CN102186986B

CN102186986B - 用于检测和/或鉴定军团菌属细菌的反应培养基

Info

Publication number: CN102186986B
Application number: CN200980140979.XA
Authority: CN
Inventors: M·塞利耶; S·奥伦加; D·罗比雄; V·索沃内
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2009-10-14
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2029-10-14
Also published as: CN102186986A; JP2012505648A; WO2010043818A1; US20110171667A1; FR2937338A1; ES2536555T3; EP2352839A1; EP2352839B1; JP5769174B2; FR2937338B1; US8709746B2; PL2352839T3

Abstract

本发明涉及用于培养和/或检测和/或鉴定军团菌属细菌的反应培养基，其包括至少一种硅化合物，其特征在于所述硅化合物是非极性二氧化硅。本发明还涉及包括至少一种硅化合物的反应培养基用于培养、检测和/或鉴定军团菌属细菌的用途。

Description

用于检测和/或鉴定军团菌属细菌的反应培养基

本发明涉及用于军团菌的反应培养基，还涉及此培养基的用途以及使用这种培养基的方法。

军团菌(Legionella sp)是水生环境(自然生态系统和水分配网)的细菌，能够在人类中引起感染，有时是致死的感染。在人类中已经证实了军团菌属的数个种，但最重要的是嗜肺军团菌(L.pneumophila)，其是大约90％军团菌病病例的成因。其他种，诸如约旦军团菌(L.jordanis)，通常从免疫抑制个体中分离。军团菌病(或军团病(legionnaire′s disease))是呼吸疾病，其特征为严重急性肺病，其感染是通过吸入受军团菌污染的气悬体而获得，例如冷却塔、空调系统，保健水疗(health spas)、淋浴等。在2到10天的潜伏期后，患者表现出流感样综合征。这之后是高烧、胸膜炎(pleuresy)和严重的咳嗽，伴有胃肠问题(腹泻、呕吐)或甚至有时是神经学上的问题(谵妄、嗜睡、精神错乱)。在2005年，法国报道了超过1500个病例，而欧洲报道了大约5700个病例；在美国，CDC(Centers for Disease Control and Prevention)估计每年有8000到18,000个军团菌病的病例。

军团菌病的诊断非常复杂，因为该疾病是非典型的：标准的肺病，其没有任何特别。平均起来病例的死亡率是20％，在社区病例中较低，但另一方面，在医院病例中很高。早期诊断是非常重要的，以便为患者提供合适的治疗。

可以根据下列方法进行诊断：

-通过直接免疫荧光法的鉴定。用抗主要嗜肺军团菌血清组(serogroup)的抗体在样品上进行，此方法能够证实可溶性抗原。主要使用的方法是ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫学测定)或ICM(膜上的免疫色谱法)。这些技术的主要缺点是它们只能检测某些嗜肺军团菌血清组的可能存在；

-通过间接免疫荧光法对于抗LPS O抗原的抗体的血清学诊断。此方法只能鉴定嗜肺军团菌血清组1，并且有很多假阳性的风险，这是由于和分枝杆菌(mycobacteria)、钩端螺旋体(leptospira)、衣原体 (Chlamydia)、支原体(Mycoplasma)、假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)等的交叉反应；

-通过培养法的细菌学鉴定。培养军团菌是很难的。这是因为它们不在血液琼脂上生长，必须严格控制pH(6.9+/-0.2)，并且必需满足细菌的要求。因此，培养通常在添加了ACES缓冲液、L-半胱氨酸和铁(后两种成分是必需生长因子)的BCYE(Buffered Charcoal Yeast Extract)琼脂，或者GVPC琼脂上生长。可在37℃温育48小时后观察到菌落。军团菌的鉴定可以在GVPC军团菌培养基(bioMérieux)上进行，其是促进大部分军团菌种(尤其是嗜肺军团菌)的分离的特异性和选择性培养基。依靠经优化的3种抗生素的混合物，此培养基能够抑制革兰氏阳性菌、大部分革兰氏阴性菌、酵母和霉菌的生长。

但是，现有的培养基含有活性碳，以便吸附军团菌产生的有毒化合物、或培养基中存在的有毒化合物(酵母提取物，琼脂，等等)、或通过培养基的高压灭菌(其造成自由基的形成，这对军团菌也是有毒的)产生的有毒化合物。这些培养基因此是黑色的，这使它们不适合掺入生色或荧光酶底物，而这类底物能够促进培养基的解读。

本发明目的是通过提供新的用于军团菌属细菌的反应培养基以解决现有技术中的问题。

出人意料的，本发明人证明硅质化合物在反应培养基中的使用允许快速和方便的检测军团菌。

在介绍本发明之前，给出下列定义以便更好的理解本发明。它们决不是为了进行限制。

术语反应培养基旨在表示包含代谢的表达和/或微生物(诸如军团菌)的生长必需的所有成分的培养基。

反应培养基可以是固体、半固体或液体。术语“固体培养基”旨在表示，例如胶凝的(gelled)培养基。琼脂是微生物学中用于培养微生物的常规胶凝剂，但有可能使用结冷胶(gelrite)、明胶、琼脂糖或其他天然或人工的胶凝剂。本发明的反应培养基必须允许军团菌的生长。

反应培养基可以包括组合在一起的一种或多种成分，诸如氨基酸、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素等。

培养基还可以包含着色剂。为了说明着色剂，可以提及的包括伊文思蓝、中性红、遮光剂如二氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿、一种或多种代谢指示剂、一种或更多种代谢调节剂，等等。

反应培养基可以是培养培养基、显示培养基(revealing medium)或培养和显示培养基。就显示培养基来说，在接种前培养微生物，就培养和显示培养基来说，显示培养基也构成培养培养基。

本领域技术人员还可以使用双板(biplate)，使得可以方便地比较两种培养基(包括各种底物或各种选择性混合物)，其上将已存有相同的生物样品。

术语选择性混合物旨在表示允许选择性培养特定微生物的化合物的混合物。在本发明的背景下，选择性混合物可允许军团菌的选择性培养。这类培养基特别包括下列化合物：甘氨酸、硫酸多粘菌素B、万古霉素或头孢羟唑，放线菌酮或茴香霉素或游霉素，单独或组合的。

选择性培养基还允许一些军团菌种(例如嗜肺军团菌)的选择性培养。在这种情况下，选择性混合物特别包括下列化合物：甘氨酸，硫酸多粘菌素B，万古霉素或头孢孟多、放线菌酮、茴香霉素、纳他霉素，溴甲酚紫、溴百里酚蓝，单独或组合的。

术语硅质化合物旨在表示任何包含元素硅的化合物。按照非限制性的方式，可以提及的有天然或合成的沸石、粘土、优选伊利石、蒙脱石及优选海泡石，或其它非极性二氧化硅。

术语非极性二氧化硅旨在表示一种或多种二氧化硅颗粒，其上接枝有非极性的化学功能团，最常见的是具有至少2个碳原子的烷基链。优选它们具有4到24个碳原子，更优选18个碳原子(十八烷基)、8个碳原子(辛基)或4个碳原子(丁基)。

优选此非极性二氧化硅是十八烷基二氧化硅或辛基二氧化硅。

术语酶底物旨在表示可以被酶代谢的分子以产生允许直接或者间接检测微生物的产物。它可以是天然或合成的底物。底物的代谢将引起反应培养基或生物体细胞的物理化学特性的变化。此变化可通过物理化学法检测，尤其是光学法，通过操作员的眼睛或借助于仪器、光谱测定法、电法、磁法等。优选其是光学性质中的变化，诸如吸收、荧光或发光的改变。

术语荧光或生色酶底物旨在表示一种分子，其代谢产生具有不同于该底物的荧光或颜色的产物。

在本发明的背景下，酶底物优选选自氧化还原酶底物和水解酶底物。

优选此底物是硝基还原酶、氧化还原酶、乙酰乙酰基辅酶A还原酶、脱氢酶、超氧化物歧化酶、osidase、肽酶、核酸酶或酯酶底物。

对于生色底物特别可提及的是那些基于茜素的，α-葡糖苷酶底物，以及最特别是茜素-α-糖苷。

对于荧光底物，可以提及的是那些基于香豆素的，那些在专利EP0641351(″Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent precipitates″，Haugland et al.)或专利申请FR 07/55371中描述的，还原酶底物，以及特别是硝基还原酶底物，和更优选的在专利申请FR 07/55373或专利EP 1 124 986中描述的那些。对于氧化还原酶酶活性的底物，更特别可提及的是还原酶底物和优选的硝基还原酶底物。

在已经含有茜素-α-糖苷的培养基中引入第二种酶底物(尤其是第二种α-葡糖苷酶底物)能够提高军团菌与培养基中生长的其他属的区分。

术语生物样品旨在表示临床样品，其源自支气管、气管或肺部吸出(aspiration)的样本，胸膜液的样本，支气管肺泡灌洗的样本，痰样本，血液样本或肺活组织检查样本，以及更少见的关节或心包液的样本；或食品样品。因此此样品可以是液体或固体的，按照非限制性的方式，可提及的有，临床血液、血浆、尿液或粪便样品，鼻、喉咙、皮肤、伤口或脑脊液样本，或来自水(饮用水)的食品样品。

术语环境样品旨在表示水样本，按照非限制性的方式，可提及的有：供水网络、空调系统、冷却塔、喷雾器、弥雾机(mister)。

在这方面，本发明首先涉及用于培养和/或检测和/或鉴定军团菌属细菌的反应培养基，包括至少一种非极性二氧化硅。优选所述非极性二氧化硅是十八烷基二氧化硅。优选所述非极性二氧化硅与粘土(优选海泡石)组合。优选十八烷基二氧化硅与海泡石组合。

根据本发明一个优选的实施方案，所述反应培养基还包括酶底物。

优选所述酶底物是荧光或生色(优选生色)酶底物。

优选所述荧光或生色酶底物是氧化还原酶底物或水解酶底物。

根据本发明一个优选的实施方案，非极性二氧化硅的浓度为0.01-100g/l，优选1-5g/l。在本发明的培养基包括非极性二氧化硅组合粘土的情况下，粘土的浓度也是0.01-100g/l，优选1-5g/l。

根据本发明一个优选的实施方案，反应培养基还包括选择性混合物，其允许军团菌属细菌的选择性培养。

优选此选择性混合物包括甘氨酸、硫酸多粘菌素B、万古霉素、放线菌酮、茴香霉素、溴甲酚紫或溴百里酚蓝，单独或组合的。

这类培养基的使用允许军团菌属细菌的选择性检测。

本发明的培养基还可以包括允许特定军团菌种(诸如嗜肺军团菌)的选择性培养的选择性混合物。这种选择性混合物优选包括甘氨酸、硫酸多粘菌素B、万古霉素、喹诺酮或氟喹诺酮、放线菌酮、茴香霉素、溴甲酚紫或溴百里酚蓝，单独或组合的。选择性的差异还可以通过改变甘氨酸的浓度(从2.5g/l到7.5g/l)而获得(Glycine-containing selective medium for isolation of Legionellaceae from environmental specimens，Robert M.Wadowski and Robert B.Yee)。

本发明还涉及包括至少一种硅质化合物的反应培养基用于培养、检测和/或鉴定军团菌属细菌的用途。优选所述硅质化合物是非极性二氧化硅和/或粘土。优选所述非极性二氧化硅是十八烷基二氧化硅。优选所述粘土是海泡石。

根据本发明一个优选的实施方案，所使用的反应培养基中的硅质化合物的浓度为0.01-100g/l，优选1-5g/l。在所使用的反应培养基包括硅质化合物组合的情况下，每种化合物的浓度为0.01-100g/l，优选1-5g/l。

最后，本发明涉及用于检测和/或鉴定军团菌属细菌的方法，其特征在于其包括下列步骤：

a)将可能包含军团菌属细菌的样品与如上所述的反应培养基接触；

b)温育，和

c)检测军团菌属细菌的存在。

温育优选在30℃-50℃之间的温度进行，且更优选在36℃-42℃之间。军团菌优选借助于α-葡糖苷酶或氧化还原酶活性(其使得可以获得有颜色的或荧光的菌落)的方法进行检测。其他属的菌落(如果它们不被抑制)是无色的或与军团菌的颜色是不同的或者与军团菌的颜色或荧光是相同的。

温育时间允许军团菌属细菌生长以便允许它们的检测。不是限制性的，48-72h的温育是合适的，但更短的温育也是可能的。

当使用此培养基时，优选借助于氧化还原酶活性(其使得可以获得有颜色的或荧光的菌落)来检测军团菌。其他细菌被抑制，或是无色的，或与军团菌的颜色或荧光是不同的，或与军团菌的颜色或荧光是相同的。

给出下面的实施例是为了解释，没有限制的性质。它们使得可以更清楚的理解本发明。

实施例1

在5种不同的培养基上测试军团菌属的各种菌株。在温育72h和96h后判读各个皿。

1.培养基和微生物

使用具有下列组成的培养基(以g/l组成)：

-酵母提取物：10g/l

-α-酮戊二酸：1g/l

-ACES/KOH：4/1.65g/l

-甘氨酸：3g/l

-盐酸半胱氨酸：0.4g/l

-焦磷酸铁：0.25g/l

-谷胱甘肽：5g/l

-琼脂：17g/l。

向这种培养基中添加5g/l的非极性二氧化硅(十八烷基二氧化硅，培养基1)、5g/l的极性二氧化硅(硅胶，培养基2)、5g/l高极性二氧化硅(3-氨丙基二氧化硅，培养基3)或5g/l的非极性二氧化硅(辛基二氧化硅，培养基4)。

BCYE培养基(Feeley et al，J Clin Microbiol.1979 10：437-41)是作为生长对照的培养基。

2.测试

将所述培养基分配到培养皿中。通过三象限划线(three quadrant streaking)接种军团菌各菌株。将皿在有CO₂存在的条件下在37℃温育96h。

在温育72和96h后进行判读。

3.结果

结果记录在下表中：

M：团块(mass)；C：菌落

M(团块)栏的标记″1″、″2″或″3″表示在1、2或3象限测试的菌株的生长；″0″表示无生长。菌落(C)的大小以毫米给出。

4.解释

包含非极性性质的二氧化硅的培养基允许所有被测菌株生长，所述生长大于BCYE培养基。

实施例2

在8种不同的培养基上测试军团菌属的各种菌株。在温育72h和96h后判读各个平皿。

4.1.培养基和微生物

使用具有下列组成的培养基(以g/l组成)：

-酵母提取物：10g/l

-α-酮戊二酸：1g/l

-ACES/KOH：4/1.65g/l

-甘氨酸：3g/l

-盐酸半胱氨酸：0.4g/l

-焦磷酸铁：0.25g/l

-谷胱甘肽：5g/l

-琼脂：17g/l。

向这种培养基中添加1g/l的非极性二氧化硅(十八烷基二氧化硅，培养基T)，或分别添加0.1、0.5、1、2.5、5、7.5或10g/l海泡石(培养基1、2、3、4、5、6和7)。

2.测试

将所述培养基分配到培养皿中。通过三象限划线接种军团菌各菌株。平皿在有CO₂存在的条件下在37℃温育96h。

在温育72和96h后进行判读。

3.结果

结果记录在下表中：

生长：M：团块；C：菌落

M(团块)栏的标记″1″、″2″或″3″表示在1、2或3象限测试的菌株的生长；″0″指示无生长。菌落(C)的大小以毫米给出。

4.解释

以浓度5-10g/l包含海泡石的培养基允许所有嗜肺军团菌的生长，所述生长与对照培养基基本相同。

实施例3

在3种不同的培养基上测试军团菌属的各种菌株。然后在温育72和96h后判读平皿。

1.培养基和微生物

使用具有下列组成的培养基(以g/l组成)：

-酵母提取物：10g/l

-α-酮戊二酸：1g/l

-ACES/KOH：4/1.65g/l

-甘氨酸：3g/l

-盐酸半胱氨酸：0.4g/l

-焦磷酸铁：0.25g/l

-谷胱甘肽：5g/l

-十八烷基二氧化硅：1g/l。

向这种培养基中添加17g/l的琼脂(培养基T)、17g/l的结冷胶(培养基T1)和5g/l的海泡石及17g/l的琼脂(培养基T2)。

2.测试

将培养基分配到培养皿中。通过三象限划线接种军团菌各菌株。平皿在有CO₂存在的条件下在37℃温育96h。

在温育72和96h后进行判读。

3.结果

结果记录在下表中：

M(团块)栏的标记″1″、″2″或″3″表示在1、2或3象限测试的菌株的生长。菌落(C)的大小以毫米给出。

4.解释

此处所有测试的培养基允许所有军团菌的生长，并具有大的分离的菌落尺寸。

实施例4

在本发明的包括硝基还原酶的荧光底物(即2-(5′-氟代-2′-硝基苯基)苯并噻唑)的培养基上测试军团菌属的各种菌株。然后在温育72h、96h和120h后判读平皿。

1.培养基和微生物

使用具有下列组成的培养基(以g/l组成)：

-酵母提取物：10g/l

-α-酮戊二酸：1g/l

-ACES/KOH：4/1.65g/l

-甘氨酸：3g/l

-盐酸半胱氨酸：0.4g/l

-焦磷酸铁：0.25g/l

-谷胱甘肽：5g/l

-琼脂：17g/l

-十八烷基二氧化硅：1g/l。

以50g/l在DMSO类溶剂中制备荧光底物2-(5′-氟代-2′-硝基苯基)苯并噻唑的母液。将对应于终浓度为5mg/l底物的体积添加到所述熔解培养基(molten medium)中。

2.测试

将所述培养基倒入55mm直径的培养皿，然后通过三象限划线从0.5McFarland的悬液接种军团菌菌株。平皿在37℃温育5天。

3.结果

温育72、96和120小时后目视检查形成的菌落。记录荧光(在366nm的UV灯下读取)以及强度。

结果记录在下表中：

0表示无分离的菌落或无荧光。荧光强度以0(无荧光)到4(非常强的荧光)的标度范围读取。

4.解释

本发明的包含荧光底物的培养基允许所有被测菌株的生长以及军团菌的便捷检测。

实施例5：

在本发明的包括α-葡糖苷酶的生色底物(即茜素-α-糖苷)的培养基上测试军团菌属的各种菌株。然后在温育72和96h后判读平皿。

1.培养基和微生物

使用具有下列组成的培养基(以g/l组成)：

-酵母提取物：10g/l

-α-酮戊二酸：1g/l

-ACES/KOH：4/1.65g/l

-甘氨酸：3g/l

-盐酸半胱氨酸：0.4g/l

-焦磷酸铁：0.25g/l

-谷胱甘肽：5g/l

-琼脂：17g/l

-十八烷基二氧化硅：1g/l。

以40g/l在DMSO类溶剂中制备生色底物(茜素-α-糖苷)的母液。将对应于终浓度为50mg/l底物的体积添加到所述熔解培养基中。采用同样的方式，在渗透水(osmosed water)中制备柠檬酸铁的母液，然后过滤所述溶液，继而以100mg/l添加到培养基中。

2.测试

将所述培养基倒入55mm直径的培养皿，然后通过三象限划线从0.5McFarland的悬液接种军团菌菌株。平皿在37℃温育4天。

3.结果

温育72和96小时后目视检查菌落形成。记录显色以及强度。

结果记录在下表中：

0表示无生长，或无分离的菌落，或无显色。显色强度以0(无显色)到4(非常高的强度)的标度范围读取。颜色经过Pvi(粉红色/紫罗兰)在粉红色(标记为P)到紫罗兰(Vi)之间变化。

4.解释

本发明的包括生色底物的培养基允许8/10的被测菌株生长，并能够通过团块和菌落的粉红色-到-紫罗兰显色的出现而方便的检测军团菌。

Claims

1.一种用于培养、检测和/或鉴定军团菌属细菌的反应培养基，包括至少一种硅质化合物，其特征在于所述硅质化合物是非极性二氧化硅。

2.权利要求1的反应培养基，其特征在于非极性二氧化硅的浓度为0.01-100g/l。

3.权利要求2的反应培养基，其特征在于非极性二氧化硅的浓度为1-5g/l。

4.权利要求1-3中任一项的反应培养基，还包括荧光的或生色的酶底物。

5.权利要求4的反应培养基，其中所述荧光的或生色的酶底物是氧化还原酶底物或水解酶底物。

6.权利要求1到3中任一项的反应培养基，还包括允许选择性培养军团菌属细菌的选择性混合物。

7.包括至少一种硅质化合物的反应培养基在制备用于培养、检测和/或鉴定军团菌属细菌的培养基中的用途，其中所述硅质化合物是非极性二氧化硅。

8.权利要求7的反应培养基的用途，其中硅质化合物的浓度为0.01-100g/l。

9.权利要求8的反应培养基的用途，其中硅质化合物的浓度为1-5g/l。

10.权利要求7-9中任一项的反应培养基的用途，所述反应培养基还包括荧光的或生色的酶底物。

11.权利要求8或9中的反应培养基的用途，其中所述荧光的或生色的酶底物是氧化还原酶底物或水解酶底物。

12.权利要求7-9中任一项的反应培养基的用途，所述反应培养基还包括允许选择性培养军团菌属细菌的选择性混合物。