CN107407684A

CN107407684A - 用于检测抗心脏受体家族成员的抗体的方法

Info

Publication number: CN107407684A
Application number: CN201580068565.6A
Authority: CN
Inventors: 卢茨·施姆堡; 瓦尔德玛·米尼希; 尼尔斯-彼得·贝克尔
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2017-11-28
Also published as: RU2017116436A; EP3234615A1; RU2707071C2; DE102014226663A1; RU2017116436A3; US20180143213A1; WO2016097400A1

Abstract

本发明涉及用于检测抗心脏受体家族成员的抗体的方法；用于进行本发明所述方法的试剂盒；本发明所述方法用于诊断、治疗和/或预防与心脏受体家族的一个或多个成员有关的一种或多种疾病的用途；以及本发明所述方法用于a)鉴定抗所述心脏受体家族成员的抗体的结合性质的调节剂或b)鉴定用于治疗一或多种所述疾病的治疗剂的用途。

Description

用于检测抗心脏受体家族成员的抗体的方法

技术领域

本发明涉及用于检测抗心脏受体家族成员的抗体的方法；用于进行本发明所述方法的试剂盒；本发明所述方法用于诊断、治疗和/或预防与心脏受体家族的一个或多个成员有关的一种或多种疾病的用途，特别是选自由高血压、扩张心肌病、青光眼、慢性疲劳和痴呆组成的组的疾病；以及本发明所述方法用于a)鉴定抗心脏受体家族成员的抗体的结合性质的调节剂或b)鉴定用于治疗上述一或多种疾病的治疗剂的用途。

背景技术

心力衰竭(HF)是导致血液不充足供应至身体组织的心脏病理损伤。HF的诱发因素包括泵功能降低(收缩期心脏机能不全)或心脏充盈缺损(舒张期心脏机能不全)。HF是西方人死亡的主要原因并且造成巨大的财政和社会危害。大约2％的总体成人患有HF，具有与年龄增长相关的升高的发病率和患病率(65岁和更老者6％-10％受影响)。

心脏功能受自主神经系统控制。信号传递由心脏受体、主要由肾上腺素能受体(AR)和毒蕈碱性乙酰胆碱受体(mAChR)触发。肾上腺素能受体(AR)属于由儿茶酚胺、尤其是肾上腺素和去甲肾上腺素靶向的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。已在人体中表征了九种AR，分成三个家族：α1肾上腺素能受体(α1AR)、α2肾上腺素能受体(α2AR)和β肾上腺素能受体(βAR)。已描述了βAR的三种亚型：β1AR、β2AR和β3AR，均在人心脏中表达。AR调控包括起搏点活动、心肌收缩和血管肌紧张的许多生理过程。具有特殊临床关联性的是β1AR和β2AR，其中β1AR是心脏中的优势亚型。因此，β1AR是称为‘β-阻断剂’的治疗活性类化合物的主要靶标，广泛用于治疗心血管疾病中。

除AR外，乙酰胆碱受体(AChR)也起显著作用。存在两种类型的AChR：烟碱性AChR(nAChR)和毒蕈碱性AChR(mAChR)。nAChR是离子移变的并且因此自身充当离子通道。mAChR是促代谢受体(蛋白偶联的)并且属于GPCR超家族。mAChR触发例如心搏和心压。由于其药理性质，mAChR被再分类成五种亚型：M1至M5。奇数编号的mAChR M1、M3和M5与Gq异源三聚G蛋白缔合。偶数编号的mAChR M2和M4与Gi异源三聚G蛋白缔合。例如，M2的激活导致心率降低。

自身抗体(“Aab's”)在自身免疫疾病的发病中起重要作用。最近的研究结果表明抗心脏受体的抗体(“Ab's”)的致病和诊断关联性，例如高浓度抗α1AR的Aab's与血压升高相关联。临床研究显示出与健康对照相比HF患者的β1AR自身抗体(“Aab”)效价之间存在显著相关性。抗mAChR M2的Aab's的存在与心肌病风险升高相关联。另外，发现mAChR-Aab's在纤维性颤动患者中高流行(Semin.Immunopathol.2014年5月，36(3)，351-63)。由于高通量筛选方法的有限可利用性，抗心脏受体家族成员的Ab's的致病关联性尚未经受流行病学研究并且很少数据可用于心脏功能障碍的鉴别诊断和治疗。因此，开发用于测定抗特定心脏(亚)受体的自身抗体的快速、特异性、灵敏和可靠的方法可起到重要作用，如果此类方法允许测定交叉反应性则可起到甚至更多作用。此类方法将允许早期诊断或鉴别诊断并且可在预防、治疗或监测与心脏受体家族的一个或多个成员有关的自身免疫相关病症中具有特殊价值。此外，需要提供便宜和有效的方法，所述方法将进一步允许鉴定分别结合心脏受体家族的一个或多个成员而与Aab's或治疗剂相互作用的调节剂(即，激活剂、抑制剂、或以其他方式影响抗原与抗体之间相互作用的分子)。

当前可利用的试验方法可能不提供所需特异性、可扩展性、可管理性、灵敏性，和/或可能需要大量的生物样本。因此，存在改进方法和测定技术的需要。如权利要求书所定义的本发明通过提供进一步适合自动化或高通量筛选的显示改进的速度、特异性和/或灵敏性的方法来克服现有技术的上述问题。根据本发明的方法接近于生理条件，因为所述方法使抗原形成正确的三维结构。这是本发明与使用表达自细菌的蛋白质或肽片段的方法之间的主要差异。本发明的方法适合于自动化和在研究和/或临床实验室中进行。此外，本发明的方法允许鉴定病理或治疗性抗体与心脏受体家族成员之间的特异性交叉反应性。意外地，由于本发明的方法的灵敏性和/或特异性提高，本方法允许相互作用的区别研究，以及开发在预防、诊断和治疗与心脏受体家族成员有关的疾病或病症上改进的方法和药剂。

发明内容

因此，本发明的第一实施方案在于提供在待研究样本中检测与一种或多种抗原分子反应的分析物抗体的存在和/或结合性质的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一种或多种第一抗原分子，分析物抗体当存在于所述样本中时可与所述第一抗原分子相互作用，并且所述第一抗原分子选自心脏受体家族(CRF)；以及

(b)提供一种或多种第二抗原分子，分析物抗体当存在于所述样本中时可与所述第二抗原分子相互作用，并且所述第二抗原分子选自CRF；以及

(c)使如由步骤(a)提供的所述第一抗原分子和如由步骤(b)提供的所述第二抗原分子同时或相继地与待研究样本接触，借此分析物抗体当存在于所述样本中时可与所述抗原分子相互作用从而形成包含[第一抗原分子]-[分析物抗体]-[第二抗原分子]的复合物；以及

(d1)在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后，提供固定手段，借此存在于步骤(c)中所形成的所述复合物中的及能够在步骤(c)中形成复合物的所述第一抗原分子分别能够在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后固定至固体支撑物；和/或

(d2)在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后，提供第二标记手段，借此存在于步骤(c)中所形成的所述复合物中的及能够在步骤(c)中形成复合物的所述第一抗原分子分别在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后用所述第二标记手段标记；以及

(e)在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后，提供第一标记手段，借此存在于步骤(c)中所形成的所述复合物中的及能够在步骤(c)中形成复合物的所述第二抗原分子分别在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后用所述第一标记手段标记；以及

(g)检测在步骤(c)中或在步骤(c)之后形成的所述复合物的存在从而提供对存在于所述样本中的分析物抗体的指示，

其中所述第一标记手段和所述第二标记手段是不同的，并且优选地，其中排除使用放射性标记手段。

本发明的方法的另一个实施方案包括以下步骤：

(d1)在步骤(c)之前，提供固定手段，借此存在于步骤(c)中所形成的所述复合物中的及能够在步骤(c)中形成复合物的所述第一抗原分子分别能够在步骤(c)之前固定至固体支撑物；和/或

(d2)在步骤(c)之前，提供第二标记手段，借此存在于步骤(c)中所形成的所述复合物中的及能够在步骤(c)中形成复合物的所述第一抗原分子分别在步骤(c)之前用所述第二标记手段标记；以及

(e)在步骤(c)之前，提供第一标记手段，借此存在于步骤(c)中所形成的所述复合物中的及能够在步骤(c)中形成复合物的所述第二抗原分子分别在步骤(c)之前用所述第一标记手段标记；以及

在本发明的方法的另一个实施方案中，进一步排除：

a)使用放射性标记手段和包括沉淀的任何步骤，或

b)使用放射性标记手段和包括离心的任何步骤。

根据本发明，第一和第二标记手段被选为不同的并且分别提供可区别的相异信号，优选地可借助可应用检测方法的单次测量结果的区别明显的可检测的信号。在本发明的替代实施方案中，第一和第二抗原分子内的抗原部分相同或不同。在本发明的又一个实施方案中，第一和/或第二抗原分子嵌入类膜或膜环境。在本发明的又一个实施方案中，待研究样本的分析物Ab's是特定个体的Aab's或治疗性Ab's或诊断性Ab's，后者优选是单克隆的。在本发明的方法的又一个实施方案中，在使所述抗原与所述分析物Ab's接触之前提供选自第一标记手段、第二标记手段、固定手段和调节剂的一种或多种组分，即分别标记、固定所述一个或两个抗原，以在与抗体一起的所述复合物形成之前产生第一和第二抗原分子。

本发明的另一目的是本发明的方法用于诊断受试者中疾病的存在或素因(disposition)的体外用途，所述疾病与受体(或其部分)的功能有关，所述受体是心脏受体家族(“CRF”)的成员。本发明的又一目的是本发明的方法和/或试剂盒用于鉴定用于治疗和/或预防一种或多种疾病的药用有效化合物的用途，所述疾病与受体(或其部分)的功能有关，所述受体是CRF成员，具体而言，所述疾病选自高血压、扩张性心肌病、青光眼、慢性疲劳和痴呆，特别优选使用自动化方法、尤其是高通量筛选测定法(“HTS”)。

优选地，本发明的方法是体外方法，所述方法可包括除上文提及的那些以外的步骤，所述步骤可分别与样本的预处理或评价、所述方法的原始或二次试验信号的进一步加工、尤其是相对于所述复合物的存在的检测有关。本发明的方法可部分或完全地手动进行或自动化。任选地，本发明的方法的步骤(a)、(b)、(c)、(c1)、(c2)、(d)、(d1)、(d2)、(e)、(f)、和(g)、(h)、和(i)的一者或多者可部分或完全地由自动化辅助，包括合适的机器和感觉设备和/或计算机辅助的原始信号的加工和/或评估。此外，技术人员要注意，本发明的方法优选需要信号的校准或标准化以便例如借助内标或外标、即一种或多种已知量的参考化合物(参考Ab's或复合物)来分别确保检测信号的量化和要鉴定的复合物的存在。

在本发明的替代实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同或不相同的(即，不同的)。在本发明的其他替代实施方案中，第一和第二抗原是不同的并且属于相同或不同的CRF成员。在本发明的另一个实施方案中，第一和/或第二抗原嵌入类膜或膜环境。在本发明的优选实施方案中，所述方法允许检测约0.03ng/ml至3ng/ml、优选0.03ng/ml至1ng/ml、并且更优选0.03ng/ml至0.1ng/ml的浓度的抗CRF成员的所述Ab's。

在本发明的方法的另一个实施方案中，在步骤(c)之前、优选在与待分析样本接触之前，以固定形式(例如，偶联至固体支撑物)提供一种或多种第一抗原分子。任选地，固体支撑物可以液相(例如，作为分散体、悬浮液或胶体)提供，或者，其可被提供为例如微量滴定板或适合于亲和层析的任何材料。此类固定的一种或多种第一抗原分子随后同时或连续地与待分析样本和与一种或多种第二抗原分子接触。

固定的一种或多种第一抗原分子当与所述样本接触时可形成包含[第一抗原分子]-[分析物抗体]的中间复合物，其中一种或多种第一抗原分子固定至固体支撑物并且因此形成的固定中间复合物随后与存在于溶液中的一种或多种第二抗原分子接触，从而形成经由第一抗原分子直接或间接固定至固体支撑物的包含[第一抗原分子]-[分析物抗体]-[第二抗原分子]的迄今所述复合物。

在本发明的方法的另一个实施方案中，由第二标记手段加标签的一种或多种第一抗原分子在步骤(c)之前提供。在本发明的方法的另一个实施方案中，将一种或多种第一抗原分子固定至固体支撑物并且在步骤(c)之前提供。在本发明的方法的另一个实施方案中，由第一标记手段加标签的一种或多种第二抗原分子在步骤(c)之前提供。在本发明的方法的另一个实施方案中，固定至固体支撑物的一种或多种第一抗原分子和由第一标记手段加标签的一种或多种第二抗原分子在步骤(c)之前提供。在本发明的方法的另一个实施方案中，由第二标记手段加标签的一种或多种第一抗原分子和由第一标记手段加标签的一种或多种第二抗原分子在步骤(c)之前提供。在本发明的方法的又一个实施方案中，一种或多种第一抗原分子固定至固体支撑物并且一种或多种第二抗原分子由第一标记手段加标签，其中所述第二抗原分子提供于溶液中。在本发明的方法的又一个实施方案中，一种或多种第一抗原分子固定至固体支撑物并且一种或多种第二抗原分子由第一标记手段加标签，其中所述第一和第二抗原分子均提供于溶液中。本发明的方法的另一个实施方案允许通过采用本领域已知的例如夹心型或RET(共振能量转移)型的测定信号检测技术(例如，非竞争性或竞争性测定法)来直接监测(i)存在于样本中的所述分析物抗体和(ii)所述一种或多种第一抗原分子和(iii)如提供的所述一种或多种第二抗原分子的相互作用，而RET测定类型不需要所述第一抗原分子固定和/或与液相分离。本发明的方法的又一个实施方案允许鉴定调节剂，所述调节剂能够与在步骤(c)中形成的复合物相互作用和/或能够干扰根据如根据本发明的检测分析物抗体的方法所定义的步骤(c)的复合物形成。因此，本发明的方法的另一个实施方案进一步包括步骤(f)：在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后，提供待测试其与在步骤(c)中形成的复合物相互作用和/或能够干扰根据步骤(c)的复合物形成的能力的一种或多种化合物，并且在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后，使所述试验化合物同时或相继地与所述样本、所述一种或多种第一抗原分子和/或所述一种或多种第二抗原分子接触，或使所述试验化合物同时或相继地与在步骤(c)中或在步骤(c)之后形成的所述复合物接触。在根据本发明的方法的另一个实施方案中，一种或多种调节剂(即，“待测试其与所述复合物相互作用或复合物形成的能力的化合物”)在本发明的检测抗体的方法的步骤(c)之前提供。在本发明的方法的其他另外的实施方案中，选自由所述固定手段、所述第二标记手段和所述第一标记手段组成的组的所述一或多种手段在根据本发明的检测自身抗体的方法的步骤(c)之前提供。

在另一个实施方案中，本发明提供试剂盒，所述试剂盒可用于进行根据本发明所述的任何方法，所述试剂盒包含：(a)选自如根据本发明的一或多种方法所定义的CRF的一种或多种第一抗原分子；(b)选自如根据本发明的一或多种方法所定义的CRF的一种或多种第二抗原分子；(c₁)如根据本发明的一或多种方法所定义的固定手段和/或(c₂)如根据本发明的一或多种方法所定义的第二标记手段；以及(d)如根据本发明的一或多种方法所定义的第一标记手段，和任选地，一种或多种分析物抗体，所述分析物抗体与如根据本发明的一或多种方法所定义的一种或多种第一和第二抗原分子反应。在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒包含：(a)用第二标记手段标记的所述第一抗原分子，或(a)固定至固体支撑物的所述第一抗原分子；和(b)用第一标记手段标记的所述第二抗原分子。

在其他另外的实施方案中，本发明提供根据本发明的任何方法或试剂盒用于诊断与心脏受体家族的一个或多个成员有关的疾病或功能障碍的存在、发作或流行和/或用于鉴定用于治疗和/或预防与心脏受体家族的一个或多个成员有关的疾病或功能障碍的药用有效化合物的用途。

本发明的又一个主题是用两种或更多种不同标记手段加标签、优选可区别地可检测的选自心脏受体家族(CRF)的组的一个或多个成员用于进行用于鉴定抗CRF的一个或多个成员的一种或多种抗体的方法、制造用于进行所述方法的试剂盒的用途，以及其诊断或治疗性用途及其用于鉴定在治疗与CRF的一个或多个成员有关的疾病或功能障碍、尤其是选自由高血压、扩张心肌病、青光眼、慢性疲劳和痴呆组成的组的疾病上治疗有效的药剂的用途。

具体实施方案

一般而言，本申请中使用的所有术语和词语应具有本领域技术人员的一般知识的含义。然而，一些术语和词语的以下优选定义可进一步指定本发明：

术语“多肽”和“蛋白(质)”是同义使用的。

根据本发明的术语“样本”具有“待分析样本”的含义，主要包括液体、悬浮液或分散体，优选具有生物和/或化学合成来源。样本可通过众所周知的技术获得并且可由诸如血液、血浆、血清、脑脊液、唾液、尿液、精液、泪液等分离的体液组成。“样本”可进一步包括得自动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猪、灵长类动物)或具有人来源的头发、剪下的指甲、粪便或其他排泄物、分离细胞、细胞匀浆、组织匀浆或器官匀浆。组织样本或器官样本可通过例如活检或涂片得自任何组织或器官。分离细胞可通过诸如离心或细胞分选的分离技术得自体液或组织或器官。优选地，细胞样本、组织样本或器官样本得自表达、含有、积累、浓缩或产生本文中所指的抗原、分析物抗体或调节剂的那些细胞、组织或器官。样本可能已经用本领域技术人员已知的处理和/或修饰以便允许在本发明的方法中存储或进一步加工。例如，本领域技术人员可知样本可稀释于适当的缓冲液中，或，在样本来源于尿液的情况下，如果生物素被用作本发明的方法中的标记手段，则样本中所含的任何生物素需被去除以便避免干扰准确的生物素测定。优选地，样本可选自怀疑或假定发作或存在与心脏功能的调控或血压有关的疾病或功能障碍病状(或其中此种病状应被监测)或者相关疾病(例如，青光眼、痴呆、慢性疲劳或心律失常)的个体。在本发明的一个实施方案中，样本可为参考并且包含已知种类和量的分析物抗体和/或一种或多种调节剂、优选地已知种类和量的分析物抗体和一种或多种调节剂两者。这可具有对鉴定如本文所述调节剂的特殊关联性。

一般而言，根据本发明的术语“抗原分子”意指合成获得的化合物，其包含加标签(固定和/或标记的)抗原，并且分析物抗体可与所述抗原分子相互作用，并且所述抗原分子能够结合(一种或多种)分析物抗体以形成包含[分析物抗体-抗原分子]的特异性复合物。

根据本发明的术语“抗原”意指来自心脏受体家族、它们的亚基、肽或片段的组的任何分子，并且分析物抗体可与所述抗原相互作用，并且所述抗原能够结合(一种或多种)分析物抗体以形成包含[分析物抗体-抗原分子]的特异性复合物。抗原可为天然或合成的，并且对其的修饰优选诸如不有害地影响根据本发明的方法中的结合性质。

根据本发明的术语“分析物抗体”意指能够结合至是CRF成员的(一种或多种)抗原、分别能够结合至选自由肾上腺素能受体(AR)和乙酰胆碱能受体(ACR)组成的组的受体中一者或多者的任何抗体，所述分析物抗体的存在通过如本文中进一步概述的本发明的方法来定量和/或定性地分析，诸如α1AR、α2AR、βAR、烟碱性ACR、毒蕈碱性ACR、和它们的亚基、肽、片段和/或变体。CRF成员的特定实例是：α1A AR，α1B AR，α1D AR，α2A AR，α2B AR，α2CAR，β1 AR，β2 AR，β3 AR，烟碱性神经元ACR，烟碱性肌肉ACR，毒蕈碱性M1 ACR，毒蕈碱性M2ACR，毒蕈碱性M3 ACR，毒蕈碱性M4 ACR，毒蕈碱性M5 ACR。根据本发明，直系同源或旁系同源序列也可为合适的。

术语“分析物抗体”进一步意指单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、双特异性抗体或双抗体、二价抗体、多特异性抗体、合成抗体、适体、镜像适配体(spiegelmer)、人或人源化抗体、以及它们的片段或变体，诸如像Fab-、Fv-或scFv-片段，或这些中任何者的化学修饰衍生物，例如，抗体-药物缀合物、结构域抗体、纳米抗体或抗体模拟物(DARPin，‘设计的锚蛋白重复蛋白’)。在本发明的特定实施方案中，术语“分析物抗体”意指内源性自身抗体、治疗性抗体和/或诊断性抗体。

根据本发明的术语“心脏受体家族的成员”或“心脏受体家族”(CRF)意指选自由肾上腺素能受体(AR)和乙酰胆碱能受体(ACR)组成的组的任何多肽，诸如α1AR、α2AR、βAR、烟碱性ACR、毒蕈碱性ACR、和它们的亚基、肽、片段和/或变体，尤其是α1A AR、α1B AR、α1D AR、α2A AR、α2B AR、α2C AR、β1 AR、β2 AR、β3 AR、烟碱性神经元ACR、烟碱性肌肉ACR、毒蕈碱性M1 ACR、毒蕈碱性M2 ACR、毒蕈碱性M3 ACR、毒蕈碱性M4 ACR、毒蕈碱性M5 ACR，包括它们的亚基、变体、类似物、衍生物、片段、直系同源和旁系同源序列，所述CRF包含针对抗体的结合结构域，更优选具有天然来源的此类分子。优选地，CRF属于动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猪、灵长类动物)或人来源，更优选人。

在根据本发明的方法的其他替代实施方案中，术语“CRF”将仅意指：a)肾上腺素能受体(AR)；b)乙酰胆碱能受体(ACR)；c)肾上腺素能α1受体；d)肾上腺素能α2受体；e)肾上腺素能β受体；f)烟碱性乙酰胆碱能受体；g)毒蕈碱性乙酰胆碱能受体；或在各个情况下其亚基、变体、类似物、衍生物或片段，所述CRF包含针对抗体的结合结构域，更优选具有天然来源的此类分子。优选地，CRF属于动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猪、灵长类动物)或人来源，更优选人，而在其他另外的实施方案中，上述定义仅指第一抗原分子。

编码CRF成员的合适多肽及其对应基因是本领域技术人员所周知的。CRF成员可商购自重组来源(例如，从美国MN 55413，Minneapolis的R&D Systems公司，美国MD 20850，Rockville的OriGene Technologies公司)并且众所周知来自蛋白和核酸序列数据库，诸如像EMBL、Genbank等。给出针对人物种以特异性受体蛋白的CRF成员的当前可利用数据库登录号，但本发明不应理解为局限于此。

根据本发明的术语“肾上腺素能受体”(“AR”)意指具有天然存在的氨基酸序列的任何分离多肽或它们的任何变体。编码AR的氨基酸序列和基因序列是技术人员例如从诸如UniProtKB或http://www.rcsb.org的序列数据库中的条目中所周知的。例示出以下序列：

a)α1-肾上腺素能受体(α1AR)：

P35348(ADA1A HUMAN)；P35368(ADA1B HUMAN)；P25100(ADA1D HUMAN)；

b)α2-肾上腺素能受体(α2AR)：

P08913(ADA2A HUMAN)；P18089(ADA2B HUMAN)；P18825(ADA2C HUMAN)；

c)β-肾上腺素能受体(βAR)：

P08588(ADRB1 HUMAN)；P07550(ADRB2 HUMAN)；P13945(ADRB3 HUMAN)。

在本发明的又一个实施方案中，AR意指AR变体，其在动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猪、灵长类动物)或人中显示致病或功能障碍流行。在本发明的又一个实施方案中，AR嵌入膜环境中。

根据本发明的术语“乙酰胆碱能受体”(“ACR”)意指具有天然存在的氨基酸序列的任何分离多肽或烟碱性(nACR)或毒蕈碱性(mACR)ACR的任何变体。目前已鉴定了17种不同的nAChR亚基，被分成肌肉型和神经元型亚基(CHRNA1；CHRNA2；CHRNA3；CHRNA4；CHRNA5；CHRNA6；CHRNA7；CHRNA8；CHRNA9；CHRNA10；CHRNB1；CHRNB2；CHRNB3；CHRNB4；CHRND；CHRNE；和CHRNG)。在这17种亚基中，α2-α7和β2-β4已在人体中鉴定。烟碱性ACR是所述亚基的五聚体，因此，目前的生物性nAChR存在范围广泛的变型，可分成肌肉型、神经节型和不同CNS型类别。

编码ACR的氨基酸序列和基因序列是技术人员例如从诸如UniProtKB或http://www.rcsb.org的序列数据库中的条目中所周知的。例示出以下序列：

毒蕈碱性乙酰胆碱受体(mAChR)：

P11229(ACM1 HUMAN)；P08172(ACM2 HUMAN)；P20309(ACM3 HUMAN)；P08173(ACM4HUMAN)；P08912(ACM5 HUMAN)，以及烟碱性乙酰胆碱受体(nAChR)，以及它们的亚基(UE)，例如来自UniProtKB：α1(P02708)；α2(Q15822)；α3(P32297)；α4(P43681)；α5(P30532)；α6(Q15825)；α7(P36544)；β1(P11230)；β2(P17787)；β3(Q05901)；β4(P30926)；γ(P07510)；δ(Q07001)；ε(Q04844)。

在本发明的又一个实施方案中，ACR意指ACR变体，其在动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猪、灵长类动物)或人中显示致病或功能障碍流行。在本发明的又一个实施方案中，ACR嵌入膜环境中。

根据本发明的术语“变体”意指前文提及的抗原的任何片段、类似物、衍生物、融合蛋白、亚基或亚基链。优选地，“变体”可具有与前文提及的相应多肽或蛋白基本上相同的生物学性质，优选相对于其免疫学性质，并且甚至更优选相对于功能障碍性质。此外，要理解根据本发明的术语“变体”意指因至少一个氨基酸置换、修饰、缺失和/或添加而不同的任何氨基酸序列，其中变体的氨基酸序列仍与所提及的相应多肽或蛋白的原始序列的氨基序列，优选特定多肽或蛋白的整个长度，优选至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％相同。变体可为等位基因变体或任何其他物种特异性同系物、旁系同源物或直系同源物。此外，本文中所指的变体包括上文从CRF中提及的各多肽或蛋白的片段，前提是这些片段具有基本上相同的生物学或病理生理学性质。此外，本文中所指的变体包括上文从CRF中提及的各多肽或蛋白与多肽的融合蛋白，所述融合蛋白适合作为固定手段、标记手段或标记，前提是此种融合蛋白基本上维持上文从CRF中提及的各原始多肽或蛋白的相同的生物学、优选免疫性质。变体可进一步包括通过糖基化或者任何其他化学或酶促修饰对所述多肽或蛋白修饰，前提是这些变体具有与上文所指的基本上相同的生物学、优选免疫性质。根据本发明的变体可包括不改变或大致上不改变生物活性的所谓‘沉默’置换、添加和缺失。更具体而言，根据本发明的变体可对一或多个氨基酸残基已做了修饰，所述氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基、优选保守氨基酸残基置换，或此类变体中一或多个氨基酸残基可包括已置换基团。此类变体被认为在本文教导的范围内。最通常地，‘沉默’变体是通过保守性氨基酸置换变化的那些。此类置换是多肽中给定氨基酸被具有类似化学特性的另一个氨基酸置换的那些。在这点上理解为保守性置换的是在以下者之中一个替换另一个：小脂族氨基酸A、V、L和I之中；羟基残基S和T之中；酸性残基D和E之中；酰胺残基N和Q之中；碱性残基K和R之中；以及芳族残基F和Y之中(根据IUPAC命名法的氨基酸单字母密码)。在本发明的一个实施方案中，“变体”享有基本上相同的生物学性质。在本发明的另一个实施方案中，使用CRF成员的“变体”，所述变体显示致病或功能障碍流行，即，与在动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猪、灵长类动物)或人受试者中与心脏受体家族有关的疾病相关联。

根据本发明的术语“生物学性质”特别意指所提及的相应分子的结合性质。在CRF的特定成员的情况下，生物学性质意指其与其生物学或(病理)生理学配体在合适的条件下形成复合物的能力，所述配体尤其是选自肾上腺素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱或其他已知活性递质的一种或多种分子。任选地，术语“生物学性质”可进一步包括多肽的某些特异性免疫性质，例如在多肽可通过相同ELISA法特异性检测的情况下。具体而言，CRF成员如其变体般，在(a)可与分析物抗体相互作用、(b)可通过相同ELISA法检测两者和/或(c)可通过根据本发明的检测方法来检测的情况下表现基本上相同的“生物学性质”。

在本发明的另一个优选实施方案中，一种或多种第一抗原分子和一种或多种第二抗原分子是选自由以下组成的组的一种或多种多肽：α1Α-AR，α1B-AR，α1D-AR，α2A-AR，α2B-AR，α2C-AR，β1-AR，β2-AR，β3-AR，nAChR和mAChR或它们的变体、亚基和片段。

根据本发明的术语“在检测自身抗体的方法的步骤(c)之前提供”意指在接触所述抗原分子和所述分析物抗体之前提供。

根据本发明的术语“检测存在和/或结合性质”意指定性和/或定量测定分析物的相对或绝对量或浓度，优选定量测定。信号可直接或间接获得。直接测量涉及基于得自一种或多种反应离析物和/或反应产物自身的信号来测量反应离析物和/或反应产物中一者或多者的量或浓度，并且所述信号的强度与反应体积中一种或多种反应离析物和/或反应产物的分子数直接相关。此种信号可例如通过测量一种或多种反应离析物和/或反应产物的特定物理或化学性质的强度或值来获得。间接测量包括测量得自在本说明书中称作“标记手段”的次级组分(即，不是反应离析物或反应产物自身的组分)或生物学读出或放大系统的信号，例如借助荧光体、发色团、离子浓度来例如测量可测量的细胞或跨膜响应、配体、或酶促反应产物，所述测量可借助光学、电气和/或电子设备来进行。对于酶促反应产物的测量而言，优选底物的量饱和。任选地，底物还可在反应之前用可检测标记来标记。优选地，反应配偶体与底物接触持续足够的时间段，所述时间段对应于产生一种或多种反应产物的可检测量、诸如可测量信号所必需的时间。代替测量一种或多种反应产物的量或浓度，可测量出现一种或多种反应产物的给定(例如，可检测)量或浓度的所需时间。

根据本发明，术语“检测存在和/或结合性质”涵盖技术人员已知的所有用于测定反应离析物和/或反应产物的量的方式。所述方式包括用于进行免疫测定法的方法和装置，可利用呈各种(例如，夹心、竞争或其他)测定格式的标记或固定分子。所述测定法适合于产生指示反应离析物和/或反应产物存在或不存在的信号。此外，信号强度可优选地直接或间接相关(例如，成比例或成反比)于反应体积中存在的反应离析物和/或反应产物的量。所述方法优选地包括生物传感器、耦接至免疫测定法的光学装置、生物芯片、以及诸如光谱仪或层析装置的分析装置。其他方法包括使用任选地预处理或预涂布的微板、微阵列、管阵列或芯片、全自动或机器免疫测定法的基于ELISA的方法(可例如由Roche-Elecsys^TM、Abbott-AxSYM^TM或Brahms Kryptor^TM分析仪系统获得)。优选地，“检测存在和/或结合性质”包括将使反应配偶体聚到一起持续足够时间段以获得可检测信号的步骤。

根据本发明的术语“结合”包括共价和非共价结合。术语“特异性结合”意指比对其他分子的结合亲和性至少高3倍、优选至少高10倍并且更优选至少高50倍的结合亲和性。在本发明的另一个实施方案中，术语“结合”将意指在体外结合测定法中在合适的条件下结合配偶体的结合，优选在根据测定法制造商的说明书或根据基本上如下文实施例章节中所定义方法的条件下。一般而言，“结合”意指约10^-14M至10^-7M、优选约10^-13M至10^-9M的结合亲和性(K_D意指解离常数与缔合常数的商)。

根据本发明的术语“调节剂”意指任何生物学或化学复合物，大分子(例如，大于约5kDa)，小分子(例如，小于约5kDa甚至小于约800Da)，分离或纯化化合物或其混合物，具有选定细胞、组织或器官来源的粗提物或匀浆，天然化合物或具有合成来源的化合物，包括一种或多种肽、多肽(例如，多克隆或单克隆抗体，包括单链抗体、双抗体、多特异性抗体、人源化抗体、杂交抗体、或它们的片段，诸如Fv、Fab和F(ab)₂片段)、适体、镜像适配体，核酸和/或小分子。

根据本发明的术语“嵌入膜环境中的抗原分子”意指可来源于跨膜蛋白的所述抗原分子被提供于膜模型或另一种两亲性实体中，包括例如细胞、膜、囊泡、胶团或脂质体结构的任何合适的合成、天然或人工环境，借此所述抗原分子维持其功能和/或结构完整性并且能够与上述分析物抗体相互作用并且因此允许所述复合物形成。

用于嵌入膜环境中的蛋白的测定方法是技术人员例如从使用人工或仿生膜或脂双层(本文中“膜模型”)的技术和方法中所周知的。膜模型广泛用于研究膜蛋白的性质并且其中的许多者适合于进行本发明的方法，特别是在应避免所述抗原分子变性的情况下。

根据本发明的术语“膜模型”意指任何脂质体或囊泡，例如，包含呈球形几何形状的一个或多个脂质层的人工产生的囊泡。此类脂质体和囊泡还用作运输脂质、蛋白和小分子的载体并且可用于施用药物中。囊泡或脂质体可通过例如通过声裂和/或挤压破裂来自选定细胞培养物、组织、器官或亚细胞结构(例如，核、高尔基体、内质网、线粒体)的生物膜并且随后自体再组装脂质结构而制备，借此例如用染料、多肽或其他标记手段来标记是可能的。其他“膜模型”可包含已在体外合成组装的脂双层。它们可由一种或多种合成和/或天然脂质制成。

术语“膜模型”可进一步包括例如黑脂膜(BLM)、囊泡、脂双层、脂质体、胶团、双层膜微胞、杂交双层(包含疏水单层和脂单层)和纳米磷脂盘，所述膜模型可锚定、负载或束缚于固相或固体基质，并且可任选地被提供有可使膜和/或上述抗原分子离固体基质维持一段距离的间隔物或垫层(例如，聚乙二醇、寡核苷酸、肽、多肽(例如，链霉亲和素)或水凝胶)。优选地，间隔物或垫层是亲水分子。与囊泡或细胞膜对比，上述负载双层可具有坐在固体支撑物上的平面结构。因此，仅双层的上面暴露于溶液。例如，蛋白脂质体的制备从在实施例1至20中公开脂质体制备的专利申请EP 1992688 A1中已知。

根据本发明的术语“胶团”意指不具有脂双层的另一类型的膜模型。在含水溶液中，胶团是其中其亲水部分暴露于极性溶剂并且其疏水部分处于中心的两亲性分子(例如，去污剂)的集合。胶团能够通过部分嵌入膜蛋白并且使其疏水表面屏蔽极性溶剂来使膜蛋白溶解。术语“双层膜微胞”意指通常由两种脂质构成的又一类型的膜模型，所述脂质中的一者形成脂双层而另一者是使双层中心屏蔽周围溶剂分子的两亲性类胶团集合。术语“纳米磷脂盘”意指嵌入两亲性蛋白、脂质或去污剂层包被的脂双层区段。膜蛋白也可通过纳米磷脂盘来整合和溶解。

根据本发明的术语“与心脏受体家族有关的疾病”(“DRCRF”)意指与CRF的一个或多个成员、优选是如上文定义的AR或ACR的多肽、更优选指CRF的所述成员中一者、两者或三者有关的任何病症或功能障碍。

根据本发明的术语“DRCRF”优选意指具有持久或中间性质的病症，所述病症选自由高压功能障碍、高血压、扩张心肌病、青光眼、慢性疲劳、痴呆和自身免疫病症组成的组，尤其是具有持久性质的所述病症，并且最优选具有自身免疫来源的所述病症中的一者。

根据本发明的术语“固定手段”意指适合于根据技术人员的知识将所述第一抗原分子固定至固体支撑物、优选维持其结构和/或功能完整性的任何试剂和/或方法。相对于根据本发明采用的固体支撑物种类和条件，它们并不与通常使用的材料、方法和已知免疫测定技术中采用的条件有所不同。根据本发明所使用的固体支撑物可包括如当前在已知ELISA技术中采用的ELISA板，或可采用用于本发明中的任何其他合适的支撑物，诸如微滴定板(具有96、384、1536或3456个孔或更多)或其部分、管、颗粒、磁珠、硝酸纤维素、芯片技术等。可根据本发明的示教来使用的适合作为固体支撑物的材料是本领域众所周知的，并且包括例如可商购获得的柱材料、聚苯乙烯珠及其他载体、乳胶珠、磁珠、胶体态金属、玻璃表面、硅基化表面、以及用于蛋白微芯片技术中的硅表面和芯片、硝酸纤维素载体、纤维素载体、膜、膜模型、稳定脂质体或细胞(例如，duracytes^TM)、孔，或者反应托盘、容器或微量滴定板、塑料管等的表面。

所述第一抗原分子可固定至技术人员已知的任何载体。此类载体的实例是惰性材料，诸如玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁矿、和金。载体可为可溶或不可溶的，在不可溶载体的情况下，载体是固体或胶体并且可任选地被提供为悬浮液。

用于固定所述抗原分子的合适方法是已知的并且包括但不限于离子、疏水或共价相互作用。还可适合于在悬浮液中使用所述固定手段，例如空心微珠或微球体，任选地属于不同种类，任选地标记，任选地两者携带各自不同的抗原分子。例如从专利US 5,744,305中已知基于固相化学和对光不稳的保护基团的用于产生悬浮液的方法。

根据本发明的术语“标记”意指直接或间接标记。直接标记涉及将标记(“标签”)直接(共价或非共价)偶联至待标记分子。间接标记涉及将第二配体结合(共价或非共价)至待标记分子。此种第二配体在测定法条件下特异性结合至待标记分子(例如，具有高至少3倍、优选至少10倍、并且更优选高至少50倍的亲和性)。所述第二配体还可与合适的标记手段偶联和/或可结合结合至第二配体的第三配体。第二或高次配体的使用可用来增加或放大信号。合适的第二和高次配体可包括抗体、二级抗体和众所周知的链霉亲和素-生物素体系(Vector Laboratories公司)。此外，待标记分子或底物还可用本领域已知的一种或多种标签/标记“加标签”。然后，此类标签可靶向针对高次配体。合适的标签包括生物素、地高辛、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG标签(N-DYKDDDDK-C)、绿色荧光蛋白(GFP)、myc标签、甲型流感病毒血细胞凝集素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签一般位于或接近于N端和/或C端。

此外，待标记分子或底物还可被提供有本领域已知的合适“间隔物”分子以便避免在庞大分子的情况下因空间压缩所致的相对于结合性质的任何立体限制。

根据本发明的术语“第一标记手段”意指可直接或间接检测的标记手段，优选选自以下的组：酶，放射性同位素，用于化学发光、生物发光、荧光的染料或其前体，以及磁性标签(例如，“磁珠”，包括顺磁性和超顺磁性标记)。“第一标记手段”可通过本领域已知的适当检测方法来检测。合适的标记可进一步包括金颗粒、乳胶珠、吖啶酯、鲁米诺和钌。酶促活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶和它们的衍生物。用于直接或间接检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(氯化硝基四氮唑蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐、CDP-Star^TM(AmershamBiosciences)、ECL^TM(Amersham Biosciences)和本领域已知的其他者。合适的酶-底物组合可导致显色反应产物或离析物(发色团、荧光、化学或生物发光)增加或减少，这可通过已知方法(例如，使用光度计、光电倍增器和感光胶片或照相机系统)来检测。相同的原理在测量酶促反应的终点、进行或速度时适用于量化。

已知的荧光标记包括荧光染料和蛋白(诸如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素、和Alexa染料系列(例如，Alexa 568)、以及量子点。许多合适的荧光标记可商购获得。荧光蛋白的实例包括但不限于绿色、黄色、青色、蓝色和红色荧光蛋白。

合适的化学发光或生物发光标记可包括原核(例如，细菌lux编码的)或真核(例如，萤火虫luc编码的)荧光素酶，以及拥有变化或改变的光学性质的变体，诸如发出不同颜色光的荧光素酶，例如来源于东方萤火虫(Photinus pyralis)、居蟹皮海绵(Suberitesdomuncula)和小菇属(Mycena)真菌。此外，发光蛋白、例如钙激活发光蛋白及其特定设计的变体可为合适的，其发出通常在200nm至1100nm范围内、或在可见光谱(即，350nm至800nm)内的光，例如，来自海生水螅体长薮枝螅水母(Obelia longissima)的螅蛋白，或例如来自发光水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)或其他生物体的水母发光蛋白可为合适的，任选地处于膜中。

合适的放射性标记包括³⁵S、¹²⁵I、³²P、³³P及其他核素。放射性标记可通过已知和适当的任何方法、例如感光胶片或磷光体成像器来检测。

用于进行本发明的合适检测方法还包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电致化学发光)、生物发光、RIA(放射免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、夹心酶免疫试验、夹心免疫测定法(ECLIA)、解离增强镧系荧光免疫测定法(DELFIA^TM，美国PerkinElmer公司)、闪烁迫近测定法(SPA)、浊度测定法、散射测浊法、乳胶增强浊度测定法或散射测浊法、乳胶凝集测定法、或固相免疫测定法，优选排除沉淀。

本领域已知的其他方法(诸如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法和质谱)可任选地与如上文所述的标记或其他检测方法组合使用。

根据本发明的术语“第二标记手段”意指任何可直接或间接检测的标记手段，选自以下的组：酶，放射性同位素，用于化学发光、生物发光、荧光的染料或其前体，以及磁性标签(例如，“磁珠”，包括顺磁性和超顺磁性标记)。优选地，“第一标记手段”是非放射性标记，更优选“第一标记手段”和“第二标记手段”是非放射性的。术语“第二标记手段”的使用意指“第二标记手段”不与“第一标记手段”相同。技术人员可知如何选择第一和第二标记手段以确保来自第一和第二标记手段的信号可在根据本发明的检测方法中可区别地检测。合适的第二标记手段可通过本领域已知的适当检测方法、例如基于共振能量转移(RET)原理来检测。优选地，“第二标记手段”包括适合于如技术人员已知的荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)或化学发光共振能量转移(CRET)的标记手段。当选择合适的第二标记手段时，技术人员考虑第一标记手段的种类以便确保RET信号可检测和可区别。例如，合适标记手段的RET信号产生和选择可提供关于复合物形成的种类和动力学和所形成复合物的结构特征的额外信息。

序列：

Seq.ID No.1LUC DNA序列

Seq.ID No.2LUC蛋白质序列

Seq.ID No.3引物P1 Luc Fw

Seq.ID No.4引物P2 Luc Rv

Seq.ID No.5cDNA B1

Seq.ID No.6AA B1

Seq.ID No.7引物P3 B1 Fw

Seq.ID No.8引物P4 B1 Rv

Seq.ID No.9cDNA B1-Luc

Seq.ID No.10AA B1-Luc

Seq.ID No.11cDNA B2

Seq.ID No.12AA B2

Seq.ID No.13引物P5 B2 Fw

Seq.ID No.14引物P6 B2 Rv

Seq.ID No.15cDNA B2 Luc

Seq.ID No.16AA B2 Luc

Seq.ID No.17cDNA M2

Seq.ID No.18AA M2

Seq.ID No.19引物P7 M2 Fw

Seq.ID No.20引物P8 M2 Rv

Seq.ID No.21cDNA M2 Luc

Seq.ID No.22AA M2 Luc

Seq.ID No.23引物P9 B2 2b5 Bac Fw

Seq.ID No.24引物P10 B2 2b5 Bac Rv

本发明将通过不限制本发明范围的以下实施例和比较实施例来例示。

实验程序：

材料：

DNA引物得自Life Technologies(美国CA，Carlsbad)；pSP-luc+NF载体得自Promega公司(德国Mannheim)；pIRESneo载体得自Clontech(美国CA，Palo Alto)；载体pFastBac1和High Five^TM昆虫细胞得自Invitrogen(美国CA，Carlsbad)；涂布有PGA14抗体(Selenotest LIA)的聚苯乙烯管得自ICI immunochemical intelligence公司(德国Berlin)。如果不另外规定，其他试剂和化学品得自Sigma-Aldrich Chemie GmbH(德国Munich)或Merck KGaA(德国Darmstadt)；酶得自Promega(美国WI，Madison)或New EnglandBiolabs(美国MA，Ipswich)。

实施例1：构造融合蛋白

实施例1A：构造β1肾上腺素能受体-荧光素酶融合蛋白

编码萤火虫荧光素酶(在质粒pSP-luc+NF上的Seq.ID No.2)的氨基酸2-551的DNA(Seq.ID No.1)通过使用分别含有EcoRI和BamHI限制性位点的引物P1(Seq.ID No.3)和P2(Seq.ID No.4)的PCR(‘聚合酶链式反应’)来扩增。用EcoRI和BamHI限制性核酸内切酶消化质粒pIRESneo；所得片段被得自上述PCR的编码萤火虫荧光素酶的DNA替换，因此产生质粒pIRESneo-Luc。编码人β1肾上腺素能受体(Seq.ID No.6)的氨基酸1-469的cDNA(Seq.IDNo.5)通过使用分别含有EcoRV和EcoRI限制性位点的引物P3(Seq.ID No.7)和P4(Seq.IDNo.8)的PCR来扩增。用EcoRV和EcoRI限制性核酸内切酶消化pIRESneo-Luc并且所得片段被得自先前PCR的编码人β1肾上腺素能受体的DNA序列替换，从而产生含有编码标记融合蛋白Seq.ID No.10的Seq.ID No.9的载体pIRESneo-B1-Luc。

实施例1B：构造β2肾上腺素能受体-荧光素酶融合蛋白

编码人β2肾上腺素能受体(Seq.ID No.12)的氨基酸1-413的cDNA(Seq.ID No.11)通过使用分别含有Not1和EcoR1限制性位点的引物P5(Seq.ID No.13)和P6(Seq.ID No.14)的PCR来扩增。用NotI和EcoRI限制性核酸内切酶消化pIRESneo-Luc并且用得自先前PCR的编码β2肾上腺素能受体的DNA序列替换所得片段，从而产生含有编码标记融合蛋白Seq.IDNo.16的Seq.ID No.15的载体pIRESneo-B2-Luc。

实施例1C：构造M2毒蕈碱性受体-荧光素酶融合蛋白

编码M2毒蕈碱性受体(Seq.ID No.18)的氨基酸1-466的cDNA(Seq.ID No.17)通过使用分别含有EcoRV和EcoR1限制性位点的引物P7(Seq.ID No.19)和P8(Seq.ID No.20)的PCR来扩增。用EcoRV和EcoR1限制性核酸内切酶消化质粒pIRESneo-Luc，并且用得自先前PCR的编码M2毒蕈碱性受体的DNA序列替换所得片段，从而产生含有编码标记融合蛋白Seq.ID No.22的Seq.ID No.21的载体pIRESneo-M2-Luc。

实施例1D：构造β2肾上腺素能受体和由PGA14抗体识别的表位的融合蛋白

编码β2肾上腺素能受体(Seq.ID No.12)的氨基酸1-413的cDNA(Seq.ID No.11)通过使用分别含有BamHI和HindIII限制性位点的引物P9(Seq.ID No.23)和P10(Seq.IDNo.24)的PCR来扩增(P10含有由PGA14抗体识别的16个氨基酸表位的编码序列)。用BamHI和HindIII限制性核酸内切酶消化pFastBac1载体并且所得片段被得自上述PCR的编码β2肾上腺素能受体和PGA14表位的融合蛋白的DNA序列替换，从而产生载体pFastBac1-B2-PGA14标签。

实施例2：制造产生B1-Luc、B2-Luc和M2-Luc的细胞

实施例2A：制造产生B1-Luc、B2-Luc和M2-Luc的HEK 293

在5％CO₂和37℃，HEK 293细胞生长于补充有10％胎牛血清的DMEM-F12中。根据制造商的说明书，使用FuGENE6转染试剂(得自德国Grenzach-Wyhlen，Roche DeutschlandHolding公司)，用质粒pIRESneo-B1-Luc、pIRESneo-B2-Luc或pIRESneo-M2-Luc之一转染HEK 293细胞。在转染之后48小时，用0.8mg/ml G418(Gibco^TMBRL，Invitrogen)开始选择。选择表达高水平融合蛋白的稳定克隆。

实施例2B：制造B1-Luc、B2-Luc和M2-Luc细胞提取物

收获生长于75cm²平皿中的汇合HEK293细胞(产生B1-LUC、B2-LUC或M2-LUC)并且再悬浮于PBS中。通过用PBS离心来清洗细胞。在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5；100mMNaCl；10％甘油；1％triton X-100)中裂解所得细胞。离心悬浮液，从碎屑中移除上清液并且存储在-80℃。

实施例2C：制造表达融合蛋白B2-PGA14标签的重组杆状病毒

将得自实施例1D的B2-PGA14标签序列通过细菌中的位点特异性重组转移至杆粒DNA。然后，根据制造商的规程(Invitrogen的Bac-to-Bac表达系统手册)，杆粒被用来在Sf9昆虫细胞中产生完全重组的杆状病毒。

实施例2D：制造B2-PGA14标签融合蛋白

High Five^TM昆虫细胞的悬浮液在Express Five^TM无血清介质中生长至2×l0⁶个细胞/ml的密度。然后，以1的感染复数(MOI)用重组B2-PGA14标签-杆状病毒感染(转导)细胞。在感染后72小时收获细胞并且将提取物收集并存储在-80℃，如实施例2B中所描述的。

比较实施例3：针对B2自身抗体(B2-aAb's)的免疫沉淀测定

将得自实施例2B的B2-Luc细胞提取物用含有50mM Tris-HCl pH 7.5、100mMNaCl、1％Triton X-100、10％甘油、5mg/ml BSA的缓冲液稀释20倍。将100μl稀释提取物(约10⁷RLU)与10μl样本(血清探针)混合并且在4℃孵育过夜。随后通过在室温下在上述缓冲液中添加10μl 10％蛋白A-琼脂糖(POROS^TM，Life Technologies)悬浮液伴随振荡持续1h来沉淀免疫复合物。沉淀蛋白A-琼脂糖并且用1ml清洗缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 7.5、100mMNaCl、0.1％Triton X-100)清洗3次。最后，在Berthold光度计(AutoLumat Plus LB 953)中测量沉淀的免疫复合物的荧光素酶活性持续10秒。结果表示为RLU界限。表1显示出B2-aAb阳性血清和B2-aAb阴性血清的活性。

实施例4：桥联测定法

实施例4A：用于检测B2-aAb的桥联测定法

涂布有PGA14抗体的聚苯乙烯管(ICI immunochemical)在4℃用200μl含有B2-PGA14标签的SF6昆虫细胞孵育过夜。在B2-PGA14标签固定之后，将管用1ml缓冲液20mMTris-HCl pH 7.5、50mM NaCl、10％甘油清洗两次。然后，将每个管用含有10mg/ml BSA的100μl上述缓冲液和100μl样本(血清探针)的混合物在4℃孵育过夜。将管用1ml上述缓冲液清洗两次并且在4℃用200μl如上文在实施例2B中所述获得的B2-Luc孵育过夜，在含BSA的上述缓冲液中(约40×10⁶RLU荧光素酶活性)稀释。在孵育之后，将管清洗四次并且在Berthold光度计(AutoLumat Plus LB 953)中测量荧光素酶活性持续10秒。表1中所示的结果表示为RLU(相对光单位)界限并且与得自实施例3的常规测定法的结果相比。

表1：得自常规免疫沉淀(实施例3)和本发明的测定法(实施例4)中的阳性和阴性血清的信号。

实施例4B：针对来自人血清的B2-aAb的测定法的检测限

将每3份B2-aAb阳性和阴性血清稀释于20mM Tris-HCl、pH 7.5、50mM NaCl、10％甘油、10mg/ml BSA中。测定法如实施例4A中所述的进行。背景信号仅通过缓冲液获得。

表2：B2-aAb阳性和阴性血清的稀释

实施例4C：人血清中B2-aAb的恢复速率

三份人B2-aAb阳性血清(P1-P3)用阴性血清(K1-K3)1:1混合并且如实施例4A中所述的分析(表3)。

表3：B2-aAb的恢复速率

实施例4D：抗原直接涂布于塑性表面

三份人B2-aAb阳性血清和三份B2-aAb阴性血清如实施例4A中所述的分析，尽管具有差异，但在用直接未涂布的聚苯乙烯管(Berlin，ICI immunochemical intelligence公司)检测之前孵育来自实施例2D的B2-PGA14标签融合复合物。对照恰如4A中所述的分析(表4)。

表4：管涂布的效应

实施例4E：特异性检测

三份人B2-aAb阳性血清和三份B2-aAb阴性血清如实施例4A中所述的分析，具有差异，用1:500稀释的HRP偶联家兔抗人IgG(德国Hamburg，DIANOVA)代替来自实施例2B的B2-Luc提取物来进行测定(表5)。

表5：检测方法的效应

	RLU
		P1	2632746
P2	2357224
		P3	2468791
K1	2586937
		K2	2703475
K3	2638210
		对照P1	69754
对照K1	953
		无血清对照	392

实施例4F：抗B2抗体的检测限。

将已知量的抗B2抗体(美国，California，Santa Cruz，sc-569)稀释于缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 7.5、50mM NaCl、10％甘油、10mg/ml BSA)中，如表中所示并且如实施例4A中所述分析。

表6：抗B2抗体的检测限

实施例4G：异桥联

三份B2-aAb阳性血清如实施例4A中所述分析。B2-aAb交叉反应性的检测使用在4℃在具有BSA的缓冲液中用200μL来自实施例2B的稀释的B2-Luc提取物、稀释的B1-Luc提取物或稀释的M2-Luc提取物(B1和B2为40×10⁶RLU荧光素酶活性，M2为0.5×10⁶RLU荧光素酶活性)过夜孵育来进行(表7)。

表7：B2-aAb和B1或M2受体的交叉反应性

实施例5：在人体中B2-aAb水平的临床关联性

表8显示出在人体中B2-aAb存在的患者血清的体重量(肥胖症和糖尿病风险)和年龄的平均值(和标准差)。

表8

序列表

<110> 德国夏瑞蒂医学院

<120> 用于检测抗心脏受体家族成员的抗体的方法

<130> BYEP1719

<150> DE102014226663.7

<151> 2014-12-19

<160> 24

<170> BiSSAP 1.3.2

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> Photinus pyralis

<400> 1

gtcaccgacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct ggaagatgga 60

accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120

gcttttacag atgcacatat cgaggtggac atcacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc 180

gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240

tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300

gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt 360

tcgcagccta ccgtggtgtt cgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420

aaaaagctcc caatcatcca aaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480

tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540

tttgtgccag agtccttcga tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga 600

tctactggtc tgcctaaagg tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg 660

catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720

gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780

cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac 840

aagattcaaa gtgcgctgct ggtgccaacc ctattctcct tcttcgccaa aagcactctg 900

attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960

aaggaagtcg gggaagcggt tgccaagagg ttccatctgc caggtatcag gcaaggatat 1020

gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080

gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140

acgctgggcg ttaatcaaag aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt 1200

tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260

ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cctgaagtct 1320

ctgattaagt acaaaggcta tcaggtggct cccgctgaat tggaatccat cttgctccaa 1380

caccccaaca tcttcgacgc aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440

cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500

tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560

gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620

aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taa 1653

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> Photinus pyralis

<400> 2

Val Thr Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

20 25 30

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu

35 40 45

Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala

50 55 60

Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val

65 70 75 80

Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu

85 90 95

Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg

100 105 110

Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val

115 120 125

Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro

130 135 140

Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly

145 150 155 160

Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe

165 170 175

Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile

180 185 190

Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val

195 200 205

Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp

210 215 220

Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val

225 230 235 240

Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu

245 250 255

Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val

275 280 285

Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr

290 295 300

Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser

305 310 315 320

Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile

325 330 335

Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr

340 345 350

Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe

355 360 365

Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val

370 375 380

Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly

385 390 395 400

Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly

405 410 415

Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe

420 425 430

Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln

435 440 445

Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile

450 455 460

Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu

465 470 475 480

Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys

485 490 495

Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu

500 505 510

Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly

515 520 525

Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Lys Ile Ala Val

545 550

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 3

attgaattcg tcaccgacgc caaaaac 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 4

attggatcct tacacggcga tctttcc 27

<210> 5

<211> 1431

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atgggcgcgg gggtgctcgt cctgggcgcc tccgagcccg gtaacctgtc gtcggccgca 60

ccgctccccg acggcgcggc caccgcggcg cggctgctgg tgcccgcgtc gccgcccgcc 120

tcgttgctgc ctcccgccag cgaaagcccc gagccgctgt ctcagcagtg gacagcgggc 180

atgggtctgc tgatggcgct catcgtgctg ctcatcgtgg cgggcaatgt gctggtgatc 240

gtggccatcg ccaagacgcc gcggctgcag acgctcacca acctcttcat catgtccctg 300

gccagcgccg acctggtcat ggggctgctg gtggtgccgt tcggggccac catcgtggtg 360

tggggccgct gggagtacgg ctccttcttc tgcgagctgt ggacctcagt ggacgtgctg 420

tgcgtgacgg ccagcatcga gaccctgtgt gtcattgccc tggaccgcta cctcgccatc 480

acctcgccct tccgctacca gagcctgctg acgcgcgcgc gggcgcgggg cctcgtgtgc 540

accgtgtggg ccatctcggc cctggtgtcc ttcctgccca tcctcatgca ctggtggcgg 600

gcggagagcg acgaggcgcg ccgctgctac aacgacccca agtgctgcga cttcgtcacc 660

aaccgggcct acgccatcgc ctcgtccgta gtctccttct acgtgcccct gtgcatcatg 720

gccttcgtgt acctgcgggt gttccgcgag gcccagaagc aggtgaagaa gatcgacagc 780

tgcgagcgcc gtttcctcgg cggcccagcg cggccgccct cgccctcgcc ctcgcccgtc 840

cccgcgcccg cgccgccgcc cggacccccg cgccccgccg ccgccgccgc caccgccccg 900

ctggccaacg ggcgtgcggg taagcggcgg ccctcgcgcc tcgtggccct gcgcgagcag 960

aaggcgctca agacgctggg catcatcatg ggcgtcttca cgctctgctg gctgcccttc 1020

ttcctggcca acgtggtgaa ggccttccac cgcgagctgg tgcccgaccg cctcttcgtc 1080

ttcttcaact ggctgggcta cgccaactcg gccttcaacc ccatcatcta ctgccgcagc 1140

cccgacttcc gcaaggcctt ccagggactg ctctgctgcg cgcgcagggc tgcccgccgg 1200

cgccacgcga cccacggaga ccggccgcgc gcctcgggct gtctggcccg gcccggaccc 1260

ccgccatcgc ccggggccgc ctcggacgac gacgacgacg atgtcgtcgg ggccacgccg 1320

cccgcgcgcc tgctggagcc ctgggccggc tgcaacggcg gggcggcggc ggacagcgac 1380

tcgagcctgg acgagccgtg ccgccccggc ttcgcctcgg aatccaaggt g 1431

<210> 6

<211> 496

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Gly Ala Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Ser Glu Pro Gly Asn Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ala Pro Leu Pro Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ala Arg Leu

20 25 30

Leu Val Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro Ala Ser Glu

35 40 45

Ser Pro Glu Pro Leu Ser Gln Gln Trp Thr Ala Gly Met Gly Leu Leu

50 55 60

Met Ala Leu Ile Val Leu Leu Ile Val Ala Gly Asn Val Leu Val Ile

65 70 75 80

Val Ala Ile Ala Lys Thr Pro Arg Leu Gln Thr Leu Thr Asn Leu Phe

85 90 95

Ile Met Ser Leu Ala Ser Ala Asp Leu Val Met Gly Leu Leu Val Val

100 105 110

Pro Phe Gly Ala Thr Ile Val Val Trp Gly Arg Trp Glu Tyr Gly Ser

115 120 125

Phe Phe Cys Glu Leu Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala

130 135 140

Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile

145 150 155 160

Thr Ser Pro Phe Arg Tyr Gln Ser Leu Leu Thr Arg Ala Arg Ala Arg

165 170 175

Gly Leu Val Cys Thr Val Trp Ala Ile Ser Ala Leu Val Ser Phe Leu

180 185 190

Pro Ile Leu Met His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg

195 200 205

Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Ala Tyr

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Ser Val Val Ser Phe Tyr Val Pro Leu Cys Ile Met

225 230 235 240

Ala Phe Val Tyr Leu Arg Val Phe Arg Glu Ala Gln Lys Gln Val Lys

245 250 255

Lys Ile Asp Ser Cys Glu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Pro Ala Arg Pro

260 265 270

Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Gly

275 280 285

Pro Pro Arg Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Pro Leu Ala Asn Gly

290 295 300

Arg Ala Gly Lys Arg Arg Pro Ser Arg Leu Val Ala Leu Arg Glu Gln

305 310 315 320

Lys Ala Leu Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Val Phe Thr Leu Cys

325 330 335

Trp Leu Pro Phe Phe Leu Ala Asn Val Val Lys Ala Phe His Arg Glu

340 345 350

Leu Val Pro Asp Arg Leu Phe Val Phe Phe Asn Trp Leu Gly Tyr Ala

355 360 365

Asn Ser Ala Phe Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg

370 375 380

Lys Ala Phe Gln Gly Leu Leu Cys Cys Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg

385 390 395 400

Arg His Ala Thr His Gly Asp Arg Pro Arg Ala Ser Gly Cys Leu Ala

405 410 415

Arg Pro Gly Pro Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ala Ser Asp Asp Asp Asp

420 425 430

Asp Asp Val Val Gly Ala Thr Pro Pro Ala Arg Leu Leu Glu Pro Trp

435 440 445

Ala Gly Cys Asn Gly Gly Ala Ala Ala Asp Ser Asp Ser Ser Leu Asp

450 455 460

Glu Pro Cys Arg Pro Gly Phe Ala Ser Glu Ser Lys Val Phe Ala Ser

465 470 475 480

Glu Ser Lys Val Gly Gln His Arg Gln Gly His Pro Glu Asn Arg Asp

485 490 495

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 7

atagatatca tgggcgcggg ggtgctcgtc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 8

atagaattcc accttggatt ccgaggcgaa 30

<210> 9

<211> 3084

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

atgggcgcgg gggtgctcgt cctgggcgcc tccgagcccg gtaacctgtc gtcggccgca 60

ccgctccccg acggcgcggc caccgcggcg cggctgctgg tgcccgcgtc gccgcccgcc 120

tcgttgctgc ctcccgccag cgaaagcccc gagccgctgt ctcagcagtg gacagcgggc 180

atgggtctgc tgatggcgct catcgtgctg ctcatcgtgg cgggcaatgt gctggtgatc 240

gtggccatcg ccaagacgcc gcggctgcag acgctcacca acctcttcat catgtccctg 300

gccagcgccg acctggtcat ggggctgctg gtggtgccgt tcggggccac catcgtggtg 360

tggggccgct gggagtacgg ctccttcttc tgcgagctgt ggacctcagt ggacgtgctg 420

tgcgtgacgg ccagcatcga gaccctgtgt gtcattgccc tggaccgcta cctcgccatc 480

acctcgccct tccgctacca gagcctgctg acgcgcgcgc gggcgcgggg cctcgtgtgc 540

accgtgtggg ccatctcggc cctggtgtcc ttcctgccca tcctcatgca ctggtggcgg 600

gcggagagcg acgaggcgcg ccgctgctac aacgacccca agtgctgcga cttcgtcacc 660

aaccgggcct acgccatcgc ctcgtccgta gtctccttct acgtgcccct gtgcatcatg 720

gccttcgtgt acctgcgggt gttccgcgag gcccagaagc aggtgaagaa gatcgacagc 780

tgcgagcgcc gtttcctcgg cggcccagcg cggccgccct cgccctcgcc ctcgcccgtc 840

cccgcgcccg cgccgccgcc cggacccccg cgccccgccg ccgccgccgc caccgccccg 900

ctggccaacg ggcgtgcggg taagcggcgg ccctcgcgcc tcgtggccct gcgcgagcag 960

aaggcgctca agacgctggg catcatcatg ggcgtcttca cgctctgctg gctgcccttc 1020

ttcctggcca acgtggtgaa ggccttccac cgcgagctgg tgcccgaccg cctcttcgtc 1080

ttcttcaact ggctgggcta cgccaactcg gccttcaacc ccatcatcta ctgccgcagc 1140

cccgacttcc gcaaggcctt ccagggactg ctctgctgcg cgcgcagggc tgcccgccgg 1200

cgccacgcga cccacggaga ccggccgcgc gcctcgggct gtctggcccg gcccggaccc 1260

ccgccatcgc ccggggccgc ctcggacgac gacgacgacg atgtcgtcgg ggccacgccg 1320

cccgcgcgcc tgctggagcc ctgggccggc tgcaacggcg gggcggcggc ggacagcgac 1380

tcgagcctgg acgagccgtg ccgccccggc ttcgcctcgg aatccaaggt ggtcaccgac 1440

gccaaaaaca taaagaaagg cccggcgcca ttctatccgc tggaagatgg aaccgctgga 1500

gagcaactgc ataaggctat gaagagatac gccctggttc ctggaacaat tgcttttaca 1560

gatgcacata tcgaggtgga catcacttac gctgagtact tcgaaatgtc cgttcggttg 1620

gcagaagcta tgaaacgata tgggctgaat acaaatcaca gaatcgtcgt atgcagtgaa 1680

aactctcttc aattctttat gccggtgttg ggcgcgttat ttatcggagt tgcagttgcg 1740

cccgcgaacg acatttataa tgaacgtgaa ttgctcaaca gtatgggcat ttcgcagcct 1800

accgtggtgt tcgtttccaa aaaggggttg caaaaaattt tgaacgtgca aaaaaagctc 1860

ccaatcatcc aaaaaattat tatcatggat tctaaaacgg attaccaggg atttcagtcg 1920

atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct cccggtttta atgaatacga ttttgtgcca 1980

gagtccttcg atagggacaa gacaattgca ctgatcatga actcctctgg atctactggt 2040

ctgcctaaag gtgtcgctct gcctcataga actgcctgcg tgagattctc gcatgccaga 2100

gatcctattt ttggcaatca aatcattccg gatactgcga ttttaagtgt tgttccattc 2160

catcacggtt ttggaatgtt tactacactc ggatatttga tatgtggatt tcgagtcgtc 2220

ttaatgtata gatttgaaga agagctgttt ctgaggagcc ttcaggatta caagattcaa 2280

agtgcgctgc tggtgccaac cctattctcc ttcttcgcca aaagcactct gattgacaaa 2340

tacgatttat ctaatttaca cgaaattgct tctggtggcg ctcccctctc taaggaagtc 2400

ggggaagcgg ttgccaagag gttccatctg ccaggtatca ggcaaggata tgggctcact 2460

gagactacat cagctattct gattacaccc gagggggatg ataaaccggg cgcggtcggt 2520

aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt gtggatctgg ataccgggaa aacgctgggc 2580

gttaatcaaa gaggcgaact gtgtgtgaga ggtcctatga ttatgtccgg ttatgtaaac 2640

aatccggaag cgaccaacgc cttgattgac aaggatggat ggctacattc tggagacata 2700

gcttactggg acgaagacga acacttcttc atcgttgacc gcctgaagtc tctgattaag 2760

tacaaaggct atcaggtggc tcccgctgaa ttggaatcca tcttgctcca acaccccaac 2820

atcttcgacg caggtgtcgc aggtcttccc gacgatgacg ccggtgaact tcccgccgcc 2880

gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg acggaaaaag agatcgtgga ttacgtcgcc 2940

agtcaagtaa caaccgcgaa aaagttgcgc ggaggagttg tgtttgtgga cgaagtaccg 3000

aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga aaaatcagag agatcctcat aaaggccaag 3060

aagggcggaa agatcgccgt gtaa 3084

<210> 10

<211> 1027

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Gly Ala Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Ser Glu Pro Gly Asn Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ala Pro Leu Pro Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ala Arg Leu

20 25 30

Leu Val Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro Ala Ser Glu

35 40 45

Ser Pro Glu Pro Leu Ser Gln Gln Trp Thr Ala Gly Met Gly Leu Leu

50 55 60

Met Ala Leu Ile Val Leu Leu Ile Val Ala Gly Asn Val Leu Val Ile

65 70 75 80

Val Ala Ile Ala Lys Thr Pro Arg Leu Gln Thr Leu Thr Asn Leu Phe

85 90 95

Ile Met Ser Leu Ala Ser Ala Asp Leu Val Met Gly Leu Leu Val Val

100 105 110

Pro Phe Gly Ala Thr Ile Val Val Trp Gly Arg Trp Glu Tyr Gly Ser

115 120 125

Phe Phe Cys Glu Leu Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala

130 135 140

Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile

145 150 155 160

Thr Ser Pro Phe Arg Tyr Gln Ser Leu Leu Thr Arg Ala Arg Ala Arg

165 170 175

Gly Leu Val Cys Thr Val Trp Ala Ile Ser Ala Leu Val Ser Phe Leu

180 185 190

Pro Ile Leu Met His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg

195 200 205

Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Ala Tyr

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Ser Val Val Ser Phe Tyr Val Pro Leu Cys Ile Met

225 230 235 240

Ala Phe Val Tyr Leu Arg Val Phe Arg Glu Ala Gln Lys Gln Val Lys

245 250 255

Lys Ile Asp Ser Cys Glu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Pro Ala Arg Pro

260 265 270

Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Gly

275 280 285

Pro Pro Arg Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Pro Leu Ala Asn Gly

290 295 300

Arg Ala Gly Lys Arg Arg Pro Ser Arg Leu Val Ala Leu Arg Glu Gln

305 310 315 320

Lys Ala Leu Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Val Phe Thr Leu Cys

325 330 335

Trp Leu Pro Phe Phe Leu Ala Asn Val Val Lys Ala Phe His Arg Glu

340 345 350

Leu Val Pro Asp Arg Leu Phe Val Phe Phe Asn Trp Leu Gly Tyr Ala

355 360 365

Asn Ser Ala Phe Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg

370 375 380

Lys Ala Phe Gln Gly Leu Leu Cys Cys Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg

385 390 395 400

Arg His Ala Thr His Gly Asp Arg Pro Arg Ala Ser Gly Cys Leu Ala

405 410 415

Arg Pro Gly Pro Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ala Ser Asp Asp Asp Asp

420 425 430

Asp Asp Val Val Gly Ala Thr Pro Pro Ala Arg Leu Leu Glu Pro Trp

435 440 445

Ala Gly Cys Asn Gly Gly Ala Ala Ala Asp Ser Asp Ser Ser Leu Asp

450 455 460

Glu Pro Cys Arg Pro Gly Phe Ala Ser Glu Ser Lys Val Val Thr Asp

465 470 475 480

Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp

485 490 495

Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu

500 505 510

Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asp Ile

515 520 525

Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala Glu Ala Met

530 535 540

Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val Cys Ser Glu

545 550 555 560

Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly

565 570 575

Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu

580 585 590

Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys

595 600 605

Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gln

610 615 620

Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser

625 630 635 640

Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr

645 650 655

Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile

660 665 670

Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro

675 680 685

His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe

690 695 700

Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val Val Pro Phe

705 710 715 720

His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly

725 730 735

Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg

740 745 750

Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu

755 760 765

Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser

770 775 780

Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val

785 790 795 800

Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile Arg Gln Gly

805 810 815

Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro Glu Gly

820 825 830

Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe Phe Glu Ala

835 840 845

Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gln Arg

850 855 860

Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr Val Asn

865 870 875 880

Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His

885 890 895

Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe Ile Val

900 905 910

Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro

915 920 925

Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala

930 935 940

Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala

945 950 955 960

Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Ile Val

965 970 975

Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly

980 985 990

Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp

995 1000 1005

Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys

1010 1015 1020

Ile Ala Val

1025

<210> 11

<211> 1239

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

atggggcaac ccgggaacgg cagcgccttc ttgctggcac ccaatagaag ccatgcgccg 60

gaccacgacg tcacgcagca aagggacgag gtgtgggtgg tgggcatggg catcgtcatg 120

tctctcatcg tcctggccat cgtgtttggc aatgtgctgg tcatcacagc cattgccaag 180

ttcgagcgtc tgcagacggt caccaactac ttcatcactt cactggcctg tgctgatctg 240

gtcatgggcc tggcagtggt gccctttggg gccgcccata ttcttatgaa aatgtggact 300

tttggcaact tctggtgcga gttttggact tccattgatg tgctgtgcgt cacggccagc 360

attgagaccc tgtgcgtgat cgcagtggat cgctactttg ccattacttc acctttcaag 420

taccagagcc tgctgaccaa gaataaggcc cgggtgatca ttctgatggt gtggattgtg 480

tcaggcctta cctccttctt gcccattcag atgcactggt accgggccac ccaccaggaa 540

gccatcaact gctatgccaa tgagacctgc tgtgacttct tcacgaacca agcctatgcc 600

attgcctctt ccatcgtgtc cttctacgtt cccctggtga tcatggtctt cgtctactcc 660

agggtctttc aggaggccaa aaggcagctc cagaagattg acaaatctga gggccgcttc 720

catgtccaga accttagcca ggtggagcag gatgggcgga cggggcatgg actccgcaga 780

tcttccaagt tctgcttgaa ggagcacaaa gccctcaaga cgttaggcat catcatgggc 840

actttcaccc tctgctggct gcccttcttc atcgttaaca ttgtgcatgt gatccaggat 900

aacctcatcc gtaaggaagt ttacatcctc ctaaattgga taggctatgt caattctggt 960

ttcaatcccc ttatctactg ccggagccca gatttcagga ttgccttcca ggagcttctg 1020

tgcctgcgca ggtcttcttt gaaggcctat gggaatggct actccagcaa cggcaacaca 1080

ggggagcaga gtggatatca cgtggaacag gagaaagaaa ataaactgct gtgtgaagac 1140

ctcccaggca cggaagactt tgtgggccat caaggtactg tgcctagcga taacattgat 1200

tcacaaggga ggaattgtag tacaaatgac tcactgctg 1239

<210> 12

<211> 413

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Gly Gln Pro Gly Asn Gly Ser Ala Phe Leu Leu Ala Pro Asn Gly

1 5 10 15

Ser His Ala Pro Asp His Asp Val Thr Gln Glu Arg Asp Glu Val Trp

20 25 30

Val Val Gly Met Gly Ile Val Met Ser Leu Ile Val Leu Ala Ile Val

35 40 45

Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Lys Phe Glu Arg Leu

50 55 60

Gln Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Thr Ser Leu Ala Cys Ala Asp Leu

65 70 75 80

Val Met Gly Leu Ala Val Val Pro Phe Gly Ala Ala His Ile Leu Met

85 90 95

Lys Met Trp Thr Phe Gly Asn Phe Trp Cys Glu Phe Trp Thr Ser Ile

100 105 110

Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala

115 120 125

Val Asp Arg Tyr Phe Ala Ile Thr Ser Pro Phe Lys Tyr Gln Ser Leu

130 135 140

Leu Thr Lys Asn Lys Ala Arg Val Ile Ile Leu Met Val Trp Ile Val

145 150 155 160

Ser Gly Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ile Gln Met His Trp Tyr Arg Ala

165 170 175

Thr His Gln Glu Ala Ile Asn Cys Tyr Ala Asn Glu Thr Cys Cys Asp

180 185 190

Phe Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Ile Val Ser Phe

195 200 205

Tyr Val Pro Leu Val Ile Met Val Phe Val Tyr Ser Arg Val Phe Gln

210 215 220

Glu Ala Lys Arg Gln Leu Gln Lys Ile Asp Lys Ser Glu Gly Arg Phe

225 230 235 240

His Val Gln Asn Leu Ser Gln Val Glu Gln Asp Gly Arg Thr Gly His

245 250 255

Gly Leu Arg Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Lys Glu His Lys Ala Leu

260 265 270

Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro

275 280 285

Phe Phe Ile Val Asn Ile Val His Val Ile Gln Asp Asn Leu Ile Arg

290 295 300

Lys Glu Val Tyr Ile Leu Leu Asn Trp Ile Gly Tyr Val Asn Ser Gly

305 310 315 320

Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ile Ala Phe

325 330 335

Gln Glu Leu Leu Cys Leu Arg Arg Ser Ser Leu Lys Ala Tyr Gly Asn

340 345 350

Gly Tyr Ser Ser Asn Gly Asn Thr Gly Glu Gln Ser Gly Tyr His Val

355 360 365

Glu Gln Glu Lys Glu Asn Lys Leu Leu Cys Glu Asp Leu Pro Gly Thr

370 375 380

Glu Asp Phe Val Gly His Gln Gly Thr Val Pro Ser Asp Asn Ile Asp

385 390 395 400

Ser Gln Gly Arg Asn Cys Ser Thr Asn Asp Ser Leu Leu

405 410

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 13

atagcggccg catggggcaa cccgggaacg gc 32

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 14

atagaattcc agcagtgagt catttgtact aca 33

<210> 15

<211> 2892

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

atggggcaac ccgggaacgg cagcgccttc ttgctggcac ccaatagaag ccatgcgccg 60

gaccacgacg tcacgcagca aagggacgag gtgtgggtgg tgggcatggg catcgtcatg 120

tctctcatcg tcctggccat cgtgtttggc aatgtgctgg tcatcacagc cattgccaag 180

ttcgagcgtc tgcagacggt caccaactac ttcatcactt cactggcctg tgctgatctg 240

gtcatgggcc tggcagtggt gccctttggg gccgcccata ttcttatgaa aatgtggact 300

tttggcaact tctggtgcga gttttggact tccattgatg tgctgtgcgt cacggccagc 360

attgagaccc tgtgcgtgat cgcagtggat cgctactttg ccattacttc acctttcaag 420

taccagagcc tgctgaccaa gaataaggcc cgggtgatca ttctgatggt gtggattgtg 480

tcaggcctta cctccttctt gcccattcag atgcactggt accgggccac ccaccaggaa 540

gccatcaact gctatgccaa tgagacctgc tgtgacttct tcacgaacca agcctatgcc 600

attgcctctt ccatcgtgtc cttctacgtt cccctggtga tcatggtctt cgtctactcc 660

agggtctttc aggaggccaa aaggcagctc cagaagattg acaaatctga gggccgcttc 720

catgtccaga accttagcca ggtggagcag gatgggcgga cggggcatgg actccgcaga 780

tcttccaagt tctgcttgaa ggagcacaaa gccctcaaga cgttaggcat catcatgggc 840

actttcaccc tctgctggct gcccttcttc atcgttaaca ttgtgcatgt gatccaggat 900

aacctcatcc gtaaggaagt ttacatcctc ctaaattgga taggctatgt caattctggt 960

ttcaatcccc ttatctactg ccggagccca gatttcagga ttgccttcca ggagcttctg 1020

tgcctgcgca ggtcttcttt gaaggcctat gggaatggct actccagcaa cggcaacaca 1080

ggggagcaga gtggatatca cgtggaacag gagaaagaaa ataaactgct gtgtgaagac 1140

ctcccaggca cggaagactt tgtgggccat caaggtactg tgcctagcga taacattgat 1200

tcacaaggga ggaattgtag tacaaatgac tcactgctgg tcaccgacgc caaaaacata 1260

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ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac 1560

atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc 1620

gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa 1680

aaaattatta tcatggattc taaaacggat taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc 1740

gtcacatctc atctacctcc cggttttaat gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat 1800

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gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt 1920

ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt 1980

ggaatgttta ctacactcgg atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga 2040

tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt caggattaca agattcaaag tgcgctgctg 2100

gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa agcactctga ttgacaaata cgatttatct 2160

aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt 2220

gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg caaggatatg ggctcactga gactacatca 2280

gctattctga ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca 2340

ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga 2400

ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg 2460

accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg ctacattctg gagacatagc ttactgggac 2520

gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat 2580

caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc ttgctccaac accccaacat cttcgacgca 2640

ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg 2700

gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca 2760

accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc 2820

ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag 2880

atcgccgtgt aa 2892

<210> 16

<211> 963

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Gly Gln Pro Gly Asn Gly Ser Ala Phe Leu Leu Ala Pro Asn Arg

1 5 10 15

Ser His Ala Pro Asp His Asp Val Thr Gln Gln Arg Asp Glu Val Trp

20 25 30

Val Val Gly Met Gly Ile Val Met Ser Leu Ile Val Leu Ala Ile Val

35 40 45

Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Lys Phe Glu Arg Leu

50 55 60

Gln Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Thr Ser Leu Ala Cys Ala Asp Leu

65 70 75 80

Val Met Gly Leu Ala Val Val Pro Phe Gly Ala Ala His Ile Leu Met

85 90 95

Lys Met Trp Thr Phe Gly Asn Phe Trp Cys Glu Phe Trp Thr Ser Ile

100 105 110

Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala

115 120 125

Val Asp Arg Tyr Phe Ala Ile Thr Ser Pro Phe Lys Tyr Gln Ser Leu

130 135 140

Leu Thr Lys Asn Lys Ala Arg Val Ile Ile Leu Met Val Trp Ile Val

145 150 155 160

Ser Gly Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ile Gln Met His Trp Tyr Arg Ala

165 170 175

Thr His Gln Glu Ala Ile Asn Cys Tyr Ala Asn Glu Thr Cys Cys Asp

180 185 190

Phe Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Ile Val Ser Phe

195 200 205

Tyr Val Pro Leu Val Ile Met Val Phe Val Tyr Ser Arg Val Phe Gln

210 215 220

Glu Ala Lys Arg Gln Leu Gln Lys Ile Asp Lys Ser Glu Gly Arg Phe

225 230 235 240

His Val Gln Asn Leu Ser Gln Val Glu Gln Asp Gly Arg Thr Gly His

245 250 255

Gly Leu Arg Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Lys Glu His Lys Ala Leu

260 265 270

Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro

275 280 285

Phe Phe Ile Val Asn Ile Val His Val Ile Gln Asp Asn Leu Ile Arg

290 295 300

Lys Glu Val Tyr Ile Leu Leu Asn Trp Ile Gly Tyr Val Asn Ser Gly

305 310 315 320

Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ile Ala Phe

325 330 335

Gln Glu Leu Leu Cys Leu Arg Arg Ser Ser Leu Lys Ala Tyr Gly Asn

340 345 350

Gly Tyr Ser Ser Asn Gly Asn Thr Gly Glu Gln Ser Gly Tyr His Val

355 360 365

Glu Gln Glu Lys Glu Asn Lys Leu Leu Cys Glu Asp Leu Pro Gly Thr

370 375 380

Glu Asp Phe Val Gly His Gln Gly Thr Val Pro Ser Asp Asn Ile Asp

385 390 395 400

Ser Gln Gly Arg Asn Cys Ser Thr Asn Asp Ser Leu Leu Val Thr Asp

405 410 415

Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp

420 425 430

Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu

435 440 445

Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asp Ile

450 455 460

Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala Glu Ala Met

465 470 475 480

Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val Cys Ser Glu

485 490 495

Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly

500 505 510

Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu

515 520 525

Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys

530 535 540

Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gln

545 550 555 560

Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser

565 570 575

Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr

580 585 590

Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile

595 600 605

Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro

610 615 620

His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe

625 630 635 640

Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val Val Pro Phe

645 650 655

His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly

660 665 670

Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg

675 680 685

Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu

690 695 700

Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser

705 710 715 720

Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val

725 730 735

Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile Arg Gln Gly

740 745 750

Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro Glu Gly

755 760 765

Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe Phe Glu Ala

770 775 780

Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gln Arg

785 790 795 800

Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr Val Asn

805 810 815

Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His

820 825 830

Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe Ile Val

835 840 845

Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro

850 855 860

Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala

865 870 875 880

Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala

885 890 895

Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Ile Val

900 905 910

Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly

915 920 925

Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp

930 935 940

Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys

945 950 955 960

Ile Ala Val

<210> 17

<211> 1398

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

atgaataact caacaaactc ctctaacaat agcctggctc ttacaagtcc ttataagaca 60

tttgaagtgg tgtttattgt cctggtggct ggatccctca gtttggtgac cattatcggg 120

aacatcctag tcatggtttc cattaaagtc aaccgccacc tccagaccgt caacaattac 180

tttttattca gcttggcctg tgctgacctt atcataggtg ttttctccat gaacttgtac 240

accctctaca ctgtgattgg ttactggcct ttgggacctg tggtgtgtga cctttggcta 300

gccctggact atgtggtcag caatgcctca gttatgaatc tgctcatcat cagctttgac 360

aggtacttct gtgtcacaaa acctctgacc tacccagtca agcggaccac aaaaatggca 420

ggtatgatga ttgcagctgc ctgggtcctc tctttcatcc tctgggctcc agccattctc 480

ttctggcagt tcattgtagg ggtgagaact gtggaggatg gggagtgcta cattcagttt 540

ttttccaatg ctgctgtcac ctttggtacg gctattgcag ccttctattt gccagtgatc 600

atcatgactg tgctatattg gcacatatcc cgagccagca agagcaggat aaagaaggac 660

aagaaggagc ctgttgccaa ccaagacccc gtttctccaa gtctggtaca aggaaggata 720

gtgaagccaa acaataacaa catgcccagc agtgacgatg gcctggagca caacaaaatc 780

cagaatggca aagcccccag ggatcctgtg actgaaaact gtgttcaggg agaggagaag 840

gagagctcca atgactccac ctcagtcagt gctgttgcct ctaatatgag agatgatgaa 900

ataacccagg atgaaaacac agtttccact tccctgggcc attccaaaga tgagaactct 960

aagcaaacat gcatcagaat tggcaccaag accccaaaaa gtgactcatg taccccaact 1020

aataccaccg tggaggtagt ggggtcttca ggtcagaatg gagatgaaaa gcagaatatt 1080

gtagcccgca agattgtgaa gatgactaag cagcctgcaa aaaagaagcc tcctccttcc 1140

cgggaaaaga aagtcaccag gacaatcttg gctattctgt tggctttcat catcacttgg 1200

gccccataca atgtcatggt gctcattaac accttttgtg caccttgcat ccccaacact 1260

gtgtggacaa ttggttactg gctttgttac atcaacagca ctatcaaccc tgcctgctat 1320

gcactttgca atgccacctt caagaagacc tttaaacacc ttctcatgtg tcattataag 1380

aacataggcg ctacaagg 1398

<210> 18

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Met Asn Asn Ser Thr Asn Ser Ser Asn Asn Ser Leu Ala Leu Thr Ser

1 5 10 15

Pro Tyr Lys Thr Phe Glu Val Val Phe Ile Val Leu Val Ala Gly Ser

20 25 30

Leu Ser Leu Val Thr Ile Ile Gly Asn Ile Leu Val Met Val Ser Ile

35 40 45

Lys Val Asn Arg His Leu Gln Thr Val Asn Asn Tyr Phe Leu Phe Ser

50 55 60

Leu Ala Cys Ala Asp Leu Ile Ile Gly Val Phe Ser Met Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Thr Val Ile Gly Tyr Trp Pro Leu Gly Pro Val Val Cys

85 90 95

Asp Leu Trp Leu Ala Leu Asp Tyr Val Val Ser Asn Ala Ser Val Met

100 105 110

Asn Leu Leu Ile Ile Ser Phe Asp Arg Tyr Phe Cys Val Thr Lys Pro

115 120 125

Leu Thr Tyr Pro Val Lys Arg Thr Thr Lys Met Ala Gly Met Met Ile

130 135 140

Ala Ala Ala Trp Val Leu Ser Phe Ile Leu Trp Ala Pro Ala Ile Leu

145 150 155 160

Phe Trp Gln Phe Ile Val Gly Val Arg Thr Val Glu Asp Gly Glu Cys

165 170 175

Tyr Ile Gln Phe Phe Ser Asn Ala Ala Val Thr Phe Gly Thr Ala Ile

180 185 190

Ala Ala Phe Tyr Leu Pro Val Ile Ile Met Thr Val Leu Tyr Trp His

195 200 205

Ile Ser Arg Ala Ser Lys Ser Arg Ile Lys Lys Asp Lys Lys Glu Pro

210 215 220

Val Ala Asn Gln Asp Pro Val Ser Pro Ser Leu Val Gln Gly Arg Ile

225 230 235 240

Val Lys Pro Asn Asn Asn Asn Met Pro Ser Ser Asp Asp Gly Leu Glu

245 250 255

His Asn Lys Ile Gln Asn Gly Lys Ala Pro Arg Asp Pro Val Thr Glu

260 265 270

Asn Cys Val Gln Gly Glu Glu Lys Glu Ser Ser Asn Asp Ser Thr Ser

275 280 285

Val Ser Ala Val Ala Ser Asn Met Arg Asp Asp Glu Ile Thr Gln Asp

290 295 300

Glu Asn Thr Val Ser Thr Ser Leu Gly His Ser Lys Asp Glu Asn Ser

305 310 315 320

Lys Gln Thr Cys Ile Arg Ile Gly Thr Lys Thr Pro Lys Ser Asp Ser

325 330 335

Cys Thr Pro Thr Asn Thr Thr Val Glu Val Val Gly Ser Ser Gly Gln

340 345 350

Asn Gly Asp Glu Lys Gln Asn Ile Val Ala Arg Lys Ile Val Lys Met

355 360 365

Thr Lys Gln Pro Ala Lys Lys Lys Pro Pro Pro Ser Arg Glu Lys Lys

370 375 380

Val Thr Arg Thr Ile Leu Ala Ile Leu Leu Ala Phe Ile Ile Thr Trp

385 390 395 400

Ala Pro Tyr Asn Val Met Val Leu Ile Asn Thr Phe Cys Ala Pro Cys

405 410 415

Ile Pro Asn Thr Val Trp Thr Ile Gly Tyr Trp Leu Cys Tyr Ile Asn

420 425 430

Ser Thr Ile Asn Pro Ala Cys Tyr Ala Leu Cys Asn Ala Thr Phe Lys

435 440 445

Lys Thr Phe Lys His Leu Leu Met Cys His Tyr Lys Asn Ile Gly Ala

450 455 460

Thr Arg

465

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 19

atagatatca tgaataactc aacaaactcc t 31

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 20

atagaattcc cttgtagcgc ctatgttctt 30

<210> 21

<211> 3051

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

atgaataact caacaaactc ctctaacaat agcctggctc ttacaagtcc ttataagaca 60

tttgaagtgg tgtttattgt cctggtggct ggatccctca gtttggtgac cattatcggg 120

aacatcctag tcatggtttc cattaaagtc aaccgccacc tccagaccgt caacaattac 180

tttttattca gcttggcctg tgctgacctt atcataggtg ttttctccat gaacttgtac 240

accctctaca ctgtgattgg ttactggcct ttgggacctg tggtgtgtga cctttggcta 300

gccctggact atgtggtcag caatgcctca gttatgaatc tgctcatcat cagctttgac 360

aggtacttct gtgtcacaaa acctctgacc tacccagtca agcggaccac aaaaatggca 420

ggtatgatga ttgcagctgc ctgggtcctc tctttcatcc tctgggctcc agccattctc 480

ttctggcagt tcattgtagg ggtgagaact gtggaggatg gggagtgcta cattcagttt 540

ttttccaatg ctgctgtcac ctttggtacg gctattgcag ccttctattt gccagtgatc 600

atcatgactg tgctatattg gcacatatcc cgagccagca agagcaggat aaagaaggac 660

aagaaggagc ctgttgccaa ccaagacccc gtttctccaa gtctggtaca aggaaggata 720

gtgaagccaa acaataacaa catgcccagc agtgacgatg gcctggagca caacaaaatc 780

cagaatggca aagcccccag ggatcctgtg actgaaaact gtgttcaggg agaggagaag 840

gagagctcca atgactccac ctcagtcagt gctgttgcct ctaatatgag agatgatgaa 900

ataacccagg atgaaaacac agtttccact tccctgggcc attccaaaga tgagaactct 960

aagcaaacat gcatcagaat tggcaccaag accccaaaaa gtgactcatg taccccaact 1020

aataccaccg tggaggtagt ggggtcttca ggtcagaatg gagatgaaaa gcagaatatt 1080

gtagcccgca agattgtgaa gatgactaag cagcctgcaa aaaagaagcc tcctccttcc 1140

cgggaaaaga aagtcaccag gacaatcttg gctattctgt tggctttcat catcacttgg 1200

gccccataca atgtcatggt gctcattaac accttttgtg caccttgcat ccccaacact 1260

gtgtggacaa ttggttactg gctttgttac atcaacagca ctatcaaccc tgcctgctat 1320

gcactttgca atgccacctt caagaagacc tttaaacacc ttctcatgtg tcattataag 1380

aacataggcg ctacaagggt caccgacgcc aaaaacataa agaaaggccc ggcgccattc 1440

tatccgctgg aagatggaac cgctggagag caactgcata aggctatgaa gagatacgcc 1500

ctggttcctg gaacaattgc ttttacagat gcacatatcg aggtggacat cacttacgct 1560

gagtacttcg aaatgtccgt tcggttggca gaagctatga aacgatatgg gctgaataca 1620

aatcacagaa tcgtcgtatg cagtgaaaac tctcttcaat tctttatgcc ggtgttgggc 1680

gcgttattta tcggagttgc agttgcgccc gcgaacgaca tttataatga acgtgaattg 1740

ctcaacagta tgggcatttc gcagcctacc gtggtgttcg tttccaaaaa ggggttgcaa 1800

aaaattttga acgtgcaaaa aaagctccca atcatccaaa aaattattat catggattct 1860

aaaacggatt accagggatt tcagtcgatg tacacgttcg tcacatctca tctacctccc 1920

ggttttaatg aatacgattt tgtgccagag tccttcgata gggacaagac aattgcactg 1980

atcatgaact cctctggatc tactggtctg cctaaaggtg tcgctctgcc tcatagaact 2040

gcctgcgtga gattctcgca tgccagagat cctatttttg gcaatcaaat cattccggat 2100

actgcgattt taagtgttgt tccattccat cacggttttg gaatgtttac tacactcgga 2160

tatttgatat gtggatttcg agtcgtctta atgtatagat ttgaagaaga gctgtttctg 2220

aggagccttc aggattacaa gattcaaagt gcgctgctgg tgccaaccct attctccttc 2280

ttcgccaaaa gcactctgat tgacaaatac gatttatcta atttacacga aattgcttct 2340

ggtggcgctc ccctctctaa ggaagtcggg gaagcggttg ccaagaggtt ccatctgcca 2400

ggtatcaggc aaggatatgg gctcactgag actacatcag ctattctgat tacacccgag 2460

ggggatgata aaccgggcgc ggtcggtaaa gttgttccat tttttgaagc gaaggttgtg 2520

gatctggata ccgggaaaac gctgggcgtt aatcaaagag gcgaactgtg tgtgagaggt 2580

cctatgatta tgtccggtta tgtaaacaat ccggaagcga ccaacgcctt gattgacaag 2640

gatggatggc tacattctgg agacatagct tactgggacg aagacgaaca cttcttcatc 2700

gttgaccgcc tgaagtctct gattaagtac aaaggctatc aggtggctcc cgctgaattg 2760

gaatccatct tgctccaaca ccccaacatc ttcgacgcag gtgtcgcagg tcttcccgac 2820

gatgacgccg gtgaacttcc cgccgccgtt gttgttttgg agcacggaaa gacgatgacg 2880

gaaaaagaga tcgtggatta cgtcgccagt caagtaacaa ccgcgaaaaa gttgcgcgga 2940

ggagttgtgt ttgtggacga agtaccgaaa ggtcttaccg gaaaactcga cgcaagaaaa 3000

atcagagaga tcctcataaa ggccaagaag ggcggaaaga tcgccgtgta a 3051

<210> 22

<211> 1016

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Met Asn Asn Ser Thr Asn Ser Ser Asn Asn Ser Leu Ala Leu Thr Ser

1 5 10 15

Pro Tyr Lys Thr Phe Glu Val Val Phe Ile Val Leu Val Ala Gly Ser

20 25 30

Leu Ser Leu Val Thr Ile Ile Gly Asn Ile Leu Val Met Val Ser Ile

35 40 45

Lys Val Asn Arg His Leu Gln Thr Val Asn Asn Tyr Phe Leu Phe Ser

50 55 60

Leu Ala Cys Ala Asp Leu Ile Ile Gly Val Phe Ser Met Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Thr Val Ile Gly Tyr Trp Pro Leu Gly Pro Val Val Cys

85 90 95

Asp Leu Trp Leu Ala Leu Asp Tyr Val Val Ser Asn Ala Ser Val Met

100 105 110

Asn Leu Leu Ile Ile Ser Phe Asp Arg Tyr Phe Cys Val Thr Lys Pro

115 120 125

Leu Thr Tyr Pro Val Lys Arg Thr Thr Lys Met Ala Gly Met Met Ile

130 135 140

Ala Ala Ala Trp Val Leu Ser Phe Ile Leu Trp Ala Pro Ala Ile Leu

145 150 155 160

Phe Trp Gln Phe Ile Val Gly Val Arg Thr Val Glu Asp Gly Glu Cys

165 170 175

Tyr Ile Gln Phe Phe Ser Asn Ala Ala Val Thr Phe Gly Thr Ala Ile

180 185 190

Ala Ala Phe Tyr Leu Pro Val Ile Ile Met Thr Val Leu Tyr Trp His

195 200 205

Ile Ser Arg Ala Ser Lys Ser Arg Ile Lys Lys Asp Lys Lys Glu Pro

210 215 220

Val Ala Asn Gln Asp Pro Val Ser Pro Ser Leu Val Gln Gly Arg Ile

225 230 235 240

Val Lys Pro Asn Asn Asn Asn Met Pro Ser Ser Asp Asp Gly Leu Glu

245 250 255

His Asn Lys Ile Gln Asn Gly Lys Ala Pro Arg Asp Pro Val Thr Glu

260 265 270

Asn Cys Val Gln Gly Glu Glu Lys Glu Ser Ser Asn Asp Ser Thr Ser

275 280 285

Val Ser Ala Val Ala Ser Asn Met Arg Asp Asp Glu Ile Thr Gln Asp

290 295 300

Glu Asn Thr Val Ser Thr Ser Leu Gly His Ser Lys Asp Glu Asn Ser

305 310 315 320

Lys Gln Thr Cys Ile Arg Ile Gly Thr Lys Thr Pro Lys Ser Asp Ser

325 330 335

Cys Thr Pro Thr Asn Thr Thr Val Glu Val Val Gly Ser Ser Gly Gln

340 345 350

Asn Gly Asp Glu Lys Gln Asn Ile Val Ala Arg Lys Ile Val Lys Met

355 360 365

Thr Lys Gln Pro Ala Lys Lys Lys Pro Pro Pro Ser Arg Glu Lys Lys

370 375 380

Val Thr Arg Thr Ile Leu Ala Ile Leu Leu Ala Phe Ile Ile Thr Trp

385 390 395 400

Ala Pro Tyr Asn Val Met Val Leu Ile Asn Thr Phe Cys Ala Pro Cys

405 410 415

Ile Pro Asn Thr Val Trp Thr Ile Gly Tyr Trp Leu Cys Tyr Ile Asn

420 425 430

Ser Thr Ile Asn Pro Ala Cys Tyr Ala Leu Cys Asn Ala Thr Phe Lys

435 440 445

Lys Thr Phe Lys His Leu Leu Met Cys His Tyr Lys Asn Ile Gly Ala

450 455 460

Thr Arg Val Thr Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe

465 470 475 480

Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met

485 490 495

Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His

500 505 510

Ile Glu Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg

515 520 525

Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile

530 535 540

Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly

545 550 555 560

Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn

565 570 575

Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val

580 585 590

Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys

595 600 605

Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr

610 615 620

Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro

625 630 635 640

Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys

645 650 655

Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys

660 665 670

Gly Val Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala

675 680 685

Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu

690 695 700

Ser Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly

705 710 715 720

Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu

725 730 735

Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu

740 745 750

Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp

755 760 765

Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro

770 775 780

Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro

785 790 795 800

Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu

805 810 815

Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val

820 825 830

Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu

835 840 845

Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met

850 855 860

Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys

865 870 875 880

Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu

885 890 895

His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly

900 905 910

Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro

915 920 925

Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly

930 935 940

Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr

945 950 955 960

Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys

965 970 975

Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu

980 985 990

Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala

995 1000 1005

Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ala Val

1010 1015

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 23

ataggatcca tggggcaacc cgggaacggc 30

<210> 24

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "Primer"

<220>

<223> Primer

<400> 24

ataaagctta atctcggttc tctgggtgac cctgcctatg ctgacccagc agtgagtcat 60

ttgtactaca 70

Claims

1.一种在待研究样本中检测与一种或多种抗原分子反应的分析物抗体的存在和/或结合性质的方法，所述方法包括：

(b)提供一种或多种第二抗原分子，分析物抗体当存在于所述样本中时可与所述第二抗原分子相互作用，并且所述第二抗原分子选自所述CRF；以及

(c)使如由步骤(a)提供的所述第一抗原分子和如由步骤(b)提供的所述第二抗原分子同时或相继地与所述待研究样本接触，借此分析物抗体当存在于所述样本中时可与所述抗原分子相互作用从而形成包含[第一抗原分子]-[分析物抗体]-[第二抗原分子]的复合物；以及

(g)检测在步骤(c)中或在步骤(c)之后形成的复合物的存在从而提供对存在于所述样本中的分析物抗体的指示。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

(f)在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后，提供能够与在步骤(c)中形成的所述复合物相互作用和/或能够干扰根据步骤(c)的所述复合物形成的一种或多种调节剂，并且在步骤(c)之前、或与步骤(c)同步、或在步骤(c)之后，使所述一种或多种调节剂同时或相继地与所述样本、所述一种或多种第一抗原分子和/或所述一种或多种第二抗原分子接触，或使所述一种或多种调节剂同时或相继地与在步骤(c)中或在步骤(c)之后形成的所述复合物接触。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一抗原分子和所述第二抗原分子是相同的。

4.根据权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其中所述第一抗原分子和/或所述第二抗原分子嵌入膜环境中。

5.根据权利要求1至4中一项或多项所述的方法，其中所述样本中待检测的所述分析物抗体是内源性自身抗体或单克隆抗体。

6.根据权利要求1至5中一项或多项所述的方法，其中选自由所述第一标记手段、所述第二标记手段、所述固定手段和所述调节剂组成的组的所述手段中的一者或多者在接触所述抗原分子和所述分析物抗体之前提供。

7.一种可用于进行根据权利要求1至6中一项或多项所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)选自如权利要求1至2中一项或多项所定义的心脏受体家族的一种或多种第一抗原分子；

(b)选自如权利要求1至2中一项或多项所定义的心脏受体家族的一种或多种第二抗原分子；

(c1)如权利要求1所定义的固定手段和/或

(c2)如权利要求1所定义的第二标记手段；以及

(d)如权利要求1所定义的第一标记手段。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中

(a)所述第一抗原分子用第二标记手段标记；以及

(b)所述第二抗原分子用第一标记手段标记。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中

(a)所述第一抗原分子固定至固体支撑物；以及

(b)所述第二抗原分子用第一标记手段标记。

10.根据权利要求1至6中一项或多项所述的方法用于诊断与心脏受体家族有关的疾病的存在或发作的用途。

11.根据权利要求1至6中一项或多项所述的方法用于鉴定用于治疗和/或预防与心脏受体家族有关的疾病的药用有效化合物的用途。

12.根据权利要求7至9中一项或多项所述的试剂盒用于诊断与心脏受体家族有关的疾病的存在或发作的用途。

13.根据权利要求7至9中一项或多项所述的试剂盒用于鉴定用于治疗和/或预防与心脏受体家族有关的疾病的药用有效化合物的用途。