CN101736072B

CN101736072B - 快速鉴别原料奶品质的方法

Info

Publication number: CN101736072B
Application number: CN 201010105513
Authority: CN
Inventors: 袁飞; 陈颖; 徐宝梁; 赵贵明; 张菲菲; 杨海荣; 赵勇胜
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-01-28
Filing date: 2010-01-28
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2030-01-28
Also published as: CN101736072A

Abstract

本发明涉及一种快速鉴别原料奶品质的测定方法，其包括如下步骤：对原料奶灭菌，保持其原有品质的同时杀灭其中的微生物；向待测样品和对照品分别添加显色底物溶液和微生物菌悬液；实时扫描测定，利用酶标仪，在一定的培养温度和波长下，使用动力学测定模式进行测定；鉴别品质：以测定时间为X轴，以吸收值为Y轴，作微生物生长曲线，根据生长曲线鉴别原料奶样品的品质。使用本鉴别方法，能够简单、快速、高效地鉴别奶的品质。

Description

快速鉴别原料奶品质的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴别原料奶品质的方法。

背景技术

我国原料牛奶非法添加、造假、抗生素残留等问题非常严重，奶粉中三聚氰胺中毒事件的根源就是原料牛奶的非法添加三聚氰胺造成的。但是由于目前采用的原料牛奶检测主要是感官、比重和酸度测定，虽然非法添加、造假、抗生素残留的原料牛奶中蛋白质、脂肪等各种营养成分和抗生素等有害成分含量与高品质的原料牛奶相差甚远，但采用目前的这些普通检测方法很难检测出来。三聚氰胺事件后，有采用高效液相色谱等手段进行检测的情况，但是因需要高值的检测仪器，检测成本高，无法在原料牛奶的检测中实现。并且，三聚氰胺只是原料牛奶非法添加物之一，不可能采用化学分析手段一一检测原料牛奶中所有可能存在的非法添加物。因此，如何实现原料牛奶的快速、低成本、总体质量的检测，用现有的方法无法实现。

微生物的生长与繁殖需要吸收蛋白质、糖类等营养物质，合成新的细胞成分和分裂增加细菌数量。同时，微生物对pH、抗生素也较敏感。因此，营养成分的含量对微生物生长和繁殖有很大影响，同时pH不适宜、抗生素的存在容易造成微生物不生长繁殖或生长繁殖缓慢。因此，可以将微生物接种到食品中，测定其中微生物生长繁殖情况，对食品品质进行分析。该方法成本低，并且只要食品中营养成分不足，或者存在抑制微生物生长的有害成分，都能反映到微生物的生长，可以检测出食品总体的品质情况。

目前微生物生长繁殖情况主要采用平板涂布和浊度法进行测定，两者都需要从食品中取样测定，且前一种方法耗时长，后一种方法因浊度测定方法本身的局限性，在食品微生物检测中应用常常出现浊度与微生物生长繁殖情况不一致情况。只有解决了这两个问题，才能实现通过微生物生长繁殖情况，对食品品质进行快速分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴别原料奶品质的方法，应用这种方法，可快速地鉴别出非法添加、造假、抗生素残留等问题原料牛奶，无问题原料牛奶可用于生产，有问题原料牛奶退货，或者进一步检测其是否掺水、非法添加、造假或者存在抗生素残留等问题。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种快速鉴别原料奶品质的测定方法，所述方法包括如下步骤：

A.灭菌：将原料奶煮沸，保持其原有品质的同时杀灭其中的微生物；

B.加样：将待测样品和对照品分别加入微孔板，然后根据需要加入显色底物溶液和微生物菌悬液；

C.实时扫描测定：将微孔板放入酶标仪中，在预定的培养温度下培养后，于波长400±40nm，使用动力学测定模式进行扫描测定；和

D.鉴别品质：根据微生物的生长曲线鉴别原料奶样品的品质。

在步骤D中，可以以测定时间为X轴，以吸收值为Y轴，作每孔的微生物生长曲线；或者，生长曲线也可以是直接采用软件制作的生长曲线。

本发明检测的原料奶选自牛奶、羊奶等哺乳动物的乳汁。

本发明的测定方法的步骤C中的培养温度优选为20℃～45℃；更优选为36～37℃。

本发明的测定方法的步骤B中使用的对照品选自阳性对照、阴性对照和空白对照中的至少一种。阳性对照分别为添加了三聚氰胺的原料奶、造假原料奶和/或抗生素残留超标的原料奶；阴性对照为高品质的原料奶；空白对照为待测的原料奶。

步骤D中的生长曲线可分为三种类型：陡峭型、中间型、平缓型。陡峭型：延滞期短，对数期几乎呈直线上升，稳定期维持在较高的吸收值，且持续时间长，在8小时内未进入衰亡期；中间型：延滞期长，对数期缓慢上升，稳定期维持在较低的吸收值，且持续时间短，有些在8小时内即进入衰亡期；平缓型：整个曲线呈抛物线型或贴近X轴呈直线，一直维持较低的吸收值。阴性对照和品质好的待测样品为陡峭型生长曲线；阳性对照和品质差的待测样品为中间型或平缓型生长曲线；空白对照为平缓型生长曲线。从而可以根据生长曲线的类型鉴别原料奶样品的品质。

根据本发明所述的鉴别原料奶品质的测定方法，其中工艺步骤B所述的显色底物和微生物是特异性的。该种微生物具有使该显色底物分解产生荧光物质的活性，并且随着微生物数量的增加，底物分解量增加，荧光物质的强度增加，可在长波长紫外光下定量测定，在一定范围内荧光的强度与微生物数量呈正比。从而可以通过连续扫描测定荧光强度，实时了解微生物的生长情况。例如，显色底物可以为红四氮唑，微生物菌悬液可以为嗜热乳酸链球菌菌悬液。因为测定的波长采用的是长波长紫外光，并且是由特异性微生物分解特异性底物产生的特异性荧光，所以，与浊度法相比具有更好的特异性。

工艺步骤D中通过微生物生长曲线来鉴别原料奶的品质，与其他原料奶品质的鉴别方法相比具有更简单、更经济、更快速、更注重牛奶总体品质、可实时检测原料奶中微生物的生长状况的优点。

也就是说，本发明提供了一种原料奶品质鉴别方法，其是通过微生物在原料奶中的生长情况，定性判断原料奶的品质。

本发明适宜于原料奶的快速鉴定，如发现原料奶品质有问题，可直接退货，或者可进一步分析原料奶存在的具体问题。

按照本发明所述的原料奶品质的鉴别方法，可以将该方法简述为：原料奶灭菌——原料奶加样——实时扫描测定——鉴别原料奶的品质。如发现原料牛奶品质有问题，可直接退货，或者可进一步分析原料牛奶存在的具体问题。原料奶经过灭菌处理，最大限度保持原有品质，同时去除其中的微生物，再将特异性微生物接种到原料奶中，微生物在原料奶中生长，分解显色底物，产生荧光物质，在400±40nm的长波长下测定荧光强度，作微生物生长曲线，根据微生物生长曲线类型，进行牛奶品质的快速鉴别。

根据本发明的一个实施方案，本发明的测定方法包括以下步骤：

A.灭菌：将原料牛奶煮沸数次(如3次)，保持其原有品质的同时，杀灭其中的微生物；

B.加样：将待测样品和对照品分别加入微孔板，然后加入显色底物溶液(如红四氮唑)和微生物菌悬液(如嗜热乳酸链球菌)；

C.实时扫描测定：将微孔板放入酶标仪中，将培养温度设定为36～37℃，测定波长为400nm，使用动力学测定模式，每隔数分钟测定1次，连续测定数小时；和

D.鉴定品质：以测定时间为X轴，以吸收值为Y轴，作每孔的微生物生长曲线；如有相应软件，可直接采用软件，制作生长曲线；根据生长曲线鉴别原料奶样品的品质。

生长曲线可分为三种类型：陡峭型、中间型、平缓型。阴性对照和品质好的待测样品为陡峭型生长曲线；阳性对照和品质差的待测样品为中间型或平缓型生长曲线；空白对照为平缓型生长曲线。从而可以根据生长曲线的类型鉴别原料牛奶样品的品质。

使用本鉴别方法，能够简单、快速、高效地鉴别奶的品质。

下面，结合以下示例性实施例对本发明作进一步详细说明和示例说明，但它们并非用于对本发明的限定。

附图说明

图1为嗜热乳酸链球菌在分别含有尿素和抗生素的牛奶溶液中的生长曲线图。

具体实施方式

实施例1

将原料牛奶放入三角瓶中，以2层牛皮纸封口，在电炉上煮沸后取出，在水中冷却，再煮沸，冷却后再煮沸，冷去备用。在超净工作台中，从三角瓶中取40～60μl原料牛奶样品至加有210～230μl脑心浸液的无菌、透明、平底、细胞培养微孔板的微孔中，然后加入10μl显色底物(红四氮唑，TTC)，20μl嗜热乳酸链球菌菌悬液。微生物菌悬液事先以小管冻存在超低温冰箱中，要使用时，取出1管，恢复到室温即可使用。显色底物，配置成储存液，灭菌后，在冰箱4℃保存，使用时用灭菌蒸馏水稀释十倍后使用。每次试验除待检原料牛奶样品外，需设阳性对照、阴性对照和空白对照：阳性对照中待检的40～60μl原料牛奶样品被替换为添加了尿素(1％)的原料牛奶、或者被替换为添加了抗生素的原料牛奶(例如可添加青霉素0.04单位或链霉素5单位)；阴性对照中待检的40～60μl原料牛奶样品被替换为高品质的原料牛奶(三元奶牛场提供)；空白对照中10μl显色底物被替换为10μl蒸馏水。每个样品(包括对照)重复3孔实验。加完样后，盖上微孔板盖。放入扫描仪中。将扫描仪培养温度设为36℃，打开动力学研究软件(Thermo公司multiskan speetrum酶标仪SkanItso软件)，每隔10分钟在400nm处检测1次，检测时间为8小时。作每孔的吸收与时间曲线图。

如图1所示，A1、B1、C1为空白对照，A2、B2、C2为添加了尿素溶液(1％)的阳性对照，A3、B3、C3为添加了抗生素(青霉素0.04单位)的阳性对照，A12、B12、C12为阴性对照，其余为待检原料牛奶样品。其中添加尿素溶液、抗生素的阳性对照原料牛奶中微生物的生长曲线很平坦，而阴性对照和待检原料牛奶样品生长曲线出现明显的对数生长期和稳定生长期。可见，待检原料牛奶样品为合格牛奶。

与现有技术相比，本发明具有的优点为：可简单、快速、高效地鉴别原料牛奶品质。

Claims

1.一种快速鉴别原料奶品质的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A．灭菌：将原料奶煮沸，保持其原有品质的同时杀灭其中的微生物；

B．加样：将待测样品和对照品分别加入微孔板，然后加入显色底物溶液和微生物菌悬液,其中，所述显色底物为红四氮唑，所述微生物菌悬液为嗜热乳酸链球菌菌悬液；

C．实时扫描测定：将微孔板放入酶标仪中，在预定的培养温度下培养后，于测定波长400±40nm处，使用动力学测定模式进行扫描测定；和

D．鉴别品质：根据微生物的生长曲线鉴别原料奶样品的品质；

在步骤D中，以测定时间为X轴，以吸收值为Y轴，作每孔的微生物生长曲线；其中，所述生长曲线分为三种类型：陡峭型、中间型、平缓型；阴性对照和品质好的待测样品为陡峭型生长曲线；阳性对照和品质差的待测样品为中间型或平缓型生长曲线；空白对照为平缓型生长曲线；其中，陡峭型为延滞期短，对数期几乎呈直线上升，稳定期维持在较高的吸收值，且持续时间长，在8小时内未进入衰亡期；中间型为延滞期长，对数期缓慢上升，稳定期维持在较低的吸收值，且持续时间短，有些在8小时内即进入衰亡期；平缓型为整个曲线呈抛物线型或贴近X轴呈直线，一直维持较低的吸收值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B中的对照品选自阳性对照、阴性对照和空白对照中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C中的培养温度为20℃～45℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤C中的培养温度为36～37℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C中的测定波长为400nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料奶是原料牛奶或原料羊奶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤D中，直接采用软件制作生长曲线。