JPH10313892A - 迅速な微生物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 迅速な微生物の検出方法の提供。 【解決手段】 下記工程を含む、標的微生物および非標
的競合微生物の両方を含み得るサンプル中の標的微生物
を検出および同定する迅速なスクリーニング方法：サン
プルを増殖培地で予備富裕化し；非標的微生物の増殖を
抑え、さらに標的微生物の増殖を促進するための少なく
とも１つの非標的微生物抑制物質を該増殖培地に加え；
少なくとも１つの該抑制物質を含む該増殖培地中の該サ
ンプルを所定時間保温し；標的微生物の同定に特異的な
生化学的アッセイを実施し；およびサンプル中の標的微
生物の存在を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中の微生
物の存在を検出する方法に関する。より具体的には、本
発明は、他の競合する微生物を含む可能性があるサンプ
ルにおいて標的微生物を迅速に検出し同定する方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】食品、医薬、化粧品および水は、病原微
生物の汚染について日常的に検査される。病原体の存在
に関するスクリーニングを目的とする主要な技術は、非
選択富裕化培地から出発して続いて最初の富裕化培地の
一部を選択培地に移すという一連の培地（栄養液）の移
し変えを必要とする。この過程によって最初の非選択富
裕化培地中の潜在的に損傷を受けている微生物の増殖の
開始が可能になり、一旦この微生物が回復すると、少量
の非選択培地が二次（選択）培地に移される。この過程
（その期間はしばしば人間の労働パターンおよび当該微
生物の増殖パターンによって規定される）は、完了まで
数日を要する。例えば、サルモネラ菌（Salmonella）の
存在について食物サンプルを培養するには、典型的には
約２０−２５グラムのサンプル（例えば肉）を約２２５
ｍｌの一次富裕化培地に添加することが必要である。こ
の一次富裕化培地は典型的には非選択性で、例えば緩衝
ペプトン水（Buffered Peptone Water（BPW)）または一
般用予備富裕化ブロス（Universal Pre-enrichment Bro
th（UBP)）で、損傷を受けた微生物の修復を可能にす
る。サンプルをこの後一次富裕化ブロスと十分に混合
し、約３５℃から±２℃で２２−２８時間保温する。こ
の工程に続いてサンプルはさらに、標的微生物（例えば
サルモネラ）の継続的増殖を可能にするが、同時に他の
大半の競合微生物の増殖を制限する抑制物質を含む増殖
促進培地で選択的に富裕化される。

【０００３】標的微生物の選択的富裕化を目的とする最
も一般的に用いられる方法は、約１ミリリットルの一次
富裕化培地を１０ミリリットルの選択培地、例えば亜セ
レン酸塩シスチンブロス（Selenite Cystine Broth）お
よび四チオン酸塩ブロス（AOAC）をそれぞれ含む２本の
試験管に移し、これらの試験管を約３５℃で２２−２８
時間保温することを必要とする。サルモネラ菌用の他の
二次富裕化培地には、ラッパポート・バシリアディス培
地（Rappaport-Vassiliadis Medium（RV))およびロール
リトリプトースブロス(Lauryl Tryptose Broth))が含ま
れるであろう。一般にこの二次富裕化工程の後に、二次
富裕化ブロスの固形培地での平板培養を含む検出工程、
または他のより迅速な方法が続く（例えば免疫学的アッ
セイまたはＤＮＡプローブ（Difco Laboratories、デト
ロイト、ミシガンから全ての培地は入手可能である）。
全アッセイ期間を短縮させるために最初の富裕化工程の
期間を短縮させる多くの試みが何年にもわたって行なわ
れてきた。一般に、更なる検査のために十分に生存力の
ある微生物を得るためには６から１２時間の一次富裕化
が必要であることが判明した。これらの一般的な方法の
いくつかは下記で考察する。人が消費または使用するこ
とを目的としてデザインされた製品には細菌の汚染の可
能性があることは長い間認識されてきた。これら人の消
費を目的とした製品の製造業者および／または加工業者
は、人の消費用製品の品質と安全性を確保するためにこ
れらの製品を検査する。そのような製品には生肉、調理
食品、食品調理設備、飲料水、入浴用水および、微生物
が生存し人間もしくは動物への接触または伝達を可能に
する他の媒介物が含まれる。

【０００４】典型的には生物、例えば腸内細菌（すなわ
ち腸内細菌科、例えばサルモネラおよびEscherichia co
li（大腸菌))およびグラム陽性菌（例えばStaphylococc
us（葡萄球菌）およびEnterococcus（腸内球菌))は、人
間および動物の消費または使用を目的とする製品で検査
される生物である。これらの微生物は一般に人間および
動物の結腸、腸または糞便に存在する。食品、例えば家
禽、赤肉、シーフード、卵、またはこれらの生産物を含
む一切の食品が処理または加工時に糞便と接触すると
き、これらの生物による汚染およびそれに続く最終使用
者もしくは消費者（すなわち人間）へのこれら生物の伝
達の可能性が存在する。十分な数の微生物の存在は、例
えば腐敗を引き起こすことによって食品の変質をもたら
すだけでなく、人間や動物が消費した場合さらに病気を
引き起こすこともあるであろう。汚染食品の消費による
食中毒件数は米国だけで控えめに見積もっても年間数百
万件になろう。人の細菌性食中毒の殆どの事例では、吐
き気、嘔吐、下痢、悪寒、発熱および消耗を含む急性症
状がもたらされるが、一方、例えば幼児、高齢者、妊
婦、新生児のような人々および免疫無防備状態にある人
々については死亡も起こりえる。細菌性食中毒に起因す
る経済的損失の合計は、生産性の損失、医療保険系統の
使用増加および医療提供者系統の使用増加により毎年数
十億ドルに達すると概算されている。

【０００５】食品媒介性病原細菌の伝播を防止するため
に、食品製造業者および／または加工業者は日常的にか
れらの食物サンプルを検査し、製品を人々の消費につな
がる流通に乗せる前に汚染製品を特定しようとする。病
原微生物は、多数のまたは多様な他の病原性および／ま
たは非病原性微生物を含む可能性がある食品の中で極め
て少い数で存在するので、致死以下の損傷を受けている
病原微生物の回復および検出方法が開発された。病原微
生物は、典型的には人間の消費を目的とした製品の加工
中に損傷を受けている。即ち、病原微生物は、加熱、凍
結、化学添加物との接触または機械的加工工程（これら
は製品に存在する病原微生物を損傷し、または衰弱させ
る）を受けているであろう。食物サンプルから病原微生
物を回収する伝統的な方法は、米国特許出願第5145786
号（Bailey）で説明さているように５つの基本的な工程
を含む。第一の工程は予備富裕化で、ここでは食物サン
プルは非選択培地で富裕化され、損傷細菌細胞を安定な
生理学的状態に回復させる。第二の工程は選択的富裕化
を含み、ここでは選択的抑制試薬が増殖促進培地に添加
され、選択病原微生物の増殖を促進し、一方他のほとん
どの細菌の増殖を制限する。第三の工程は富裕化させた
増殖培地のサンプルの固形選択培地での選択的平板培養
を含み、疑いのある病原細菌の純粋な個々のコロニーを
物理的に単離する。次の工程は、非標的または競合微生
物を排除するためにこの選択平板培養工程から得られた
純粋な培養を生化学的に検査し、またはスクリーニング
することを含む。最後の工程は、サンプル中に存在する
病原性微生物を具体的に特定するために疑いのある病原
性微生物の純粋培養を血清学的に分析することを含む。
この慣用的な方法の主な欠点は、この方法は非常に労働
集約的で時間を要するということである。この慣用的方
法は、分析サンプル中の病原微生物の有無について陽性
または陰性結果を得るために３日から５日程度を必要と
し、労働力と資材の両方を集中的に必要とする。この長
時間を要する分析は、腐敗しやすい製品の製造業者には
しばしば不適切である。なぜならば、このような製造業
者は、検査期間が終了して陰性検査結果が得られるまで
製品をねかせておかなければならないからである。

【０００６】慣用的な検出方法に必要な長い期間を排除
するために、結果を得るために要する時間が顕著に短縮
された他の方法が開発された。ＲＥＶＥＡＬサルモネラ
検査システム（Neogen Corp., ランシング、ミシガン、
米国特許第5296370号）は、陰性結果を得るために必要
な時間枠を約２日に短縮した。第一日目に、被験サンプ
ルを非抑制予備富裕化培地に接種する。接種後約２から
４時間で高度に選択的な抑制物質を添加して特定の病原
細菌を選択的に富裕化させ、一方サンプル中に存在する
他の微生物の増殖を抑制する。２日目に、陽性および陰
性サンプルの検出のために全サンプルを免疫アッセイに
よって調べる。続いて全ての陽性サンプルをさらに検査
してそれが何であるかを確認する。この方法は、陽性ま
たは陰性培養を検出するために全サンプルを免疫アッセ
イによって分析する必要があるという欠点を有する。表
１に記載されている他の方法は、サンプル中のサルモネ
ラ菌を同定するために市販されている多数の検査システ
ムを例示している。表１に示す全ての方法は、純粋な培
養を得るために選択的に増殖させた微生物を固形選択培
地に平板培養するか、またはサンプル中のサルモネラ菌
の有無について陽性もしくは陰性結果を得るために全て
のサンプルについて免疫学的もしくは核酸によるアッセ
イを必要とする。

【０００７】

【表１】 表１−１ ──────────────────────────────────── システム 予備富裕化 選択工程 の名称 培養時間／温度 培養時間／温度 ──────────────────────────────────── ＡＯＡＣ ラクトースブロス セレナイト・システインブロス トリプトン大豆ブロス （ＳＣ）又は四チオン酸塩ブロス 栄養ブロス （ＴＴ） ２４ｈ／３５℃ ２４ｈ／３５℃ ＩＳＯ 緩衝ペプトン水 ラッパート・バシリアディスブロ （ＢＰＷ） ス（ＲＶ） １８ｈ／３５−３７℃ ８ｈ／４２℃ ＳＣブロス ８ｈ／３５℃ サルモネラ− ラクトースブロス ＴＴブロス ＴＥＫ 栄養ブロス １８−２４ｈ／４２℃ オルガノン− ２４＋／−２ｈ／３５℃ ＳＣブロス テクニカ社 １８−２４ｈ／３５℃ TECRA インタ 非抑制ブロス ＴＴブロスおよびＳＣブロス ーナショナル １８−２２ｈ／３５℃ ６−８ｈ／３５℃ ・バイオプロ ダクツ社 TECRA ユニー 非加熱新鮮食品：タージ なし− クインターナ トール７含有改変ＢＰＷ ディップスティックにより選択的 ショナル・バ 他の食品：改変ＢＰＷ イオプロダク １６ｈ／３５℃ ツ社 ────────────────────────────────────

【０００８】

【表２】 表１−１続き ──────────────────────────────────── システム 付加工程 アッセイ形式 全日数 感度／ の名称 培養時間／温度 特異性 ＡＯＡＣ なし 平板培地− ３日 100 ％ ブリリアントグリーン寒天 ＨＥＫＴＯＥＮ寒天 ＸＬＤ寒天 ２４ｈ／３５℃ 亜硫酸ビスマス寒天 ４日 ４８ｈ／３５℃ ＩＳＯ なし 平板培地− ３日 100 ％ ブリリアントグリーン寒天 ２４ｈ／３５℃ サルモネラ− 富裕化後： エリザ− ４日 ＴＥＫ 選択培地から１０ 単クローン性抗体 96.5％ オルガノン− μｇ／ｍｌノボビ 約２時間 89.3％ テクニカ社 オシン含有Ｍ−ブ ロスに移替え 16-8ｈ／35℃ TECRA インタ 富裕化後： エリザ− ３日 ーナショナル 選択培地からＭ− サルモネラ光学免疫アッセイ 98.6％ ・バイオプロ ブロスへ移替え 約２時間 96.1％ ダクツ社 16-20 ｈ／35℃ TECRA ユニー なし エリザ− ２日 クインターナ ディップステック・アッセイ ショナル・バ 約６時間イオプロダクツ社

【０００９】

【表３】 表１−２ ──────────────────────────────────── システムの名称 予備富裕化 選択工程 培養時間／温度 培養時間／温度 ──────────────────────────────────── TECRA サルモネラ リン酸緩衝液付加改変ＢＰＷ 免疫的富裕化 免疫捕捉 最低１６時間／３５−３７℃ 改変ＢＰＷ１本 インターナショナル Ｍ−ブロス１本 バイオプロダクツ社 室温で最低20分ディップ スティックとともに保温 パスＳＴＩＫ ＢＰ水、または ＲＶブロス ＬＵＭＡＣ ＢＶ ブリリアントグリーン １６−２４ｈ／４２℃ 含有ＢＰ水 １６−２４ｈ／３７℃ １−２テスト 低細菌数：非抑制ブロス なし バイオコントロール ２４ｈ／３５℃ 高細菌数：ヨウ素活性化 システム社 高細菌数：予備富裕化 テトラチオネート・ブリ （例：ＢＡＭ） リアントグリーンブロス ２４ｈ／３５℃ ８ｈ／４２℃ バイオメリュックス ＶＩＤＡＳ バイオメリュックス 改変ＩＳＯ法 ＢＰ水 RV培地６−８ｈ／４２℃ １８ｈ／３５−３７℃ ＳＣブロス ６−８ｈ／３５−３７℃ 改変ＢＡＭ法 非選択培地 TTブロス６−８h/４２℃ １８ｈ／３５−３７℃ ＳＣブロス ６−８ｈ／３５−３７℃

【００１０】

【表４】 表１−２（続き） ──────────────────────────────────── システムの名称 付加工程 アッセイ形式 全日数 感度／ 培養時間／温度 特異性 ──────────────────────────────────── TECRA サルモネラ なし エリザ− ２日 免疫捕捉 ディップスティ インターナショナル ックアッセイ バイオプロダクツ社 約６時間 ──────────────────────────────────── パスＳＴＩＫ 富裕化後： エリザ− ３日 ＬＵＭＡＣ ＢＶ ＢＰ水 ディップスティ 93.0％ ックアッセイ 6-8h /37℃ １０分 96.4％ ──────────────────────────────────── １−２テスト なし 免疫拡散− ３日 バイオコントロール PPT の白色バン 85-100％ システム社 ドは半固形培地 100％ により自動性サ ルモネラの固定 によって生じる 16-30h/35 ℃ ──────────────────────────────────── バイオメリュックス 富裕化後： ＥＬＦＡ− ３日 ＶＩＤＡＳ 選択培地からＭ 酵素連結ケイ光 バイオメリュックス ブロスへ移替え 免疫アッセイ 改変ＩＳＯ法 18h/42℃ ４５分改変ＢＡＭ法

【００１１】

【表５】 表１−３ ──────────────────────────────────── システムの名称 予備富裕化 選択工程 培養時間／温度 培養時間／温度 ──────────────────────────────────── ジーントラック 生肉： ＳＣブロス ジーン・トラック・ ラクトースブロス １６−１８ｈ／３５℃ システムズ ２２−２４ｈ／３５℃ 他の食品： ＴＴブロスおよびＳＣ ＢＡＭ／ＡＯＡＣ法 ブロス ２２−２４ｈ／３５℃ ６ｈ／３５℃ ──────────────────────────────────── ダイナビード ＢＰ水 免疫磁性分離(IMS) ＤＹＮＡＬ ＡＳ １６−２０ｈ／３７℃ 選択ビーズを予備富裕 化と組み合わせる １０分／周囲温度 ──────────────────────────────────── マイクロ−スクリーン ネオゲン社 方法Ａ 復活培地 ＳＣブロス ２ｈ／３７℃ １８ｈ／４５℃ 方法Ｂ ＢＡＭ法 ＳＣおよびＴＴブロス ラクトースブロス ２４ｈ／３７℃並びに ２２−２６ｈ／３７℃ ＲＶブロス ２４ｈ／４４℃ ────────────────────────────────────

【００１２】

【表６】 表１−３（続き） ──────────────────────────────────── システム 付加工程 アッセイ形式 全日数 感度／ の名称 培養時間／温度 特異性 ──────────────────────────────────── ジーントラック 富裕化後： 核酸による 生肉：４日 98.5％ ジーン・トラッ 選択培地からグラム アッセイ 他の食品： 97.5％ ク・システムズ 陰性ブロスへ移替え 約２時間 ３日 12-18h/35 ℃ ──────────────────────────────────── ダイナビード なし 平板培地− ３日 DYNAL AS XLD およびBGA 24h/37℃ ──────────────────────────────────── マイクロ−ス クリーンネオ ゲン社 方法Ａ なし 金標識免疫吸着 ２日 アッセイと組み 合わせたクロマ トグラフィー 約＜８時間 方法Ｂ 選択寒天培地で ４日 分離 ２４ｈ／３５℃ ────────────────────────────────────

【００１３】前述の方法または表１に記載した方法のい
ずれにおいても、微生物（例えばサルモネラ菌）の存在
に関して検査されるサンプルの液体富裕化（これは富裕
化培地中のサルモネラ菌レベルを調節することによって
実施される）では、広範囲の汚染物（サンプルに存在す
る他の微生物）濃度にわたってそのレベルに達するこ
と、またはそのレベルを越えることは不可能である。さ
らに、上記のいずれの方法も、液体の生化学的同定（こ
れは微調整されたものである）を混合培養で実施して信
頼に足るものにすることは不可能である。上記の方法
は、生化学的同定試験を実施する前に富裕化培養を固形
選択培地に平板培養して純粋培養を得る必要があるか、
または病原微生物（例えばサルモネラ菌）の存在を特定
するために全ての単離サンプルを免疫アッセイに付す必
要がある。したがって、標的微生物（例えばサルモネラ
菌）および競合非標的微生物の両方を含む可能性がある
サンプル中の標的微生物の検出および同定を目的とした
迅速なスクリーニング方法であって、当該方法が、微生
物（例えばサルモネラ菌）の存在について検査されるべ
きサンプルの液体での富裕化（これは富裕化培地中のサ
ルモネラ菌のレベルを汚染物（サンプル中に存在する他
の微生物）レベルと同じかまたはそれを越えるレベルに
広範囲の汚染物濃度に対して調節することによる）と、
常に混合状態にある可能性を有する培養で実施される生
化学的同定の両方を利用するものである前記スクリーニ
ング方法を樹立することは有益であろう。さらに、標的
微生物（例えばサルモネラ菌）および競合非標的微生物
の両方を含む可能性があるサンプル中の標的微生物の検
出および同定を目的とした迅速なスクリーニング方法で
あって、当該方法で生化学的試験を用いることによって
さらに詳細な検査から大部分の陰性サンプルを迅速に排
除して、それによって製造業者または加工業者が特定の
病原微生物の存在について陰性と検定された製品を消費
に向けて放出することを可能にすることができる前記ス
クリーニング方法を樹立することは有益であろう。

【００１４】

【発明の概要】本発明は、サンプル中の標的微生物の検
出および同定を目的とした能率的な方法（これは、生化
学的アッセイが常に混合状態にある可能性を有する培養
で実施できるという付加的利益をもたらす）を提供する
だけでなく、更なる検査から大部分の陰性サンプルを迅
速に排除する方法もまた提供する。本発明はまた、迅速
に増殖するグラム陽性（＋）微生物と同様に多数の迅速
に増殖するグラム陰性（−）微生物を用いる場合にも応
用できる方法を提供する。本発明は、標的微生物および
競合非標的微生物の両方を含む可能性があるサンプル中
の標的微生物の検出および同定を目的とする本発明の方
法は、軽度の選択性を有する培地でサンプルを富裕化す
る工程、所定期間この増殖培地でサンプルを保温する工
程、該増殖培地に少なくとも１種の非標的微生物の抑制
物質を添加して非標的微生物増殖を抑え標的微生物の増
殖を促進する工程、サンプルをこの増殖培地で所定期間
保温する工程、標的微生物の同定に特異的な生化学的ア
ッセイを実施する工程、および標的微生物が該サンプル
中に存在することを検出する工程を含む。微生物の検出
方法システムもまた開示される。本発明の他の利点は、
添付の図面を考慮したとき、以下の詳細な説明を参照す
ることにより、一層本発明が理解されるように容易に理
解されるだろう。

【００１５】

【発明の実施の形態】一般に本発明は、標的微生物およ
び競合非標的微生物の両方を含む可能性があるサンプル
中で迅速に増殖する標的微生物の検出および同定を目的
とした迅速なスクリーニング方法を提供する。本方法
は、増殖培地でサンプルを富裕化する工程、所定期間こ
の増殖培地でサンプルを保温する工程、該増殖培地に少
なくとも１種の非標的微生物の抑制物質を添加して非標
的微生物の増殖を抑え標的微生物の増殖を促進する工
程、サンプルを抑制物質を含む増殖培地で所定期間保温
する工程を含む。本発明はまた、標的微生物の同定に特
異的な生化学的アッセイを実施する工程、および続いて
サンプル中に標的微生物が存在することを検出する工程
を含む。

【００１６】標的生物とは、本発明の方法を用いて具体
的に検査しようとしているか、および／または選別しよ
うとしている生物である。例えば食物サンプルの検査の
場合、迅速に増殖する被験標的微生物にはサルモネラ菌
および／または大腸菌が含まれるがこれらに限定されな
い。これらの細菌は食品に頻繁に見出される固有の病原
体であるので、それらは、病原体が食物サンプルに存在
するか否かを決定するためにしばしば検査の" 標的”に
される。一般に、迅速に増殖する微生物は１時間未満の
世代時間を有する。本発明の方法によって迅速に検出で
きる迅速に増殖する標的微生物は、好ましくは３０分未
満の世代時間を有するであろう（例えばサルモネラ菌お
よび大腸菌）。これらの微生物の増殖時間は、当該微生
物が増殖している培地のタイプにしたがって１５分から
４０分の範囲であろう。濃厚な培地（例えばＴＳＢ）は
より少ない（短い）世代時間をもたらし、一方希薄な培
地（例えば最少培地）はより多い（長い）世代時間をも
たらすであろう。本発明の方法を用いて検出および同定
できる標的微生物には、迅速に増殖できるグラム（−）
微生物（例えば大腸菌を含む腸内細菌科）および迅速に
増殖するグラム（＋）微生物（例えば黄色葡萄球菌Stap
hylococcus aureus および大便腸内球菌Enterococcus f
aecalis)の一切が含まれる。標的微生物は、下記で極め
て詳細に考察するように、特定の抑制物質および該標的
微生物に対する生化学試薬を個々に調製し、これらの抑
制物質および生化学検査の混合培養での使用を可能にす
ることによって検出および同定できる。サンプル中の標
的微生物の存在についてサンプルをスクリーニングする
ために、適切なサンプル（すなわち食品サンプル、医薬
品サンプルまたは他のもの）を入手する。適切な大きさ
および重さのサンプルを適切な予備富裕化培地を含む適
切な容器に入れる。

【００１７】本発明の好ましい実施態様では容器はバッ
グ形で構築される。このバッグは弾力性を有するいずれ
かのプラスチック材（例えばポリエステル／ポリエチレ
ン薄層製品）で構築できる。被験サンプル（例えば食物
サンプル）の性質上、この容器は、サンプル中に局在す
る微生物を露出させるために該バッグに入れたサンプル
の均質化または" 消化”に耐えうるように弾力性を有す
る素材で構築されるべきである。この容器はまた当業者
に既知の他の適切ないずれの素材で構築してもよい。こ
の容器はまた、容器の内容物の流出を防止しさらに容器
の内容物の汚染を防止するために例えば" ファスナー”
式密閉のように密閉されていてもよい。この容器はま
た、液体の通過が可能であるが、一方食物塊のような特
定の物質が通過するのを防止するフィルターを含むこと
ができる。予備富裕化培地の容器にサンプルを入れた
後、当業者に周知の手段を用いてバッグ内でこのサンプ
ルを消化または均質化する(Stomacher Lab-Blender, Se
wardMedical, ロンドン、英国）。サンプルを予備富裕
化培地を含むバッグ内で約３０秒から５分間消化する。
続いて容器を標的微生物の増殖に適した温度で保温す
る。例えば、標的微生物がサルモネラ菌の場合は容器を
約３５℃±２℃で保温できるであろう。予備富裕化培地
での保温（予備富裕化工程）は、サンプル中に存在する
致死以下で損傷を受けている微生物を復活させるために
実施する。この予備富裕化工程は、継続して約２から６
時間実施することができる。好ましくは予備富裕化工程
は継続して約４時間実施される。

【００１８】予備富裕化培地には、当業者に既知の非選
択的および／または軽度に選択的な一般的増殖培地のい
ずれも含まれる。例えばこれにはＲＥＶＩＶＥ（Neogen
Corp., ランシング、ミシガン）、ＴＢＳ培地(Difco,
デトロイト、ミシガン）または同様なタイプの培地が含
まれる。予備富裕化培地は、潜在的に損傷を受けた標的
微生物の迅速な回復と増殖を可能にする非選択液体培地
から軽度に選択的な増殖培地のいずれでもよく、これら
はさらに十分な細菌の増殖を許容して標的微生物の十分
な増殖を可能にし、その結果この予備富裕化培地は、標
的微生物が最初のサンプルに存在している場合には少な
くとも１個の生存力のある標的微生物を含むこととにな
ろう。適切な非選択増殖培地の例（これらはDifco Labo
ratories（デトロイト、ミシガン）から入手できる）に
は、トリプシン消化大豆ブロス（Tryptic Soy Broth, T
SB）、緩衝ペプトン水（Buffered Peptone Water, BP
W)、一般用予備富裕化ブロス(Universal Pre-enrichmen
t Broth, UPB）、リステリア富裕化ブロス（Listeria E
nrichment Broth, LEB）および当業者に既知の他の非選
択的培地または軽度選択的培地が含まれる。本発明で使
用される好ましい予備富裕化培地は改変ＴＳＢ培地であ
る。本発明では、予備富裕化培地はまた選択的抑制物質
または軽度に選択的抑制物質（例えば抗生物質）の添加
を含むことができる。本発明の方法では、サルモネラ菌
の増殖に有利なように選別圧力を提供するためにサンプ
ルの添加および保温前に抗生物質ノボビオシンを改変Ｔ
ＳＢ培地に添加すことができる。ノボビオシンまたはそ
のナトリウム塩は１−５０μｇ／ｍｌの濃度で添加でき
る。好ましくはノボビオシンの濃度は約２０−４０μｇ
／ｍｌで、より好ましい濃度は予備富裕化培地に対して
約２５μｇ／ｍｌである。また別には、他の抗生物質
（例えばバンコマイシン、ペニシリン、アンピシリンお
よびアミカシン）を適切な濃度で利用できる。当業者に
既知の他の標的微生物選別強化添加物を予備富裕化培地
に加えて、サンプル中に存在する競合する他の非標的微
生物を凌いで選択した標的微生物の増殖を促進すること
ができる。

【００１９】予備富裕化工程またはサンプル中の損傷を
受けた標的微生物の復活に続いて選択的富裕化工程を実
施し、予備富裕化工程時には抑制されなかった競合する
非標的微生物をさらに抑制する。例えば、サルモネラ菌
が標的微生物の場合は、選択的富裕化工程は、さらに他
のグラム（−）細菌を抑制するために実施され、それに
よって混合培養中のサルモネラ菌の増殖を促進する。約
４時間の予備富裕化工程の保温終了時に少なくとも１種
の選択的抑制物質またはその混合物を添加することがで
きる。約１０ミリリットルの抑制物質混合物を予備富裕
化培地およびサンプルを含む容器に添加する。この時期
は極めて重要である。なぜならば、競合する非標的微生
物の増殖レベルを抑制しない場合には、生化学分析に対
して陽性反応を得ることを妨げるほど競合非標的微生物
の増殖レベルが増加するからである。この選択的抑制物
質を含む容器をさらに約６から８時間（半自動移替えを
利用する場合）または１６から２０時間（手動移替えを
利用する場合）、上記のように標的微生物に応じて約３
３℃から４３℃の温度範囲でさらに保温する。この保温
時間枠は極めて重要である。なぜならば、この時間枠の
間に、標的微生物対非標的微生物の比が生化学的アッセ
イの実施に適切であるときは何時でも微生物を移すこと
ができるからである。好ましくは、選択的抑制物質を含
む容器はさらに約８時間３５℃±２℃で保温される。

【００２０】選択的抑制物質またはその混合物は、非標
的微生物の増殖を抑制し、一方で標的微生物の増殖また
は成育を促進することが知られている化合物または試薬
を含むことができる。例えば、標的微生物がサルモネラ
菌の場合は、塩化マグネシウム、マラカイトグリーンお
よびクリスタルバイオレットを容器内の予備富裕化培地
に添加し、優れた非標的微生物抑制を得ることができる
ことが分かった。溶液中のマラカイトグリーンの濃度は
約１０ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌ（０．００３％−
０．０３％W/V)の範囲で、塩化マグネシウム濃度は約
０．５ｇ／ｌから約２ｇ／ｌ（０．１％−１．０％W/V)
の範囲で、クリスタルバイオレットの濃度は約０．００
１ｇ／ｌから０．０１０ｇ／ｌ（０．０００５％−０．
００１％W/V)の範囲である。サルモネラ菌用の抑制物質
混合物の好ましい濃度は３０ｍｇ／ｍｌのマラカイトグ
リーン、０．００５ｇ／ｌのクリスタルバイオレットお
よび約１．０ｇ／ｌの塩化マグネシウムである。他の抑
制物質は、胆汁塩、デオキシコール酸ナトリウム、亜セ
レン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、四チオン酸ナ
トリウム、アセトスルファミンナトリウム、マンデル
酸、セレナイト−システインテトラチオネート、サルフ
ァメタゾン、ブリリアントグリーン、マラカイトグリー
ン、クリスタルバイオレット、タージトール４、サルフ
ァジアジン、アミカシンおよびノボビオシンを含むこと
ができる。非標的微生物抑制物質の存在下でサンプルを
保温した後、強化富裕化工程を実施し、サンプルの大部
分（約７０−９０％またはそれ以上）（これらは標的微
生物の存在について陰性であることが判明したもの）を
排除する。約１２時間の保温（４時間の予備富裕化＋８
時間の選択的富裕化（半自動移替えの場合))終了時、ま
たは約２０時間の保温（４時間の予備富裕化＋１６時間
の選択的富裕化（手動移替えの場合))終了時に、サンプ
ルの一部分を最初の容器から別の培地を入れた液体容器
に移す。液体容器では標的微生物の存在を決定する特異
的な生化学アッセイが実施される。このサンプルの移替
えは、所定量のサンプルを培地を入れた液体容器に人の
手で移して達成するか、または自動化手段（例えば現在
係属中の米国特許出願第08/503081号（Edenら、1995年7
月14日出願、本発明の譲り受け人に譲渡）に記載された
手段）によって達成できる。

【００２１】また別には、サンプルを一晩（約１６時
間）保温し、続いて最初の容器から別の培地を入れた液
体容器に手動でまたは半自動で移すことができる。後者
の容器で標的微生物の存在を決定する特異的な生化学ア
ッセイが実施される。サンプルの一部分の移替えは、培
地を入れた液体容器に所定量のサンプルを手動で移す
か、または上記に述べたような自動化手段で移すことに
よって達成できる。したがって、本発明は、標的微生物
および非標的微生物の両方を含む可能性があるサンプル
中の標的微生物を迅速に検出する手動、半自動または自
動化システム式のシステムを提供する。このシステムは
一般に、その中にサンプルを入れる容器、非標的微生物
の増殖を抑制する増殖抑制物質、標的微生物を特定する
生化学試薬および標的微生物を特定する検出アッセイを
包含すると定義される。標的微生物同定用の生化学検査
または試薬には抗生物質、染料、および例えば糖の醗
酵、脱カルボキシル反応、固有の酵素による切断を標的
にさせることによって、および／または染料（蛍光染料
を含む）と組み合わせて使用することによって特定の微
生物を示唆する生化学試薬が含まれる。さらに、当業者
に既知の微生物の検出および同定で用いられる他の試薬
も本発明で使用できる。例えば、サルモネラ菌の検出
に、容器から得たサンプルの一部を培地を含む液体容器
（例えば試験管）に移すことができる。この容器は、Ｍ
ＵＣＡＰ（メチルウンベリフェリルカプリレート）検査
を実施するために必要な試薬を含むことができる。また
別の試験管を用いることができるが、これらの試験管
は、更なる生化学検査（例えばＨ₂Ｓ試験）のための試
薬、適切な基礎培地（例えばＬＩＣＮＲ（リジン−鉄−
システイン−中性赤ブロス）基礎培地）中のリジンデカ
ルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼまたは
アルギニンデカルボキシラーゼの存在を示唆するように
特にデザインされた培地、ペプトンをベースにした醗酵
反応培地（例えばダルシトール、プロピレングリコール
（ＰＧ）、グルクロン酸（ＧＡ）用）を含むことがで
き、さらに、クエン酸塩利用もまた、培地を入れた液体
容器に加えたシモン（Simmon's）クエン酸塩寒天（Difc
o Manual）またはクエン酸塩培地（硫酸マグネシウム、
燐酸二水素アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酵母抽
出物、塩化ナトリウム）を用いてアッセイできる。サル
モネラ菌用の好ましい生化学試薬または検査は、ＭＵＣ
ＡＰ検査でＨ₂Ｓ細片を含む試験管およびリジン脱カル
ボキシル反応を表示する試薬を含む試験管を含む。

【００２２】保温後サンプルの一部を生化学試薬を含む
個々の培地を入れた液体容器または試験管に加えた後、
約１２から１４時間（好ましくは１２時間）保温する
（完全な富裕化は２４時間）。標的微生物に特異的な生
化学アッセイの結果によって、標的微生物の存在につい
て陰性であることが判明したサンプルは直ちに排除する
ことができる。すなわち、生化学アッセイまたは検査
は、標的微生物および非標的微生物を含む混合培養中の
標的生物の存在を示すように特異的にデザインされてい
るので、これらの特異的生化学アッセイに対する陰性反
応はサンプル中に標的微生物が存在しないことを示唆
し、したがって、そのようなサンプルを考慮から直ちに
除外することを可能にする。陽性または陰性検査の検出
は視覚、蛍光産生、ガス産生および／または当業者に既
知の他の適切ないずれかの手段によって実施される。特
異的生化学アッセイ後の陽性結果に続いて、更なる微生
物学的分析（例えば免疫アッセイ、ＤＮＡプローブ分
析、血清学的分析、選択培地での平板培養など）を実施
して、標的微生物が陽性であったサンプルを特定して確
認する。本発明の方法を利用することによって、２２５
ｍｌについて１個の標的微生物を最初の接種物に含む可
能性がある被験サンプルは、予備富裕化の後では１０⁰
−１０¹ｃｆｕ／ｍｌ、選択的富裕化の後では１０³−１
０⁴ｃｆｕ／ｍｌ、さらに強化富裕化の後では１０⁶ｃｆ
ｕ／ｍｌ以上に富裕化させることができる。このような
最終濃度では、混合培養で実施される生化学的アッセイ
は適切に実施することができ、標的微生物の存在につい
ての検査が可能である。本発明はまた、予備富裕化培
地、選択的抑制物質、並びに標的微生物の検出および同
定用の迅速なスクリーニング方法のために必要な特異的
生化学アッセイ試薬（これらの全ては上記に記載した）
を含むキットを包含する。

【００２３】

【実施例】熱損傷法 ：材料 ：トリプシン消化大豆ブロス（Difco ロット番号80
0543） トリプシン消化大豆寒天（Difco ロット番号66932JA) ＮａＣｌ(Sigma Chemicals 109F/0498） バクト−ペプトン（Difco ロット番号37680JA) ＴＳＡ＋２％ＮａＣｌ ＴＳＡ ０．１％ペプトン希釈用ブランク（９．０ｍｌ／試験
管） 水浴（Blue M） 方法：水浴（攪拌器付）を５５℃に設定し、ほとんど一
杯にして蓋をし、スイッチを入れ３０から４５分間温め
た。それぞれ１８ｍｌのＴＳＢを含む滅菌した１００ｍ
ｌの蓋付培地瓶をラックに入れて、熱アッセイ開始の約
１５−２０分前に水浴に静置した。

【００２４】熱アッセイ前（Ｔ₀）の培養一覧 １）腸炎菌（S. enteritidis）およびネズミチフス菌
（S. typhimurium）をＴＳＢ中で１８から２４時間３５
±２℃で増殖させた。 ２）アッセイの日に滅菌したペプトン希釈用ブランクで
１０^-6までの連続希釈を実施した。 ３）１０^-6希釈から得た１００μｌ懸濁液をＴＳＡ平板
に播種して平板培養した。この平板をバイオフード中で
１５から２０分乾燥させ、３５±２℃で一晩保温した。熱損傷アッセイ １）各々２ｍｌの腸炎菌およびネズミチフス菌を２本の
別々の培地瓶中の予備加熱ＴＳＢブロス（１：１０希
釈）に加え、加熱水浴に１５分静置した。

【００２５】２）１５分後、接種物を含む培地瓶を氷浴
中で迅速に冷却し、更なる加熱を停止させた。 ３）培地瓶から１ｍｌ量を取り出し、９ｍｌのペプトン
／食塩水希釈用ブランクに無菌的に移した（１０^-2）。 ４）１０^-5までの連続希釈を実施した。 ５）−２および−３希釈から得た１００μｌの懸濁液を
ＴＳＡおよびＴＳＡ＋２％ＮａＣｌ平板上に播種して平
板培養した。この平板をバイオフードで１５−２０分乾
燥させ、続いて３５±２℃で一晩保温した。 熱損傷を算出するために用いた式は以下のとおりであ
る：

【００２６】

【数１】

【００２７】結果：サンプルの検査時に致死以下で損傷
を受けている標的細胞の模擬実験のために上記で述べた
細菌細胞を熱で損傷させる方法を用いたとき、９２−９
８％の損傷集団を創り出すために必要な５５℃水浴中で
の損傷時間は１５から３０分であることが分かった。増殖培地の選択 サンプル中の微生物の復活および増殖に適した増殖培地
を確認するために、改変ＴＳＢおよびＲＥＶＩＶＥ培地
をネズミチフス菌に対するそれらの性能について比較し
た。バイオテク（Biotek）光吸収読み取り装置(Bio-Tek
Instruments,Winooski, バーモント）に接種物を移す
前の６時間平板培養カウントを表２に示す。４．１ｃｆ
ｕ／ｍｌの熱損傷ネズミチフス菌接種物を約３５℃±２
℃で改変ＴＳＢ、ＲＥＶＩＶＥおよびラクトースブロス
に接種した。種々の増殖培地での損傷ネズミチフス菌の
増殖結果を図１に示す。改変ＴＳＢはＲＥＶＩＶＥに匹
敵しえることがバイオテク装置を用いて判明した。表２
を参照すれば、改変ＴＳＢ培地で増殖させたサンプル
は、ＲＥＶＩＶＥ培地で増殖させたサンプルよりも６時
間の保温後より速く増殖しさらにより大きな細胞集団を
もつことが判明したが、このことはより強い復活を示し
ている。

【００２８】

【表７】 表２ バイオテクへの移替え前の６時間平板培養のカウント ────────────────────────── ブロス ＴＳＡ ＴＳＡ＋Ｎａｃｌ ────────────────────────── ＲＥＶＩＶＥ １．５Ｅ＋０４ １．５Ｅ＋０４ ＥＳＰ−ＴＳＢ ２．１Ｅ＋０４ ２．１Ｅ＋０４ ラクトース ８．６Ｅ＋０３ ４．７Ｅ＋０３ ──────────────────────────

【００２９】非標的微生物の増殖抑制：３例のサルモネ
ラ菌（２例の腸炎菌、１例のネズミチフス菌）および６
例の競合微生物（４例のグラム陰性（−）菌、２例のグ
ラム陽性（＋）菌）についていくつかの抑制物質を調べ
た。全微生物をそれぞれ抑制物質存在下および非存在下
で改変ＴＳＢおよびラクトースブロス（ＬＢ）の両方で
調べた。増殖コントロールは、それぞれ図２および３に
示すように改変ＴＳＢおよびＬＢについて抑制物質の非
存在下で調べた。被験微生物は、腸炎菌muenster株（Ｓ
ｍ）、腸炎菌heidelberg株（Ｓｈ）、ネズミチフス菌
（Ｓｔ）並びに競合微生物のEnterobacter aerogenes
（Ｅａ）、大腸菌（Ｅｃ）、Citrobacter freundii（Ｃ
ｆ）、Proteus vulgaris（Ｐｖ）、大便腸内球菌（Ｅ
ｆ）および黄色葡萄球菌（Ｓａ）であった。最初の被験
抑制物質はデオキシコレート／ブリリアントグリーン
（それぞれ０．２５％／０．００１％）で、結果は図４
および５に示す。図３は、デオキシコレート／ブリリア
ントグリーンを添加されていない改変ＴＳＢの結果を示
している。サルモネラ菌種およびＥａは、抑制物質デオ
キシコレート／ブリリアントグリーンを含む改変ＴＳＢ
培地で良好に増殖した。Ｅｃの増殖は遅くなった。Ｃ
ｆ、Ｐｖ、ＥｆおよびＳａの増殖は図４に示すように抑
制された。デオキシコレート／ブリリアントグリーンを
添加したＬＢ中のサルモネラ菌種およびＥａの増殖は図
５に示す。Ｅｃの増殖は遅くなり、Ｃｆ、Ｐｖ、Ｅｆお
よびＳａの増殖は抑制された。

【００３０】ノボビオシン／ブリリアントグリーン
（０．０００１％／０．００１％）の抑制物質組合せを
含む改変ＴＳＢに対する上記の検査微生物の増殖を図６
に示す。Ｓｍの増殖は遅延し、他の全ての検査微生物の
増殖は抑制された。同じ実験をノボビオシン／ブリリア
ントグリーン含有ＬＢを用いて実施したが、全ての検査
微生物の増殖は抑制された。検査微生物に対する影響を
調べるために、約０．０４６％の濃度の抑制物質タージ
トール４（ＸＬＴ４補充、Difco Laboratories, デトロ
イト、ミシガン）を改変ＴＳＢおよびＬＢの両方で調べ
た。図７に示したように、改変ＴＳＢではタージトール
４はＳａの増殖を抑制した。Ｐｖの増殖は遅延し、他の
検査微生物は良好に増殖した。図８に示すように、ＬＢ
中のタージトール４はＳａおよびＰｖの増殖を抑制し、
一方、他の検査微生物は良好に増殖した。改変ＴＳＢ中
のタージトール４／ブリリアントグリーン（それぞれ
０．０４６％／０．００１％）の抑制物質組合せの影響
を図９に示す。サルモネラ菌種、ＥａおよびＥｃはこの
抑制物質の組合せの存在下で良好に増殖した。Ｃｆの増
殖は微かに遅延し、Ｐｖ、ＥｆおよびＳａの増殖は抑制
された。ＬＢ中のタージトール４／ブリリアントグリー
ンの抑制物質組合せによって全ての検査微生物の増殖が
抑制された。

【００３１】図１０および１１並びに表３および４に、
ノボビオシンの改変ＴＳＢ中の理想的な濃度および投与
時間の両方を決定するためにデザインした実験結果を示
す。３．１２５−５０μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度の
ノボビオシンの熱損傷ネズミチフス菌およびS. branden
bergに対する影響を調べた。さらに、サルモネラ菌およ
び非サルモネラ菌（１−１０ｃｆｕ／ｍｌのサルモネラ
菌対１０⁴ｃｆｕ／ｍｌの非サルモネラ菌）の混合に対
してノボビオシンの最適濃度を決定するために実験を行
なった。５０μｇ／ｍｌの濃度でほとんどのグラム陽性
微生物が抑制され、C. freundii および大腸菌を除くほ
とんどのグラム陰性微生物を抑制することが分かった。
しかしながら、この濃度ではサルモネラ菌もまた抑制さ
れた。改変ＴＳＢ培地で約２５μｇ／ｍｌの濃度が、グ
ラム陽性菌およびいくつかのグラム陰性菌を抑制する
が、サルモネラ菌の増殖および復活を抑制しない濃度で
あることが分かった。さらに、ノボビオシンの添加時期
は検査のまさに開始時が最良であることもまた判明し
た。

【００３２】

【表８】 表３ 種々の濃度のノボビオシンにおけるネズミチフス菌の増殖 ──────────────────────────────────── 時間 コントロール 50μg/ml 25μg/ml 12.5μg/ml 6.25μg/m 3.125μg/ml ──────────────────────────────────── 10ｈ 1.0E+06 2E+03 2.3E+05 6.0E+05 6.5E+05 1.0E+06 12ｈ 2.4E+08 1.6E+04 2.0E+06 5.4E+06 6.5E+06 1.7E+08 14ｈ 6.9E+08 3E+04 9.1E+07 2.3E+08 4.2E+08 8.8E+08 16ｈ 9.4E+08 1E+05 5.2E+08 7.3E+08 9.2E+08 9.6E+08 18ｈ 1.2E+09 9E+05 8.2E+08 9.4E+08 8.7E+08 9.4E+08 ────────────────────────────────────

【００３３】

【表９】 表４ 種々の濃度のノボビオシンにおけるS.brandenburg の増殖 ──────────────────────────────────── 時間 コントロール 50μg/ml 25μg/ml 12.5μg/ml 6.25μg/m 3.125μg/ml ──────────────────────────────────── 10ｈ 7.0E+07 1.0E+05 1.8E+06 1.5E+07 5.0E+07 3.7E+07 12ｈ 8.8E+08 3.4E+05 1.4E+08 1.2E+09 7.9E+08 8.9E+08 14ｈ 1.0E+09 1.5E+06 6.8E+00 1.4E+09 1.9E+09 1.9E+09 16ｈ 3.0E+09 3.3E+07 1.3E+09 1.1E+09 1.4E+09 1.2E+09 18ｈ 2.1E+09 7.0E+07 3.2E+09 3.6E+09 5.5E+09 1.0E+09 ────────────────────────────────────

【００３４】生化学試薬−選択的富裕化：生化学反応製
剤を１９種のサルモネラ菌血清型および１４種の非サル
モネラ競合微生物を用いて表５に示したように調べた。
表５に示した微生物を用いて合計８反応を調べた。これ
らの反応は４つの別々の群に分けることができる： １）Ｈ₂Ｓ反応 −乾燥細片（Ｈ₂Ｓ−Ｓ）対培地（Ｈ₂Ｓ−Ｍ） ２）醗酵反応 −ダルシトール（ＤＵＬ） −グルクロネート（ＧＡ） −プロピレングリコール（ＰＧ） ３）デカルボキシラーゼ反応 −リジン（ＬＹＳ）（改変ＬＩＣＮＲ培地で） −オルニチン（ＯＲＮ）（改変ＬＩＣＮＲ培地で） −アルギニン ４）酵素切断反応 Ａ．色素生成（ブロモクロロインドリル）−ＢＣＩ −グルクロナイド −カプリレート Ｂ．蛍光生成（メチルウンベリフェリル）−ＭＵ −グルクロナイド（ＭＵＧ） −カプリレート（ＭＵＣＡＰ） ２試験管システムを用いることができるが、この場合第
一の試験管（＃１）はＨ₂Ｓ細片（黒色）またはカプリ
レート（蛍光）を含み、第二の試験管（＃２）はダルシ
トール（黄色）またはグルクロナイド（蛍光）またはダ
ルシトール（黄色）を含む。

【００３５】

【表１０】 表５ サルモネラ菌及び競合微生物に対する反応結果 ──────────────────────────────────── サルモネラ菌 DUL PG GA LYS ORN H2S-M H2S-S CIT 計 ──────────────────────────────────── S.agona ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.anatum ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.braenderup ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.brandenburg ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.derby ＊ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.heidelberg ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.infantis ＋ ＋ ＋ − − ＋ ＋ ＋ ６ S.kentucky ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.montevideo ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ ＋ ＋ ７ S.muenchen ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.muenster ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.newport ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.oranienberg* ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.pullorum − − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ６ S.reading ＊ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.schott- ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ muelleri* S.st.paul* ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.thompson* ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ S.typhimurium ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ８ ──────────────────────────────────── ＊新規な被験微生物を示す

【００３６】

【表１１】 表５（続き） ──────────────────────────────────── 競合微生物 DUL PG GA LYS ORN H2S-M H2S-S CIT 計 ──────────────────────────────────── Acinebacter − − − − − − − − ０ calcoaceticuis Alcaligenes − − − − − − − − ０ fecalis Citrobacter ＋ ＋ ＋ − ＋ − ＋ − ５ diversus Citrobacter ＋ ＋ ＋ − − − ｗ＋ ＋ ５ freundii Enterbacter − − ＋ ＋ − − − ＋ ３ aerogenes Entercoccus − − − − − − − − ０ faecalis E.coli − − ＋ − − − − − １ Hafnia alvei − − ＋ − − ＋ − − ２ Klebsiella − − ＋ ＋ − − − ＋ ３ pneumoniae Proteus − − − − ＋ ＋ ＋ − ３ mirabilis Proteus − − − − − − − − ０ vulgaris Providencia − − − − − − − ＋ １ alcalifaciens Serratia − − − − − − − ＋ １ marcescens Staph aureus − − − − − − − − ０ ────────────────────────────────────

【００３７】これらの反応はサルモネラ菌を推定的に特
定するための標的として吟味した。これらの反応はほと
んどの場合にサルモネラ菌種について陽性結果をもたら
すので選んだ。表５の数字は、それぞれの検査において
各微生物についての陽性検査結果の合計である。検査し
た殆どのサルモネラ菌は全ての検査について陽性であっ
た。最も高スコアーを得た競合菌は２つのシトロバクタ
ー菌（Citrobacter)で５つの陽性結果を示したが、これ
ら２つのサンプルはリジンが陰性で、したがってサルモ
ネラ菌の種とシトロバクター菌の種間で陽性識別が可能
である。実施例１ グラム陰性腸内細菌と競合状態のサルモネラ菌種の混合
富裕化。この実施例は、富裕化工程から強化富裕化工程
まで一貫して実施される実験を例示する。この検査はま
た、クリスタルバイオレット（ｃｖ）の０．１％ＭｇＣ
ｌ₂ ＋０．００３％のマラカイトグリーンへの添加が反
応培地に及ぼす影響を調べるために実施した。材料 ：検査微生物の熱損傷については上記で説明した方
法と材料を参照されたい。 改変ＴＳＢ(Difco, ロット＃91198) 改変ＴＳＢ培地（Difco) ノボビオシンナトリウム(Difco R_x P5670-42B) 無水塩化マグネシウム(Sigma, ロット＃86F-3524) マラカイトグリーン蓚酸塩(Sigma, ロット＃122H0257) バクト−クリスタルバイオレット(Difco, ロット＃7273
17) ＸＬＤ−寒天(Difco, ロット＃85746JD) ＸＬＤ−寒天プレート 消化バッグ（Seward Stomacher Bags, Seward Medical) 使用細菌株：ネズミチフス菌（S. typhimurium）ATCC14
028、S. brandenberg ATCC6955、E. aerogenes ATCC 13
048、大腸菌（E. coli) ATCC25922およびH. alvei ATCC
23280

【００３８】方法：上記で述べた熱損傷方法を参照され
たい。予備富裕化アッセイ ：熱損傷ネズミチフス菌およびS. b
randenbergを１０^-2の濃度まで１：１０希釈で段階希釈
した。２つの消化バッグ（それぞれ２２５ｍｌの改変Ｔ
ＳＢ＋ノボビオシン（２５μｇ／ｍｌ）を含む）にネズ
ミチフス菌およびS. brandenbergのいずれかを接種し
た。競合細菌叢を調製し、以下のように添加した：０．
５ｍｌのマクファーランド培地（McFarland's)中の各競
合細菌培養（約１ｘ１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ）を段階希釈し
約１０⁵の濃度を得た。約３３μｌの各競合微生物をサ
ルモネラ菌と培地を含む消化バッグに加え、約１ｘ１０
⁴ｃｆｕ／２２５ｍｌの競合微生物濃度を得た。以下の
ように６つの消化バッグ個々に割り当て、分析した: （１）クリスタルバイオレットおよびネズミチフス菌＋
競合微生物、（２）クリスタルバイオレットおよびSalm
onella brandenberg＋競合微生物、（３）クリスタルバ
イオレットおよび競合微生物のみ、（４）ネズミチフス
菌＋競合微生物クリスタルバイオレット無し、（５）Sa
lmonella brandenberg＋競合微生物クリスタルバイオレ
ット無し、（６）競合微生物のみクリスタルバイオレッ
ト無し。

【００３９】全バッグを十分に混合し、約４時間約３５
＋／−２℃で保温した。４時間保温した後、選択的抑制
物質を以下のように添加した：クリスタルバイオレット
を含むべき全てのバッグに、０．１％クリスタルバイオ
レットの１００Ｘストックの１ｍｌを０．０００３％マ
ラカイトグリーン＋０．１％ＭｇＣｌ₂ の２０Ｘストッ
クの１０ｍｌと合わせて加えた。０．００３％マラカイ
トグリーン＋０．１％ＭｇＣｌ₂ の２０Ｘストックの１
０ｍｌをクリスタルバイオレット無しと表示された全て
のバッグに添加した。続いてバッグをさらに８時間保温
し、その後サンプルを下記のように生化学試薬反応に移
した。サンプルを反応培地試験管に移した後、全バッグ
をさらに１２時間保温した。この保温に続いて（開始か
ら２４時間）、平板のカウントをＴＳＡおよびＸＬＤ平
板で実施した。結果 ： 最初の接種量： ネズミチフス菌＝６１０ｃｆｕ／２２５ｍｌ（９２％熱
損傷）S. brandenberg ＝１０１ｃｆｕ／２２５ｍｌ（９１％熱
損傷） その他（大腸菌およびH. alvei）＝１．０ｘ１０⁴ｃｆ
ｕ／２２５ｍｌ２２時間平板カウント ：クリスタルバイオレット含有 ネズミチフス菌／競合微生物 サルモネラ＝２．２ｘ１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ 競合微生物＝５．７ｘ１０⁸ｃｆｕ／ｍｌS. brandenberg ／競合微生物 サルモネラ＝３．１ｘ１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ 競合微生物＝７．０ｘ１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ

【００４０】実施例２ 大腸菌、E. aerogenesおよびHafnia alveiを含むサルモ
ネラ菌の完全富裕化モデル この実験の目的は、予備富裕化ステージおよび選択富裕
化ステージの両方で用いられる染料／抑制物質系が、サ
ルモネラ菌の陰性遮蔽物として用いられる色素および蛍
光反応に対して影響を与えるか否かを知ることであっ
た。さらにこの実験は、現実のモデル系から菌集団情報
および増殖情報を得るために実施した。材料 ： Ｌ−システイン二ナトリウム（Difco, P-2401-20B) クエン酸鉄アンモニウム(Sigma, 67F-0825) サリシン(Difco, #798545) チオ硫酸ナトリウム(Sigma, S-1648) マンニトール(Difco, 7497L) デキストロース(Difco, 709544) 酵母抽出物(Difco, 0127-19-9) Ｌ−リジンＨＣｌ(Difco, P-0705-20B) トリプトン、カゼインの膵液消化物(#3 P-5940) 中性赤(Sigma, N-7005) Ｈ₂Ｓ細片（Difco, 1626-30-6) ＭＵＣＡＰ（Research Organics, 0179M-2) フェノールレッド（Difco, R_x, 5533N) ダルシトール(Sigma, D-0256) 無水エチルアルコール(Spectrum Chemical) 水酸化ナトリウム ＨＣｌ カプリル酸(Sigma, C-5038) クエン酸ナトリウム(Difco, P-7260-20B) 硫酸マグネシウム(Sigma, M-1880) 燐酸二水素アンモニウム(Sigma, A-1645) 燐酸二カリウム（Difco, P-6500-20B) 塩化ナトリウム（Difco, 7240R_x6081R) 硫酸マグネシウム(Sigma, M0250) 硫酸第一鉄

【００４１】反応培地： １）ＭＵＣＡＰ＋Ｈ₂Ｓ細片培地−クエン酸塩ベース成分 ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム ０．２ 燐酸二水素アンモニウム １ 燐酸二カリウム １ 塩化ナトリウム ５ 酵母抽出物 ０．３ クエン酸ナトリウム ５ チオ硫酸ナトリウム ０．１ 培地のｐＨ ７．８３ ２）改変ＬＩＣＮＲ培地 成分 ｇ／ｌ 酵母抽出物 ３ トリプトン ５ Ｌ−リジン １０ Ｌ−シスチン ０．１ マンニトール ５ デキストロース １ サリシン １ 中性赤 ０．０２５ 培地のｐＨ ２５℃＋／−０．２℃で６．２ 培地１および２の両方を調製して９ｍｌ量を培地管に分
注し、１２１℃で１５分オートクレーブした。６バッグ
の全てを調製した。これらは上記に述べたようにノボビ
オシン含有改変ＴＳＢを含んでいた。バッグに以下のよ
うに細菌を接種した： バッグ１−Ｓｔ、Ｅｃ、Ｅａ、Ｈａ バッグ２−Ｓｂ、Ｅｃ、Ｅａ、Ｈａ バッグ３−Ｅｃ、Ｅａ、Ｈａ バッグ４−Ｓｔ、Ｅｃ、Ｅａ、Ｈａ バッグ５−Ｓｂ、Ｅｃ、Ｅａ、Ｈａ バッグ６−Ｅｃ、Ｅａ、Ｈａ バッグ１−３はクリスタルバイオレットを含んでいた。
バッグ４−６は、前の実施例で述べたようにクリスタル
バイオレットを含んでいない。

【００４２】予備富裕化および選択富裕化の両方を含む
１２時間の保温の後、各バッグから１ｍｌを（１）ＭＵ
ＣＡＰ／Ｈ₂Ｓおよび（２）Ｌｙｓデカルボキシラーゼ
試薬を含む２本の反応管に移した。Ｈ₂Ｓ細片を培地管
の上部で折り畳みキャップで密封した。通常は細片の半
分の長さを各サンプルに用いた。Ｈ₂Ｓ細片はＭＵＣＡ
Ｐ管にのみ混合した。続いてこれらの反応管を保温しさ
らに１２時間反応を促進させた。１２時間保温した後、
反応結果を観察し、反応管に存在する細菌を計測した。
この実験の時程は以下のとおりである： １０A.M. 損傷サルモネラ菌および競合微生物をバッグ
に接種 ２P.M. 抑制物質添加 １０P.M. 生化学反応に移替え １０A.M. 陽性結果について生化学反応の読み取り 註記：この反応は８：３０A.M.に読み取りを実施した
（この実験については２２．５時間、Ｌｙｓについては
２４時間）。ＭＵＣＡＰ試験の方法 １）サンプルをチオ硫酸ナトリウムを含むクエン酸塩ブ
ロスで１０から１２時間保温した。 ２）サンプルから１ｍｌ量を別の反応ガラス管に移し
た。 ３）１％ＭＵＣＡＰストック溶液を調製した。 ４）白金耳一杯のストックＭＵＣＡＰ溶液１μｌを１ｍ
ｌ量のサンプルに加えた。 ５）蛍光反応を進行させ、少なくとも１５分間５分毎に
読み取り、ウッズ（Woods)ランプを用いて観察した。こ
の実験の結果は表６で説明する。 ＭＵＣＡＰ試薬は、ＭＵＣＡＰ溶液の一部分を添加する
ことによってサンプルに直接添加するか、または固形支
持体（例えば紙片）上に初めにＭＵＣＡＰ試薬を載せる
ことによって添加することもできる。酢酸エチル中のメ
チルウンベリフェリルカプリレートの濃度は約０．０５
％から１０％の範囲である。酢酸エチル中のメチルウン
ベリフェリルカプリレートの好ましい濃度は約０．１％
である。

【００４３】酢酸エチルに溶解したＭＵＣＡＰ試薬の希
釈物５０μｌを５ｍｌの培地に加えることができる。さ
らにこの試薬は、細片に染み込ませてものを用いて乾燥
状態で加えることができる。以下の実施例３で説明する
ようにＭＵＣＡＰ試薬を導入するためにこの細片を続い
て培地に加えることができる。液体形での使用結果は表
６に示したものと同じであった。ＭＵＣＡＰは溶液から
沈澱する傾向があるため、以前はＭＵＣＡＰ試薬は液体
形では使用できなかった。しかしながら、本明細書で用
いられるように、酢酸エチルに溶解させたＭＵＣＡＰ試
薬を直接液体形で用いるか、または酢酸エチルに溶解さ
せたＭＵＣＡＰ試薬を固形基質上で乾燥させて用いるこ
とができる。両方の事例で沈澱は排除された。

【００４４】

【表１２】 表６ ─────────────────────────────────── １ ２ ３ ４ ５ ６ ─────────────────────────────────── ＭＵＣＡＰ^* ＋＋＋ ＋＋＋ − ＋＋＋ ＋＋＋ − ─────────────────────────────────── Ｈ₂Ｓ ＋ ＋ − ＋ ＋ − ─────────────────────────────────── Ｌｙｓ − − − − − − ───────────────────────────────────^* １５分進行後。

【００４５】Ｈ₂Ｓの結果： ＋＝細片上に黒色沈澱が形成された全ての事例 −＝細片は白色リジンの結果 ： ＋＝黄色 −＝赤色のままＭＵＣＡＰの結果 −＝培地によるバックグラウンドまたは培地と同じ ＋＝バックグラウンドを越えるが極めて弱い蛍光 ＋＋＝より強い蛍光、対照がなくても陽性の判定可能 ＋＋＋＝良好な明るい陽性蛍光 ＋＋＋＋＝強烈な蛍光 ＭＵＣＡＰの結果は少なくとも１５分の保温後に最も強
く観察された。Ｈ₂Ｓの結果 ：Ｓｔサンプルは１９時間後に陽性で、Ｓ
ｂサンプルは２０．５時間後に陽性であった。

【００４６】ＭＵＣＡＰ＋ＮａＯＨの結果：２２．５時
間後、反応管内で認められる蛍光を増強させるために、
０．１ＮのＮａＯＨ１０μｌを１ｍｌの各サンプルの被
験物に加えた。ＭＵＣＡＰ培地に水酸化ナトリウムを添
加した結果は表７に示す。

【００４７】

【表１３】 表７ １５分後のＭＵＣＡＰｗ／ＮａＯＨ ─────────────────────────────────── サンプル １ ２ ３ ４ ５ ６ ─────────────────────────────────── ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋ ───────────────────────────────────

【００４８】蛍光は、競合微生物のみを含む陰性コント
ロール（３および６）については殆ど増強されないこと
が分かった。

【００４９】リジン試験の結果 保温３０時間後リジンの検査は表８に示すように特異性
を示すようになった。

【００５０】

【表１４】 表８ ───────────────────────── １ ２ ３ ４ ５ ６ ───────────────────────── ＋黄 ＋黄 −赤 ＋黄 ＋黄 −赤 ───────────────────────── 細菌数計測はＭＵＣＡＰ／Ｈ₂Ｓ管で２２．５時間に実
施した。サンプル１、２、４および５をＸＬＤ培地で計
測し、サンプル３および６はＴＳＡ培地で計測した。こ
れら計測結果は表９に示す。

【００５１】

【表１５】 表９ ─────────────────────────────────── １ ２ ３ ４ ５ ６ ─────────────────────────────────── サルモネラ 9.5X10⁸ 5.5X10 ⁸ − 8.9X10⁸ 9.1X10⁸ − ─────────────────────────────────── 競合微生物 ＮＴ ＮＴ ＜10⁵ ＮＴ ＮＴ 7.7x10⁸ ─────────────────────────────────── ＮＴ：未試験 サンプル３（バッグ３）の競合微生物は富裕化工程から
１０⁵ｃｆｕ／ｍｌ未満に減少したことが分かった。表
１０に示したように、慣用的なサルモネラ検査法と比べ
て上記に述べた本発明の方法は、標的微生物と同じよう
に非標的微生物を含むサンプルで標的微生物の迅速な検
出を可能にする。本発明は、混合状態にある可能性が高
い培養で実施し、それによって有用な検査結果を得るた
めに必要な時間を大幅に減少させることができるように
生化学的アッセイを特質的に仕立ておよび／または改変
することによって実施される。

【００５２】

【表１６】 表１０ 通常のサルモネラ検出法とディフコの迅速サルモネラ検査の比較 ──────────────────────────────────── 時間 通常法 競合メーカーの方法−リビール ──────────────────────────────────── １日目 予備富裕化： 一次富裕化： −非抑制培地に食品サンプルを 予備富裕化 接種し、消化 −非抑制培地に食品サンプルを接 −保温２４時間 種し消化 選択富裕化 −高度に選択的な抑制物質を予備 富裕化に対して４時間で添加 ──────────────────────────────────── ２日目 選択的富裕化： 検出： −予備富裕化の１ｍ量を選択ブ −免疫アッセイ ロス培地に移す −全サンプルの検査の要あり −保温２４時間 陽性の確認の作業に移る ──────────────────────────────────── ３日目 検出： −純粋培養を得るために選択富 裕ブロスから選択寒天に全サン プルを平板培養する ──────────────────────────────────── ４日目 サルモネラの疑いのある平板を 分析する 陽性確認の作業に移る ────────────────────────────────────

【００５３】

【表１７】 表１０（続き） ──────────────────────────────────── 時間 ディフコ迅速サルモネラ検査法 ディフコ迅速サルモネラ検査法 （自動移替え） （手動移替え） ──────────────────────────────────── １日目 一次富裕化 一次富裕化 予備富裕化 予備富裕化 −軽度の抑制物質を含む培地に −軽度の抑制物質を含む培地に食 食品サンプルを接種し消化 品サンプルを接種し消化 選択富裕化 選択富裕化 −高度に選択的な抑制物質を予 −高度に選択的な抑制物質を予備 備富裕化に対して４時間で添加 富裕化に対して４時間で添加 二次富裕化： 二次富裕化： −１２時間してから一部分を自 −２４時間してから手動による移 動装置で反応培地に移す 替えで一部分を反応培地に移す ──────────────────────────────────── ２日目 分析反応： 分析反応： −７０−９０％の陰性サンプル −７０−９０％の陰性サンプルを を検出工程から除く 検出工程から除く 検出： 検出： −免疫アッセイ −免疫アッセイ 陽性確認の作業に移る 陽性確認の作業に移る ──────────────────────────────────── ３日目 ──────────────────────────────────── ４日目 ────────────────────────────────────

【００５４】実施例３ 本発明の迅速な微生物検出システムの性能を評価するた
めに、種々の条件でサンプルを検査した。最初にネズミ
チフス菌を埋め込んだ（spiked）サンプルおよびネズミ
チフス菌を埋め込まない（unspiked）サンプルを調べ
た。３７℃で４時間予備富裕化し、続いて１８時間の選
択抑制を３５℃±２℃で実施した。サルモネラ菌検出の
ために、リジン、ＭＵＣＡＰおよびＨ₂Ｓ検査を４２℃
で６時間まで実施した。材料 ： 鶏肉−タイソン（Tyson) 殻付きエビ 赤色色素−McCormick 乾燥卵黄−Sigma E-0625 鶏卵−大、ＡＡ ノボビオシン−Difco 48580JA ＴＳＡ（Difco 97897) ヘクトエン腸内菌用寒天（Hektoen Enteric Agar) 消化バッグ 消化装置−テクマーラブ(Tekmar lab)ブレンダー リジン反応用リジン−６ 酢酸エチル（Sigma 27, 052-0) Ｈ₂Ｓ反応用０．５％ペプトン ＭＵＣＡＰ細片 ＭｇＣｌ₂ （無水）−Sigma M-8266 マラカイトグリーン−Sigma M-6880 クリスタルバイオレット−Difco 727317 ネズミチフス菌ATCC14028 ＴＳＢ（Difco 97214) ０．８５％ＮａＣｌ−Difco 94669 改変ＴＳＢ−Difco 91198 Ｈ₂Ｓ細片−Difco 95855JB 市販漂白剤−Clorox ＳＤＳ−J.T. Baker(L050-5) 滅菌容器 滅菌外科用メス 滅菌ガラス器具 ピペット、チップなど

【００５５】方法：１日目 （１）改変−ＴＳＢ：合計３リットル：９８．４ｇの改
変ＴＳＢ粉末を３リットルの水に溶解し、緩やかに加熱
した。この混合物を１５ポンド１２１℃で１５分オート
クレーブし、室温で一晩冷却した。 （２）選択抑制物質：合計２００ｍｌ ４．０ｇのＭｇＣｌ₂ を２００ｍｌの滅菌水に入れ完全
に溶解させた。０．１２ｇのマラカイトグリーンをこの
ＭｇＣｌ₂ 混合物に加え、該混合物に０．０２ｇのクリ
スタルバイオレットを添加した。この混合物を穏やかに
加熱し、固形物を完全に溶解させた。混合物を室温に冷
却し、０．２２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌し
た。

【００５６】（３）ネズミチフス菌：ＴＳＢで継代培養
を調製し、一晩３７℃で保温した。損傷培養（上記のよ
うに損傷）から得た１０^-3希釈の１００μｌサンプルを
" 埋め込み（spiked)"と標識したバッグに加えた。

【００５７】（４）ＭＵＣＡＰ細片：ＭＵＣＡＰの０．
１％溶液を酢酸エチルで調製した。 未使用濾紙片を
０．１％ストック溶液に浸し、完全に風乾した。 （５）リジン反応用リジン−６： 硫酸マグネシウム−０．１ｇ 燐酸アンモニウムモノベーシック−０．５ｇ リン酸カリウムジベーシック−０．５ｇ ＮａＣｌ−２．５ｇ 酵母抽出物−０．１５ｇ リジンＨＣｌ−５．０ｇ ブラウンクレゾール紫（Brown Cresol Purple)−０．２
％ストック２．５ｍｌ 乳糖−１．２５ｇ 蔗糖−１．２５ｇ 上記を蒸留水１リットルに溶解し、ｐＨを５．１に調整
して１５ポンドの圧で１２１℃１５分滅菌した。サンプ
ルを５ｍｌの滅菌試験管に分注した。 （６）０．５％ペプトン：０．５ｇのペプトンを１００
ｍｌの１回蒸留したＨ₂Ｏに溶解し、１５ポンド１２１
℃で１５分オートクレーブした。溶液を室温に冷却し、
５ｍｌのサンプルを滅菌管に分注した。 （７）ヘクトエン腸内細菌用寒天：製造元の指示にした
がって１リットル容量を調製し、一晩室温で保存した。

【００５８】２日目 （１）消化バッグ：２２５ｍｌの改変ＴＳＢを滅菌消化
バッグに分注し、以下のように標識した： １．乾燥卵黄（埋め込み） ６．乾燥卵黄（非埋め込み） ２．鶏卵（埋め込み） ７．鶏卵（非埋め込み） ３．鶏肉（埋め込み） ８．鶏肉（非埋め込み） ４．エビ（埋め込み） ９．エビ（非埋め込み） ５．色素（埋め込み） １０．色素（非埋め込み） １１．コントロール（埋め込み無し、肉無し）

【００５９】（２）鶏卵：１リットルの洗浄溶液を以下
のように調製した：１グラムのＳＤＳを９９２ｍｌのＨ
₂Ｏに加え、市販の漂白剤８ｍｌを添加した。実験に使
用した鶏卵は固いブラシで洗浄し乾燥させた。この洗浄
鶏卵を３０分ＳＤＳ−漂白剤溶液に浸した。卵黄を無菌
的に取り出し、各卵黄２５グラムを適切に標識された消
化バッグに入れた。テクマー消化装置でバッグを約２分
消化した。１ミリリットル量をｐＨ検査の目的で取り出
した。さらに１ミリリットル量を食塩水試験管で１０^-2
および１０^-3の連続希釈を作製するために取り出した。
１ミリリットルの１０^-2および１０^-3を空の滅菌ペトリ
皿に入れ、約２０ｍｌの液体の平板カウント寒天をペト
リ皿に注ぎ入れて固まらせた。続いてこの平板を４８時
間３５℃±２℃で保温した。

【００６０】（３）鶏肉：切り刻んだ鶏肉約２５ｇのサ
ンプルを２つ無菌的に計量して取り出した。このサンプ
ルを消化バッグに入れて約２分消化した。続いて消化し
た材料を（２）で述べたようにサンプルとして取り出し
て平板培養した。 （４）乾燥卵黄：約２５ｇの乾燥卵黄のサンプルを２つ
無菌的に計量して取り出し、消化バッグに入れた。サン
プルを消化し、（２）の説明のようにｐＨ検査および平
板培養の目的で一部分を取り出した。 （５）エビ：半分に切ったエビ約２５ｇのサンプルを２
つ無菌的に計量して取り出し、改変ＴＳＢを含む滅菌消
化バッグに移した。上記の（２）に記載したようにこの
サンプルを取り扱った。

【００６１】（６）ノボビオシン：凍結乾燥ノボビオシ
ンを４℃の保存から取り出し室温に馴染ませた。各々の
凍結乾燥ノボビオシンバイアルには２０ｍｇのノボビオ
シンが含まれていた。滅菌蒸留水（３．５５ｍｌ）を無
菌的に各バイアルに注入し、５．６３ｍｇ／ｍｌのスト
ック溶液を得た。コントロールバッグ（バッグ１１）と
標識した消化バッグを含む各消化バッグに１ミリリット
ルのノボビオシン溶液を無菌的に添加して、最終濃度２
５μｇ／ｍｌを得た。各消化バッグへのノボビオシンの
添加に続いて、ノボビオシンを混合物全体に分布させる
ために各バッグの内容物を激しく攪拌して混合した。 （７）０時（Ｔ₀）の平板カウント：１０^-2および１０
^-3希釈から得た接種物サンプルの１００μｌをヘクトエ
ン腸内細菌用培地にＴＳＡ平板と同様に平板培養した。
続いて、この平板を層流の下で１５分乾燥させ、３５℃
±２℃で４８時間保温した。表１１はこの平板カウント
の結果を示す。

【００６２】

【表１８】

【００６３】（８）赤色色素：１０ｍｌの色素を２２５
ｍｌの改変ＴＳＢに添加した。続いて上記に詳細に述べ
た（２）の方法にしたがった。

【００６４】（９）予備富裕化：消化バッグ（サンプル
およびコントロールを含む）を３５℃±２℃で４時間保
温した。平板カウントはＴ₄で実施し、結果は表１２に
示した。

【００６５】

【表１９】

【００６６】（１０）選択抑制：１１個のバッグを３５
℃±２℃での保温から４時間後に取り出した。１０ｍｌ
の選択的抑制物質を添加し混合した。バッグを続いて一
晩保温した。

【００６７】３日目 （１１）生化学反応： （ａ）リジン：５ｍｌのリジン−６を滅菌管に分注し
た。各バッグから得た５０μｌ（１：１００希釈）をリ
ジン−６を含む別々の試験管に添加した。陰性コントロ
ールも含めて試験管の全てを６時間まで４２℃で保温し
た。各試験管の読み取りを毎時間実施した。結果は表１
３に示す。

【００６８】

【表２０】

【００６９】（ｂ）Ｈ₂Ｓ：０．５％ペプトン５ｍｌを
滅菌管に分注した。０．５％ペプトンを含む別々の試験
管に各バッグから１００μｌを分注した。陰性コントロ
ール試験管とともに各試験管にＨ₂Ｓ細片を吊るした。
試験管を４２℃で６時間まで保温した。結果は表１４に
示す

【００７０】

【表２１】

【００７１】（ｃ）ＭＵＣＡＰ：５ｍｌのリジン−６を
滅菌管に分注した。各バッグから得た１００μｌの被験
材料ををリジン−６を含む別々の試験管に添加した。陰
性コントロール試験管を含む各試験管にＭＵＣＡＰ細片
を吊るした。試験管を逆さまにしないで４２℃で６時間
まで保温した。続いて試験管を少しの間逆さまにし、室
温で５、１０および１５分後に一切の変化を読み取っ
た。結果は表１５に示す

【００７２】

【表２２】

【００７３】（１２）生化学反応の解釈： （ａ）リジン：黄色から紫色の着色変化が陽性反応を示
した。 （ｂ）Ｈ₂Ｓ：Ｈ₂Ｓ細片の黒色化が陽性反応を示した。 （ｃ）ＭＵＣＡＰ：１＋またはそれより強い低波長ＵＶ
光の蛍光が陽性反応を示した。 （１３）Ｔ₂₂の平板カウント _: （ａ）Ｔ₂₂（接種後２２時間）：選択的抑制物質と一晩
保温した後、各消化バッグの材料を食塩水ブランクで希
釈した（１０^-1、１０^-2および１０^-3）。１０ ^-2および
１０^-3の５０μｌをＴＳＡおよびＨＥ平板に播種した。
この平板を３５℃±２℃で一晩保温し、ネズミチフス菌
または他のいずれかの夾雑菌が増殖したか否かを調べ
た。結果は表１６に示すが、ここで（ＴＮＴＣ）はコロ
ニーが多過ぎてカウントできないことを示す。

【００７４】

【表２３】

【００７５】（ｂ）Ｔ₂₇（接種後２７時間）：リジンを
用いた生化学反応が陽性になった後（もし陽性にならな
ければ、４２℃で保温した後で）、白金耳一杯の反応混
合物をＨＥ平板に播種し、一晩３５℃±２℃で保温し、
続いてコロニーの性状を観察した。結果は表１７に示
す。

【００７６】

【表２４】

【００７７】結果： （１）改変ＴＳＢ中のサンプル食品のｐＨ（消化後）： 乾燥卵黄 ６．８ 卵黄 ７．０ エビ ７．２２ 鶏肉 ６．８８ 色素 ７．２１ コントロール（改変ＴＳＢのみ） ７．２２ （２）ネズミチフス菌培養に対する損傷％： 損傷％は先に述べたように算出し、９０．３％であっ
た。 （３）消化サンプルのＴ₀平板カウントは表１１に示
す。

【００７８】結論：０時間（Ｔ₀）では、サンプルはい
ずれもＨＥ寒天上で典型的なコロニーは示さなかった
（表１１参照）。しかしながら、ＴＳＡ上では鶏肉およ
びエビのサンプルは１０^-2で３０ｃｆｕ／ｍｌおよび１
０^-2希釈で多過ぎてカウント不能コロニー（ＴＮＴＣ）
を示し、雑菌の混入を示唆した。予備富裕化の４時間
後、以下の観察がＴＳＡ上で認められた（表１２参
照）： 乾燥卵黄−埋め込み １０^-2希釈で２０ｃｆｕ／ｍｌ 鶏肉−埋め込み １０^-2希釈で２０ｃｆｕ／ｍｌ エビ−埋め込み １０^-2希釈で２２０ｃｆｕ／ｍｌ 鶏肉−非埋め込み １０^-2希釈で２０ｃｆｕ／ｍｌ エビ−非埋め込み １０^-2希釈で２４０ｃｆｕ／ｍｌ 他のバッグはいずれも４時間の保温の後いかなる増殖も
示さなかった。

【００７９】表１６によれば、合計２２時間の保温（Ｔ
₂₂）の後、ＴＳＡでは非埋め込み卵黄および非埋め込み
色素以外のサンプルではコロニーは多過ぎてカウント不
能であった。このことは、埋め込みおよび非埋め込みサ
ンプルの両方で微生物は増殖の機会をもち増殖を開始す
ることができること、すなわち細菌濃度は１ｘ１０⁶ｃ
ｆｕ／ｍｌに達することが可能なことを示している。卵
黄および色素は無菌的であることが判明し、さらに検査
中は一貫して無菌的であった。ＨＥ寒天での平板培養に
続いて、乾燥卵黄−埋め込みは青・緑色コロニーを示
し、サルモネラ菌の存在を示唆した（表１７参照）。卵
黄−埋め込みも同じ結果を示した。鶏肉−埋め込みおよ
びエビ−埋め込みからはサケ肉色で胆汁色の沈澱を有す
るコロニーが単離された。これらのコロニーは大腸菌の
可能性があろう。色素−埋め込みのサンプルはＨＥ平板
で典型的なサルモネラコロニーを示した。乾燥卵黄−非
埋め込みはＨＥ平板で典型的なサルモネラコロニーを示
し、乾燥卵黄はおそらくある程度サルモネラ菌で汚染さ
れたことを示唆した。卵黄−非埋め込みおよび色素は全
検査期間の間無菌状態を維持した。鶏肉−非埋め込み
は、ある程度の汚染（おそらく大腸菌でこれは胆汁色の
沈澱を含むサケ肉色を示す）を含むことが分かった。エ
ビ−非埋め込みは、ＨＥ寒天で幾つかのサルモネラ型コ
ロニーとともに多くのサケ肉色コロニーを含むことが分
かった。陽性コントロール（埋め込み）は、ＨＥ寒天で
外見的にサルモネラと思われる多くのコロニーを含むこ
とが分かった。

【００８０】４２℃で６時間保温した後生化学反応管か
ら得た接種物に由来するコロニーは以下の外観を有して
いた：乾燥卵黄−埋め込み、卵黄−埋め込み、色素−埋
め込み、乾燥卵黄−非埋め込みおよびコントロールサン
プルは、黒色の中心部をもつ青・緑色のコロニー（サル
モネラ菌を示唆する）を有することが分かった。鶏肉−
埋め込みおよびエビ−埋め込みは、胆汁色の沈澱を有す
るサケ肉色のコロニーを示し、夾雑菌（おそらく大腸
菌）の存在を示唆した。卵黄−非埋め込みおよび色素−
非埋め込みは増殖を示さず、無菌的であることを示唆し
た。鶏肉−非埋め込みは夾雑菌（おそらく大腸菌）の存
在について陽性であることが判明した。エビ−非埋め込
みは、サルモネラ様コロニーとともに夾雑菌の混合物を
含むことが判明した。陽性コントロールは、サルモネラ
の外見を有するコロニーのみを含むことが分かった。

【００８１】生化学反応：表１８によれば、乾燥卵黄−
埋め込みはサルモネラ菌を示唆する反応について陽性で
あることが分かった。この結果は予想したとおりで、本
物の陽性結果と考えられた。卵黄−埋め込みはサルモネ
ラ菌について陽性の検査結果を示した。鶏肉−埋め込み
は、サルモネラ菌の存在について陽性の生化学プロフィ
ールを不当に引き出した。エビ−埋め込みは、リジンと
ＭＵＣＡＰ反応の両方がサルモネラ菌の存在について陰
性であるという事実から矛盾がある。色素−埋め込み
は、リジンとＭＵＣＡＰ反応の両方が反応培地の暗赤色
のために読み取りが困難であるという事実のために決定
不能であった。Ｈ₂Ｓ検査ではサルモネラ菌の存在につ
いて陽性であることが分かった。乾燥卵黄−非埋め込み
は生化学プロフィールを利用すれば陰性であったが、Ｈ
Ｅ寒天では、サルモネラ菌または他の夾雑菌の存在を示
唆するサルモネラ様コロニーが存在した。卵黄−非埋め
込みは本物の陰性生化学結果を生じたことが分かった。
鶏肉−非埋め込みは弱い陽性の生化学プロフィールを示
した。この結果は、ＨＥ寒天で夾雑菌が分離されたとい
う事実と結びつき、鶏肉−非埋め込みについての生化学
プロフィールは本物の陰性結果であることを示した。エ
ビ−非埋め込みは、生化学結果は陽性でサルモネラ菌に
よる汚染を示唆するという事実のために矛盾がある。色
素−非埋め込みは無菌的なままで、検査の間中コロニー
を生じなかった。コントロール試験管は、サルモネラ菌
の存在について本物の陽性結果を示唆する強い陽性の生
化学プロフィールを示した。これらの結果（エビ−埋め
込みおよびエビ−非埋め込みの両方についての矛盾を含
む）は、本発明の迅速な微生物検出方法は、２８時間の
全検査時間内に最も確実な結果を提供することを示し
た。

【００８２】

【表２５】

【００８３】実施例４ 本実施例では、（サルモネラ菌）埋め込みおよび非埋め
込み鶏肉、エビ、無脂肪ドライミルク、全粒黒胡椒、豚
挽き肉、牛挽き肉およびミルクチョコレートを検査する
ことによって本発明の迅速な微生物検出方法の性能を評
価するために実施した実験を詳述する。材料 ： 無脂肪ドライミルク−Saco Mix'n Drink 全粒黒胡椒−McCormick 豚挽き肉ソーセージ 牛挽き肉 ミルクチョコレート−Hershey's Milk Chocolate Bar ＴＳＩ寒天−Difco 72853JG 残りの材料は実施例３に挙げたとおりである。方法 ：方法は実施例３で述べたとおりに実施した。

【００８４】２日目 （１）消化バッグ：鉱物を含まない２２５ｍｌの改変Ｔ
ＳＢを滅菌消化バッグに分注し。以下のように標識し
た： 埋め込み 非埋め込み １．鶏肉 ８．鶏肉 ２．エビ ９．エビ ３．ドライミルク １０．ドライミルク ４．全粒黒胡椒 １１．全粒黒胡椒 ５．豚挽き肉ソーセージ １２．豚挽き肉ソーセージ ６．牛挽き肉 １３．牛挽き肉 ７．ミルクチョコレート １４．ミルクチョコレート １５．コントロール （２）２５ｇの検査材料を計量し、（１）のように標識
した消化バッグに入れた。 （３）ノボビオシン：実施例３で述べたとおり。 （４）０時（Ｔ₀）の平板カウント：１０^-2および１０
^-3希釈から得た接種物１００μｌをＴＳＡ平板とともに
ヘクトエン腸内細菌用培地に平板培養した。続いてこの
平板を１５分層流の下で乾燥させ、３５℃±２℃で４８
時間培養した。結果は表１９に示す。

【００８５】

【表２６】

【００８６】（５）予備富裕化：消化バッグ（サンプル
およびコントロールを含む）を３５℃±２℃で４時間培
養した。 （６）選択抑制：保温４時間後に３５℃±２℃の保温か
らバッグを取り出した。選択抑制物質１０ｍｌを添加し
混合した。続いてバッグを３５℃±２℃の保温器に入れ
一晩保温した。Ｔ₄で平板カウントを実施し、結果は表
２０に示す。

【００８７】

【表２７】

【００８８】（７）生化学反応： （ａ）リジン：上記のように実施した。結果は表２１に
示す。

【００８９】

【表２８】

【００９０】（ｂ）Ｈ₂Ｓ：上記のように実施した。結
果は表２２に示す。

【００９１】

【表２９】

【００９２】（ｃ）ＭＵＣＡＰ：上記のように実施し
た。結果は表２３に示す。

【００９３】

【表３０】

【００９４】（８）結果の解釈： リジン：黄色から紫色への変化は陽性結果を示し、黄色
から灰色への変化は弱い陽性を示した。 Ｈ₂Ｓ：細片の僅かな黒色化は弱い陽性を示し、中等度
の黒色化は陽性結果を示した。 ＭＵＣＡＰ：１＋またはそれより強い蛍光は陽性結果を
示した。 （９）Ｔ₂₂でのＨＥおよびＴＳＩ平板培養：ヘクトエン
腸内細菌用寒天：黒色の中心部を有する青・緑色コロニ
ーはサルモネラ菌を示唆し、胆汁色の沈澱をもつ橙色の
コロニーは夾雑菌を示唆した。結果は表２４および２５
に示す。

【００９５】ＴＳＩ斜面培地：アルカリ性の斜面、黒色
の底部およびガス産生はサルモネラ菌の存在を示唆し
た。黄色の斜面および底部並びにガス産生は大腸菌の存
在を示唆し、さらに黒色の斜面および底部、ある程度の
黄色の着色（酸性斜面）はサルモネラ菌および夾雑菌の
交差汚染を示唆した。結果は表２４および２５に示す。

【００９６】

【表３１】

【００９７】

【表３２】

【００９８】結果： （１）２分消化後の改変ＴＳＢ中の検査材料のｐＨ： コントロール ７．３ 鶏肉 ６．８２ エビ ７．３４ ドライミルク ６．７９ 胡椒 ７．２２ 豚肉ソーセージ ６．８６ 牛挽き肉 ６．８４ ミルクチョコレート ６．９６ （２）バッグ当たりの微生物数（埋め込みサンプルの
み）：１０^-4の損傷培養の１００μｌ：ＴＳＡ平板での
１ｃｆｕはＴ₀で約１ｃｆｕ／バッグを生じた。 ＨＥ平板でのＴ₀：１０^-2および１０^-3希釈の５０μｌ
をＨＥ平板で平板培養した。結果は表１９に示す。

【００９９】結論：表２６に示した結果によれば、ドラ
イミルク、全粒黒胡椒およびミルクチョコレート（全て
非埋め込み）は本物の陰性結果を生じた。７種の埋め込
みサンプルの全てはサルモネラ菌について陽性結果を生
じた。鶏肉、エビ、豚挽き肉ソーセージおよび牛挽き肉
（全て非埋め込み）は全てサルモネラ菌について検査が
陽性であることが判明し、これらの製品は、ルモネラ
菌、またはサルモネラ菌の存在について陽性の生化学検
査プロフィールを生じるサルモネラ様微生物で汚染され
ていた可能性があることを示唆した。

【０１００】

【表３３】

【０１０１】サルモネラ菌の存在について陽性の検査結
果を示す全てのサンプルで青・緑色コロニーが、２２時
間または２８時間のいずれかの時点でヘクトエン腸内細
菌用寒天で認められた（これはサルモネラ様微生物を示
唆する）。これらのコロニーのＴＳＩ斜面培地の結果に
よってサルモネラ菌の存在が確認された。しかしなが
ら、１０^-2および１０^-3希釈はＨＥ寒天で過剰密集コロ
ニーを生じることが分かった。いくつかの事例ではこの
過剰密集コロニーはサルモネラ菌の存在を覆い隠した。
これらの結果は、ネズミチフス菌のただ１個の細胞また
はコロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む接種物が食品サン
プルに接種されたときでさえ、従来技術による方法で必
要とされるよりも少ない時間でこの最も確実な検査結果
が得られることを示した。

【０１０２】本出願を通して種々の刊行物が引用および
数字によって参照されている。これら刊行物の完全な引
用は以下の一覧に示されている。本発明に関連する技術
の状態をより完全に述べることを目的として、これら刊
行物の完全な開示が参照により本明細書に含まれる。本
発明を説明的態様で開示してきたが、使用した用語は限
定よりむしろ詳述を目的としていることは理解されるべ
きである。明らかに本発明に多くの改変および変更が上
記の教示によって可能である。したがって、本発明は、
具体的に記載されたものよりむしろ添付の請求の範囲内
で実施することができることは理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】熱損傷ネズミチフス菌の種々の予備富裕化培地
における増殖を示すグラフである。

【図２】抑制物質を添加しない改変ＴＳＢ培地における
種々の細菌サンプルの時間に対する増殖を示すグラフで
ある。

【図３】乳糖ブロスコントロール培地における種々の細
菌サンプルの時間に対する増殖を示す。

【図４】ブリリアントグリーン／デオキシコレートの抑
制物質組合せを含む改変ＴＳＢ培地における種々の細菌
サンプルの時間に対する増殖を示すグラフである。

【図５】ブリリアントグリーン／デオキシコレートの抑
制物質組合せを含む乳糖ブロスにおける種々の細菌サン
プルの時間に対する増殖を示すグラフである。

【図６】ブリリアントグリーン／ノボビオシンの抑制物
質組合せを含む改変ＴＳＢ培地における種々の細菌サン
プルの時間に対する増殖を示すグラフである。

【図７】抑制物質タージトール４を含む改変ＴＳＢ培地
における種々の細菌標本の時間に対する増殖を示すグラ
フである。

【図８】増殖抑制物質タージトール４を含む乳糖ブロス
における種々の細菌標本の時間に対する増殖を示すグラ
フである。

【図９】タージトール４／ブリリアントグリーンの抑制
物質組合せを含む改変ＴＳＢ培地における種々の細菌標
本の時間に対する増殖を示すグラフである。

【図１０】ノボビオシンを含む改変ＴＳＢ培地における
ネズミチフス菌の増殖曲線を示すグラフであるが、ここ
でノボビオシンの濃度は増殖に対するその影響を調べる
ために変化させられている。

【図１１】ノボビオシンを含む改変ＴＳＢ培地における
S. brandenbergの増殖曲線を示すグラフであるが、ここ
でノボビオシンの濃度はS. brandenbergの増殖に対する
その影響を調べるために変化させられている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 モーリーン エイ シュナイダー アメリカ合衆国 ミシガン州 49334 フ ァーミントン ヒルズ ベラ ヴィスタ ドライヴ 31719 (72)発明者 ショーバ シー スワミー アメリカ合衆国 ミシガン州 48188 キ ャントン ダンストン ロード 1675 (72)発明者 マンダー エス ネイガー アメリカ合衆国 ミシガン州 48197 イ プシランティ タウンシップ ランブルウ ッド ストリート 7809

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記工程を含む、標的微生物および非標
   的競合微生物の両方を含み得るサンプル中の標的微生物
   を検出および同定する迅速なスクリーニング方法：サン
   プルを増殖培地で予備富裕化し；非標的微生物の増殖を
   抑え、さらに標的微生物の増殖を促進するための少なく
   とも１つの非標的微生物抑制物質を該増殖培地に加え；
   少なくとも１つの該抑制物質を含む該増殖培地中の該サ
   ンプルを所定時間保温し；標的微生物の同定に特異的な
   生化学的アッセイを実施し；およびサンプル中の標的微
   生物の存在を検出する。
2. 【請求項２】 該増殖培地が軽度に抑制的である請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】 標的微生物について陰性であることが判
   明したサンプルを選別して除く工程をさらに含む請求項
   １に記載の方法。
4. 【請求項４】 該サンプルが微生物の混合培養を含むと
   さらに規定される請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 当該予備富裕化工程が継続して約２から
   ６時間である請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 当該予備富裕化工程が継続して約４時間
   である請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 該サンプルが増殖培地および少なくとも
   １つの非標的微生物抑制物質とともに約６時間から８時
   間保温される請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 該サンプルが増殖培地および少なくとも
   １つの非標的微生物抑制物質とともに約８時間保温され
   る請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 該サンプルが、標的微生物の同定に特異
   的な生化学試薬を含む増殖培地とともに約１２から１４
   時間保温される請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 該サンプルが、標的微生物の同定に特
    異的な生化学試薬を含む増殖培地とともに約１２時間保
    温される請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 該サンプルが約３３℃から４３℃の範
    囲の温度で保温される請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 該サンプルが約３５℃で保温される請
    求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 該増殖培地が改変ＴＳＢおよび抗生物
    質を含む請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 該抗生物質がノボビオシンを含む請求
    項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 該抑制物質が塩化マグネシウム、マラ
    カイトグリーンおよびクリスタルバイオレットの混合物
    を含む請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 該抑制物質がセレナイト−システイン
    テトラチオネートを含む請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 該生化学試薬がＨ₂Ｓ検査細片を含む
    請求項１に記載の方法。
18. 【請求項１８】 該生化学試薬がリジンデカルボキシラ
    ーゼ検出試薬を含む請求項１に記載の方法。
19. 【請求項１９】 該生化学試薬がアルギニンデカルボキ
    シラーゼおよびオルニチンデカルボキシラーゼを含む請
    求項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 該生化学試薬が、基質としてダルシト
    ール、プロピレングリコールおよびグルクロン酸塩を含
    む基質利用反応を含む請求項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 該生化学試薬がメチルウンベリフェリ
    ルカプリレート（ＭＵＣＡＰ）およびメチルウンベリフ
    ェリルグルコナイド（ＭＵＧ）を含む請求項１に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 該メチルウンベリフェリルカプリレー
    ト（ＭＵＣＡＰ）およびメチルウンベリフェリルグルコ
    ナイド（ＭＵＧ）が溶液状態である請求項２１に記載の
    方法。
23. 【請求項２３】 該メチルウンベリフェリルカプリレー
    ト（ＭＵＣＡＰ）およびメチルウンベリフェリルグルコ
    ナイド（ＭＵＧ）が固形状態である請求項２１に記載の
    方法。
24. 【請求項２４】 移替え工程がさらに、所定量の増殖培
    地に含まれるサンプルについて免疫アッセイを実施する
    工程を含む請求項１に記載の方法。
25. 【請求項２５】 適用工程がさらに、増殖培地中のサン
    プルを少なくとも部分的に均質化すると規定される請求
    項１に記載の方法。
26. 【請求項２６】 標的微生物の同定に特異的な生化学試
    薬を含む、少なくとも１種の培地を入れた液体容器に、
    サンプルを含む所定量の増殖培地を移し替える工程をさ
    らに含む請求項１に記載の方法。
27. 【請求項２７】 当該移替え工程が実質的に自動化され
    ている請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 当該移替え工程が実質的に手動である
    請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 下記を含む、標的微生物および非標的
    競合微生物の両方を含み得るサンプル中の標的微生物を
    検出および同定する迅速なスクリーニングのためのシス
    テム：サンプルおよび増殖培地を含有するための容器手
    段：非標的微生物の増殖を抑え、かつ標的微生物の増殖
    を促進する増殖培地中の非標的微生物の増殖を抑制する
    ための増殖抑制手段；サンプル中の標的微生物を同定す
    るための生化学試薬手段；およびサンプル中の標的微生
    物の存在を検出するための検出手段。
30. 【請求項３０】 当該増殖培地が改変ＴＳＢおよび抗生
    物質を含む請求項２９に記載のシステム。
31. 【請求項３１】 当該抗生物質がノボビオシンを含む請
    求項３０に記載のシステム。
32. 【請求項３２】 当該増殖抑制手段が塩化マグネシウ
    ム、マラカイトグリーンおよびクリスタルバイオレット
    の混合物を含む請求項２９に記載のシステム。
33. 【請求項３３】 該抑制物質がセレナイト−システイン
    テトラチオネートを含む請求項２９に記載のシステム。
34. 【請求項３４】 当該生化学試薬手段がＨ₂Ｓ検査細片
    を含む請求項２９に記載のシステム。
35. 【請求項３５】 当該生化学試薬手段がリジンデカルボ
    キシラーゼ検出試薬を含む請求項２９に記載のシステ
    ム。
36. 【請求項３６】 該生化学試薬がアルギニンデカルボキ
    シラーゼおよびオルニチンデカルボキシラーゼを含む請
    求項２９に記載のシステム。
37. 【請求項３７】 該生化学試薬が、基質としてダルシト
    ール、プロピレングリコールおよびグルクロン酸塩を含
    む基質利用反応を含む請求項２９に記載のシステム。
38. 【請求項３８】 当該生化学試薬手段がメチルウンベリ
    フェリルカプリレート（ＭＵＣＡＰ）およびメチルウン
    ベリフェリルグルコナイド（ＭＵＧ）を含む請求項２９
    に記載のシステム。
39. 【請求項３９】 該メチルウンベリフェリルカプリレー
    ト（ＭＵＣＡＰ）およびメチルウンベリフェリルグルコ
    ナイド（ＭＵＧ）が溶液状態である請求項３８に記載の
    システム。
40. 【請求項４０】 該メチルウンベリフェリルカプリレー
    ト（ＭＵＣＡＰ）およびメチルウンベリフェリルグルコ
    ナイド（ＭＵＧ）が固形状態である請求項３８に記載の
    方法。
41. 【請求項４１】 当該検出手段が、当該サンプルについ
    て免疫アッセイを実施するための免疫アッセイ手段を含
    む請求項２９に記載のシステム。
42. 【請求項４２】 当該サンプルおよび増殖培地を含有す
    るための当該容器手段が弾力性を有するプラスチックバ
    ッグを含む請求項２９に記載のシステム。
43. 【請求項４３】 酢酸エチル中に溶解されたメチルウン
    ベリフェリルカプリレートの溶液を含む、微生物学的診
    断分析で使用するメチルウンベリフェリルカプリレート
    （ＭＵＣＡＰ）試薬。
44. 【請求項４４】 当該溶液中のメチルウンベリフェリル
    カプリレートの濃度が約０．０５％から１０％の範囲で
    ある請求項４３に記載の試薬。
45. 【請求項４５】 当該溶液中のメチルウンベリフェリル
    カプリレートの濃度が約０．１％である請求項４４に記
    載の試薬。