BRPI0515397B1 - métodos para detecção e identificação específicas de streptococcus agalactiae usando atividade de esterase, e meio de reação - Google Patents
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Abstract
método para detecção de streptococcus agalactiae usando atividade de esterase. a presente invenção refere-se a um método para detecção e identificação específicas de streptococcus agalactiae usando um meio de reação compreendendo pelo menos um substrato enzimático de esterase.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO ESPECÍFICAS DE STREPTO-COCCUS AGALACTIAE USANDO ATIVIDADE DE ESTERASE, E MEIO DE REAÇÃO". A presente invenção refere-se ao campo da detecção e identificação de Streptococcus agalactiae. Mais especificamente, a invenção refe-re-se ao uso de substratos de esterase, opcionalmente em combinação com pelo menos um substrato de oc-glicosidase, substrato de fosfatase, substrato de β-celobiosidase ou substrato de N-acetilglicosaminidase, para detecção e identificação de Streptococcus agalactiae. O gênero Streptococcus contém numerosas espécies que são muito difundidas na natureza, sobre a pele e membranas mucosas de seres humanos e animais, e são responsáveis por múltiplas infecções. Elas são bactérias abundantes que são encontradas no estado livre no ambiente externo (solo, ar, água), no estado de saprófito ou no estado comensal em seres humanos e animais. Elas estão localizadas na rinofaringe para estreptococos dos grupos A, C, G e H e salivarius, o intestino para estreptococos fecais do grupo D e a cavidade vagi-nal para estreptococos do grupo B. Seu papel patogênico é extremamente variado e depende da espécie em questão e sua localização no organismo.
Estreptococos são cocos Gram +, de 0,5 a 1 μηι de diâmetro, que exibem agrupamento na forma de uma pequena cadeia e são imóveis. Eles são catalase-negativos, têm um metabolismo fermentativo e são opcionalmente anaeróbicos e são sensíveis a variações na temperatura (crescimento ótimo a 37Ό) e a variações no pH (pH ótimo d e 7).
Streptococcus agalactiae (ou estreptococos B) é reconhecido como um dos principais agentes infecciosos responsáveis pela mastite em gado. Em seres humanos, ele é essencialmente um saprófito do trato genital feminino (vagina), mas ele também é encontrado na rinofaringe e no intestino, em particular no reto. Em adultos, a colonização freqüentemente permanece assintomática, mas o Streptococcus agalactiae pode ser responsável por septicemia, pneumonia, meningite, artrite, infecções urinárias e supurações profundas. Em mulheres que estão grávidas ou após o parto, a infec- ção pode levar à endometrite e esterilidade.
Em recém-nascidos, a contaminação ocorre no útero ou, mais comumente, durante o parto, em virtude de inalação do fluido amniótico ou dentro de secreções vaginais. Uma infecção precoce aparece imediatamente após o parto das primeiras horas de vida. Infecção precoce é promovida pelo parto prematuro, ruptura das membranas e uma forte colonização da vagina da mãe. A taxa de mortalidade nesse tipo de infecção é muito alta (> 50%). Infecções tardias são geralmente refletidas por meningite {meningite infantil) e artrite.
Seleção sintomática para portador de Streptococcus agalactiae ê recomendada no final da gravidez, idealmente entre 34 e 38 semanas de amenorréia (35-37 semanas de gravidez) devido, em particular, à sua prevalência (10% na França, isto é, pelo menos 75 000 mulheres grávidas/ano) e das conseqüêncías da mesma durante partos a termo total, o que o toma um problema de saúde pública.
Meios e/ou meios seletivos os quais tomam possível direcionar o diagnóstico estão comercialmente disponíveis. Contudo, esses meios têm deficiências pelo fato de que eles não são suficientes, em si, para o diagnóstico de Streptococcus agalactiae e que é necessário realizar testes suplementares, tal como demonstração do antígeno de Lancefield ao grupo B (po-lissacarídeo com presença dominante de rhamnose) e hidrólise de hipurato (caldo de hipurato).
Os meios seletivos mais comumente usados são caldo de Todd-Hewitt, um caldo enriquecido para pesquisa de estreptococos do grupo B em mulheres grávidas. Esse caldo contém vários antibióticos que inibem a maioria dos microorganismos Gram-negativos da flora associada, tais como ácido nalixídico e gentamicina, ou ácido nalixídico, polimixina e violeta cristal.
Após a etapa de enriquecimento, o caldo de Todd-Hewitt antibió-tico-suplementado deve ser subcultivado sobre meios para pesquisa de estreptococos (veja recomendações do CDC (Center for Disease Control), MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report), 16 de Agosto de 2002, Vol. 51, No. RR-11).
Meio de Lim é uma variante do caldo de Todd-Hewitt e contém 1 % de extrato de lêvedo, ácido nalixídico e colistina.
Um ágar Columbia contendo 5% de sangue é também usado e toma possível, em particular, demonstrar a característica β-hemolítica do Streptococcus agalactiae. Contudo, essa característica nem sempre é evidente: o halo hemolítico em torno das colônias pode ser estreito proporcionando, ao invés disso, uma aparência a>hemolítica ou mesmo γ-hemolítica. Por outro lado, essa característica se torna clara se, na área das colônias de Streptococcus agalactiae, existem colônias de Staphylococcus aureus {Camp-fator).
As deficiências desses meios seletivos são que eles devem ser suplementados com testes bioquímicos e/ou imunoensaios.
Atualmente, o único meio seletivo pronto-para-uso comercialmente disponível que torna possível isolar e identificar diretamente Streptococcus agalactiae a partir de amostras reto-vaginais é o meio Granada (Bi-olys SA). Esse meio tem a característica de promover a produção de um pigmento carotenóide por cepas de Streptococcus agalactiae em virtude da presença, no meio, de amido solúvel, peptona de proteose N°. 3, glicose, piruvato de sódio, sulfato de magnésio, metotrexato, colistina, violeta cristal, ágar, soro de cavalo, Na2HPC>4 anídrico, metronidazol, sal de hemi-sódio de MOPS (ácido morfolinopropano-sulfônico) e água destilada, e incubação sob condições anaeróbicas. Esse meio, portanto, tem a deficiência de que a detecção direta de Streptococcus agalactiae é realizada sob condições anaeróbicas, as quais não são fáceis de implementar. Além disso, nenhum meio de detecção contendo um ou mais substratos enzimáticos está disponível. O requerente demonstrou, agora, contra todas as expectativas, que é possível usar substratos enzimáticos, em particular substratos enzimáticos de esterase, para detecção e identificação específicas de Streptococcus agalactiae.
Especificamente, de modo surpreendente, a requerente demonstrou que apenas Streptococcus agalactiae, dentre as espécies bacterianas mais próximas mais comumente encontradas de uma maneira associada, 3 incapazes de usar substratos enzimáticos de esterase precoceme n menos de 18 h após inoculação), de modo que eles são os únicos < j são revelados precocemente por substratos de esterase, por exem| n nenhuma modificação das colônias que vão sendo obtidas no meio \ semente, por exemplo, sem nenhuma modificação da coloração das ci s que vão sendo obtidas no meio, quando um substrato de esterase t gênico é usado, sem haver qualquer difusão da coloração no meio ição e, portanto, com a coloração estando concentrada nas colônias, s 3 essas moléculas tenham, contudo, um efeito prejudicial sobre o cre nto das bactérias.
Conseqüentemente, esse substrato enzimático tem a vantag cional de que os resultados podem ser lidos precocemente, em partici proximadamente 18-20 h de incubação, com um contraste muito bom.
Assim, um objetivo da presente invenção é um método para ção e identificação específicas de Streptococcus agalactiae caracteriz; o fato de um meio de reação compreendendo pelo menos um substr dmãtico de esterase ser usado.
Os substratos enzimáticos de esterase que são adequados p ϊ da invenção são qualquer substrato conhecido por aqueles versados nica que torna possível demonstrar tal atividade enzimática. Tais subs podem, por exemplo, ser cromogênicos ou fluorescentes e são descril ■ exemplo, no catálogo da BiOSYNTH., Substrates and Reagents Fw.biosvnth.com ou no catálogo da GLYCOSYNTH, catálogo de subs enzimáticos ou www.olvcosvnth.co.uk. À guisa de exemplo de substratos de esterase, menção pode a a derivados de indoxiloctanoato, indoxílnonanoato ou indoxildecanoi preferência derivados de indoxiloctanoato, mais preferivelmente seus ados halogenados, mais preferivelmente os derivados cl ora d os ou bror s, tais como 5-bromo-6-cloro-3-indoxiloctanoato e 5-bromo-4-clorc oxiioctanoato para os quais a leitura é particularmente precoce.
Uma vez que uma leve atividade de esterase é observada ap f h de incubação (atividade menor do que 0,6 em uma escala de 0 a 4) detecção de Streptococcus agalactiae pode ser aperfeiçoada através da adição de pelo menos um outro substrato enzimático. Em virtude da propriedade específica do Streptococcus agalactiae de não usar o substrato de este-rase ou de usa-lo muito pouco, não importa se o outro substrato enzimático é ou não usado pelo Streptococcus agalactiae e outras espécies. Além disso, uma vez que o uso do substrato de esterase por Streptococcus agaladi-ae é apenas muito leve, de modo que isso modifica apenas ligeiramente a aparência das colônias obtidas, será indicado, no texto subsequente, apenas que Streptococcus agalactiae são incapazes de usar o substrato de esterase.
Assim, de acordo com uma modalidade, o método da invenção usa um meio de reação também compreendendo outro substrato enzimático que não um substrato de esterase.
Os outros substratos enzimáticos que não um substrato de esterase (substrato de não-esterase) adequados para fins da invenção são qualquer substrato do qual o uso por um gênero confere, sobre a colônia, uma aparência diferente da aparência obtida quando o substrato de esterase é usado. Tal aparência diferente é, por exemplo, uma coloração diferente. A-lém disso, esse substrato de não-esterase é tal que, quando um gênero usa esse substrato de não-esterase e o substrato de esterase (outra cepa que não Streptococcus agalactiae), a aparência das colônias obtidas (por exemplo, sua coloração) também é diferente da aparência das colônias de Streptococcus agalactiae. Especificamente, quando um substrato de esterase e um substrato de não-esterase que podem ser usados por cepas de Streptococcus agalactiae são combinados em um meio de reação, as cepas de S-treptococcus agalactiae são, então, negativos para a esterase e positivos para o substrato de não-esterase (eles podem ser marcados -/+, a primeira parte da equação correspondendo ao substrato de esterase e a segunda parte correspondendo ao substrato de não-esterase), enquanto que os outros gêneros são capazes de usar apenas o substrato de esterase (eles são +/- ou o substrato de esterase e o substrato de não-esterase (eles são +/+). Similarmente, quando um substrato de esterase e um substrato de não- esterase que não podem ser usados pelas cepas de Streptococcus agalacti-ae são combinados em um meio de reação, os cepas de Streptococcus aga-lactiae são, então, negativos para a esterase e negativos para o substrato de não-esterase (eles são enquanto que os outras cepas são capazes de usar apenas o substrato de esterase (eles são +/-) ou o substrato de esterase e o substrato de não-esterase (eles são +/+). Em resumo, os cepas de Streptococcus agalactiae são sempre -/+ ou -/-, enquanto que as outras espécies são sempre +/- ou +/+.
Assim, por exemplo, se um substrato de esterase cromogênico o qual resulta em uma coloração azul das colônias quando a colônia sob consideração usa o substrato é combinado com outro substrato enzimático cromogênico o qual resulta em uma coloração rosa das colônias quando a colônia sob consideração usa o substrato, quatro tipos de coloração podem ser obtidos: rosa ou incolor a levemente azul ou azul ou violeta (rosa + azul). A coloração rosa e a aparência incolor a levemente azul são apenas representativas de Streptococcus agalactiae, como segue: ou a cepa é capaz de usar o substrato de não-esterase e a colônia se torna rosa (cepa -/+) ou ele é incapaz de usar o substrato de não-esterase e a colônia permanece incolor ou se toma levemente azul (cepa -/-). As colorações azul e violeta são representativas das outras espécies como segue: ou a cepa é capaz de usar apenas o substrato de esterase e ela se toma azul (cepa +/-) ou a cepa é capaz de usar o substrato de esterase e o outro substrato enzimático e ela se torna rasa e azul, isto é, violeta (cepa +/+).
Similarmente, se um substrato de esterase que absorve fluorescência, o qual resulta em resfriamento de fluorescência quando a colônia sob consideração usa o substrato, é combinado com outro substrato enzimático fluorescente o qual resulta em fluorescência nas colônias quando a colônia sob consideração usa o substrato, o último substrato que está sendo usado pelo Streptococcus agalactiae, dois tipos de colônias podem ser obtidos: ou colônias fluorescentes ou colônias fracamente a não-fluorescentes. As colônias fluorescentes são representativas apenas de Streptococcus aga-lactiae, uma vez que essa espécie é capaz de usar apenas o outro substrato enzimático que não o substrato de esterase. As colônias fracamente a não-fluorescentes são representativas das outras espécies como segue: ou a cepa é capaz apenas de usar o substrato de esterase e é não-fluorescente ou a cepa é capaz de usar o substrato de esterase e o outro substrato enzimático e é fracamente a não-fluorescente.
Exemplos de tais outros substratos que não um substrato de esterase que são adequados para fins da invenção incluem substratos de α> glicosidase, substratos de fosfatase, substratos de β-celobiosidase, substratos de N-acetilglicosaminidase e substratos de β-glicosidase.
Assim, de acordo com outra modalidade, o método da invenção usa, como meio de reação, um meio compreendendo, além de um substrato de esterase, pelo menos um substrato enzimático escolhido de substratos de oc-glicosidase, substratos de fosfatase, substratos de β-celobiosidase, substratos de N-acetilglicosaminidase e substratos de β-glicosidase.
Os meios de reação compreendendo ou consistindo em um substrato de esterase e (em) pelo menos um substrato enzimático escolhido de um substrato de oc-glicosidase, um substrato de fosfatase e um substrato de β-celobiosidase são novos e constituem outro assunto da invenção.
Os substratos enzimáticos de «-glicosidase adequados para fins da invenção são qualquer substrato conhecidos por aqueles versados na técnica que torna possível demonstrar tal atividade enzimática. Tais substratos podem, por exemplo, ser cromogênicos ou fluorescentes e são descritos, por exemplo, no catálogo da BIOSYNTH, Substrates and Reagents ou www.biosvnth.com ou no catálogo da GLYCOSYNTH, catálogo de substratos enzimáticos ou www.Qlvcosvnth.co.uk. À guisa de exemplo de um substrato de oc-glicosidase, menção pode ser feita a substratos baseados em derivado de indoxila, substratos baseados em derivado de umbeliferona e substratos baseados em derivado de naftol.
De preferência, o substrato enzimático de a>glicosidase adequado para fins da invenção é um substrato baseado em derivado de indoxila.
Exemplos de tais derivados de indoxila incluem derivados de 3-indolil-oc-D-glicopiranosídeo, de preferência derivados halogenados desses compostos. À guisa de exemplos de derivados de 3-indolil-oc-D-glicopiranosídeo halogenados, menção pode ser feita a 6-bromo-3-indolil-oc-D-glicopiranosídeo, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-a>D-glicopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-oc-D-glicopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-metil-ac-D-glicopiranosídeo e 6-cloro-3-indolil-oc-D-glicopiranosídeo, o último composto sendo particularmente preferido.
Os substratos enzimáticos de fosfatase adequados para fins da invenção são qualquer substrato conhecido por aqueles versados na técnica que torna possível demonstrar tal atividade enzimática. Tais substratos podem, por exemplo, ser cromogênicos ou fluorescentes e são descritos, por exemplo, no catálogo da BIOSYNTH, Substrates and Reagents ou www.biosvnth.com. À guisa de exemplo de um substrato de fosfatase, menção pode ser feita de substratos baseados em derivado de indolila, substratos baseados em derivado de umbeliferona e substratos baseados em nitrofenila.
De preferência, o substrato enzimático de fosfatase adequado para fins da invenção é um substrato baseado em derivado de indoxila.
Exemplos de tais derivados de indoxila incluem derivados de fosfato de 3-indolila, tais como fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila, fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolila e fosfato de 6-cloro-3-indolila, o último composto sendo particularmente preferido.
Os substratos enzimáticos de β-celobiosidase adequados para fins da invenção são qualquer substrato conhecido por aqueles versados na técnica que toma possível demonstrar uma atividade enzimática. Tais substratos podem, por exemplo, ser cromogênicos ou fluorescentes e são descritos, por exemplo, no catálogo da BIOSYNTH, Substrates and Reagents ou www.biosvnth.com ou no catálogo da GLYCOSYNTH, catálogo de substratos enzimáticos ou www.qlvcosynth.co.uk· À guisa de exemplo de substrato de β-celobiosidase, menção pode ser feita a substratos baseados em derivado de indolila, substratos ba- seados em derivado de umbeliferona e substratos baseados em nitrofenila.
De preferência, o substrato enzimático de β-celobiosidase adequado para fins da invenção é um substrato baseado em derivado de indoxi-la.
Exemplos de tais derivados de indoxila incluem derivados de 3-indolil-p-D-celobiosídeo, tais como 6-cloro-3-indolil-p-D-celobiosídeo e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-celobiosídeo, o último composto sendo particularmente preferido.
Os substratos enzimáticos de N-acetiiglicosaminidase adequados para fins da invenção são qualquer substrato conhecido por aqueles versados na técnica que torna possível demonstrar tal atividade enzimática. Tais substratos podem, por exemplo, ser cromogênicos e fluorescentes e são descritos, por exemplo, no catálogo da BIOSYNTH, Substrates and Re-agents ou www.biosvnth.com ou no catálogo da GLYCOSYNTH, catálogo de substratos enzimáticos ou www.alvcosvnth.co.uk· À guisa de exemplo de um substrato de N-acetilglicosaminidase, menção pode ser feita a substratos baseados em derivado de indoxila, substratos baseados em derivado de umbeliferona e substratos baseados em nitrofenila.
De preferência, um substrato enzimático de N-acetilglicosaminidase adequado para fins da invenção é um substrato baseado em derivado de indoxila.
Exemplos de tais derivados incluem derivados de 3-indolil-p-N-acetii-glicosaminida, tais como 5-bromo-6-cloro-3-indolil-N-acetil-p-D-glicosaminida, 6-cloro-3-indolií-N-acetil-p-D-glicosaminida e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-N-acetilglicosaminida, o último composto sendo particularmente preferido.
Os substratos enzimáticos de β-glicosidase adequados para fins da invenção são qualquer substrato conhecido por aqueles versados na técnica que torna possível demonstrar tal atividade enzimática. Tais substratos podem, por exemplo, ser cromogênicos ou fluorescentes e são descritos, por exemplo, no catálogo da BIOSYNTH, Substrates and Reagents ou www.biosynth.com ou no catálogo da GLYCOSYNTH, catálogo de substratos enzimáticos ou www.alvcosvnth.co.uk. À guisa de exemplo de um substrato de β-glicosidase, menção pode ser feita a substratos baseados em derivado de indolila, substratos baseados em derivado de umbeliferona e substratos baseados em nitrofenila.
De preferência, o substrato enzimático de β-glicosidase adequado para fins da invenção é um substrato baseado em derivado de indoxila.
Exemplos de tais derivados de indoxila incluem derivados de 3-indolil^-D-glicopiranosídeo, tais como 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicopiranosídeo, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-p-D-glicopiranosídeo, 6-cloro~3-indolil-p-D-glicopiranosídeo e5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-metil-p-D“ glicopiranosídeo.
De acordo com uma modalidade, o método da invenção usa um meio de reação compreendendo i) um substrato de esterase e ii) um substrato de fosfatase ou um substrato de oc-glicosídase, a combinação de substrato de esterase/substrato de fosfatase sendo preferida.
De acordo com outra modalidade, o meio de reação compreende, além do substrato de esterase e do substrato de fosfatase ou substrato de oc-glicosidase, um substrato enzimático escolhido de um substrato de β-celobiosidase, um substrato de N-acetilglicosaminidase e um substrato de β-glicosidase, de preferência um substrato de β-celobiosidase e um substrato de N-aceti!glicosaminidase. 0 meio de reação, conforme usado no método da invenção é, portanto, um meio de reação para detecção em virtude da presença de pelo menos um substrato enzimático.
Esse meio de reação pode ser usado como um meio de visualização apenas ou como um meio de cultura e visualização. No primeiro caso, a cultura de microorganismos é realizada antes de inoculação e, no segundo caso, o meio de reação também constitui o meio de cultura. 0 meio de reação pode ser sólido, semi-sólido ou líquido. 0 termo "meio sólido ou semi-sólido" se destina a significar, por exemplo, um meio gelificado. Ágar é o meio sólido convencional em microbiologia para cultura de microorganismos, mas é possível usar gelatina ou agarose. Um determinado número de preparações está comercialmente disponível, por exemplo, ágar Columbia, ágar de tripcase-soja, ágar de MacConkey, ágar de Sabou-raud ou, mais geralmente, aqueles descritos no Handbook of Microbiological Media (CRC Press). A quantidade de ágar no meio de reação é de 2 a 40 g/l. Para os meios sólidos, a quantidade de ágar é, de preferência, de 9 a 25 g/l, mais preferivelmente de 12 a 14 g/l. Para os meios semi-sólidos, a quantidade de ágar é, de preferência, de 2 a 6 g/l.
Os substratos enzimáticos da invenção podem ser usados em uma ampla faixa de pH, em particular entre um pH de 5,5 e 10. A concentração do(s) substrato(s) enzimático(s) no meio de reação está entre 10 e 2000 mg/l, de preferência entre 50 e 500 mg/l, mais preferivelmente entre 80 e 400 mg/l, o que constitui uma modalidade preferida da invenção.
Naturalmente, aqueles versados na técnica determinarão a concentração do(s) substrato(s) enzimático(s) no meio dentro dessa faixa, de acordo com o substrato escolhido. Assim, na medida em que o substrato de esterase usado é octanoato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila, uma concentração de entre 100 e 400 mg/l é preferida. O meio de reação que pode ser usado para fins da invenção também pode compreender outros componentes que são de uso para melhorar a especificidade e/ou a sensitividade do método da invenção.
Assim, de acordo com uma modalidade da invenção, o meio de reação compreende soluções de fosfato, tais como soluções de Na2HP04 e K2HP04.
Isso é porque 0 uso de tais soluções de fosfato torna possível melhorar substancialmente a capacidade de leitura do meio, a qual é refletida por uma resistência na sutileza da coloração ou por um aumento na expressão e/ou na detecção da atividade de fosfatase a 18 h. A concentração de tais soluções de fosfato está entre 0,3 e 1,5 g/l para cada solução, uma concentração de 0,5 g/l sendo preferida. O meio de reação também pode conter uma mistura de inibidores para inibição ou limitação do crescimento de cepas indesejadas, tais como cepas falsa-positivas, por exemplo, Candida ou Staphyíococcus sapro-phyticus, sem modificação da sensitividade de detecção do meio. A esse respeito, a mistura de reação pode conter uma mistura de antibióticos. A adição de antibióticos ao meio de reação permite, inter a//-a, que tempo seja poupado, uma vez que a identificação de Streptococcus agalactiae é realizada diretamente.
Exemplos de antibióticos que são adequados para fins da invenção incluem aztreonam e anfotericina B. Esses antibióticos estão comercialmente disponíveis da ICN, Squibb ou Sigma. A quantidade de cada antibiótico no meio de reação varia de a-cordo com o antibiótico em questão e será prontamente determinada por aqueles versados na técnica. 0 meio de reação também pode compreender um ou mais elementos em combinação, tais como aminoácidos, peptonas, carboidratos, nucleotídeos, minerais, vitaminas, tensoativos, tampões, sais de fosfato, sais de amônio, sais de sódio ou sais de metal. Exemplos de meios são descritos nos pedidos de patente da requerente EP 656 421 e WO 99/09207. A implementação do método da invenção pode ser realizada de acordo com as etapas a seguir consistindo em: a) inoculação de um meio de reação conforme definido acima, com toda ou parte da amostra, b) incubação do meio inoculado, c) revelação da presença de pelo menos uma atividade de este-rase sozinha ou em combinação com pelo menos uma outra atividade enzi-mática que não uma atividade de esterase, o qual constitui outro assunto da invenção.
As etapas de inoculação e incubação são amplamente conhecidas por aqueles versados na técnica.
Por exemplo, a temperatura de incubação pode ser 37°C. Com relação à atmosfera de incubação, ela é, de preferência aeróbica. A revelação é realizada com o olho nu através de visualização de uma alteração na coloração que não se difunde no meio de reação e, portanto, está concentrada nas colônias. No caso de revelação da fluorescência, dispositivos de leitura de fluorescência conhecidos por aqueles versados na técnica são usados.
As amostras biológicas a serem analisadas são qualquer amostra clínica passível de conter Streptococcus agalactiae, tal como um espécime vaginal, um espécime de urina ou qualquer outra amostra da qual a análise pode auxiliar um médico ao atingir um diagnóstico. A invenção será mais completamente compreendida a partir dos exemplos fornecidos à guisa de ilustração não limitativa.
Exemplo 1: Detecção de Streptococcus agalactiae usando substratos enzi-máticos de esterase 1.1 Preparação dos meios de reação Os meios de reação foram preparados através de mistura de extrato de coração-cérebro (4,84 g/l; Solabia), infusão de carne (1,96 g/l; Solabia), biotiona (1 g/l; Solabia), biotripcase (7,2 g/l; Solabia), carbonato de sódio (0,3 g/l; VWR), piruvato de sódio (2 g/l; Fluka), tampão de HEPES (0,4 g/l; Sigma), peptona de lactalbumina (2 g/l; DMV), glicose (1 g/l; Merck), ágar American (2 g/l; Sobigel) e ágar European (12 g/l; Roko).
Após sujeição à autoclave durante 15 min a 121°C, um substrato enzimático de esterase, conforme indicado abaixo, foi adicionado em uma taxa de 0,3 g/l; seguido por resfriamento em um banho de água a 50°C: octanoato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila (X-C8; Inalco), o qual proporciona uma coloração turquesa quando ele é usado e octanoato de 5-bromo-6-cloro-3-indo!ila (Magenta-C8; Inalco), o qual proporciona uma coloração rosa-vermelho quando ele é usado.
Os meios foram, então, entornados em um disco de Petri para a subseqüente inoculação de cepas bacterianas. 1.2 Inoculação das cepas de microorganismos Três cepas de Streptococcus agalactiae e três cepas de outras bactérias, todas da coleção da requerente, suspensas em solução salina fisiológica, foram inoculadas de modo a proporcionar colônias isoladas sobre cada um dos meios. Os pratos foram incubados a 37°C durante 48 horas. As colônias formadas foram examinadas visualmente após 18,24 e mais de 40 horas de incubação. A coloração dessas colônias, o crescimento e também a intensidade de sua coloração (representativa da atividade de esterase) foram anotados. 1.3 Resultados Os resultados são fornecidos na Tabela 1 aqui depois e são expressos: - em termos de crescimento (G) com o tamanho sendo indicado em mm, - em termos de cor (Co) com T = turquesa, R = rosa ou vermelho, - em termos de intensidade (I) de coloração, baseado em uma escala de arbitrariedade oscilando de 0 a 4, 0 correspondendo a uma ausência de atividade e 4 correspondendo à presença de uma coloração muito intensa, - de acordo com o tempo de incubação em horas (T).
Tabela 1 I
I
I
I i I
I
I
I
Os resultados demonstram que estreptococos B podem ser detectados precocemente usando um substrato enzimático de esterase, uma vez que eles exibem uma atividade zero a muito fraca a 18-24 h.
Exemplo 2: Detecção de Streotococcus aaalactiae usando um substrato de esterase e um substrato de oc-qlicosídase ou substrato de fosfatase O protocolo descrito acima no Exemplo 1 foi repetido, exceto que, ao mesmo tempo que 0,3 g/l do substrato de esterase X-C8,0,3 g/l de 6-cloro-3-indolil-oc-D-glicopiranosídeo (-oc-Glu Rosa) ou 0,3 g/l de fosfato de 6-cloro-3-indolila (-P Rosa), os quais proporcionam uma coloração rosa quando eles são usados, foram adicionados.
Os resultados são fornecidos na Tabela 2 abaixo, na qual o crescimento, a coloração e a intensidade são fornecidos, conforme no E-xemplo 1 e onde R = Rosa/(Rose)/Vermelho, PB = Rosa-Marrom, T = Turquesa, Gr = Verde, Vi = Violeta, B = Azul, GVi = Cinza-Violeta e GB = Cinza-Azul.
Tabela 2 I
I
I
Essa tabela demonstra que a detecção das cepas de Strepto-coccus agalactiae é aperfeiçoada quando um substrato de esterase cromo-gênico é usado em combinação com outro substrato enzimático cromogêní-co, outro que não um substrato de esterase, que pode ser usado pelas ce-pass de Streptococcus agalactiae.
Exemplo 3: Detecção de Streptococcus agalactiae usando um substrato de esterase, um substrato de fosfatase e um substrato de β-celobiosidase O protocolo descrito no Exemplo 2 foi repetido, usando 0,3 g/l de X-C8 e 0,2g/l de Rose-P, com exceção que 0,08 g/l de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-celobiosídeo (Cellobio) também são adicionados ao mesmo tempo que os outros substratos, junto com 0,5 g/l de Na2HPC>4 e 0,5 g/l de K2HPO4, antes de autoclave.
Como meio de controle, um meio apenas com X-C8 e Rose-P foi usado.
Os resultados são fornecidos na Tabela 3 abaixo, na qual 0 crescimento, a coloração e a intensidade são fornecidos, conforme no E-xemplo 1 e onde R = Rosa/(Rose)/Vermelho, Ma = Malva, Vi = Violeta, B -Azul, GB = Cinza-Azul e DP = Púrpura Profundo.
Tabela 3 i Os resultados na Tabela 3 demonstram um aperfeiçoamento na especificidade de detecção de Streptococcus agalactiae comparado com as outras cepas quando três substratos enzimáticos, incluindo um substrato de esterase, são usados.
Exemplo 4: Detecção de Streptococcus agalactiae usando um substrato de esterase. um substrato de fosfatase e um substrato de N-acetilqlicosaminidase O protocolo descrito no Exemplo 3 foi repetido, exceto que 0,4 g/l de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-N-acetiiglicosaminida (X-NAGIu) foi usado em lugar do Cellobio. O meio de controle é idêntico ao meio testado, exceto que ele não contém qualquer X-NAGIu.
Os resultados são fornecidos na Tabela 4 abaixo, na qual o crescimento, a coloração e a intensidade são fornecidos, conforme no E-xemplo 1 e onde R = Rosa/Vermelho, B = Azul, GP = Cinza-Rosa e Mg = Magenta.
Tabela 4 Os resultados nessa Tabela demonstram um aperfeiçoamento na especificidade de detecção de Streptococcus agalactiae comparado com as outras cepas quando três substratos enzimáticos, incluindo um substrato de esterase, são usados.
Exemplo 5: Detecção de Streptococcus agalactiae usando um substrato de esterase, um substrato de fosfatase e um substrato de β-qiicosidase O protocolo descrito no Exemplo 4 foi repetido, exceto que 0,08 g/1 de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicosidase (Χ-β-Glu) e 0,3 g/l de 5-bromo-4-cloro-3-indolii-N-metil-p-D-glicopiranosideo (Α-β-Gluverde) foram usados em lugar de X-NAGIu. O meio de controle é idêntico ao meio testado, exceto que ele não contém qualquer Χ-β-Glu ou GreenA-p-Glu.
Os resultados são fornecidos na Tabela 5 abaixo, na qual o crescimento, a coloração e a intensidade são fornecidos, conforme no E-xemplo 1 e onde R = Rosa/Vermelho, Ma = Malva, Vi = Violeta, B = Azul e GB = Cinza-Azul.
Tabela 5 Os resultados obtidos na Tabela 5 demonstram um aperfeiçoamento na especificidade de detecção de Streptococcus agalactiae comparado com as outras cepas quando três substratos enzimáticos, incluindo um substrato de esterase, são usados.
Exemplo 6: Aperfeiçoamento na sensitividade de detecção através da adição de solução de fosfato O protocolo descrito no Exemplo 1 foi repetido, exceto que 0,3 g/l de -P Rosa e 0,5 g/l de Na2HP04e 0,5 g/l de KhP04 foram adicionados ao mesmo tempo que 0,3 g/l do substrato de esterase X-C8. O mesmo meio, mas sem solução de fosfato, foi usado como meio de controle.
Os resultados são fornecidos na Tabela 6 abaixo, na qual o crescimento, a coloração e a intensidade são fornecidos, conforme no E-xemplo 1, onde R = Rosa e Mg = Magenta.
Tabela 6 Os resultados nessa Tabela 6 demonstram um aperfeiçoamento na sutileza de coloração a partir de 18 h ou um aumento na expressão das cepas de S. agaladiae.
Exempto 7: Comparação da sensitividade e da especificidade de detecção de S. agaladiae usando um meio contendo um substrato de este-rase de acordo com a invenção e os meios comerciaimente disponíveis Para esse estudo de sensitividade e especificidade, um meio de acordo com a invenção, preparado conforme descrito no Exemplo 1, contendo 0,3 g/l de X-C8 e também: 0,2 g/l de -P Rosa, 0,08 g/l de Cellobio, 0,5 g/l de Na2HP04, 0,5 g/l de K2HPO4, 0,012 g/l de aztreonam e 0,004 g/l de anfo-tericina B, foi usado.
Como meio para comparação, 0 meio Granada (ref. 10 077, Bl-OLYS, França) (meio Granada) foi usado. 69 cepas de microorganismos, incluindo 14 de Streptococcus agaladiae, foram inoculadas e deixadas incubar a 37°C durante até 24 h e em temperatura ambiente além desse tempo. As colônias foram visualizadas conforme descrito acima. A confirmação das colônias suspeitas de serem características de estreptococos B, isto é, aparecendo como sendo ro-sas/vermelhas, foi realizada por meio de um ensaio de aglutinação usando 0 reagente Slidex Strepto Kit de acordo com as recomendações do fornecedor (bioMérieux, França). As colônias não-características, isto é, as colônias que eram outras que não rosa ou que tinham a coloração característica mas que proporcionaram uma resposta negativa no ensaio de aglutinação (cepas fal-sa-positivas) foram identificadas por meio do Galeries ID 32 Strep (bioMé-rieux, França).
Os resultados são expressos como % de diagnóstico corrigido com relação a todos os testes em termos de sensitividade e especificidade e são fornecidos na Tabela 7 abaixo, a % de sensitividade correspondendo ao número de positivos verdadeiros detectados sobre 0 meio dividido pelo número total de positivos verdadeiros a serem detectados (*100) e a % de especificidade % correspondendo ao número de negativos verdadeiros detectados sobre 0 meio dividido pelo número total de negativos verdadeiros a serem detectados (*100).
Tabela 7 Os resultados indicados nessa tabela demonstram o aperfeiçoamento na sensitividade de detecção de estreptococos B (Streptococcus agalactiae) usando o método da invenção. Além disso, eles também demonstram que o meio de detecção da invenção também tem boa especificidade, especificidade a qual é aperfeiçoada após enriquecimento em virtude da passagem em caldo de Todd-Hewitt durante 18-24 horas a 35-37°C com ou sem C02 a 5% antes de inoculação do ágar (veja recomendações do CDC (Center for Disease Control), MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report), 16 de Agosto de 2002, Vol. 51, No. RR-11).
Exemplo 8: Uso do meio baseado em amostras clínicas Para esse estudo, o meio de acordo com a invenção, conforme preparado acima no Exemplo 7, foi usado.
Um total de 134 amostras/esffegaços originários de espécimes vaginais ou endocervicais de mulheres grávidas foram usados nesse estudo.
Cada esfregaço foi emulsificado em 1 ml de solução salina fisiológica estéril e 100 μΙ dessa solução foram depositados, primeiramente, sobre um ágar Columbía contendo 5% de sangue de cavalo e, em segundo, sobre o meio usado no método da invenção. Além disso, 100 μΙ da solução acima foram usados para inocular um caldo de Todd-Hewitt. Após incubação durante 20 horas a 37°C e sob condições aeróbicas, o sangue-ágar e o meio da invenção foram inoculados usando o caldo de Todd-Hewitt e, então, incubados a 37°C durante 20 h sob condições aeróbicas. A confirmação das colônias suspeitas de serem características de estreptococos B, isto é, que tinham a cor rosa/vermelha, foi realizada por meio de um ensaio de aglutinação usando o reagente Slidex Strepto Kit de acordo com as recomendações do fornecedor (bioMérieux, França).
Dentre as 134 amostras, 112 foram inoculadas sobre os meios de ágar, primeiro, diretamente a partir da suspensão em solução salina fisiológica e, em segundo, após enriquecimento em caldo de Todd-Hewitt. As 22 amostras restantes foram inoculadas sobre os meios de ágar apenas diretamente a partir da suspensão em solução salina fisiológica.
Os resultados, expressos como a sensitividade e especificidade médias percentuais, são apresentados na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8 Os resultados na Tabela 8 acima mostram que o meio da invenção, usado com amostras clínicas, torna possível melhorar a sensitividade e a especificidade de detecção de Streptococcus agalactiae. Especificamente, 20/20 espécimes contendo Streptococcus agalactiae são detectados sobre o meio da invenção, contra 19 sobre o meio Columbia e existe apenas um resultado falso + sobre o meio de esterase, contra 24 sobre o ágar Columbia. Pode ser observado que os resultados são melhores do que quando o meio foi testado com as cepas de laboratório.
REIVINDICAÇÕES
Claims (9)
1. Método para detecção e identificação específicas de Strepto-coccus agalactiae, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas consistindo em: a) inocular um meio de reação compreendendo pelo menos um substrato enzimático de esterase, em que o dito substrato enzimático de es-terase é um derivado de indoxiloctanoato, indoxilnonanoato ou indoxildeca-noato, b) incubar o meio inoculado, c) revelar a presença de pelo menos uma atividade de estearase através da visualização de uma mudança na coloração.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o meio de reação também compreender outro substrato enzimático usado por Streptococcus agalactiae, outro que não um substrato de esterase.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o referido outro substrato enzimático ser pelo menos um substrato enzimático escolhido de substratos de oc-glicosidase, substratos de fosfa-tase, substratos de β-celobiosidase, substratos de N-acetilglicosaminidase e substratos de β-glicosidase.
4. Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato de o referido meio de reação compreender) um substrato de esterase e ii) um substrato de fosfatase ou um substrato de x-glicosidase.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o referido meio de reação também compreender um substrato enzimático escolhido de um substrato de β-celobiosidase, um substrato de N-acetilglicosaminidase e um substrato de β-glicosidase.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de a concentração de cada substrato enzimático estar entre 10 e 2000 mg/l.
7. Método para detecção e identificação específicas de uma bactéria ou bactérias da espécie Streptococcus agalactiae em uma amostra passível de conter essa bactéria, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas consistindo em: a) inocular um meio de reação, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, com toda ou parte da amostra, b) incubar o meio inoculado, c) revelar a presença de pelo menos uma atividade de esterase sozinha ou em combinação com pelo menos outra atividade enzimática que não uma atividade de esterase.
8. Meio de reação, caracterizado pelo fato de compreender (i) um substrato de esterase, em que o dito substrato enzimático de esterase é um derivado de indoxiloctanoato, indoxilnonanoato ou indoxildecanoato, e (ii) um substrato enzimático escolhido de substratos de β-celobiosidase, substratos de N-acetil-glucosaminidase e substratos de β-glucosidase, e (iii) um substrato de fosfatase.
9. Meio de reação de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de também compreender soluções de fosfato.
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| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06H | Technical and formal requirements: requirement cancelled [chapter 6.8 patent gazette] |
Free format text: REF. A RPI NO 2158 DE 15/05/2012. ANULACAO DA EXIGENCIA 6.6 POR TER SIDO INDEVIDA. REQUERENTE NAO APRESENTOU RESPOSTA A EXIGENCIA CONFORME DISPOE A RESOLUCAO 207 DE 24/04/2009, ENTRETANTO, A RESPOSTA CONSTA NO FORMULARIO DE DEPOSITO. |
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| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
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Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO POR NAO SE ENQUADRAR NO ART. 229-C DA LPI. |
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| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/12/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
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| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 14/09/2005, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO |