PL178535B1 - Kompozycja do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella, produkt żywieniowy i sposób izolacji kompozycji - Google Patents

Kompozycja do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella, produkt żywieniowy i sposób izolacji kompozycji

Info

Publication number
PL178535B1
PL178535B1 PL94314986A PL31498694A PL178535B1 PL 178535 B1 PL178535 B1 PL 178535B1 PL 94314986 A PL94314986 A PL 94314986A PL 31498694 A PL31498694 A PL 31498694A PL 178535 B1 PL178535 B1 PL 178535B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
strain
culture
bacteria
salmonella
composition
Prior art date
Application number
PL94314986A
Other languages
English (en)
Other versions
PL314986A1 (en
Inventor
David J. Nisbet
Donald E. Corrier
John R. Deloach
Original Assignee
Agriculture
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agriculture filed Critical Agriculture
Publication of PL314986A1 publication Critical patent/PL314986A1/xx
Publication of PL178535B1 publication Critical patent/PL178535B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/114—Fusobacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)

Abstract

1 Kompozycja do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella zawierajaca substancje nosnikowe i/lub karme dla pta- ków, znamienna tyra, ze zlozona jest z populacji zasadniczo biologicznie czystych bakterii, w sklad których to bakterii wchodza zasadniczo wszystkie (1) pierwszy szczep Enterococcus faecalis, (24) trzeci szczep Eubactenum, (2) drugi szczep Enterococcus faecalis, (25) drugi szczep Bifidobacterium lub czwarty szczep Lactobacillus, (3) pierwszy szczep Enterococcus faecium, (26) trzeci szczep Bifidobacterium lub piaty szczep Lactobacillus. (4) drugi szczep Enterococcus faecium, (27) czwarty szczep Propionibacterium, (5) trzeci szczep Enterococcus faecium, (28) szczep Veillonella, (6) Enterococcus avium, (29) szczep Fusobacterium (7) trzeci szczep Enterococcusfaecalis, w ilosci efektywnie hamujacej kolonizacje drobiu przez Salmonella. (8) Lactococcus lactis, (9) pierwszy szczep Lactobacillus (10) pierwszy szczep Escherichia coli, (11) Citrobacter freundu, (12) bakteria nalezaca do rodziny Enterobactenaceae, (13) szczep Pseudomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) drugi szczep Escherichia coli, (16) pierwszy szczep Propiombacteriium, (17) drugi szczep Propionibacterium, (18) drugi szczep Lactobacillus, (19) pierwszy szczep Bifidobacterium lub trzeci szczep Lactobacillus, (20) trzeci szczep Propionibacterium, (21) pierwszy szczep Eubactenum, (22) drugi szczep Eubactenum, (23) nieznana bakteria okreslona jako szczep OAGPB-5, P L 178535 B 1 (51) IntCl6 A61K 39/02 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są określone kompozycje do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella, produkt żywieniowy jak również sposób izolacji wspomnianej kompozycji. Kompozycje zwane też probiotykami stosowane są do kontroli Salmonella w kolonizacji przez Salmonella zwierząt domowych w tym ptactwa, a w szczególności kurcząt.
Mimo wysiłków naukowców i agend zdrowia publicznego, częstość salmonellozy u ludzi wzrosła w ciągu ostatnich 20 lat. Liczba stwierdzonych przypadków zakażeń u człowieka przekracza 40000 rocznie. Jednak Communicable Disease Center (Centrum ds. Chorób Zakaźnych) szacuje, że prawdziwa częstość infekcji człowieka przez Salmonella w USA może wynosić od 2 do 4 milionów przypadków rocznie. Produkty żywnościowe pochodzące od zwierząt, w tym drób, są nadal głównym źródłem zakażeń u człowieka.
Biorąc pod uwagę rozpowszeclhńonąobecność Salmonella w środowisku mało prawdopodobną jest możliwość całkowitej ochrony drobiu przed Salmonella Tak więc naukowcy nieustannie badają sposoby zwiększenia odporności drobiu narażonego przez kontakt z Salmonella na kolonizację przez ten mikroorganizm. Badania koncentrowały się na ocenie szczepionek, ustaleniu normalnej ochronnej flory jelitowej oraz ocenie dodatków paszowych, które hamują wzrost i kolonizację przez Salmonella. Rola odporności gospodarza na kolonizację przez Salmonella jest niejasna i także nie jest pewne czy stymulacja reakcji odpornościowych skutecznie podniesie odporność na kolonizacj ę przez Salmonella. Doświadczalne szczepionki nie były konsystentnie skuteczne.
Jest dobrze udokumentowane, ze normalna mikroflora jelitowa wzmaga odporność na kolonizację przez Salmonella. Doustne zaszczepianie młodych kurcząt beztlenowymi hodowlami bakteryjnymi mikroflory, które sątakże nazywane probiotykami (definiowane jako hodowle bakterii, które mają korzystny wpływ na zwierzę, któremu są podawane) przygotowane z zawartości jelita ślepego lub odchodów dojrzałych kurcząt okazały się skutecznie zmniejszać kolonizację przez Salmonella (Snoeyenbos i in., Avian Dis., 23:904-913 (1979), Schneitz i in., Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B., 89:109-116 (1981), i Stavric i in., J. Food. Prot., 48:778-782, (1985)). Z drugiej strony, metody hodowli kurcząt, które zapobiegają ich kolonizacji przez beztlenowe mikroorganizmy jelita ślepego powodują zwiększoną wrażliwość zwierząt na kolonizację przez Salmonella (Pivnick i in., J. Food Prot., 44:909-916, (1981)). Te probiotyki mogą zmniejszać kolonizację przezSalmonella drogą szybkiej kolonizacji przewodu pokarmowego młodych kurcząt (Pivnick i in., ibid) poprzez współzawodniczenie o miejsca przyczepu na ścianie jelita (Snoeyenbos i in., ibid) lub poprzez produkcję bakteriostatycznych lub bakteriobójczych lotnych kwasów tłuszczowych o krótkich łańcuchach (Bames i in., J. Hyg. Camb., 82:263-283 (1979) i Am. J. Clin. Nutr., 33:2426-2433, (1980), Corrier i in., Avian Dis., 34: 668-676, (1990) i Avian Dis., 34:617-625,(1990),i Hintoniin., Avian Dis., 34:626-633 (1990)), które hamują wzrost enteropatogenów.
Jednak tylko dla hodowli normalnej mikroflory, które zawierają mieszaną populację kilkuset różnych mikroorganizmów wykazano, że skuteczne hamująone wzsostSalmonella. Ustanowienie normalnej flory jelitowej ujednodniowych kurcząt przez zastosowanie mieszanej kultury mikroorganizmów było szeroko stosowane w kilku państwach europejskich do kontroli kolonizacji przez Salmonella. Jednakże ze względu na niezdefiniowaną liczbę i typy mikroorganizmów obecnych w mieszanych kulturach, system ten nie został powszechnie zaakceptowany w Stanach Zjednoczonych. Jedną z przeszkód szerokiego stosowania tej metody jest to, ze skład produktu nie może zostać wystandaryzowany, i w związku z tym produkt nie może być wytworzony czy
178 535 przechowywany na dużą skałę bez zmian w składzie i skuteczności działania. Dodatkowo, ze względu na fakt, że materiałem wyjściowym jest zawsze zawartość jelita dorosłego ptaka, produkt może zawierać patogenne wirusy, bakterie lub pasożyty, które mogą stanowić zagrozenie dla zdrowia kurcząt. Dodatkowo, US Food and Drug Administration postawiła niedawno wymaganie, konieczności uzyskiwania zezwoleń na wszystkie niezdefiniowane kultury.
Niedawno doniesiono również, że laktoza i inne produkty cukru mlekowego dodawane do paszy lub wody kurcząt wzmagają odporność na kolonizację przez Salmonella (Oyofo i in., AvianDis., 33:531-534, (1989) i Poultry Science, 68:1357-1360 (1989), Corrier i in., ibid., i Hinton i in., ibid). Laktoza w pożywieniu wzmaga kwasowość treści jelita ślepego i wpływa na wzrost i produkty fermentacji normalnej mikroflory jelitowej. Dieta z dodatkiem laktozy może też zwiększać odporność na kolonizację przez Salmonella przez wzmaganie bakteriostatycznego działania lotnych kwasów tłuszczowych o krótkim łańcuchu, takichjak kwasy octowy, propionowy i masłowy, produkowanych przez niektóre normalne bakterie jelitowe (Corrier i in., ibid, Hinton i in., ibid.).
Odporność na kolonizację przez Salmonella u kurcząt wzrasta dodatkowo gdy kurczętom dostarczana jest w pożywieniu kombinacja laktozy i kultur beztlenowych mikroorganizmów hodowanych w pożywce płynnej zawierającej laktozę (Corrier i in., i Hinton i in., ibid.).
Odkryliśmy obecnie określoną kompozycję bakterii (probiotyk) skuteczną w hamowaniu kolonizacji ptaków przez Salmonella. Probiotyk składa się z określonych populacj i lub kultur zasadniczo biologicznie czystych bakterii. Obejmują one szczepy następujących bakterii:
Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium,
Enterococcus avium,
Lactococcus lactis,
Lactobacillus,
Escherichia coli,
Citrobacter freundii,
Pseudomonas,
Serratia liąuefaciens,
Propionibacterium,
Bifidobacterium (lub Lactobacillus),
Eubacterium,
Veillonella, i
Fusobacterium.
a także innąbakterię należącą do rodziny Enterobacteriaceae i nieznanąbakterię określaną jako szczep OAGPB-5.
Przy stosowaniu probiotyk jest podawany ptakom w ilości skutecznej do hamowania ich kolonizacji przez Salmonella. Szczególnie korzystne jest uzyskanie podwyższonego hamowania kolonizacji przez Salmonella przez włączenie do probiotyku laktozy. Wyżej wymieniony probiotyk może być także łączony z normalną karmą, dając nową karmę, która może być zjedzona przez ptaka.
Wynalazek także dotyczy nowej metody izolowania, z odchodów, zawartościjelita ślepego lub zawartościj elita grubego dorosłych zwierząt, probiotyków, które są skuteczne w kontrolowaniu lub hamowaniu kolonizacji zwierząt domowych, w tym ptaków, przez Salmonella. Odchody czy zawartość jelita sąłączone z pozywkączy podłożem hodowlanym i inkubowane bez rozcieńczenia (tzw. hodowla okresowa) w warunkach beztlenowych. Po tej wstępnej inkubacji, powstała hodowlajest poddawana ciągłemu przepływowi do uzyskania hodowli w fazie stałej, wtedy możliwe jest odzyskanie hodowli w fazie stałej do zastosowania jako probiotyk.
Zgodnie z tym odkryciem celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonej metody i kompozycji do kontrolowania kolonizacji ptaków przez Salmonella.
Dodatkowym celem tego wynalazku jest dostarczenie określonych kultur bakterii beztlenowych, które mogą być łatwo standaryzowane, do kontroli kolonizacji ptaków przez Salmonella.
178 535
Jeszcze jednym celem jest dostarczenie ulepszonego sposobu izolacji kompozycji bakterii beztlenowych do stosowania jako probiotyków do kontroli kolonizacji przez Salmonella zwierząt domowych, w szczególności ptactwa.
Inne cele i korzyści tego wynalazku zostaną wykazane w następującym opisie.
Probiotyk według sposobu z wynalazku jest skuteczny w kontrolowaniu kolonizacji ptaków przez Salmonella po podaniu im tego preparatu, zmniejszając średnie stężenie Salmonella w populacji ptaków i/lub obniżając procent ptaków kolonizowanych przez patogen. Wynalazek może być stosowany do dowolnego rodzaju ptaków, takichjak kurczęta, indyki, kaczki, przepiórki i gęsi. Po podaniu ptakom probiotyk dostarcza konsystentnej ochrony przeciw różnym Salmonella, szczególnie S. typhimurium i S. enteriditis.
Probiotyk opracowano z jelita ślepego kurcząt wolnych od Salmonella. Jak opisano bardziej dokładnie w przykładzie I, odzyskano jelita ślepe z kurcząt, zaszczepiano nimi odpowiednie podłoże hodowlane i inkubowano w warunkach beztlenowych w hodowli pojedynczej. Hodowlę następnie inkubowano w warunkach hodowli o ciągłym przepływie, przy określonym tempie wymiany pożywki aż do uzyskania równowagi stanu stałego. Po odzyskaniu i podaniu ptakom otrzymana hodowla stanu stałego wykazywała znaczną skuteczność jako probiotyk dla kontroli kolonizacji przez Salmonella u ptaków, którym ją podano.
Po analizie, z hodowli stanu stałego uzyskano 29 zasadniczo czystych izolatów bakterii, w tym 15 beztlenowców względnych i 14 bezwzględnych. Skład hodowli określono jako:
I. Względnie beztlenowe Gram-dodatnie ziarniaki:
(1) pierwszy szczep Enterococcus faecalis, (2) drugi szczep Enterococcus faecalis, (3) pierwszy szczep Enterococcus faecium, (4) drugi szczep Enterococcus faecium, (5) trzeci szczep Enterococcus faecium, (6) Enterococcus avium, (7) trzeci szczep Enterococcus faecalis,
II. Względnie beztlenowe Gram-dodatnie ziamiakolaseczki:
(8) Lactococcus lactis, (9) pierwszy szczep Lactobacillus,
III. Względnie beztlenowe Gram-ujemne laseczki:
(10) pierwszy szczep Escherichia coli., (11) Citrobacter freundii, (12) bakteria należąca do rodziny Enterobacteriaceae, (13) gatunek Pseudomonas, (14) Serratia liąuefaciens, (15) drugi szczep Escherichia coli,
IV. Bezwzględnie beztlenowe Gram-dodatnie laseczki:
(16) pierwszy szczep Propionibacterium, (17) drugi szczep Propionibacterium, (18) drugi szczep Lactobacillus, (19) pierwszy szczep Rifidobacterium lub trzeci szczep Lactobacillus, (20) trzeci szczep Propionibacterium, (21) pierwszy szczep Eubacterium, (22) drugi szczep Eubacterium, (23) nieznana bakteria określona jako szczep OAGPB-5, (24) trzeci szczep Eubacterium, (25) drugi szczep Bifidobacterium lub czwarty szczep Lactobacillus, (26) trzeci szczep Bifidobacterium lub piąty szczep Lactobacillus, (27) czwarty szczep Propionibacterium,
V. Bezwzględnie beztlenowe Gram-ujemne ziarniaki:
(28) szczep Vedlonella, i
178 535
VI. Bezwzględnie beztlenowe Gram-ujemne laseczki:
(29) szczep Fusobacterium.
Według wynalazku kompozycja do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella zawierająca substancje nośnikowe i/lub karmę dla ptaków, złozona jest z populacji zasadniczo biologicznie czystych bakterii, w skład których to bakterii wchodzą zasadniczo wszystkie:
(1) pierwszy szczep Enttrococcus faecahs, (2) drugi szczep Enttrococcus fatcalis, (3) pierwszy szczep Enttrococcus faecrum, (4) drugi szczep Enttrococcus faecrum, (5) trzeci szczep Enttrococcus fatcium, (6) Enttrococcus avium, (7) trzeci szczep Enttrococcus fatcalis, (8) Lactococcus lactis, (9) pierwszy szczep Lactobacillus, (10) pierwszy szczep Eschtrichia coli, (11) Citrobacttr frtundii, (12) bakteria należąca do rodziny Enterobacteriaceae, (13) szczep Pstudomonas, (14) Strratia liąutfacitns, (15) drugi szczep Eschtrichia coli, (16) pierwszy szczep Propionibacltruum, (17) drugi szczep Propionibacttrium, (18) drugi szczep Lactobacillus, (19) pierwszy szczep Bifidobacttrium lub trzeci szczep Lactobacillus, (20) trzeci szczep Propionibacttrium, (21) pierwszy szczep Eubacttrium, (22) drugi szczep Eubacttrium, (23) nieznana bakteria określona jako szczep OAGPB-5, (24) trzeci szczep Eubacttrium, (25) drugi szczep Bifidobacttrium lub czwarty szczep Lactobacillus, (26) trzeci szczep Bifidobacttrium lub piąty szczep Lactobacillus, (27) czwarty szczep Propronibacttrrum, (28) szczep Yetllontlla, i (29) szczep Fusobacttrium.
w ilości efektywnie hamującej kolonizację drobiu przez Salmonella.
Kompozycja probiotyczna zawierająca wszystkie 29 wyżej wymienione szczepy bakteryjne została zdeponowana zgodnie z Umową Budapeszteńską w American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Md 20852, USA) jako Competitive Exclusion Culture CF3 (współzawodnicząca hodowla wykluczająca) i przypisano jej numer ATCC 55515. Poszczególne szczepy są scharakteryzowane w przykładach I i II.
Otrzymana hodowla stanu stałego może być zastosowana bezpośrednio jako probiotyk, lub przechowana do późniejszego zastosowania. W tym ostatnim przypadku, hodowla może być przechowywana jako wskazana mieszanina, albo można wyizolować poszczególne typy bakterii i następnie ponownie je połączyć.
Szczególnie korzystne jest gdy probiotyk jest złożony z bakterii ze zdeponowanej hodowli stanu stałego, której dotycząprzykłady I i II. Jednak w innej formie wiele bakterii, które mająbyć użyte może być uzyskanych ze znanych lub standardowych szczepów, lub z izolatów otrzymanych z ptaków Na przykład, ale bez ograniczenia do niego, jeden lub więcej ze szczepów Enttrococcus, Lactococcus, E. coli, Citrobacttr, Pstudomonas, Strratia, Propionibacttrium, Bifidobacttrium, Eubacttrium, Yedlontlla, Fusobacttrium, lub szczególnie Lactobacillus, mogą zastąpić szczepy z tego samego rodzaju lub gatunku w zdeponowanym probiotyku z przykładów. Aby zwiększyć skuteczność przy stosowaniu hodowli znanych szczepów, bakterie
178 535 mogąbyć adoptowane do ptaka przez pasażowanie przez niego, szczególnie korzystnie z innymi organizmami z hodowli stanu stałego, a następnie winny być odzyskane i izolowane z odchodów lub zawartości jelita ślepego. W przypadku stosowania izolatów z ptaków, bakterie mogą być wyodrębniane indywidualnie z odchodów lub treści jelita ślepego dorosłych ptaków stosując zwyczajowe dla tej dziedziny techniki lub zgodnie z opisem De Loach (zgłoszenie patentowe USA nr 07/822505), którego treść jest tu zawarta w formie odnośnika.
Jest też przewidywane, że wynalazek ten może być stosowany z probiotykiem zawierającym mniej niż wszystkie 29 wyżej wymienione szczepy bakteryjne i że jedna, dwie lub trzy bakterie mogąbyć usunięte z probiotyku przy tylko nieznacznym obniżeniu jego skuteczności. Na przykład, ale bez ograniczenia do niego, szczepy Pseudomonas czy innych nadmiarowych bakterii to znaczy bakterii dla których obecnych jest kilka szczepów lub gatunków, mogą być usunięte bez znaczącego wpływu na skuteczność probiotyku. Jednak optymalna kontrola kolonizacj i przez Salmonella uzyskiwanaj est przy probiotyku zawieraj ącym wszystkie 29 szczepów.
Niektóre ze szczepów bakterii tego wynalazku mogą być także dowolnie wybrane ze względu na zdolność do przylegania do komórek nabłonka przewodu pokarmowego ptaka, zgodnie z technikąNurmi i in. al. patent USA nr 4 689 226, którego treść jest zawarta w formie odnośnika w niniejszym dokumencie.
Wynalazek ten dotyczy też nowego sposobu otrzymania probiotyków skutecznych w kontrolowaniu lub hamowaniu kolonizacji przez Salmonella różnych zwierząt domowych w tym również ale nie wyłącznie ptaków, a także koni, świń i bydła. Zamiast wytwarzać probiotyk ze znanych kultur muzealnych lub czystych izolatów bakteryjnych niespodziewanie stwierdzono, że stabilny, określony probiotyk może być otrzymany bezpośrednio z odchodów, treści jelita ślepego i/lub jelita grubego docelowego, dorosłego zwierzęcia.
Sposób izolacji kompozycji do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella, polega na tym, że obejmuje:
(a) zaszczepienie pożywki hodowlanej odchodami, treściąjelita ślepego lub jelita grubego dorosłego zwierzęcia domowego, posiadającego ochronną mikroflorę, skuteczną w hamowaniu kolonizacji Salmonellą, a następnie inkubowanie okresowej hodowli w warunkach beztlenowych w celu dostarczenia hodowli pośredniej;
(b) inkubowanie wymienionej hodowli pośredniej w hodowli ciągłej przy tempie obrotu między około 0,029 do około 0,10 godz.'1, wartość pH pomiędzy około 4,7 i 6,5, w warunkach beztlenowych dostatecznie długo by uzyskać stan stały; i (c) odzyskanie hodowli stałej z etapu (b).
Sposobem według wynalazku odchody lub treść jelita ślepego lub grubego sąnajpierw zastosowane jako inokulum do hodowli okresowej, a następnie hodowane w warunkach ciągłego przepływu do uzyskania stanu stałego lub równowagi. Otrzymana kultura stanu stałego może być odzyskana i zastosowana jako probiotyk. Określenie „treść jelita ślepego” jest tu definiowane tak, by obejmować materiały w obrębie wewnętrznych granic jelita ślepego oraz całe jelito ślepe jako takie, w tym jego części takie jak warstwa śluzówki.
Stadium kultury okresowej może być przeprowadzane w każdym konwencjonalnym fermentorze. Jednak zastosowanie chemostatu bez rozcieńczenia (tzn. bez dodawania świeżej pożywki hodowlanej i usuwania zużytej pożywki hodowlanej) jest szczególnie korzystne w celu eliminacji przeniesienia hodowli do dalszych etapów i zmniejszenia ewentualnej kontaminacji hodowli. Po ich zebraniu, treść jelita grubego lub ślepego ze zwierzęcia lub jego odchody, które mająbyć zastosowane jako inokulum, są łączone z odpowiednim podłożem hodowlanym i inkubowane w warunkach beztlenowych. Hodowla okresowa powinna być kontynuowana:
1. od około 6-18 godzin, szczególnie korzystnie 12-18 godzin
2. do momentu gdy gęstość optyczna (mierzona przy 600 nm) osiągnie przynajmniej 1,0, i/lub
3. nie więcej niż 2 godziny po osiągnięciu wartości pH około 4,2.
Po tym czasie hodowla okresowa powinna być zakończona i winna być rozpoczęta hodowla ciągła. Gdy okres inkubacji jest określony przez warunek (1), a szczególnie warunek (2)
178 535 korzystne jest kontrolowanie pH przy wartości około 5,5 używając zazwyczaj stosowany przyrząd do kontroli pH. Co więcej, w przypadku nie stosowania kontroli pH, w celu uniknięcia śmierci części komórek, korzystne jest kontynuowanie hodowli okresowej przy wartości pH nie mniejszej od 4,2.
Hodowla ciągła w chemostacie z ciągłym dostarczaniem świeżej pożywki i usuwaniem zużytego podłoża jest rozpoczynana natychmiast po zakończeniu stadium hodowli okresowej. Odpowiednie chemostaty mogąbyć łatwo określone i obejmująna przykład takie jak opisane przez Wanga (Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley & Sons, New York, 1979, str. 99-137, której treść jest tu zawarta w formie odniesienia). Zadziwiające jest, że wzrost tej mieszaniny w ciągłej hodowli z określonym rozcieńczeniem czy tempem wymiany pożywki i w specyficznym pH pozwala hodowli na osiągnięcie równowagi lub stanu stałego. W zależności od zwierzęcia użytego jako źródło inokulum, specyficznego podłoża i warunków hodowli, liczba bakterii obecna wyjściowo może być zmniejszona do stabilnej hodowli z względnie niewieloma zasadniczo biologicznie czystymi bakteriami, które mogąbyć łatwo określone. Na przykład przy stosowaniu ptaków, około 500 bakterii oryginalnie obecnych w inokulum może ulec zmniejszeniu w stabilnej hodowli do około 10 do 40 bakterii. Odpowiednie warunki dla tego stadium obejmują tempo obrotu od około 0,029 do około 0,10 godz.4, korzystnie około 0,0416 godz.4 i pH między około 4,7 i 6,5, szczególnie korzystnie około 5,5.
Temperatura i pożywki stosowane do hodowli okresowej i ciągłej nie sąwartościami krytycznymi i mogąbyć łatwo określone. Odpowiednie temperatury mogą wahać się od 26° do 47°C. Różne odpowiednie podłoża hodowlane z różnymi źródłami energii mogąbyć także stosowane. Bez ograniczania się do nich, korzystne źródła energii to glukoza i galaktoza a szczególnie korzystne laktoza.
Można założyć, że osiągnięto stan stały gdy wartość pH hodowli, OD600 i zawartość lotnych kwasów tłuszczowych pozostaje na mniej więcej stałym poziomie. Po osiągnięciu stanu stałego hodowla może być odzyskana w dowolnym momencie do zastosowania tak jak opisano. Idealnie, kultura stanu stałego powinna być także scharakteryzowana lub określona przez izolację i identyfikację populacji bakteryjnych w niej zawartych przy zastosowaniu metod normalnie używanych w tej dziedzinie. Po izolacji bakterie mogąbyć przechowywane dowolnie długo używając konwencjonalnych metod do późniejszego zastosowania, zgodnie na przykład z opisem patentowym US nr 5340 577. Specjalista biegły w tej dziedzinie oceni, że powyżej opisany proces hodowli okresowej/ciągłej może też być zastosowany z izolowanymi lub biologicznie czystymi bakteriami jako wstępnym inokulum.
Hodowle stanu stałego wyprodukowane według tego sposobu mogąbyć, jeśli jest to konieczne, poddane skriningowi w celu wybrania kompozycji, wykazujących optymalną skuteczność w hamowaniu kolonizacji docelowego zwierzęcia przez Salmonella. Przykładowo skrining może być przeprowadzony in vivo przez podanie obciążeniu Salmonellą jak jest przyjęte w tej dziedzinie i jak opisano w przykładach III i IV. W skrócie, hodowla stanu stałego jest podawana zwierzętom wolnym od Salmonella. Po okresie czasu wystarczającym dla ustalenia tej hodowli wjelicie, na ogół po drugim lub trzecim dniu, zwierzętom podawane jest obciążenie w formie żywotnej hodowli Salmonella, zwierzęta sąhodowane a następnie zabijane, po czym treść jelitowa jest analizowana pod kątem kolonizacji przez Salmonella. Skuteczne hamowanie kolonizacji przez Salmonella jest wykazywane poprzez obniżone średnie stężenie Salmonella (CFU), lub niższy procent kolonizowanych zwierząt, w populacji po probiotyku w porównaniu z populacjąnie poddaną jego działaniu.
Nieoczekiwanie stwierdziliśmy tez, że probiotyki produkowane sposobem według wynalazku lub inną metodą mogą być także dokładnie badane in vivo przez analizę profilu lotnych kwasów tłuszczowych (VFA) w jelicie ślepym. Technika ta nie wymaga zwyczajowego obciążania przez podanie Salmonella. Aby określić skuteczność dowolnej kultury jest ona podawana docelowemu zwierzęciu i pozwala się jej na osadzenie w jelicie jak poprzednio. Około 2-3 dni po podaniu kultury, korzystnie po 3 dniach, zwierzęta są zabijane i mierzy się zawartość kwasu propionowego i całkowitą zawartość lotnych kwasów tłuszczowych (kwasy: octowy plus propiono10
178 535 wy, masłowy, izomasłowy, walerianowy i izowalerianowy) w treści jelita ślepego. Techniki, które mogąbyć zastosowane do pomiaru kwasów sąkonwencjonalne dla tej dziedziny i obejmują chromatografię cieczowo-gazową opisaną przez Corrier i in. (Avian Dis., 34:617-625, 1990), której treść jest tu zawarta przez odniesienie. Skuteczność probiotyku w hamowaniu kolonizacji przez Salmontlla jest stwierdzana gdy:
1. stężenie kwasu propionowego jest większe lub równe około 10 mmol/g treści jelita ślepego, i/lub
2. całkowite stężenie lotnych kwasów tłuszczowychjest około 100% lub więcej wyższe niż u zwierząt kontrolnych.
Chociaż stężenie kwasu propionowego można określać po drugim dniu, przewidywalność skuteczności zmniejsza się jeśli jest oparta na pomiarach całkowitej zawartości lotnych kwasów tłuszczowych po trzecim dniu.
Podobnie jak wymieniony powyżej, złożony z 29 szczepów- probiotyk, hodowle stanu stałego wyprodukowane sposobem według wynalazku mogąbyć użyte bezpośrednio jako probiotyk lub przechowane celem późniejszego zastosowania. Podobnie, bakterie z których składa się kultura mogą być także izolowane i identyfikowane, i znane lub standardowe szczepy lub izolaty z tego samego docelowego zwierzęcia mogąbyć podstawione(użyte) zamiast bakterii tego samego rodzaju czy gatunku w hodowli stanu stałego jak opisano powyżej.
Sposobem według wynalazku można wyprodukować duże ilości probiotyków albo w warunkach hodowli pojedynczej albo w ciągłej hodowli bakterii na odpowiednim podłożu hodowlanym stosując beztlenowe zwyczajowe dla tej dziedziny techniki hodowli. Z tych metod, hodowla ciągłajest szczególnie korzystna ponieważ hodowle stanu stałego sąniesłychanie stabilne i mogąbyć utrzymywane w nieskończoność w warunkach hodowli stanu stałego. Inokulum do hodowli na dużą skalę może być próbką lub zarodzią hodowli stanu stałego, depozytem lub hodowlą muzealną lub zasadniczo biologicznie czystym izolatem bakterii. Bakterie mogąbyć hodowane razem lub na oddzielnych podłożach i następnie łączone ze sobądla ułatwienia standaryzacji. Zgodnie z ostatnią techniką, końcowe stężenie każdej bakterii powinno wynosić około 108do 109 organizmów na ml przed dokonaniem ich połączenia. Jednakże specjalista biegły w tej dziedzinie będzie wiedział, że stężenie to nie jest krytyczne i może ulegać zmianom.
Na ogół gdy prowadzi się hodowlę w dużej skali w hodowli okresowej, hodowla winna być inkubowana przez 16-72 godzin, korzystnie od 24-48 godzin, przed zebraniem. Jednak stwierdziliśmy, że w każdym razie hodowla okresowa powinna być prowadzona aż do osiągnięcia następujących parametrów fermentacji:
1. stężenie kwasu octowego jest większe lub równe około 20 mM,
2. stężenie kwasu propionowego jest większe lub równe około 10 mM stężenie kwasu masłowego plus izomasłowego jest większe lub równe około 15 mM.
Stosowanie probiotyku sposobem według wynalazku nie zależy od konkretnej metody produkcji. Probiotyki wytwarzane którąkolwiek z metod opisanych powyżej mogąbyć wykorzystane w ten sam sposób. Po wytworzeniu kultury bakteryjnej mogąbyć podane zwierzęciu, bezpośrednio, pojedynczo lub w połączeniach. Produkt żywieniowy zawiera paszę zwierzęcą w kombinacji z kompozycją złożoną z populacji zasadniczo biologicznie czystych bakterii, w skład których to bakterii wchodzią zasadniczo wszystkie:
(1) pierwszy szczep Enttrococcus fatcalis, (2) drugi szczep Enttrococcus fatcalis, (3) pierwszy szczep Enttrococcus fatcium, (4) drugi szczep Enttrococcus fatcium, (5) trzeci szczep Enttrococcus fatcium, (6) Enttrococcus avium, (7) trzeci ' szczep Enttrococcus fatcalis, (8) Lactococcus lactis, (9) pierwszy szczep Lactobacillus,
178 535 (10) pierwszy szczep Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii, (12) bakteria należąca do rodziny Enterobacteriaceae, (13) szczep Pseudomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) drugi szczep Escherichia coli., (16) pierwszy szczep Propionibacteriium, (17) drugi szczep Propionibacterium, (18) drugi szczep Lactobacillus, (19) pierwszy szczep Bifidobacterium lub trzeci szczep Lactobacillus, (20) trzeci szczep Propionibacterium, (21) pierwszy szczep Eubacterium, (22) drugi szczep Eubacterium, (23) nieznana bakteria określona jako szczep OAGPB-5, (24) trzeci szczep Eubacterium, (25) drugi szczep Bifidobacterium lub czwarty szczep Lactobacillus, (26) trzeci szczep Bifidobacterium lub piąty szczep Lactobacillus, (27) czwarty szczep Propionibacterium, (28) szczep Veillonella, i (29) szczep Fusobacterium.
w ilości efektywnie hamującej kolonizację drobiu przez Salmonella.
Można też preparować probiotyk z odpowiednim nośnikiem, między innymi, ale nie wyłącznie, z laktozą lub mlekiem odtłuszczonym, lub łączyć z małą ilościąpaszy do stosowania w postaci premiksu. Kultury mogą być także liofilizowane dla stabilnego przechowywania i łatwości obróbki. Takie liofilizowane hodowle mogąbyć bezpośrednio podawane zwierzęciu lub też rekonstytuowane przed użyciem. Należy zauważyć, że jedna lub wszystkie z bakterii mogą być zakapsułkowane stosując konwencjonalne w tej dziedzie metody, między innymi, ale nie wyłącznie, enkapsulaeję w żelu alginianowym. Mimo że brakjest dokładnej teorii uważa się jednak, że ten sposób enkapsulacji może zapobiec obniżaniu przez pewne bakterie do poziomów niepożądanych stężenia kwasu mlekowego w górnych częściach przewodu pokarmowego. Może tez chronić bakterie i pozwalać im na osiągnięcie jelita ślepego, gdzie obecność kwasu mlekowego jest korzystną
Probiotyk według wynalazku może być łączony z innymi zasadniczo czystymi bakteriami, które są stosowane w probiotykach skutecznych w kontroli Salmonella u zwierząt domowych lub ptaków, a w szczególności z bakteriami wytwarzającymi kwas mlekowy lub lotne kwasy tłuszczowe. Bez ograniczania się do nich, inne odpowiednie bakterie obejmują gatunki Peptostreptococcus lub bakterie opisane w DeLoach (zgłoszenie patentowe US nr 07/822 505), którego zawartość jest tu włączona przez odniesienie. Inne środki pomocnicze-konwencjonalne czy stosowane w dziedzinie leczenia zwierząt domowych czy ptactwa, a w szczególności do hamowania enteropatogenów, mogą być dodawane do probiotyku. Odpowiednie środki pomocnicze-adjuwanty obejmują np. kokcidiostatyki, które nie są skuteczne przeciw organizmom Gram-dodatnim. Szczególnie korzystne jest dodanie laktozy. Zgodnie z postępowaniem w danej dziedzinie zwierzętom lub ptakom można podawać także nieterapeutyczne ilości antybiotyków·'. Antybiotyki takie mogą być podawane w kombinacji z probiotykiem lub oddzielnie. Alternatywnie antybiotyki te mogątakże być podane ptakom in ovo w ilościach, które są ilościami terapeutyczny mb ale które spadają do poziomu nieterapeutycznego po około 3 dniach po wykluciu.
Podczas gdy probiotyk zgodnie z wynalazkiemjest przede wszystkim podawany lub wprowadzany do przewodu pokarmowego poprzez połączenie z paszą lub wodą, a następnie spożycie, można przewidzieć także jego podawanie doustne lub donosowe poprzez rozpylanie preparatu bezpośrednio na zwierzę zgodnie z regułami dziedziny. Inne alternatywy obejmują wstrzykiwanie bezpośrednio do przewodu pokarmowego lub podawanie do steku. W odniesieniu do tej ostatniej metody, probiotyk może być bezpośrednio rozpylany na otwór stekowy ptaka lub na ściółkę
178 535 klatki gdzie wejdzie w kontakt z obszarem otworu stekowego w czasie normalnej aktywności ptaków. Po wej ściu w kontakt z obszarem otworu stekowego probiotyk zostaje wprowadzony do steku drogą odwrotnej perystaltyki.
Podanie probiotyku może nastąpić w dowolnym momencie w życiu zwierzęcia. Jednak szczególnie korzystnejest podanie probiotyku świeżo wyklutym ptakom w wieku od 1 do 14 dni.
Probiotyk podawany jest traktowanemu nim zwierzęciu, w porównaniu ze zwierzętami nie traktowanymi probiotykiem, w ilości skutecznej dla znaczącego hamowania kolonizacji przez Salmonella. Odpowiednie ilości może łatwo określić specjalista w danej dziedzinie przy czym będą się one nieco wahać w zależności od wieku i wielkości zwierzęcia.
Następujące przykłady mają na celu wyłącznie dodatkowe zobrazowanie wynalazku, natomiast nie jest ich celem ograniczenie zakresu ochrony zakreślonego przez zastrzeżenia patentowe.
Przykład I. Otrzymywanie probiotyku
Wstępne inokulum. Inokulum otrzymano od trzech 1O-tygodniowych kurcząt typu broiler wolnych od Salmonella, hodowanych od wyklucia na karmie i wodzie wolnej od lekarstw-. Ptaki zabito i aseptycznie usunięto z nich jelita ślepe, które zostały bezpośrednio przeniesione do komory beztlenowej (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI). Każde jelito ślepe pocięto na kilka kawałków i rozdrobniono w Lab Blender (Tekmar, Cincinnati, Ohio). Rozdrobnione tkanki jelita ślepego i treść połączono i dokładnie zhomogenizowano i dodano glicerol do końcowego stężenia 20%. Ostateczny homogenatjelita ślepego zamrażano w -70°C do momentu użycia. Dziesięć ml zamarzniętego homogenatu jelita ślepego rozmrażano i inkubowano w warunkach beztlenowych w 100 ml bulionu VIANDE LEVURE (VL) w 39°C i stosowano jako kulturę do zaszczepiania kolejnej hodowli w ciągłym przepływie (CF).
Aparatura do ciągłego przepływu. Zarówno stadia hodowli okresowej jak i hodowli o ciągłym przepływie przeprowadzano w chemostacie 1150 ml fermentora BioFloIII (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ). Gdy hodowlę prowadzono w warunkach ciągłego przepływu, stosowano następujące parametry:
- tempo rozcieńczenia 0,0416'* (co odpowiada tempu przepływu 0,80 ml/min i czasowi wymiany w pojemniku 24 g),
- temperatura 39°C,
- tempo wytrząsania 200 obr./min.
Warunki beztlenowe utrzymywano przez przepłukiwanie ciągłym strumieniem dwutlenku węgla wolnego od tlenu.
Wzrost organizmów z jelita ślepego w warunkach ciągłego przepływu Naczynie chemostatu wypełniano 1050 ml sterylnego bulionu Viande Levure (VL), zaszczepiano 100 ml hodowli i inkubowano beztlenowo w hodowli okresowej w 39°C z tempem wytrząsania 200 obr./min. Po 6 godzinach w hodowli okresowej włączano pompę do pożywek i hodowlę inkubowano w warunkach ciągłego przepływu. Warunki stanu stałego uzyskiwano po około 5 dniach hodowli z przepływem ciągłym. Uznawano warunki za stan stały gdy wartość pH, OD600 i stężenia lotnych kwasów tłuszczowych pozostawały mniej więcej stałe.
Próbki hodowli w ciągłym przepływie zbierano aseptycznie po 5 dniach i 61 dniach hodowli i wysiewano na agarze tryptozowym uzupełnionym 5% krwią bydl<^«^£^, agarze McConkey i agarze krwistym Center for Disease Control (CDCBA). Płytki z agarem tryptozowym i płytki z agarem McConkey inkubowano w powietrzu w 37°C przez 7 dni. Płytki CDCBA inkubowano w komorze beztlenowej (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI) zawierającej atmosferę 80% azotu, 10% wodoru i 10% dwutlenku węgla w 3 7°C przez 7 dni. Dwadzieścia dziewięć izolatówbakteryjnych złożonych z 15 względnych i 14 bezwzględnych beztlenowców reprezentujących 10 różnych rodzajów zidentyfikowano w dniu 5 i ponownie w 61 dniowych hodowlach w przepływie ciągłym. Zidentyfikowano 29 izolatów bakteryjnych stosując biochemiczne i enzymatyczne procedury i profile podatności na związki przeciwbakteryjne stosowane zwykle w tej dziedzinie (Holdeman et al, 1977, Anaerobe Laboratory Manual, wyd. 4, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, Farmer i in., 1985, J. Clin. Microbiol., 21:46-76;
178 535
Lennette i in., Clinical Microbiology. wyd. 4, American Society for Microbiology, Waszyngton,
D. C., i Deveriese et al., 1987, Int. J. Syst.Bacteriol., 37:257-259, ich treść jest tu zawarta w formie odniesienia). Wyniki opisano w przykładzie II.
Bakterie zidentyfikowano jako:
I. Względnie beztlenowe Gram dodatnie ziarniaki:
(1) Enterococcus faecalis określany jako szczep M, (2) Enterococcus faecalis określany jako szczep N, (3) Enterococcus faecium określany jako szczep Y, (4) Enterococcus faecium określany jako szczep Z, (5) Enterococcus faecium określany jako szczep X, (6) Enterococcus avium, (7) Enterococcus faecalis określany jako szczep O,
II. Względnie beztlenowe Gram-dodatnie ziamiakolaseczki:
(8) Lactobacillus lactis podgatunek diacetylactis, (9) gatunek Lactobacillus (szczep nr 1),
III. Względnie beztlenowe Gram-ujemne laseczki:
(10) Escherichia coli określana jako szczep CC-3A, (11) szczep Citrobacter freundii określony jako CC-3, (12) bakteria należąca do rodziny Enterobacteriaceae (wstępnie szczep Enterobacter,
E. coli lub Kluyvera cryocrescens), (13) gatunek Pseudomonas, (14) Serratia liąuefaciens, (15) Escherichia coli określana jako szczep CC-3B,
IV. Bezwzględnie beztlenowe Gram-dodatnie laseczki:
(16) gatunek Propionibacterium (szczep nr 1, wstępnie P jensenii lub P thoenii), (17) gatunek Propionibacterium (szczep nr 2, wstępnie P granulosum), (18) gatunek Lactobacillus (szczep nr 2), (19) gatunek Bifidobacterium (szczep nr 1) lub gatunek Lactobacillus (szczep nr 3), (20) gatunek Propionibacterium (szczep nr 3), (21) gatunek Eubacterium (szczep nr 1), (22) gatunek Eubacterium (szczep nr 2), (23) nieznana bakteria określana jako szczep OAGPB-5, (24) gatunek Eubacterium (szczep nr 2), (25) gatunek Bifidobacterium (szczep nr 2) lub gatunek Lactobacillus (szczep nr 4), (26) gatunek Bifidobacterium (szczep nr 3) lub gatunek Lactobacillus (szczep nr 4), (27) gatunek Propionibacterium (szczep nr 4),
V. Bezwzględnie beztlenowe Gram-ujemne ziarniaki:
(28) szczep Veillonella, i
VI. Bezwzględnie beztlenowe Gram-ujemne laseczki:
(29) gatunek Fusobacterium
Hodowla w ciągłym przepływie, określona jako złożona z 29 izolatów wykazała wzrost w hodowli mieszanej, żywotność w kwaśnym środowisku (pH 5,0 do 6,5) i wytwarzanie lotnych kwasów tłuszczowych (VFA) jako końcowych produktów fermentacji.
Skład probiotyku, jako kompozycji zawierającej 29 wyżej wymienione szczepy bakteryjne został zdeponowany zgodnie z Umową Budapeszteńską w American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA) jako Competitive Exclusion Culture CF3 (współzawodnicząca hodowla wykluczająca) i otrzymała nr ATCC 55515.
Przykład II. Charakterystyka bakterii
Chromatografia gazowo-cieczowa (GLC). Każdy z 29 szczepów bakterii z CDCBA zaszczepiano do pożywek płynnych pepton-drożdże (PY) i PY +1% glukoza (PYG), a następnie inkubowano w warunkach beztlenowych w 37°C przez 2 dni. Lotne kwasy tłuszczowe (vFa) i nielotne kwasy tłuszczowe (NVFA) ekstrahowano stosując procedury standardowe, a następnie
178 535 wykrywano je stosując GowMac GLC. GLC kalibrowano handlowo dostępnymi standardami VFA i NVFA. Wyniki przedstawiono w tabelach 1A - 1C.
Charakterystyka komórek, kolonii i hodowli. Reakcję Grama i morfologię komórek względnych beztlenowych bakterii 1-15 określono stosując preparaty barwione Gramem z agaru krwistego po inkubacji przez 24 godziny w 37°C. Ruchliwość bakterii określano stosując miękki agar (0,4%) z solami tetrazolowymi. Pożywkę do badania ruchliwości zaszczepiano bakteriami z agaru krwistego, a następnie inkubowano w obecności powietrza w 37°C przez 24 godziny. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie.
Aby określić charakterystykę hodowli, bakterie 1-9 zaszczepiano na 2 płytkach z agarem krwistym, 2 z agarem MacConkey, 2 z agarem krwistym z azydkiem sodu, i 2 z agarem krwistym z eskulinąi żółcią. 1 płytkę z każdego rodzaju inkubowano na powietrzu w 37°C. 1 płytkę z agarem krwistym i 1 płytkę z agarem MacConkey inkubowano w atmosferze 80% azotu, 10*% wodoru i 10% dwutlenku węgla w 37°C. Jednąpłytkę z agarem krwistym z azydkiem sodu i 1 płytkę agaru z eskuliną i żółcią inkubowano w powietrzu w 45°C przez 2 dni. Zdolność do wzrostu, charakterystyka kolonii i wzory hemolizy na agarze krwistym, reakcja laktozowa na agarze MacConkey i hydroliza eskuliny na agarze z eskulinąi żółcią były odczytywane po 1 i 2 dniach inkubacji. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie.
Aby określić cechy hodowli względnych beztlenowych Gram-ujemnych bakterii 10-15, stosowano tę samąprocedurę z pominięciem płytek z agarem krwistym z azydkiem sodu i płytek z eskuliną i żółcią.
Dla bezwzględnie beztlenowych bakterii 16-29 badano reakcję Grama i morfologię komórki bakteryjnej stosuj ąc barwienie Gramem bakterii z agaru krwistego z ekstraktem z mózgów serc wzbogaconym heminą i menadionem (CDCBA), które inkubowano w atmosferze 80% azotu, 10% wodoru i 10% dwutlenku węgla w 37°C przez 2 dni. Ruchliwość określano stosując handlowo dostępną zredukowaną pożywkę sterylizowaną w warunkach beztlenowych (PRAS) od CDCBA, a następnie inkubowano bakterie przez 2 dni w 37°C.
Aby określić cechy hodowli bakterie 16-29 zaszczepiano na 2 płytkach CDCBA i 2 płytkach agaru MacConkey. Jednąpłytkę CDCBA i 1 płytkę MacConkey inkubowano w powietrzu w 3 7°C oraz 1 płytkę CDCBA i 1 płytkę MacConkey inkubowano w warunkach beztlenowych w 37°C. Zdolność do wzrostu i charakterystykę kolonii i wzór hemolizy na CDCBA odczytywano po 1, 3 i 5 dniach inkubacji. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie.
Wyniki przedstawiono w tabelach 2A-C.
Testy na obecność katalazy, oksydazy i redukcji azotu. Dla względnie beztlenowych bakterii 1 -9, kolonie z agaru krwistego inkubowanego w powietrzu w 37°C przez 2 dni użyto do testów na katalazę i oksydazę. Odczynnikami do przeprowadzenia testów na katalazę i oksydazę były odpowiednio 3% H2O2 i 1% roztwór chlorowodorku tetrametylo-p-fenylenodiaminy. Reakcje oksydazy i katalazy odczytywano jako dodatnią lub ujemną. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie. Dla bakterii względnie beztlenowych Gram-dodatnich 10-15 zastosowano ten sam test lecz hodowlę inkubowano przez tylko 24 godziny.
Dla bezwzględnie beztlenowych bakterii 16-29 zastosowano do przeprowadzenia testów na katalazę i oksydazę kolonie z CDCBA inkubowane w warunkach beztlenowych w 37°C przez dni. Odczynniki do testów na katalazę i oksydazę były takie jak podano powyżej. Bakterie do testu na katalazę i oksydazę wystawiano na powietrze przez 30 minut przed dodaniem odczynników. Wszystkie reakcje odczytywano jako dodatnie lub ujemne. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie.
Stosowano dwie metody do detekcji reduktazy azotanowej u względnie beztlenowych bakterii 1-15. W metodzie agaru z azotanami, agar zawierający 0,1% KNO2 zaszczepiano bakteriami z agaru krwistego, które były inkubowane w 37°C przez 24 godziny. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C, dodawano odczynniki A i B (N,N-dimetylo-naftylamina i kwas sulfanilowy). W metodzie beztlenowej krążków na agarze krwistym, organizm wysiewano na agar krwisty, a następnie kładziono krążek papierowy nasycony 0,4% roztworem KNO3 na obszar gęstego rozmazu. Płytkę inkubowano w warunkach beztlenowych w 37°C przez 24 godziny, a następnie na
178 535 krążek papierowy nakładano odczynniki A i B. Aby określić czy zachodziła redukcja azotanu dalsza niz do azotynu, do krążka po dodaniu odczynników dodawano pył cynkowy. Wszystkie reakcje odczytywano jako dodatnie lub ujemne. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie.
Dla bezwzględnie beztlenowych bakterii 16-29 oznaczano reduktazę azotanową stosując powyżej opisaną metodę beztlenową krążka na krwistym agarze, z tą różnicą, że zamiast agaru krwistego stosowano CDCBA.
Wyniki przedstawiono w tabelach 3A-C.
Testy tlenowego wykorzystania węglowodanów. Dla względnie beztlenowych bakterii 1 -9 badano produkcję kwasu z glukozy, dulcytolu, laktozy, maltozy, mannitolu, salicyny i sukrozy stosując 1% substrat w podłożu czerwieni fenolowej w bulionie. Do wykrywania produkcji gazu w pożywce z glukozą była stosowana probówka Durhama. Każdąprobówkę zaszczepiano badanym organizmem z agaru krwistego inkubowanego w powietrzu w 37°C przez 24 godziny. Pożywki inkubowano w powietrzu w 37°C przez 2 dni. Obserwowano zachodzenie zmiany barwy w każdej probówce. Probówki z czerwoną barwą były uznane 'za ujemne a z żółtą barwą za dodatnie. Każdy test przeprowadzono dwukrotnie.
Tak samo postępowano z względnie beztlenowymi Gram-ujemnymi bakteriami 10-15, z tym, ze oznaczano tylko glukozę, laktozę i sukrozę.
Agar TSI (potrójny cukier-żelazo) zaszczepiano w hodowli wszystkich względnych beztlenowców 1-15 na agarze krwistym inkubowanym w powietrzu w 37°C przez 24 godziny.
Po 24 godzinach inkubacji w powietrzu w 37°C odczytywano reakcje na agarze TSI jako dodatnie lub ujemne. Test przeprowadzano dwukrotnie.
Względnie beztlenowymi bakteriami 1-9 zaszczepiano bulion Voges Proskauer z agaru krwistego, a następnie inkubowano w powietrzu w 37°C przez 24 godziny. Dodawano odczynniki A i B (40% KOH i alfa-naftol) i reakcję odczytywano jako dodatnią lub ujemną. Test przeprowadzano dwukrotnie.
Dla względnie beztlenowych bakterii Gram-ujemnych 10-15 zaszczepiano dwie probówki z bulionem Voges Proskauer z czerwienią metylową z płytki z agarem krwistym, która była inkubowana w powietrzu w 37°C przez 24 godziny. Dla próby z czerwienią metylową dodano roztworu czerwieni metylowej do probówki A. Dla testu Vogesa-Proskauera, odczynniki A i B (40% KOH i alfa-naftol) dodano do probówki B. Reakcje odczytywano jako ujemne lub dodatnie. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie.
Wyniki przedstawiono w tabelach 3 A-C.
Testy wykorzystywania aminokwasów i próby na obecność ureazy. Względnie beztlenowe Gram-uj emne bakterie 10-15 testowano na dekarboksylazę lizyny i ureazę, a bakterie 1-15 badano na produkcję indolu. Agar żelazowy z lizyną (LIA) stosowano do wykrycia dekarboksylazy lizyny. LIA zaszczepiano z płytki z agarem krwistym a następnie inkubowano w powietrzu w 37°C przez 24 godziny. Reakcje odczytywanojako dodatnie lub ujemne. Testy powtarzano dwukrotnie.
Stosowano dwie metody do wykrywania produkcji indolu z tryptofanu. Bulion tryptofanowy zaszczepiany z agaru krwistego, inkubowano w powietrzu w 37°C przez 24 godziny, a następnie przeprowadzano reakcję z odczynnikiem Ehrlicha. Stosując metodę beztlenowa z krążkiem rozsiewano organizm na płytce z agarem krwistym, a następnie umieszczano krążek papieru na powierzchni agaru. Płytkę z agarem krwistym inkubowano w warunkach beztlenowych w 37°C przez 24 godziny, a następnie na krążek nakładano 1 % roztwór p-dimetyloaminocynamoaldehydu. Wszystkie wyniki odczytywano jako dodatnie lub ujemne. Test na bulionie tryptofanowym wykonywano dwukrotnie a test beztlenowy z krążkiem jeden raz.
Agar z mocznikiem inokulowano z płytki z agarem krwistym i inkubowano w powietrzu w 37°C przez 24 godziny. Reakcję odczytywano jako dodatnią lub ujemną, test powtarzano dwukrotnie.
Wyniki te są także przedstawione w tabelach 3 A-C.
Handlowy system API20E. Względnie beztlenowe Gram-ujemne bakterie 10-15 także' analizowano pod kątem 20 reakcji biochemicznych (tabela 4) stosując handlowy system opisany przez producenta (Analytab Products, Plainview, NY). Testy powtórzono dwukrotnie.
178 535
Wyniki przedstawiono w tabeli 4.
Fermentacja węglowodanów, upłynniania żelatyny i testy wykorzystywania aminokwasów Handlowo dostępne zredukowane pożywki płynne sterylizowane w warunkach beztlenowych (PRAS) (tabela 5) zaszczepiano gęstą zawiesiną względnie beztlenowych bakterii 1-15 z agaru krwistego. Pożywki inkubowano na powietrzu w 37°C przez 5 dni i określano wartość pH każdej hodowli po 1, 3 i 5 dniach za pomocą pehametru. Hodowle o wartości pH < 6,5 odczytywano jako dodatnie, a z pH > 6,6 jako ujemne. Pożywki argininowe badano pod kątem zwiększenia wartości pH, a pożywki z żelatynąpod kątem upłynnienia. Każdy test przeprowadzanojednokrotnie.
Tę samąprocedurę powtarzano z bezwzględnie tlenowymi bakteriami 16-29 ale inokulum przygotowywano z organizmów hodowanych na CDCBA i wszystkie inkubacje przeprowadzano w warunkach beztlenowych.
Wyniki przedstawiono w tabelach 5A-C i 3 A-C.
Testy handlowym systemem API Rapid STREP. U względnych beztlenowców 1-9 badano 20 właściwości biochemicznych (tabela 6) stosując handlowy system do identyfikacji enterokoków i paciorkowców według zaleceń producenta (Analytab Products, Plainview, NY). Pokrótce, kolonie z agaru krwistego inkubowanego w powietrzu w 37°C przez 24 godziny zawieszano w 3 ml sterylnej wody destylowanej by uzyskać zawiesinę bakteryjną odpowiadającą standardowi McF arlanda nr 5. Każdą studzienkę inokulowano i paski inkubowano w powietrzu w 37°C przez 24 godziny. Po 24 godzinach inkubacji dodawano odczynniki do testu produkcji acetoiny, hydrolizy hippuranu i reakcji enzymatycznych dla pyrrolidonylo-2-naftylamidu, alfa-galaktozydazy, beta-glukoronidazy, beta-galaktozydazy, fosfatazy alkalicznej i arylamidazy leucynowej. Reakcje odczytywano po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej jako dodatnie lub ujemne. Hydrolizę eskuliny, dihydrolazę argininy i produkcję kwasu z rybozy, arabinozy, mannitolu, sorbitolu, laktozy, trehalozy, inuliny, rafmozy, skrobii i glikogenu odczytywano jako dodatnie lub ujemne. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.
Test handlowym systemem API STAPH Trac. Względnie beztlenowe bakterie 1 -9 oceniano pod kątem 19 cech biochemicznych (tabela 7) stosując handlowy system zgodnie z opisem producenta (Analytab Products, Plainview, NY). Pokrótce kolonie z agaru krwistego inkubowanego w powietrzu w 37°C przez 24 godziny zawieszano w 5 ml sterylnej wody destylowanej aby uzyskać zawiesinę bakteryj ną odpowiadaj ącą standardowi McFarland nr 5. Każdą studzienkę inokulowano i paski inkubowano w powietrzu w 37°C przez 24 godziny. Po 24 godzinach inkubacji dodawano odczynniki do testów na produkcję acetoiny, fosfatazy alkalicznej, reduktazy azotanowej oraz reakcji enzymatycznych dla alfa-metylglukozydu, dihydrolazy argininy, glukozy, fruktozy, maltozy, mannitolu, mannozy, melibiozy, N-acetylglukozaminy, rafinozy, sacharozy, trehalozy, ureazy, ksylitolu i ksylozy. Reakcje odczytywano jako dodatnie lub ujemne. Każdy test przeprowadzano dwukrotnie. Wyniki przedstawiono w tabeli 7.
Handlowe testy systemem API ZYM. U wszystkich względnych tlenowców 1-15 badano aktywności enzymatyczne w stosunku do 19 substratów (tabela 8) stosując handlowy półilościowy system enzymatyczny zgodnie z opisem producenta (Analytab Products, Plainview, NY). Pokrótce, kolonie z agaru krwistego inkubowanego w powietrzu w 37°C przez 24 godziny zawieszano w 3 ml sterylnej wody destylowanej, aby uzyskać zawiesinę bakteryjną odpowiadaj ącą standardowi McFarlanda nr 5. Każdą studzienkę paska inokulowano zawiesiną bakteryjną. Po inkubacji w 37°C przez 4 godziny w ciemności dodawano odczynnik A i B do każdej studzienki i zostawiano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Intensywności zabarwienia reakcji porównywano do schematu dostarczonego przez producenta i oceniano następująco: 0=brak zmiany barwy, ślady <5 nanomoli (nmol), 1=5 nmol, 2=10 nmol, 3=20 nmol, 4=30 nmol, i 5>40 nmol.
Te same procedury powtórzono dla bezwzględnie beztlenowych bakterii 16-29, z tą różnicą, że inokulum przygotowywano z organizmów hodowanych na CDCBA w warunkach beztlenowych. Wyniki przedstawiono w tabelach 8 A-C.
Handlowe płytki Presumpto I, II i III. Dla bezwzględnych beztlenowców bakterii 16-29 zaszczepiano płytki Presumpto I, II i III bakteriami z CDCBA, a następnie inkubowano w warunkach beztlenowych w 37°C przez 2 dni. Testy przeprowadzano i wyniki odczytywano zgodnie
178 535 z zaleceniami producenta (tabela 9). Każdy test przeprowadzano dwukrotnie. Wyniki przedstawiono w tabelach 9A-D.
Ttsty wrażliwości na związkip)rztciwbakttryjnt. Stosowano standardową procedurę dyfuzj i z krążka do badania względnych beztlenowców 1-15 pod kątem ich wrażliwości na wybrane związki przeciwbakteryjne jak przedstawiono w tabeli 10. Wyniki odczytywano jako oporne lub wrażliwe (włączając w to średnio wrażliwe). Każdy test przeprowadzono raz.
Tę samą procedurę powtórzono z bezwzględnymi beztlenowcami bakteriami 16-19, z tą różnicą, że stosowano CDCBA i hodowle inkubowano w warunkach beztlenowych.
Wyniki przedstawiono w tabelach 10A-C.
Wyniki. Wyniki badań przedstawiono w tabelach 1 do 10. Wszystkie bakterie identyfikowano zgodnie ze standardowymi kryteriami hodowli i biochemicznymi.
Przykład III. Doświadczenia in vivo z kurczętami broilerami
Salmontlla. Pierwszy izolat S. typhimurium z kurcząt otrzymany z National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA 50010 wybrano pod kątem oporności na nowobiocynę (NO) i kwas nalidyksowy (NA) w naszym laboratorium i utrzymywano w pożywkach z 25 gg NO i 2 0 gg NA/ml. Badane inokula przygotowywano z hodowli nocnej, przeniesionej poprzednio trzykrotnie w bulionie sojowym z tryptykaząi seryjnie rozcieńczonej w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do stężenia 4 x 104 x cfu/1,0 ml. Stężenie żywotnych komórek obciążającego inokulum potwierdzano przez liczenie kolonii na płytkach z agarem z zielenią brylantową (BGA). Pożywki stosowane do hodowania z NO-NA z obciążanych kurcząt w badaniach eksperymentalnych zawierały 25 gg NOi2O pg NA/ml do hamowania wzrostu bakterii i nieopomych Salmonelli.
Kurczęta broilery płci męskiej otrzymywano w dniu wylęgu z handlowej wylęgami i umieszczano w klatkach na podłodze ze ściółką ze skrobanej sosny. Kurczęta trzymano w warunkach ciągłego oświetlenia; miały one swobodny dostęp do wody i paszy z kukurydzy i soi bez dodatku lekarstw, która to pasza zawierała co najmniej poziomy istotnych składników odżywczych zalecanych przez National Research Council (1984). Papierowe wyściółki z pudełek, w których transportowano kurczęta i trzy losowo wybrane próbki karmy po 25 g kolejno hodowano w buforowanej wodzie peptonowej, bulionie z seleninem cystyny i na płytkach BGA jak uprzednio opisano (Andrews i in., 1978, Isolation and Identification of Salmontlla, W : Bacteriological Analytical Manual, 5 wydanie, Assoc. of Anal. Chem., Waszyngton, D. C., Rozdział 6,1 -24) i badano na obecność salmonelli. Nie stwierdzono obecności Salmontlla spp. w wyściółkach papierowych i karmie. Kurczęta losowo przypisywano do dwóch grup i podawano im albo 1) nic (kontrolne) albo 2) określoną kulturę (CC) w pierwszej wodzie do picia. CC zbierano jako wypływ z hodowli ciągłego przepływu z przykładu I, zawierała ona około 108 beztlenowych cfu/ml, i była dodawana do wody pitnej w stosunku 1:5 (1 część CC; 4 części wody). Kurczęta badane otrzymywały wodę z bakteriami przez 18 godzin i szacowano, że każde kurczę wypiło 10 ml wody z CC. Po 18 godzinach usunięto resztę wody z bakteriami i zastąpiono ją świeżą wodą wodociągową. W trzecim dniu, dwa dni po podaniu CC i przed próbą z podaniem Salmontlla wybrano losowo 10 kurcząt z każdej grupy i zabito je przez złamanie szyi. Zbadano stężenie lotnych propionowych kwasów tłuszczowych (VFA) i całkowite stężenia VFA (octowy+propionowy + masłowy + izomasłowy+walerianowy + izowalerianowy) w treści jelita ślepego stosując gazową chromatografię cieczowąjak uprzednio opisano (Corrier i in., 1990, Avian Dis., 34: 617-625). Wszystkie pozostałe kurczęta przetestowano przez przepłukanie wola w wieku 3 dni stosując 104 cfu s. typhimurium zgodnie z zaleceniami dla oceniania skuteczności świeżo przygotowanych hodowli bakterii zjelita ślepego (Mead i in., 1989, J. Food Protect., 52:500-502). W wieku 10 dni 20 kurcząt z każdej grupy zabijano i pobierano treść jelita ślepego z każdego kurczęcia aseptycznie i oceniano kolonizację przez S. typhimurium jak opisano poniżej. Treść jelitową z dziesięciu 10-dniowych zabitych kurcząt wybierano losowo i mierzono w nich stężenia VFA, jak opisano powyżej. Schemat eksperymentalny powtórzono w czterech niezależnych próbach stosując nowo wylęgnięte kurczęta i scharakteryzowane bakterie z jelita ślepego utrzymywane w hodowlach o ciągłym przepływie przez 5 dni (Próba 1),26dni(Próba2),40dni(Próba3)i61 dni(Próba4). Stężenia Vfa w treści jelita ślepego mierzono w czasie prób 2, 3 i 4 ale nie w czasie próby 1.
178 535
Stężenie kwasu propionowego w treści jelita ślepego kurcząt, którym podano bakterie była znacząco podwyższona (P < 0,005) w porównaniu z danymi kontrolnymi w dniu 3 i w dniu 10 w próbach 2, 3 i 4 (tabela 11). Dodatkowo stwierdzono znaczącą korelację (P <0,005) między zwiększonym stężeniem kwasu propionowego w jelicie ślepym zJ3-dniowych kurcząt eksperymentalnych i w zmniejszeniu log10 w liczbie Salmonella w treści jelita ślepego 10-dniowych kurcząt eksperymentalnych (r = -0,99).
W dniu 3 stężenie całkowitych VFA w treści jelita ślepego kurcząt eksperymentalnych było znacząco podwyższone (P <0,01) w porównaniu z kurczętami kontrolnymi (tabela 12). Dodatkowo, zachodziła znacząca korelacja (PP <0,01) pomiędzy zwiększonymi stężeniami całkowitego VFA w 3-dniowych kurczętach eksperymentalnych i zmniejszeniu log1() liczby Salmonella w treści jelitowej 10-dniowych kurcząt eksperymentalnych (r=-0,67). W10 dniu stężenie całkowitych VFA w jelicie ślepym tych kurcząt było znacząco podwyższone (P < 0,05) w porównaniu z kontrolnymi kurczętami z Prób 3 i 4.
Kolonizacja jelita ślepego przez S. typhimurium. Jak podano powyżej, aseptycznie usuwano jedno jelito ślepe z każdego kurczęcia, rozdrobniono je za pomocą nożyczek i inkubowano w 30 ml bulionu z seleninem cystyny przez 24 godz. w 37°C. Po inkubacji bulion wysiewano na płytkach BGA, inkubowano w 24 godzinach i badano czy występujątypowe kolonie S. typhimurium. Porcję (0,2 g) zawartości pozostałego jelita ślepego rozcieńczano seryjnie i wysiewano powierzchniowo na płytki BGA w rozcieńczeniach 1:100, 1:1000 i 1:10 000. Płytki inkubowano przez 24 godz. w 37°C i liczbę cfu S. typhimurium oznaczano stosując automatyczny licznik kolonii (Biotran III, New Brunswick Scientific, Edison, NJ). Typowe kolonie Salmonella potwierdzano poprzez testy biochemiczne na agarze z potrójnym cukrem i żelazem i agarze z lizyną i żelazem (Difco Laboratories, Detroit, Mi) i następnie serologicznie określane jako S. typhimurium stosując przeciwciało przeciw Salmonella O, grupa 13, czynniki 14,12,15 (Difco Laboratories, Detroit, MI). Zliczenia kolonii Salmonella z płytek wyrażano w formie log^ Salmonella na gram treści jelita ślepego. Treść jelita ślepego, która była ujemna pod względem hodowli Salmonella w rozcieńczeniu 1:100 ale dodatnia po hodowli w seleninie cystyny przypisywano losowo wartość 1,50 logw Salmonella/g treści jelita ślepego. Hodowlom na seleninie cystyny, które dawały wynik ujemny na płytkach BGA przypisywano wartość log1() dla Salmonella 0.
Aby ocenić skuteczność traktowania CC w oporności na obciążenie Salmonella wyliczono czynnik ochrony (PF) jak opisano uprzednio (Pivnick i Nurmi, 1982, The Nurmi Concept and its role in the Control of Salmonellae in Poultry, W: Developments in Food Microbiology, Davies (red) Applied Science Publishers, Londyn, 41 -70, Mead i in. 1989, J. Food Protect. 52:500-502). PF = (średni log^ Salmonella grupa kontrolna/średni logw grupa traktowana Salmonella).
Różnice w liczbie kurcząt dodatnich na hodowle Salmonella między grupami analizowano zapomocątestu chi-kwadrat. Różnice między średnimi określano stosując test Studenta. Znaczenie korelacji i wszystkie procedury statystyczne wykonano zgodnie z opisem (Snedecor i Cochran, 1967, Statistical Methods, wyd. 6, Iowa State University Press, Ames, IA).
W porównaniu z kontrolami, liczba S. typhimurium w treści jelita ślepego traktowanych kurcząt obniżyła się wsposób znaczący (P <0,005) o 6,35,5,39,3,84 i 5,77jednostek logw wkażdej z prób 12,3 i 4, odpowiednio (tabela 13). Czynnik ochronny, liczony by ocenić skuteczność charakteryzowanych kultur, wyznaczono jako 63,5,7,14,15,2 i 10,6, odpowiednio dla próby 1,2,3i4.
Eksperymentalna dawka obciążająca 104 S typhimurium dawała w efekcie kolonizacjęjelita ślepego u 90 do 100% kontroli w wieku 10 dni podczas czterech prób (tabela 6). W porównaniu z kontrolami, liczba kurcząt dodatnich na hodowle Salmonella z jelita ślepego w traktowanej grupie obniżyła się wsposób znaczący (P<0,01) o 100%, 65%, 75% i 60%, odpowiednio w próbie 1,2,3 i4.
Przykład IV. Otrzymanie probiotyku
Przygotowano drugą hodowlę stanu stałego stosując procedurę hodowli ciągłej sposobem według wynalazku, jak opisano w opisie patentowym US nr 5 340 577 złożonym 29 lipca, 1992, którego treść jest tu zawarta w formie odnośnika.
Hodowla stanu stałego określonaj ako CFII składała się zj edenastu różnych bakterii, w tym czterech względnie beztlenowych Gram-dodatnich ziarniaków, dwóch względnie beztlenowych
178 535
Gram-dodatnich laseczek, trzech względnie beztlenowych Gram-ujemnych laseczek, jednej bezwzględnie beztlenowej Gram-dodatniej laseczki, i jednej bezwzględnie beztlenowej Gram-dodatniej ziamiakolaseczki. Bakterie zidentyfikowano jako:
(1) Enterococcus faecalis (określony jako szczep A), (2) Enterococcus faecalis (określony jako szczep B), (3) Enterococcus avium, (4) Lactococcus lactis, (5) gatunek Lactobacillus (określany jako CMS), (6) Lactobacillus animalis, (7) Citrobacter freundii, (8) Escherichia coli, (9) Escherichia fergusoni, (10) Bifidobacterium animalis, i (11) Propionibacterium acidipropionici.
Kultury stanu stałego wykazywały znaczącą skuteczność jako probiotyk po podaniu ptactwu, znacząco zmniejszając kolonizację ptaków przez Salmonella typhimurium i S. enteriditis w porównaniu z ptakami nie traktowanymi probiotykiem.
Jest zrozumiałe, że powyższy szczegółowy opis jest podany wyłącznie jako ilustracja a jego modyfikacje i odmiany mogą być stosowane i wprowadzane bez odbiegania od ducha i zakresu wynalazku.
Tabela 1A
VFA Grupa I Grupa II
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG
Mrówkowy S/S S/S -/- T/- -/- -/- -/T -/- -/-
Octowy S/S S/S T/T T/- -/T -/- S/T -/- T/T
Propionowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Izomasłowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Masłowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Izowalerianowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Walerianowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Izokapronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Kapronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
NVFA
Pirogronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Mlekowy T/L T/L T/L S/L T/L T/L L/L S/L T/L
Szczaw iooctowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Malonowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Fumarowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Bursztynowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Benzoesowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Fenylooctowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Ilości VFA (lotnych kwasów tłuszczowych) i NVFA (nielotnych kwasów tłuszczowych) są określane w następujący sposób· - = brak produkcji; T - produkcja śladowych ilości, S - produkcja niewielkich ilości; L - produkcja dużych ilości, oraz V - produkcja bardzo dużych ilości
178 535
Tabela IB
VFA Grupa III Grupa IV
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG
Mrówkowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/-
Octowy S/L S/S S/L T/T T/- S/S T/S S/S T/T -/- S/S
Propionowy T/- T/- T/- -/- -/- -/- T/L L/L -/- -/- S/S
Izomasłowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Masłowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Izowalerianowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Walerianowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Izokapronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Kapronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
NVFA
Pirogronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Mlekowy -IL -/L -/L -/- -/S L/- T/S T/S S/S -/- -/-
Szczawiooctowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Malonowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Fumarowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Bursztynowy -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/- -/- s/s
Benzoesowy L/L L/T L/T -/- -/- L/L T/T -/- -/- -/- -/-
Fenylooctowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
178 535
Tabela IC
VFA Grupa IV Grupa V Grupa VI
21 22 23 24 25 26 27 28 29
PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG PY/PG
Mrówkowy -/- -/- -/- T/- -/- -/- -/- -/- -/- '
Octowy S/L L/S S/- S/- -/- -/S T/T T/T S/T
Propionowy -/- -/- -/- S/L -/- -/- S/- L/L -/-
Izomasłowy -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/- -/-
Masłowy V/L -/S -/- -/S -/- -/- -/- -/- L/V
Izowalerianowy -/- -/- -/L -/- -/- -/- -/- -/-
Walerianowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Izokapronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Kapronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
NVFA
Pirogronowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Mlekowy T/S T/- -/- -/- S/L T/L -/- -/- -/-
Szczawiooctowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Malonowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Fumarowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Bursztynowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Benzoesowy S/- -IL L/- L/- -/- -/- L/L -/- -/-
Fenylooctowy -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
178 535
Tabela 2A
Właściwości komórek, hodowli i kolonii
Warunki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Reakcja Grama + + + + + + + + + -
Morfologia c c c c c c c cb b b
Ruchliwość - -
Oddychanie fa fa fa fa fa fa fa fa fa fa
Wzrost na.
Agarze krwistym + + + + + + + + + +
Agarze MacConkey - - - - - - - - - +
Agarze krwistym z azydkiem sodu + + + + + + + - - NA
Agarze z eskuliną i żółcią (37°C) + + + + + + + NA
Agarze z eskuliną i żółcią (45°C) + + + + + + + NA
CDCBA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Hemoliza - - + + + + - + + -
Reakcja laktozowa na agarze MacConkey NA NA NA NA NA NA NA NA NA +
Hydroliza eskulmy s+ + + + + + + NA
Morfologia c = ziarniak, b = laseczka, cb = ziamiakolaseczka
Oddychanie: oa = bezwzględne beztlenowce, fa = względne beztlenowce
CDCBA = Agar krwisty z wyciągiem z mózgów i serc wzbogacony hemmą i menadionem, hemoliza określana na agarze krwistym dla względnych beztlenowców i na CDCBA dla bezwzględnych beztlenowców
ND = nie dotyczy
Tabela 2B
Właściwości komórek, hodowli i kolonii
Warunki 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Reakcja Grama - - - - - + + f + +
Morfologia b b b b b b b b b b
Ruchliwość + - + + - - - - - -
Oddychanie fa fa fa fa fa oa oa oa oa oa
Wzrost na:
Agarze krwistym + + + + + NA NA NA NA NA
Agarze MacConkey + + + + + - - - - -
Agarze krwistym z azydkiem sodu NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Agarze z eskuliną i żółcią (37°C) NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Agarze z eskuliną i żółcią (45°C) NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA
CDCBA NA NA NA NA NA + + + + +
Hemoliza - - - - - - - +
Reakcja laktozowa na agarze MacConkey on + + +
Hydroliza eskulmy NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA
178 535
Tabela 2C
Właściwości komórek, hodowli i kolonii
Warunki 21 22 23 24 25 26 27 2829
Reakcja Grama + + + + + + + —
Morfologia b cb b b b b cb cb
Ruchliwość - - - - - - - —
Oddychanie oa oa oa oa oa oa oa oaoa
Wzrost na:
Agarze krwistym NA NA NA NA NA NA NA NANA
Agarze MacConkey - - - - - - - —
Agarze krwistym z azydkiem sodu NA NA NA NA NA NA NA NANA
Agarze z eskulinąi żółcią (37 C) NA NA NA NA NA NA NA NANA
Agarze z eskuliną i żółcią (45 C) NA NA NA NA NA NA NA NANA
CDCBA + + + + + + + ++
Hemoliza —
Reakcja laktozowa na agarze MacConkey
Hydroliza eskuliny NA NA NA NA NA NA NA NANA
Tabela 3A
Właściwości biochemiczne
Warunki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 u
Katalaza - - - - - - - - - +
Oksydaza - - - - - - - - - -
Redukcja azotanu
Agar z azotanem - - - - - - - - - +
Beztlenowa - - - - - - - - + +
Bulion glukozowy
Kwas + + + + + + + + +
Gaz - - - - - - - - - +
Wykorzystanie węglowodanów
Dulcytol - - - - - - - - -
Laktoza + + + + + + + + + +
Maltoza + + + + + + + +
Mannitol + + + + + + + + -
Salicyna + + + + + + + + +
Sukroza + + + + + + + + + +
Agar TSI
Fiolka/skos a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a a/a
Gaz - - - - - - - - - +
178 535
Tabela 3a - ciąg dalszy
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Siarkowodór/ - - - - - - - - - -
Czerwień metylowa + + + + + + + - +
V ogues-Proskauer - - - - - - - + - -
Produkcja indolu - - - - - - - - - +
Cytrynian + + - + - - - - - -
Malonian - - - - - - - - -
Dihydrolaza argininy + + + 4- - + + + +
Dekarboksylaza lizyny NA NA NA NA NA NA NA NA NA +
Upłynnianie żelatyny + + - - - - - - -
Ureaza - - - - - - - - - -
Redukcja azotanu:
Agar z azotanem: + = wzrost, - = brak wzrostu Beztlenowa: oznaczana metodą krążka na agarze krwistym
Wykorzystywanie węglowodanów: + = produkcja kwasu, - = brak produkcji kwasu agar TSI fiolka/skos: a = kwaśny, b = zasadowy Dekarboksylaza lizyny określana na agarze LIA NA = nie dotyczy
Tabela 3B Właściwości biochemiczne
Warunki 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Katalaza + + + + + - - - - -
Oksydaza - - + - - - - - - -
Redukcja azotanu
Agar z azotanem + + + + + NA NA NA NA NA
Beztlenowa + + + + + - - -
Bulion glukozowy
Kwas + - + + NA NA NA NA NA
Gaz + - - + NA NA NA NA NA
Wykorzystanie węglowodanów
Dulcytol - - - NA NA NA NA NA
Laktoza + + - - + NA NA NA NA NA
Maltoza - + + NA NA NA NA NA
Mannitol - + NA NA NA NA NA
Salicyna - NA NA NA NA NA
Sukroza + + - + - NA NA NA NA NA
Agar TSI
Fiolka/skos a/a a/a Mb a/b a/a NA NA NA NA NA
Gaz + + - + NA NA NA NA NA
Siarkowodór/ + - - - NA NA NA NA NA
178 535
Tabela 3b - ciąg dalszy
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Czerwień metylowa + + - + + NA NA NA NA NA
V ogues-Proskauer - - - - - NA NA NA NA NA
Produkcja indolu - + - - + NA NA NA NA NA
Cytrynian + - + + + NA NA NA NA NA
Malonian + + NA NA NA NA NA
Dihydrolaza argininy - - + + -
Dekarboksylaza lizyny - + + + +
Upłynnianie żelatyny - - - - -
Ureaza
Tabela 3C Właściwości biochemiczne
Warunki 21 22 23 24 25 26 27 28 29
l 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Katalaza - - - - - - - - -
Oksydaza - - - - - - - - -
Redukcja azotanu
Agar z azotanem NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Beztlenowa -
Bulion glukozowy
Kwas NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Gaz NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Wykorzystanie węglowodanów
Dulcytol NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Laktoza NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Maltoza NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Mannitol NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Salicyna NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Sukroza NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Agar TSI
Fiolka/skos NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Gaz NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Siarkowodór/ NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Czerwień metylowa NA NA NA NA NA NA NA NA NA
V ogues-Proskauer NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Produkcja indolu NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Cytrynian NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Malonian NA NA NA NA NA NA NA NA NA
178 535
Tabela 3C - ciąg dalszy
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dihydrolaza argininy + + - - + +
Dekarboksylaza lizyny
Upłynnianie żelatyny - - - - - -
Ureaza - - - - - +
Tabela 4 System API 20E
Testy biochemiczne Bakteria (izolat)
10 11 12 13 14 15
ONPG +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+
Dihydrolaza argininy -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-
Dekarboksylaza lizyny +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+
Dekarboksylaza omityny +/+ -/- +/+ +/+ +/+ -/-
Cytrynian -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-
H2S -/- +/+ -/- -/- -/- -/-
Ureaza -/- -/- -/- +/+ +/+ -/-
Deaminaza tryptofanu -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Indol +/+ -/- +/+ -/- -/- +/+
Voges-Proskauer -/- -/- -/- -/- +/+ -/-
Zelatyna -/- -/- -/- +/+ +/+ -/-
Glukoza +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+
Mannitol +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+
Inozytol -/- -/- -/- -/- +/+ -/-
Sorbitol +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+
Ramnoza +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+
Sukroza +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+
Melibioza +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+
Amygdalina -/- -/- +/+ -/- +/+ +/+
Arabinoza +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+
* Dane z powtórzenia 1/ powt 2
178 535
Tabela 5A
Testy fermentacji węglowodanów
Substraty węglowodanowe Bakteria (izolat)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Adonitol + - - - - + - - - - -
Arabmoza + + + + + + + - - + +
Dulcytol - - - - - - - - - - -
Fruktoza + + + + + + + + + + +
Glicerol + + - - + + + - + + +
Mleczan - - - - - ND - - + - -
Maltoza + + - - + + + + + + +
Mannoza + + - - + + + + + + +
Melibioza + - + - - + + - - - -
Rafmoza - - - + + - + - + + -
Ryboza + + + + + + + + + - +
Sorbitol + + + - + + + - + + +
Sukroza + + + + + + + + + + -
Ksyloza + + - + + + + + + + +
Amygdalina + + + + + + - + - - -
Celobioza + + + + + - - + + - +
Erytrytol - - - - - + - - - - -
Glokoza + + + + + + + + + + +
Inozytol + + - - - - - - - - -
Laktoza + + + + + + + + - + +
Mannitol + + + + + + + + + + +
Melezytoza + + + + + + - - - - -
Pirogronian + - - - - - + - - - -
Ramnoza + - + + - + + - + + +
Salicyna + + + + + + + + - + +
Skrobia + - - - + + - + - - -
Trehaloza + + + + + + - + + + +
178 535
Tabela 5B
Testy fermentacji węglowodanów
Substraty węglowodanowe Bakteria (izolat)
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Adonitol - - - - - - - - -
Arabinoza + - - + + + + - -
Dulcytol - - - - - - - - -
Fruktoza + - + + + + - - +
Glicerol + - + + - + - - -
Mleczan - - + + - - - - +
Maltoza + - + + + + + - +
Mannoza + - + + + + - - +
Melibioza + - + + + + - - -
Rafinoza + - - + + + + - +
Ryboza + - + + + + - - +
Sorbitol + - + + + + - - -
Sukroza + - + + + + + - +
Ksyloza + - - + + + - - +
Amygdalina - - - + + - - - -
Celobioza - - - + + - + - +
Erytrytol - - - - - - - - -
Glokoza + - + + + + + - +
Inozytol - - + + - + - - -
Laktoza + - - + + + - - +
Mannitol + - + + - + - - +
Melezytoza - - - + - - - - +
Pirogronian - - - + - - - - +
Ramnoza + - - - + - - - +
Salicyna + - + + + - + - -
Skrobia - - - + + - - - +
Trehaloza + - + + + + + - +
178 535
Tabela 5C
Testy fermentacji węglowodanów
Substraty węglowodanowe Bakteria (izolat)
23 24 25 26 27 28 29
Adonitol - - - - - -
Arabinoza - + + - - -
Dulcytol - - - - - -
Fruktoza + + - + + +
Glicerol - - + + - -
Mleczan - + - - - -
Maltoza - + + + - +
Mannoza + - - + - -
Melibioza - - - + - -
Rafinoza - + + + - -
Ryboza - - - - - -
Sorbitol - - - - - -
Sukroza - + + + - -
Ksyloza + - - + - -
Amygdalina - + - - - -
Celobioza - + - + - +
Erytrytol - - - - - -
Glokoza + + + + - +
Inozytol - - - - -
Laktoza - + + + - +
Mannitol + - - - - -
Melezytoza - - - - - -
Pirogronian - - - - - -
Ramnoza - - - - - -
Sahcyna - + + - - -
Skrobia - - - + - -
Trehaloza - + + - - +
178 535
Tabela 6
Testy Systemem API Rapid STREP
Enzym/Substrat Bakteria (izolat)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Voges-Proskauer +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+
Hydroliza hipuranu -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/-
Hydroliza eskuliny +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/-
Pyrrolidonylo-2-nafy- lamid +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 47+ -/-
Alfa-galaktozydaza -/- -/- -/- -/- -/-
Beta-glukuronidaza -/- -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ -/- -/-
Beta-galaktozydaza -/- +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ -/-
Fosfataza alkaliczna -/- -/- -/- -/+ -/- -/- +/+ -/- -/-
Arylamidaza leucyny +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ -/+
Dihydrolaza argininy +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ -/+ -/-
Ryboza +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-
Arabinoza -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/-
Mannitol +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-
Sorbitol +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/-
Laktoza -/- -/- +/+ +/+ +/+ 1--+ +/+ +/+ , -/-
Trehaloza +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-
Inulina -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
Rafmoza -/- -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ -/- -/-
Skrobia +/+ +/+ +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-
Glikogen -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
* Dane z powtórzenia 1/ powt. 2
178 535
Tabela 7
Testy Systemem API STAPH Trac
Enzym/Substrat Bakteria (izolat)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Glukoza +/+ +/0 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Fruktoza +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Mannoza +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Maltoza +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Laktoza +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Trehaloza +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Mannitol +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Ksylitol -/- -/- -/- -/- +/+ -/- -/- +/+
Melibioza -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+
Redukcja azotanu -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/+ -/-
Fosfataza alkaliczna +/+ -/- +/+ -/- -/- -/- -/- +/+ +/+
Produkcja acetoiny +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Rafmoza -/- -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ -/- +/+
Ksyloza -/- -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Sacharoza +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Alfa-metylo-glukozyd +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ -/- +/+
N-acetylo-glukozyd +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Dihydrolaza argininy +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ -/-
Ureaza -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
* Dane z powtórzenia 1/ powt. 2
178 535
Tabela 8A
Testy Enzymatyczne Póhlościowe Systemem API ZYM
Oznaczany enzym Bakteria (izolat)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Kontrola 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Fosfataza alkaliczna 0/0 1/0 T/T T/T 0/0 2/2 0/0 T/T 0/0 5/4
Esteraza (C4) 0/0 1/1 1/1 1/1 2/2 2/2 1/1 0/0 T/T 0/0
Lipaza esterazy (C8) 1/3 2/2 2/2 2/2 2/2 0/0 2/2 2/1 2/2 T/T
Lipaza (C14) 0/0 0/0 0/0 0/0 T/0 0/0 0/0 0/0 2/2 0/0
Aminopeptydaza leucynowa 5/3 T/l 1/1 0/0 0/0 0/0 1/1 2/3 3/3 1/1
Aminopeptydaza walinowa 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 2/2 T/T
Aminopeptydaza cystynowa T/T 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T 1/1 T/T
Trypsyna 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T
Chymotrypsyna 0/1 0/0 0/0 0/0 2/2 0/0 T/l T/T 0/0 0/0
Fosfataza kwaśna 3/3 1/2 T/T 0/0 1/1 1/1 1/1 2/3 2/2 3/3
Fosfohydrolaza 2/2 2/2 1/1 3/3 1/1 1/1 2/2 2/2 2/2 3/3
Alfa-galaktozydaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 4/4 0/0
Beta-galaktozydaza 0/0 T/T 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 1/1 3/3 2/3
Beta-glukuromdaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0
Alfa-glukozydaza 4/4 2/3 0/0 0/0 0/0 0/0 2/2 3/3 0/0 0/0
Beta-glukozydaza 4/3 0/0 2/2 1/1 2/1 0/0 T/T 2/2 0/0 0/0
N-acetylo-beta-glukoza- minidaza 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0
Alfa-mannozydaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Alfa-fnkozydaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Półilościowe oznaczenie aktywności enzymów jest następujące: 0 = brak zmiany barwy, T - ślady = <5 nmol, 1 = 5 nmol, 2 = 10 nmol, 3 = 20 nmol, 4 = 30 nmol i 5 =>40 nmol * Dane powtórzenia 1/ powt. 2
178 535
Tabela 8B
Testy Enzymatyczne Półilościowe Systemem API ZYM
Oznaczany enzym Bakteria (izolat)
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Kontrola 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Fosfataza alkaliczna 5/5 3/2 2/2 3/3 2/3 3/3 0/0 0/0 0/0 5/5
Esteraza (C4) 1/1 0/0 3/3 3/3 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0 1/1
Lipaza esterazy (C8) 1/1 0/0 4/3 3/3 0/0 T/0 1/1 0/0 T/0 1/1
Lipaza (C14) 1/T 1/T 3/3 2/3 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Aminopeptydaza leucynowa 3/4 5/5 4/4 4/4 4/4 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Aminopeptydaza walinowa 1/1 2/3 2/2 2/2 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Aminopeptydaza cystynowa T/T 0/0 1/1 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Trypsyna T/T 2/2 2/2 2/2 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Chymotrypsyna T/T 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0
Fosfataza kwaśna 5/5 3/4 2/2 4/4 4/4 2/3 0/0 2/2 T/T 2/2
Fosfohydrolaza 4/3 3/3 1/1 2/2 4/3 2/2 1/1 2/2 T/T 2/2
Alfa-galaktozydaza 2/1 0/0 0/0 2/2 0/0 5/5 4/4 0/0 0/0 2/.2
Beta-galaktozydaza 4/4 3/3 0/0 4/3 2/2 2/3 5/5 0/0 3/3 3/3
Beta-glukuronidaza 1/1 0/0 0/0 1/1 T/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Alfa-glukozydaza 1/1 T/T 0/0 2/2 0/0 1/1 3/4 2/2 3/3 0/0
Beta-glukozydaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 5/5 0/0 0/0 3/3 0/0
N-acetylo-beta-glukoza- minidaza 0/0 0/0 0/0 2/2 T/0 3/3 0/0 0/0 0/0 5/5
A lfa-mannozydaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Alfa-fukozydaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
178 535
Tabela 8C
Testy Enzymatyczne Póhlościowe Systemem APIZYM
Oznaczany enzym Bakteria (izolat)
21 22 23 24 25 26 27 28 29
Kontrola 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Fosfataza alkaliczna 0/0 0/0 0/0 0/0 5/5 T/T 5/5 0/0 0/0
Esteraza (C4) T/T 0/0 1/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T
Lipaza esterazy (C8) T/T 1/1 1/1 T/T 0/0 0/0 1/1 0/0 1/T
Lipaza (Cl4) 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Aminopeptydazą leucynowa 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 T/T 0/0 0/0
Aminopeptydazą walinowa 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Aminopeptydazą cystynowa 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Trypsyna 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Chymotrypsyna 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Fosfataza kwaśna 0/0 T/0 0/0 0/0 2/2 1/1 4/2 2/2 1/1
Fosfohydrolaza 1/1 1/1 1/1 2/2 1/1 1/1 5/3 2/1 2/2
Alfa-galaktozydaza 2/2 T/0 2/1 0/0 c/o 0/0 4/2 0/0 1/T
Beta-galaktozydaza 0/0 T/0 0/0 0/0 c/o 0/0 4/2 0/0 0/0
Beta-glukuronidaza 0/0 0/0 0/0 0/0 c/o 0/0 5/3 0/0 0/0
Alfa-glukozydaza 0/0 3/2 1/T 0/0 0/0 2/2 3/2 0/0 0/0
Beta-glukozydaza 0/0 1/T 1/T 0/0 2/3 0/0 0/0 0/0 0/T
N-acetylo-beta-glukoza- minidaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 3/2 0/0 0/0
Alfa-mannozydaza 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Alfa-fiikozydaza 0/0 1/T 0/0 0/0 0/0 0/0 1/0 0/0 0/0
178 535
Tabela 9A
Testy Systemem Płytek Presumpto
Nr płytki Presumpto Ćwiartka nr. Pożywki agarowe Zdolność do wzrostu/testy biochemiczne Bakteria (izolat)
16 17 1819
I 1 Pożywka LD Wzrost +++ +++ +
Indol - - -
2 LD-eskulina Wzrost +++ + +++
Katalaza - - -
Hydroliza eskuliny +-H- - -
3 LD-żółtko Wzrost +++ + +++
Lecytynaza - - -
Lipaza - -
Proteoliza - - -
4 LD-zółć Wzrost I I I
II 1 LD-DNA Wzrost -H+ +-H- +++
DNAza + - -
2 LD-glukoza Wzrost -H-+ +++ +++
Fermentacja Glukozy + + -
3 LD-mleko Wzrost +++ +++ +++
Hydroliza kazeiny - - -
4 LD-skrobia Wzrost +++ -H-+ +++
Hydroliza skrobi - - -
III 1 LD-mannitol Wzrost +++ +++ +++
Fermentacja mannitolu - + -
2 LD-laktoza Wzrost +++ +++ +-H-
Fermentacja laktozy + + -
3 LD-ramnoza Wzrost +++ +++ +++
Fermentacja ramnozy + - -
4 LD-żelatyna Wzrost -H-+ +++ +++
Hydroliza żelatyny - -
Porównanie wzrostu na LD-agarze z żółcią w porównaniu z agarem LD: I = słabszy wzrost oraz E = równy wzrost
178 535
Tabela 9B
Testy Systemem Płytek Presumpto
Nr płytki Presumpto Ćwiartka nr. Pożywki agarowe Zdolność do wzrostu/testy biochemiczne Bakteria (izolat)
20 21 2223
I 1 Pożywka LD Wzrost
Indol
2 LD-eskulina Wzrost
Katalaza
Hydroliza eskuliny
3 LD-żółtko Wzrost
Lecytynaza
Lipaza
Proteoliza
4 LD-żółć Wzrost
U 1 LD-DNA Wzrost
DNAza
2 LD-glukoza Wzrost
Fermentacja Glukozy
3 LD-mleko Wzrost
Hydroliza kazeiny
4 LD-skrobia Wzrost
Hydroliza skrobi
III 1 LD-manmtol Wzrost
Fermentacja mannitolu
2 LD-Iaktoza Wzrost
Fermentacja laktozy
3 LD-ramnoza Wzrost
Fermentacja ramnozy
4 LD-żelatyna Wzrost
Hydroliza żelatyny
178 535
Tabela 9C
Testy Systemem Płytek Presumpto
Nr płytki Presumpto Ćwiartka nr. Pożywki agarowe Zdolność do wzrostu/testy biochemiczne Bakteria (izolat)
24 25 2627
I 1 Pożywka LD Wzrost
Indol
2 LD-eskulina Wzrost
Katalaza
Hydroliza eskuliny
3 LD-żółtko Wzrost
Lecytynaza
Lipaza
Proteoliza
4 LD-żółć Wzrost
II 1 LD-DNA Wzrost
DNAza
2 LD-glukoza Wzrost
Fermentacja Glukozy
3 LD-mleko Wzrost
Hydroliza kazeiny
4 LD-skrobia Wzrost
Hydroliza skrobi
III 1 LD-mannitol Wzrost
Fermentacja mannitolu
2 LD-laktoza Wzrost
Fermentacja laktozy
3 LD-ramnoza Wzrost
Fermentacja ramnozy
4 LD-żelatyna Wzrost
Hydroliza żelatyny
178 535
Tabela 9D
Testy Systemem Płytek Presumpto
Nr płytki Presumpto Ćwiartka nr. Pożywki agarowe Zdolność do wzrostu/testy biochemiczne Bakteria (izolat)
28 29
I 1 Pożywka LD Wzrost +++
Indol -
2 LD-eskulina Wzrost +++
Katalaza -
Hydroliza eskuliny -
3 LD-żóltko Wzrost +++
Lecytynaza - 1 i
Lipaza -
Proteoliza -
4 LD-żółć Wzrost E
II 1 LD-DNA Wzrost +++
DNAza -
2 LD-glukoza Wzrost -H-+
Fermentacja Glukozy -
3 LD-mleko Wzrost +++
Hydroliza kazeiny -
4 LD-skrobia Wzrost +++
Hydroliza skrobi -
III 1 LD-mannitol Wzrost +++
Fermentacja mannitolu -
2 LD-laktoza Wzrost +++
Fermentacja laktozy -
3 LD-ramnoza Wzrost +++
Fermentacja ramnozy -
4 LD-żelatyna Wzrost +++
Hydroliza żelatyny +
178 535
Tabela 10A
Testy wrażliwości na związki o działaniu przeciwbakteryjnym
Związek o działaniu przeciwbakteryjnym Bakteria (izolat)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amikacyna R s s S s s s s s s
Ampicylina S s s s s s s s s
Augmentyna S s s R R s s
Bacytracyna R R R R R S R s s R
Karbenicylina S S s R S R s R s s
Cefalorydyna S R s R R S R s s s
Cefalotyna s s R R S S s s s s
Chloramfenikol s s s S S S s s s s
Chlortetracyklina R R s S s S R s s s
Klindamycyna R R R R R R R s s s
Kloksacylina R R R R R R R R R R
Erytromycyna R R S S s S R s s s
Gentamycyna s s s s s S S s s s
Kanamycyna R R R R s R R s s s
Linkomycyna R R R R R R R R s R
Metycylina R R R R R S R s R R
Kwas nalidyksowy R R R R R R R R R S
Neomycyna S S S S s S R s s S
Nitrofurantoina S S s s S S s s s
Nowobiocyna R R R s S s R s
Penicylina R R R R s S s R s R
Polimyksyna B R R R R R R R R R s
Rifampina S S S S S S S s s s
Streptomycyna R R R R s R R R s s
Sulfadiazyna R R R R R R R R s s
Trimetoprim R S R R R R S R s s
Tetracyklina R S S S S S R s s s
Wankomycyna S s S S s S S s R R
S = Wrażliwy, R = Oporny
178 535
Tabela 10B
Testy wrażliwości na związki o działaniu przeciwbakteryjnym
Związek o działaniu przeciwbakteryjnym Bakteria (izolat)
11 12 13 14 1 11 11 18 11 20
Amikacyna S S s s s R S R R R
Ampicylina R S R s s
Augmentyna S S R s s S S
Bacytracyna R R R R R R R R R R
Karbenicylina S s S s s s S S S S
Cefalorydyna R s R R R R S S s S
Cefalotyna R s R R s R s s s s
Chloramfenikol S s S S s S s s s s
Chlortetracyklina S s S S s s R R R
Klindamycyna R R R R R s s s s s
Kloksacylma R R R R R R R R R R
Erytromycyna R s S R s s s R R R
Gentamycyna S s S S S O R S R R R
Kanamycyna S s s S S R s R R R
Linkomycyna R R R R R R s R R R
Metycylina R R R R R R R R R R
Kwas nalidyksowy S S S S S R s R R R
Neomycyna s S S S S R s R R R
Nitrofurantoina s S R S s
Nowobiocyna R S s
Penicylina R R R R R R R S S S
Polimyksyna B s S S R S R s R R R
Rifampina R S S S R S s S S S
Streptomycyna S S S S S R s R R R
Sulfadiazyna s S S s s S R R R R
Trimetoprim s s R s R R R R R R
Tetracyklina s s S s s S R R R
Wankomycyna R R R R R S S S S
178 535
Tabela 10C
Testy wrażliwości na związki o działaniu przeciwbakteryjnym
Związek o działaniu przeciwbakteryjnym Bakteria (izolat)
21 22 23 24 25 26 27 28 29
Amikacyna R R R R R R R s S
Ampicylina
Augmentyna S S S S S S S s S
Bacytracyna R R R R R R R R R
Karbenicylina S S S S S S S S S
Cefalorydyna S S S S S S S s S
Cefalotyna s s S S s s s s S
Chloramfenikol s s S s s s s s S
Chlortetracyklina R R R R R R R s S
Klindamycyna S S S S S s s s s
Kloksacylina R R R R R R R R R
Erytromycyna R R R R R R R S s
Gentamycyna R R R R R R R S s
Kanamycyna R R R R R R R S s
Linkomycyna R R R R R R R S s
Metycylina R R R R R R R R R
Kwas nalidyksowy R R R R R R R S S
Neomycyna R R R R R R R S s
Nitrofurantoina
Nowobiocyna
Penicylina S S S S S S S R R
Polimyksyna B R R R R R R R S S
Rifampina S S S S S S s s S
Streptomycyna R R R R R R R s S
Sulfadiazyna R R R R R R R R R
Trimetoprim R R R R R R R R R
Tetracyklina R R R R R R R S S
Wankomycyna S S S S S S s R R
178 535
Tabela 11
Efekt podania scharakteryzowanej kultury bakterii jelita ślepego na stężenie kwasu propionowego w treści jelita śśepego kurcząt broiierów 3- i 10-cduowych*
Grupa Próba 2 Próba 3 Próba 4
Dzień 3 Dzień 10 Dzień 3 Dzień 10 Dzień 3 Dzień 10
Kontrole .61±.58 1.82±.61 ,68±.60 2.46±.93 .54±.58 2.67±0 88
Traktowane 21 28±15.75* 27.64±10.15* 16.85±8.14* 27 01±9.48* 20.73± 10.78* 47.75±12 4*
♦ Wartości to średnie ± SD dla 10 kurcząt i nmol/g treści jelita ślepego * Znacząco różne od kontroli (P < 0,005)
Tabela 12
Efekt podania scharakteryzowanej kultury bakterii jelita ślepego na całkowite stężenie lotnych kwasów tłuszczowych w treści jelita ślepego kurcząt broilerów 3- i 10-dniowych*
Grupa Próba 2 Próba 3 Próba 4
Dzień 3 Dzień 10 Dzień 3 Dzień 10 Dzień 3 Dzień 10
Kontrole 9 03 ± 2.30 73 01 ± 6.43 14.03 ± 6.75 52.87 ± 16.98 16.66 ±2 71 71 95 ± 16 25
Traktowane 14.75 ±5.80** 80.84 ± 20.69 45.60 ±8.05** 69.14 ±23.04* 50 67 ±22 59** 107.03 ± 28.63*
* Wartości to średnie ± SD dla 10 kurcząt i nmol/g treści jelita ślepego * Znacząco różne od kontroli (P <0,005)
Tabela 13
Efekt podania scharakteryzowanej kultury bakterii jelita ślepego na liczbę Salmonella typhimurium w treści jelitowej 10-dniowych kurcząt broilerów*
Grupa Logio Salmonella na gram treści jelita ślepego
Próba 1 Próba 2 Próba 3 Próba 4
Kontrole 6.35 ±0.99' 6 28 ±0.53 4.11 ±2.15 6.37 ± 0 60
Traktowane 0±0* 0.89 ± 1.50* 0.27 ± 0.69* 0.60 ±0.75*
* Dane podano jako x ± SD dla 20 kurcząt * Znacząco różne od kontroli (P <0,005)
Tabela 14
Efekt podania scharakteryzowanej kultury bakterii jelita ślepego na liczbę 10-dniowych kurcząt* broilerów, z których uzyskuje się hodowlę z jelita ślepego dodatnią na Salmonella typhimurium*
Grupa Kurczęta dodatnie na hodowlę Salmonella /wszystkich kurcząt (%)
Próba 1 Próba 2 Próba 3 Próba 4
Kontrole 20/20 (100) 20/20(100) 18/20 (90) 20/20 (100)
Traktowane 0/20 ( 0)* 7/20 (35)* 3/20 ( 15)* 8/20 (40)*
* Znacząco różne od kontroli (P <0,01) * Wartości to średnie ± SD dla 10 kurcząt i nmol/g treści jelita ślepego * Znacząco różne od kontroli (P <0,005) * Wartości to średnie ± SD dla 10 kurcząt i nmol/g treści jelita ślepego * Znacząco różne od kontroli * = (P < 0,05); * * = (P < 0,01)
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella zawierająca substancje nośnikowe i/lub karmę dla ptaków, znamienna tym, że złożona jest z populacji zasadniczo biologicznie czystych bakterii, w skład których to bakterii wchodzą zasadniczo wszystkie:
    (1) pierwszy szczep Enterococcus faecalis, (2) drugi szczep Enterococcus faecalis, (3) pierwszy szczep Enterococcus faecium, (4) drugi szczep Enterococcus faecium, (5) trzeci szczep Enterococcus faecium, (6) Enterococcus avium, (7) trzeci szczep Enterococcus faecalis, (8) Lactococcus laclis, (9) pierwszy szczep Lactobacillus (10) pierwszy szczep Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii, (12) bakteria należąca do rodziny Enterobacteriaceae, (13) szczep Pseudomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) drugi szczep Escherichia coli, (16) pierwszy szczep Propionibacteriium, (17) drugi szczep Propionibacterium, (18) drugi szczep Lactobacillus, (19) pierwszy szczep Bifidobacterium lub trzeci szczep Lactobacillus, (20) trzeci szczep Propionibacterium, (21) pierwszy szczep Eubacterium, (22) drugi szczep Eubacterium, (23) nieznana bakteria określona jako szczep OAGPB-5, (24) trzeci szczep Eubacterium, (25) drugi szczep Bifidobacterium lub czwarty szczep Lactobacillus, (26) trzeci szczep Bifidobacterium lub piąty szczep Lactobacillus, (27) czwarty szczep Propionibacterium, (28) szczep Veillonella, i (29) szczep Fusobacterium.
    w ilości efektywnie hamującej kolonizację drobiu przez Salmonella.
  2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wymieniona kompozycja zawiera Depozyt ATCC nr 55515, i/lub:
    wymieniona kompozycja zawiera 26 z wymienionych bakterii, i/lub wymieniona kompozycja zawiera 27 z wymienionych bakterii, i/lub wymieniona kompozycja zawiera 28 z wymienionych bakterii, i/lub wymieniona kompozycja zawiera wszystkie wymienione bakterie, i/lub wymieniona kompozycja dodatkowo zawiera laktozę, i/lub wymieniona kompozycja dodatkowo zawiera kokcidiostatyk, nieaktywny w stosunku do bakterii Gram-dodatnich, i/lub wymieniona kompozycja dodatkowo zawiera nośnik, i/lub wymienione bakterie tej kompozycji występująewentualnie w postaci zakapsułkowanej.
    178 535
  3. 3. Produkt żywieniowy zawierający paszę zwierzęcą w kombinacji z kompozycją bakteryjną, znamienny tym, że zawiera paszę zwierzęcąw kombinacji z kompozycją złożoną z populacji zasadniczo biologicznie czystych bakterii, w skład których to bakterii wchodzą zasadniczo wszystkie:
    (1) pierwszy szczep Enterococcus faecalis, (2) drugi szczep Enterococcus faecalis, (3) pierwszy szczep Enterococcus faecium, (4) drugi szczep Enterococcus faecium, (5) trzeci szczep Enterococcus faecium, (6) Enterococcus avium, (7) trzeci szczep Enterococcus faecalis, (8) Lactococcus lactis, (9) pierwszy szczep Lactobacillus, (10) pierwszy szczep Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii, (12) bakteria należąca do rodziny Enterobacteriaceae, (13) szczep Pseudomonas, (14) Serratia liąuefaciens, (15) drugi szczep Escherichia coli, (16) pierwszy szczep Propionibacteriium, (17) drugi szczep Propionibacterium, (18) drugi szczep Lactobacillus, (19) pierwszy szczep Bifidobacterium lub trzeci szczep Lactobacillus, (20) trzeci szczep Propionibacterium,, (21) pierwszy szczep Eubacterium, (22) drugi szczep E.ubacterium, (23) nieznana bakteria określona jako szczep OAGPB-5, (24) trzeci szczep Eubacterium, (25) drugi szczep Bifidobacterium lub czwarty szczep Lactobacillus, (26) trzeci szczep Bifidobacterium lub piąty szczep Lactobacillus, (27) czwarty szczep Propionibacterium, (28) szczep Veillonella, i (29) szczep Fusobacterium.
    w ilości efektywnie hamującej kolonizację drobiu przez Salmonella.
  4. 4. Sposób izolacji kompozycji do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella, znamienny tym, że obejmuje:
    (a) zaszczepienie pożywki hodowlanej odchodami, treściąjelita ślepego lub jelita grubego dorosłego zwierzęcia domowego, posiadającego ochronną mikroflorę, skuteczną w hamowaniu kolonizacji Salmonellą, a następnie inkubowanie okresowej hodowli w warunkach beztlenowych w celu dostarczenia hodowli pośredniej;
    (b) inkubowanie wymienionej hodowli pośredniej w hodowli ciągłej przy tempie obrotu między około 0,029 do około 0,10 godz.'1, wartości pH pomiędzy około 4,7 i 6,5, w warunkach beztlenowych dostatecznie długo by uzyskać stan stały; i (c) odzyskanie hodowli stałej z etapu (b).
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap inkubowania wymienionej hodowli okresowej j est kontynuowany przez około 6-18 godzin, i/lub pH w wymienionej hodowli okresowej jest utrzymywane dla wartości około 5,5 i/lub etap inkubowania wymienionej hodowli okresowej jest prowadzony do momentu, w którym gęstość optyczna osiągnie wartość co najmniej około 1,0, i/lub etap inkubowania wymienionej hodowli okresowej jest prowadzony w czasie nie dłuższym niż 2 godziny po momencie, w którym pH osiągnie wartość około 4,2, i/lub tempo obrotu wynosi około 0,0416 godz.4, a wymienione pH w wymienionej hodowli ciągłej ma wartość około 5,5, i/lub pH w wymienionej hodowli okresowej jest nie mniejsze od 4,2, i/lub
    178 535 temperatura wymienionej hodowli okresowej i wymienionej hodowli ciągłej mieści się między około 26° do 47°C.
  6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wymieniona hodowla zawiera laktozę.
  7. 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap wymienionej hodowli ciągłej jest poprzedzony etapem hodowli okresowej.
PL94314986A 1993-12-13 1994-12-13 Kompozycja do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella, produkt żywieniowy i sposób izolacji kompozycji PL178535B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/166,779 US5478557A (en) 1992-07-29 1993-12-13 Probiotic for control of salmonella
PCT/US1994/014444 WO1995016461A1 (en) 1993-12-13 1994-12-13 PROBIOTIC FOR CONTROL OF $i(SALMONELLA)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL314986A1 PL314986A1 (en) 1996-09-30
PL178535B1 true PL178535B1 (pl) 2000-05-31

Family

ID=22604677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94314986A PL178535B1 (pl) 1993-12-13 1994-12-13 Kompozycja do hamowania kolonizacji ptaków przez Salmonella, produkt żywieniowy i sposób izolacji kompozycji

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5478557A (pl)
EP (1) EP0785800A1 (pl)
JP (1) JPH09506625A (pl)
KR (1) KR960706355A (pl)
CN (1) CN1142773A (pl)
AU (1) AU693146B2 (pl)
BR (1) BR9408295A (pl)
CA (1) CA2178192A1 (pl)
CZ (1) CZ173396A3 (pl)
FI (1) FI962429A (pl)
HU (1) HUT74951A (pl)
NZ (1) NZ278508A (pl)
PL (1) PL178535B1 (pl)
SK (1) SK281141B6 (pl)
WO (1) WO1995016461A1 (pl)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9107305D0 (en) * 1991-04-08 1991-05-22 Unilever Plc Probiotic
US5340577A (en) * 1992-07-29 1994-08-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Probiotic for control of salmonella
US5928686A (en) * 1995-06-07 1999-07-27 Novus International, Inc. Nutrient formulation and process for feeding young poultry and other animals
US5985336A (en) * 1995-06-07 1999-11-16 Novus International, Inc. Nutrient formulation and process for feeding young poultry and other animals
US5976580A (en) 1995-06-07 1999-11-02 Novus International, Inc. Nutrient formulation and process for enhancing the health, livability, cumulative weight gain or feed efficiency in poultry and other animals
US6899872B1 (en) * 1995-11-27 2005-05-31 Standa Lab Sa Absorbable dietary composition for improving the biological balance of intestinal tract flora
US5807546A (en) 1996-10-11 1998-09-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Livestock mucosal competitive exclusion culture to reduce enteropathogenic bacteria
US6017525A (en) * 1997-04-02 2000-01-25 Logan; Walter T. Poultry house litter treatment
US5965128A (en) * 1997-08-13 1999-10-12 University Of Georgia Research Foundation Inc. Control of enterohemorrhagic E. coli 0157:H7 in cattle by probiotic bacteria and specific strains of E. coli
US5879719A (en) * 1997-08-28 1999-03-09 Midwest Zoological Research, Inc. Process for control, elimination or inhibition of salmonellae in reptiles and/or amphibians
US5951977A (en) * 1997-10-14 1999-09-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Competitive exclusion culture for swine
US6756361B1 (en) * 1997-10-14 2004-06-29 Nabi Enterococcus antigens and vaccines
AT406166B (de) * 1997-12-30 2000-03-27 Erber Erich Kg Mikroorganismus, verfahren zur gewinnung desselben sowie futtermittelzusatz
US6110455A (en) * 1999-01-20 2000-08-29 Ms Bioscience Method for encouraging poultry to distribute and ingest competitive exclusion products
IL130303A0 (en) 1999-06-03 2000-06-01 M G Novobiotech Ltd A bacterial strain processed plant extracts and probiotic compositions for human and veterinary use
US7504251B2 (en) * 1999-06-03 2009-03-17 Biobalance Llc Bacterial strain, processed plant extracts, compositions containing same, processes for their preparation and their therapeutic and industrial applications
DE19943644A1 (de) * 1999-09-13 2001-03-15 Rolf Reissbrodt Anwendung eines probiotischen Escherichia coli Isolates zur Hemmung der Shiatoxinproduktion und des Wachstums von enterohämorrhagischen E.coli (EHEC)-Stämmen
JP4410992B2 (ja) * 2000-11-30 2010-02-10 ザ バイオ バランス コーポレイション 細菌株、処理された植物抽出物、それらを含有する組成物、その調製方法、ならびにその治療的応用および産業的応用
US7101565B2 (en) 2002-02-05 2006-09-05 Corpak Medsystems, Inc. Probiotic/prebiotic composition and delivery method
US7323166B2 (en) 2002-06-19 2008-01-29 Board Of Regents University Of Nebraska Lactic acid bacteria cultures that inhibit food-borne pathogens
EP1374878A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-02 N.V. Nutricia Method and composition for preventing or alleviating symptoms of malabsorption from the gastrointestinal tract
IL152127A0 (en) 2002-10-06 2003-05-29 Bio Balance Corp Probiotic compositions for the treatment of inflammatory bowel disease
US7361497B2 (en) * 2002-10-18 2008-04-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Probiotic bacteria
US20040241150A1 (en) * 2002-12-19 2004-12-02 Hargis Billy M. Defined competitive exclusion cultures for food borne pathogens
WO2004104175A2 (en) * 2003-05-14 2004-12-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Probiotic bacteria and methods
MXPA06001821A (es) * 2003-08-18 2006-05-31 Bio Balance Corp Una composicion probiotica, liquida, estable, preparacion y aplicaciones de la misma.
US20070009490A1 (en) * 2003-10-02 2007-01-11 Conte Anthony E Dried biotherapeutic composition, uses, and device and methods for administration thereof
JP2007518463A (ja) * 2003-10-02 2007-07-12 ザ バイオ バランス コーポレイション 乾燥した生物学的治療用組成物、その使用、及びその投与のための装置及び方法
CA2566617C (en) 2004-05-14 2013-12-31 Agtech Products, Inc. Method and composition for reducing e.coli disease and enhancing performance using bacillus
EP2351494A1 (en) 2005-03-18 2011-08-03 The United States of America as represented by the secretary of Agriculture Bacteriocins and novel bacterial strains
WO2006101486A2 (en) 2005-03-18 2006-09-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Bacteriocins and novel bacterial strains
US7754469B2 (en) * 2005-11-30 2010-07-13 Agtech Products, Inc Microorganisms and methods for treating poultry
CA2702577A1 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Jbs United, Inc. Method for increasing performance of offspring
US8021654B2 (en) 2008-03-14 2011-09-20 Danisco A/S Methods of treating pigs with Bacillus strains
CA2721180C (en) 2008-04-17 2016-10-11 Danisco A/S Bacillus strains useful for animal odor control
US8540981B1 (en) 2008-07-07 2013-09-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps Bacillus strains useful against calf pathogens and scours
US9107938B2 (en) 2010-09-30 2015-08-18 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods of selecting and using therapeutic and prophylactic probiotic cultures to reduce bacterial pathogen loads
US8557234B1 (en) 2011-05-18 2013-10-15 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods of controlling pit foam
BR112014003950B1 (pt) 2011-08-24 2022-01-11 Dupont Nutrition Biosciences Aps. Uso de cepas de bacillus isoladas produtoras de enzima e alimentação de um animal
CN103609837B (zh) * 2013-11-20 2015-06-10 湖北绿天地生物科技有限公司 用于乳猪的乳酸菌粉剂及其制备方法、使用方法
CN107205440B (zh) 2014-11-19 2021-07-13 堪萨斯州立大学研究基金会 动物饲料和饲料成分中的化学缓和剂
MX2017010064A (es) * 2015-02-11 2017-11-01 Chr Hansen As Reduccion de la concentracion de bacterias gramnegativas en un producto alimenticio fermentado por la combinacion de extracto de vino tinto y un cultivo que comprende por lo menos una cepa bacteriana de acido lactico productora de bacteriocina.
WO2017030876A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 Clearh2O, Inc. High throughput process for delivering semi-firm gel for poultry
CN105779363B (zh) * 2016-05-17 2019-06-04 江南大学 一种液化沙雷氏菌及其转化合成洋茉莉醛的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3937814A (en) * 1971-09-13 1976-02-10 Dirigo Corporation Compositions for safe extension of storage life of foods
US3953609A (en) * 1974-02-06 1976-04-27 Microlife Technics, Inc. Method for the growth restriction of undesirable digestive system bacteria in animals and the establishment of lactobacillus lactis NRRL B-5628
US4335107A (en) * 1978-06-05 1982-06-15 Snoeyenbos Glenn H Mixture to protect poultry from salmonella
FI59925C (fi) * 1980-01-11 1981-11-10 Esko Viljo Nurmi Foerfarande foer framstaellning av ett bakteriepreparat anvaendbart foer foerhindrande av salmonellainfektion hos fjaederfae
SE465206B (sv) * 1989-12-22 1991-08-12 Eva Grahn Farmaceutisk beredning foer bekaempning av patogena tarmbakterier
US5308615A (en) * 1992-01-17 1994-05-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Probiotic for control of Salmonella
US5340577A (en) * 1992-07-29 1994-08-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Probiotic for control of salmonella

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09506625A (ja) 1997-06-30
PL314986A1 (en) 1996-09-30
SK76596A3 (en) 1997-06-04
FI962429A (fi) 1996-07-18
HUT74951A (en) 1997-03-28
NZ278508A (en) 1998-03-25
US5478557A (en) 1995-12-26
CN1142773A (zh) 1997-02-12
CZ173396A3 (en) 1997-08-13
AU1402095A (en) 1995-07-03
SK281141B6 (sk) 2000-12-11
EP0785800A1 (en) 1997-07-30
EP0785800A4 (pl) 1997-07-30
KR960706355A (ko) 1996-12-09
BR9408295A (pt) 1997-08-26
FI962429A0 (fi) 1996-06-12
CA2178192A1 (en) 1995-06-22
WO1995016461A1 (en) 1995-06-22
AU693146B2 (en) 1998-06-25
HU9601621D0 (en) 1996-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5478557A (en) Probiotic for control of salmonella
García-Hernández et al. Isolation, characterization and evaluation of probiotic lactic acid bacteria for potential use in animal production
US5951977A (en) Competitive exclusion culture for swine
Tsai et al. Antagonistic activity against Helicobacter pylori infection in vitro by a strain of Enterococcus faecium TM39
JP2004523241A (ja) プロバイオティクスとして有用な新規ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）
Branton et al. In vitro characterization and safety of the probiotic strain Lactobacillus reuteri cardioviva NCIMB 30242.
US5302388A (en) Control of campylobacter jejuni colonization
US9107938B2 (en) Methods of selecting and using therapeutic and prophylactic probiotic cultures to reduce bacterial pathogen loads
US7744868B2 (en) Composition and method for inhibiting Salmonella and Campylobacter colonization in poultry
Vlková et al. Selection of probiotic bifidobacteria for lambs
Promsopone et al. Evaluation of an avian-specific probiotic and Salmonella typhimurium-specific antibodies on the colonization of Salmonella typhimurium in broilers
KR100513168B1 (ko) 돼지 유행성 설사증 (PED) 코로나바이러스 및 유해 미생물 억제 활성을 가지는 신규 내 산성 엔테로코커스 훼카리스Probio-056 및 이를 함유하는 생균활성제
KR100523255B1 (ko) 가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸 및 유해 병원성 미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스훼시움 Probio-048 및 이를 함유한 생균활성제
US20190075821A1 (en) Composition, Probiotic Formulation and Method to Reduce Bacterial Infection in Poultry
Oliveira et al. In Vitro Selection and In Vivo Trial of Lactobacillus strains for use a potential probiotics for laying hens
Oliveira et al. In vitroSelection and In vivoTrial of Lactobacillus Strains for Use a Potential Probiotics for Laying
Ha et al. Comparison of Salmonella typhimurium and selected facultative chicken cecal bacteria survivability after specific amino acid-limited batch growth
US7361497B2 (en) Probiotic bacteria
Ščerbová et al. Relation to enterocins and herbal extracts of fecal hemolytic Escherichia coli from domestic ducks detected with MALDI-TOF mass spectrometry
Karunarathna Incidence and pathogenesis of enterococcus associated chicken embryo and neonatal mortality
Danyluk et al. Competitive inhibition bacteria of bovine origin against Salmonella serovars
KR20230168470A (ko) 송아지 분변으로부터 분리된 균주와, 이를 포함하는 설사증 예방 및 완화 제제
Ahmady et al. EFFECT OF DIETARY MANNAN OLIGOSACCHARIDE AND LIGNIN ON POPULATION AND CHARACTERISTICS OF PROBIOTIC BACTERIA ISOLATED FROM JAPANES QUAILS
Nisbet et al. Competitive exclusion culture for swine