KR20150014420A

KR20150014420A - 아넥신 단백질의 검출을 위한 나노면역센서 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20150014420A
Application number: KR1020140190830A
Authority: KR
Inventors: 이재준; 김영준; 만부부 라만 모하마드
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-02-06
Also published as: KR101636011B1

Abstract

본 발명은 암 바이오마커 단백질(biomarker protein)의 검출 및 정량화를 위한 중량분석법(gravimetry) 기반의 나노면역센서(nanoimmunosensor)에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 폐암(lung adenocarcinomas, AdC)과 전립선암(prostate cancer, PCa)의 바이오마커 단백질인 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)를 비표지 방식(label-free)일 뿐만 아니라 초고감도로 검출할 수 있는 나노면역센서 및 이의 제조방법을 제공함으로써, 종래 기술의 문제점인 복잡하고 시간 및 비용이 많이 소요된다는 점뿐만 아니라 인력도 많이 투입되어야 한다는 점을 해결할 수 있고, 비표지 방식(label-free)이므로 암의 진단을 매우 간편하게 할 수 있으며, 침습(혈액) 및 비침습(소변) 시료의 분석이 모두 가능하기에 그 활용범위가 넓고, 초고감도이므로 암을 초기에 진단할 수 있는 효과가 있으며, 특히 소변 등을 진단시료로 사용할 경우 비침습 진단이 가능하므로 보다 환자친화적인 진단법 개발의 효과를 가진다.

Description

아넥신 단백질의 검출을 위한 나노면역센서 및 이의 제조방법{NANOIMMUNOSENSOR FOR THE DETECTION OF ANNEXIN PROTEIN AND THE METHOD FOR PREPARING THEREOF}

본 발명은 암 진단용 바이오마커 단백질(biomarker protein)의 검출 및 정량화를 위한 중량분석법(gravimetry) 기반의 나노면역센서(nanoimmunosensor)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폐암(lung adenocarcinomas, AdC)과 전립선암(prostate cancer, PCa)의 바이오마커 단백질인 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)를 초고감도(ultrasensitive) 및 비표지방식(label-free)으로 검출하기 위한 암진단용 나노면역센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

암은 인간이 사망하는 주요 원인 중에 하나인데 환자의 생존에 있어서 암의 조기진단은 매우 중요하다(Zoli et al., 1996). 대부분 암의 경우, 암의 조기진단(1기)을 통해서 5년 이상 생존율을 90%이상으로 올릴 수 있다(Etzioni et al., 2003). 다양한 종류의 암들 중에서 폐암은 많은 국가에서 암 사망의 주요 원인으로 알려져 있다(Chen et al., 2003). 2004년 세계보건기구(WHO) 발표에 의하면 특히 폐선암(lung adenocarcinomas, AdC)은 폐암의 8대 주요 그룹 중 하나이다(Travis et al., 2004). 한편 전립선암(prostate cancer, PCa)은 남성의 암사망과 관련하여 두 번째로 그 비율이 높고, 65세 이상의 남성 9명 중 1명에게 영향을 미치고 있다(Xin et al., 2003). 최근 폐선암과 전립선암은 재발되는 경우가 증가하고 있으며, 예후 또한 좋지 않은 경향이 있는데(Hoffman et al., 2000), 폐선암 및 전립선암 환자들의 예후는 이들 암의 전이와 관련이 되어 있다(Kim et al., 2009). 따라서 이들 암환자의 장기 생존률을 높이기 위해서는 적절한 바이오마커를 사용하여 이들 암을 1기에 진단하거나 재발을 확인하는 것이 필요하다(Greenberg and Lee, 2007; Kulasingam and Diamindis, 2008).

한편, 초기 암진단 목적으로 임상에서 승인된 바이오마커가 거의 없긴 하지만 아넥신 As(annexin As; ANXAs)와 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)는 폐암과 전립선암의 진단 바이오마커의 가능성을 인정받고 있다.(Rifai et al., 2006). Annexin A1(ANXA1), annexin A2(ANXA2), 및 annexin A3(ANXA3)은 폐선암(AdC)와 편평상피암(squamous cell carcinomas)에서 과발현된다(Brichory et al., 2001). 한편, 전립선암(PCa)의 조기진단에 있어서 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)의 측정은 부정확할 수 있다는 연구결과가 있다(Schostak et al., 2009). PSA의 레벨이 4.0-10.0 ng/mL인 경우일지라도 이런 PAS의 농도가 전립선암(PCa) 때문이 아니라 다른 원인들-예를 들면 양성 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia (BPH)), 염증 및 전립선염(prostatitis)-과 관련이 있을 수 있다는 사실이 알려졌다. 또한 전립선암(PCa) 환자들 중 일부의 PSA 레벨은 4.0 ng/mL 미만인 경우도 있는 것으로 나타났다. PSA를 이용한 진단의 이런 모호함 때문에 사실은 불필요한 조직검사(biopsy)가 행해지고 있다(Leman et al., 2009). 최근 ANXA3이 전립선암(PCa)에 대한 비침습적이고 매우 특이적인 바이오마커인 것으로 웨스턴 블랏 기술(western blot techniques)에 의해 밝혀졌다(Liu et al., 2009; K??llermann et al., 2008). ANXA3은 25℃에서 48시간 이상 동안 소변 샘플에서 안정적이며, 24시간 또는 그 이상의 기간 동안 반복적인 측정의 과정에서도 안정적이다(Schostak et al., 2009). 따라서 폐선암(AdC)와 전립선암(PCa)의 조기진단을 위해 혈청(blood serum)과 소변 샘플에서의 ANXA3 분석 방법의 개발은 PSA를 사용하는 진단법의 한계를 넘어서는데 있어서 매우 중요하며 유용하다.

일반적으로 단백질 바이오마커(protein biomarkers)는 기존의 면역분석기술(immunoassay techniques)인 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), western blotting 등에 의해 검출된다. 그러나 상기의 기술들은 복잡하고 시간 및 비용이 많이 소요될 뿐만 아니라 인력도 많이 투입되어야 한다. 따라서 광학(optical)이나 전기화학적 방법(electrochemical methods)을 기반으로 하는 새로운 면역센서(immunosensor) 기술의 개발은 분석 시간을 획기적으로 줄일 수 있다. 그러나 기존의 전기화학 및 광학적 방법은 비록 좋은 감도를 얻을 수 있긴 하지만, 검출신호 생성을 위한 라벨로써 형광 태그나 신호 생성 관련 효소를 사용해야 하기 때문에 많은 경우에 적절하지 않다. 따라서 라벨이 없는(label-free) 면역센서(immunosensor)의 개발이 암진단용 바이오마커 단백질(cancer biomarker proteins)을 검출하는데 있어 매우 유용하다.

한편, 암진단을 위한 센서와 관련된 종래기술로는 한국공개특허 제10-2009-0129228호(전도성고분자 나노와이어를 이용한 면역센서 및 그의 제조방법), 한국공개특허 제10-2011-0038897호(폐암 진단센서 및 이의 제조방법) 등이 있다.

이에 본 발명자는 폐암(lung adenocarcinomas, AdC)과 전립선암(prostate cancer, PCa)의 바이오마커 단백질인 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)를 비표지 방식(label-free)일 뿐만 아니라 초고감도로 검출할 수 있는 나노면역센서를 개발 및 그 효과를 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은, 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 전착된 전극위에 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)을 형성한 후 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)를 고정한 다음, 상기 CdS QDs 나노프로브가 고정된 곳에 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)를 고정하여 얻어진 anti-ANXA3/QDs/SAM/QCM 전극을 포함하는 암진단용 나노면역센서를 제공함에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 비표지 방식이고, 초고감도로 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)를 검출할 수 있는 상기 anti-ANXA3/QDs/SAM/QCM 전극을 포함하는 암진단용 나노면역센서의 제조방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 전착된 전극위에 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)을 형성한 후 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)를 고정한 다음, 상기 CdS QDs 나노프로브가 고정된 곳에 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)를 고정하여 얻어진 anti-ANXA3/QDs/SAM/QCM 전극을 포함하는 암진단용 나노면역센서를 제공한다.

상기 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 전착된 전극은 Au 전극인 것을 특징으로 한다.

상기 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)은 시스타민(cystamine)을 사용하여 형성시키는 것을 특징으로 한다.

상기 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe) 및 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)는 아마이드 결합에 의해 고정되는 것을 특징으로 한다.

상기 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)는 10mM PBS(phosphate buffer saline solution)을 사용하여 1:5의 희석률로 고정하는 것을 특징으로 한다.

상기 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)는 10mM PBS(phosphate buffer saline solution)을 사용하여 1:1000의 희석률로 고정하는 것을 특징으로 한다.

상기 암은 폐암(lung adenocarcinomas, AdC) 또는 전립선암(prostate cancer, PCa)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 (1) 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 Au 전극을 전착시키는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 위에 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 전착된 Au 전극위에 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)을 형성시키는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 형성된 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM) 위에 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)를 고정하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의해 CdS QDs 나노프로브가 고정된 곳에 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)를 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서의 제조방법을 제공한다.

상기 (2)단계에서 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)은 시스타민(cystamine)을 사용하여 형성시키는 것을 특징으로 한다.

상기 (3)단계에서 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)는 10mM PBS(phosphate buffer saline solution)을 사용하여 1:5의 희석률로 고정하는 것을 특징으로 한다.

상기 (4)단계에서 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)는 10mM PBS(phosphate buffer saline solution)을 사용하여 1:1000의 희석률로 고정하는 것을 특징으로 한다.

상기 (3)단계 및 (4)단계에서 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe) 및 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)는 아마이드 결합에 의해 고정되는 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 폐암(lung adenocarcinomas, AdC)과 전립선암(prostate cancer, PCa)의 바이오마커 단백질인 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)를 비표지 방식(label-free)일 뿐만 아니라 초고감도로 검출할 수 있는 나노면역센서 및 이의 제조방법을 제공함으로써, 종래 기술의 문제점인 시간 및 비용이 많이 소요될 뿐만 아니라 인력도 많이 투입되어야 한다는 점을 해결할 수 있는 효과가 있다. 또한 혈액은 물론 소변 등을 분석 시료로 사용할 수 있으므로 침습 및 비침습 방식이 둘 다 가능하다는 장점을 가진다.

본 발명은 비표지 방식(label-free)이므로 암의 진단을 매우 간편하게 할 수 있고, 침습(혈액) 및 비침습(소변) 시료의 분석이 모두 가능하기에 그 활용범위가 넓으며, 초고감도이기 때문에 암을 초기에 진단할 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 QCM 기반 검출 시스템(QCM-based detection system)을 나타낸 것
도 2a 는 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)의 희석률이 1:0 내지 1:20인 경우의 영향을 나타낸 그래프.
도 2b 는 아넥신 A3 의 항체(anti-annexin A3; anti-ANXA3)의 희석률이 1:100 내지 1:1000인 경우의 영향을 나타낸 그래프.
도 2c 는 pH가 5.5 내지 8.5인 경우 ANXA3 흡착의 반응에 대한 영향을 나타낸 그래프.
도 3a 는 CYS SAM(black line; SAM/QCM), SAM/QCM의 표면에 QDs의 고정(red line; QDs/SAM/QCM) 및 QDs/SAM/QCM의 표면에 anti-ANXA3 antibody의 고정(green line)을 형성하는 동안에 진동수의 변화(frequency change (Δf))를 나타낸 그래프.
도 3b 는 SAM에 대한 CdS(QDs)의 흡착을 square-wave voltammetry에 의해 전기화학적으로 확인한 그래프.
도 4a 는 0.075 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도범위에서 ANXA3 검출 진동수 응답의 보정곡선(calibration plot)을 나타낸 그래프.(삽도는 0.075 ng/mL 내지 50 ng/mL 농도범위에서 ANXA3 검출 진동수 응답을 보여주는 그래프)
도 4b 는 0.075 ng/mL 내지 5 ng/mL 농도범위에서 ANXA3 검출 진동수 응답의 보정곡선(calibration plot)을 나타낸 그래프.(삽도는 0.075 ng/mL 내지 5 ng/mL 농도범위에서 ANXA3 검출 진동수 응답을 보여주는 그래프)
도 5a 는 인간의 혈청(serum), 소변(urine) 샘플 및 PBS(phosphate buffer saline solution)의 ANXA3 검출에 대한 대조실험(control experiments) 결과.
도 5b 는 IgG와 HSA(human serum albumin)의 비특이적 흡착을 ANXA3검출과 비교한 그래프.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

한편, 아넥신 A3(annexin A3)은 'ANXA3', 인간혈청알부민(Human serum albumin)은 'HSA', 면역글로블린 G는 'IgG', 카드뮴 황화물(Cadmium sulfide)은 'CdS', 인산 완충 생리 식염수는(phosphate buffer saline solution)는 'PBS', 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance)은 'QCM/N', 자기조립단위막분자막(self-assembled monolayer)는 'SAM', 양자점(quantum dots)는 'QDs'라 한다.

실시예 1. 실험준비

(1) 아넥신 A3의 항체(anti-annexin A3; anti-ANXA3), 재조합된 GST가 태그된 ANXA3은 Abnova CO(Walnut, CA USA)에서 구입하였다. 인간혈청알부민(Human serum albumin; HSA), 면역글로블린 G(IgG), 소 혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide(EDC), sodium dihydrogen phosphate(NaH₂PO₄) 및 disodium hydrogen phosphate(Na₂HPO₄)는 Sigma(St. Louis, MO USA)에서 구입하였고, 11-Mercaptoundecanoic acid, mercaptoethanol, sodium acetate, glacial acetic acid 및 sodium chloride(NaCl)는 Aldrich(St. Louis, MO USA)에서 구입하였다.

(2) N-hydroxysuccinimide(NHS)는 Fluka(St. Louis, MO USA)에서, Cadmium sulfide nanocrystals, CdS(QDs)는 NN-Labs(Fayetteville, AR USA)에서 구입하였고, 인산 완충 생리 식염수는(phosphate buffer saline solution , PBS) 0.9 %의 염화나트륨(NaCl), 10mM NaH₂PO₄, 10mM Na₂HPO₄를 혼합하여 준비하였다.

(3) ANXA3의 test solution은 10mM PBS로 희석된 stock solution에 의해 준비하였고, 아세테이트 완충 용액은 0.2 M glacial acetic acid를 첨가하여 원하는 pH로 조정한 0.2 M sodium acetate(Aldrich)로 준비하였다.

(4) 한편, 다른 모든 화학물질은 extra pure analytical 등급이었고, 추가적인 정제없이 사용하였다.

(5) 모든 수용액(aqueous solutions)은 밀리-Q-워터 정화시스템(Milli-Q water purifying system, 18 MΩcm)에서 얻은 이차 증류수로 준비하였다.

(6) SWV(square wave voltammetry)와 QCM(quartz crystal microbalance) 실험은 electrochemical quartz crystal microbalance(CH Instruments Inc., USA)을 위한 추가 모듈은 CHI430A electrochemical workstation을 사용하여 수행되었다.

(7) AT-cut quartz crystal (A = 0.21 cm²;8MHz)에 얇은 Au 층이 형성된 것은 QCM 실험에 사용되었다. SWV 실험은 금 전극(gold electrodes, area = 0.07 cm²)을 적용한 SAM(self-assembled monolayer, 자기조립단위막분자막)과 QDs(quantum dots, 양자점)/SAM, KCl에 함침한 Ag/AgCl 및 백금 와이어(platinum (Pt) wire)는 각각 작업전극, 기준전극, 상대전극으로 사용하였다.

(8) 실험은 5mV 증가폭(increment), 25mV 의 진폭(amplitude) 및 60 Hz의 주파수(frequency)를 -1.0에서 0.0V로 스캔하였으며, 도 1은 QCM 기반 탐지 시스템(QCM-based detection system)의 개요를 나타낸 것이다.

실시예 2. 카르복시산 그룹과 CdS(QDs)의 작용(functionalization of CdS QDs with Carboxylic acid groups)

QDs는 이미 보고된 프로토콜(Jacob et 1l., 2006)에 따라 카르복시산(COOH)과 작용한다. 간략히 설명하면, QDs(5mg을 1mL의 톨루엔에 혼합한 것)과 11-mercaptoundecanoic acid(22 mg)의 혼합물을 30분 동안 실온에서 혼합시켰다. 초과된 thiol은 3000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액(supernatant)의 제거에 의해 제거하고, 120 ㅅL 의 PBS (10 mM, pH = 8.6)에 분산시켰다(COOH-QDs).

또한, QDs의 카르복시산(COOH) 그룹을 활성화하기 위해 500μL의 PBS, 1mg EDC 및 1mg NHS로 희석된 서스펜션(suspension) 50㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 섞어주고(stir), 상층액(supernatant)을 제거하기 위해 3000rpm에서 1분동안 원심분리한 다음 1mL PBS(pH = 7.4)에 분산시켰다.

실시예 3. QCM 전극의 보정(calibration of the QCM electrode)

crystal이 QCM cell에 배치된 후 Au 전극(8 MHz, AT-cut quartz crystal)의 초기 진동수를 관찰하였다.

10㎕의 시스타민 솔루션(cystamine solution)(aq)(농도; 0.5-1.5 g/㎖[5.0-15 ng])을 Au/QCM 전극의 표면 전체에 증착시킨 후 실온에서 건조하였다. 상기 시스타민을 처리한 Au/QCM 전극을 셀에 위치시킨 후 고정 진동수를 얻을 때 까지 관찰하였다.(약 1-2시간)

모든 실험은 4번을 반복하여 수행하였으며, 평균 진동수(average Δf values)는 석영전극(quarts electrode)에 Au가 증착되는 질량에 대응하여 나타내었다.

감도는 직선의 기울기로부터 약 0.78Hz/ng 이었다(R=0.999).

실시예 4. ANXA3 나노면역센서 프로브의 제조(fabrication of the ANXA3 nanoimmunosensor probe)

(1) 도 1. 에 나타낸 바와 같이, QCM 나노면역센서의 제조과정은 3단계로 구성된다.(cystamine SAM 형성(formation) / QDs 첨가 / anti-ANXA3 antibody 고정)

(2) 첫 번째로, 2시간 동안 20mM cystamine solution(CYS)에 Au/QCM 전극을 함침하여 cystamine SAM(self-assembled monolayer)을 형성하였다. 한편, Au/QCM 전극을 사용하기 전에, Piranha solution으로 세척한 다음 물로 헹구었다.

(3) cystamine SAM이 형성된 Au/QCM 전극(SAM/QCM)에서 남아있는 활성화된 Au 표면은 20mM mercaptoethanol을 사용하여 2시간 동안 차단하였다. 그 다음 cystamine SAM이 형성된 Au/QCM 전극(SAM/QCM)을 증류수를 사용하여 3번 세척하고, 결합되지 않은 시스타민과 메르캅토에탄올 잔여물을 제거하였다.

(4) EDC와 NHS로 처리한 COOH 그룹와 Cds(QdS)의 작용은 30분 동안 500 ㅅL COOH-CdS에 cystamine SAM이 형성된 Au/QCM 전극(SAM/QCM)을 함침시킴으로써, cystamine solution(CYS)와 EDC와 NHS로 처리한 COOH 그룹의 결합에 의해 이루어진다(공유결합에 의해 고정됨).

(5) PBS 용액으로 세 번 세척한 후에, anti-ANXA3 antibody는 500ㅅL 의 anti-ANXA3 antibody solution에 QDs/SAM/QCM electrode를 15분동안 함침하여 고정하였다.(공유결합에 의해 고정됨)

(6) PBS 솔루션으로 세 번 세척한 후, anti-ANXA3/QDs/SAM/QCM nanoimmunosensor probe의 비특이적 흡착을 최소화하기 위해 0.1% BSA(bovine serum albumin) solution으로 차단하였다.

실시예 5. 나노면역센서의 특이성(specificity of the nanoimmunosensor)

비특이적 흡착(nonspecific adsorption)은 나노면역센서의 표면을 0.1% BSA(bovine serum albumin) solution을 사용하여 1시간 동안 차단처리 해줌으로서 최소화할 수 있다.

AXNA3 면역센서의 선택성은 IgG 및 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 단백질에 대한 진동수 응답 측정에 의해서 평가되었다. 도 5B는 1 ng/mL ANXA3와 함께 10ng/mL IgG 및 10ng/mL HSA에 대한 진동수 응답을 보여 준다. IgG 와 HSA에서 진동수 감소가 거의 없는 것은 본 발명에 의한 나노면역센서가 다른 단백질의 심각한 간섭없이 ANXA3 검출에 대하여 높은 특이성이 있다는 것을 보여주는 것이다.

실험예 1. 실험조건의 최적화(optimization of the experimental conditions)

(1) COOH-QDs의 희석률을 1:0에서 1:20까지 변화시키면서 20번을 반복하여 COOH-QDs 양의 ANXA3 검출반응에 대한 영향을 실험하였다. 그 결과 ANXA3의 진동수 변화에 대한 COOH-QDs 희석률의 영향을 보여주는 도 2a에 나타낸 바와 같이 희석률이 1:5인 경우가 최적화된 희석률인 것을 알 수 있었다. 일반적으로 희석률이 높을수록 낮은 진동수 변화가 있었지만, 희석률이 1:5가 될 때 까지 조금씩 증가하였다.

(2) 높은 농도에서는 반응의 변화가 크게 나타나지 않았다. 한편, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 1:1000의 희석률을 anti-ANXA3 고정을 위한 최적의 농도로 결정하였다.

(3) 한편, 도 2c는 최적화된 희석률(QDs 1:5, anti-ANXA3 1:1000)에서 ANXA3 검출의 진동수 응답에 대한 pH의 영향을 보여준다. pH 7.5가 최적의 조건인 것으로 나타났으나, 생리적인 pH condition을 고려하여 본 발명에서는 pH 7.4를 사용하였다.

실험예 2. 면역센서 프로브의 특성(charaterization of the immunosensor probe)

(1) 도 3a는 CYS SAM(black line; SAM/QCM), SAM/QCM의 표면에 QDs의 고정(red line; QDs/SAM/QCM) 및 QDs/SAM/QCM의 표면에 anti-ANXA3 antibody의 고정(green line)을 형성하는 동안에 진동수의 변화(frequency change (Δf))를 보여준다. 그 결과, Au/QCM에서 SAM을 형성시, 진동수 감소는 약 2시간 후에 정상상태에 도달하였다. 이는 self-assembly에 의한 cystamine monolayer의 형성이 2시간 이내에 완성되었음을 의미한다. SAM formation 과정에서 약 140.5ng의 질량 변화(흡착률=2.97 x 10^-9mol/cm²)에 해당하는 180 Hz의 진동수 변화가 있었다. 이는 Au/QCM의 표면에 compact monolayer가 잘 형성된 것을 의미한다(Love et. al., 2005). 약 115.5ng의 질량변화에 해당하는 약 148 Hz의 진동수 변화는 SAM에 대한 CdS(QDs) 의 흡착이 진행된 후 15분 이내에 달성되었다.

(2) 도 3b에 나타낸 바와 같이, SAM에 대한 CdS(QDs)의 흡착은 square-wave voltammetry에 의해 전기화학적으로 확인되었다. 본 실험은 Au전극에 SAM와 QDs/SAM을 적용한 것을 아세테이트 완충 용액(acetate buffer solution; pH 4.3)에서 산화 전극 벗김 분석(anodic stripping analysis)을 수행되었다. 그 결과, QDs/SAM을 적용한 Au적극의 cadmium stripping peak는 약 ~ -0.6V를 나타냈다. CdS(QDs) 양의 증가에 의한 최대 순간 전류(peak current)의 상승을 통해 SAM/QCM에 QDs가 공유결합된 것을 확인하였다.

(3) 마지막으로, QDs/SAM/QCM 전극에서 anti-ANXA3의 고정은 81.25ng의 질량변화에 해당하는 104 Hz의 진동수에서 정상상태에 도달하였다(도 3a, green line). anti-ANXA3의 몰 질량(molar mass)이 항체의 일반적인 값인 150,000g과 비슷하다고 가정할 때 anti-ANXA3의 흡착률은 약 2.58ㅧ10^-12mol/cm²인 것으로 추측되었다(Liu et al.,2009).

실험예 3. 나노면역센서의 성능(performance of the nanoimmunosensor)

나노면역센서의 ANXA3 감지 성능은 다양한 양을 포함하는 PBS solution의 진동수 응답을 측정하여 증명하였다.

(1) 도 4a에 도시한 바와 같이, 대부분의 경우 15분 이내에 진동수의 변화는 정상상태에 도달하였다. 이는 나노면역센서의 정량가능 최소 검출 한계가 이미 상술한 최적 조건에서 100pg/mL 이하인 것을 보여주는 것이었다. 또한, 도 4a에서 알 수 있듯이, calibration plot에서 진동수 응답은 0.075 와 50 ng/mL 사이에서 선형적 관계로 나타났다. 이로부터, Δf (Hz) = (1.65 ㅁ 0.07) + (1.16 ㅁ 0.06) [ANXA3] ng/mL의 회귀방정식(regression equation)을 도출하였다(회귀계수(regression coefficient)=0.994).

이는 약 0.075ㅁ0.01 ng/mL의 검출한계 ANXA3에 대해 1.16ㅁ0.06 Hz/ng/mL의 감도에 대응된다.

(4) 도 4b(calibration plot and inset)는 0.075 ng/mL~5ng/mL의 농도범위에서 ANXA3의 흡착에 대한 진동수 응답을 보여주고 있다. ANXA3 농도 0.1ng/mL에서 상대표준편차(relative standard deviation (RSD))는 약 2%였다. 이와 같은 낮은 검출한계는 QDs/SAM/QCM 표면에 고정된 anti-ANXA3 antibody가 ANXA3과 강력한 친화력을 보여 충분한 반응성이 있다는 것을 보여주는 것이다.

실험예 4. 실제 샘플 분석(real sample analysis)

본 발명에 의한 나노면역센서의 실질적인 적용범위를 시험하기 위해 인간 혈청 및 소변 샘플(0.1 ng/mL의 ANXA3을 첨가)을 사용하여 ANXA3 검출에 대한 대조시험(control experiments)을 수행하였다.

도 5a, 5b.에 도시된 대조샘플(control sample)의 진동수 응답 곡선에서 명확하게 알 수 있듯이, 정상 상태 진동수 감소는 ANXA3가 첨가된 대조샘플 모두에서 관찰되었다. 반면, ANXA3가 첨가되지 않은 경우 진동수의 변화가 없었다.

상기 2개의 샘플(혈청 및 소변)은 15분 이내에 정상상태에 도달하였다. 또한, 2개 샘플(혈청 및 소변)의 정상상태에서의 진동수 변화의 총합은 동일한 농도의 ANXA3을 포함하는 PBS로부터 얻은 것과 거의 동일하였다. 이는 실제 사람의 생체액에서 ANXA3과 anti-ANXA3 사이의 완벽한 상호작용에 의해 센서의 오염이나 예상하지 않은 경쟁적인 반응이 없는 것을 강력하게 시사한다.

결론적으로, 본 발명에 의해 중량분석법(gravimetry)의 하나인 QCM/N을 기반으로 한 CdS(QDs) 초감도 나노면역센서는 폐암 및 전립선암의 바이오마커 단백질 ANXA3의 비표지 방식(label-free) 검출이 가능하고, 상기 나노면역센서는 Au/QCM에 cystamine SAM monolayer를 형성하고, SAM/QCM의 CdS(QDs) nanoprobe에 COOH기가 고정되며, QDs/SAM/QCM의 표면에 anti-ANXA3이 공유결합에 의해 고정되는 것으로 구성된다.

한편, 본 발명에 의한 나노면역센서는 IgG 및 HSA와 같은 단백질의 어떠한 간섭없이 사람 혈청 및 소변 샘플에서 0.075 ㅁ 0.01 ng/mL ANXA3 검출한계를 나타내고, 넓게는 0.075 - 50 ng/mL의 범위에서 검출이 가능하다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시예 일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 전착된 전극위에 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)을 형성한 후 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)를 고정한 다음, 상기 CdS QDs 나노프로브가 고정된 곳에 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)를 고정하여 얻어진 anti-ANXA3/QDs/SAM/QCM 전극을 포함하는 암진단용 나노면역센서.
제 1 항에 있어서,
상기 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 전착된 전극은 Au 전극인 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서.
제 1 항에 있어서,
상기 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)은 시스타민(cystamine)을 사용하여 형성시키는 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서.
제 1 항에 있어서,
상기 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe) 및 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)는 아마이드 결합에 의해 고정되는 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서.
(1) 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 Au 전극을 전착시키는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 위에 수정진동자저울(quartz crystal microbalance/nanobalance, QCM/N)에 전착된 Au 전극위에 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)을 형성시키는 단계;
(3) 상기 (2)단계에 의해 형성된 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM) 위에 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)를 고정하는 단계;
(4) 상기 (3)단계에 의해 CdS QDs 나노프로브가 고정된 곳에 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)를 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서의 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 (3)단계에서 카드뮴설파이드(cadmium sulfide; CdS)로 이루어진 양자점(quantum dots; QDs) 나노프로브(nanoprobe)는 10mM PBS(phosphate buffer saline solution)을 사용하여 1:5의 희석률로 고정하는 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서의 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 (4)단계에서 아넥신 A3(annexin A3, ANXA3)의 항체(anti-ANXA3)는 10mM PBS(phosphate buffer saline solution)을 사용하여 1:1000의 희석률로 고정하는 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서의 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 (2)단계에서 자기조립분자막(self assembled monolayer, SAM)은 시스타민(cystamine)을 사용하여 형성시키는 것을 특징으로 하는 암진단용 나노면역센서의 제조방법.