JP2012505648A - レジオネラ属バクテリアを検出および/または同定するための反応培地 - Google Patents
レジオネラ属バクテリアを検出および/または同定するための反応培地 Download PDFInfo
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Abstract
Description
2005年には、フランスでは1500件以上、ヨーロッパでは約5700件が報告された。米国では、CDC (Centers for Disease Control and Prevention) は、年間8000〜18000件のレジオネラ症があると推定している。
診断は、以下の方法に従って実施することができる:
・直接の免疫蛍光法による同定。
主要なレジオネラ・ニューモフィラ亜群に対する抗体を用いて試料上で実施する。この方法では、可溶性抗原を示すことが可能である。主に使用する方法は、ELISA(酵素免疫吸着測定法)、RIA(放射免疫学アッセイ)またはICM(膜上の免疫クロマトグラフィー)である。これらの技術の主な欠点は、それらが特定のレジオネラ・ニューモフィラ亜群が存在する可能性のみを検出することができることである;
・間接免疫蛍光法によるLPS O抗原に対する抗体の血清学的診断。この方法は、レジオネラ・ニューモフィラ亜群1だけを同定することが可能であり、マイコバクテリウム、レプトスピラ、クラミジア属、マイコプラズマ属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属などとの交差反応による偽陽性の危険性が高い;
・培養方法による細菌の同定。レジオネラを増殖させることは困難である。レジオネラが血液寒天培地上で培養されず、pHは厳しく制御されなければならず(6.9+/−0.2)、バクテリアの必要条件を満たされなければならないためである。したがって、培養は、一般的には、ACESバッファー、L‐システインおよび鉄(これらの最後の2成分は必須の増殖因子である)を添加したBCYE(緩衝活性炭酵母抽出物:Buffered Charcoal Yeast Extract)寒天;又はGVPC寒天で実施される。コロニーは、37℃で48時間のインキュベーションにより観察することができる。レジオネラの同定は、大部分のレジオネラ種、特にレジオネラ・ニューモフィラの単離を促進する特異的な選択培地であるGVPCレジオネラ培地(ビオメリュー)上で実施することができる。3つの抗生物質の最適化された混合物によって、この培地は、グラム陽性菌、大部分のグラム陰性菌、酵母およびカビの増殖を抑制することができる。しかしながら、この培養培地はレジオネラによって産生されるか、又は培地(イースト抽出物、寒天等)に存在するか、培地の加圧滅菌(レジオネラにとって毒であるフリーラジカルも形成する)によって産生される毒性化合物を吸着するための活性炭を含む。結果として、これらの培地は黒色であり、培地の読みとりを促進できる発色性又は蛍光性酵素基質の組込みに不適当である。
反応培地は、培養培地、検出(revealing)培地または培養且つ検出培地であってもよい。検出培地の場合、微生物は接種の前に培養され、培養且つ検出培地の場合、検出培地は培養培地をも構成する。当業者は、2つの培地が容易に比較できるように成っている双プレートを使用することができ、それはさまざまな基質またはさまざまな選択混合物を含み、その上に同じ生物学的サンプルが置かれる。
選択培地は、更に、特定のレジオネラ種(たとえばレジオネラ・ニューモフィラ)の選択培養を可能にすることができる。この場合、選択混合物は、特に以下の化合物:グリシン、硫酸ポリミキシンB、バンコマイシンまたはセファマンドール、シクロヘキシミド、アニソマイシン、ナタマイシン、ブロムクレゾールパープル、ブロムチモールブルーを単独でまたは組合わせて含む。
非極性シリカは、非極性の化学官能基、最も一般的には少なくとも2つの炭素原子を有するアルキル化された鎖がグラフトされている1又は複数のシリカ粒子を意味することを目的とする。好ましくは、それらは4から24の炭素原子、さらにより好ましくは18の炭素原子(オクタデシル)、8つの炭素原子(オクチル)または4つの炭素原子(ブチル)を有する。この非極性シリカはオクタデシルシリカまたはオクチル・シリカであることが望ましい。
蛍光性又は発色性酵素の基質なる用語は、分子の代謝が基質とは異なる蛍光または色を有する生成物を生み出す分子を意味することを目的とする。
発色性基質として、アリザリン、α-グルコシダーゼ基質、特にアリザリン-α-グルコシドを元にしたものを挙げることができる。蛍光性基質として、特許EP0641351(Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent precipitates", Haugland et al.) 又は特許出願FR07/55371に記載のクマリン、レダクターゼ基質、特にニトロレダクターゼ基質、より好ましくは特許出願FR07/55373または特許EP1124986に記載されているものを挙げることができる。酸化還元酵素の酵素活性のための基質として、特にレダクターゼ基質、好ましくはニトロレダクターゼ基質を挙げることができる。すでにアリザリン-α-グルコシドを含んでいる培地に、第2の酵素基質、特に第2のα-グルコシダーゼ基質を導入することは、培地で増殖する他の属からレジオネラを区別することを高めることができる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に前記反応培地は、酵素基質を含む。好ましくは、前記酵素基質は、蛍光性または発色性であり、好ましくは発色性の酵素基質である。前記蛍光性又は発色性酵素基質は、酸化還元酵素基質または加水分解酵素基質であることが望ましい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、反応培地は、更にレジオネラ属バクテリアの選択培養を可能にする選択混合物を含む。
好ましくは、この選択混合物は、単独でまたは組合せにより、グリシン、硫酸ポリミキシンB、バンコマイシン、シクロヘキシミド、アニソマイシン、ブロムクレゾールパープルまたはブロムチモールブルーを含む。上記の培地の使用は、レジオネラ属バクテリアの選択的検出を可能にする。
本発明による培地は、レジオネラの特定の種(例えばレジオネラ・ニューモフィラ)の選択培養を可能にする選択混合物を含んでもよい。そのとき、この選択混合物は、単独でまたは組合せで、グリシン、硫酸ポリミキシンB、バンコマイシン、キノロンまたはフルオロキノロン、シクロヘキシミド、アニソマイシン、ブロムクレゾールパープルまたはブロムチモールブルーを含むことが好ましい。選択性の違いは、また、2.5g/l〜7.5g/lの範囲でグリシン濃度を変化させることによって得ることができる(Glycine-containing selective medium for isolation of Legionellaceae from environmental specimens, Robert M. Wadowski and Robert B. Yee)。
本発明の好ましい一実施形態によれば、使用する反応培地中のケイ質化合物の濃度は、0.01〜100g/l、好ましくは1〜5g/lである。使用する反応培地がケイ質化合物の組合せを含む場合には、各々の化合物の濃度は、0.01〜100g/l、好ましくは1〜5g/lである。
a)上記の反応培地にレジオネラ属バクテリアを含む可能性がある試料を接触させる工程、
b)インキュベートする工程、および
c)レジオネラ属バクテリアの検出する工程を含む。
この培地が使われる場合、レジオネラは着色又は蛍光性のコロニーを得ることを可能にする酸化還元酵素活性によって検出されることが好ましい。他のバクテリアは抑制されるか、無色であるか、レジオネラのものとは色または蛍光が異なるか、または色または蛍光が同一である。
レジオネラ属のさまざまな菌株は、5つの異なる培地上で試験された。次に、皿は、72時間および96時間のインキュベーション後に読みとられる。
1. 培地と微生物
以下の組成を有する培地を使用した(組成、g/l):
イースト抽出物:10g/l
α‐ケトグルタール酸:1g/l
ACES/KOH:4/1.65g/l
グリシン:3g/l
塩酸システイン:0.4g/l
ピロリン酸第二鉄:0.25g/l
グルタチオン:5g/l
寒天:17g/l。
5g/lの非極性シリカ(オクタデシルシリカ、培地1)、5g/lの極性シリカ(シリカゲル、培地2)、5g/lの高極性シリカ(3−アミノプロピルシリカ、培地3)または5g/lの非極性シリカ(オクチルシリカ、培地4)をこの培地に加えた。
BCYE培地(Feeley et al, J Clin Microbiol. 1979 10:437-41) は、増殖制御として働いた培地であった。
2. テスト
培地をペトリ皿に分配した。さまざまなレジオネラ属の菌株は、3つのクワドラント・ストリーキングによって接種した。皿は、CO2の存在下で、37℃で96時間インキュベートした。読取りは、72時間および96時間のインキュベーション後に、実施された。
3. 結果
結果を下記の表に記録する:
M(かたまり)カラムの記号「1」、「2」または「3」は、1つ、2つ又は3つのクワドラントにおける試験された菌株の増殖を示す;「0」は、増殖が無かったことを示す。
コロニー(C)のサイズは、ミリメータで示す。
4. 解釈
非極性の性質のシリカを含有するシリカは、試験された全ての菌株の増殖を可能にし、その増殖はBCYE培地より大きかった。
レジオネラ属のさまざまな菌株は、8つの異なる培地で試験された。次に、皿は、72時間および96時間のインキュベーション後に読み取られた。
1. 培地と微生物
以下の組成を有する培地が使用された(組成、g/l):
イースト抽出物:10g/l
α‐ケトグルタール酸:1g/l
ACES/KOH:4/1.65g/l
グリシン:3g/l
塩酸システイン:0.4g/l
ピロリン酸第二鉄:0.25g/l
グルタチオン:5g/l
寒天:17g/l。
1g/lの非極性シリカ(オクタデシルシリカ、培地T)、又はそれぞれ、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5または10g/lのセピオライト(培地1、2、3、4、5、6および7)をこの培地に加えた。
2. テスト
培地をペトリ皿に分配した。さまざまなレジオネラ属の菌株は、3つのクワドラント・ストリーキングによって接種された。皿は、CO2の存在下で、37℃で96時間インキュベートされた。読取りは、72時間および96時間のインキュベーション後に、実施された。
3. 結果
結果を下記の表に記録する:
M(かたまり)カラムの記号「1」、「2」または「3」は、1つ、2つ又は3つのクワドラントにおける試験された菌株の増殖を示す;「0」は、増殖が無かったことを示す。コロニー(C)のサイズは、ミリメータで示す。
4.解釈
5〜10g/lの濃度でセピオライトを含有する培地は、レジオネラ・ニューモフィラの増殖を可能にし、その増殖が対照培地と実質的に同一だった。
レジオネラ属のさまざまな菌株は、3つの異なる培地上で試験された。次に、皿は、72時間および96時間のインキュベーション後に読み取られた。
1. 培地と微生物
以下の組成を有する培地が使用された(組成、g/l)。
イースト抽出物:10g/l
α‐ケトグルタール酸:1g/l
ACES/KOH:4/1.65g/l
グリシン:3g/l
塩酸システイン:0.4g/l
ピロリン酸第二鉄:0.25g/l
グルタチオン:5g/l
オクタデシルシリカ:1g/l。
17g/lの寒天(培地T)、17g/lのゲルライト(培地T1)および5g/lのセピオライトと17g/lの寒天(培地T2)をこの培地に加えた。
2. テスト
培地をペトリ皿に分配した。さまざまなレジオネラ属の菌株は、3つのクワドラント・ストリーキングによって接種した。皿は、CO2の存在下で、37℃で96時間インキュベートした。読取りは、72時間および96時間のインキュベーション後に、実施された。
3. 結果
結果を下記の表に記録する:
M(かたまり)カラムの記号「1」、「2」または「3」は、1つ、2つ又は3つのクワドラントにおける試験された菌株の増殖を示す;「0」は、増殖が無かったことを示す。コロニー(C)のサイズは、ミリメータで示す。
4. 解釈
ここで試験した全ての培地は、大きな単離コロニー・サイズを有する全てのレジオネラの増殖を可能にした。
レジオネラ属のさまざまな菌株は、ニトロレダクターゼ、すなわち、2-(5’-フルオロ-2’-ニトロフェニル)ベンゾチアゾールのための蛍光性基質を含んで成る、本発明の培地上で試験された。次に、皿は、72時間、96時間および120時間のインキュベーション後に読み取られた。
1. 培地と微生物
以下の組成を有する培地を使用した(組成、g/l):
イースト抽出物:10g/l
α‐ケトグルタール酸:1g/l
ACES/KOH:4/1.65g/l
グリシン:3g/l
塩酸システイン:0.4g/l
ピロリン酸第二鉄:0.25g/l
グルタチオン:5g/l
寒天:17g/l
オクタデシルシリカ:1g/l。
蛍光性基質2-(5’-フルオロ-2’-ニトロフェニル)ベンゾチアゾールの保存溶液は、DMSOタイプの溶媒で50g/lに調製した。基質の最終濃度5mg/lに対応する量を、前記の溶解した培地に加えた。
2. テスト
培地は、直径55mmのペトリ皿に注入され、次にレジオネラ属の菌株は、0.5マクファーランドの懸濁液から3つのクワドランドストリーキングによって接種をされた。皿は、37℃で5日間インキュベートされた。
3. 結果
形成されるコロニーは、72、96および120時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。蛍光(366ナノメートルのUVランプ下で読みとられる)、更には強度を書き留めた。
結果は、下記の表に記録される:
0は、単離コロニーの欠如か、又は蛍光の欠如を示す。蛍光強度は、0(蛍光なし)から4(非常に強い蛍光)の範囲のスケールで読みとられる。
4. 解釈
蛍光性基質を含む本発明による培地は、試験される全ての菌株の増殖およびレジオネラの簡単な検出を可能にした。
レジオネラ属のさまざまな菌株は、α−グルコシダーゼ、すなわちアリザリン−α−グルコシド用の発色性基質を含んで成る本発明の培地上試験された。次に、皿は、72時間および96時間のインキュベーション後に読み取られた。
1. 培地と微生物
以下の組成を有する培地が使用された(組成、g/l):
イースト抽出物:10g/l
α‐ケトグルタール酸:1g/l
ACES/KOH:4/1.65g/l
グリシン:3g/l
塩酸システイン:0.4g/l
ピロリン酸第二鉄:0.25g/l
グルタチオン:5g/l
寒天:17g/l
オクタデシルシリカ:1g/l。
発色性基質(アリザリン-α-グルコシド)の保存溶液は、DMSOタイプの溶媒で40g/lに調製された。基質の最終濃度50mg/lに対応する量を、前記の溶解した培地に加えた。同様に、クエン酸鉄の保存溶液は、浸透水で調製され、次に溶液はろ過され、100mg/lで培地に加えた。
2. テスト
培地は直径55mmのペトリ皿に注入され、次にレジオネラ属の菌株は0.5マクファーランドの懸濁液から3つのクワドランド・ストリーキングで接種をされた。皿は、37℃で4日間インキュベートされた。
3. 結果
形成されたコロニーは、72と96時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。着色、更には強度が、書きとめられた。結果は、下記の表に記録される:
0は、増殖の欠如か、又は単離コロニーの欠如か、又は着色の欠如を示す。着色強度は、0(着色なし)から4(非常に強い強度)の範囲のスケールで読みとられた。
色はピンク色(Pと示す)から、Pvi(ピンク/紫色)を経て、紫色(Vi)まで変化する。
4. 解釈
発色性基質を含む本発明の培地は、試験した8/10菌株の増殖を可能にし、かたまりとコロニーのピンクから紫色の着色の出現により、レジオネラの簡単な検出を可能にした。
Claims (12)
- 少なくとも一つのケイ質化合物を含有する、レジオネラ属バクテリアを培養、検出および/または同定するための反応培地であって、前記ケイ質化合物が非極性シリカであることを特徴とする反応培地。
- 非極性シリカの濃度が0.01〜100g/l、好ましくは1〜5g/lであることを特徴とする、請求項1に記載の反応培地。
- 蛍光性又は発色性酵素基質を更に含む、請求項1又は2に記載の反応培地。
- 前記蛍光性又は発色性酵素基質は、酸化還元酵素基質または加水分解酵素基質である、請求項3に記載の反応培地。
- レジオネラ属バクテリアの選択培養を可能にする選択混合物を更に含む、請求項1から4の何れか一項に記載の反応培地。
- レジオネラ属バクテリアを培養、検出および/または同定するための、少なくとも一つのケイ質化合物を含む反応培地の使用。
- 前記ケイ質化合物が非極性シリカおよび/または粘土である、請求項6に記載の反応培地の使用。
- ケイ質化合物の濃度が0.01〜100g/l、好ましくは1〜5g/lである、請求項6または7に記載の反応培地の使用。
- 蛍光性又は発色性酵素基質を含む、請求項6から8の何れか一項に記載の反応培地の使用。
- 前記蛍光性又は発色性酵素基質が酸化還元酵素基質または加水分解酵素基質である、請求項8に記載の反応培地の使用。
- レジオネラ属バクテリアの選択培養を可能にする選択混合物を含む、請求項6から10の何れか一項に記載の反応培地の使用。
- レジオネラ属バクテリアを検出および/または同定する方法であって、
(a)請求項1から5の何れか一項に記載の反応培地に、レジオネラ属バクテリアを含む可能性がある試料を接触させる工程、
(b)インキュベートする工程、および
(c)レジオネラ属バクテリアの存在を検出する工程を含む方法。
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