HUT74951A - Probiotic for control of salmonella - Google Patents

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.

Probiotikus készítmények szalmonella-fertőzés megelőzésére

A találmány tárgyát meghatározott összetételű probiotikus baktériumtenyészetek képezik, melyek alkalmasak háziállatokban, ezen belül szárnyasokban, különösen pedig csirkékben, szalmonellával történő kolonizáció megelőzésére. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti probiotikus készítményeket tartalmazó állati tápszerek, valamint a probiotikus készítmények előállítására szolgáló eljárások.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható szalmonella fertőzés (kolonizáció) kialakulásának megelőzésére szárnyasokban, elsősorban baromfiakban.

A kutatók és közegészségügyi szervek erőfeszítései ellenére a humán szalmonellózis előfordulási aránya az utóbbi húsz évben emelkedett. A ténylegesen bejelentett humán esetek száma évente meghaladja a 40 000-et. A Communicable Disease Center (fertőző betegségeket nyilvántartó központ) becslései szerint azonban, a humán szalmonella-fertőzések valódi előfordulása az Amerikai Egyesült Államokban évente elérheti a 2-4-milliót. A humán fertőzések elsődleges for

Aktaszámunk: 83912-8245/PÁ ········ ·· ·· ·· ·· · ·· ·· · • ··· · · ··· • · · · · « rását ma is az állati eredetű élelmiszerek, ezen belül baromfiak képezik.

Az alábbiakban ismertetjük a technika korábbi állása szerinti ismereteinket.

A környezetben a szalmonella széles körű elterjedtségének következtében valószerűtlen, hogy a baromfikat a szalmonellával történő találkozástól teljesen meg tudnánk védeni. Ezért a kutatók folyamatosan vizsgálják annak a lehetőségeit, hogy a szalmonella-fertőzésnek kitett baromfikban a kolonizációval szemben fokozott rezisztenciát hozzanak létre. A vizsgálatok vakcinák kifejlesztésére, a fertőzéssel szemben védő normális bélflóra létrehozására, valamint olyan tápadalékok azonosítására irányultak, amelyek képesek gátolni a szalmonella szaporodását és az azzal történő kolonizációt. A gazdaszervezet immunitásának szerepe a szalmonella-kolonizációval szembeni védekezésben tisztázatlan, és az is bizonytalan, hogy az immunválasz stimulálása hatékony lenne-e a szalmonella-kolonizációval szembeni rezisztencia fokozására. A kísérleti vakcinákról nem bizonyosodott be, hogy egyértelműen hatékonyak lennének.

Közlemények alapján jól ismert, hogy a normális mikrobiális bélflóra fokozza a szalmonella-kolonizációval szembeni rezisztenciát. Fiatal csirkék orális úton történő fertőzése felnőtt csirkék cekális bennékéből vagy ürülékéből előállított mikroflórát tartalmazó, probiotikus tenyészeteknek is nevezett anaerob baktériumtenyészetekkel hatékonyan csökkentette a szalmonella-kolonizációt, (probiotikus tenyészeteknek a leírásban olyan baktériumtenyészet• · ·

- 3 eket nevezünk, amelyek az adott állatban, amelynek azokat beadjuk, előnyös hatást fejtenek ki) [ Snoeyenbos és mtsai.: Avian Dis. 23, 904 (1979); Schneitz és mtsai.: Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B. 89, 109 (1981); valamint Stravic és mtsai.: J. Food Prot. 48, 778 (1985)] . Ezzel szemben, az olyan baromfi-tenyésztési gyakorlat, amely megakadályozza a csirkéknek a fenti cekális anaerobokkal történő kolonizációját, a csirkéket sokkal fogékonyabbá teszi a szalmonellakolonizációval szemben [Pivnick és mtsai.: J. Food Prot. 44, 909 (1981)] . Az említett probiotikus tenyészetek oly módon csökkenthetik a szalmonella-kolonizációt, hogy gyorsan kolonizálják a fiatal csirkék béltraktusát [ Pivnick és mtsai.: lásd fenn], és versengenek a bélfalon a megtapadást lehetővé tevő helyekért [ Snoeyenbos és mtsai.: lásd fenn] , vagy oly módon, hogy az enteropatogén baktériumok szaporodását gátló bakteriosztatikus vagy baktericid hatású rövid láncú illő zsírsavakat termelnek [ Barnes és mtsai.: J. Hyg. Camb. 82, 263 (1979); és Am. J. Clin. Nutr. 33, 2426 (1980); Corrier és mtsai.: Avian Dis. 34, 668 (1990); és

Avian Dis. 34, 617 (1990); valamint Hinton és mtsai.: Avian Dis. 34, 626 (1990)] .

A szalmonellák szaporodásának gátlására azonban, csak az olyan normális mikroflórát tartalmazó tenyészetek bizonyultak hatékonynak, amelyek több száz különböző mikroorganizmusból álló kevert populációt tartalmaztak. Több európai országban a szalmonella-kolonizáció megelőzésére széles körben alkalmazzák azt az eljárást, amely szerint egy napos csirkékben mikroorganizmusok kevert tenyészetével normális • · • · · · · · · · ♦ ··· · · ··· • · · · · ·

- 4 bélflórát hoznak létre. Mivel azonban a kevert tenyészetben jelen levő mikroorganizmusok száma és típusa nem meghatározott, a rendszert az amerikai egyesült államokban nem fogadták el széles körben. A fenti eljárás széles körű alkalmazását többek között hátráltatja az a tény, hogy a termék összetétele nem standardizálható, és az az összetétel vagy a hatékonyság megváltozása nélkül nagy mennyiségben nem tárolható és nem állítható elő. Ezen felül, mivel a kiindulási anyagot mindig felnőtt szárnyas béltartalma képezi, a készítmény tartalmazhat olyan kórokozó vírusokat, baktériumokat vagy parazitákat, amelyek a csirkék egészségére veszélyesek lehetnek. Ezen felül, az U. S. Food & Drug Administration (amerikai egyesült államokbeli élelmiszerés gyógyszerellenőrző hivatal) az utóbbi időben megköveteli a nem meghatározott összetételű tenyészetek engedélyeztetését .

Nemrégiben közölték, hogy a csirkék táplálékához vagy ivóvizéhez adott laktóz vagy más tej cukor-tartalmú termék fokozza a szalmonella-kolonizációval szembeni rezisztenciát [ Oyofo és mtsai.: Avian Dis . 33, 531 (1989); és Polultry

Sci. 68, 1357 (1989); Corrier és mtsai.: lásd fenn; valamint Hinton és mtsai.: lásd fenn] . A táplálékban található laktóz fokozza a cekális bennék aciditását, és befolyásolja a normális bélflóra szaporodását, valamint annak fermentációs termékeit. A laktózzal kiegészített táplálék fokozhatja a szalmonella-kolonizációval szembeni rezisztenciát úgy is, hogy fokozza egyes, a normális bélflórához tartozó baktériumok által termelt rövid láncú illő zsírsavak, például • ·

- 5 ecet-, propion- és vajsavak bakteriosztatikus hatását [Corrier és mtsai.: lásd fenn; Hinton és mtsai.: lásd fenn] .

A csirkékben a szalmonella-kolonizációval szembeni rezisztencia fokozódott továbbá akkor is, amikor a csirkéknek laktóz-tartalmú táplálék és laktóz-tartalmú levestáptalajban szaporított cekális anaerobok tenyészetének kombinációját adták [Corrier és mtsai.: lásd fenn, Hinton és mtsai.: lásd fenn] .

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást .

A találmány tárgyát meghatározott összetételű probiotikus tenyészetek képezik, közelebbről, a találmány tárgyát szárnyasokban szalmonella-kolonizáció megakadályozására vagy gátlására képes baktérium-tartalmú készítmények képezik. A probiotikus tenyészet lényegében biológiailag tiszta, meghatározott baktériumpopulációkat vagy baktériumtenyészeteket tartalmaz. A következő baktériumnemzetségekhez vagy baktériumfajokhoz tartozó törzseket alkalmaztuk :

Enterococcus faecalis,

Enterococcus faecium,

Enterococcus avium,

Lactococcus lactis,

Lactobacillus,

Escherichia coli

Citrobacter freundii,

Pseudomonas • ·

- 6 Serratia liquefaciens,

Propionibacterium,

Bifidobacterium (vagy Lactobacillus),

Eubacterium,

Veillonella, és

Fusobacterium, valamint egy, az Enterobacteriaceae családhoz tartozó egyéb baktériumot, és egy 0AGPB-5-törzsnek nevezett ismereten baktériumot.

A gyakorlatban a probiotikus tenyészetet olyan mennyiségben adjuk be az adott szárnyasnak, amely hatékonyan gátolja annak szalmonellával történő kolonizációját. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a szalmonella-kolonizáció fokozott gátlását úgy érjük el, hogy a probiotikus tenyészetbe laktózt teszünk. Az említett probiotikus tenyészet szokásos táplálékkal is kombinálható, ezáltal olyan új táp-készítményt nyerünk, amelyet a szárnyas orálisan vehet fel.

A találmány tárgyához tartozik ezen felül új eljárás felnőtt állatok ürülékéből, cekális bennékéből vagy vastagbél-bennékéből olyan probiotikus tenyészetek izolálására, amelyek hatékonyak háziasított állatokban, ezen belül szárnyasokban szalmonella-kolonizáció megakadályozására vagy gátlására. Az ürüléket vagy cekális bennéket vagy béltartalmat tápfolyadékkal vagy tenyésztőfolyadékkal elegyítjük, majd hígítás nélkül (azaz, zárt rendszerű tenyészetben) , anaerob körülmények mellett inkubáljuk. A fenti előinkubálást követően a kapott tenyészetet folyamatos ára····«·»· · · · · ·· * · · ·· ·« * • ··· · « ··· • · · · · ·

- 7 moltatásos körülmények mellett tenyésztjük, amíg a stacioner állapotot el nem érjük, ezután a stacioner fázisú tenyészetet probiotikus tenyészetként történő alkalmazás céljára kinyerjük.

Ezen felül a találmány tárgyát képezi szárnyasokban szalmonella-kolonizáció gátlására alkalmazható továbbfejlesztett eljárások és készítmények kifejlesztése.

A találmány tárgyát képezik továbbá, olyan meghatározott összetételű, szárnyasokban szalmonella-kolonizáció gátlására képes, anaerob-baktériumokat tartalmazó tenyészetek, amelyek könnyen standardizálhatok.

A találmány tárgyához tartozik továbbá, továbbfejlesztett eljárás olyan probiotikus tenyészetekként alkalmazható baktérium-tartalmú készítmények izolálására, amelyek háziasított állatokban, közelebbről szárnyasokban képesek szalmonella-kolonizáció gátlására.

A találmány további céljai és előnyei világosak lesznek a következő leírás alapján.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány szerinti probiotikus tenyészetek szárnyasokban, az azoknak történő adagolást követően hatékonyan gátolják a szalmonella-kolonizációt oly módon, hogy a baromfi-populációban csökkentik az átlagos szalmonellakoncentrációt, és/vagy csökkentik a kórokozóval kolonizálódott baromfik százalékos arányát. A találmány szerinti megoldás bármely szárnyasfaj esetében alkalmazható, például, de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, al···· ·«.*· ·ν «V »« • · · · » · · » • ··· · · · » · • ♦ · · · · .- 8 kalmazható a következő baromiakban: csirkékben, pulykákban, kacsákban, fürjekben és libákban. A beadást követően a probiotikus tenyészet megbízható védettséget hoz létre különböző szalmonellákkal, elsősorban S. typhimuriuinmal és S. enteritidisszel szemben.

A probiotikus tenyészetet szalmonella-mentes csirkék cekumából állítottuk elő. Amint azt az 1. példában részletesen leírjuk, a csirkék cekumát eltávolítottuk, megfelelő tápfolyadékba oltottuk, majd anaerob körülmények mellett, zárt rendszerű tenyészetben inkubáltuk. Ezt követően a tenyészeteket folyamatos áramoltatásos tenyésztési feltételek és meghatározott ütemű tápfolyadékcsere mellett tenyésztettük, amíg a stacioner vagy egyensúlyi állapotot el nem értük. Amikor a kapott stacioner tenyészetet kinyertük és szárnyasoknak beadtuk, az probiotikus tenyészetként szignifikánsan hatékonynak bizonyult a kezelt madarak szalmonellával történő kolonizációjának gátlására.

Az analízis során a stacioner tenyészetből 29, lényegében tiszta baktérium-izolátumot nyertünk, ezen belül 15 fakultatív anaerobot és 14 obiigát anaerobot. A meghatározás szerint, a tenyészet összetétele a következő volt:

I. Fakultatív anaerob, Gram-pozitív coccusok:

(1) egy első Enterococcus faecalis törzs, (2) egy második Enterococcus faecalis törzs, (3) egy első Enterococcus faecium törzs, (4) egy második Enterococcus faecium törzs, (5) egy harmadik Enterococcus faecium törzs, (6) Enterococcus avium • · · (7) egy harmadik Enterococcus faecalis törzs,

II. Fakultatív anaerob, Gram-pozitív coccobacillusok:

(8) Lactobacillus lactis, (9) egy első Lactobacillus törzs,

III. Fakultatív anaerob, Gram-negatív bacillusok:

(10) egy első Escherichia coli törzs, (11) Citrobacter freundii, (12) egy, az Enterobacteriaceae családba tartozó baktérium, (13) egy Pseudomonas species, (14) Serratia liquefaciens, (15) egy második Escherichia coli törzs,

IV. Obiigát anaerob, Gram-pozitív bacillusok:

(16) egy első Propionibacterium species, (17) egy második Propionibacterium species, (18) egy második Lactobacillus törzs, (19) egy első Bifidobacterium törzs vagy egy harmadik

Lactobacillus törzs, (20) egy harmadik Propionibacterium törzs, (21) egy első Eubacterium törzs, (22) egy második Eubacterium törzs, (23) egy ismeretlen, OAGPB-5-jelű baktérium, (24) egy harmadik Eubacterium törzs, (25) egy második Bifidobacterium törzs vagy egy negyedik Lactobacillus törzs, (26) egy harmadik Bifidobacterium törzs vagy egy ötödik

Lactobacillus törzs, (27) egy negyedik Propionibacterium törzs, ···· ···· ··* ,·*♦ ·

-ιόν. Obiigát anaerob, Gram-negativ coccousok:

(28) egy Veillonella species, és

VI. Obiigát anaerob, Gram-negativ bacillusok:

(29) egy Fusobacterium species.

A mind a 29 fenti baktériumtörzset tartalmazó készítményt a Budapesti Szerződés értelmében CF3 Competitive Exclusion Culture megnevezéssel letétbe helyeztük az American Type Culture Collection intézetében (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA), ahol az az ATCC 55515 nyilvántartási számon szerepel. Az egyes törzsek jellemzését az 1. és 2. példákban adtuk meg.

A kapott stacioner tenyészetet alkalmazhatjuk közvetlenül probiotikus tenyészetként, vagy tárolhatjuk későbbi felhasználásig. Az utóbbi esetben, a tenyészet tárolható a fenti elegyként, vagy az egyes baktériumok izolálhatok, tárolhatók, majd utólag összekeverhetők.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a probiotikus tenyészet az 1. és 2. példákban leírt, letétbe helyezett stacioner tenyészetet alkotó baktériumokat tartalmazza. A találmány egy további megvalósítási módja szerint azonban, számos olyan baktérium alkalmazható, amelyeket ismert vagy standard törzsekből, vagy szárnyasokból származó izolátumokból nyerhetünk. Például, de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, a példákban ismertetett, letétbe helyezett probiotikus tenyészetet alkotó törzsek egy vagy több, azonos nemzetségbe vagy fajba tartozó más törzzsel helyettesíthetők, amelyek a következők lehetnek: Enterococcus, Lactococcus, E. coli, Citrobacter, ···· ···· ·· ,·*» · · • · . · ···

- ii Pseudomonas, Serratia, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Veillonella, Fusobacterium, és különösen a Lactobacillus. Ismert törzsekhez tartozó törzstenyészet alkalmazása esetén, a baktériumokat a szárnyasokban történő passzálással - előnyösen a stacioner tenyészetből származó többi organizmussal együtt - adaptálhatjuk a madarakhoz, majd azokat az ürülékből vagy cekális bennékből visszanyerjük és izoláljuk. Amennyiben szárnyasból származó izolátumokat alkalmazunk, a baktériumokat a felnőtt szárnyas ürülékből vagy cekális bennékéből egyenként izolálhatjuk és kinyerhetjük a technika állása szerint ismert módszerekkel, vagy DeLoach eljárása szerint [ 07/822 505 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi irat] , amelyek teljes terjedelmük a kitanítás részét képezik.

Nyilvánvaló az is, hogy a találmány szerinti megoldás alkalmazható a fent említett 29 törzsnél kevesebbet tartalmazó probiotikus tenyészet esetében is, és a fenti probiotikus tenyészetből egy, két vagy három baktérium kihagyható úgy, hogy annak hatékonysága csak kis mértékben csökken. Például, de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, a pseudomonas vagy az elterjedtebb baktériumokhoz tartozó törzsek - azaz, azok a nemzetségek, amelyeknek több törzse vagy faja van jelen - kihagyhatok a probiotikus tenyészetből anélkül, hogy a hatékonyság lényegesen csökkenne. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint azonban, a szalmonella-kolonizáció optimális gátlása olyan probiotikus tenyészettel érhető el, amely mind a 29 törzset tartalmazza.

........ .··. .··. . .

• ·.. . · ··· • ···. . · ·

- 12 A találmány szerinti egyes baktériumtörzsek kiválaszthatók az adott szárnyas emésztőtraktusának epitheliális sejtjeihez történő tapadás képessége alapján is Nurmi és munkatársai eljárása szerint [ 4 69 226 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] , amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.

A találmány tárgyát képezi továbbá új eljárás különböző háziállatokban - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, szárnyasokban, valamint lovakban, sertésben és szarvasmarhában - szalmonellával történő kolonizáció megakadályozására vagy gátlására alkalmazható probiotikus tenyészetek előállítására. Ahelyett, hogy ismert törzstenyészetekből vagy tiszta baktériumizolátumokból állítanánk elő probiotikus tenyészetet, váratlanul azt találtuk, hogy stabil, meghatározott összetételű probiotikus tenyészet nyerhető közvetlenül felnőtt korú célzott állatok ürülékéből, cekális bennékéből és/vagy vastagbél-bennékéből. A találmány szerinti eljárásban az ürüléket, cekális bennéket vagy vastagbél-bennéket először zárt rendszerű tenyészet beoltására használjuk, majd meghatározott ütemű tápfolyadékcsere és pH mellett folyamatos áramoltatásos körülmények mellett tenyésztjük a stacioner vagy egyensúlyi állapot eléréséig. A kapott stacioner tenyészet probiotikus tenyészetként történő alkalmazás céljára kinyerhető. A leírásban cekális bennéknek a cekum belsejében található anyagot, valamint természetesen a teljes cekumban, ezen belül annak részeiben, például a nyálkahártyarétegben található anyagot nevezzük.

- 13 A zárt rendszerű előtenyészet előállítása bármely szokásos fermentorban végezhető. Előnyös azonban hígítás nélkül működő kemosztát alkalmazása, (azaz, friss tápfolyadék hozzáadása és az elhasználódott tápfolyadék eltávolítása nélküli fermentáció), hogy elkerüljük a tenyészet átoltásának szükségességét a következő munkafolyamat előtt, valamint csökkentsük a tenyészet kontaminációjának veszélyét. Az állatból származó cekális bennéket vagy vastagbélbennéket vagy az állat ürülékét, melyet inokulumként kívánunk használni, az összegyűjtést követően megfelelő tápfolyadékkal elegyítjük, és anaerob körülmények mellett inkubáljuk. A fenti zárt rendszerű előtenyésztést az alábbi paraméterek figyelembe vételével folytatjuk:

(1) körülbelül 6-18 óráig, előnyösen körülbelül 12-18 óráig, vagy (2) amíg a 600 nm-en mért fényelnyelés körülbelül 1,0es értéket ér el, és/vagy (3) legfeljebb 2 órán át azután, hogy a pH körülbelül 4,2-es értéket ért el;

ezután a zárt rendszerű tenyésztést befejezzük, és folyamatos tenyésztést indítunk el. Amennyiben az inkubációs időt az (1.)- vagy különösen a (2.)-számú feltételekkel határozzuk meg, előnyös a pH-t a technika állása szerint szokásos módon egy pH-szabályozó készülék segítségével körülbelül pH=5,5 értéken tartani. Abban az esetben, ha a fenti pH-szabályozást nem alkalmazzuk, a sejtek egy része pusztulásának megakadályozása céljából a zárt rendszerű tenyészet ···· ···· • ·

- 14 inkubálását előnyösen csak addig folytatjuk, amíg a pH nem csökken körülbelül 4,2 alá.

A zárt rendszerű tenyésztés befejezését követően kemosztátban azonnal folyamatos tenyészetet indítunk meg friss tápfolyadék folyamatos bejuttatása és az elhasznált tápfolyadék eltávolítása mellett. Alkalmas kemosztátok könnyen meghatározhatók, ilyenek például a Wang által leírtak [ Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley & Sons, New York, 98-137 (1979), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi] . Meglepő módon, az elegy folyamatos tenyészetben történő szaporítása meghatározott hígítás vagy meghatározott ütemű tápfolyadékcsere, valamint meghatározott pH-érték mellett lehetővé teszi, hogy a tenyészet stacioner vagy egyensúlyi fázist érjen el. Az inokulum forrásaként alkalmazott állattól, az adott táptalajtól és tenyésztési körülményektől függően az eredetileg jelen levő baktériumok száma viszonylag kevés, lényegében biológiailag tiszta, könnyen meghatározható baktériumfajtát tartalmazó stabil tenyészetre csökkenthető. Szárnyasok alkalmazása esetén például, az inokulumban eredetileg jelen levő körülbelül 500 baktérium száma úgy csökkenthető, hogy körülbelül 10-40 baktériumot tartalmazó stabil tenyészetet kapjunk. Ebben a tenyésztési fázisban például a következő körülményeket alkalmazhatjuk: a tápfolyadékcsere üteme: óránként körülbelül 0,029-0,10, előnyösen óránként körülbelül 0,0416; és a pH= körülbelül 4,7-6,5, előnyösen körülbelül 5,5.

A zárt rendszerű tenyészet és folyamatos tenyészet készítésénél alkalmazott hőmérséklet, valamint a tápfolyadék milyensége nem döntő fontosságú, és a fenti körülmények könnyen meghatározhatók. A megfelelő hőmérséklet körülbelül 26-47 °C között lehet. Ezen felül alkalmazhatunk különböző, eltérő energiaforrásokat tartalmazó tápfolyadékokat is. Anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, előnyös energiaforrások a glükóz vagy galaktóz, és különösen a laktóz.

A stacioner fázis beálltát akkor állapíthatjuk meg, amikor a tenyészet pH-ja, 600 nm-en mért fényelnyelése (OD₆₀₀ ) , és illő zsirsav-koncentráció j a körülbelül állandó értéket ér el. Miután a stacioner fázist elértük, a tenyészetet a fent ismertettek szerint bármikor kinyerhetjük és felhasználhatjuk. Ideális esetben, a stacioner fázisú tenyészetet a technika állása szerint ismert módszerek alkalmazásával, az abban található baktérium-populációk izolálásával és identifikálásával jellemezzük vagy meghatározzuk. Az izolálást követően a baktériumok a későbbi felhasználásig ismert technikákkal korlátlan ideig tárolhatók, amint azt például a 07/921 173 számú, jelen bejelentés előzményét képező szabadalmi bejelentésben ismertetjük (a bejelentés napja: 1992. július 29.). Szakember számára világos, hogy a fent ismertetett zárt rendszerű / folyamatos rendszerű tenyésztési eljárás úgy is végezhető, hogy kiindulási inokulumként izolált vagy biológiailag tiszta baktériumokat alkalmazunk.

···· ····

- 16 A találmány szerinti eljárással előállított stacioner tenyészeteket adott esetben megvizsgálhatjuk, hogy kiválaszszuk azokat a készítményeket, amelyek a szalmonellakolonizáció gátlása szempontjából a célzott állatban optimális hatékonysággal rendelkeznek. A találmány egy megvalósítási módja szerint, az vizsgálatot végezhetjük szalmonellával történő kísérletes fertőzéssel in vivő, amint az technika állása szerint szokásos, és amint azt a 3. és 4. példák ismertetik. Röviden, a stacioner tenyészetet a leírtak szerint szalmonellától mentes állatoknak adjuk be. Adott idő, rendszerint 2-3 nap elteltével, amely elegendő a tenyészetnek a bélben történő elszaporodásához, az állatokat élő szalmonella tenyészettel kísérletesen fertőzzük, inkubáljuk, végül elöljük, és a cekális bennékeket szalmonella-kolonizációra nézve analizáljuk. A kezelt populációban a szalmonella-kolonizáció gátlásának hatékonyságát a kezeletlen kontrollokhoz képest a szalmonella-koncentráció (colony forming unit, CFU, telepképző egységek) átlagának csökkenése vagy a kolonizálódott állatok százalékos arányának csökkenése jelzi.

Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással vagy bármely más eljárással előállított probiotikus tenyészetek úgy is vizsgálhatók in vivő, hogy a cekumban analizáljuk az illó zsírsavak (volatile fatty acid, VFA) profilját. Ehhez az eljáráshoz nincs szükség a szokásos, élő szalmonellával történő kísérletes fertőzésre. Valamely tenyészet hatékonyságát úgy határozhatjuk meg, hogy azt a célzott állatnak beadjuk, és a tenyészetet a fent leírtak szerint, ••·· ·«·· • · · • ··· . · ·

- 17 hagyjuk megtelepedni a bélben. A kezelést követően 2-3 nappal, előnyösen a 3 napon, az állatokat leöljük, és a cekális bennékekben meghatározzuk a propionsav és az összes illő zsírsav (ecet- és propionsav, vajsav, izovajsav, valeriánsav és izovaleriánsav) koncentrációját. A zsírsavak meghatározására alkalmazható technikák ismertek, ilyen például a Corrier és munkatársai által leírt gáz-folyadék-kromatográfiás eljárás [ Avian Dis. 34, 617 (1990)] , amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Egy probiotikus tenyészet akkor mondható szalmonella-kolonizáció szempontjából hatékonynak, ha:

(1) a cekális bennékben propionsav-koncentráció nagyobb, mint körülbelül 10 mmól/g, vagy azzal egyenlő; és/vagy (2) az össz-illózsírsavkoncentráció körülbelül 100 %kai vagy többel nagyobb, mint a kezeletlen kontroliokban.

Bár a propionsav-koncentrációk a második napot követően határozhatók meg, a hatékonyság megítélése kevésbé megbízható, amennyiben azt az össz-zsirsavkoncentráció meghatározása alapján, a 3. napot követően végezzük.

A fent említett 29 törzsből álló probiotikus tenyészethez hasonlóan, a találmány szerinti eljárással előállított stacioner tenyészetek alkalmazhatók közvetlenül probiotikus tenyészetként vagy tárolhatók későbbi felhasználásig. Hasonlóképp, a tenyészetet alkotó baktériumokat ugyancsak izolálhatjuk és azonosíthatjuk, és a fent ismertetettek szerint, a stacioner tenyészetben található baktériumokat a megfelelő nemzetséghez vagy fajhoz tartozó ismert vagy

- 18 standard törzsekkel, vagy ugyanabból a célzott állatból származó izolátumokkal helyettesíthetjük.

A találmány szerinti probiotikus tenyészetből nagy mennyiségeket állíthatunk elő a baktériumok megfelelő tápfolyadékban, zárt rendszerű vagy folyamatos rendszerű tenyészetként történő tenyésztésével, a technika állása szerint ismert anaerob tenyésztési technikák alkalmazásával. A fentiek közül a folyamatos tenyészet előnyösebb, mivel a stacioner tenyészetek különösen stabilak, és állandó tenyésztési körülmények mellett korlátlan ideig fenntarthatok. Nagy mennyiségű tenyészet megindításához inokulumként alkalmazhatunk stacioner tenyészetből vett mintát vagy inokulumot, a letétbe helyezett tenyészeteket, vagy a baktériumok törzstenyészeteit vagy biológiailag lényegében tiszta izolátumait. A baktériumokat tenyészthetjük együtt, vagy a standardizálás megkönnyítése céljából szaporíthatjuk külön tenyésztő táptalajokban, majd később kombinálhatjuk azokat. Az utóbbi technika alkalmazása esetén, az elegyítést megelőzően valamennyi baktérium végkoncentrációjának milliliterenként körülbelül 10⁸-10⁹ között kell lennie. Szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a koncentráció nem döntő fontosságú, és az módosítható.

Általánosságban, amennyiben nagy mennyiségű termelést végzünk zárt rendszerű tenyészetben, a tenyészetet az öszszegyűjtést megelőzően körülbelül 16-72 órán át, előnyösen 24-48 órán át kell inkubálnunk. Azt találtuk azonban, hogy bármely esetben, a zárt rendszerű tenyésztést az alábbi fermentációs paraméterek eléréséig kell folytatnunk:

- 19 ΜΙ» ··’· ·* _#··< .**· » · · * · ··· • ·* · · · ·..· ...’ .........

(1) az ecetsav koncentrációja körülbelül 20 mmól/1, vagy annál nagyobb;

(2) a propionsav koncentrációja körülbelül 10 mmól/1, vagy annál nagyobb;

(3) a vaj sav és izovajsav koncentrációja körülbelül 15 mmól/1, vagy annál nagyobb.

A találmány szerinti probiotikus tenyészet alkalmazhatóságát nem befolyásolja az adott előállítási mód; bármely fent említett eljárással előállított probiotikus tenyészet azonos módon használható. Az előállítást követően a baktérium-tenyészeteket külön-külön vagy kombinációban közvetlenül beadhatjuk az adott állatnak. Adott esetben, a probiotikus tenyészetet formulázhatjuk egy gyógyászatilag elfogadható hordozó segédanyaggal - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - laktózzal vagy fölözött tejporral, vagy előkeverékként történő alkalmazás céljára kombinálhatjuk kis mennyiségű táppal. A tenyészeteket a stabil tárolás és a kezelés megkönnyítése céljából fagyasztva száríthatjuk is. Az ilyen fagyasztva szárított tenyészeteket beadhatjuk az állatoknak közvetlenül, vagy más eljárás szerint, azokat az alkalmazást megelőzően helyreállíthatjuk. Adott esetben, a baktériumok egyike vagy valamennyi a technika állása szerint ismert módszerekkel kapszulázható, például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - alginátgélbe kapszulázható. Oltalmi igényünket semmiképpen sem korlátozva bármely elmélettel, feltételezzük, hogy a kapszulázás ily módon képes megakadályozni azt, hogy egyes baktériumok a béltraktus felső ré........ ··. .··. .’*· • · · - Λ»·

- 20 szében nem kívánatos szintre csökkentsék a tej savkoncentrációt. A kapszulázás megvédheti magát a baktériumot is, és lehetővé teheti számukra, hogy elérjék a cekumot, ahol a tejsav-felhasználás előnyös.

A találmány szerinti probiotikus tenyészet további, olyan biológiailag lényegében tiszta baktériumokkal, elsősorban tej savat vagy illő zsírsavakat termelő baktériumokkal is kombinálható, amelyek probiotikus tenyészetként alkalmazva háziasított állatokban vagy szárnyasokban hatékonyan gátolják a szalmonella-kolonizációt. Anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, alkalmazhatók a Peptostreptococcus fajhoz tartozó baktériumok, vagy DeLoach által leírt baktériumok [ 07/822 505 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi irat, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi] . A probiotikus tenyészethez adhatunk egyéb, a technika állása szerint háziasított állatok vagy baromfik kezelésére, és különösen az enteropatogének gátlására alkalmazott szokásos vagy ismert adjuvánsokat is. Alkalmazható adjuvánsok például Gram-pozitív organizmusokkal szemben hatástalan coccidiosztatikumok. Különösen előnyös a laktóz hozzáadása.

A technika állása szerint szokásos módon, a háziasított állatnak vagy szárnyasnak terápiás szint alatti mennyiségben antibiotikumot is adhatunk. Az említett antibiotikumokat beadhatjuk a probiotikus tenyészettel együtt vagy külön. Más eljárás szerint, az antibiotikumokat a szárnyasnak beadhatjuk in ovo olyan mennyiségben, amely terápiás hatá-

- 21 sú, de amelynek mennyisége a kelést követően körülbelül 3 napon belül a terápiás szint alá csökken.

Bár a találmány szerinti probiotikus tenyészetet elsősorban az emésztőtraktusba adjuk be vagy juttatjuk be oly módon, hogy azt az állat táplálékával vagy vizével elegyítjük, majd szájon át bejuttatjuk, nyilvánvaló, hogy azt beadhatjuk szájon vagy orron át úgy, hogy a készítményt a technika állása szerint ismert módon spray vagy permet formájában adjuk be közvetlenül az állatnak. További eljárás szerint, azt közvetlenül a gyomor-bél-traktusba injektálhatjuk vagy a kloakába juttathatjuk. Az utóbbi esetben, a probiotikus tenyészetet közvetlenül a szárnyas végbélnyílására vagy a baromfiketrec padlóján található alomra permetezhetjük, miáltal az a baromfi normális aktivitása folytán érintkezni fog a végbélnyílás környékével. Miután az a végbélnyílás környékével érintkezett, a probiotikus tenyészet reverz perisztaltika révén bejut a kloakába.

A probiotikus tenyészetet beadására az állat élete során bármikor sor kerülhet. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint azonban, a probiotikus tenyészetet frissen kikelt szárnyasoknak adjuk be, körülbelül az 1-14 nap között.

A probiotikus tenyészetet olyan mennyiségben adjuk be, amely a kezelt állatokban a kezeletlen állatokhoz képest lényegében hatékonyan gátolja a szalmonella-kolonizációt. A megfelelő mennyiséget szakember könnyen meghatározhatja, és az az állat korától és méretétől függően változhat.

···· ···· « · • · · ·

- 22 A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

1. példa

Probiotikus tenyészet előállítása

Kiinduló inokulum: A kiinduló inokulumot három hetes korú, szalmonella-mentes broiler-csirkékből nyertük, melyeket a kikeléstől kezdve gyógyszert nem tartalmazó vizen és tápon tartottunk. A madarakat leöltük, a cekumokat aszeptikus körülmények mellett eltávolítottuk, és azonnal anaerob tartályba tettük. (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI). Valamennyi cekumot több darabra vágtunk, és egy LaboBlender-készülékkel (Tekmar, Cincinnati, OH) maceráltuk. A maceráit cekális szövetet és a cekális bennéket együtt alaposan homogenizáltuk, majd ahhoz 20 % végkoncentrációig glicerint adtunk. Végül, az így kapott cekális homogenizátum-elegyet a felhasználásig -70 °C-on lefagyasztottuk. A fagyasztott cekális homogenizátumból 10 ml-t felolvasztottunk, és anaerob körülmények mellett, 39 °C-on, 100 ml Viande Levure (VL) folyékony táptalajban inkubáltunk, ezt használtuk beoltó-tenyészetként a későbbi folyamatos áramlású (CF) tenyészethez.

Folyamatos áramlású készülék: Mind a zárt rendszerű tenyésztést, mind a folyamatos áramlású tenyésztést BioFloIII-fermentor egy-egy 1150 ml térfogatú kemosztát tartályában végeztük (New Brunswick Scientific Co. Edison, NJ).

- 23 Amikor a tenyésztést folyamatos tenyésztési körülmények mellett végeztük, a következő paramétereket alkalmaztuk:

- higitási arány: 0,0416 ¹ (0,80 ml/perc áramlási se- bességnek és 24 órás tartály-ürülési ciklusidőnek megfelelően) ;

- 39 °C-os hőmérséklet, és

- 200 ford/perc rázási sebesség.

Az anaerob körülményeket úgy tartottuk fenn, hogy a tartályt folyamatosan 0₂-mentes CO₂-dal áramoltattuk át.

A cekális organizmusok tenyésztése folyamatos áramlású körülmények mellett:

A kemosztát tartályt 1 050 ml, steril Viande Levure (VL) levestáptalajjal töltöttük fel, 100 ml beoltótenyészettel beoltottuk, majd zárt rendszerű tenyészetben, 200 ford/perc rázás és anaerob körülmények mellett 39 °C-on inkubáltuk. Miután a tenyésztést 6 órán át zárt rendszerű tenyészetben végeztük, a tápanyag-pumpát megindítottuk, és a tenyészetet folyamatos áramlású körülmények mellett inkubáltuk tovább. A stacioner körülményeket körülbelül 5 napos folyamatos áramlású tenyésztést követően értük el. A stacioner fázis beálltát akkor állapítottuk meg, amikor a tenyészet pH-ja, 600 nm-en mért fényelnyelése és illő zsírsav koncentrációja körülbelül állandó értéket ért el.

A folyamatos áramlású tenyészetből az 5. és 61. napon aszeptikus körülmények mellett mintát vettünk, és azokat 5 % szarvasmarha vérrel kiegészített triptóz-agarra, MacConkey-agarra és Center fór Disease Controlvéresagarra (CDCBA) oltottuk.

A triptóz-agar- és «··· ·♦··

MacConkey-agar-lemezeket 7 napig 37 °C-on inkubáltuk. A CDCBA-lemezeket 7 napig, 37 °C-on, 80 % nitrogént, 10 % hidrogént és 10 % szén-dioxidot tartalmazó anaerob tartályban (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI) inkubáltuk. Az 5 napos, majd a 61 napos folyamatos áramlású tenyészetből 29 baktérium-izolátumot, köztük 15 fakultatív anaerobot és 14 obiigát anaerobot azonosítottunk, amelyek 10 különböző nemzetséget képviseltek. A 29 baktérium-izolátumot a technika állása szerint ismert biokémiai és enzimatikus módszerek, valamint antimikrobiális érzékenységi profilok alkalmazásával azonosítottuk [ Holdeman és mtsai.:

Anaerobé

Laboratory

Manual, 4. kiadás,

Virginia

Polytechnic

Institute and State University,

Blacksburg,

VA (1977);

Farmer és

J. Clin. Microbiol. 21,

Lennette és mtsai.:

Clinical Microbiology, kiadás,

American Society fór Microbiology⁷', Washington, D.C.

(1985); valamint

Devriese és mtsai.: Int. J. Syst.

Bacteriol. 37, 257 (1987), amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik] .

Az eredményeket a 2. példában összegeztük.

Az alábbi baktériumokat azonosítottuk:

I. Fakultatív anaerob, Gram-pozitív coccusok:

(1) Enterococcus faecalis, amelyet M-törzsnek neveztünk, (2) Enterococcus faecalis, amelyet N-törzsnek neveztünk, (3) Enterococcus faecium, amelyet Y-törzsnek neveztünk, (4) Enterococcus faecium, amelyet Z-törzsnek neveztünk,

(5)	Enterococcus	faecium,	ame1ye t	X-törzsnek neveztünk,
(6)	Enterococcus	avi um,
(7)	Enterococcus	faecalis	törzs,	amelyet O-törzsnek ne-

veztünk,

II. Fakultatív anaerob, Gram-pozitiv coccobacillusok:

(8) Lactobacillus lactis, diacetilactis subspecies, (9) Lactobacillus species, (1. törzs),

III. Fakultatív anaerob, Gram-negatív bacillusok:

(10) Escherichia coli, amelyet CC-3A-törzsnek neveztünk, (11) Citrobacter freundii törzs, amelyet CC-3-törzsnek neveztünk, (12) egy, az Enterobacteriaceae családba tartozó baktérium, (feltételezetten egy Enterobacter species, E. coli vagy Kluyvera cryocrescens), (13) egy Pseudomonas species, (14) Serratia liquefaciens, (15) egy Escherichia coli, amelyet CC-3B-törzsnek neveztünk,

IV. Obiigát anaerob, Gram-pozitiv bacillusok:

tőén P.

(18) (19) egy Propionibacterium species, egy Propionibacterium species, granulosum), egy Lactobacillus species, (2.

egy Bifidobacterium species (1. törzs, (2 . törzs, törzs), feltehefeltehevagy egy

Lactobacillus species (3. törzs), (20) egy Propionibacterium species (3. törzs), ···· (21) egy Eubacterium species (1. törzs), (22) egy Eubacterium species (2. törzs), (23) egy ismeretlen baktérium, amelyet OAGPB-5-törzsnek neveztünk, (24) egy Eubacterium species (3. törzs), (25) egy Bifidobacterium species (2. törzs) vagy egy Lactobacillus species (4. törzs), (26) egy Bifidobacterium species (3. törzs) vagy egy Lactobacillus species (4. törzs), (27) egy negyedik Propionibacterium species (4. törzs),

V. Obligát anaerob, Gram-negatív coccousok:

(28) egy Veillonella species,

VI. Obiigát anaerob, Gram-negatív bacillusok:

(29) egy Fusobacterium species.

Az így jellemzett, 29 baktérium-izolátumot tartalmazó folyamatos áramlású tenyészetről kimutattuk, hogy az kevert tenyészetben kompatibilis szaporodású, savas környezetben (pH 5,0-6,5 között) életképes, és fermentációs végtermékként illő zsírsavakat (VFA-kat) termel.

A mind a 29 fenti baktériumtörzset tartalmazó készítményt a Budapesti Szerződés értelmében CF3 Competitive Exclusion Culture elnevezéssel letétbe helyeztük az American Type Culture Collection intézetében (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA), ahol az az ATCC 55515 nyilvántartási számon szerepel.

2. példa

A baktériumok jellemzése

Gáz-folyadék kromatográfia (gas liquid chromatograhy, GLC) Mind a 29 baktériumot CDCBA-táptalajról peptonélesztő (PY-), valamint 1 % glükózt tartalmazó PY (PYG-) levestáptalajba oltottuk, majd 2 napig, anaerob körülmények mellett, 37 °C-on inkubáltuk. Az illő zsírsavakat (VFA-kat) és nem-illó zsírsavakat (NVFA-kat) ismert eljárásokkal extraháltuk, majd GowMac GLC-készülékkel kimutattuk. A GLC-t a kereskedelemben hozzáférhető VFA- és NVFA-standardokkal kalibráltuk. Az eredményeket az l.A-C táblázatokban összegeztük.

Sejt-, telep- és tenyésztési sajátságok: Az 1-15. fakultatív anaerob baktériumok Gram-reakcióját és sejtmorfológiáját 24 órán át, 37 °C-on levegő jelenlétében inkubált véresagarról készült, Gram-festett kenetek alapján határoztuk meg. A baktériumok mozgását tetrazolium-sót tartalmazó, motilitás vizsgálatra szolgáló lágyagar (0,4 %) alkalmazásával határoztuk meg. A motilitás vizsgálatra szolgáló táptalajt véresagarról oltottuk be, majd 24 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Valamennyi tesztet két alkalommal végeztünk el.

A tenyészet jellemzőinek vizsgálata céljából az 1-9. baktériumokat 2 véresagarra, 2 MacConkey -agarra, 2 nátrium-azidos véresagarra és 2 epe-eszkulin agarlemezre oltottuk. Egy véresagarlemezt és egy MacConkey-agarlemezt 37 °C-on, 80 % nitrogént, 10 % hidrogént és 10 % széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáltunk. Egy nátriumazidos véresagalemezt és egy epe-eszkulin agarlemezt 2 na-

- 28 pig, 45 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltunk. Egy, valamint két napos inkubálást követően véresagaron meghatároztuk a növekedési képességet, telep-jellemzőket és hemolitikus mintát, MacConkey-agaron megfigyeltük a laktóz-reakciót és epe-eszkulin agaron az epe-hidrolízisreakciót. Valamennyi tesztet két alkalommal végeztünk el.

A 10-15. fakultatív anaerob Gram-negatív baktériumok tenyésztési jellemzőinek meghatározása céljából az előbbivel megegyező eljárást alkalmaztunk, azzal az eltéréssel, hogy a nátrium-azidos véresagarlemezeket és epe-eszkulinagarlemezeket kihagytuk.

A 16-29. obiigát anaerob baktériumok esetében, a baktériumok Gram-reakcióját és sejtmorfológiáját heminnel és menadionnal dúsított brain-heart infusion véresagarról (CDCBA) készített Gram-fesett kenetek alapján határoztuk meg, amelyet 2 napig, 37 °C-on, 80 % nitrogént, 10 % hidrogént és 10 % szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáltunk. A mozgást a kereskedelemben hozzáférhető, előredukált, anaerob körülmények mellett sterilizált táptalaj (PRAS) alkalmazásával határoztuk meg, amelyet CDCBA-ról oltottunk be, majd 2 napig anaerob körülmények mellett, 37 °C-on inkubáltunk.

A 16-29. baktériumok tenyésztési jellemzőinek meghatározása céljából a baktériumokat 2 CDCBA- és 2 MacConkeyagarlemezre oltottuk. Egy CDCBA-és egy MacConkey-agarlemezt 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltunk, egy CDCBA-és egy MacConkey-agarlemezt pedig 37 °C-on, anaerob körülmények mellett inkubáltunk. Egy, három és öt napos inkubálást kö···· ····

vetően a CDCBA-lemezeken meghatároztuk a növekedési képességet, telepjellemzőket és hemolitikus mintát. Valamennyi tesztet két alkalommal végeztünk el.

Az eredményeket a 2.A-C táblázatokban foglaltuk össze.

Kataláz-, oxidáz-teszt és nitrát-redukciós teszt Az 19. fakultatív anaerob baktériumok esetében a kataláz- és oxidáz-tesztekhez olyan véresagarról származó telepeket használtunk, amelyeket két napig, 37 °C-on levegő jelenlétében inkubáltunk. A kataláz- és oxidáz-tesztekhez a következő reagenseket alkalmaztuk: az előbbihez 3 %-os H₂O₂-t, az utóbbihoz 1 %-os tetrametil-p-feniléndiamindihidrokloridot. Az oxidáz- és kataláz-teszteket negatívnak vagy pozitívnak ítéltük. Valamennyi tesztet két alkalommal végeztünk el. A 10-15. fakultatív anaerob Gram-negativ baktériumok esetében az előbbivel megegyező eljárást alkalmaztunk, azzal az eltéréssel, hogy a tenyészeteket csak 24 órán át inkubáltuk.

A 16-29. obiigát anaerob baktériumok esetében a kataláz- és oxidáz-tesztek elvégzéséhez 2 napig, 37 °C-on, anaerob körülmények mellett inkubált CDCBA-ról származó telepeket használtunk. A kataláz- és oxidáz-tesztekhez a fentivel megegyező reagenseket alkalmaztunk. A kataláz- és oxidáz-tesztek elvégzéséhez a baktériumokat a reagensek hozzáadását megelőzően 30 percig levegő jelenlétének tettük ki. Az oxidáz- és kataláz-reakciókat negatívnak vagy pozitívnak értékeltük. Valamennyi tesztet két alkalommal végez tünk el.

• · · · ···· ·· · · ·· · ·· ·· ···· · · ··· ··* *··* * · ·

- 30 Az 1-15. fakultatív anaerob baktériumok esetében a nitrát-reduktáz kimutatására két módszert alkalmaztunk. A nitrát-agar eljárás szerint, 0,1 % KNO₃-t tartalmazó nitrátagart oltottunk be 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubált véresagarról. Miután az inkubálás 24 óráig, 37 °C-on folytattuk, a reakció értékelésére az A- és B- reagenseket alkalmaztuk (N,N-dimetil-naftilamin és szulfanilsav). Az anaerob véresagar-korong módszer szerint, az organizmusokat véresagarra szélesztettük, majd vastagon beoltott részre 0,4 % KN0₃-oldattal átitatott papírkorongot helyeztünk. A lemezeket 24 órán át, 37 °C-on, anaerob körülmények mellett inkubáltuk, majd a paírkorongra A-és Breagenst tettünk. Annak megállapítása céljából, hogy a nitrát teljesen elredukálódott-e, a reagenssel kezelt korongokhoz cinkport adtunk. Valamennyi reakciót negatívnak vagy pozitívnak ítéltük meg. Mindegyik tesztet két alkalommal végeztük el.

A 16-29. obiigát anaerob baktériumok esetében a nitrát reduktázt a fent ismertetett anaerob véresagar-korong módszerrel határoztuk meg, azzal az eltéréssel, hogy véresagar helyett CDCBA-t használtunk.

Az eredményeket a 3.A-C táblázatokban foglaltuk össze.

Anaerob szénhidrát-felhasználási tesztek Az 1-9. fakultatív anaerob baktériumok esetében 1 % szubsztrátot és fenolvöröst tartalmazó alap-levestáptalajban meghatároztuk a savtermelést a következő cukrokból: glükóz, dulcit, laktóz, maltóz, mannit, szalicin és szacharóz. A glükózt tartalmazó csőben a gáztermelés kimutatására Durham-csövet al• · · · · · · · ··· · ·

- 31 kalmaztunk. Valamennyi csövet 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubált véresagarról beoltottunk a tesztorganizmussal. A levestáptalajokát 2 napig, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltuk. Valamennyi csőben megfigyeltük a színváltozást. A piros színű csöveket negatívnak, a sárga színű csöveket pozitívnak tekintettük. Valamennyi tesztet két alkalommal végeztünk el.

A fentivel megegyező eljárást ismételtük meg a 10-15. fakultatív anaerob Gram-negatív baktériumokkal, azzal az eltéréssel, hogy csak glükózt, laktózt és szacharózt teszteltünk .

Az 1-15. fakultatív anaerob baktériumok tenyészeteivel, amelyeket előzőleg 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében véresagaron tenyésztettünk, triple sugár iron (TSI, három féle cukrot és vassót tartalmazó) táptalajt oltottunk be. Miután a táptalajokat 24 órán át, 37 °C-on levegő jelenlétében inkubáltuk, a TSI-agar reakciókat feljegyezzük, azokat pozitívnak vagy negatívnak ítéltük. A tesztet két alkalommal végeztük el.

Az 1-9. fakultatív anaerob baktériumok esetében véresagarról Voges-Proskauer levestáptalajt oltottunk be, majd azt 24 órán át, 37 °C-on levegő jelenlétében inkubáltuk. A táptalajhoz A- és B- reagenseket adtunk (40 %-os KOH és alfa-naftol), majd a reakciót leolvasva azt pozitívnak vagy negatívnak ítéltük. A tesztet két alkalommal végeztük el.

Az 10-15. fakultatív anaerob, Gram-negatív baktériumok esetében véresagarról két metilvörös--Voges-Proskauer levestáptalajt tartalmazó csövet (A és B) oltottunk be,

- 32 majd azokat 24 órán át, 37 °C-on levegő jelenlétében inkubáltuk. A metilvörös teszt elvégzéséhez az A-csőhöz metilvörös-festéket adtunk. A Voges-Proskauer-teszt értékeléséhez a B-csőhöz A- és B- reagenseket adtunk (40 %-os KOH és alfa-naftol). A reakciókat pozitívnak vagy negatívnak ítéltük. Valamennyi tesztet két alkalommal végeztünk el.

Az eredményeket a 3.A-C táblázatokban foglaltuk össze.

Aminosav-felhasználása teszt és ureáz-teszt

Az 10-15. fakultatív anaerob, Gram-negatív baktériumokat lizin dekarboxiláz és ureáz enzimek jelenlétére teszteltük, az 1-15. baktériumokat pedig indol termelésre nézve vizsgáltuk. A lizin dekarboxiláz kimutatására lizin-vas (LIA) agart használtunk. A LIA-táptalajt véresagarlemezről oltottuk be, majd 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltuk. A reakciókat pozitívnak vagy negatívnak ítéltük. A tesztet két alkalommal végeztük el.

A triptofánból történő indol-termelés kimutatására két módszert alkalmaztunk. Véresagarról triptofán-levestáptalajt oltottunk be, azt 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltuk, majd Ehrlich-féle reagenssel reagáltattuk. Az anaerob agar-korong módszer szerint, az organiz-

must véresagarlemez	felszínére oltottuk. A véresagar-
lemezeket 24 órán át,	37 °C-on, anaerob körülmények mellett
inkubáltuk, majd a	korongokra 1 %-os p-dimetilamino-

fahéjsavaldehid-oldatot cseppentettünk. Valamennyi reakciót pozitívként vagy negatívként értékeltünk. A triptofán levestáptalaj-tesztet két alkalommal ismételtük, az anaerob-korong-módszert egy alkalommal végeztük el.

- 33 ········ ·· ·· ( • · · · · · · * · * · · · « • · · · *

Karbamid-agart véresagarlemezről oltottunk be, majd 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltunk. A reakciókat pozitívnak vagy negatívnak ítéltük. A tesztet két alkalommal végeztük el.

Az eredményeket a 3.A-C táblázatokban foglaltuk össze.

Kereskedelemben hozzáférhető API-ŰOE-System-tesztek

Az 10-15. fakultatív anaerob Gram-negatív baktériumokat további 20 biokémiai reakcióra nézve értékeltük (4. táblázat) egy, a kereskedelemben hozzáférhető rendszer alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva (Analytab Products, Plainview, NY) . A teszteket két alkalommal végeztük el.

Az eredményeket a 4. táblázatban összegeztük.

Szénhidrát-fermentáció, zselatin-elfolyósítás, és aminosav-felhasználás! tesztek A kereskedelemben hozzáférhető előredukált, anaerob körülmények mellett sterilizált (PRAS) levestáptalajt oltottunk be az 1-15. fakultatív anaerob baktériumok véresagarról készített sűrű szuszpenziójával (5. táblázat) . A levestáptalajokát 5 napig, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltuk; 1, 3 és 5 napos inkubációt követően valamennyi tenyészet pH-ját pH-készülékkel meghatároztuk. Azokat a tenyészeteket, amelyek pH-ja 6,5 vagy annál kisebb volt, pozitívnak, azokat a tenyészeteket, amelyek pH-ja 6,6 vagy annál nagyobb volt, negatívnak tekintettük. Az arginin-táptalajt megnövekedett pH-ra, a zselatin-táptalajt elfolyósodásra nézve vizsgáltuk. Valamennyi tesztet egy alkalommal végeztünk el.

• · · · · · • · · · · • · · · · • · ·

A 16-29. obiigát anaerob baktériumokkal a fentivel megegyező eljárást ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy az inokulumot CDCBA-táptalajon növekedett organizmusokból készítettük, és valamennyi inkubációt anaerob körülmények mellett végeztünk.

Az eredményeket az 5.A-C és 3.A-C táblázatokban összegeztük .

A kereskedelemben hozzáférhető API-Rapid-STREPSystem-tesztek

Az 1-9. fakultatív anaerob baktériumokat 20 biokémiai sajátságra nézve értékeltük egy, enterococcusok és streptococcusok azonosítására szolgáló, a kereskedelemben hozzáférhető rendszer alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva (Analytab Products, Plainview, NY) (6. táblázat) . Röviden, véresagarról származó telepeket, amelyeket 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltunk, 3 ml steril desztillált vízben szuszpendáltunk, hogy a McFarland-féle 5-ös számú standardnak megfelelő sűrűségű szuszpenziót kapjunk. Valamennyi mélyületet beoltottuk, majd a csíkokat 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltuk. Huszonnégy (24) órás inkubáció elteltével, az acetoin-termelődés, a hippurát-hidrolízis, valamint a pirrolidonil-2-naftilamin, alfa-galaktozidáz, bétaglukuronidáz, béta-galaktozidáz, alkalikus foszfatáz és leucin arilamidáz enzimreakciók értékelésére a reagenseket hozzáadtuk. A reakciókat 10 percig, szobahőmérsékleten történő inkubációt követően olvastuk le, azokat pozitívnak vagy negatívnak ítéltük. Az eszkulin hidrolízist, arginin ···· ···« ·· ······ .j..· .· ···

- 35 dihidrolázt, valamint a ribózból, arabinózból, mannitból, szorbitból, laktózból, trehalózból, inulinból, raffinózból, keményítőből és glikogénből történő savképzést pozitívknak vagy negatívnak ítéltük. Valamennyi teszteket két alkalommal végeztünk el.

Az eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze.

A kereskedelemben hozzáférhető API-STAPH-Trac-Systemtesztek

Az 1-9. fakultatív anaerob baktériumokat 19 biokémiai sajátságra nézve értékeltük egy, a kereskedelemben hozzáférhető rendszer alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva (Analytab Products, Plainview, NY) (7. táblázat) . Röviden, véresagarról származó telepeket, amelyeket 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltunk, 3 ml steril desztillált vízben szuszpendáltunk, hogy a McFarland-féle 5-ös számú standardnak megfelelő sűrűségű baktériumszuszpenziót kapjunk. Valamennyi mélyületet beoltottuk, majd a csíkokat 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltuk. Huszonnégy (24) órás inkubáció elteltével, az acetoin-termelődés, alkalikus foszfatáz, nitrát reduktáz, valamint alfa-metil-glukozid, arginin dihidroláz, glükóz-, fruktóz-, maltóz-, mannit-, mannóz-, melibióz-, Nacetil-glükózamin-, raffinóz-, szacharóz-, trehalóz-, ureáz-, xilitol-, és xilóz-enzimreakciók értékelésére a reagenseket hozzáadtuk. A reakciókat pozitívnak vagy negatívnak ítéltük. Valamennyi teszteket két alkalommal végeztünk el.

Az eredményeket a 7. táblázatban foglaltuk össze.

- 36 ~

A kereskedelemben hozzáférhető API-ZYM-System-tesztek

Valamennyi, 1-15. jelzésű fakultatív anaerob baktériumot 19 szubsztráttal szemben mutatott enzimaktivitásra vizsgáltunk meg egy, a kereskedelemben hozzáférhető szemikvantitatív enzimrendszer alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva (Analytab Products, Plainview, NY) . Röviden, véresagarrról származó telepeket, amelyeket 24 órán át, 37 °C-on, levegő jelenlétében inkubáltunk, 3 ml steril desztillált vízben szuszpendáltunk, hogy a McFarland-féle 5-ös számú standardnak megfelelő sűrűségű baktériumszuszpenziót kapjunk. A csíkok valamennyi mélyületét beoltottuk a baktériumszuszpenzióval. Négy (4) órán át, 37 °C-on, sötétben végzett inkubációt követően valamennyi mélyülethez A- és B-reagenst adtunk, és a reakciókat 5 percig, szobahőmérsékleten hagytuk előhívódni. A reakciók színintenzitását összehasonlítottuk a gyártó által megadott értékelő sémával, és azokat a következők szerint osztályoztuk: 0= színváltozás nem történt; nyomokban= <5 nmól/1; 1= 5 nmól/1; 2= 10 nmól/1; 3= 20 nmól/1; 4= 30 nmól/1; 5= >=40 nmól/1.

A 16-29. obiigát anaerob baktériumok esetében a fentivel megegyező eljárást ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy az inokulumot CDCBA-táptalajon, anaerob körülmények mellett növekedett organizmusokból készítettük.

Az eredményeket a 8.A-C táblázatokban foglaltuk össze.

A kereskedelemben hozzáférhető I-es ΙΙ-es és III-as Presumpto-lemezek ········ ·· · • · · · · • · · · · ·

- 37 A 16-29. obiigát anaerob baktériumok esetében I-es IIes és III-as Presumpto-lemezeket oltottunk be CDCBAtáptalajról, majd azokat 2 napig, anaerob körülmények mellett, 37 °C-on inkubáltuk. A teszteket elvégeztük, és az eredményeket a gyártó utasításai szerint értékeltük (9. táblázat). Valamennyi teszteket két alkalommal végeztünk el.

Az eredményeket a 9.A-D táblázatokban foglaltuk össze.

Antimikrobiális érzékenységi tesztek

Az 1-15. fakultatív anaerob baktériumok válogatott antimikrobiális hatóanyagokkal szembeni érzékenységének vizsgálatára a standard korongdiffúziós módszert alkalmaztuk a 10. táblázatban ismertetettek szerint. Az eredményeket leolvastuk, a baktériumokat rezisztensnek vagy érzékenynek ítéltük (vagy mérsékelten érzékenynek). Valamennyi teszteket egy alkalommal végeztünk el.

A 16-29. obiigát anaerob baktériumokkal a fentivel megegyező eljárást ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy CDCBA-táptalajt használtunk, és a tenyészeteket anaerob körülmények mellett inkubáltuk.

Az eredményeket a 10.A-C táblázatokban foglaltuk össze.

Eredmények: A profilok eredményeit az 1-10. táblázatokban összegeztük. Valamennyi baktériumot standard tenyésztési és biokémiai jellemzők alapján identifikáltunk.

········ ·· ·· ·· ·· · ·· ·· · • ··· · · ··· • · · · · ·

- 38 3. példa

Brojler-csirkékben végzett in vivő kísérlet

Szalmonella Egy S. typhimurium elsődleges baromfiizolátumot, amelyet a National Veterinary Services Laboratory-tói kaptunk (Ames, IA, 50010), laboratóriumunkban novobiocin- (NO) és nalidixsav- (NA) rezisztenciára szelektáltunk, és milliliterenként 25 mg NO-t és 20 mg NA-t tartalmazó táptalajban tartottunk fenn. Kísérletes fertőzésre használt inokulumot állítottunk elő olyan egy éjszakás tenyészetből, amelyet előzőleg három alkalommal triptikáz-szójalevestáptalajban passzáltunk, és amelyből steril, foszfát-pufferes fiziológiás sóoldatban sorozathígítást készítettünk 4xl0⁴ telepképző egység /1,0 ml koncentrációig. A kísérletes fertőzésre használt inokulumban az élő sejtek koncentrációját brillantzöld-agar (BGA) lemezeken határoztuk meg. A kísérletek során a kísérletesen fertőzött csirkékből származó NO-NA-rezisztens izolátum tenyésztésére használt táptalaj az egyéb baktériumok és nemrezisztens szalmonellák növekedésének gátlására milliliterenként 25 mg NO-t és 20 mg NA-t tartalmazott.

Kisérletterv: Hím broiler-csirkéket kereskedelmi keltetőből szereztünk be a kikelés napján, és fenyőháncs-alommal borított tyúkólakba helyeztünk. A csirkéket folyamatos megvilágítás mellett tartottuk, és azok szabadon hozzáférhettek vízhez, valamint gyógyszerrel nem kezelt, kukoricából és szójababból álló táplálékhoz, amely az egyes tápanyagokból tartalmazta vagy meghaladta a National Research Council ajánlása (1984) szerinti kritikus szintet. A csir········ ·· ·· ·· ·· · ·· ·· · • ··· · · · · ·

- 39 kék szállítására használt dobozok papírbéléseit és a táplálék három véletlenszerűen kiválasztott 25 grammos mintáját egymást követően pufferolt peptonvízben, szelenit-cisztinlevestáptalajban, majd brillantzöld-lemezeken tenyésztettük, amint azt a korábbiakban leírták [ Andrews és mtsai.: Isolation and Identification of Salmonella, Bacteriological Analytical Manual, 5. kiadás, Accoc Pff. Anal. Chem., Washington, D.C., 6. fejezet, 1-24. oldal (1978)], majd szalmonella jelenlétére vizsgáltuk. A papírbélésekben vagy a táplálékban nem sikerült szalmonella speciest kimutatni. A csirkéket véletlenszerű módon két csoportra osztottuk, 1) az első csoport nem részesült kezelésben (kontrollok), 2) a második csoport első ivóvizébe jellemzett tenyészetet (characterized culture, CC) adagoltunk. A CC-t az 1. példa szerinti folyamatos áramlású tenyészetből effluensként gyűjtöttük, az milliliterenként körülbelül 10 anaerob telepképző egységet (cfu-t) tartalmazott, és 1/5 arányban adtuk az ivóvízhez (1 rész CC; 4 rész víz) . A kezelt csirkék 18 órán át kaptak kezelt ivóvizet, ezalatt becslésünk szerint valamennyi csirke 10 ml CCkezelt vizet ivott meg. Tizennyolc (18) óra elteltével a maradék kezelt vizet eltávolítottuk, és friss csapvízzel pótoltuk. A harmadik napon, két nappal a CC-kezelést követően és a szalmonellával történő kísérletes fertőzést megelőzően, mindegyik csoportból 10 csirkét véletlenszerűen kiválasztottunk, és azokat a nyakcsigolya diszlokációjával fájdalommentesen leöltük. A korábbiakban közöltek szerint [ Corrier és mtsai.: Avian Dis. 34, 617 (1990)] a cekális ···«···· · · ·· ·· ·· · ·· ·· · • ··· · · · · ·

- 40 bennékekben gáz-folyadék kromatografiával meghatároztuk a propion-VFA-koncentrációt és össz-VFA- (ecetsav + propionsav + vaj sav + izovajsav + valeriánsav + izovaleriánsav) koncentrációt. Valamennyi megmaradt csirkét 3 napos korban gabonával történő töméssel 10⁴ telepképző egység S. typhimuriurnm.a.1 kísérletesen fertőztünk, amint azt cekális baktériumokból újonnan készített tenyészetek hatékonyságának ellenőrzésére a szakirodalomban ajánlják [ Mead és mtsai.: J. Food Protect. 52, 500 (1989)] . Tíz napos korban mindegyik csoportból 20 csirkét fájdalommentesen leöltünk, valamennyi csirkéből aszeptikus körülmények mellett cekális bennéket gyűjtöttünk, és azt az alábbiakban ismertetettek szerint, S. tiphyznurium-kolonizációra megvizsgáltuk. A 10 napos korú, fájdalommentesen leölt csirkék közül 10 cekális bennékét véletlenszerűen kiválasztottuk, és azokban a fent koncentrációkat.

leírtak szerint meghatároztuk a VFAA kísérlet menetét négy független kísér letben, újonnan kikelt csirkék és folyamatos áramlású tenyészetben 5 napig (1.

napig (3. kísérlet) tott, jellemzett cekális baktériumok felhasználásával megismételtük. A cekális bennékekben a VFA-k koncentrációját a 2., 3. és 4. kísérlet során meghatároztuk, de az 1. kísérlet során nem.

A 2., 3. és 4. kísérletben a 3. és 10. napokon a kezelt csirkék cekális bennékében a propionsav-koncentráció a kontrollokhoz képest szignifikánsan megnőtt (p<0,005) (11.

táblázat). Ezen felül, szignifikáns összefüggés volt kimu···· ····

- 41 tatható (p<0,005) a 3 napos korú kezelt csirkék cekális propionsav-koncentrációjának növekedése és a 10 napos korú kezelt csirkék cekális bennékében a szalmonellák számának tízes alapú logaritmus szerinti csökkenése között (r=0,99) .

A 3. napon a kezelt csirkék cekális bennékében az összVFA-koncentráció a kontroll csirkékhez képest szignifikánsan emelkedett (p<0,01) (12. táblázat). Ezen felül, szignifikáns összefüggés volt kimutatható (p<0,01) a 3 napos korú kezelt csirkék cekális össz-VFA-koncentráiójának növekedése és a 10 napos korú kezelt csirkék cekális bennékében a szalmonellák számának tízes alapú logaritmus szerinti csökkenése között (r=-0,67) . A 3. és 4. kísérlet során, a 10. napon a kezelt csirkék cekális bennékében az össz-VFA-koncentráció a kontroll csirkékhez képest szignifikánsan megnőtt (p<0,05).

Cekális kolonizáció S. tiphymuriurnraal

Amint azt a fentiekben említettük, valamennyi csirkéből aszeptikus körülmények mellett eltávolítottuk a cekumot, azt ollóval daraboltuk, és 24 órán át, 37 °C-on, 30 1 szelenit-cisztin-levestáptalajban inkubáltuk. Az inkubációt követően a levestáptalajt BGA-lemezekre szélesztettük, a lemezeket 24 óráig inkubáltuk, és tipikus S. tiphymurium telepek jelenlétére vizsgáltuk. A megmaradt cekumbennék egy részéből (0,2 gramm) sorozathígítást készítettünk, és az 1:100, 1:1 000 és 1:10 000 hígításokból BGA-lemezekre szélesztettünk. A lemezeket 24 órán át, 37 °C-on inkubáltuk, majd egy automatikus telepszámláló készülékkel (Biotran········ ·· ·· · · ·· · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · ·

- 42 III, New Brunswick Scientific, Edison, NJ) meghatároztuk a S. tiphymurium telepképző egységek (cfu) számát. A tipikus szalmonella-telepeket triple sugár iron agaron és lizinvas-agaron (Difco Laboratories, Detroit, MI) végzett biokémiai tesztekkel szalmonellaként azonosítottuk, majd azokat szerológiai módszerekkel, Salmonella O-antiszérumok - 13.

csoportsavó, valamint 1., 4., 12. és 15. faktorsavók (Difco Laboratories, Detroit, MI) - alkalmazásával S. tiphymuriumként identifikáltuk. Az egy lemezen található szalmonella-telepek számát 1 gramm cekális bennékben található szalmonellák tízes alapú logaritmusával fejeztük ki. Azokat a cekális bennékeket, amelyek 1:100 hígításban szalmonella-tenyésztésre negatívak voltak, de szelenitcisztin-táptalajban történő tenyésztést követően pozitívnak bizonyultak, önkényesen úgy tekintettük, hogy azok 1 gramm cekális bennékben log₁₀l,50 szalmonellát tartalmaznak. Azokat a szelenit-cisztin-tenyészeteket, amelyek BGA-lemezeken negatívnak bizonyultak úgy tekintettük, hogy azok log₁₀-ben kifejezett szalmonella-tartalma = 0.

A szalmonellával történő kísérletes fertőzéssel szemben rezisztenciát létrehozó CC-kezelés hatékonyságának értékelésére kiszámítottuk az úgy nevezett védettségi faktort (protection factor , PF) ; a számítást a szakirodalomban közöltek szerint végeztük [ Pivnick és Nurmi: The Nurmi Concept and its Role in the Control of Salmonellae in Polutry, Developments in Food Microbiology, szerk:

Davies, Applied Sciences Publishers, London, 41-70. oldal (1982); Mead és mtsai.: J. Food Protect. 52, 500 (1989)] . A ···· ···· • ··· · · · · · • · · 9 · ·

- 43 ~

PF-értéket az alábbi képlet szerint számítjuk ki: a kontroll csoportban talált szalmonellák log₁₀-ben kifejezett számának átlaga / a kezelt csoportban talált szalmonellák log₁₀-ben kifejezett számának átlaga.

A S.tiphymurium-tenyésztésre pozitív csirkék számának eltéréseit a csoportok között χ-négyzet-analizissel vizsgáltuk. Az átlagok közti eltéréseket a Student-féle tteszttel határoztuk meg. A korreláció szignifikanciájának kiszámítását és valamennyi statisztikai analízist a szakirodalomban leírtak szerint végeztük [ Snedecor és Cochran: Statistical Methods, 6. kiadás, Iowa State University

Press, Ames, IA, (1967)] .

A kontroliokkal összehasonlítva, a kezelt csirkék cekális bennékében a S. tiphymurium baktériumok száma az 1., 2., 3. és 4. kísérletek során szignifikánsan csökkent (P<0,005); az egyes kísérletekben a következő értékeket kaptuk: 6,35 log₁₀ egység, 5,39 log₁₀ egység, 3,84 log₁₀ egység és 5,77 log₁₀ egység (13. táblázat) . A meghatározott összetételű tenyészet hatékonyságának jellemzésére használt védettségi faktor számításaink szerint az 1., 2., 3. és 4. kísérletek során a következő volt: 63,5; 7,14; 15,2; és 10, 6.

A kísérletes fertőzésre használt, 10⁴ S. tiphymuriumot tartalmazó dózis a négy kísérlet során 10 napos korra a kontroll csirkék 90-100 %-ában hozott létre kolonizációt (6. táblázat). A kontrollokkal összehasonlítva, a kezelt csoportban a szalmonella-tenyésztésre pozitív cekális bennékkel rendelkező csirkék száma az egyes, 1., 2., 3. és ···· ···· ·· ·· ·· · ·· ·· · • ··· · · ··· β · · · · ·

- 44 4. kísérletek során szignifikánsan csökkent (P<0,01); az egyes kísérletekben a következő értékeket kaptuk: 100 %; 65 %; 75 %; és 60 %.

4. példa

Probiotikus tenyészet előállítása

A találmány szerinti folyamatos tenyésztési eljárás alkalmazásával egy második stacioner tenyészetet állítottunk elő a 07/921 173 számú közzétételi iratban ismertetettek szerint (bejelentés napja: 1992 július 29.), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.

A CFII-jelű stacioner tenyészet tizenegy különböző baktériumból állt, ezen belül a következőket tartalmazta: négy fakultatív anaerob Gram-pozitív coccust, két fakultatív anaerob Gram-pozitív pálcát, három fakultatív anaerob Gramnegatív pálcát, egy obiigát anaerob Gram-pozitív pálcát, és egy obiigát anaerob Gram-pozitív coccobacillust. A baktériumokat identifikáltuk, azok a következőknek bizonyultak:

(1) Enterococcus faecalis, (amelyet A-törzsnek neveztünk) , (2) Enterococcus faecalis, (amelyet B-törzsnek neveztünk) , (3) Enterococcus avium, (4) Lactococcus lactis, (5) Lactobacillus species (CMS-jelú), (6) Lactobacillus animalis, (7) Citrobacter freundii, (8) Escherichia coli, • · (9) Escherichia fergusonii_r (10) Bifidobacterium animalis, és (11) Propoinibacterium acidipropionici.

A stacioner tenyészet szárnyasoknak beadva probiotikus tenyészetként igen hatékonynak bizonyult; a kezeletlen madarakhoz képest szignifikánsan csökkentette a szárnyasok S. tiphymuriurnmal és S. enteri tidisszel történő kolonizációját.

A fentiekben a találmány szerinti megoldást szemléltetés céljából részletesen ismertettük. Szakember számára nyilvánvaló, hogy az ismertetett megvalósítási módokban egyenértékű módosítások és variációk széles skáláját lehet létrehozni anélkül, hogy a találmányi gondolattól eltérnénk vagy az igényelt oltalmi körön kívül kerülnénk. Az ilyen módosítások és variációk szintén a találmány tárgyát képe zik.

• · ···· ···· • · ·

- 46 Illő zsírsavak PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG hangyasav S/S S/S -/- 17- -/- -/- -/T -/- -/ecetsav S/S S/S T/T T/- -/T -/- S/T -/- T/T

II >

c »O • · · • · · · ·

- 47 Ο

CN c o- .

cu co ω >

•m.

CO CO '

- > ' co j > > - cu ~ > η H......

Cu.

cu

O >< w h >>>

cu

>

···· ····

H J......

Η > > >>

>

• · ·

4- -g «

···· ···· ·» * · • · · * · · · • · 1« · · • · · · ·

Sejt-, tenyésztési és telepiellemzők

» *· ····

oo

r*

Sejt-, tenyésztési és telepjellemzők

CM

.<β

,eö

2	‘O	c o	X υ
-o	X 'ü υ '<ú υ	u. cí Oü	s ο
u S	.ü -* e. g	ω u	υ ο

»··· ···· »· ·· «««*»* • # · w e · ·«· • · · · « · σ\ CN

CN

CN

Sejt-, tenyésztési és telepjellemzők

CQ O

CQ

CN CN

CN

• · · · • · • ·

Γ-

Biokémiai jellemzők un ’T

'+++++

+ ' ⁺ + ^{+ 1} ' 4- i + + + + +

+4-4-4-4-

+ +

m i >	. . + 1	1 +	+ + + +	’eS	1 ' +		' + E
CN · 1	1 + >	' +	+ + + +	Ί9	• · + ·	+	' + E	7 +

Ví

s > N o

* ·

Biokémiai jellemzők

4- 4-

44- 4“ 4“ ‘

4- «

4- 4-

CM

dekarboxiláz

Zselatinelfolyósitás

Ureáz

• · • · · ··

- 54 CM

íz izgsízís íz Íz5s +

CM

íz íz

r*CM

Íz!z^!z!zl ÍZ Sí jz ÍZ 5s Z íz

Biokémiai jellemzők o CM

W) CM

?5 ÍZ δε Sz !z íz ξ íz Sz íz jz iz 5ζ íz £ίδ ίζξξ^ίζξ ίζ Szíz^ Ζ !ζ?ζ + ίζ δε 5ζ íz Sz 5ζ ίζ ζ íz őz Β: ίζ + ίζ δε δζ ίζ δε ίζ ίζ ÍZ ÍZ Β: ?Ζ Ζ ÍZ Sz ίζ δε δζ ίζ ίζ δζ ίζ δζ Βζ ίζ 5ζ ίζ Βδζ

CM

ίζ ίζ δζ δε ίζ ίζ ίζ δζ ίζ δζ Βζ ÍZ ÍZ Ζ Bíz

• · • · · ·· ··· ····

El. -t. \ \ -Λ L. Í -Í. ¹ -i.

+ + + + + +^4^

—.+ + + + + ι 4- t

-+ + + + + ' + '

4- + + 4-4- + + 4- + 4-4^+ + + + + 4^+ + 4^ +

-^+ + + 4^^ + ^

τ

CZ) ώ φ (N

E <

Baktérium (izolátuni)

• · • · · · ···· • · ·

- 56 4- + + + + + + + + + + 4-4- + '+ + + + + > + ' + ' ' +

4-4- + 4-

+ + + '4- + + + + + + +

Szénhidrát-fermentációs tesztek

Baktérium (izolátum) un

+ + 4- +

4- +

4- +

4- '4-4-4+ 4- 4CN + + 4- + + 4+ + 4- + + + + 4- ·+ + + + + + + + + + + 4- + + + +

• · · · *··· *·

Szénhidrát-fermentációs tesztek

Baktérium (izolátum)

4- ‘ + + + «4-4- '4-4- ‘4£ +++'+ + + + + + + +

4- ' 4- 4- 4- 4- 4- ‘4-44- + 4- + + + + + + + + + + + ' + + + + + + + + + + + + + + + '+ + + + + + '· + + + + + ++ + +' --.++-+!+ + + + + . + + + + + + + +

N Cfl

N -O •ti G §§ 75 u.

_Q < < Q

N <o -S c3 “u -ö

2 2 ¢2 2

N N »Ű -O fi

N -O e

-O kO N (Λ

N

Ό c3 υ

£ < u ώ 3 á

N '2

N •o

N

O >

N G §3

OTIip j s

- τ u 2 2 fe fe ω n

te

G J= a £

- 58 ···· ··«·

Szénhidrát-fermentációs tesztek o CN

4-4- + + + +

4- <

+ · 4CN '4- '4- <4-444- < 4- + + - 44- < 4cr CN

V ·

···» ··'« • · • · ···· · V,

I

r-

“API RAPID STREP System” tesztek

Baktérium (izolátum)

+ + + +

4^ 4^

+ + + + + + -?+’+’+’ ···· « · -9 «

··.· * «« » •· ·· ♦·· Τ» ·· + + + + + + +^^+ + ^4^4^4^4^+ + +^^4^4^ + + + + + + +^+.^^ + + + + + + +^+^-^^ + + + +· + + + + + + ^4^+ + + + +^^+ + '

API STAPH Trac System tesztek Baktérium (izolátum)

• · · · · · ·

- 61 © © — ©ifi

OH © ©

Η H © re re © Η H © ce re ©

Γ*”ΑΡΙ ΖΥΜ” szemikvantitativ enzimrendszer tesztek Baktérium (izolátum)

O\

©H ©H

HcN CN '—

HCN CN

re	CN	— ©©CN	CN TT	re	©
re	CN	— B©cn	CN ’T	re

re ©

CN 3

© — ©CN — CN ©CN CN© © ©CN CN^ ©

: Az adatokat a következőképp tüntettük fel: 1. replika / 2. replika.

- 62 o

CN © un © un © ©

CN

CN

CN CN

CN CN un un

ON © © δ ©

© © Η H £2 δ © h h* ° m © cn © © CN δ ·· · ·· · · » • ··· · · ··· • · · · ·

Α

Baktérium (izolatum)

© m © © ©ín δ δ ο m mm © m mm

© © ’T m © δ δ nr δ cn © © © ?N H Ö O

CN ο nr CN CN cn δ c^ CN

m		CN	©
		CN	δ

CN © Ο

Ín δ δ

G<

m

CN

CN

© © © δ © CN © ©

--- '— *-«· *-«· © m © ©

un m un Ín ©

X. © cn © ττ m © m cn © m m δ m © un δ un

Η Η un m — pí Η un Ín

• ·

CL OO H — oiH

Ai —

5 O 5$

OO O©

© © OOCN *·Ο © Ο O CN — © NO ©

B

© ©

B B ©V) ©<—

B --³

©

H

©

©

O© CN

m cn

CN

rr

CN

©

CN

©

©

B

£

δ

B

BB ’T

iT)

f*7

B

cn

δ

”ΑΡΙ ΖΥΜ” szemikvantitatív enzimrendszer tesztek Baktérium (izolátum)

oh

ΦΦ

©

©

©

©

OO —

— ©

Φ

©

CN

Φ

©

©

Φ

Bh

BB

©

B

B

©

BB^

— B

B

B

CN

B

B

©

B

ID 5^

OO

©

©

©

5

oon

— ©

o

© —h.

©

m

©

©

φ

04 Qid

B δ

B

B

B

φ

BB Ín

^B

B

o

B

CN

B

B

B

ΦΦ HH © ©

BB E^H δ B © © ®55 δ B BBB

• · ····♦· • · ♦ · · · · ·· • · · · ·

N <

+	4-	+	+	4-	4·	4-	4-	4-	4-
+ >		< +	' +	' 4-	• 4-	- 4-	' 4-	' 4-	• 4-
+	+	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-

9.A táblázat “Presumpto Plate System” tesztek “Presumto Plate” Negyed sorszáma Agár táptalaj Növekedési képesség / Baktérium (izolátum) sorszáma biokémiai tesztek

		4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
4- ·	| 4- i	1 1 +	• 4-	4- 4-	• 4-	i 4-	4- 4-	+ 4-	> 4-
		4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-

+	4-	4-	4-	4- 4-	4“	4-	4-	4- 4~	4-
4·	+	' 4-	+ !	' · *-· + 4- 4-	4- 4-	i 4-	+	'4-4-4-	4- +
4-	+	4-	4-	4- +	4-	4-	4-	4- 4-	+

• · · · · · · • · · · · · • · ·

- 65 CM CM

CM “Presumpto Plate Svstem” tesztek “Presumto Plate” Negyed sorszáma Agár táptalaj Növekedési képesség / Baktérium (izolátum) sorszáma biokémiai tesztek o

CM

CM

e

Λ υ ω tM

Q ’T CM rr — CMc**>rr

“Presumpto Plate System” tesztek “Presumto Plate” Negyed sorszáma Agár táptalaj Növekedési képesség / Baktérium (izolátum) sorszáma biokémiai tesztek

CN

TF CN ’c?

a

Q U

(“Λ

	N <0
? Q	5
gá	'Öű Q u

SO

’T

CN • ·

“Presumpto Plate System tesztek “Prcsumto Plate” Negyed sorszáma Agár táptalaj Növekedési képesség / Baktérium (izolátum) sorszáma biokémiai tesztek

4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-	+
+	1 + ·	4-	. . w +	4-	• 4-	> 4-	> 4-	i 4-	< +	• 4-
4-	+	4-	+	4-	+	+	4-	+	4-	4-

<71<71C71Qá<71<71<71<71t710áeá<71t71<Ziaáaá<71<Z)<Zl öá<71<71<71<71<71<710á

Ο <71 <71 <71<71C/l(71C71<71<710á<71<71C/lC710áQá<71<71<71<71BáOTC/l<71C71<71Bá

CO<71<71<71CáC71<71<71<71<71OáC71<71C71pá<710á<71CZ)0á|0áPáC/laáPáBá<71<71 r~ <71 <71 (Oá <71 oá (Z> <ti oáoáaáaácioáoáoáaáoá<zi<zicAoá<7ioáfiá<7i oá <z>

Antimikrobiális érzékenységi tesztek

Baktérium (izolátum)

Ό <Z171eá<7iaá<71t71<71<710ápá<71<71eáaá<71öá</l<71<71<71eíC71aáaáPác/l<71 <n CO <71 (0á<730á<71C/lC710áöá<71C/lC71páöáPá<71<Z><71 <71 Oá <71 <71 ffí Oá <71 <71 ’T <71 eáaáaá(2áaá<7icziaáoá<7ic/ieáoáoáaá<zi

OáOá<710áPápá<71<71 r*l <71<71<710á<71<71páC/l<71 oáoáviyieáPásáoáyiyioáeáoá <71 Oá Pá öá <71 <71

0áCZl<71pá<71<71<71C/10á

0áöáÖÍC«eáPá<2áCá<71<710áBáPá<71 oá éá aá eá ezi

Ui 'Λ

X

O ha ε

e <

1= érzékeny; R= rezisztens.

• · · o

CM ti

Oá ϊ Oá

Antimikrobiális érzékenységi tesztek Baktérium (izolátum) es

- 69 co oá co co co co sí m cí se oá oá pí bí bí oá

MBáWcOMCOPÍMBáBÍPáBáPáBáPáPá

COBácZCOMOOpáCOBÍCOCZICOCOBácOCZ) páoá<ooáeá<ocoMoácooáaáoáBáoáoá co qá co sí sí sí sí co cocácosíaíBíeíco ai co <z> ca eí oá ataí<Aai<Aat&cA “2 co co

Oá co oá co co

COBáOáCOCOCOOáBáCOCCCOCOpáCO

Oá CO CO Oá CO Oá

X CO CO

OáCOOáOáCOCOOáOáOáCOcZOá

PáCOCOCOCOpíaáCOCOCOCOCOOá <zi oá

P^COOáOáCOCOOáOáCOCOCO

BÍOácOCOPáBáOÍCO

CA co co oá co oá

oácocococococopá

COBÍCOOáCOOáOáCOCOOáOáOáCOOTOáOáCOCZICO oá co oá co co co

CA x

Έ c

<

Tetraciklin S

Vankomycin R

S= érzékeny; R= rezisztens.

CN

CO

C/j Pá CO CO CO

COCOCOPÍCOCOCOCOPECOCO oícococopíaícopá *j CO COPáCOCOCOCOCOCOPáCOCOCOCOPÍCOCO

Ρ^ίΖ^ζΟΡ^^Ρί rCN

copícococ^coűáczpápápEpápEpíPíaí

COpácOp^p^PÍPÍCO

Pi

WPáMWWWCtíWPáPÍPÍPÍOáPáOáe:

(ZfficoeípíffÍKÍM

N 'JS Ξ CO

Pi wptí<z<ziwwtíweípi;páöáeí3íqáaí

CZiBátZIQáaáOáPáW tziaícflczvi!zaíc«aáfiáöíQ;aáP.Páoá we^cziBíeáeásácz m ¢/ <N WPáTJOTCOCZBáGOöáeipáffípÍpáff;»

Mpáweáaípáaáw

CN CN oá coeáwt^izcziBácziaáPáPiöíPásásáeS czipítzBíaásáPíw

pípípípípípípípí

Pi Pi oá oá

Cekális baktériumokat tartalmazó meghatározott összetételű tenyészettel végzett kezelés hatása 3 napos, valamint 10 napos korú broiler-csirkékben a cekális bennék propionsav-koncentrációjára¹ o < + fi un

4- fi O l> o >

CM 'Τ'

C/5 oo un

O	I +	+	*
a	m	00
fi	Tt	!>
fi	un„	o	o
cn	o	CM

* oo

M o a λ	O 1 4Ϊ
fi	o	o
		r\ o
	cm	CM
öj
		*
CC	o	Μ-

^M 9 + ° + a un Λ OO X ^C m o —

r—1 M0
	o	1
O a	1 +	+	*
fi	M	un
c	CM	M0	r-H
o	<X	Γ·	r o
	r—H	CM	T—·

CM oo un^ o

tz> O	1 +	+	*
a	oo	un
fi	F—(	CM	C'
c	kO	rx f“4	r\ un
m	o	CM	r-H

- 72 Cekális baktériumokat tartalmazó meghatározott összetételű tenyészettel végzett kezelés hatása 3 napos, valamint 10 napos korú broiler-csirkékben a cekális bennék ossz illó zsírsav koncentrációjára¹

00 O	1	+
CX		rc	*
ce	n	<o	m
c	σγ	(>	M0 A
o	,—M	o	00
1—·	o	r··^	CM

M O	+	+	* *
CX	v©	o	σ>
03	M0	MS	η
G	V©	θ'	CM
m	l	<n	CM

cfl O	+	+	*
CX	rc	o	*
c3	o,	Ό	<n
e		A •n	o A
rc	T“H	^r	00

O m Ό

Ό CM ca -J D

O + + c o oo ο m o -Η r- 00 cc

O cc

A CM ,

ΓΛ o	1 +	+	*
CX	in	*
cö	rc	Γ	o
Ö	<O	A	00 A
m		ί—1	η

Cekális baktériumokat tartalmazó meghatározott összetételű tenyészettel végzett kezelés hatása 10 napos korú broilercsirkékben a cekális bennékben található S. typimuriumok számára

un o <o θ'

V Ph

O

C5

I— ’öS c

<Z) c >03

N CZ2

Cekális baktériumokat tartalmazó meghatározott összetételű tenyészettel végzett kezelés hatása 10 napos korú broilercsirkékben a S. typimurium tenyésztésre pozitív cekális bennékkel rendelkező csirkék számára «5 s '03

N

	S'	•X-
	o
		O
	a
	CN	o
	O
	CN	oö

-2>d

4d

ΪΛ

	O	X-
Ό	o
73 5	O	QO CO
	o
CN	CN	O
	O	CM
	O1

ό

	n
	O
-bd	<D
	θ'
<u	V
tj	¢4
>	<—z
c±	F—1
'<□	-o
üd
>» 'CÚ	u*
ÖJQ
	C
	o
	44
<υ	cú
44	u.
u<	<<υ
’ω
Q
O	a
	CÖ
	w ö
o w
cö
Ό	c ö
03	Q Öű
N	C N
<	<5 co
• ·	75 j· ·_> *

Claims (22)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Készítmény szárnyasok szalmonellával történő kolonizációjának gátlására, amely biológiailag lényegében tiszta baktérium-populációkat tartalmaz, és a következők közül lényegében valamennyi baktériumot tartalmazza:

   I. fakultatív anaerob, Gram-pozitív coccusok:

   (1) egy első Enterococcus faecalis törzs, (2) egy második Enterococcus faecalis törzs, (3) egy első Enterococcus faecium törzs, (4) egy második Enterococcus faecium törzs, (5) egy harmadik Enterococcus faecium törzs, (6) Enterococcus avium, (7) egy harmadik Enterococcus faecalis törzs,

   II. fakultatív anaerob, Gram-pozitív coccobacillusok:

   (8) Lactobacillus lactis, (9) egy első Lactobacillus törzs,

   III. Fakultatív anaerob, Gram-negatív bacillusok:

   (10) egy első Escherichia coli törzs, (11) Citrobacter freundii, (12) egy, az Enterobacteriaceae családba tartozó baktérium, (13) egy Pseudomonas species, (14) Serratia liquefaciens, (15) egy második Escherichia coli törzs,

   IV. Obiigát anaerob, Gram-pozitív bacillusok:

   (16) egy első Propionibacterium species, (17) egy második Propionibacterium species,

   - 76 ···· ···· ·· ·· ·· ·· · · · ·· · • ··· · · ··· • · · · · · (18) egy második Lactobacillus törzs, (19) egy első Bi fi dóba c téri um törzs vagy egy harmadik

   Lactobacillus törzs, (20) egy harmadik Propionibacterium törzs, (21) egy első Eubacterium törzs, (22) egy második Eubacterium törzs, (23) egy ismeretlen, OAGPB-5-jelű baktérium, (24) egy harmadik Eubacterium törzs, (25) egy második Bifi dóbactérium törzs vagy egy negye- dik Lactobacillus törzs, (26) egy harmadik Bifi dóbactérium törzs vagy egy ötödik

   Lactobacillus törzs, (27) egy negyedik Propionibacterium törzs,

   V. obiigát anaerob, Gram-negativ coccousok:

   (28) egy Veillonella species, és

   VI. obiigát anaerob, Gram-negatív bacillusok:

   (29) egy Fusóbactérium species.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely az ATCC:

   55515 nyilvántartási számon szereplő tenyészetet tartalmaz- za, és/vagy a felsorolt baktériumok közül 26 baktériumot tartalmaz, és/vagy a felsorolt baktériumok közül 27 baktériumot tartalmaz, és/vagy a felsorolt baktériumok közül 28 baktériumot tartalmaz,

   és/vagy valamennyi felsorolt baktériumot tartalmazza, és/vagy ezen felül laktózt is tartalmaz, és/vagy

   - 77 ezen felül olyan coccidiosztatikumot is tartalmaz, amely Gram-pozitív baktériumokkal szemben hatástalan, és/vagy ezen felül hordozóanyagot is tartalmaz, és/vagy baktériumokat kapszulázva tartalmazza.
3. 3. Táp-készítmény, amely állati tápot tartalmaz az 1. igénypont szerinti készítménnyel kombinálva.
4. 4. Eljárás szárnyasok szalmonellával történő kolonizációjának gátlására, azzal jellemezve, hogy a szárnyasoknak lényegében biológiailag tiszta baktérium-populációt tartalmazó készítményt adunk be, és a készítmény lényegében valamennyi baktériumot tartalmazza a következők közül:

   I. fakultatív anaerob, Gram-pozitív coccusok:

   (1) egy első Enterococcus faecalis törzs, (2) egy második Enterococcus faecalis törzs, (3) egy első Enterococcus faecium törzs, (4) egy második Enterococcus faecium törzs, (5) egy harmadik Enterococcus faecium törzs, (6) Enterococcus avium, (7) egy harmadik Enterococcus faecalis törzs,

   II. fakultatív anaerob, Gram-pozitív coccobacillusok:

   (8) Lactobacillus lactis, (9) egy első Lactobacillus törzs,

   III. fakultatív anaerob, Gram-negatív bacillusok:

   (10) egy első Escherichia coli törzs, (11) Citrobacter freundii, (12) egy, az Enterobacteriaceae családba tartozó bakté rium, • · · · • · (13) egy Pseudomonas species, (14) Serratia liquefaciens, (15) egy második Escherichia coli törzs,

   IV. obiigát anaerob, Gram-pozitív bacillusok:

   (16) egy első Propionibacterium species, (17) egy második Propionibacterium species, (18) egy második Lactobacillus törzs, (19) egy első Bifidobacterium törzs vagy egy harmadik Lactobacillus törzs, (20) egy harmadik Propionibacterium törzs, (21) egy első Eubacterium törzs, (22) egy második Eubacterium törzs, (23) egy ismeretlen, OAGPB-5-jelű baktérium, (24) egy harmadik Eubacterium törzs, (25) egy második Bifidobacterium törzs vagy egy negyedik Lactobacillus törzs, (26) egy harmadik Bifidobacterium törzs vagy egy ötödik Lactobacillus törzs, (27) egy negyedik Propionibacterium törzs,

   V. obiigát anaerob, Gram-negatív coccousok:

   (28) egy Veillonella species, és

   VI. obiigát anaerob, Gram-negatív bacillusok:

   (29) egy Fusobacterium species.

   azzal jellemezve, hogy a készítményt olyan mennyiségben adjuk be, amely az adott szárnyas béltraktusában hatékonyan gátolja a szalmonellával történő kolonizációt.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, mely az ATCC: 55515 nyilvántartási számon szereplő tenyészetet tartalmazza, és/vagy a készítmény a felsorolt baktériumok közül 25 baktériumot tartalmaz, és/vagy a felsorolt baktériumok közül 27 baktériumot tartalmaz, és/vagy a felsorolt baktériumok közül 28 baktériumot tartalmaz, és/vagy valamennyi említett baktériumot tartalmazza.
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szárnyasként baromfi kolonizációját gátoljuk.
7. 7. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baromfiként a következők valamelyikének kolonizációját gátoljuk: csirke, pulyka, kacsa, fürj és liba, és/vagy a baromfi körülbelül 14 naposnál fiatalabb.
8. 8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szárnyasnak laktózt is beadunk, és/vagy olyan coccidiosztatikumot is beadunk, amely Gram-pozitív baktériumokkal szemben lényegében hatástalan.
9. 9. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett baktérium-populációt egy hordozóanyaggal együtt adjuk be, és/vagy az említett baktériumokat kapszulázva adjuk be.
10. 10. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktérium-populációt orális úton adjuk be a szárnyasnak, előnyösen táplálékkal és/vagy vízzel kombinálva, vagy a baktérium-populációt a szárnyasra permetezzük, ···* ·ν·« • ·

    - 80 és/vagy a baktérium-populációt az említett szárnyas kloakájával érintkeztetjük.
11. 11. Eljárás háziállatokban szalmonella-kolonizáció gátlására hatékonyan alkalmazható probiotikus tenyészet izolálására, azzal jellemezve, hogy (i) táptalajt felnőtt háziállat ürülékével, cekális bennékével vagy vastagbél-tartalmával oltunk be, azt zárt rendszerű tenyészetben anaerob körülmények között inkubáljuk, és ily módon közti tenyészetet nyerünk;

    (ii) a fenti közti tenyészetet folyamatos tenyészetben inkubáljuk óránként körülbelül 0,029-0,10 tartályürülési ciklus, körülbelül 4,7-6,5 közötti pH és anaerob körülmények mellett, a stacioner fázis eléréséhez szükséges ideig; és (iii) A (ii) lépés szerinti a stacioner tenyészetet kinyerjük .
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iii) lépés szerinti stacioner fázisú tenyészetet az említett háziállatokban szalmonella-kolonizáció gátlására nézve megvizsgáljuk.
13. 13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy háziállatként szárnyasban alkalmazható tenyészetet izolálunk.
14. 14. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a zárt rendszerű tenyészetet körülbelül 6-18 órán át inkubáljuk, és/vagy a zárt rendszerű tenyészet pH-ját körülbelül 5,5-ös értéken tartjuk, és/vagy ···· ···· ·· φφ φφ • · · ·· ·« · . · ·*· * · ·Α.

    a zárt rendszerű tenyészet inkubálását addig folytatjuk, amíg annak fényelnyelése legalább körülbelül 1,0-es értéket ér el, és/vagy a zárt rendszerű tenyészet inkubálását legfeljebb körülbelül 2 órán át folytatjuk azt követően, hogy a pH körülbelül 4,2-es értéket ért el, és/vagy a zárt rendszerű tenyészetben a tartályürülési ciklus óránként körülbelül 0,0416, és a pH körülbelül 5,5, és/vagy a zárt rendszerű tenyészetben a pH nem kisebb, mint 4,2, és/vagy a zárt rendszerű tenyészet és a folyamatos áramlásé tenyészet hőmérséklete körülbelül 26-47 °C közötti.
15. 15. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy táptalajként laktózt tartalmazó tenyésztő tápfolyadékot alkalmazunk.
16. 16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészet hatékonyságának vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük:

    (i) háziasított tesztállatokat szerzünk be, és azoknak a 11. igénypont (iii) lépése szerinti stacioner fázisú tenyészetet beadjuk;

    (ii) kezeletlen kontroll állatokat alkalmazunk;

    (iii) a tesztállatokat és kontroll állatokat 2-3 napig tartjuk;

    (iv) a tesztállatok és kontroll állatok cekális bennékében meghatározzuk a propionsav-koncentrációt és az ossz-illózsírsavkoncentrációt, és

    - 82 (v) a tesztállatok esetén mért propionsav-koncentrációt és össz-illózsírsavkoncentrációt összehasonlítjuk a kontroll állatok eseten mért értékekkel;

    és a stacioner fázisú tenyészetet akkor ítéljük hatékonynak az adott háziasított állatban szalmonellakolonizáció gátlására, ha:

    (a) a tesztállatok cekális bennékében a propionsavkoncentrácíó körülbelül 10 mmól/g vagy annál nagyobb, és/vagy (b) a tesztállatokban az össz-illózsírsavkoncentráció a kontroll állatokban található érték körülbelül 100 %-a vagy annál nagyobb.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az össz-illózsírsavkoncentrációt az alábbi összetevők koncentrációjának összegeként határozzuk meg: ecetsav, propionsav, vaj sav, izovajsav, valeriánsav és izovaleriánsav.
18. 18. Probiotikus tenyészet, amely a 12. igénypont szerinti eljárás alkalmazásával lett előállítva.
19. 19. Eljárás háziállatokban probiotikus tenyészetként szalmonella-kolonizáció gátlására alkalmazott baktériumkészítmények hatékonyságának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy (i) háziasított tesztállatokat szerzünk be, és azoknak a vizsgálandó baktériumkészítményt beadjuk;

    (ii) kezeletlen kontroll állatokat alkalmazunk;

    (iii) a tesztállatokat és kontroll állatokat 2-3 napig tartjuk;

    - 83 .... ...

    ·.? I**· *“ (iv) a tesztállatok és kontroll állatok cekális bennékében meghatározzuk a propionsav-koncentrációt és az össz-illózsirsavkoncentrációt, és (v) a tesztállatok esetén mért propionsav-koncentrációt és össz-illózsirsavkoncentrációt összehasonlítjuk a kontroll állatok esetén mért értékekkel;

    és a stacioner fázisú tenyészetet akkor ítéljük hatékonynak az adott háziállatban szalmonella-kolonizáció gátlására, ha:

    (a) a tesztállatok cekális bennékében a propionsavkoncentráció körülbelül 10 mmól/g vagy annál nagyobb, és/vagy (b) a tesztállatokban az össz-illózsírsavkoncentráció a kontroll állatokban található érték körülbelül 100 %-a vagy annál nagyobb.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az össz-illózsírsavkoncentrációként az alábbi összetevők koncentrációját határozzuk meg: ecetsav, propionsav, vajsav, izovajsav, valeriánsav és izovaleriánsav.
21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy háziállatként szárnyasban alkalmazható probiotikus tenyészetet vizsgálunk.
22. 22. Háziállatokban szalmonella-kolonizációt hatékonyan gátló baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy a 19. igénypont szerinti eljárás alkalmazásával lett előállítva.