CN1142773A

CN1142773A - 用于控制沙门氏菌的利生菌

Info

Publication number: CN1142773A
Application number: CN94194949A
Authority: CN
Inventors: D·J·尼斯贝特; D·E·科里埃; J·B·迪罗阿希
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government; US Department of Agriculture USDA
Priority date: 1993-12-13
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 1997-02-12
Also published as: EP0785800A1; BR9408295A; SK76596A3; JPH09506625A; PL314986A1; HU9601621D0; CZ173396A3; NZ278508A; HUT74951A; FI962429A0; WO1995016461A1; SK281141B6; FI962429A; AU693146B2; CA2178192A1; PL178535B1; KR960706355A; US5478557A; EP0785800A4; AU1402095A

Abstract

一种限定性利生菌或厌氧菌组合物可有效用于控制或抑制家禽沙门氏菌的移生。该利生菌包括29种生物学上基本纯的细菌的种群或培养物。在使用中，可给受试家禽施用有效量的利生菌以提高家禽对沙门氏菌移生的抗性。本发明还涉及一种从成年动物粪便、盲肠内容物或大肠中分离利生菌的新方法，以用于有效控制或抑制沙门氏菌在家畜中的移生，将粪便、盲肠内容物或大肠与培养基结合，并在无氧条件下进行不稀释温育(即成批培养)。紧接着这一初步温育，所得培养物在连续流动条件下温育直至达到一种稳态，在这以后的时间里，稳态培养物可以回收作为利生菌使用。

Description

用于控制沙门氏菌的利生菌

相关申请的参考

本专利申请为1992年7月29日提交的申请序号07/921,173的部分继续，前申请内容在此引入作为参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及使用限定性利生菌(probiotics)控制沙门氏菌(Salmonella)在家养动物、包括家禽特别是鸡中的移生。

尽管经过研究人员和公共卫生机构的努力，在过去20年中人类沙门氏菌病的发病率仍然升高了。每年报道感染该病的实际病例数超过四万。然而，据传染病中心估计，在美国每年人类沙门氏菌感染的真实发病率可能高达二至四百万。包括家禽在内的动物性食品仍是人类沙门氏菌感染的主要来源。现有技术说明

考虑到沙门氏菌在环境中的广泛存在，不可能完全保护家禽不与沙门氏菌接触。因此，研究人员继续研究新的方法，用于增加接触沙门氏菌的家禽对其移生的抗性。这些研究集中于对疫苗的评价、构建保护性的正常肠内菌群和鉴定可抑制沙门氏菌生长和移生的食品添加物。宿主的免疫力在抗沙门氏菌中的作用尚不清楚，而且同样不能肯定是否刺激免疫反应可有效地增加对沙门氏菌移生的抗性。实验性的疫苗并未被证实总是有效的。

许多文献报道，正常肠内微生物群系可增加对沙门氏菌移生的抗性。给雏鸡口服接种微生物菌群的厌氧菌培养物被证明可有效地降低沙门氏菌的移生，而以上厌氧微生物来自成鸡盲肠内容物和粪便，并被称为利生菌(probiotic，定义为服用后有利于动物的细菌培养物)[Snoeyenboset al.，Avian Dis.，23：904-913，(1979)，Schneitz et al.，ActaPathol.Microbiol.Scand.Sect.B.，89；109-116，(1981)，andStavric et al.，J.Food Prot.，48：778-782，(1985)]。与此相反，阻止上述盲肠厌氧菌在雏鸡体内被移生的家禽饲养实践，会使雏鸡对沙门氏菌的移生更加敏感[Pivnick et al.，J.Food Prot.，44：909-916，(1981)]。上述利生菌可能通过在雏鸡肠道内的迅速移生而减少沙门氏菌的移生(Pivnick et al.，ibid)，通过竞争肠壁的附着位点(Snoeyenbos et al.，ibid)，或通过产生具有抑菌或杀菌作用的短链挥发性的脂肪酸[Barnes et al.，J.Hyg.Camb.，82：263-283，(1979)and Am.J.Clin.Nutr.，33：2426-2433，(1980)，Corrier et al.，Avian Dis.，34：668-676，(1990) and Avian Dis.，34：617-625，(1990)，and Hinton et al.，Avian Dis.，34：626-633，(1990)]，以抑制肠病原体的生长。

然而，包含几百种不同微生物混合种群的正常微生物菌群培养物被证实可有效地抑制沙门氏菌的生长。在欧洲的一些国家，已广泛使用微生物混合培养物构建日龄雏鸡体内正常肠内菌群，用以控制沙门氏菌的繁殖。然而，由于上述培养混合物中存在的微生物数目和种类还未确定，这一系统在美国尚未得到广泛的认可。导致这一方法广泛使用受阻的一个原因是培养产物的组成不能标准化，因此培养产物不能在贮存和在大规模生产时在组成和效力上不变。同样，由于开始的材料通常是成禽的肠容物，这些物质可能含有病原性病毒、细菌或寄生虫，它们可能危害雏鸡的健康。还有，美国食物和药品局最近要求所有非限定性培养物必须通过审批。

最近已有报道，在雏鸡的饲料或饮水中加入乳糖和其它乳糖制品可以增强对沙门氏菌移生的抗性[Oyofo et al.，Avian Dis.，33：531-534，(1989)and Poultry Sci.，68：1357-1360，(1989)，Corrier et al.，ibid，and Hinton et al.，ibid.]。饮食中的乳糖可增加盲肠内容物的酸性和影响肠内正常菌群的生长和发酵产物。补充乳糖的饮食，通过增加某些正常肠内细菌产生的如乙酸、丙酸、丁酸等短链易挥发性脂肪酸的抑菌作用，而可能同样增强对沙门氏菌移生的抗性[Corrier et al.，ibid，Hinton et al.，ibid]。

当给雏鸡同时提供饮食中的乳糖和在含乳糖培养液中生长的盲肠厌氧菌培养物时，雏鸡对沙门氏菌繁殖的抗性进一步增加[Corrier et al.and Hinton et al.，ibid]。

发明概述

我们现已发现一种对控制或抑制沙门氏菌在家禽中的移生有效的限定性利生菌或细菌组合物，该利生菌包括生物学基本纯的细菌的限定性种群或培养物。它们包括下列菌株：

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，

faecium肠球菌(Enterococcus faecium)，

avium肠球菌(Enterococcus avium)，

lacfis乳酸球菌(Lactococcus lactis)，

乳酸杆菌属(Lactobacillus)，

大肠杆菌(Escherichia coli)，

弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)，

假单胞菌属(Pseudomonas)，

液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，

丙酸杆菌属(Propionibacterium)，

双歧杆菌属(或乳酸杆菌属)(Bifidobacterium(orLactobacillus)，

真细菌属(Eubacterium)，

韦永球菌属(Veillonella)，和

梭形杆菌属(Fusobacterium)

以及属于肠杆菌科的其它细菌和一类未知的称为OAGPB-5的菌株。

在使用中，给受试家禽服用有效量的利生菌，用于抑制沙门氏菌的移生。在一种优选的实施方案中，通过在利生菌中掺入乳糖可能获得增强的抑制沙门氏菌作用。上述利生菌也可能与常用的饲料结合，以提供一种可供家禽摄食的新的饲料产品。

本发明亦涉及以成年动物粪便、盲肠或大肠内容物中分离利生菌的一种新方法，以用于有效地控制或抑制沙门氏菌在包括家禽在内的家畜中的移生。将粪便、盲肠或大肠容物与营养物或培养基混合，并在无氧条件下不稀释地温育(即批培养)。经过这一初步的温育，所得的培养物须在连续流动条件下直至获得稳态，之后的稳态培养物可收获作为利生菌使用。

按照这一发现，本发明的一个目的在于提供一种用于控制沙门氏菌在家禽中的移生的改进的方法和组成物。

本发明的进一步目的在于提供可能易于标准化的厌氧菌限定性培养物，用于控制沙门氏菌在家禽的移生。

本发明的另一个目的在于提供一种改进的方法，用于分离细菌组合物作为利生菌使用，以供控制沙门氏菌在家畜特别是家禽中的移生。

本发明的其它目的和优点在后面的说明中将是显而易见的。

发明详述

服用本发明中的利生菌可有效地控制沙门氏菌在家禽中的移生，包括减少家禽群体中平均沙门氏菌浓度和(或)降低被沙门菌病原体移生的家禽百分率。本发明可能用于任何一种家禽，包括但不限于诸如鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和鹅的家禽。给家禽服用后，利生菌可为家禽提供持久的保护用于抗多种沙门氏菌特别是鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。

利生菌来自无沙门氏菌鸡的盲肠。如在实施例1中详细描述的，将鸡的盲肠回收，接种到合适的培养基中，在分批培养中在无氧条件下温育。接着该培养物以特定的培养基交换速率在连续流动的培养条件下温育直至获得稳态或平衡。当回收并给家禽服用后，此生成的稳态培养物作为利生菌在控制处理后禽类的沙门氏菌移生上显示了显著的有效性。

通过分析，从稳态培养物中回收到29种基本上纯化的细菌分离物，包括15种兼性和14种专性厌氧菌。培养物中细菌的组成确定如下：

I.兼性厌氧菌，革兰氏阴性球菌：

(1)第一粪肠球菌株，

(2)第二粪肠球菌株，

(3)第一faecium肠球菌株，

(4)第二faecium肠球菌株，

(5)第三faecium肠球菌株，

(6)avium肠球菌株，

(7)第三粪肠球菌株，

II.兼性厌氧菌，革兰氏阳性球杆菌：

(8)lactis乳酸球菌，

(9)第一乳酸杆菌株，

III.兼性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(10)第一大肠杆菌株，

(11)弗氏柠檬酸菌，

(12)一种属于肠杆菌科的细菌，

(13)一种假单胞菌属的菌种，

(14)液化沙雷氏菌，

(15)第二大肠杆菌株，

IV.专性厌氧菌，革兰氏阳性杆菌：

(16)第一丙酸杆菌种，

(17)第二丙酸杆菌种，

(18)第二乳酸杆菌株，

(19)第一双歧杆菌株或第三乳酸杆菌株，

(20)第三丙酸杆菌株，

(21)第一真细菌株，

(22)第二真细菌株，

(23)一种未知的称为OAGPB-5的细菌株，

(24)第三真细菌株，

(25)第二双歧杆菌株或第四乳酸杆菌株，

(26)第三双歧杆菌株或第五乳酸杆菌株，

(27)第四丙酸杆菌株，

V.专性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(28)一种韦永球菌属菌种，

VI.专性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(29)一种梭形杆菌属菌种。

包括上述所有29种细菌的利生菌组合物，已在布达佩斯条约下存入美国典型培养物保藏中心(ATCC，American Type CltureColleetion)(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，USA)，作为排除竞争培养物，CF3，指定的保存编号为ATCC 55515。单独菌株的特性将在实施例1和例2中进行特征描述。

所得的稳态培养物可直接作为利生菌使用，或贮存待用。对于后者，可按需要以混合物贮存，或者可能分离出单独菌株、贮存，然后再重新组合。

按照优选实施方案，利生菌由实施例1和例2中的稳态培养物产出的细菌组成。而在可选性的实施方案中，许多细菌可能从已知的或标准的菌株中获得，或者从家禽回收的分离物中获得。例如，但不仅限于，一种或更多的菌株，包括肠球菌、乳酸球菌、大肠杆菌、柠檬酸菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、真细菌属、韦永球菌属、梭形杆菌属或特别是乳酸杆菌属，可能替代实施例中贮存利生菌中相同属或种的菌株。在使用已知菌株的贮存培养物时，为加强功效，这些细菌可通过家禽体内(培养)以适应家禽，更优选的是将其与来自稳态培养物的其它细菌一起使用，然后将其从家禽的粪便或盲肠内容物中回收和分离。当使用家禽分离物时，使用本领域中常规技术或按DeLoach所述[U.S.专利申请序号07/822,505]，可能从成年家禽的粪便或盲肠内容物中分别分离和回收细菌，其内容在此引入作为参考。

同样可以预测，在利生菌少于上述所有的29种菌株的情况下，本发明仍可能实施，从利生菌中去除一、二或三种细菌可能只引起效力的轻微下降。例如，并不仅限于此，假单胞菌属或多余的菌株，即那些属于存在多菌株或菌种的属的菌株，可以去除而不显著降低效力。然而，按照优选实施方案，利生菌对沙门氏菌移生的最佳控制作用是在所有29种菌株均包括的情况下获得的。

按照Nurmi等人的技术(美国专利4,689,226，其内容在此引入作为参照)，同样可能任选本发明中的一些细菌株，用做有能力吸附至受试家禽消化道上皮细胞的细菌。

本发明同样涉及一种新方法，用于获得利生菌以有效地控制或抑制沙门氏菌在多种家畜中的移生，其中包括但不仅限于家禽以及马、猪和牛。与其说使用已知的贮存培养物或纯化的细菌分离物产生利生菌，不如说我们无意中发现一种可能直接从成年靶动物的粪便、盲肠和(或)大肠内容物中生产稳定的限定性利生菌的方法。按照这一方法，首先使用粪便、盲肠或大肠内容物作为成批培养的接种物，然后在特定的培养基交换和pH条件连续流动培养，直至达到稳态或平衡。所得的稳态培养物可回收作为利生菌使用。其中盲肠内容物被定义为包括盲肠内缘中的物质以及整个盲肠本身，包括其所属的如粘膜层的各部分。

成批培养阶段可在任何常规的发酵容器中进行。然而，优选使用无稀释作用的恒化器(即不加入新鲜培养基和不取走失效的培养基)，以避免培养物转入后面的进程以及减少对培养物潜在的污染。动物盲肠或大肠内容物及其粪便收集后可作为接种物。与合适的培养基混合并在无氧条件下温育。这一成批培养物应连续温育：

(1)约6～18小时，优选12～18小时左右，或

(2)直到光密度(在600nm测量)至少达到约1.0左右，和(或)

(3)pH达到4.2左右后约2小时以内；达到上述时间时，成批培养应终止，并开始连续培养。如果使用上述条件(1)或者特别是条件(2)确定温育期，优选使用本领域常规的pH调节剂控制培养物的pH值在5.5左右。另外，如果不采取这一pH控制，以避免某些细菌的死亡，优选成批培养物保持pH值不低于4.2左右。

在结束上述成批培养阶段后，接着马上开始在恒化器中的持续培养，并持续补充新鲜的培养基和取走失效的肉汤培养基。合适的恒化器可能易于确定，例如包括Wang所述的反应器[Fermentation and EnzymeTechnology，John Wiley & Sons，New York，1979，pages 98-137，该内容在此引入作为参考]。令人惊奇的是，在特定的稀释或培养基的周转率和特定的pH值下，连续培养中的混合物生长，可以使培养物达到一个平衡或稳态。根据接种源所使用的动物、特定的培养基和培养条件，开始存在的细菌数目可能减少至一个含有相对少数生物学基本纯化的细菌的稳定培养物，并可能易于确定。例如，当使用家禽时，开始约有500种细菌存在于接种物中，在稳定培养物中可能减少至约10到40种细菌。这一阶段合适的条件包括周转率在0.029到0.10小时^-1左右，优选0.0416小时^-1左右，pH值在4.7至6.5左右，优选5.5左右。

温度和所用培养基对于大批和连续培养并非关键因素，并可能易于确定。合适的温度可能在约26℃至47℃之间变化。含有不同能量来源的多种合适的培养基同样可以使用。虽然对此没有限制，但优选的能量来源包括葡萄糖、半乳糖，以及特别是乳糖。

当培养物pH、OD₆₀₀和易挥发性脂肪酸浓度保持近似不变时，培养物可认为已呈现稳态。一但达到稳态，培养物可在任何时候回收，并按所述使用。理想的是，同样也应该对稳态培养物加以鉴定或限定，通过使用本领域常规的方法，对其中的细菌种群进行分离和检验。一经分离，细菌使用常规的技术可能无限期地贮存，并按所述的方法用于以后的使用，例如，可按本发明以前相关的、序号为07/921,173的专利申请(1992年7月29日提交)中所述的方法进行。本领域熟练的技术人员将会意识到，使用分离的或生物学纯化的细菌作为初始接种物同样可能使用上述的成批/连续培养的方法。

按本方法产出的稳态培养物可以任意地加以筛选以选择显示最高效价的组合物，用于抑制沙门氏菌在适用动物上的移生。在一项优选的实施方案中，使用本领域常规技术，上述筛选可在体内用沙门氏菌攻击而进行，其内容在实施例3和例4中加以叙述。简单地讲，可按在此所述的方法给未感染沙门氏菌的动物喂服稳态培养物。当经过一段时间，通常是喂服后2或3天，足够培养物在消化道内确立之后，用活的沙门氏菌培养物攻击动物，潜伏一段时间后，接着处死动物，动物的盲肠内容物用于分析沙门氏菌的移生。有效抑制沙门氏菌移生可用平均沙门氏菌浓度(CFU)的减少或动物被移生百分率的降低表示，并将处理的动物组与未处理的对照组比较。

我们同样发现，按照本发明或经其它任何方法产生的利生菌，通过分析盲肠中易挥发性脂肪酸的成份谱，同样可能实现在体内的准确筛选。这一技术并不需要通常的沙门氏菌攻击。为了评估任一培养物的效价，可给适用的动物喂服培养物，并如前所述使培养物在消化道内确立。处理后约2-3天，优选3天，处死动物，测定盲肠内容物中丙酸和所有挥发性脂肪酸(乙酸加丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸)的浓度。测定上述酸可能使用的技术为本领域常规的方法，包括Corrier等人所述的气-液色谱法(Avian Dis.，34：617-625，1990)，其内容在此引入作为参考。当：

(1)盲肠内容物中丙酸浓度超过或等于10mmol/g时，和(或)

(2)总的挥发性脂肪酸的浓度超过未处理对照组接近100％或更多时，显示可作为利生菌以抑制沙门氏菌移生的效价。尽管允许在第二天以后测定丙酸的浓度，但如果以总挥发性脂肪酸浓度的测定为基准，则第3天以后的测定会使抑菌效价的预测值偏低。

就上述的含29种菌株的利生菌，按本法生产的稳态培养物可能直接作为利生菌使用或贮存待以后使用。类似地，培养物中所包括的细菌也可能被分离和鉴定；而且，已知或标准化的菌株，或从相同适用动物中分离的细菌，它们都可能替代上述稳态培养物中同属或同种的细菌。

在合适的培养基中，使用本领域常规的无氧培养技术，通过对细菌成批或连续培养，可能生产大量的本发明的利生菌。其中，连续培养具有特别的优点，因为稳态培养物非常稳定并可能无限地保持稳态培养的状态。大规模培养的接种物可能是稳态培养物的样品或菌种、贮存的培养物或生物学基本纯化的细菌分离物。细菌可能联合培养，或者为了易于标准化而在不同的培养基上培养，再联合培养。对于后一种技术，在联合培养前每种细菌的终浓度应在10⁸至10⁹个细菌/毫升。然而，本领域熟练的技术人员会发现细菌的浓度并非关键而且可能改变。

通常，当在成批培养中进行大规模生产时，培养物在收获前应温育约16-72小时，优选24-48小时。然而，我们发现无论如何，成批培养应持续直至达到以下的发酵参数：

(1)乙酸浓度高于或等于约20mM，

(2)丙酸浓度高于或等于10mM，

(3)丁酸加异丁酸浓度高于或等于15mM。

本发明中利生菌的使用不受特定的生产方法的影响；上述任何一种方法产生的利生菌可以用同一方法使用。细菌培养物产生后，可以单独或联合直接给受试动物服用。可供选择的是，利生菌可能进一步地与合适的载体配制，包括但不仅限用乳糖、脱脂乳，或者与少量的食物结合作为预先混合物使用。培养物可能冻干以用于稳定贮存和易于管理。该冻干培养物可能直接给动物服用，或可选地，在使用前重建。应特别注意，可使用本领域常规技术将一种或所有细菌包入胶囊，包括、但不限于使用藻酸盐凝胶使其胶囊化。不希望被理论所限定，相信使用这种方法包裹，可以防止一些细菌将上部肠道内乳酸的浓度降至不希望的水平。胶囊化同样可保护细菌并使其到达盲肠，而该处乳酸的利用是合乎需要的。

本发明的利生菌可能与其它生物学基本纯化的细菌联用，这些纯化的细菌，特别是那些产生乳酸或挥发性脂肪酸的细菌，作为利生菌已用于有效控制家畜或家禽中沙门氏菌。并不仅限于此，其它合适的细菌可包括胨链球菌属或DeLoach所述的细菌[U.S.Patent application serialno.07 1822，505](其内容在此引入作为参考)。本领域常规或已知的、用于处理家畜或家禽的其它佐剂，特别是用于抑制肠道病原菌的佐剂，可加到利生菌中。合适的佐剂包括，例如，对抗革兰氏阳性菌无效的抑球虫剂。特别优选添加乳糖。

本领域常规的非治疗水平的抗生素同样可以给动物或家禽使用。这些抗生素可以与利生菌联合或分别服用。亦或，这些抗生素可以治疗水平给家禽的蛋使用，但在孵化后约3天内其水平降至非治疗水平。

虽然本发明的利生菌主要通过与动物饲料或饮水联用后被摄取而施用于导入消化道，可展望也可以通过本领域常规的方法经口腔或鼻腔喷雾制剂的形式直接给动物服用利生菌。还有其它可选的方法，包括直接灌注到胃肠道中或经泄殖腔施用。对于后者，利生菌可能直接喷在家禽的肛门上或给到禽栏底部的铺草上，在家禽的正常活动过程中与肛门区接触。一但接触到肛门区，利生菌可通过逆向蠕动而导入泄殖腔。

可在动物一生的任何时期施用利生菌。然而，在优选的实施方案中，给约1至14天龄的新孵出家禽服用利生菌。

与不经处理的动物比较，服用有效量的利生菌可以基本抑制沙门氏菌在处理后动物中的移生。本领域熟练的技术人员可以容易地确定合适的使用量，并随动物的年龄和大小稍有改变。

以下的实施例仅试图进一步说明本发明，而非限制权利要求书中各权项的范围。

实施例1

利生菌的制备初始接种

初始接种物可从3只10周龄用于焙烤的无沙门氏菌小鸡中获得，这些鸡孵化后用不含药物的饲料或饮水饲养。将鸡处死后，无菌条件下取出盲肠并迅速移至无氧容器中(Coy Laboratory Proclucts，Ann Arbor，MI)。将每个盲肠剪成若干碎块，并浸渍于实验室用搅拌器中(Tekmar，Cincinnati，OH)。浸渍的盲肠组织和内容物混合在一起并被充分匀浆，之后加入甘油至终浓度为20％，最终的盲肠匀浆混合物于-70℃冷冻直至使用。解冻10ml的冷冻盲肠匀浆物，并在100ml Viande Levure(VL)肉汤培养基中于39℃无氧温育，并作为种菌用于下面的连续流动(CF)培养。

连续流动装置。成批和连续流动培养阶段均在BioFlo III发酵器(NewBrunswick Scientific Co.，Edison，NJ)中的1150ml的恒化器中进行。当培养物在连续流动条件下生长时，可使用下列的参数：

--稀释速率0.0416^-1(相应的流动速率为0.80ml/分钟和整个容器周转时间为24小时)，

--温度为39℃，和

--搅动速度为200rpm。用稳定的无O₂的CO₂气流充满容器以保持无氧条件。

连续流动条件下盲肠微生物的生长。恒化器内充满1050ml无菌的Viande Levure(VL)肉汤培养基和接种100ml的种菌，在成批培养中于39℃、200rpm搅拌速率下无氧温育。成批培养6小时后，开动营养物泵，培养物在连续流动条件下温育。在连续流动培养后约5天可获得稳态条件。当培养物pH、OD₆₀₀和挥发性脂肪酸浓度保持近似不变时，认为达到稳态条件。

无菌收集经过5天和61天培养后的连续流动培养物样品，并铺种于补充5％牛血的胰化蛋白琼脂、McConkey琼脂和疾病控制中心血琼脂(CDCBA)。胰化蛋白琼脂和McConkey琼脂平皿在空气中于37℃温育7天。CDCBA平皿在含80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳气体的无氧室中(Coy Laboratory Products，Ann Arbor，MI)于37℃温育7天。由15种兼性和14种专性厌氧菌组成的29种细菌分离物，代表10个不同种属的细菌，在连续流动培养的第5天以及第61天时进行鉴定。29种细菌分离物可使用本领域常规的生化、酶促过程和抗微生物敏感性检测方法加以鉴定(Holdeman et al.，1977，Anaerobe Laboratory Manual，4th ed.，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg，VA；Farmer et al.，1985，J.Clin.Microbiol.，21：46-76；Lennette et al.，1985，Clinical Microbiology，4 th ed.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.；and Devriseet al.，1987，Int.J.Syst.Bacteriol.，37：257-259，每项内容在此引入作为参考)。其结果在实施例2中描述。

上述细菌鉴定为：

I.兼性厌氧菌，革兰氏阳性球菌：

(1)粪肠球菌标为菌株M，

(2)粪肠球菌标为菌株N，

(3)faecium肠球菌标为菌株Y，

(4)faecium肠球菌标为菌株Z，

(5)facium肠球菌标为菌株X，

(6)avium肠球菌

(7)粪肠球菌标为菌株O，

II.兼性厌氧菌，革兰氏阳性球杆菌：

(8)laetis乳酸球菌亚种双裂杆菌(diacetylactis)，

(9)一种乳酸杆菌属的菌种(菌株编号1)，

III.兼性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(10)大肠杆菌，标为菌株CC-3A，

(11)弗氏柠檬酸菌株，标为菌株CC-3，

(12)一种属于肠杆菌科的细菌(暂定为肠杆菌种、大肠肝菌或cryocrescens柯洛伊克尔菌)，

(13)一种假单胞菌属的菌种，

(14)液化沙雷氏菌，

(15)大肠杆菌，标为菌株CC-3B，

IV.专性厌氧菌，革兰氏阳性杆菌：

(16)一种丙酸杆菌属的菌种(菌株编号1，暂定为詹氏丙酸杆菌或特氏丙酸杆菌)，

(17)一种丙酸杆菌属的菌种(菌株编号2，暂定为颗粒丙酸杆菌)，

(18)一种乳酸杆菌属的菌种(菌株编号2)，

(19)一种双歧杆菌属的菌种(菌株编号1)，或一种乳酸杆菌属的菌种(菌株编号3)，

(20)一种丙酸杆菌属的菌种(菌株编号3)，

(21)一种真细菌属的菌种(菌株编号1)，

(22)一种真细菌属的菌种(菌株编号2)，

(23)一种未知的细菌标为菌株OAGPB-5，

(24)一种真细菌属的菌种(菌株编号3)，

(25)一种双歧杆菌属的菌种(菌株编号2)或一种乳酸杆菌的菌种(菌株编号4)，

(26)一种双歧杆菌属的菌种(菌株编号3)或一种乳酸杆菌的菌种(菌株编号4)，

(27)一种丙酸杆菌属的菌种(菌株编号4)，

V.专性厌氧菌，革兰氏阴性球菌：

(28)一种韦永球菌属的菌种，和

VI.专性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(29)一种梭形杆菌属的菌种。

连续流动培养物，具有由29种细菌分离物组成的特征，表现出在混合培养中共存生长、在酸性条件下具有生存性(pH5.0至6.5)，以及产生挥发性脂肪酸(VFA)作为发酵终产物。

利生菌的组合物，包括上述所有的29种细菌株，已在布达佩斯条约下，存入美国典型培养物保藏中心(12301，Parklawn Drive，罗克维尔，MD 20852，美国)，作为排除竞争培养物，CF3，指定的保存编号为ATCC55515。

实施例2

细菌的特征描绘

气液色谱.从CDCBA所得的29种细菌中的每种菌株，被接种至蛋白胨酵母(PY)和PY+1％葡萄糖(PYG)肉汤培养基中，接着于37℃无氧温育2天。使用标准步骤提取挥发性脂肪酸(VFAs)和非挥发性脂肪酸(NVFAs)，接着使用GowMac气液色谱(GLC)检测。GLC通过VFAs和NVFAs的商业标准品加以标定。其结果由表1A-C显示。

细胞、菌群、培养的特征描绘。兼性厌氧菌1-15的革兰氏反应和细胞的形态使用革兰氏染色法加以测定，细菌在涂片前已在血琼脂中于空气中37℃温育24小时。细菌的活动性使用含四唑盐的软琼脂(0.4％)流动培养基测定。从血琼脂中取菌接种于流动培养基中，并在空气中37℃温育24小时。每个测定进行两次。

为确定培养特性，细菌1-9接种于2份血琼脂、2份MacConkey琼脂、2份叠氮化钠血琼脂和2份胆汁七叶苷琼脂平皿。将1份血琼脂、1份MacConkey琼脂、1份叠氮化钠血琼脂和1份胆汁七叶苷琼脂平皿在空气中37℃温育。1份血琼脂和1份MacConkey琼脂平皿在含80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳的气体中37℃温育。1份叠氮钠血琼脂和1份胆汁七叶苷琼脂平皿在空气中于45℃温育2天。在温育后的第1和第2天记录细菌的生长能力、菌群特性和血琼脂上溶血类型、MacConkey琼脂上乳糖反应和胆汁七叶苷琼脂上七叶苷水解反应。每个测定进行两次。

为确定革兰氏阴性兼性厌氧菌的培养特征，可重复上述相同的过程，但省去叠氮化钠血琼脂和胆汁七叶苷琼脂平皿。

对于专性厌氧菌16-29，使用革兰氏染色测定细菌的革兰氏反应和细胞形态，细菌涂片前已在富含血红素和甲萘醌的脑和心脏血浸渍的琼脂(CDCBA)上、在含80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳空气中于37℃温育2天。为测定细菌活动性，从CDCBA上取菌至所用的、商业性预先造成无氧的无菌(PRAS)培养基中，并于37℃无氧温育2天。

为确定细菌的培养特性，细菌16-29接种于2份CDCBA和2份MacConkey琼脂平皿中。1份CDCBA和1份MacConkey琼脂平皿在空气中37℃温育，1份CDCBA和MacConkey琼脂平皿于37℃无氧温育。温育后1、3、5天记录细菌的生长能力、菌群特性和CDCBA上的溶血类型。

以上结果在表2A-C中显示。

过氧化氢酶、氧化酶和硝酸盐还原测定。对于兼性厌氧菌1-9，在血琼脂上于空气中37℃温育2天后，菌群可用于进行过氧化氢酶和氧化酶的测定。过氧化氢酶和氧化酶测定用的试剂分别为3％H₂O₂和1％四甲基对苯二胺二盐酸盐溶液。两种酶反应记录为阳性或阴性。每个测定进行两次。同样的程序用于测定革兰氏阴性的兼性厌氧菌10-15，只是培养物只温育24小时。

对于专性厌氧菌16-29，在CDCBA上于37℃无氧温育2天后，菌群用于进行过氧化氢酶和氧化酶的测定。两种酶测定的试剂与上相同。用于两种酶测定的细菌在加入试剂前先在空气中暴露30分钟。所有反应记录为阳性或阴性。每个测定进行两次。

使用两种方法检测兼性厌氧菌1-15中的硝酸盐还原酶。对于硝酸盐琼脂法，在含0.1％KNO₃的琼脂上接种来自血琼脂已于空气中37℃温育24小时的细菌。于37℃温育24小时后，使用试剂A和B(N，N′-二甲基萘胺和对氨基苯磺酸)测定。对于无氧的血琼脂-纸片法，在血琼脂上划种细菌后，将一浸渍0.4％KNO₃溶液的圆纸片放在划种细菌密集的区域。平皿于37℃无氧温育24小时后，将试剂A和B加在测定纸片上。为确定已被还原的硝酸盐是否超过现存的硝酸盐，将锌粉加至经测定试剂处理过的纸片上。所有反应记录为阴性或阳性。每个测定进行两次。

对于专性厌氧菌16-29，使用以上的无氧血琼脂-纸片法测定硝酸盐还原酶，只是用CDCBA代替血琼脂。

结果显示于表3A-C。

有氧碳水化合物利用测定。对于兼性厌氧菌1-9，来自葡萄糖、半乳糖醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷和蔗糖的酸性产物，使用1％的底物，在酚红液体培养基中加以测定。用德拉姆管测定葡萄糖培养液中的产气量。将已在空气中37℃温育24小时的、来自血琼脂的受检细菌接种于每个管中。培养液在空气中于37℃温育2天。观察每管的颜色变化。管为红色记录为阴性，管呈黄色记录为阳性。每个测定进行两次。

用同样的过程测定革兰氏阴性兼性厌氧菌10-15，但只分析葡萄糖、乳糖和蔗糖。

将三糖铁(TSI)琼脂接种来自已在血琼脂中37℃温育24小时的、所有兼性厌氧菌1-15的培养物。在空气中37℃温育24小时后，TSI琼脂反应记录为阳性或阴性。每个测定进行两次。

对于兼性厌氧菌1-9，从血琼脂中接种至Voges-Proskauer液体培养基中，接着在空气中于37℃温育24小时。加入试剂A和B(40％KOH和α-萘酚)。反应记录为阳性或阴性。每个测定进行两次。

对于革兰氏阴性兼性厌氧菌10-15，从血琼脂平皿中接种至2份甲基红-Voges Proskauer液体培养管(A和B)，接着在空气中37℃温育24小时。对于甲基红测定，将1份甲基红染料溶液加入A管。对于Voges-Proskauer测定，将试剂A和B(40％KOH和α-萘酚)加入管B。反应用阳性或阴性记录。每个测定进行两次。

结果显示于表3A-C。

氨基酸利用和尿素酶测定。革兰氏阴性兼性厌氧菌10-15测定赖氨酸脱羧酶和尿素酶，细菌1-15测定吲哚的生成。用赖氨酸铁琼脂(LIA)检测赖氨酸脱羧酶。从血琼脂平皿中取菌接种至LIA，并在空气中37℃温育24小时。反应用阳性或阴性记录。每个测定进行两次。

使用两种方法检测从色氨酸产生的吲哚。从血琼脂中取菌接种至色氨酸液体培养基，并在空气中37℃温育24小时，接着与Ehrlich′s试剂反应。使用厌氧琼脂-纸片法，在血琼脂平皿上划种细菌，接着将一张纸片放在琼脂表面。该血琼脂平皿于37℃无氧温育24小时，接着用1％对二甲胺基肉桂醛(P-dimethylaminocinnamal dehyde)测定纸片。所有结果用阳性或阴性记录。色氨酸液体培养基测定重复两次，而厌氧琼脂-纸片法一次。

从血琼脂平皿中取菌接种至尿素琼脂，接着在空气中37℃温育24小时。反应用阳性或阴性记录。测定重复两次。

这些结果也显示于表3A-C。

商业性API 20E系统。革兰氏阴性兼性厌氧菌10-15还用20种化学反应(表4)加以评估，按厂家说明使用一种商业反应系统(AnalytabProducts，Plainview，NY)。测定重复两次。

结果显示于表4。

碳水化合物发酵、明胶液化和氨基酸利用测定。将血琼脂上兼性厌氧菌1-15的稠密悬液接种于商业性的预先造成无氧的无菌(PRAS)液体培养基中(表5)。该液体培养基在空气中37℃温育5天，在接种后第1、3、5天，用pH计测定每份培养物的pH值。培养物的pH≤6.5记为阳性，而培养物pH≥6.6为阴性。精氨酸培养基用增加的pH值评估，而明胶培养基则用液化作用评估。每个测定进行一次。

对于专性厌氧菌16-29可重复相同过程，仅接种物来自CDCBA上生长的细菌，以及所有温育均在无氧条件下。

结果显示于表5A-C和3A-C。

商业性的API Rapid STREP系统测定。使用商业性的鉴定肠球菌和链球菌系统评估兼性厌氧菌1-9的20种生化特性，测定按厂家说明(Analytab Products，Plainview，NY)。简而言之，将已在血琼脂中于空气37℃温育24小时的菌落悬浮至3ml的无菌蒸馏水中，以提供与McFarland 5号标准相同的细菌悬液。在每个器皿中接种细菌，然后在空气中37℃温育24小时。温育24小时后，加入试剂以测定羟基丁酮的生成、马尿酸盐水解作用和吡咯烷酮基-2-萘酰胺(Pyrrolidonyl-2-naphthylamide)的酶催化反应、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和亮氨酸芳胺酶。在室温下温育10分钟后以阳性或阴性记录反应。七叶苷水解、精氨酸二水解酶，以及从核糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、菊粉、蜜三糖、淀粉和糖原来的酸性产物均以阳性或阴性记录。每个测定进行两次。

结果显示于表6。

商业性APESTAPH Trac系统测定。使用商业性的系统评估兼性厌氧菌1-9的19种生化性质(表7)，测定按厂家说明(Analytab Products，Plainview，NY)。简而言之，将已在血琼脂中于空气37℃温育24小时的菌落悬浮于3ml无菌蒸馏水中，以提供与McFarland 5号标准相同的细菌悬液。每个器皿中接种细菌，并在空气中37℃温育24小时。温育24小时后，加入试剂以测定羟基丁酮生成、碱性磷酸酶、硝酸盐还原酶和α-甲基-葡萄糖苷的酶促化反应，以及精氨酸二水解酶、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、N-乙酰氨基葡萄糖、蜜三糖、蔗糖、海藻糖、尿素酶、木糖醇和木糖。反应用阳性或阴性记录。每个测定进行两次。

结果显示于表7。

商业性APIZYM系统测定。使用商业性半定量酶系统评估所有兼性厌氧菌1-15对19种底物的酶活性，测定按厂家说明(Analytab Products，Plainview，NY)。简而言之，将已在血琼脂中于空气37℃温育24小时的菌落悬浮于3ml无菌蒸馏水中，以提供与McFarland 5号标准相同的细菌悬液。每个器皿中接种细菌悬液。在暗处于37℃温育24小时后，每个器皿中加入试剂A和B，然后在室温条件下反应进行5分钟。反应的颜色深浅与厂家的示意图比较，并定级如下：0＝无颜色改变，痕迹量＝＜5纳摩尔(nmol)，1＝5nmol，2＝10nmol，3＝20nmol，4＝30nmol和5≥40nmol。

对于专性厌氧菌16-29，或重复上述过程，只是接种物来自CDCBA上无氧生长的细菌。

结果显示于表8A-C。

商业性的Presumpto平皿I、II和III。对于专性厌氧菌16-29，从CDCBA上接种细菌至Presumpto平皿I、II和III上，接着于37℃无氧温育2天。测定进行和结果记录均按厂家说明(表9)。每个测定进行两次。

结果显示表9A-D。

抗菌剂敏感性测定。用标准的圆盘-扩散法测定兼性厌氧菌1-15对表10显示的所选抗微生物试剂的抗菌剂敏感性。结果用抗性的(R)或敏感性的(S)(包括中等敏感性的)记录。每个测定进行一次。

对于专性厌氧菌16-29重复上述过程，只是使用CDCBA并且对培养物进行无氧温育。

结果显示于10A-C。

结果。测定结果由表1-10显示。所有细菌按标准培养物和生化标准加以鉴定。

实施例3

用焙烤用(Broiler)雏鸡的体内实验

沙门氏菌.从家禽中分离的原代鼠伤寒沙门氏菌得自国立兽医服务实验室，Ames，IA 50010，在我们实验室中被选择新生霉素(NO)和萘啶酮酸(NA)耐受性，并在含25mg NO和20mg NA/ml的培养基中维持生长。攻击用接种菌由隔夜培养物制备而来，此培养物已在胰化酪蛋白大豆液体培养基中转移过三次，并经无菌磷酸缓冲液逐步稀释至浓度为4×10⁴cfu/1.0mL。攻击接种物中活菌的浓度在亮绿琼脂(BGA)平皿上经菌落计数证实。在实验研究中。用于培养攻击后对NO-NA耐受的雏鸡分离物的培养基中含有25mg NO和20mg NA/mL，以抑制其它细菌和非耐受性沙门氏菌的生长。

实验设计。得自商业孵卵场的当日孵出的雄性焙烤用雏鸡，放置于以松木屑做垫料的有底层的鸡笼中。给雏鸡维持连续的光照，并供给自由摄取的饲水，以及不含药物的谷物和大豆饲料，这些饲料含有或超过由国立研究会(1984)推荐的关键营养成份的水平。将运输雏鸡盒子的纸衬和随机选取的3份25g饲料样品在缓冲性蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸液体培养基和如前所述的BGA平皿中(Andrews et al.，1978，Isolationand Identification of Salmonella.In：Bacteriological AnalyticalManual，5th ed.，Assoc.Off.Anal.Chem.，Washington，D.C.，Chapter6，1-24)依次培养，并检测沙门氏菌属的细菌。在纸内衬或饲料中不可检出spp.沙门氏菌。将雏鸡随机分成两组，在其第一次饲水中提供1)没有处理(对照)，或2)特定的细菌培养物(CC)。CC取自实施例1中连续流动培养外流物，含有大约10⁸厌氧菌cfu/ml，并以1∶5的比例加入饮水中(1份CC；4份水)。给处理组的雏鸡提供18小时处理过的饮水，而且每只雏鸡估计可饮用10ml经CC处理的饮水。18个小时后，取走剩余的处理过的饮水并换成新鲜的自来水。第三天，CC处理后两天及沙门氏菌攻击前，每组随机取10只雏鸡并无痛苦拉颈处死。盲肠内容物中丙酸类挥发性脂肪酸(VFA)的浓度和总VFA(乙酸+丙酸+丁酸+异丁酸+戊酸+异戊酸)的浓度由以前报导的气液色谱法测定(Corrier et al.，1990，Avian Dis.，34：617-625)。按推荐的评估盲肠细菌新制备培养物效价的方法，所有剩余的雏鸡均用嗉囔管饲法给10⁴cfu的鼠伤寒沙门氏菌加以攻击(Mead et al.，1989，J.Food Protect.，52：500-502)。在10天大小，每组取20只雏鸡，无痛苦处死，从每只鸡中无菌取出盲肠内容物，并按下文所述的方法评估鼠伤寒沙门氏菌的移生。从上述的10日龄处死的鸡中随机取10份肠内容物，并用前述的方法测定VFA的浓度。以上试验设计在4个不同的试验中加以重复，即使用新孵出的雏鸡和在连续流动培养中分别持续5天(试验1)、26天(试验2)、40天(试验3)和61天(试验4)的特定盲肠细菌。在试验2、3、4过程中测定VFA′s在盲肠内容物中的浓度，而在实验1中不测定。

与对照组比较，试验2、3、4在第3天和第10天时，处理组雏鸡的盲肠内容物中丙酸浓度显著升高(p＜0.005)(表11)。另外，3日龄处理组鸡的盲肠丙酸浓度增加与10日龄处理组鸡盲肠内容物中沙门氏菌数目的log₁₀值下降之间存在着显著的相关性(p＜0.005)(r＝-0.99)。

在第3天，与对照组比较，处理组鸡盲肠内容物中总VFA′s的浓度显著增加(p＜0.01)(表12)。另外，3日龄处理组鸡中总VFA浓度的增加与10日龄处理组鸡盲肠内容物中沙门氏菌数目的log₁₀值降低之间存在着显著相关(p＜0.01)(r＝-0.67)。在第10天，对于试验3和4，与对照组比较，处理组鸡盲肠中总VFA′s的浓度显著升高(p＜0.05)。

鼠伤寒沙门氏菌在盲肠中的繁殖。如上所述，无菌条件下取走每只鸡一部分盲肠，用剪刀剪碎，并在30ml的亚硒酸盐-胱氨酸液体培养基中于37℃温育24小时。温育后将培养液划种于BGA平皿上，温育24小时并检测典型性鼠伤寒沙门氏菌的菌落。将1份来自剩余盲肠的内容物(0.2g)依次以1∶100、1∶1000和1∶10000稀释并平铺至BGA平皿上。平皿于37℃温育24小时，鼠伤寒沙门氏菌的cfu的数目使用自动菌落计数仪(Biotran III，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)确定。典型的沙门氏菌菌落还用三糖铁琼脂和赖氨酸铁琼脂(DefcoLaboratories，Detroit，MI)上的生化测定加以证实，以及使用沙门氏菌0抗血清，组13，因子1、4、12、15(Difco Laboratories，Detroit，MI)做鼠伤寒沙门氏菌的血清学鉴定。沙门氏菌的菌群平皿接种数用每克盲肠内容物中log₁₀沙门氏菌数表示。若盲肠容物在1∶100稀释下沙门氏菌培养为阴性，而在亚硒酸盐-胱氨酸培养时呈阳性，则将其log₁₀沙门氏菌/g盲肠容物的值规定为1.50。亚硒酸盐-胱氨酸的培养物在BGA平皿上为阴性则log₁₀沙门菌值规定为0。

为评估CC处理后对沙门氏菌攻击抗性的效价按以前所述的方法计算“保护系数”(PF)(Pivnick and Nurmi，1982，The Nurmi Concept andits Rolein the Control of Salmonellae in Poultry，In：Developmentsin Food Microbiology，Davies(ed.)，Applied Sciences Publishers，London，41-70；Mead etal.，1989，J.Food Protect.，52：500-502)。PF＝(对照组log₁₀沙门氏菌的均值/处理组log₁₀沙门氏菌的均值)。

用χ方分析(chi-square)分析各组间鼠伤寒沙门氏菌培养阳性雏鸡在数目上的差异。各组均值的差异用Student′s t检验确定。相关的显著性和所有统计过程均按文献所述进行(Snedecor and Cochran，1967，Statistical Mefhods，6th ed.，Iowa Atate University Press，Ames，IA)。

与对照组比较，处理组鸡盲肠内容物中鼠伤寒沙门氏菌的数目显著降低(p＜0.005)，在1、2、3、4每次实验中分别降低了6.35、5.39、3.84和5.77个log₁₀单位(表13)。计算保护系数用于估计特定培养物的效价，在试验1、2、3、4中PF分别测定为63.5、7.14、15.2和10.6。

在四次实验中，实验所用的攻击剂量10⁴鼠伤寒沙门氏菌导致了对照组中90％至100％的10日龄雏鸡的盲肠中有沙门氏菌的移生(表14)。与对照组比较，处理组盲肠培养沙门氏菌阳性的雏鸡数目显著降低(p＜0.01)，在1、2、3、4每次试验中分别下降了100％、65％、75％和60％。

实施例4

利生菌的制备

使用本发明连续培养方法可制备第二种稳态培养物，其内容如patent application serial no.07/921,173，1992年7月29日提交，的专利所述，其内容在此引入作为参考。

该稳态培养物称为CF II，由11种不同的细菌组成，包括四种兼性革兰氏阳性厌氧球菌，两种兼性革兰氏阳性厌氧杆菌，三种兼性革兰氏阴性厌氧杆菌，一种专性革兰氏阳性氧杆菌和一种专性革兰氏阳性厌氧球杆菌。细菌鉴定如下：

(1)粪肠球菌 (标为菌株A)，

(2)粪肠球菌 (标为菌株B)，

(3)avium肠球菌，

(4)lactis肠球菌，

(5)乳酸杆菌类 (标为CMS)，

(6)animalis乳酸杆菌，

(7)弗氏柠檬酸菌，

(8)大肠杆菌，

(9)费罗因德埃希杆菌，

(10)animalis双歧杆菌，和

(11)丙酸丙酸杆菌。

当给家禽服用时，这一稳态培养物证明基本上具有利生菌的效果，与未处理家禽相比，它可以显著降低鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌在家禽中的移生。

应理解，上述详细描述仅作为阐述，可对其进行改良和变化，而不偏离本发明的宗旨和范围。

我们要求：

表1A

组I 组2

1 2 3 4 5 6 7 8 9挥发性脂肪酸 PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG甲酸 S/S S/S -/- T/- -/- -/- -/T -/- -/-乙酸 S/S S/S T/T T/- -/T -/- S/T -/- T/T丙酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-异丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-异戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-异癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-非挥发性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-乳酸 T/L T/L T/L S/L T/L T/L L/L S/L T/L丁酮二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-延胡索酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-苯甲酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-VIAs和NVFAs的量表示如下：-＝没有产生；T＝痕迹量产生；S＝少量产生 L＝大量产生；V＝极大量的产生；

表1B

组III 组IV

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20挥发性脂肪酸 PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG甲酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/-乙酸 S/L S/S S/L T/T T/- S/S T/S S/S T/T -/- S/S丙酸 T/- T/- T/- -/- -/- -/- T/L L/L -/- -/- S/S异丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-异戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- /-异癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-非挥发性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-乳酸 -/L -/L -/L -/- -/S L/- T/S T/S S/S -/- -/-丁酮二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-延胡索酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/- -/- S/S苯甲酸 L/L L/T L/T -/- -/- L/L T/T -/- -/- -/- -/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-

表1C

组4 组5 组6

21 22 23 24 25 26 27 28 29挥发性脂肪酸 PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG甲酸 -/- -/- -/- T/- -/- -/- -/- -/- -/-乙酸 S/L L/S S/- S/- -/- -/S T/T T/T S/T丙酸 -/- -/- -/- S/L -/- -/- S/- L/L -/-异丁酸 -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/- -/-丁酸 V/L -/S -/- -/S -/- -/- -/- -/- L/V异戊酸 -/- -/- -/- -/L -/- -/- -/- -/- -/-戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-异癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-非挥发性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-乳酸 T/S T/- -/- -/- S/L T/L -/- -/- -/-丁酮二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-延胡索酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-苯甲酸 S/- -/L L/- L/- -/- -/- L/L -/- -/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-

表2A细胞、培养和菌落特性条件 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10革兰氏反应 + + + + + + + + + -形态学 c c c c c c c cb b b活动性 - - - - - - - - - -细菌呼吸 fa fa fa fa fa fa fa fa fa fa生长于血琼脂 + + + + + + + + + +MacConkey琼脂 - - - - - - - - - +叠氮钠血琼脂

+ + + + + + + - - NA胆汁七叶苷琼脂

(37℃) + + + + + + + NA胆汁七叶苷琼脂

(45℃) + + + + + + + NA

CDCBA琼脂 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA溶血 - - + + + + - + + -乳糖反应在MacConkey琼脂 NA NA NA NA NA NA NA NA NA +七叶苷水解 + + + + + + NA形态学：c＝球菌，b＝杆菌，cb＝球杆菌细菌呼吸：oa＝专性厌氧菌，fa＝兼性厌氧菌CDCBA＝富含血红素和甲萘醌的脑和心脏浸渍血琼脂溶血测定：对兼性厌氧菌在血琼脂上，对专性厌氧菌在CDCBA上NA＝不能使用

表2B细胞、培养和菌落特性条件 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20革兰氏反应 - - - - - + + + + +形态学 b b b b b b b b b b活动性 + - + + - - - - - -细菌呼吸 fa fa fa fa fa oa oa oa oa oa生长于血琼脂 + + + + + NA NA NA NA NAMacConkey琼脂 + + + + + - - - - -叠氮钠血琼脂

NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA胆汁七叶苷琼脂

(37℃) NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA胆汁七叶苷琼脂

(45℃) NA NA NA NA NA NA NA NA NA NACDCBA琼脂 NA NA NA NA NA + + + + +溶血 - - - - - - - +乳糖反应在MacConkey琼脂 + + - - +七叶苷水解 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA

表2C细胞、培养和菌落特性条件 21 22 23 24 25 26 27 2829革兰氏反应 + + + + + + + --形态学 b cb b b b b cb cb活动性 - - - - - - - --细菌呼吸 oa oa oa oa oa oa oa oaoa生长于血琼脂 NA NA NA NA NA NA NA NANAMacConkey琼脂 - - - - - - - --叠氮钠血琼脂 NA NA NA NA NA NA NA NANA胆汁七叶苷琼脂(37℃) NA NA NA NA NA NA NA NANA胆汁七叶苷琼脂(45℃) NA NA NA NA NA NA NA NANACDCBA琼脂 + + + + + + + ++溶血 --乳糖反应在MacConkey琼脂七叶苷水解 NA NA NA NA NA NA NA NANA

表3A生化特性条件 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10过氧化氢酶 - - - - - - - - - +氧化酶 - - - - - - - - - -硝酸盐还原硝酸盐琼脂 - - - - - - - - - +无氧条件 - - - - - - - - + +葡萄糖肉汤培养基产酸 + + + + + + + + + +产气 - - - - - - - - - +碳水化合物利用半乳糖醇 - - - - - - - - -乳糖 + + + + + + + + + +麦芽糖 + + + + + + + + +甘露醇 + + + + + + + + -水杨苷 + + + + + + + + +蔗糖 + + + + + + + + + +TSI琼脂Butt/Slant a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a产气 - - - - - - - - - +硫化氢 - - - - - - - - -甲基红 + + + + + + + - +Vogues-Proskauer - - - - - - - + - -吲哚生成 - - - - - - - - - +枸椽酸盐 + + - + - - - - - -丙二酸盐 - - - - - - - - -精氨酸二水解酶 + + + + - + + + +赖氨酸脱羧酶 NA NA NA NA NA NA NA NA NA +明胶液化 + + - - - - - - -尿素酶 - - - - - - - - - -表3A(继续)硝酸盐还原：

硝酸盐琼脂：+＝生长，-＝不生长

厌氧：用血琼脂纸片法测定碳水化合物利用：+＝产酸，-＝不产酸TSI琼脂butt/slant：a＝酸性，b＝碱性，赖氨酸脱羧酶测定于LIA琼脂NA＝无法使用

表3B生化特性条件 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20过氧化氢酶 + + + + + - - - - -氧化酶 - - + - - - - - - -硝酸盐还原硝酸盐琼脂 + + + + + NA NA NA NA NA无氧条件 + + + + + - - -葡萄糖肉汤培养基产酸 + - + + NA NA NA NA NA产气 + - - + NA NA NA NA NA碳水化合物利用半乳糖醇 - - - NA NA NA NA NA乳糖 + + - - + NA NA NA NA NA麦芽糖 - + + NA NA NA NA NA甘露醇 - + NA NA NA NA NA水杨苷 - NA NA NA NA NA蔗糖 + + - + - NA NA NA NA NATSI琼脂Butt/Slant a/a a/a b/b a/b a/a NA NA NA NA NA产气 + + - + NA NA NA NA NA硫化氢 + - - - NA NA NA NA NA甲基红 + + - + + NA NA NA NA NAVogues-Proskauer - - - - - NA NA NA NA NA吲哚生成 - + - - + NA NA NA NA NA枸椽酸盐 + - + + + NA NA NA NA NA丙二酸盐 + + NA NA NA NA NA精氨酸二水解酶 - - + + -赖氨酸脱羧酶 - + + + +明胶液化 - - - - -尿素酶 - - - - - - - - - -

表3C生化特性条件 21 22 23 24 25 26 27 28 29过氧化氢酶 - - - - - - - - -氧化酶 - - - - - - - - -硝酸盐还原硝酸盐琼脂 NA NA NA NA NA NA NA NA NA无氧条件 -葡萄糖肉汤培养基产酸 NA NA NA NA NA NA NA NA NA产气 NA NA NA NA NA NA NA NA NA碳水化合物利用半乳糖醇 NA NA NA NA NA NA NA NA NA乳糖 NA NA NA NA NA NA NA NA NA麦芽糖 NA NA NA NA NA NA NA NA NA甘露醇 NA NA NA NA NA NA NA NA NA水杨苷 NA NA NA NA NA NA NA NA NA蔗糖 NA NA NA NA NA NA NA NA NATSI琼脂Butt/Slant NA NA NA NA NA NA NA NA NA产气 NA NA NA NA NA NA NA NA NA硫化氢 NA NA NA NA NA NA NA NA NA甲基红 NA NA NA NA NA NA NA NA NAVogues-Proskauer NA NA NA NA NA NA NA NA NA吲哚生成 NA NA NA NA NA NA NA NA NA枸椽酸盐 NA NA NA NA NA NA NA NA NA丙二酸盐 NA NA NA NA NA NA NA NA NA精氨酸二水解酶 + + - - + +赖氨酸脱羧酶明胶液化 - - - - - -尿素酶 - - - - - +

表4APE 20E系统

细菌(分离物)生化测定 10 11 12 13 14 15ONPG +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+精氨酸二水解酶 -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-赖氨酸脱羧酶 +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+鸟氨酸脱羧酶 +/+ -/- +/+ +/+ +/+ -/-枸椽酸盐 -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-H₂S -/- +/+ -/- -/- -/- -/-尿素酶 -/- -/- -/- +/+ +/+ -/-色氨酸脱氨酶 -/- -/- -/- -/- -/- -/-吲哚 +/+ -/- +/+ -/- -/- +/+Voges-Proskauer -/- -/- -/- -/- +/+ -/-明胶 -/- -/- -/- +/+ +/+ -/-葡萄糖 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+甘露醇 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+肌醇 -/- -/- -/- -/- +/+ -/-山梨醇 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+鼠李糖 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+蔗糖 +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+蜜二糖 +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+苦杏仁苷 -/- -/- +/+ -/- +/+ +/+阿拉伯糖 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+*重复实验/实验2的数据

表5A碳水化合物发酵测定

细菌(分离物)碳水化合物底物 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11核糖醇 + - - - - + - - - - -阿拉伯糖 + + + + + + + - - + +半乳糖醇 - - - - - - - - - - -果糖 + + + + + + + + + + +甘油 + + - - + + + - + + +乳酸 - - - - - ND - - + - -麦芽糖 + + - - + + + + + + +甘露糖 + + - - + + + + + + +蜜二糖 + - + - - + + - - - -蜜三糖 - - - + + - + - + + -核糖 + + + + + + + + + - +山梨醇 + + + - + + + - + + +蔗糖 + + + + + + + + + + -木糖 + + - + + + + + + + +苦杏仁苷 + + + + + + - + - - -纤维二糖 + + + + + - - + + - +赤藓醇 - - - - - + - - - - -葡萄糖 + + + + + + + + + + +肌醇 + + - - - - - - - - -乳糖 + + + + + + + + - + +甘露醇 + + + + + + + + + + +松三糖 + + + + + + - - - - -丙酮酸盐 + - - - - - + - - - -鼠李糖 + - + + - + + - + + +水扬苷 + + + + + + + + - + +淀粉 + - - - + + - + - - -海藻糖 + + + + + + - + + + +

表5B碳水化合物发酵测定

细菌(分离物)碳水化合物底物 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22核糖醇 - - - - - - - - -阿拉伯糖 + - - + + + + - -半乳糖醇 - - - - - - - - -果糖 + - + + + + - - +甘油 + - + + - + - - -乳酸 - - + + - - - - +麦芽糖 + - + + + + + - +甘露糖 + - + + + + - - +蜜二糖 + - + + + + - - -蜜三糖 + - - + + + + - +核糖 + - + + + + - - +山梨醇 + - + + + + - - -蔗糖 + - + + + + + - +木糖 + - - + + + - - +苦杏仁苷 - - - + + - - - -纤维二糖 - - - + + - + - +赤藓醇 - - - - - - - - -葡萄糖 + - + + + + + - +肌醇 - - + + - + - - -乳糖 + - - + + + - - +甘露醇 + - + + - + - - +松三糖 - - - + - - - - +丙酮酸盐 - - - + - - - - +鼠李糖 + - - - + - - - +水扬苷 + - + + + - + - -淀粉 - - - + + - - - +海藻糖 + - + + + + + - +

表5C碳水化合物发酵测定

细菌(分离物)碳水化合物底物 23 24 25 26 27 28 29核糖醇 - - - - - -阿拉伯糖 - + + - - -半乳糖醇 - - - - - -果糖 + + - + + +甘油 - - + + - -乳酸 - + - - - -麦芽糖 - + + + - +甘露糖 + - - + - -蜜二糖 - - - + - -蜜三糖 - + + + - -核糖 - - - - - -山梨醇 - - - - - -蔗糖 - + + + - -木糖 + - - + - -苦杏仁苷 - + - - - -纤维二糖 - + - + - +赤藓醇 - - - - - -葡萄糖 + + + + - +肌醇 - - - - - -乳糖 - + + + - +甘露醇 + - - - - -松三糖 - - - - - -丙酮酸盐 - - - - - -鼠李糖 - - - - - -水扬苷 - + + - - -淀粉 - - - + - -海藻糖 - + + - - +

表6API快速链球菌系统测定

细菌(分离物)酶/底物 1 2 3 4 5 6 7 8 9Voges-Proskauer +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+马尿酸盐水解 -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/-七叶苷水解 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/-吡咯烷酮基-2-萘胺 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-α-半乳糖苷酶 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-β-葡萄糖醛酸酶 -/- -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ -/- -/-β-半乳糖苷酶 -/- +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ -/- -/-碱性磷酸酶 -/- -/- -/- -/+ -/- -/- +/+ -/- -/-亮氨酸芳基胺酶 +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+精氨酸二水解酶 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ -/+ -/-核糖 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-阿拉伯糖 -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/-甘露醇 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-山梨醇 +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/-乳糖 -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-海藻糖 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-胰岛素 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-蜜三糖 -/- -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ -/- -/-淀粉 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-糖原 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-*重复1/重复2的数据

表7API STAPH Trac系统测定

细菌(分离物)酶/底物 1 2 3 4 5 6 7 8 9葡萄糖 +/+ +/0 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+果糖 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+甘露糖 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+麦芽糖 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+乳糖 +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+海藻糖 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+甘露醇 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+木糖醇 -/- -/- -/- -/- -/- +/+ -/- -/- +/+蜜二糖 -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+硝酸盐还原 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/+ -/-碱性磷酸酶 +/+ -/- +/+ -/- -/- -/- -/- +/+ +/+3-羟基丁酮生成 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+蜜三糖 -/- -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ -/- +/+木糖 -/- -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+蔗糖 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+α-甲基-葡萄糖苷 +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ -/- +/+N-乙酰-葡萄糖苷 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+精氨酸二水解酶 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ -/-尿素酶 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-*重复1/重复2的数据

表8AAPI ZYM半定量酶系统测定

细菌(分离物)酶分析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10对照 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0碱性磷酸酶 0/0 1/0 T/T T/T 0/0 2/2 0/0 T/T 0/0 5/4(C4)酯酶 0/0 1/1 1/1 1/1 2/2 2/2 1/1 0/0 T/T 0/0酯酶脂酶(C8) 1/3 2/2 2/2 2/2 2/2 0/0 2/2 2/1 2/2 T/T脂酶(C14) 0/0 0/0 0/0 0/0 T/0 0/0 0/0 0/0 2/2 0/0亮氨酸氨肽酶 5/3 T/1 1/1 0/0 0/0 0/0 1/1 2/3 3/3 1/1缬氨酸氨肽酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 2/2 T/T胱氨酸氨肽酶 T/T 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T 1/1 T/T胰蛋白酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T糜蛋白酶 0/1 0/0 0/0 0/0 2/2 0/0 T/1 T/T 0/0 0/0酸性磷酸酶 3/3 1/2 T/T 0/0 1/1 1/1 1/1 2/3 2/2 3/3磷酸水解酶 2/2 2/2 1/1 3/3 1/1 1/1 2/2 2/2 2/2 3/3α-半乳糖苷酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 4/4 0/0β-半乳糖苷酶 0/0 T/T 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 1/1 3/3 2/3β-葡萄糖醛酸酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0α-葡萄糖苷酶 4/4 2/3 0/0 0/0 0/0 0/0 2/2 3/3 0/0 0/0β-葡萄糖苷酶 4/3 0/0 2/2 1/1 2/1 0/0 T/T 2/2 0/0 0/0N-乙酰-β-葡糖胺酶 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0α-甘露糖苷酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0α-岩藻糖苷酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0半定量酶活力按如下方式记录： 0＝＜5nmol，T(痕量)＝＜5nmol，1＝5nmol，2＝10nmol，3＝20nmol，4＝30nmol，和5≥40nmol.*重复1/重复2的数据

表8BAPI ZYM半定量酶系统测定 Enzyme System Tests

细菌(分离物)酶分析 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20对照 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0碱性磷酸酶 5/5 3/2 2/2 3/3 2/3 3/3 0/0 0/0 0/0 5/5(C4)酯酶 1/1 0/0 3/3 3/3 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0 1/1酯酶脂酶(C8) 1/1 0/0 4/3 3/3 0/0 T/1 1/1 0/0 T/0 1/1脂酶(C14) 1/T 1/T 3/3 2/3 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0亮氨酸氨肽酶 3/4 5/5 4/4 4/4 4/4 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0缬氨酸氨肽酶 1/1 2/3 2/2 2/2 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0胱氨酸氨肽酶 T/T 0/0 1/1 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0胰蛋白酶 T/T 2/2 2/2 2/2 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0糜蛋白酶 T/T 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0酸性磷酸酶 5/5 3/4 2/2 4/4 4/4 2/3 0/0 2/2 T/T 2/2磷酸水解酶 4/3 3/3 1/1 2/2 4/3 2/2 1/1 2/2 T/T 2/2α-半乳糖苷酶 2/1 0/0 0/0 2/2 0/0 5/5 4/4 0/0 0/0 2/2β-半乳糖苷酶 4/4 3/3 0/0 4/3 2/2 2/3 5/5 0/0 3/3 3/3β-葡萄糖醛酸酶 1/1 0/0 0/0 1/1 T/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0α-葡萄糖苷酶 1/1 T/T 0/0 2/2 0/0 1/1 3/4 2/2 3/3 0/0β-葡萄糖苷酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 5/5 0/0 0/0 3/3 0/0N-乙酶-β-葡糖胺酶 0/0 0/0 0/0 2/2 T/0 3/3 0/0 0/0 0/0 5/5α-甘露糖苷酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0α-岩藻糖苷酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

表8CAPI ZYM半定量酶系统测定

细菌(分离物)酶分析 21 22 23 24 25 26 27 28 29对照 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0碱性磷酸酶 0/0 0/0 0/0 0/0 5/5 T/T 5/5 0/0 0/0(C4)酯酶 T/T 0/0 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T酯酶脂酶(C8) T/T 1/1 1/1 T/T 0/0 0/0 1/1 0/0 1/T脂酶(C14) 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0亮氨酸氨肽酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T 0/0 0/0缬氨酸氨肽酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0胱氨酸氨肽酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0胰蛋白酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0糜蛋白酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0酸性磷酸酶 0/0 T/0 0/0 0/0 2/2 1/1 4/2 2/2 1/1磷酸水解酶 1/1 1/1 1/1 2/2 1/1 1/1 5/3 2/1 2/2α-半乳糖苷酶 2/2 T/0 2/1 0/0 0/0 0/0 4/2 0/0 1/Tβ-半乳糖苷酶 0/0 T/0 0/0 0/0 0/0 0/0 4/2 0/0 0/0β-葡萄糖醛酸酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 5/3 0/0 0/0α-葡萄糖苷酶 0/0 3/2 1/T 0/0 0/0 2/2 3/2 0/0 0/0β-葡萄糖苷酶 0/0 1/T 1/T 0/0 2/3 0/0 0/0 0/0 0/TN-乙酰-β-葡糖胺酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 3/2 0/0 0/0α-甘露糖苷酶 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0α-岩藻糖苷酶 0/0 1/T 0/0 0/0 0/0 0/0 1/0 0/0 0/0

表9A

Presumpto平皿系统测定Presumtpo 象限号细菌(分离物)平皿编号琼脂基质生长能力/生化测定 16 17 1819I 1 LD培养基生长 +++ +++ +

吲哚 - - -

2 LD-七叶苷生长 +++ + +++

过氧化氢酶 - - -

七叶苷水解 +++ - -

3 LD-卵黄生长 +++ + +++

卵磷脂酶 - - -

脂酶 - - -

蛋白水解 - - -

4 LD-胆汁生长 I I III 1 LD-DNA 生长 +++ +++ +++

脱氧核糖核酸酶 + - -

2 LD-葡萄糖生长 +++ +++ +++

葡萄糖发酵 + + -

3 LD-牛奶生长 +++ +++ +++

酪蛋白水解 - - -

4 LD-淀粉生长 +++ +++ +++

淀粉水解 - - -III 1 LD-甘露醇生长 +++ +++ +++

甘露醇发酵 - + -

2 LD-乳糖生长 +++ +++ +++

乳糖发酵 + + -

3 LD-鼠李糖生长 +++ +++ +++

鼠李糖发酵 + - -

4 LD-明胶生长 +++ +++ +++

明胶水解 - - -

在LD-胆汁琼脂上相当的生长与LD琼脂比较：I＝很少生长；和E＝相同生长

表9B Presumpto平皿系统测定Presumtpo 象限号细菌(分离物)平皿编号琼脂基质生长能力/生化测定 20 21 2223I 1 LD培养基生长

吲哚

2 LD-七叶苷生长

过氧化氢酶

七叶苷水解

3 LD-卵黄生长

卵磷脂酶

脂酶

蛋白水解

4 LD-胆汁生长II 1 LD-DNA 生长

脱氧核糖核酸酶

2 LD-葡萄糖生长

葡萄糖发酵

3 LD-牛奶生长

酪蛋白水解

4 LD-淀粉生长

淀粉水解III 1 LD-甘露醇生长

甘露醇发酵

2 LD-乳糖生长

乳糖发酵

3 LD-鼠李糖生长

鼠李糖发酵

4 LD-明胶生长

明胶水解

表9CPresumpto平皿系统测定Presumtpo 象限号细菌(分离物)平皿编号琼脂基质生长能力/生化测定 24 25 2627I 1 LD培养基生长

吲哚

2 LD-七叶苷生长

过氧化氢酶

七叶苷水解

3 LD-卵黄生长

卵磷脂酶

脂酶

蛋白水解

4 LD-胆汁生长II 1 LD-DNA 生长

脱氧核糖核酸酶

2 LD-葡萄糖生长

葡萄糖发酵

3 LD-牛奶生长

酪蛋白水解

4 LD-淀粉生长

淀粉水解III 1 LD-甘露醇生长

甘露醇发酵

2 LD-乳糖生长

乳糖发酵

3 LD-鼠李糖生长

鼠李糖发酵

4 LD-明胶生长

明胶水解

表9DPresumpto平皿系统测定Presumtpo 象限号细菌(分离物)平皿编号琼脂基质生长能力/生化测定 28 29I 1 LD培养基生长 +++

吲哚 -

2 LD-七叶苷生长 +++

过氧化氢酶 -

七叶苷水解 -

3 LD-卵黄生长 +++

卵磷脂酶 -

脂酶 -

蛋白水解 -

4 LD-胆汁生长 EII 1 LD-DNA 生长 +++

脱氧核糖核酸酶 -

2 LD-葡萄糖生长 +++

葡萄糖发酵 -

3 LD-牛奶生长 +++

酪蛋白水解 -

4 LD-淀粉生长 +++

淀粉水解 -III 1 LD-甘露醇生长 +++

甘露醇发酵 -

2 LD-乳糖生长 +++

乳糖发酵 -

3 LD-鼠李糖生长 +++

鼠李糖发酵 -

4 LD-明胶生长 +++

明胶水解 +

表10A抗菌剂敏感性测定

细菌(分离物)抗菌剂 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10丁胺卡那霉素 R S S S S S S S S S氨苄青霉素 S S S S S S S S S奥格门丁 S S S R R S S杆菌肽 R R R R R S R S S R羧苄青霉素 S S S R S R S R S S头孢菌素II S R S R R S R S S S头孢菌素I S S R R S S S S S S氯霉素 S S S S S S S S S S氯四环素 R R S S S S R S S S氯林可霉素 R R R R R R R S S R邻氯青霉素 R R R R R R R R R R红霉素 R R S S S S R S S S庆大霉素 S S S S S S S S S S卡那霉素 R R R R S R R S S S林可霉素 R R R R R R R R S R甲氧苯青霉素 R R R R R S R S R R萘啶酮酸 R R R R R R R R R S新霉素 S S S S S S R S S S呋喃妥英 S S S S S S S S S新生霉素 R R R S S S R S青霉素 R R R R S S S R S R多粘菌素B R R R R R R R R R S利福平 S S S S S S S S S S链霉素 R R R R S R R R S S磺胺嘧啶 R R R R R R R R S S三甲氧苄氨嘧啶 R S R R R R S R S S四环素 R S S S S S R S S S万古霉素 S S S S S S S S R RS＝敏感的，R＝抗性的

表10B抗菌剂敏感性测定

细菌(分离物)抗菌剂 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20丁胺卡那霉素 S S S S S R S R R R氨苄青霉素 R S R S S奥格门丁 S S R S S S S杆菌肽 R R R R R R R R R R羧苄青霉素 S S S S S S S S S S头孢菌素II R S R R R R S S S S头孢菌素I R S R R S R S S S S氯霉素 S S S S S S S S S S氯四环素 S S S S S S R R R氯林可霉素 R R R R R S S S S S邻氯青霉素 R R R R R R R R R R红霉素 R S S R S S S R R R庆大霉素 S S S S S R S R R R卡那霉素 S S S S S R S R R R林可霉素 R R R R R R S R R R甲氧苯青霉素 R R R R R R R R R R萘啶酮酸 S S S S S R S R R R新霉素 S S S S S R S R R R呋喃妥英 S S R S S新生霉素 R S S青霉素 R R R R R R R S S S多粘菌素B S S S R S R S R R R利福平 R S S S R S S S S S链霉素 S S S S S R S R R R磺胺嘧啶 S S S S S S R R R R三甲氧苄氨嘧啶 S S R S R R R R R R四环素 S S S S S S R R R万古霉素 R R R R R S S S S

表10C抗菌剂敏感性测定

细菌(分离物)抗菌剂 21 22 23 24 25 26 27 28 29丁胺卡那霉素 R R R R R R R S S氨苄青霉素奥格门丁 S S S S S S S S S杆菌肽 R R R R R R R R R羧苄青霉素 S S S S S S S S S头孢菌素II S S S S S S S S S头孢菌素I S S S S S S S S S氯霉素 S S S S S S S S S氯四环素 R R R R R R R S S氯林可霉素 S S S S S S S S S邻氯青霉素 R R R R R R R R R红霉素 R R R R R R R S S庆大霉素 R R R R R R R S S卡那霉素 R R R R R R R S S林可霉素 R R R R R R R S S甲氧苯青霉素 R R R R R R R R R萘啶酮酸 R R R R R R R S S新霉素 R R R R R R R S S呋喃妥英新生霉素青霉素 S S S S S S S R R多粘菌素B R R R R R R R S S利福平 S S S S S S S S S链霉素 R R R R R R R S S磺胺嘧啶 R R R R R R R R R三甲氧苄氨嘧啶 R R R R R R R R R四环素 R R R R R R R S S万古霉素 S S S S S S S R R

表11 盲肠细菌特性培养物的处理对3日龄和10日龄焙烤用雏鸡的盲肠内容物中丙酸浓度的影响¹。

试验2 试验3 试验4组第3天第10天第3天第10天第3天第10天对照组 .61±.58 1.82±.61 .68±.60 2.46±.93 .54±.58 2.67±0.88处理组 21.28±15.75* 27.64±10.15* 16.85±8.14* 27.01±9.48* 20.73±10.78* 47.75±12.4*¹数值为10只雏鸡的均值±SD和mmol/g盲肠内容物。*与对照组比显著性差异(p＜0.005)

表12 盲肠细菌特性培养物的处理对3日龄和10日龄焙烤用雏鸡的盲肠内容物中总挥发性脂肪酸浓度的影响¹。

试验2 试验3 试验4组第3天第3天第3天第10天第10天第10天对照组 9.03±2.30 73.01±6.43 14.03±6.75 52.87±16.98 16.66±2.71 71.95±16.25处理组 14.75±5.80** 80.84±20.69 45.60±8.05** 69.14±23.04* 50.67±22.59** 107.03±28.63*¹数值为10只雏鸡的均值±SD和mmol/g盲肠内容物。^*与对照组比显著性差异(p＜0.005)表13 盲肠细菌特性培养物的处理对10日龄焙烤用雏鸡的盲肠内容物中鼠伤寒沙门菌数目的影响¹。

每克盲肠内容物中沙门氏菌log₁₀值组试验1 试验2 试验3 试验4对照组 6.35±0.99¹ 6.28±0.53 4.11±2.15 6.37±0.60处理组 0±0* 0.89±1.50* 0.27±0.69* 0.60±0.75*¹数据表示为20只雏鸡的X±SD.^*与对照组比显著性差异(p＜0.005)表14 盲肠细菌特性培养物的处理对10日龄烤肉用雏鸡盲肠培养呈鼠伤寒沙门氏菌阳性的数目的影响¹。

沙门氏菌培养呈阳性雏鸡/雏鸡总数 (％)组试验1 试验2 试验3 试验4对照组 20/20(100) 20/20(100) 18/20(90) 20/20(100)处理组 0/20(0)* 7/20(35)* 3/20(15)* 8/20(40)*^*与对照组比显性差异(p＜0.01)¹数值为10只雏鸡的均值±SD和mmol/g盲肠内容物。^*与对照组比显著性差异(p＜0.005)¹数值为10只雏鸡的均值±SD和mmol/g盲肠内容物。^*与对照组比显著性差异*＝(p＜0.005)；**＝(p＜0.01)

Claims

1、一种抑制禽类沙门氏菌移生的组合物，包括生物学基本纯化的细菌种群，所述的细菌基本包括下列所有的细菌：

I.兼性厌氧菌，革兰氏阳性球菌：

(1)第一粪肠球菌菌株，

(2)第二粪肠球菌菌株，

(3)第一faecium肠球菌菌株，

(4)第二faecium肠球菌菌株，

(5)第三faecium肠球菌菌株，

(6)avium肠球菌，

(7)第三粪肠球菌菌株，

II.兼性厌氧菌，革兰氏阳性球杆菌：

(8)lactis乳酸球菌，

(9)第一乳酸杆菌菌株，

III.兼性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(10)第一大肠杆菌菌株，

(11)弗氏柠檬酸菌，

(12)一种属于肠杆菌科的细菌，

(13)一种假单胞菌属的菌种，

(14)液化沙雷氏菌，

(15)第二大肠杆菌菌株，

IV.专性厌氧菌，革兰氏阳性杆菌：

(16)第一丙酸杆菌的菌种，

(17)第二丙酸杆菌的菌种，

(18)第二乳酸杆菌的菌株，

(19)第一双歧杆菌的菌株或第三乳酸杆菌的菌株，

(20)第三丙酸杆菌的菌株，

(21)第一真细菌的菌株，

(22)第二真细菌的菌株，

(23)一种标为OAGPB-5的未知细菌菌株，

(24)第三真细菌的菌株，

(25)第二双歧杆菌的菌株或第四乳酸杆菌的菌株，

(26)第三双歧杆菌的菌株或第五乳酸杆菌的菌株，

(27)第四丙酸杆菌的菌株，

V.专性厌氧菌，革兰氏阴性球菌：

(28)一种韦永球菌的菌种，和

VI.专性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(29)一种梭形杆菌属菌种。

2、权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括ATCC保存号55515的细菌，和/或

所述组合物包括26种所述的细菌，和/或

所述组合物包括27种所述的细菌，和/或

所述组合物包括28种所述的细菌，和/或

所述组合物包括所有的所述细菌，和/或

所述组合物进一步包括乳糖，和/或

所述组合物进一步包括无抗革兰氏阳性菌活性的抑球虫剂，和/或

所述组合物进一步包括载体，和/或

所述组成的所述细菌制成胶囊。

3、一种饲料产品，它包含与权利要求1中所述组合物相结合的动物饲料。

4、一种抑制禽类沙门氏菌移生的方法，包括给禽类施用一种组合物，所述组合物包括生物学基本纯化的细菌的种群，所述细菌包括基本上下列所有的：

I.兼性厌氧菌，革兰氏阳性球菌：

(1)第一粪肠球菌的菌株，

(2)第二粪肠球菌的菌株，

(3)第一faecium肠球菌的菌株，

(4)第二faecium肠球菌的菌株，

(5)第三faecium肠球菌的菌株，

(6)avium肠球菌，

(7)第三粪肠球菌的菌株，

II.兼性厌氧菌，革兰氏阳性球杆菌：

(8)lactis乳酸球菌，

(9)第一乳酸杆菌的菌株，

III.兼性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(10)第一大肠杆菌的菌株，

(11)弗氏柠檬酸菌，

(12)一种属于肠杆菌科的细菌，

(13)一种假单胞菌属的菌种，

(14)液化沙雷氏菌，

(15)第二大肠杆菌的菌株，

IV.专性厌氧菌，革兰氏阳性杆菌：

(16)第一丙酸杆菌种的菌种，

(17)第二丙酸杆菌的菌种，

(18)第二乳酸杆菌的菌株，

(19)第一双歧杆菌的菌株或第三乳酸杆菌的菌株，

(20)第三丙酸杆菌的菌株，

(21)第一真细菌的菌株，

(22)第二真细菌的菌株，

(23)一种标为OAGPB-5的未知细菌菌株，

(24)第三真细菌的菌株，

(25)第二双歧杆菌的菌株或第四乳酸杆菌的菌株，

(26)第三双歧杆菌的菌株或第五乳酸杆菌的菌株，

(27)第四丙酸杆菌的菌株，

V.专性厌氧菌，革兰氏阴性球菌：

(28)一种韦永球菌的菌株，

VI.专性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌：

(29)一种梭形杆菌的菌株。其中所述组合物以抑制沙门氏菌在所述禽类肠道中的移生有效的剂量施用。

5、权利要求4中所述的方法，其中所述组合物包括ATCC保存号55515的细菌，和/或

所述组合物包括26种所述的细菌，和/或

所述组合物包括27种所述的细菌，和/或

所述组合物包括28种所述的细菌，和/或

所述组合物包括所有的所述细菌。

6、权利要求4中所述的方法，其中所述的禽类为家禽。

7、权利要求6中所述的方法，其中所述的家禽选自包括鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和鹅的一组动物，和/或其中所述的家禽小于约14日龄。

8、权利要求4中所述的方法，进一步包括给所述的禽类施用乳糖，和/或施用对抗革兰氏阳性菌基本无活性的抑球虫剂。

9、权利要求4中所述的方法，其中所述的细菌种群与载体一起施用，和/或其中所述的细菌被胶囊化。

10、权利要求4中所述的方法，其中施用的步骤包括口服该细菌种群至所述家禽中，优选与家禽的饲料和/或饮水结合，和/或将该细菌种群喷洒在所述家禽上，和/或将该细菌种群与家禽的泄殖腔接触。

11、一种用于分离可有效用于抑制沙门氏菌在家养动物中移生的利生菌的方法，包括：

(a)将成年家养动物的粪便、盲肠内容物或大肠内容物接种至培养基中，并在无氧条件下以成批培养的形式温育，以提供一种中间培养物，

(b)将该中间培养物以连续培养形式温育，并在周转率约为0.029至0.10小时^-1，pH约为4.7至6.5和无氧条件下连续温育充足的时间以建立稳态，和

(c)从步骤(b)中回收稳态培养物。

12、权利要求11中所述的方法，进一步包括：

(d)筛选从(c)中回收的稳态培养物对沙门氏菌在所述家养动物中移生的抑制作用。

13、权利要求11中所述的方法，其中所述的家畜为家养动物为家禽。

14、权利要求11中所述的方法，其中所述成批培养的温育步骤持续6-18小时，和/或

所述成批培养在pH5.5左右维持，和/或

所述成批培养的温育步骤持续直至光密度达到至少1.0左右，和/或

所述成批培养的温育步骤在pH达到约4.2后，只继续不超过2小时左右，和/或

在所述连续培养中周转率为约0.0416小时^-1并且所述pH约5.5，和/或

所述成批培养的pH值不低于4.2，和/或

所述成批培养和连续培养的温度约在26℃至47℃之间。

15、权利要求11中所述的方法，其中所述培养基含有乳糖。

16、权利要求12中所述的方法，其中筛选步骤包括：

(1)提供受试的家养动物并给其施用取自(c)的稳态培养物；

(2)提供未经处理的对照动物；

(3)饲养受试和对照动物2-3天；

(4)测定受试和对照动物盲肠内容物中丙酸和总挥发性脂肪酸的浓度；

(5)比较受试动物和对照动物中丙酸浓度和总挥发性脂肪酸浓度；

其中所述的稳态培养物被确定可有效用于抑制沙门氏菌在家养动物中的移生，条件是当：

(1)受试动物中丙酸的浓度超过或等于约10mmol/g盲肠内容物时，和/或

(2)受试动物总挥发性脂肪酸浓度超过对照动物约100％或更多时。

17、权利要求16中所述的方法，其中总挥发性脂肪酸浓度包括乙酸加丙酸加丁酸加异丁酸加戊酸加异戊酸的浓度。

18、通过权利要求12方法产生的利生菌。

19、一种方法，它用于筛选可作为利生菌用于有效抑制沙门氏菌在家养动物中的移生的细菌组合物，包括：

(a)提供受试的家养动物和给其施用待试细菌组合物；

(b)提供未经处理的对照动物，

(c)饲养受试和对照动物2-3天，

(d)测定受试和对照动物盲肠内容物中丙酸和总挥发性脂肪酸的浓度；并且

(e)比较受试和对照动物中丙酸浓度和总挥发性脂肪酸浓度；其中所述的细菌组合物被确定可有效用于抑制沙门氏菌在家养动物中的移生，条件是当：

(1)受试动物中丙酸的浓度超过或等于约10mmol/g盲肠内容物时，和(或)

20、权利要求19中所述的方法，其中总挥发性脂肪酸浓度包括乙酸加丙酸加丁酸加异丁酸加戊酸加异戊酸的浓度。

21、权利要求19中所述的方法，其中所述的动物为家禽。

22、一种细菌组合物，它可有效地抑制通过权利要求19方法产生的家养动物的沙门氏菌的移生。