫莫耳/升之MEM丙酮酸鈉（Invitrogen)、1毫莫 耳/升MEM-非必須胺基酸（Invitrogen)之最小必須培養基 鷹氏培養基（SIGMA)中維持繼代培養。 -49- 200949248 (3) 投與抗體之調製 於投與人類化抗人類GPC 3單株抗體（選殖株名： hGC33’記載於公開申請號W0200 6/006693)當天，使用 經過濾滅菌之PBS調製成〇·5毫克/毫升、毫克/毫升 或0.05毫克/毫升作爲治療用抗體，使用作爲分別對5毫 克/公斤投與群、1毫克/公斤投與群、〇·5毫克/公斤投與 群之投與試料。 ❹ (4) 抗體投與 對於如（2)所記載般製作之HuH-7細胞移植小鼠模型 於其移植後第20天起，對HepG2細胞移植小鼠模型於其 移植後第26天起，各於每週丨次，於三週之間，由尾靜 脈以10毫升/公斤之用量投與上述（3)所調製之投與試料。 作爲陰性對照，以經過濾滅菌之P B S (載劑）與上述同樣於 每週1次’於三週之間，由尾靜脈以10毫升/公斤之用量 ® 投與。各群均由每群5〜6隻小鼠所構成。 (5) 抗腫瘤效果之評價 於hGC33抗體之人類肝癌移植小鼠模型中之抗腫瘤 效果以腫瘤體積之經時變化（圖5)及最終投與日後一週後 之腫瘤濕重量（圖5B)加以評價。圖5A爲表示於HepG2移 植小鼠模型中腫瘤體積之經時變化之圖。菱形表示載劑投 與群，四角型表示以1毫克/公斤投與hGC33抗體之投與 群，圓圈表示以5毫克/公斤投與hGC33抗體之投與群之 -50- 200949248 腫瘤體積之經時變化。投與hGC33抗體之時點以箭頭表 示。圖中*表示由顯著性檢定所得之顯著水準P爲 P<〇.05。又，圖中"表示由顯著性檢定所得之顯著水準P 爲P<0_0001。圖5B爲表示於HuH-7移植小鼠模型中腫瘤 體積之經時變化之圖。菱形表示載劑投與群，四角型表示 以1毫克/公斤投與hGC33抗體之投與群，圓圈表示以5 毫克/公斤投與hGC33抗體之投與群之腫瘤體積之經時變 〇 化。投與hGC33抗體之時點以箭頭表示。圖中*表示由顯 著性檢定所得之顯著水準P爲P<0.05。又，圖中**表示 由顯著性檢定所得之顯著水準p爲p<〇.〇〇〇l。圖5C爲表 示於HepG2移植小鼠模型中自最終投與日至一週後之腫 瘤濕重量之圖。圖中*表示由顯著性檢定所得之顯著水準 P爲P<0.05。又，圖中**表示由顯著性檢定所得之顯著水 準P爲Ρ<〇_〇〇〇1。圖5D爲表示於HuH-7移植小鼠模型中 自最終投與日至一週後之腫瘤濕重量之圖。圖中*表不由 顯著性檢定所得之顯著水準p爲p<0.05。又’圖中**表 示由顯著性檢定所得之顯著水準？爲p<0_000 1。 於統計解析之際係使用SAS前臨床包裝（SAS協會）° 使用最終測定日之腫瘤體積’以Dunnett型多重比較法評 價顯著性檢定。其結果’如圖5 A及圖5 B所示’於 hGC3 3抗體投與群中腫瘤之增殖’相較於載劑投與群認爲 受到有意義地抑制。又，明顯了解抗體藥效於HepG2細 胞移植模型中比較強’於HuH-7細胞移植模型中比較 弱。 -51 - 200949248 由以上，由藉由蛋白酶抗原賦活化法所調製之組織標 本之免疫組織染色之解析結果，可明確了解若抗原之表現 量高且顯示細胞膜局部存在性之表現樣態則對於經判定之 移植有HePG2細胞之小鼠模型顯示高的抗腫瘤效果。相 對於此，由前述解析結果，可明確了解若抗原表現量低則 對於經診斷之移植有HuH-7細胞之小鼠模型顯示低的抗 腫瘤效果。此種差異係藉由以往熱誘導抗原賦活化法解析 〇 所無法導出之結論，可明確了解藉由組合以往之熱誘導抗 原賦活化法與蛋白酶抗原賦活化法可有效判定GPC3抗體 的藥效。 本說明書中引用之所有發行刊物、專利及專利申請案 直接倂入本說明書中作爲參考。 【圖式簡單說明】 圖1爲顯示SI之分數之各等級之圖。 © 圖2爲顯示SP之分數之各等級之圖。 圖3爲顯示HuH-7及HepG2細胞移植模型之標本染 色結果圖。 圖4爲顯示由人類肝癌之臨床檢體所調製之標本染色 結果圖。 圖5A爲表示於hGC33抗體之人類肝癌移植小鼠模型 中抗腫瘤效果之圖。 圖5B爲表示於hGC33抗體之人類肝癌移植小鼠模型 中抗腫瘤效果之圖。 -52- 200949248

圖5C爲表示於hGC33抗體之人類肝癌移植小鼠模型 中抗腫瘤效果之圖。 圖5D爲表示於hGC33抗體之人類肝癌移植小鼠模型 中抗腫瘤效果之圖。 -53- 200949248 773945 序列表 <110> University of Miyazaki; Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha/ <120> Detection of Molecules Specific to Hepatocarcinoma <130> PCG-9025TW i <150> JP2008-068316 / <151> 2008-03-17 / <160> 1 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 580 <21Z> PRT <213> homo sapiens <400> 1

Met Ala Gly Thr Vai Arg Thr Ala Cys Leu Vat Val Ala Met Leu Leu IS 10 15

Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gin Ala Gin Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30

Ala Thr Cys His Gin Val Arg Ser Phe Phe Gin Arg Leu Gin Pro Gly 35 40 45

Leu Lys Trp Val Pro G!u Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gin Val 50 55 60

Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys

65 70 75 80

Tyr Gin Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gin Leu Leu Gin Ser Ala 85 90 95

Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Me lie Gin Asn Ala Ala Val Phe Gin 100 105 110

Glu Ala Phe Glu lie Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125

Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gin Ala Phe Glu Phe 130 135 140

Va! Gly Glu Phe Phe Tbr Asp Val Ser Leu Tyr lie Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 lie Asn Vat Asp Asp Met Val Asn Gtu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175

Val Me Tyr Thr Gin Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190

Asp Me Asn Gfu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 19S 200 205

Gly Asn Phe Pro Lys Leu lie Met Thr Gin Val Ser Lys Ser Leu Gin 210 215 220

Val Thr Arg lie Phe Leu Gin Ala Leu Asn Leu Gly lie Glu Va! lie 225 230 235 240

Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255

Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gin Gly Leu Wet Met Val Lys 260 265 270

Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Vat Met Gin Gly Cys Met Ata Gly

275 280 285

Val Val Glu lie Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Me Leu Ser Leu Glu 290 295 300

Glu Leu Vai Asn Gly Met Tyr Arg lie Tyr Asp Met Glu Asn Vat Leu 305 310 315 320

Leu Gly Leu Phe Ser Thr He His Asp Ser He Gin Tyr Vaf Gin Lys 325 330 335

Asn Ala Gly Lys Le崎Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 340 345 350

Gin Gin Arg Gin Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe tie 355 360 365

Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Vai Glu His Glu Glu Thr Leu 370 375 380

Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu lie Gin Lys Leu Lys Ser Phe Me Ser 385 390 395 400

Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr lie Cys Ser His Ser Pro Val Ala 405 410 415

Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gin Glu Leu Val Glu Arg Tyr 420 , 425 430

Ser Girt Lys Aia Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gin Phe Asn Leu His 435 440 445

Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gin lie lie Asp 450 455 460

Lys Leu Lys His lie Asn Gin Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys 465 470 475 480

Gfy Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly 485 490 495 200949248

Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile 61y Gly Ser Gly Asp Gly 500 505 510

Met lie Lys Val Lys Asn Gtn Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr 515 520 525

Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro 530 535 540

Lys Asp Asn Glu lie Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser 545 550 555 560

Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala lie Ser Val Val Cys Phe Phe 565 570 575

Phe Leu Val His 580

-2-

Claims (1)

1. 200949248 七、申請專利範圍 1. —種用於在受檢體中檢出肝癌細胞之存在之體外 免疫分析方法，其特徵爲包含下列各步驟： (a) 將自上述受檢體調製後，包埋於石蠟中貼附於透 過性支撐體上之自同一受檢體至少兩個可視爲相同之一組 組織標本提供爲石蠟包埋切片； (b) 對上述一組組織標本進行脫石蠟處理； © (c)對於實施有上述（b)處理並可視爲相同之一組組織 標本之一方，藉由熱誘導抗原賦活化法施以抗原賦活化處 理，對另一方藉由蛋白酶抗原賦活化法施以抗原賦活化處 理； (d) 在適合於施以前述（c)處理之組織標本中存在之蛋 白多醣3與抗蛋白多醣3抗體形成複合體之條件下，對該 標本接觸抗蛋白多醣3抗體； (e) 檢出複合體之存在，其中於存在有複合體時之受 ® 檢體判定爲存在有肝癌細胞。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中上述熱誘導 抗原賦活化法係藉由微波加熱。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中上述熱誘導 抗原賦活化法係藉由高壓蒸氣鍋加熱。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其 中上述蛋白酶抗原賦活化法中所用之蛋白酶係選自由胃蛋 白酶、胰蛋白酶以及蛋白酶K所組成之組群。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 200949248 中用以檢出複合體之檢出反應爲酵素反應。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其 中上述抗蛋白多醣3抗體爲結合於蛋白多醣3之C末端多 胜肽之抗體。 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中蛋白多醣3 之C末端多胜肽係由序列編號1所記載之第3 5 9號之胺基 酸至第580號之胺基酸所構成之多胜肽、或第375號之胺 Ο 基酸至第5 80號之胺基酸所構成之多胜肽。 8. 如申請專利範圍第6或7項之方法，其中上述抗 蛋白多醣3抗體爲GC33抗體。 9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其 中上述抗蛋白多醣3抗體爲1G12抗體。 10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之方法，其 中步驟（e)中，係對複合體之存在數値化並檢出。 11. 如申請專利範圍第1〇項之方法，其中上述數値 @ 化;係以下式算出： IRCp = PR + (SI-Cp) +SP [式中， IRCp爲蛋白多醣3之表現量分數； PR爲以檢視鏡檢出上述複合體之細胞比例加以分數 化之數値； SI-Cp爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞質中檢出有上 述複合體之染色強度加以分數化之數値； SP爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞膜中顯示完全膜 200949248 染色之細胞比例加以分數化之數値]。 12. 如申請專利範圍第10項之方法，其中上述數値 化係以下式算出： IR〇m = PR + (SI-Cm) +SP [式中， IRCm爲蛋白多醣3之膜局部化分數； PR爲以檢視鏡檢出上述複合體之細胞比例加以分數 〇 化之數値； SI-Cm爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞膜中檢出有上 述複合體之染色強度加以分數化之數値； SP爲以檢視鏡於視野中細胞之細胞膜中顯示完全膜 染色之細胞比例加以分數化之數値]。 13. —種於受檢體中存在之肝癌細胞之分類方法，係 基於申請專利範圍第11或12項之方法所算出之分數加以 分類。 ® 14. —種於受檢體中決定是否投與包含抗蛋白多醣3 抗體之抗癌劑之方法，係基於申請專利範圍第11或12項 之方法所算出之分數加以決定。 15. —種對受檢體之肝癌治療中決定包含抗蛋白多醣 3抗體之抗癌劑投與量之方法，係基於申請專利範圍第11 或12項之方法所算出之分數加以決定。