CZ173396A3 - Preparation for inhibiting colonization of domestic animals with salmonella, process of its preparation and use - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká určitých probiotik pro potlačování kolonizace salmonelou u domácích zvířat, včetně ptactva, jako drůbeže a zvláště pak u kuřat. Přes snahu vědců a úřadů zabývajících se ochranou veřejného zdraví se výskyt humánní salmonelózy během posledních 20 let zvýšil. Počet skutečně oznámených případů humánní infekce překračuje číslo 40 000 za rok. Informační středisko Communicable Disease Center odhaduje, že výskyt humánních infekcí salmonelou v samotných USA může činit každý rok až 2 až 4 miliony. Hlavním zdrojem humánní infekce jsou přitom potraviny živočišného původu, zejména drůbeží produkty.

Dosavadní stav techniky

S ohledem na rozšířenost Salmonella v životním prostředí je nepravděpodobné, že by bylo možno drůbež úplně ochránit před expozicí šalmonele. Proto se vědci zaměřili na výzkum prostředků vedoucích ke zvýšení odolnosti vůči kolonizaci drůbeže salmonelou, jíž je tato drůbež vystavena. Studie se zaměřily zejména na různé očkovací látky, zavádění protektivní normální intestinální fluory a identifikaci -krmivových přísad inhibujících růst sálmonely a její kolonizaci drůbeže. Úloha imunity hostitele proti kolonizaci salmonelou je nejasná a také zůstává nejisté, zda stimulace imunitních odpovědí účinně zvýší odolnost proti kolonizaci salmonelou. U experimentálních očkovacích látek se neprokázala konsistentní účinnost.

.1*

Bylo dobře dokumentováno, že normální intestinální mikroflóra zvyšuje odolnost proti kolonizaci salmonelou. Orální inokulace mladých kuřat anaerobními bakteriálními kulturami mikroflóry, které jsou rovněž známy pod označením probiotika (probiotika jsou definována jako bakteriální kultury vykazující prospěšný účinek na zvíře, jemuž jsou podávány) připravenými z obsahu slepého střeva nebo trusu dospělých kuřat, účinně snižuje kolonizaci salmonelou [Snoeyenbos et al., Avian Dis., 23: 904 až 913 (1979),

Schneitz et al., Acta Pathol. Microbiol. Scand. Séct. B.,.......

89: 109 až 116 (1981) a Stavric et al., J. Food Prot. 48.

778 až 782 (1985)]. Chovatelská praxe zabraňující kolonizaci těmito cekálními anaerobními organismy činí naopak kuřata susceptibilnějšími vůči kolonizaci salmonelou [Pivnick et al., J. Foot Prot., 44: 909 až 916 (1981)]. Tato probiotika mohou snižovat kolonizaci salmonelou tím, že rychle kolonizují intestinální trakt mladých kuřat (Pivnick et al, výše uvedená citace) tím, že soutěží o místa připojení k intestinální stěně (Snoeyenbos et al., výše uvedená citace) nebo tím, že vytvářejí bakteriostatika nebo baktericidní těkavé mastné kyseliny s krátkým řetězcem [Barnes et al., J. Hyg. Camb., 82: 263 až 283, (1979) a Tůn. J. Clin. Nutr., 33: 2426-2433 (1980),-Corrier et ál., Avian Dis., 34: 668 až 676 (1990) a Avian Dis., 34: 617 až 625 (1990) a Hinton et al., Avian Dis., 34: 626 až 633 (1990)], které inhibují růst enteropatogenů.

Ukázalo se však, že pouze kultury normální mikrofluory, které obsahují~smísenou populaci několika set různých mikroorganismů účinně inhibují růst salmonely. Zavádění normální instestinální flóry do jednodenních kuřat za použití směsných kultur mikroorganismů se v širokém rozsahu používá pro potlačování kolonizace salmonelou v několika evropských zemích. Vzhledem k nedefinovanému počtu a typům mikroorganismů přítomných ve směsných kulturách, nebyl však tento systém v širokém rozsahu akceptován v USA. Jednou nevýhodou ztěžující široké využití této metody je zejména skutečnost, že složení produktu nemůže být standardizováno a že tedy produkt nelze skladovat nebo vyrábět ve velkém měřítku beze změn jeho složení a účinnosti. Dalším důvodem je, že výchozí látkou je vždy intestinální obsah dospělé drůbeže, a že tedy produkt může obsahovat patogenní viry, bakterie nebo parazity, které mohou ohrožovat zdraví kuřat. Ještě dalším důvodem je, že americký úřad pro kontrolu potravin a léčiv (U.S. Food & Drug Administration) vydal nedávno nařízení, že všechny nedefinované kultury musí být schváleny.

Nedávno bylo oznámeno, že laktosa a jiné produkty s mléčným cukrem přidané do krmivá nebo napájecí vody pro kuřata zvyšují odolnost kuřat proti kolonizaci salmonelou [Oyofo et al., Avian Dis. 33: 531 až 533, (1989) a Poultry Sci., 68: 1357 až 1360 (1989), Corrier et al., ibid, a Hinton et al., ibid]. Přísada laktosy do stravy zvyšuje kyselost obsahu caeca a ovlivňuje růst a fermentační produkty normální intestinální mikroflóry. Přídavek laktosy ke stravě může též zvýšit odolnost proti kolonizaci salmonelou zvýšením bakteriostatického účinku těkavých mastných kyselin s krátkým řetězcem, jako je kyselina octová, kyselina propionová a kyselina máselná, jež jsou produkovány některými normálními intestinálními bakteriemi [Corrier et al., ibid, Hinton et al. ibid].

Odolnost kuřat vůči” kolonizaci salmonelou byla také dále zvýšena, když byla kuřatům podávána kombinace laktosové krmivové přísady s kulturami ceacálních anaerobních mikroorganismů vypěstovaných v živné půdě s obsahem laktosy [Corrier et al., ibid, Hinton et al. ibid].

Podstata vynálezu

V souvislosti s vynálezem bylo nyní vyvinuto definované probiotikum, či směs bakterií účinných pro potlačování nebo inhibici kolonizace drůbeže salmonelou.

Toto probiotikum zahrnuje definované populace nebo kultury v podstatě biologicky čistých bakterií. Tyto bakterie zahrnují následující kmeny:

Enterococcus faecalis,

Enterococcus faecium,

Enterococcus avium,

Lactococcus lactis,

Lactobacillus,

Escherichia coli,

Citrobacter freundii,

Pleudomonas,

Serratia liquefaciens,

Propionibacterium,

Bifidobacterium (nebo Lactobacillus),

Eubacterium,

Veillonella a

.......Fusobacterium -----jakož i další bakterii, která náleží do čeledi Enterobacteriaceae a neznámou bakterii označenou jako kmen OAGPB-5.

Při aplikaci se toto probiotikum podává drůbeži v množství účinně inhibujícím kolonizaci salmonelou. V přednostním provedení se může inhibice salmonely zvýšit přídavkem laktosy k probiotiku. Výše uvedené probiotikum je také možno kombinovat s konvenčním krmivém za vzniku nového krmivá, které může drůbež orálně přijímat.

Předmětem vynálezu je také nový způsob izolace probiotik, která jsou účinná pro potlačování nebo inhibici kolonizace salmonelou u domácích zvířat, včetně drůbeže, z trusu nebo obsahu slepého střeva nebo tlustého střeva dospělých zvířat. Trus nebo obsah slepého nebo tlustého střeva se smíchá s živinami nebo kultivačním médiem a bez ředění inhibuje (tj. v jednorázové kultuře) za anaerobních podmínek. Po této předběžné inkubaci se výsledná kultura pěstuje průtokovým způsobem tak dlouho, dokud se nedosáhne ustáleného stavu. Po dosažení ustáleného stavu se kultura může izolovat pro použití jako probiotikum.

Předmětem vynálezu je tedy také zlepšený způsob potlačování kolonizace salmonelou u drůbeže a prostředek k provádění tohoto způsobu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je zajištění definovaných kultur anaerobních bakterií (které lze snadno standardizovat) pro potlačování kolonizace drůbeže salmonelou.

Vynález se také týká zlepšeného způsobu izolace směsí bakterií pro použití jako probiotik pro potlačování kolonizace domácích zvířat, zejména .drůbeže, salmonelou. Další aspekty a výhody tohoto vynálezu jsou podrobněji popsány dále.

Probiotikum podle vynálezu při aplikaci účinně potlačuje kolonizaci drůbeže salmonelou. Snižuje průměrnou koncentraci salmonely v drůbeží populaci a/nebo snižuje procentický podíl drůbeže kolonizované tímto patogenem. Vynálezu lze využít u ptactva jakéhokoliv typu, přičemž jako neomezující příklady lze uvést drůbež, jako jsou kuřata, krocani, kachny, křepelky a husy. Po podání ptákům poskytuje toto probiotikum konsistentní ochranu proti různým druhům salmonely, jako je Salmoneila typhimurium a Salmonella enteriditis.

Protiobikum bylo vyvinuto ze slepého střeva kuřat, která nejsou kolonizována salmonelou. Jak je to podrobněji popsáno v příkladu 1, kuřatům se odebere slepé střevo a inokuluje se do vhodného kultivačního média. Inkubace se provádí v jednorázové kultuře za anaerobních podmínek. Získaná kultura se inkubuje za podmínek průtokové kultury se specifickou výměnou média tak dlouho, dokud se nedosáhne ustáleného stavu či rovnováhy. Když se vzniklá kultura v ustáleném stavu izoluje a podá ptákům, vykazuje významnou účinnost jako probiotikum potlačující kolonizaci ošetřených ptáků salmonelou.

Na základě analýzy bylo z kultury v ustáleném stavu získáno 29 v podstatě čistých bakteriálních izolátů, zahrnujících 15 fakultativních a 14 obligátních anaerobních mikroorganismů. Bylo zjištěno, že kultura má následující složení:

I. Fakultativní anaerobní gram-pozitivní koky:

(1)	první	kmen	Enterococcus	faecalis,
(2)	druhý	kmen	Enterococcus	faecalis,
(3)	první	kmen	Enterococcus	faecium,
(4)	druhý	kmen	Enterococcus	faecium,
(5)	třetí	kmen	Enterococcus	faecium,
(6)	Enterococcus avium,
( 7)	třetí	kmen	Enterococcus’	faecalis,

II. Fakultativní anaerobní gram-pozitivní kokobacily (8) Lactococcus lactis (9) první kmen Lactobacillus,

III. Fakultativní anaerobní gram-negativní bacily (10) první kmen Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii, (12) bakterie patřící do čeledi Enterobacteriaceae, (13) druh Pseunomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) druhý kmen Escherichia coli,

IV. Obligátní anaerobní gram-pozitivní bacily:

(16) první druh Propionibacterium, (17) druhý druh Propionibacterium, (18) druhý kmen Lactobacillus, (19) první kmen Bifidobacterium nebo třetí kmen Lactobacillus, (20) třetí kmen Propionibacterium, (21) první kmen Eubacterium (22) druhý kmen Eubacterium, (23) neznámý bakteriální kmen označený jako OAGPB-5, (24) třetí kmen Eubacterium, (25) druhý kmen Bifidobacterium nebo čtvrtý kmen Lactobacillus, (26) třetí kmen Bif idobacterium nebo pátý kmen Lactobacillus, (27) čtvrtý kmen Propionibacterium,

V. Obligátní anaerobní gram-negativní koky:

(28) druh Veillonella a

VI. Obligátní anaerobní gram-negativní bacily:

(29) druh Fusobacterium.

Probiotická směs zahrnující všech 29 výše uvedených bakteriálních kmenů byla uložena za podmínek Budapešťské dohody ve sbírce American Type Culture Collection (12301

Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA) pod označením Competitive Exclusion Culture, CF3, a bylo jí přiděleno přírůstkové číslo ATCC 55 515). Jednotlivé kmeny jsou charakterizovány v příkladech 1 a 2.

Výsledné kultury v ustáleném stavu je možno přímo použít jako probiotika nebo ji lze skladovat pro pozdější použití. V případě skladování se může kultura skladovat v podobě výše uvedené směsi nebo se mohou skladovat jednotlivé vyizolované bakterie. V posledně uvedeném případě se před použitím připraví původní směs rekombinací izolovaných bakterií.

V přednostním provedení se probiotikum podle vynálezu skládá z bakterií z uložené kultury v ustáleném stavu charakterizované v příkladech 1 a 2. V alternativním provedení je však možno mnohé z použitých bakterií získat ze známých nebo standardních kmenů nebo z izolátů získaných z drůbeže. Tak například je možno kmeny určitého rodu nebo druhu z uloženého probiotika podle příkladu provedení nahradit alespoň jedním stejným rodem nebo druhem kmene zvoleného z neomezujícího souboru zahrnujícího Enterococcus, Lactococcus, E. coli, Citrobacter, Pseudomonas, Serratia, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Veillonella, Fusobacterium nebo zejména Lactobacillus. Když se používá zásobních kultur známých kmenů, může se účinnost zásobních kultur zvýšit tím, že se bakterie adaptují na ptáky pasážováním v jejich organismu, přednostně spolu s ostatními organismy z kultury v ustáleném stavu, přičemž se z trusu nebo obsahu slepého střeva takto pasážovaná kultura izoluje. Používá-li se drůbežích izolátů, je možno bakterie jednotlivě izolovat a získat z trusu nebo obsahu slepého střeva dospělých ptáků za použití techniky, které jsou obvyklé v tomto oboru nebo které popsal DeLoach (Patentová přihláška USA pořadového čísla 07/822 505). Tato přihláška je zde citována náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Také se předpokládá, že by bylo možno vynález realizovat s probiotikem obsahujícím méně než všech 29 výše uvedených bateriálních kmenů a že by bylo možno dvě nebo tři z výše uvedených bakterií z probiotika odstranit při pouze malém snížení účinnosti. Aniž by se původci tohoto vynálezu chtěli vázat na nějaký konkrétní příklad, lze uvést, že redundantní kmeny Pseudomonas nebo kmeny bakterií, tj . rody, od nichž jsou přítomny četné kmeny nebo druhy, je možno vypustit bez významného snížení účinnosti. V souladu s přednostním provedením tohoto vynálezu se však optimálního potlačení kolonizace salmonelou dosahuje s probiotikem zahrnujícím všech 29 výše uvedených kmenů.

Některé z kmenů bakterií používaných podle tohoto vynálezu je také možno popřípadě vybrat na základě jejich schopnosti adheze k epithelové stěně zažívacího traktu ptáka, jemuž má být probiotikum aplikováno. Při této selekci se používá techniky, kterou popsali Nurmi et al. v US patentu č. 4 689 226. Tato citace je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Předmětem vynálezu je také nový způsob získávání probiotika účinného pro potlačování nebo inhibici kolonizace různých domácích zvířat salmonelou. Jako neomezující příklady domácích zvířat je možno uvést ptáky, ale také koně, vepře a hověži dobytek. Místo’ toho; abyse probio- — tikům vyrábělo ze známých zásobních kultur nebo čistých bakteriálních izolátů, je možno (což se zjistilo s překvapením) získat stabilní definované probiotikum přímo z trusu nebo obsahu slepého střeva a/nebo tlustého střeva dospělých cílových zvířat. Při tomto způsobu se trusu nebo obsahu slepého nebo tlustého střeva nejprve použije jako inokula pro zaočkování jednorázové kultury a potom se provádí kultivace za podmínek průtokové kultury při specifické výměně média a při specifickém pH tak dlouho, dokud se nedosáhne ustáleného stavu či rovnovány. Výsledná kultura v ustáleném stavu se může izolovat pro použití jako probiotikum. Pod označením obsah slepého střeva se zde rozumí materiál umístěný uvnitř slepého střeva, ale také samotné slepé střevo včetně jeho částí, jako je vrstva sliznice.

Stupeň s jednorázovou kulturou se může provádět v jakémkoliv obvyklém fermentoru. Přednostně se však používá chemostatu bez ředění (tj. bez přidávání čerstvého kultivačního média a odstraňování využitého kultivačního média), aby se zabránilo přenosu kultury do následujících stupňů a aby se snížila potenciální kontaminace kultury. Po odběru se obsah slepého střeva nebo tlustého střeva nebo trus, jichž se má použít jako inokula, smísí s vhodným kultivačním médiem a vzniklá směs se inkubuje za anaerobních podmínek. Kultivace v jednorázové kultuře by se měla provádět:

(1) po dobu asi 6 až 18 hodin přednostně asi 12 až 18 hodin nebo (2) do dosažení optické density (měřené při 600 nm) alespoň asi 1,0 a/nebo (3) ne déle než asi 2 hodiny po dosažení hodnoty pH asi 4,2.

Poté by se měla kultivace v jednorázové kultuře ukončit a měla by být zahájena kultivace v průtokové kultuře. Pokud se doba inkubace stanovuje na základě výše uvedené podmínky (1) nebo zejména (2) přednostně se hodnota pH reguluje na asi 5,5 za použití regulátoru pH, jak je to běžné v tomto oboru. Pokud se v posledně uvedeném případě nepoužívá regulace hodnoty pH, je účelné pokračovat v kultivaci v jednorázové kultuře jen tak dlouho, dokud se pH nesníží na hodnotu asi 4,2, aby se zabránilo usmrcení některých buněk.

Ihned po ukončení stupně kultivace v jednorázové kultuře se zahájí kultivace za podmínek průtokové kultury v chemostatu, při níž se kontinuálně přivádí čerstvé médium a odvádí se vyčerpaná půda. Vhodné chemostaty lze snadno určit a zahrnují například chemostaty, které popsal Wang [Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley & Sans, New York, 1979, str. 98 až 137; tato citace je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu]. S překvapením se zjistilo, že růst směsi v průtokové kultuře za použití specifického ředění nebo rychlosti výměny média a specifické hodnoty pH umožňuje, aby kultura dospěla do rovnovážného nebo ustáleného stavu. V závislosti na zvířeti použitém jako zdroj pro inokulum, specificky použitém médiu a podmínkách kultivace se může počet bakterií, které jsou původně přítomny, snížit za vzniku stabilní kultury zahrnující poměrně malý počet v podstatě biologicky čistých snadno definovatelných bakterií. Tak například, když se používá drůbeže, může se přibližně 500 .........

bakterií, které jsou přítomny v původním inokulu zredukovat na stabilní kulturu asi 10 až 40 bakterií. Vhodné podmínky pro tento stupeň zahrnují rychlost výměny média v rozmezí od asi 0,029 do asi 0,10 h^-1, přednostně asi 0,0416 h^_1 a pH v rozmezí od asi 4,7 do asi 6,5, přednostně asi 5,5.

Hodnota teploty a druh média použitého pro jednorázovou a průtokovou kulturu nemají rozhodující význam a je možno je snadno určit. Vhodná teplota může ležet v rozmezí od asi 26 do asi 47°C. Může se také použít různých vhodných kultivačních médií s různými zdroji energie. Jako neomezují12 cí příklad přednostního zdroje energie je možno uvést glukosu nebo galaktosu a zvláště pak laktosu.

Ustálený stav se konstatuje, když pH, optická densita OD₆₀₀ a koncentrace těkavých mastných kyselin v kultuře zůstává přibližně konstantní. Po dosažení ustáleného stavu se v libovolné době může kultura izolovat pro další výše popsané použití. Za ideálních podmínek je také vhodné * charakterizovat nebo definovat kulturu v ustáleném stavu prostřednictvím izolace a identifikace bakteriálních popula) * cí, které jsou v ní obsaženy, za použití technik obvyklých v tomto oboru. Po izolaci se mohou bakterie skladovat neomezeně dlouhou dobu za podmínek umožňujících jejich pozdější použití, jak je to například popsáno v patentové přihlášce pořadového čísla 07/921,173 podané 29. července 1992. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že při výše uvedeném způsobu kultivace v jednorázové a průtokové kultuře se také jako počátečního inokula může používat izolovaných nebo biologicky čistých bakterií.

Získané kultury v ustáleném stavu se podle tohoto vynálezu mohou popřípadě podrobit sereeningu za účelem izolace směsí vykazujících optimální účinnost při inhibici’ kolonizace cílového zvířete salmonelou. Podle jednoho provedení se tento sereening může provádět in vivo za použití provokace salmonelou, jak je to běžné v tomto oboru a jak je to popsáno v příkladech 3 a 4. V krátkosti lze tento postup * popsat takto: Kultura v ustáleném stavu se podá zvířatům, která neobsahují salmonelu.Po uplynutí dobypostačující pro ’ x usídlení kultury ve střevech, obvykle po 2 nebo 3 dnech se zvířata provokují životaschopnou kulturou salmonely. Po inkubaci se zvířata usmrtí a obsah jejich slepého střeva se analyzuje na kolonizaci salmonelou. Účinná inhibice kolonizace salmonelou se projeví snížením průměrné koncentrace salmonely (CFU) nebo snížením procentického podílu kolonizo13 váných zvířat v ošetřené populaci vzhledem k neošětřené kontrolní populaci.

V souvislosti s vynálezem bylo také zjištěno, že probiotika produkovaná způsobem podle vynálezu nebo jakýmkoliv jiným způsobem, je také možno podrobit spolehlivému screeningu in vivo na základě analýzy profilu těkavých mastných kyselin (VFA) v slepém střevě. Tato technika nevyžaduje obvyklou provokaci salmonelou. Pro vyhodnocení účinnosti jakékoliv kultury se po jejím podání cílovému zvířeti nechá kultura usídlit ve střevech tak, jak to bylo popsáno výše. Po 2 až 3 dnech po ošetření, přednostně po 3 dnech se zvířata usmrtí a stanoví se koncentrace kyseliny propionové a celková koncentrace těkatých mastných kyselin (kyseliny octové, kyseliny propionové, kyseliny máselné, kyseliny isomáselné, kyseliny valerové a kyseliny isovalerové) v obsahu slepého střeva. Pro měření obsahu těchto kyselin se může použít technik obvyklých v tomto oboru, jako je plynová chromátografie s kapalnou stacionární fází (GLC), kterou popsali Corrier et al. (Avian Dis., 34: 617 až 625, 1990). Tato citace je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Probiotická účinnost při inhibici kolonizace salmonelou je přitom konstatována když:

(1) je koncentrace kyseliny propionové vyšší nebo rovna přibližně hodnotě 10 mmol/g obsahu slepého střeva a/nebo (2) celková koncentrace těkavých mastných kyselin činí přibližně 100 % hodnoty zjištěné u neošetřených kontrolních zvířat nebo je vyšší.

Přestože lze koncentraci kyseliny propionové stanovit po 2 dnech, předvídatelnost účinnosti se snižuje, je-li založena na změření celkové koncentrace těkavých mastných kyseliny po třetím dnu.

Stejně jako tomu bylo v případě výše uvedeného probiotika obsahujícího 29 kmenů, může se kultur v ustáleném stavu produkovaných způsobem podle vynálezu přímo použít jako probiotika nebo se mohou uložit pro pozdější použití. Podobně lze i bakterie obsažené v kultuře izolovat a identifikovat a známými nebo standardními kmeny nebo izoláty ze stejného cílového zvířete lze nahradit bakterie stejného rodu nebo druhu obsažené v kultuře v ustáleném stavu.

V jednorázové nebo průtokové kultuře těchto bakterií ve vhodném kultivačním médiu je možno za podmínek anaerobní kultivace obvyklé v tomto oboru vyrobit velká množství probiotik podle vynálezu. Z výše uvedených způsobů kultivace se dává přednost zejména postupům s průtokovou kulturou, poněvadž kultury v ustáleném stavu jsou výjimečně stálé a mohou se v ustáleném stavu neomezeně dlouho uchovávat. Inokulem pro kultury ve velkém měřítku může být vzorek nebo očko kultury v ustáleném stavu, uložené kultury nebo zásobní kultury nebo též v podstatě biologicky čistých izolátů těchto bakterií. Bakterie je možno kultivovat v kombinaci nebo v separátních kultivačních médiích, přičemž v posledně uvedeném případě, který umožňuje lepší standardizaci se kultury, mísí teprve dodatečně. Pokud se používá posledně uvedené techniky, měla by se konečná koncentrace každé bakterie v příslušné kultuře před smícháním kultur nastavit na hodnotu přibližné v rozmezí od 10° do 10’ organismů/ml. Odborníkům v tomto oboru je však zřejmé, že výše uvedená hodnota koncentrace nemá rozhodující význam a může se měnit.

Když se kultivace v jednorázové kultuře provádí ve velkém měřítku, měla by se kultura obvykle inkubovat před sklizní po dobu asi 16 až asi 72 hodin, přednostně po dobu asi 24 až 48 hodin. V souvislosti s vynálezem se však zjistilo, že za jakýchkoliv okolností by se měla kultivace v jednorázové kultuře provádět tak dlouho, dokud se nedosáhne následujících fermentačních parametrů:

(1) koncentrace kyseliny octové vyšší asi 20mM nebo vyšší, (2) koncentrace kyseliny propionové asi lOmM nebo vyšší a (3) koncentrace kyseliny máselné a isomáselné celkem asi 15mM nebo vyšší.

Použití probiotika podle vynálezu není ovlivněno konkrétním způsobem jeho výroby. Probiotik vyrobených jakýmikoliv výše popsanými způsoby se může používat vždy stejným způsobem. Po výrobě se mohou bakteriální kultury podávat přímo cílovému zvířeti budí jednotlivě nebo ve vzájemné kombinaci. Probiotikum lze také popřípadě dále smíchat s vhodným nosičem. Jako neomezující příklady vhodných nosičů je možno uvést laktosu nebo odstředěné mléko. Probiotikum je také možno smíchat s malým množstvím krmivá a výsledné směsi se může použít ve formě premixu. Kultury lze také lyofilizovat, aby se dosáhlo jejich stability při skladování. S lyofilizovanými kulturami se také snadno manipuluje. Takové lyofilizované kultury je možno přímo podávat zvířatům nebo je možno je alternativně před použitím rekonstituovat. Zvláště je zapotřebí se zmínit o možnosti zapouzdřit některou nebo všechny bakterie za použití obvyklých způsobů zapouzdřování (enkapsulace). Jako neomezující příklad zapouzdřování je možno uvést zapouzdřování v alginátovém gelu. Aniž by se chtěli původci vázat na platnost nějaké teorie, předpokládají, že tento způsob zapouzdřování může zabránit některým bakteriím snižovat koncentraci kyseliny mléčné v horní části střevního traktu ná nežádoucí úroveň. Zapouzdření může také ochránit bakterie a umožnit jim dospět dó slepého střeva, kde je žádoucí utilizace kyseliny mléčné.

Probiotikum podle vynálezu je také možno kombinovat s jinými v podstatě biologicky čistými bakteriemi, kterých se používá v probiotikách účinných pro potlačování salmonely u domácích zvířat nebo drůbeže a zejména s bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou nebo těkavé mastné kyseliny.

Jako neomezující příklady takových vhodných bakterií je možno^- uvést^-druhy Peptostreptococcus^- nebo^ruhy—kťeré popsal DeLoach v patentové přihlášce USA pořadového čísla 07/822,505. Tato citace je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. K probiotiku lze také přidávat jiné pomocné přísady, kterých se běžně používá nebo které jsou známy v oboru léčení domácích zvířat nebo drůbeže a které se hodí zejména pro inhibici enteropatogenů. Jako vhodné adjuvanty je například možno uvést kokcidiostaty, které nejsou účinné proti gram-pozitivním organismům. Obzvláštní přednost se dává přídavku laktosy.

Domácím zvířatům nebo nebo drůbeži se také mohou podávat v neterapeutické koncentraci antibiotika, jak je to běžné v tomto oboru. Taková antibiotika je možno podávat v kombinaci s probiotikem nebo zvlášé. Alternativně lze taková antibiotika podávat drůbeži in ovo v koncentraci, která je terapeutická, ale která poklesne na neterapeutickou koncentraci do asi 3 dnů po vylíhnutí.

Přestože se probiotikum podle vynálezu bude převážně podávat nebo zavádět do zažívacího „.traktu tak, že se bude mísit s krmivém nebo vodou, které zvíře orálně konzumuje, nelze vyloučit ani přímé orální nebo nasální podávání postřikováním nebo mlžením vhodného prostředku. I posledně uvedené alternativy jsou v tomto oboru obvyklé. Z ještě dalších alternativ je možno uvést přímé injekční podání do gastrointestinálního traktu nebo kloakální podávání. V posledně uvedeném případě se probiotikum může přímo nastříkat na kloakální otvor drůbeže nebo se může aplikovat na stelivo na podlaze kotce. V posledně uvedeném případě dojde ke styku kloakálniho otvoru s probiotikem v průběhu normální aktivity drůbeže. Jakmile dojde ke kontaktu s oblastí kloaky, probiotikum se do kloaky zavede reversní peristaltikou.

Probiotikum se může zvířatům podávat v libovolné době jejich života. V přednostním provedení se však probiotikum podává čerstvě vylíhlým ptákům o stáří v rozmezí od 1 do 14 dnů.

Probiotikum se podává v množství, které účinně inhibuje kolonizaci ošetřeného zvířete salmonelou ve srovnání s neošetřenými zvířaty. Vhodné množství může odborník v tomto oboru snadno určit a bude do jisté míry závislé na stáří a velikosti zvířete.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu, který je vymezen připojenými nároky, v žádném ohledu neomezují. „ . - .

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava probiotika

Počáteční inokulum

Počáteční inokulum se získá od tří deset týdnů starých kuřat (brojlerů), která nejsou zamořena salmonelou a byla chována od vylíhnutí na nemedikované stravě a vodě. Ptáci se usmrtí a za aseptických podmínek se jim vyjme slepé střevo, které se ihned přenese do anaerobní komory (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI, USA). Každé slepé střevo se rozřízne na několik kousků a maceruje v mísiči Lab Blender (Tekmar, Cincinnati, OH, USA). Macerovaná cekální tkáň a obsah slepého střeva se spojí a důkladně homogenizují a ke vzniklému homogenátu se přidá glycerol do konečné koncentrace 20 %. Výsledný cekální homogenát se zmrazí při -70C a za těchto podmínek se uchovává až do použití. Při použití se 10 ml zmrazeného cekálního homogenátu nechá roztát a inkubuje se za anaerobních podmínek ve 100 ml média Viande Levure (VL) při teplotě 39°C. Vzniklé kultury se použije jako očkovací kultury pro následující kultivaci za průtokových podmínek (CF).

Zařízení pro kultivaci za průtokových podmínek

Jak stupeň s jednorázovou kulturou, tak stupeň s průtokovou kulturou se provádí v 1 150ml chemostatové nádobě (fermentor BioFlo III; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA). Ve stupni průtokové kultury se používá následujících parametrů:

- rychlost ředění 0,0416 h ¹ (což odpovídá průtokové rychlosti 0,80 ml/min a době výměny média 24 h;

- teplota 39°C a

- rychlost míchání 200 min”¹.

Anaerobní podmínky se udržují proplachováním nádoby konstantním proudem oxidu uhličitého prostého kyslíku.

Růst cekálních organismů za podmínek kultivace v průtokové kultuře

Do chemostatové nádoby se předloží 1 050 ml sterilní půdy Viande Levure (VL) a tato půda se inokuluje 100 ml očkovací kultury a za anaerobních podmínek inkubuje v jednorázové kultuře při 39°C a rychlosti míchání (frekvence otáčení míchadla) 200 min^-1. Po 6 hodinách v jednorázové kultuře se uvede do provozu čerpadlo živné půdy a kultura se začne inkubovat za průtokových podmínek. Ustáleného stavu se dosáhne po asi 5 dnech kultivace v průtokové kultuře. Podmínky ustáleného stavu jsou konstatovány, když pH, optická densita OD₆₀q a koncentrace těkavých mastných kyselin zůstávají v podstatě konstantní.

Když je průtoková kultura stará 5 dnů a 61 dnů, odeberou se z ní za aseptických podmínek vzorky, které se nanesou na tryptosový agar doplněný 5 % hovězí krve, .. .

McConkeyův agar a krevní agar Center for Disease Control (CDCBA). Misky s tryptosovým agare a McConkeyovým agarem se inkubují na vzduchu 7 dní při 37 °C. Misky s CDCBA se inkubují v anaerobní komoře (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI, USA) obsahující atmosféru skládající se z 80 % dusíku, % vodíku a 10 % oxidu uhličitého. Inkubace se provádí při 37°C po dobu 7 dnů. Jak v průtokové kultuře staré 5 dnů, tak v průtokové kultuře staré 61 dnů se identifikuje 29 bakteriálních izolátů, které se skládají z 15 fakultativních a 14 obligátních mikroorganismů z celkem 10 různých rodů.

Těchto 29 bakteriálních izolátů se identifikuje za použití biochemických a enzymatických postupů a profilu antimikrobiální suspceptibility, což jsou metody dobře známé v tomto oboru (Holdeman et al., 1977, Anaerobe Laboratory Manual, 4. vydání, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, USA; Farmer et al., 1985, J. Clin.

Microbiol., 21: 46 až 78; Lennette et al., 1985, Clinical Microbiology, 4. vydání, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; a Devriese et al., 1987, Int. J. Syst. Bacteriol., 37: 257 až 259. Výše uvedené citace jsou zde zmiňovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Jsou identifikovány následující bakterie:

I. Fakultativní anaerobní gram-pozitivní koky (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

Enterococcus

Enterococcus

Enterococcus

Enterococcus

Enterococcus

Enterococcus

Enterococcus faecalis označený jako kmen M faecalis označený jako kmen N faecium označený jako kmen Y, faecium označený jako kmen Z, faecium označený jako kmen X, avium faecalis označený jako kmen O

II

Fakultativní anaerobní gram-pozitivní kokobacily (8) Lactococcus lactis podruh diacetylactis, (9) druh Lactobacillus (kmen č. 1),

III. Fakultativní anaerobní gram-negativní bacily (10) Escherichia coli označený jako kmen CC-3A, (11) Citrobacter freundii, označený jako kmen CC-3, (12) bakterie patřící do čeledi Enterobacteriaceae (zřejmě druhu Enterobacter, E. coli nebo Kluyvera cryocrescens), (13) druh Pseunomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) Escherichia coli označený jako kmen CC3B,

IV. Obligátní anaerobní gram-pozitivní bacily;

(16) druh Propionibacterium (kmen č. 1, zřejmě P. jensenii nebo P. thoenii), (17) druh Propionibacterium (kmen č. 2, zřejmě P. granulosum), (18) druh Lactobacillus (kmen č. 2), (19) druh Bifidobacterium (kmen č. 1) nebo druh Lactobacillus (kmen č. 3), (20) druh Propionibacterium (kmen č. 3), (21) druh Eubacterium (kmen č. 1), (22) druh Eubacterium (kmen č. 2), (23) neznámý bakteriální kmen označený jako OAGPB-5, (24) druh Eubacterium (kmen č. 3), (25) druh Bifidobacterium (kmen č. 2) nebo druh

Lactobacillus (kmen č. 4), ----(26) druh Bifidobacterium (kmen č. 3) nebo druh Lactobacillus (kmen č. 4), (27) druh Propionibacterium (kmen č. 4),

V. _ Obligátní anaerobní gram-negativní koky: -= - (28) druh Veillonella a

VI. Obligátní anaerobní gram-negativní bacily:

(29) druh Fusobacterium

Získaná průtoková kultura charakterizovaná obsahem 29 bakteriálních izolátů vykazuje kompatibilní růst ve směsné kultuře, životaschopnost v kyselém prostředí (pH 5,0 až 6,5) a jako koncové fermentační produkty produkuje těkavé mastné kyseliny (VFA).

Tato probiotická směs obsahující všech 29 výše uvedených bakteriálních kmenů byla uložena za podmínek Budapeštské dohody ve sbírce American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA) pod označením Competitive Exclusion Culture, CF3, a bylo jí přiděleno přírůstkové číslo ATCC 55 515).

Příklad 2

Charakterizace bakterie

Plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází (GLC)

Každým z 29 bakteriálních kmenů z CDCBA se se zaočkuje pepton-kvasinková půda (PY) a půda PY s přídavkem 1 % glukosy (PYG), načež se provádí inkubace za anaerobních podmínek při 37°C po dobu 2 dnů. Těkavé mastné kyseliny (VFA) a netěkávé mastné kyseliny (NVFA) se extrahují za použití-standardních postupů a potom detegují GowMac GLC. GLC se kalibruje za použití obchodně dostupných standardů VFA a NVFA. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1A až C.

Charakterizace buňky, kolonie a kultury

Gramova reakce a morfologie buněk fakultativních anaerobních bakterií 1 až 15 se stanoví za použiti Gramova barvení stěrů z krevního agaru po 24-hodinové inkubaci na vzduchu při 37°C. Motilita bakterie se stanoví za použití pohyblivého měkkého agaru (0,4%) s tetrazoliovými solemi. Pohyblivé médium se zaočkuje vzorkem odebraným z krevního agaru a potom 24 hodin inkubuje ha vzduchu při 37 °C. Každá zkouška se provádí dvakrát.

Pro stanovení vlastností kultury se bakteriemi 1 až 9 zaočkují vždy dvě misky s krevním agarem, MacConkeyovým agarem, krevním agarem s azidem sodným a s agarem s žlučovým eskulinem. Vždy jedna miska s krevním agarem, MacConkeyovým agarem, krevním agarem s azidem sodným a s agarem s žlučovým eskulinem se inkubuje na vzduchu při 37°C. Jedna miska s krevním agarem a jedna miska s MacConkeyovým agarem se inkubuje v atmosféře 80 % dusíku, 10 % vodíku a 10 % oxidu uhličitého při teplotě 37°C. Jedna miska s krevním agarem s přídavkem azidu sodného a jedna miska s agarem obsahujícím žlučový eskulin se inkubuje na vzduchu při 45°C po dobu 2 dnů. Po 1 a 2 dnech inkubace se zaznamenají schopnost růstu, vlastnosti kolonie, hemolytický profil u krevního agaru, reakce s laktosou u Mac Conkeyova agaru a hydrolytická reakce eskulinu u agaru s žlučovým eskulinem. Každá zkouška se provádí dvakrát.

Pro stanovení vlastností kultury fakultativních anaerobních gram-negativních bakterií 10 až 15 se použije stejného postupu, při němž se však vypustí zkouška na krevním agaru s azidem sodným a agaru s žlučovým eskulinem.

U obligátních anaerobních bakterií 16 až 29 se stanovuje Gramova reakce a morfologie bakteriálních buněk za použití Gramova barvení stěrů ,z krevního_agaru„s^mozko^ srdečním nálevem, obohaceného heminem a menadionem (CDCBA), který byl inkubován v atmosféře 80 % dusíku, 10 % vodíku a 10 % oxidu uhličitého 2 dny při 37°C. Motilita se stanoví za použití obchodně dostupného předredukovaného za anaerobních podmínek sterilizovaného média (PRAŠ) z CDCBA a potom následuje dvoudenní anaerobní inkubace při 37°C.

Pro stanovení vlastností kultury se bakteriemi 16 až 29 inokulují vždy 2 misky s agarem CDCBA a MacConkeyovým agarem. Vždy jedna z misek s agarem s CDCBA a Mac Conkeyovým agarem se inkubuje na vzduchu při 37°C a zbývající jedna miska s agarem CDCBA a MacConkeyovým agarem se inkubuje za anaerobních podmínek při 37°C. Po 1, 3 a 5 dnech inkubace se zaznamenají schopnost růstu, vlastnosti kolonie, hemolytický profil u agaru CDCBA. Každá zkouška se provádí dvakrát. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 2A až C.

Zkouška s katalasou, s oxidasou a zkouška redukce nitrátu

V případě fakultativních anaerobních bakterií 1 až 9 se použije kolonií z krevního agaru inkubovaného na vzduchu 2 dny při 37°C pro zkoušku s katalasou a oxidasou. Jako reakčního činidla pro zkoušku s katalasou se použije 3% roztoku peroxidu vodíku a jako reakčního činidla pro zkoušku s oxidasou se použije 1% roztoku dihydrochloridu tetramethyl-p-fenylendiaminu. Reakce s oxidasou a katalasou se charakterizuje jako negativní nebo pozitivní. Každá zkouška se provádí dvakrát. Stejného postupu se použije pro charakterizaci fakultativních anaerobních gram-negativních bakterií 10 až 15, pouze s tím rozdílem, že se kultury inkubují pouze 24 hodin.

V případě obligátních anaerobních bakterií 16 až 29 se pro zkoušku s katalasou a oxidasou použije kolonií z CDCBA inkubovaného za anaerobních podmínek 2 dny při₌37⁰C. Pro zkoušku s katalasou a oxidasou se použije stejných reakčních činidel, jaká byla uvedena výše. Před přidáním reakčních činidel se bakterie při zkoušce s katalasou i oxidasou vystaví na dobu 30 minut působení vzduchu. Všechny reakce se charakterizují jako pozitivní nebo negativní.

Každá zkouška se provádí dvakrát.

Pro detekci nitrát reduktasy ve fakultativních anaerobních bakteriích 1 až 15 se použije dvou metod. Při metodě s nitrátovým agarem se postupuje tak, že se nitrátový agar obsahující 0,1 % dusičnanu draselného inokuluje očkem z krevního agaru, který byl 24 hodiny inkubován na vzduchu při 37°C. Po 24hodinové inkubaci při 37°C se aplikuje činidlo A a B (Ν,Ν-dimethylnaftylamin a kyselina sulfanilová). Při anaerobní metodě s krevnín agarem a papírovým kotoučkem se organismus čárkováním nanese na krevní agar a potom se na silně počárkovanou oblast umístí papírový kotouček napuštěný 0,4% roztokem dusičnanu draselného.

Miska se inkubuje za anaerobních podmínek 24 hodin při 37°C a potom se na papírový kotouček aplikuje činidlo A a činidlo B. Pro zjištění, zda došlo k redukci nitrátu, se na kotouček ošetřený činidly nanese zinkový prach. Všechny reakce se charakterizují jako negativní a pozitivní a každá zkouška se provádí dvakrát.

V případě obligátních anaerobních bakterií 16 až 29 se nitrát reduktasa stanovuje za použití výše uvedené anaerobní metody s krevním agarem a papírovým kotoučkem, ale místo krevního agaru se používá CDCBA.

Aerobní zkoušky s utilizací sacharidu

V případě fakultativních anaerobních bakterií 1 až 9 se zjišťuje produkce kyseliny z glukosy, dulcitolu, laktosy, maltosy, mannitolu, salicinu a sacharosy za použití 1% substrátu v základní půdě s fenolovou červení. Pro detekci tvorby plynu se použije Durhamovy zkumavky v glukosové půdě. Každá zkumavka se zaočkuje zkušebním organismem z krevního agaru, který byl 24 hodin inkubován na vzduchu při 37°C.

Půdy se inkubují na vzduchu 2 dny při 37C. V každé zkumavce se sleduje změna barvy. Zkumavky zbarvené červeně jsou důkazem negativního výsledku a zkumavky se žlutým zbarvením jsou důkazem pozitivního výsledku. Každá zkouška se provádí dvakrát.

Stejného postupu se použije i v případě fakultativních anaerobních gram-negativních bakterií 10 až 15, s tím rozdílem, že se jako sacharidu použije pouze glukosy, laktosy a sacharosy.

Agar se třemi cukry a železem (TSI) se zaočkuje kulturami všech fakultativních anaerobních mikroorganismů 1 až 15 z krevního agaru, který byl 24 hodin inkubován na vzduchu při 37°C. Po 24 hodinách inkubace na vzduchu při 37°C se reakce na agaru TSI charakterizují jako pozitivní nebo negativní. Každá zkouška se provádí dvakrát.

V případě fakultativních anaerobních bakterií 1 až 9 se Voges-Proskauerova půda zaočkuje vzorkem krevního agaru inkubovaného 24 hodin na vzduchu při 37°C. Přidají se činidla A a B (40% hydroxid draselný a α-naftol) a reakce se charakterizují jako pozitivní nebo negativní. Zkouška se provádí dvakrát.

V případě fakultativních anaerobních gram-negativních bakterií 1 až 15 se 2 zkumavky s Voges-Proskauerovou půdou obarvenou methylčervení (A a B) inokulují očkem z krevního agaru, načež následuje 24hodinová inkubace na vzduchu při 37°C. Při zkoušce s methylčervení se do zkumavky A_přidá roztok methylčerveně. Při Voges-Proskauerově_ _ zkoušce se reakční činidla A a B (405 hydroxid draselný a α-naftol) přidají do zkumavky B. Reakce se charakterizuje jako pozitivní nebo negativní a zkouška se provádí dvakrát. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 3A až C.

Zkouška s utilizací aminokyselin a zkouška s ureasou

Fakultativní a anaerobní gram-negativní bakterie 10 až 15 se zkoušejí na lysin dekarboxylasu a ureasu a bakterie 1 až 15 se zkoušejí na produkci indolu. Pro detekci lysin dekarboxylasy se používá agaru s lysinem a železem (LIA).

LIA se zaočkuje vzorkem krevního agaru a potom inkubuje 24 hodin na vzduchu při 37 °C. Reakce se hodnotí jako pozitivní nebo negativní. Každá zkouška se opakuje dvakrát.

Pro detekci produkce indolu z tryptofanu se používá dvou metod. Tryptofanová půda, která byla inokulována vzorkem krevního agaru, se inkubuje na vzduchu 24 hodin při 37°C a potom se nechá reagovat s Ehrlichovým činidlem. Vlastní^-detekce se provádí za použiti anaerobní metody s agarem a papírovým kotoučkem. Na misku s krevním agarem se čárkováním nanese zkušební organismus a potom se na povrch agaru umístí papírový kotouček. Miska s krevním agarem se inkubuje na anaerobních podmínek při 37°C po dobu 24 hodin a potom se na kotouček nanese 1% roztok p-dimethylaminocinnamaldehydu. Výsledky se charakterizují jako pozitivní nebo negativní. Zkouška s tryptofanovou půdou se dvakrát opakuje a anaerobní zkouška s agarem a kotoučkem se opakuje jednou.

Močovinový agar se inokuluje vzorkem krevního agaru a potom inkubuje na vzduchu při 37C po dobu 24 hodin.

Reakce se charakterizuje jako pozitivní nebo negativní. Zkouška se opakujedvakrát. Výsledky jsou také uvedeny v tabulkách 3A až C.

Obchodně dostupný systém API 20E

Fakultativní anaerobní gram-negativní bakterie 10 až 15 se také hodnotí pomocí 20 biochemických reakcí (viz tabulka 4) za použití obchodně dostupného systému podle instrukcí výrobce (Analytab Products, Plainview, NY, USA). Zkoušky se opakují dvakrát. Výsledky jsou uvedeny v tabulce .

Zkouška fermentace sacharidu, zkouška zkapalňování želatiny a zkouška s utilizací aminokyseliny

Obchodně dostupné předredukované za anaerobních podmínek sterilizované médium (PRAŠ) (viz tabulka 5) se zaočkuje hustou suspenzí fakultativní anaerobní bakterie 1 až 15 na krevním agaru. Média se inkubují na vzduchu při 37°C podobu 5 dnů a po 1, 3 a 5 dnech inkubace se pomocí pH metru stanovuje pH každé kultury. Kultury s hodnotou pH 6,5 nebo nižší jsou označeny jako pozitivní a kultury s hodnotou pH 6,6 nebo vyšší jsou označeny jako negativní. U argininového média se hodnotí zvýšení pH, zatímco u želatinového média se hodnotí zkapalnění. Každá zkouška se jednou opakuje.

Stejného postupu se použije pro charakterizaci obligátních anaerobních bakterií 16 až 29, pouze s tím rozdílem, že inokulum se připraví z organismů pěstovaných na CDCBA a všechny inkubace se provádí za anaerobních podmínek. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 5A až C a 3A až C.

Zkoušky s obchodně dostupným systémem API Rapid STŘEP

U fakultativních bakterií 1 až 9 se hodnotí 20 biochemických vlastností (viz tabulka 6) za použití obchodně - dostupného systému pro identifikaci enterokoků a streptokoků podle instrukcí výrobce (Analytab Products, Plainview, NY, USA). Postup lze v krátkosti popsat takto: Kolonie z krevního agaru, které byly inkubovány na vzduchu při 37°C po dobu 24 hodin se suspendují ve 3 ml sterilní destilované vody za vzniku bakteriální suspenze ekvivalentní standardu McFarland č; 5. Každá kopule se inokuluje a proužky se inkubují na vzduchu při 37’C po dobu 24 hodin. Po 24 hodinové inkubaci se přidají činidla pro stanovení produkce acetoinu, hydrolýzy hippurátu a enzymatické reakce na pyrrolidonyl-2-naftylamid, a-galaktosidasu, β-glukuronidasu, β-galaktosidasu, alkalickou fosfatasu a leucinarylamidasu. Reakce se hodnotí po 10 minutové inkubaci při teplotě místnosti, jako pozitivní nebo negativní. Hydrolýza eskulinu, arginin dihydroláza a produkce kyseliny z ribosy, arabinosy, mannitolu, sorbitolu, laktosy, trehalosy, lnulinu, rafinosy, škrobu a glykogenu se hodnotí jako pozitivní nebo negativní. Každá zkouška se provádí dvakrát. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Zkoušky s obchodně dostupným systémem API STAPH Trac

U fakultativních bakterií 1 až 9 se hodnotí 19 biochemických vlastností (viz tabulka 7) za použití obchodně dostupného systému podle instrukcí výrobce (Analytab Products, Plainview, NY, USA). Postup lze v krátkosti popsat takto: Kolonie z krevního agaru, které byly inkubovány na vzduchu při 37’C po dobu 24 hodin se suspendují ve 3 ml sterilní destilované vody za vzniku bakteriální suspenze ekvivalentní standardu McFarland č. -5. Každá kopule se in— okuluje a proužky se inkubují na vzduchu při 37’C po dobu 24 hodin. Po 24 hodinové inkubaci se přidají činidla pro stanovení produkce acetoinu, alkalické fosfatasy, nitrát reduktasy a enzymatických reakcí, na nichž se podílí amethylglukosid, arginin dihydrolasa, glukosa, fruktosa, maltosa, mannitol, mannosa, melibiosa, N-acetylglukosamin, rafinosa, sacharosa, trehalosa, ureasa, xylitol a xylosa. Reakce se hodnotí jako pozitivní nebo negativní. Každá zkouška se provádí dvakrát. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7.

Zkoušky s obchodně dostupným systémem API ZYM

U všech fakultativních anaerobních bakterií 1 až 15 se hodnotí enzymatická aktivita za použití 19 substrátů (viz tabulka 8) za použití obchodně dostupného semikvantitativního enzymatického systému podle instrukcí výrobce (Analytab Products, Plainview, NY, USA). Postup lze v krátkosti popsat takto: Kolonie z krevního agaru, které byly inkubovány na vzduchu při 37 °C po dobu 24 hodin se suspendují ve 3 ml sterilní destilované vody za vzniku bakteriální & suspenze ekvivalentní standardu McFarland č. 5. Každá kopule proužku se inokuluje bakteriální suspenzí. Po 4hodinové inkubací při 37°C v temnu se ke každé kopuli přidá činidlo A a B a reakce se nechají vyvinout 5 minut při teplotě !nístnosti“y Intenzita—zbarvení reakční— směsi— se—porovná—sinterprepačním schématem podle výrobce a klasifikuje takto:

= žádná barevná změna, stopy = méně než 5 nmol, 1=5 nmol, 2 = 10 nmol, 3 = 20 nmol, 4 = 30 nmol a 5 = 40 nmol nebo více.

Stejný postup se opakuje s obligátními anaerobními bakteriemi 16 až 29, pouze s tím rozdílem, že inokulum se připraví z organismů, které rostou za anaerobních podmínek na CDCBA. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 8A až C.

Zkouška za použití obchodně dostupných misek Presumpto I, II a III

Obchodně dostupné misky Presumpto I, II a III se inokulují obligátními anaerobními bakteriemi 16 až 29 z CDCBA a potom se misky 2 dny inkubují za anaerobních podmínek při 37°C. Zkoušky se provádějí a výsledky se hodnotí podle instrukcí výrobce (viz tabulka 9). Každá zkouška se provádí dvakrát. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 9A až D.

Zkoušky susceptibility vzhledem k antimikrobiálním činidlům

Pro zkoušení fakultativních anaerobních bakterií 1 až 15 na susceptibilitu vzhledem k vybraným antimikrobiálním činidlům se používá standardního disk-diffusion (viz tabulka 10). Bakterie se hodnotí jako resistentní nebo susceptibilní (včetně stupně středně susceptibilní). Každá zkouška se provádí j ednou.

Stejného postupu se použije i v případě obligátních aerobních bakterií 16 až 19; v tomto případě se však používá CDCBA a kultury se inkubují za anaerobních podmínek.

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 10A až C.

Výsledky

Výsledky profilů jsou uvedeny v tabulkách 1 až 10. Všechny bakterie se identifikují podle standardních kritérií pro kultury a standardních biochemických kritérií.

Příklad 3

Pokusy in vivo s kuřaty (brojlery)

Salmonella

Primární drůbeží izolát Salmonella typhimurium _ získaný z laboratoře National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA 50010, se podrobí selekci na resistenci vůči novobiocinu (NO) a kyselině nalidixové (NA) a uchovává v médiu s obsahem 25 mg NO a 20 mg NA/ml. Provokační inokulum se připraví z noční kultury, která byla předtím přenesena třikrát do sojové půdy s tryptikasou a sériově zředěna sterilním roztokem chloridu sodného pufrovaným fosforečnanem do dosažení koncentrace 4 x 10⁴ CFU/ml.

Koncentrace životaschopných buněk provokačního inokula se potvrdí spočítáním kolonií v miskách s agarem obarveným brilantní zelení. Média použitá pro kultivaci NO-NA resistentních izolátů z provokovaných kuřat obsahují při experimentálních studiích 25 mg NO a 20 mg NA/ml za účelem inhibice růstu jiných bakterií a neresistentních salmonel.

Uspořádání pokusu

Kohoutci (brojleři) se získají v den vylíhnutí z průmyslové líhně a umístí do kotců s pevnou podlahou, na níž jsou jako stelivo umístěny borové hobliny. Kuřata se chovají za kontinuálního osvětlení a umožní se jim volný přístup k vodě a nemedikovanému krmivu z kukuřičné a sojové mouky, jehož obsah rozhodujících živin odpovídá obsahu doporučenému National Research Council (1984) nebo je vyšší. Papírová výstelka transportních krabic pro kuřata a tři náhodně vybrané 25g vzorky krmivá se postupně kultivují v pufrované peptonové vodě, půdě se selenitem a cystinem a na miskách BGA, jak to bylo nedávno popsáno v Andrews et al., 1978, Isolation and Identification of Salmonella, Bacteriological Analytical Manual, 5. vydání, Assoc. Off. Anal. Chem., Washington, D. C. , kapitola 6, 1 až 24, a analyzují se na salmonelu. Salmonella spp. se nezjistí ani na papírové výstelce ani v krmivu. Kuřata se náhodným způsobem rozdělí do dvou stupin, přičemž jedna skupina (kontrolní) není nijak léčena a druhé skupině se podá charakterizovaná _ kultura (CC) v první pitné vodě. Charakteri zovaná kultura se shromáždí jako výtok z průtokové kultury z příkladu 1, který obsahuje přibližně 10⁸ anaerobních CFU/ml. Tato kultura se přidá k pitné vodě v poměru 1,5 (1 díl CC na 4 díly vody). Ošetřovaná kuřata dostávají upravenou vodu po dobu 18 hodin a odhaduje se, že každé kuře vypije 10 ml vody ošetřené CC. Po 18 hodinách se zbývající ošetřená voda odstraní a nahradí čerstvou vodovodní vodou. Třetí den, dva dny po ošetření CC a před provokací salmonelou se 10 kuřat náhodně zvolených z každé skupiny usmrtí cervikální dislokací. Potom se plynovou chromatografií s kapalnou stacionární fází (GLC) popsanou výše (Corrier et al., 1990, Avian Dis. 34: 617 až 625) stanoví koncentrace kyseliny propionové (těkavá mastná kyselina, VFA) a celková koncentrace VFA (kyseliny octové + kyseliny propionové + kyseliny máselné + kyseliny isomáselné + kyseliny valerové + kyselina isovalerové) v obsahu slepého střeva.

Všem zbývajícím kuřatům se ve stáří tří dnů podá provokační dávka 10⁴ CFU S. typhimurium (jedná se o doporučený postup pro vyhodnocování účinnosti nově připravených kultur cekálnich bakterií; Mead et al., 1989, J. Food

Protéct. 52: 500 až 502). 20 kuřat z každé skupiny o stáří 10 dnů se usmrtí a za aseptických podmínek se jim odebere obsah slepého střeva, v němž se dále uvedeným způsobem zjištuje kolonizace S. typhimurium. Cekální obsah 10 desetidenních usmrcených kuřat se zvolí náhodným způsobem a výše uvedeným způsobem se v něm určí koncentrace VFA. Pokus v tomto uspořádání se čtyřikrát opakuje za použití nově vylíhlých kuřat a charakterizují se cekální bakterie, které jsou udržovány v průtokové kultuře po dobu 5 dnů (pokus 1), 26 dnů (pokus 2), 40 dnů (pokus 3) a 61 dnů (pokus 4). Koncentrace VFA obsahu slepého střeva se stanovuje při pokusech 2, 3 a 4, ale nikoliv při pokusu 1.

. ,.„ ₌ _ .. _Koncentrace kyseliny propionové v obsahu slepého střeva ošetřených kuřat se významně zvýší (P < 0,005) ve srovnání s kontrolními kuřaty v den 3 a v den 10 při pokusech 2, 3 a 4 (viz tabulka 11). Kromě toho existuje významná korelace (P < 0,005) mezi zvýšenou koncentrací kyseliny propionové v obsahu slepého střeva třídenních ošetřených kuřat a dekadickým logaritmickým poklesem počtu salmonel v obsahu slepého střeva desetidenních ošetřených kuřat (r = -0,99).

V den 3 se významně zvýší (P < 0,01) koncentrace VFA celkem v obsahu slepého střeva ošetřených kuřat ve srovnání s kontrolními kuřaty (viz tabulka 12). Kromě toho existuje významná korelace (PP < 0,01) mezi zvýšenou koncentrací VFA celkem v obsahu slepého střeva třídenních ošetřených kuřat a dekadickým logaritmickým poklesem počtu salmonel v obsahu slepého střeva desetidenních ošetřených kuřat (r = -0,67). V den 10 je koncentrace VFA celkem v obsahu slepého střeva ošetřených kuřat podstatně zvýšena (P < 0,05) ve srovnání s kontrolními kuřaty při pokusech 3 a 4.

Kolonizace slepého střeva S. typhimurium

Jak již bylo uvedeno výše, za aseptických podmínek se z každého kuřete vyjme jedno slepé střevo. Slepé střevo se nůžkami rozdělí na malé kousky a 24 hodin inkubuje při teplotě 37°C v selenitové-cystinové půdě. Po inkubaci se půda načárkuje na misky s BGA. Po 24hodinové inkubaci se misky vyhodnocují na výskyt typických kolonií S. typhimurium. Část (0,2 g) obsahu zbývajícího slepého střeva se sériově zředí a rozprostřeně navzorkuje na misky s BGA při zředění 1 : 100, 1 : 1000 a 1 : 10 000. Misky se 24 hodin inkubují při 37°C a potom se v nich spočítají kolonotvorné jednotky (CFU) S. typhimurium za použití automatického počítače,.kolon.i-í_(Biotran„III,^New^Brunswick,„Edison, NJ, USA). Totožnost typických salmonelových kolonií se potvrdí biochemickými zkouškami na agaru se třemi cukry a železem a na agaru s lysinem a železem (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Druh salmonely se identifikuje jako S. typhimurium sérologicky za použití Salmoneila 0 antiséra, skupina 13, faktory 1, 4, 12 a 15 (Difco Laboratories, Detroit, MI,

USA). Počet kolonií salmonely v misce se vyjádří jako log_1Q

Salmonella/g obsahu slepého střeva. Obsahům slepého střeva, které byly negativní vzhledem ke kultuře salmonely při zředění 1 : 100, ale pozitivní po kultivaci za přítomnosti selenitu a cystinu se přidělí hodnota 1,50 log₁₀ salmonel/g obsahu slepého střeva. Kulturám se selenitem a cystinem, které byly negativní na miskách s BGA se přidělí hodnota log₁₀ salmonel 0.

Pro vyhodnocení účinnosti léčení pomocí CC při resistenci vůči napadení salmonelou se vypočítá tzv. ochranný faktor (PF), který byl nedávno definován v Pivnick and Nurmi, 1982, The Nurmi Concept and its Role in the Control of Salmonellae in Poultry, Developments in Food Microbiology, Davies (ed.), Applied Sciences Publishers, London, 41-70; Mead et al., 1989, J. Food Protéct., 52:

500 až 502. Ochranný faktor je definován následujícím způsobem:

střední log_1Q salmonel v kontrolní skupině PF = střední log₁₀ salmonel v ošetřené skupině

Rozdíly v počtu kuřat pozitivních vzhledem ke kultuře S. typhimurium mezi skupinami se analyzují pomocí analýzy chí-čtverců. Rozdíly mezi středními hodnotami se určí za použití Studentova t-testu. Významnost korelace a všechny statistické postupy se provádějí způsobem popsaným v Snedecor a Cochran, 1967, Statistical Methods,6. vydání,» Iowa State University Press, Ames, IA, USA.

Při každém z pokusů 1, 2, 3 a 4 počet S. typhimurium v obsahu slepého střeva ošetřených kuřat významně poklesne (P < 0,005) o 6,35, 5,39, 3,84 a 5,77 dekadické logaritmické jednotky (viz tabulka 13). Ochranný faktor vypočítaný pro odhad účinnosti charakterizované kultury při pokusech 1, 2, 3 a 4 činí 63,5, 7,14, 15,2 a 10,6.

Experimentální provokační dávka 10⁴ S. typhimurium vede ke kolonizaci slepého střeva u kontrolních kuřat o stáří 10 dnů při pokusech 1, 2, 3 a 4 z 90 až 100 % (viz tabulka 6). Ve srovnání s kontrolními kuřaty významně poklesne (P < 0,01) počet kuřat pozitivních vzhledem k cekální kultuře se salmonelou při pokusech 1, 2, 3 a 4 o 100, 65, 75 a 60 %.

Příklad 4

Příprava probiotika

Připraví se druhá kultura v ustáleném stavu za použití průtokového postupu podle vynálezu, popsaného v přihlášce USA pořadovaného čísla 07/921,173 podané 29. července 1992. Tato citace je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Tato kultura v ustáleném stavu, která se označí zkratkou CFII, se skládá z 11 různých bakterií, a to ze 4 fakultativních anaerobních gram-pozitivních koků, 2 fakultativních anaerobních gram-pozitivních bacilů, 3 fakultativních anaerobních gram-negativních bacilů, 1 obligátního anaerobního gram-pozitivního bacilu a 1 obligátního anaerobního gram-pozitivního kokobacilu. Bakterie jsou identifikovány takto:

(1) Enterococcus faecalis (označený jako kmen A), (2) Enterococcus faecalis (označený jako kmen B), (3) Enterococcus avium, (4) Lactococcus lactis (5) druh Lactobacillus (označený CMS) (6) Lactobacillus animalis, (7) Citrobacter freundii, (8) Escherichia coli, (9) Escherichia fergusonii, (10) Bifidobacterium animalis a (11) Propionibacterium acidipropionici.

Tato kultura v ustáleném stavu vykazuje významnou s účinnost jako probiotikum při podání drůbeži a ve srovnání s neošetřenými ptáky významně snižuje kolonizaci drůbeže Salmonella typhimurium a Salmonella enteritidis.

Tabulka ΙΑ

H cn r~l fd q

•H

Pí q

X oo ω

O

Pí o

N

Pí

O

Pí \

>í

Pí u>

o >t

Pí

I H I I I I I I

I E-< I I I I I I

I lilii I H I I lili

I I .1 .1 .1 I I I I

I I I I I I t I I

I »4 I I I I I I i w i i iiii

I w I I I l I I I I Ul II II V

-|-f*-|—|—|—|—|—|—|I tP I I I I I I

I Et I I I I I | in

H rt c •H Ch q λ-; ω o

Pi >t

Pí o

>í

Pí o

>í

Pí o

Pí >t

Pí o

Pí «3 £

I I I ’ I I I I I I

Et Eí I I I I I I I

I E-t I I I I I |

I Et I I lilii

J I I i I I I

I Et I I lili

J ¢4 I I | | | ICO l I lili

I ι-, I I I I I

I Eí I I I III

I U I I I I I I

I Et I I I I I I \ \ \'χ \x Λ. \ I t-3 I I I I I I

W m II II I I I i Eli Cil i '(Ú >

»nj '(0 'rt > o C 'rt 'rt 'rt

Ή

O rH

P

'rt

0

>

>rt

O

'rt

»rt

>

'rt

P

>O

q ω

'rt

<u

>

P

0

>

P

>

>

o

>

0

q

'rt

o ω

q

rd

o

Pí q

O 'rt

υ

o

o

P

o

o

0)

>

•h «rt

,—1

C0

P

rt

0

q q

o

q

P

rt

o

rd

>

O

Pí B

<D

>

<D

Ai

P <

N >o

1-t

o

rt P

N

>í

rt

P

O o

ω

o

rd

0

Pí Cm

O '<D

rt

rd

β

q

q

q

P

υ

P w

'rt

ω

ítí

w

rt £>

P r-1

X

(Ú

q

rt

0)

QJ

β

o

Pí Ή

β

•rd

>

•rt

•X 2

£3 β

o

β M-l

•o Λ

M-t

Ή >

P ω o —^>N-£3<U 0 '<U u q *

Λί β	rd
q	G)
Ό 0	>
0 £3
Ρ 'QJ	•H
&H	β
rt	rd
-rt β	0)
c	>
TJ 01
>rt u	QJ
>N Λ3	υ
q Λ3
11 Ό	q
0 Ό
1 P	0
PíP
··	Pí
o ii
P	II
X w
rt	>

p 'rt rt 'rt >

>P P 'rt T3 tn > >rt >N P •rt O W >1 q >n > fi O

Φ ο’β“

U1 £3 '0) o < > £3 tu O '<D > &Λ4 2 O H

P 0) rt w >

C 0) 0) tu υ υ > Λ3 >3 q q 'rl Ό Ό Ή > o o >

Ρ Ρ Ρ P w Pí Pí ω >N >N o II li o c q

SEP Ě

Tabulka 1B

Tabulka 1C

H
ΐ>
(ti	o
C	Ch
•H O
ChCM	>4
C	Ch
44
ω
>
	o
	Ch
(0 co	\
Ccs	>4
•H	Ch
Ch
c
44
W
	o
	Ch
	>4
	Ch
	o
	Ch
ω
	>4
	Ch
	0
	Ch
tn
CN	>4
	Ch
>
M

(ti C xj· •d (M Ch C λ: ω rs

- 40 I El I I > I I I 1 I W I I U I I I I

I E-t I I I I I I I

E-t W I I I I I 1

I LQ I I I I I I I i i i i i i i i i

-I—1—I—I—I—I—I—I—I

I I I I I I Ο I

I I I I I I tb I

I t-J I I I III

E-« I I I I I I d-t-J—II LQ I I I I I I o

Ch \

>4

Ch o

Ch >4

Ch o

Ch >4

Ch „0Ch \

>4

Ch

I I UEI W J I I I Eh cn cn i i i i i i i w i i cn i i i i

I t-J I I I I I I I

I J I I iJ I I I I

1 I > I I I I

I I I I I I I I

I I I I I I t-1 I

I I I I I I I I

I I I I I I 1-4 I

I I I I 11,-)1 I E-I I I I I I I

I LQ I I I I I I

I E-I I I I I LQ I •iti

'(ti '(ti

>

O

'(ti

>

> c

0

c

'(ti

>

'(ti

o

Ή

0 rd

Ci

'(ti

o

>

'(ti

O

'(ti

'(ti

>

'(ti

44

>υ

C 0)

'(ti

OJ

>

c

o

>

4->

>

>

o

>

o

C '(ti

0 w

c

H

0

Ch

c

O >(ti

O

o

o

Ci

o

o

Φ >

•H '(ti

rd

«3

M

(ti

o

c c

O

c

Ci

(0

o

rH

> 0

ch b

Φ

>

Φ

44

Ν >0

r—1

o

(ti

44

N

>1

(ti 44

O 0

w

0 H

O

0 'Φ

(ti

r—1

B

c

c

C

M O

Ci (fl

'(ti

w

(ti

w

φ í>

Cl M

X

(ti

b

(ti

Φ

Φ

b o

Dfd

B

•H

>

•H

44 55

Xí B

o

B

nXJ

<W

- 41 σι co

I XI i

re + -Q l m +i

X ' H3 + Ο 1 <4-1 +| id < C

4* O I <4-1 +1 + + + Z I Z + id < <

-E U l<4-t+1 + + +Z+ Z -4id t- O I <4-1 +1 + -|m;

+ z + Z +

	•Ή
	q
Ui	x
q	0		id
r4	P	•>i	N
r—1	0)	q	'>1
•H	id	0)	r-4
0	q	υ	O X
id	io	(0	β O
X		X	ω ή
0	Ή	o	xi q
U	q λ	Λ

Tabulka 2A l|

Charakterizace buňky, kultury a kolonii

CM ld tí

Ή β

Ό

O řu id + υ i u-ι +i + +

Id < rtj + o I <4-4 +| + + +Z+ Z + <D

O

X

Id

Q)

P id >

o β

id

P

O ld >4-1 <4-1 o

p id w Cn id

			VU w
0	•Η		ω ρ
υ	Ρ -		ω
	id β		•q id
II	ρ ώ		β q
	γΗ >		ω ιό
Λ	q οι		•Η
υ	44 μ		q χ
	ιθ ίο		id ο
«*	ή q		tn'rl
(Λ			ρ q
q	β		Ο -Ρ
rH	** Ή		o 'id
rH	ή q		Ρ tn
•Η	q >υ		44 ·Η
υ	Λ ω		•Η γΗ
10	Ο Ό		β X!
Λ	Ρ Ρ		Ο
	ω ω	β χ
II	id ο	ω	υ q
	q 44	q	Ή
Λ	Ιθ Ν	ο	q id
	ο	•Η	XI	•
·»	Ή β Ό	ο q
ω	q	id	Ρ Ρ	«
q+J ω	q	ω id	u
υ	'(ΰ	ω	id tna
υ	Cn ρ	β	q <d	o
ο	•Η rtf		id
υ	η tn id	β	id
	X ια		X! Ή	q
II	ο	β	o q

O II ω

•H Cn id o -p ι—I ·Η O H <H -H P 4->

O O . . £ £ a « > a o · q (d 3 6 >o > P k 'S 3 ω id O id C i-i tnx! CnO >n id >nd o

Q) β 44

Ή q q o „ _

- > U > Ό

X! -P <U O <U -H o ω P id p n

Ή id β β id β

M Q) 0) > υ o > >o in q sr

I—) ' >N

H <D q q

Id Φ β Í4 ® +)

OJ β

0)

ω q	ω q		id w	q	N
Ή	•H		N	0	'>1
q h	q h		'>i ω	u	H
p q	P q	CQ	H 0	0	0
id 44	id 44	u	0 44	id	p
Cn ω	Cn w	Q	β Id	£	Ό
id ω	id ω	u	Φ OJ
			W PS	q £

Q) •H tn ··

O Ή II •η q o > ic < <4-1 X CQ ρ υ υ

O *>iQ £ a υ q

r—I h > *q ω q ω β -P > Ρ W ·Η H 44 ·«-) *N x! id (d <0 o -Ρ β tn ft

P

a) o q •m O . q ρ li <4-1 >O 44 Ρ ·Η rtj q β Z q

id o

Cl σ>

co r-i rH

Λ0ir>

.-i (0 <

+ η i o 21 ra + 43 I O 2 1 (ti <

+ Ό I O 2 1 + 43 (ti

I 43 I 04 4 4 < ' C <

Z Z 2+1 rt. 'X, < <

Z 2 2 2 1 <<

z ω

•r-i q

o pH o

(0 >1

Í4 +>

rd

M'

~A!	r-H -.^=-
iC	rH
q
Λ
Φ
υ
ni
N
P3 ·Η
(N >4
Φ	(ti
(ti +J	X
44 44	fti
rH flj	Ή
q P	g
43 (ti	Ό
(ti 4ti	0
H O

ná

I Λ + 4-1 4-4(ti

43 + 04 + + fti

I X) I M-I 4-4«< I z < < < <

Z 2 2 Z I + Z

											<
	z- ......-	(ti	—		<-	• <				Z -
i	43+04		+ +	z	Z	Z z	1		+
											q
				q	g		g				g q
				>4	'>1	*—«*				q	(ti q
				(ti	Ui >	o	> o			o	tn-H
				tjl	O	o	o «			w	fÍ3 r4
Φ				q (ti	q g >o		>U in			0	q
O				Í4	g >i q	m	q ·*			+>	O 44
44				(ti o	(ti q r-4		ι—1 *«—*			44	4ti W
fti				Cti 4ti	tPXJ >N		>N			(0	>1 Φ
O)	φ			(ti >t (ti o	g	g			rH	Φ
g	•H			0)	W 0)	0)	Φ Φ				44 (ti
	tT> (ti		··	g 44	g w	q	w q		(ti	w	q n
(ti	0 +>	Ή	(ti	•h q	Ή g	•H	♦H		N		O '>i
>	r-( ·Η	q	q	q o	q o) q	r-4	q -π		'>ι Φ	U r4
o	O H	*íd		> u	> Ό >4	q	L q	m	<-4	υ	o o
g	04 -H	4ti +>	φ o	Φ -H (0 44	(0 44	u	O 44	(ti g
(ti	g -Ρ	υ	«	M (ti	L N tnW	tn w	Q	g	(ti	g Ό
>4	0 0	>>v3 44 g 44 (ti fti	Φ	(ti Φ	u	Φ	φ
o	g g	D «						Z «	q W

cn

CM co

CM

Γ»

CM ισ

CM lO

CM

M·

CM n

ΓΜ

ro		< rtj
O	2	2 2	2	2
ro	< 1	1 C <	< + 1
o	2 1	1 2 2	2 + 1	2

Xi rO + Ο I O ιθ + X» I o (0 + Xi I O + X) I + XI I < < < (<

1 2 22 + < < < rtj

12 2 2 <0 < < < < <

O 2 12 2 2+ 2 m |< < < <

O 2 12 2 2+ 2

Tabulka 2C II

Charakterizace buňky, kultury a kolonie

CM

CM

CM

Xi (0 + υ i o (0 + X I O

σ\ co ιο

Μ* (Μ

I + +1 (Ο + I (Ο I <<

Ϊ5 <0

I ¹ · · +1 Ι+ + + + + <011 +111 + Ζ II

I + + + + + <011 + 111 ι <0 ·+ + + + + <οι ι + ι ι ι ι

I + + +. + + <011 + 1111 <0 <0 I <0 \

<0 I + Ζ II <<

Ζ vlastnosti '<U < 44 η ο •Η ε ο λ: ι—1 Λ 3 υ χι (Ο

Η ο

Ή

CQ

X

Ή ε

Ό

Ο

PU (Ο ε +> 3 «3 tP 3 3

4->

•Η (Ο χσ •3

Λ ο

Ή <0

X!

.Ο.

<0

W <0

X.

<0 I <0 <0 I '>1 ε

•Η >ω w (Ο α) +> >3 Μ ιη ο Η (Ο 44 <0 Ό 3 -3 -3 ·Η Ό ·Η 3 X 0) 3 X Ο (X

3 <0 Χι Ο <0

ÍÚ	ω	rH			r—1	1/1
C	ο	Ο	<0	(ΰ	Ο 3	Ο
•Η	<0	+ι	U)	ω	+> ·Η	3
Η	Ν	•Η	ο	0	•Η Ο	3
ω	C ·Η	Ο	+»	4J	3 ·Η	,3
	ΧΗ	ι—1	44	rH	3 Η	Ο
κ*ιγ~4 *Η	3	<0	(Ú	<0 3	3
44	ft+>	Q		W

H

W

Εη 'řh 3 > Ο 3 ο h Ό <0 ο tr > <<

Ή Ό ο >

0. ΧΜΧ ι—1 ·Η +) ft ω ω •3 ω > ω >4 ο ω μ •Ο (+ <-ι ι >ι ω

Μ 3 OJ r—I 3 Ο 3 Ό X 3 ω υ +> 3 ><0 0) Ό Μ tr ο +> Ο 3 ·Η

Ο +>3 3 '(0 ·Η ό C <0 W

3Ή rH c S><o

X > >1 Ο Ο C

XI >3 ·Η 3H+J

S 3 3 3 3

Ο ·Η ,3 ·Η 44 ftr4 >-ι&ι·ΗΐΛ<ΐ)<οωο) 3 3 Ό Χ3 44 >Ν Ρ s < χι ν ο

Tabulka 3A - pokračování

Redukce nitrátu: na nitrátovém agaru: + = růst, - = žádný růst anaerobní metodou: se stanoví kotoučkovou metodou na krevním agaru

Utilizace sacharidu: + = produkce kyseliny,

- = žádná produkce kyseliny

Agar TSI vodorovný/šikmý: a = kyselý, b = alkalický Lysin dekarboxylasa stanovená na agaru LIA NA = nepoužitelné o

(M $ < < < < < < < <<<-<<<<< ZZ ZZZZZZ ZZZZZZZZI σι < < -<<<<<<<<

ZZ ZZZZZZ ZZZZZZZZ+ II oo

H . . fis? <(<<<<<,<

II Zl ZZ ZZZZZZ ZZZZZZZZ+ II i· ži gg gggggg. gggggggá, , , o

rH , , á. 2: čS S: ·<<<<<»<<.<<

Zl ZZ ZZZZZZ ZZZZZZZZI II m

r4 + 1 + + + + I + + (ti

X

I (ti + I + | + +_4- |

Ί I + + 4-1

11+4+ 11 -Ι4- I + + 4-4- II

Ό l I I I I I Ό I 1111 + (N (ti + (ti + l + I + I + + (ti + (ti + + + | I + + I

Tabulka 3B

Ή

-Ρ

W

O

C

-P

W (ti r-l >

Ό

U •H ε

o

Ό υ

o •H κ

q +>

>(ti tn (ti (ti

C

Ή ε

Ό

O

CM (ti

-P •H q

(ti (ti

Tti •q

Xi •H

P (0

Ό

U (ti

Ul >1 ,™ q (ti (ti -H ω ω +j (ti (ti to > β '(ti (ti o Ό > q o o -H q w i-i o o ω

W fti <u +>

(0 ω υ '(0 r4 (ti 44 q _ _ (0 Ό q -P (ti 44

-Ρ -Η Ό -H ' <ΰ x ω q

W o pí

OJ i~4 i—i υ o ίο <ti o (ti ό w w +)

N -Η O O -H q -H O +> +> q

- .. r-4 r—I 44 r-4 C q ti x i-1 ή q <0 iti cg q H 44 Λ-P O Ό g g w w

O D

Ή >W q

H > w O h q o >4 Ό rti o tn > <

P q

0) r-4 q o »q ío ό ω 44 q > ω -η M o ω >4 ω >υ o r-l I 44 >i w ί>ι ω x »N

Ή Ό O >

&θΛ (DO —i -H +j tn o fttí (U O (4 g > cu o M

X} O >ιΌ Ό L •H í0 Xi X ω q xi >q •H q q <ti •r4 -H a (ti tn w (ΰ ω >4 >i44 M

Ή q

'(0 >

o

- 47 σ«

Ol

2;Z ZZZZZZ Z Z Z 2 Z Z Z § + co

OJ >·

Ol

O

OJ oj s?

OJ n

OJ

Z. I << <<<<<<<< z z T: z z z z z z z z z z z +

I. ' á á á 5: á 2* 2: <<<<<<<<

^{11 Z z} zzzzzz Z Z Z Z Z Z Z Z I II << < < < < < < <<<(<<<(<<<;«:

ZZ ZZZZZZ ZZZZZZZZI I I <

liz <<

J5-S Z_Z-Z-Z-Z-Z Z-Z-Z-Z-Z“Z^_Z^_Z^b-1—Γ f· fí f; < 2· ^ř'^: '^ť‘ < <4 'Tj 'ti .-Z XM Z Z Z Z Z ZZZZZZZZ+

ZZ ZZZZZZ zzzzzzzz

OJ — <c <i i< <; λ: <c <

ZZ zzzzzz zzzzzzzz < < á á & & 2« < <<<(<-<<<< z z zzzzzz zzzzzzzz

Tabulka 3C

Biochemické vlastnosti ιϋ

C

Ή e

Ό

O a

4J '(0

J4

4-1 •H c

(0 w 3 <u 3 ω o H <0 44 3 Ό 3 4-> ·Η Ό <0 X OJ « o « tn

PS >i'H > c O Λ 4-> O (0

Ό •3 a

'(ti (ti > c

O -H W r4 O rG u

ω ti) <~4 r—I

O O 3 3 O 3 4-> ω V) 4-) O O Ή

N

- O) C Ή u 4) 4) „ 3 44 W >ir-4 H4ÍH C G3>iHH 3333 3 H 44 ft4J Q (4) a E O p >w c

•H

O 3 H •HZ O <—I O Η Ό 3 3 3 0 CZ3 W tP >

H >4 W >4 3 ti) H 3 O >fi 3 3 ti) 44 G W Ή O >4 >

Ή >4

Ό ti) . . _ o ·□ a q ί> r4 ti) . - 44 4J

G O >i W 3 '3 ÍH >4 Z 013 >4 r4 ·Η 4-> tlO +1 a w o) o l -η a > a u palňování želatiny

3 ω ω 3 3 r4 r4 Ο >1 >4 X Ό Ο ίΗΛ Ζ >4 •Η 3 Ό 44 0)

Z G Ό '3 ·Η G G G Ο ·Η ·Η γ4 tP W 3 0) 3 14 >ι44 L S < Ρ Ν p

- 48 ιη \4/\\\* ¹⁺¹ >++·+ + + + + + + 1 + 1 ι ι I I + I 1++1+++++^

-3· r4 +J Ό ι—I ο η Ν ι-4 •Η

Ή

C

Η 'Φ •Η

+) «Η 44 φ— + + + + + I + I I + + + + + + + + + + + + + + + + I + I | + + + + + + + + 4-4- + //ÍČČJýJ^{1 1 + 1 1 1 1 1 1} I · ¹ * + + + + I + I I I + I I I I I | | | ι ^{+ l} *++·+ + + + + + + ι + + I I I I + I I + +Ι + + + + + +^- +^ + I I + ·Ι · ι ^{1 1} I I + + I + + ι I I + + + I Ι++Ι I | | 1++1++^7^^ + .1 + + ι ι ι ι + ι + + Γ ι ι ι +

I j + + I + + + + ι +

I I + + I + + + + ι +

3« π3 r-4 q

Λ

Φ

Η ο

ΓΜ κ

ε 'Φ +j

W >1 ω

S >!Λ

Β

Ο

Ν '0) υ

•Η ε

Φ λ

υ ο

•Η

PQ (0 ω

φ

Φ φ γ-4 W W >ί Φ (0 X ΗΗ Ο Ο >,43 β X β Ό Ο Φ >ι43 44 Λ β φ •Η φ Ό Ό 44 φ q C Ό ·Η •Η 43 +> C C +> >Φ •Η Ή ·Η >4 Ο> W q +) β >ι β -Η << αι ο υ (ΰ

W (0 q

(0 ω

φ

Μ 0)

Γ4β « ίο

•H		β
β		ω
Φ		q
Φ		o
Ό		44
		w
q		O
Φ		β	Φ
44		P,	q φ
o		1	•<4 W
+>	r4	w	+> O
Pr	O	ω	(0 44
s	Ό	Ol r-4 q
β	q	O	Φ r-4
E4 h	>»N O

ι—I r-4 ι—1 0 0 0 +) 44 +> •Η ·Η ·Η q W 43 q ο ρ • <S c OSHM φ φ q φ λ ω w ·η ω

Ο Ο Η Ο β ή φ q S Φ Λ Ό ·Η § 43 ·Η Οΐ43 _ Φ U t—ι >, Φ Ο Λ φ φ β Μ w δ ω a < <

Data z prvního/druhého opakování |i

I + I + + I + + I l++l + l + | + |+ +||++| + + I+ +I++I + I+ + +I I 1 +

I + + I 1++1 +

I · I+ + + + +I+ + + + +I + I + I ι + ι 14-co ^{1 1 1} + 1 I + + | I + | 4- 4- 4. 4. | 4. | 4-4.1 | | + + ₊

+) '<d r—1 O N

I + I+ +I + + + + + + 4-4-1 | | 4-| 4-4-1 ₊ 4.₊ , ₍ + +I + +Z + + + I + 4- + + +I+4-I +

Ή C I—I '<C Ή P

O in -P rd m

I + I+ +I++14- + + + 4- + +14-I+ + +1 14-4-4.

^{1 + 1 + 1} I I I I++I+ + + +I + I+ 4-+I+4-I4l + l + l 1 1 14-14.4.4-14.4.

I + I+ + +I++I4Tabulka 5A

Zkoušky fermentace{sacharidu (N

I + I+ +I++I 1 4- 4. 4. 4- 4- 4. , 4.

+ + + + I 1 + 14+ + I + + I + + + I 4-4.4-4.4. + 1+ + + + + + + + + + >

o

Ό -P •r4 ^xíXj Ρ P (0 -P Λ ω O Λ (0 P ω ω

Cd fd rd

Csl

O fd ι l * + i+ + +i++i++i + i + i+ + + + +|+ + ^{1 1 1 1 1 1 1 1 1 1} lil I I I I lili i lili i

4-> TO '(ti r4 rd

O

N •H q h r-H •H q

£ co +C ^1-1 rti (fl

ID rd sj· rd ^{1 + 1 1 1} I + I I + I | + | | + I + ι I I I | , + , ₊ i + i + + i + 4- + + 4-4.4.4.(

I+ + + +I I | | | + ¹ F I -|- | I + + + + 4- 4- + + + 4. I 4. I .(. | | .( 4. 4. 4. + + 1 + 4-4-4- + + 4-4- + + + + + + + + + + + 1 + + +

I I + + + + + + | + + 4-1 , , | 4. 4. , ₊ , , _{| + | +}

Tabulka 5B '

Zkoušky fermentace sacharidu n

rd rd rd '>1 >

O

Ό 4-> •rd '(ti íd q (ti +> x; w o Λ (0 q cn w ^{1 1 1 1 1 1 1 1 1 1} I I I I I 1 l 1 1 1 l 1 1 1 l l 1

I + |+ _{+)+ + + + + + + +} ! , , (ti (0 (ti rd W 1-4 (ti rd WW rd W

O Ο O W O cti (ti O O OO +>q+ioM+)ww-Hqcti4-»M •Η -Η -H +) ω 'Cti ο O X) -rd ω -rd cti g -Q U * υ-Ρ+ι q ·Η 4d ο Λ X! o ca rd q >,λ; rd q rd «h λ p u rtjrtjOi+eiqiŠSgpSpícnw

I + I + + I | + + I + (ti rd q w o •h o +) rd rd ·Η (0 (ti (ti Λ >4 W 1/1 Ό O Λ O o cnrd +> λ; r4 řdrd řd q >Ί β Φ )d rd

X ·< U W O

		(ti	(ΰ
		ω	c		(ti
rd		H 0	N	(ti	V)
O	(ti	0 +>	0	Ui C	0
+>	W	Ρ -H		O -rd	rd
•H	0	•Η N	X!	C O Λ	(ti
W	+)	q <u	O	β ·Η O	XI
O	X	q rd	M	(ti rd Id	Q)
q	(ti	(0 ω	>1	Λ (ti Λί	L
H	ŮSg		S w*n	Ed

σϊ

ÍM ^{111 + ιι + ι|}ιι ·ι·ι + ι + ι + ιιιιιι + ^{1 * 1} · + I I I I I I I I I I 1 I

I I I I I I I I I I I

I I + + I + + + + I I + + | + | + | + | I , , | ₊ , ι + I I + I + ll + ll + lll| + | + |||| + | ₊

I+I + I+ +I 1 + 1 I + , + + I ₊ | ₊ , , , , _{+ | +}

Tabulka 5C' if

Zkoušky fermentace sacharidu n

<N '>i >

O

Ό -P •H '(0 Ρ P (ti μ

W

O Xi (ti 3 ω w ^{1 1 1} + I I ι + I I I I I + t | 1 + 1 | + | I I I ι | (ti <—i (0 q

(ti

(ti

(ti

(ti

(0

q ω

Ο

Μ

q

(ti

i—1

W 1-1

rn

W

w

rH

ω

•Η 0

+1 ι-Ι

ΓΗ ο

N

(0

w

O

O 0

U)

o

(ti O

o

ο

0

ι—1 ·Η

•Η (ti Ο

(ti ο μ

O

w q

o

+1

q +j

0

P μ

w

W -H

q (ti -μ

Ρ

(ti (ti XI

ρ ω -μ

Ο μ Ή

P

O -P

i—l

•H

•Η ·Ρ

+>

φ «(0

o

O XI

•H w

•Η

(0

ω ό ο

X! Ο ·Η

Ο ·Ρ Ν

XJ

q o λ

(ti

q

XI O

o +»

+>

C -H

M O

XI X!

Ο tPi-l

£3 8

μ q ω

o

Ρ ·Η o

x:

O

(ti ι—1

3

>·.*

i—1

q h

<p xi

Ρ

υ

ι—1 ίΡ i—1

Λ4 q ι-Ι

P

(ti Ρ P

ω

τι

P 3

P

ι—1 (ti

(ti

(0 0)

(ti Ή

Ο

(ΰ

>1 β Ú)

ρ η q

(ti <ti ω

>1

Λ (ti 44

P

Q Cm

w w χ < υ

W Ο Η

μι S S h(

2 ww

Cí co '3 rH

O

N •H

Ή p

rH ^v3 in

Ή

P

O •P λ:

ni

CQ ca + · I I I I I l + l I I I I I I I | I I + i i i i i i 1 + 11*1*1 iiiiiii + I+ +I I I I + + + I + I + + I y> I I I + I + I + I + + I + + + + I + + + + + + + + + + + I + + I + + + + I + + + + + + + + + + + I + + I + + + +I I I I + I+ + + + + +I I I I + + + +I I I I + I+ + + + + +I I I I + + + +I++I+ + + + +I++I++I + + + + I + + I + + + + + I + + I + + t

Tabulka 6 j

Zkoušky se systémem jAPI Rapid STŘEP + + + +I I++I+ + + +I++I I I I + + + +I l + l I+ + + +I++I I I I + + + +I I + I+ + + + +I++I l + l + + + +I I + I+ + + + +I++I l + l + + + +I I + I I++I++I + I l + l + + + +I l + l I++I++I + I l + l + I+ +I I I I+ + +I++I + I l + l + I+ +I I I I+ + +I++I + I l + l +>

P . P 3 rH

Ό •H

E rH

-P 3 +i P (0 H P

I

3		3
W	3	W
3	W	3
+>	3	r—1
3 Ό	O
	•H	P

G)

4-1

P

E 4J >ι V) N Λ P 3 W CO bí Λ4 I 3 íl „ —. , v, rd ·Η 1Λ H 3 3 9 O 3 >i ΛΖ XJ <D >1·Η ·Η·ΗΡΗ£ ω p w p « >ιή 0330000'3 ΡΌ P N ΝΌ+1 Ρ 4-> X 3 Λ » 3Λί U P

ΙΗΗΗ3^3·ΗΡ·Η W O O O t~I 3 H i—I Ή p 3ΡΡΡ3>-Ι(ϋ3Ο·Η fO Ό P U O O Aí 3 tnXI 3 P P Λ:

O >1 >1 >1 I I l<—ΙΦΡ-ΗΡ303ΗΡ >S Pft tfexeKjLirtJPSrfJEwPitHH

MHH 0 0 0 3 3 P +) +1 W W ·Η ·Η ·Η O

3		3
W		ω		Ρ
O		ο		ω
r-l	Ρ	Ρ		tn
3	•Η	•Η	Λ	Ο
Λ	r-l	Μ	ο	Μ
ω	3	+1	Ρ	>1
Ρ	Ρ	3	*	ί—4
A	Η	P$»w	ο

Data z prvního/druhého opakování σ>

co

-μ '3 rH

Ολο

Ν •γΊ

Ή rH 'fú ιη •γΗ μ

φ

-44— <ο pqM·

ΓΜ + + + + + + + + + I + + + + + + + I I + + + + + + + + + I + + + + + + + I I + + + + + + + 1 I + + + I + + I + + I + + + + + + + I I + + + I + + I + + I + + + + + + +Ι + Ι I + + + + + + + I + + + + + + +Ι + 1 I + + + + + + + I + + + + + + + + + I I + + + + + + I I + + + + + + + + + I I + + + + + + I I + + + + + + + 14*1 I + + + + + + + I + + + + + + +Ι + Ι ι + + + + + + + ι

-Η—I—I—+ + + + I

U (Ο μ

Η

W

CU

Η ω

Μ

Λ ,

g

QJ g

'Φ ω

>1

W <υ γ~ ω >ι Μ 44 ι-i >ω 3 3 2 Ο (Ο 44 Η tsi

0) •μ \ (0 μ ε -μ >ι ω Ν 2 c 3 w w + + + + + + + I + I + + Ι + + + + + + + I + I + + I

Ο + + + Ι++Ι I I 1 + 1 Ι + Ι+ +Ι + + + +Ι++Ι I I 1 + 1 Ι + Ι+ +Ι + + + + + + + I I Ι ++Ι Ι+ + + +Ι + + + + + + + I I Ι++Ι Ι+ + + +Ι (0 Μ (0 +) 3 (0 +> 2 '(0 ω μ ο 44 2 •Η β

•Η ο

φ υ

(0 <0 ω

(0

				fO		Φ	β	'(0		(0
	rO			w	rH	tn		44	0)	ω
(0	W	tO	to	(0 o	o	2 o	0)	O	o	o
w	o	w	w	W H	2	0 2	0	2	44	β
o	2	0	o	O nj	2	2 2 44	2	3	2
44 44	β	2 2 2	β	•Η «Η	3	(0	2	2

3 β Η 44 Φ β Η Η Ό 44 Ο 2 Ημιϋ<ΰ<ΰμ«>ιΦ<νΗμ<ΰ τι Ό Ή Ή Μ Μ Ο ΟΌ 44 44 >ι 3 3 Λ r—I γ—I ·«—I (0 tn tPO

1/1 ι—I ι—)

O >i>iC rt μ 2 2 2 w ro 2 φ β

O 2 Φ U 2 _

H UE4 tM μ ι ι μ μ x w 3 2 < t>

rt w

(0

Ή c

'(0 >

o (0

Ol o

o μ

Ό

O

Ή β' >

μ cu μ

(0

Φ

Q

o <“í co r-i oiArSr4oooooocqf\jťMnoootnoo

WWWWWWWWWW oifiHr-ioooooor>J<M<Mnoooinoo c^ttí \° ° ° o o o o o η o η n o o o oooHooooooHHononnooo

OOOOOOOOOOCUCQOOOrQOOOO oooooooooorsruoootMoooo £

£ _to— ε

OJ ε

'0) p

w ti

Ui ε

'>1 .x o

•H p

ε >1

N a

a) ε

Ή q

>

♦H

P . „(tí =P •H

P

C (tí >

Ή ε

OJ ui ¢0 0) w

(tí >1

-i >tn P 3 P O ró 44 Ea N

-P rP o

N •P ^VP c

-rp— ^víd •P p

o p

r¹.

(tí

CQ in i—( n

rH '>1

C (tí >

O ε

>1 >υ n p c p o

OOrSrdOOOOOOOMM-iriOM-OOOO wwwwwwwwww .ooi-ir-tooooooor-i^rinonoooo onor-iooooor-imdinnor-imnoo onoE-lOOOoor-tfMfsmcMOr-imrjoo onooo-ďr-iooo^rnonoooooo

0(ΜΟΟΟΜ·«ΡΟΟΟΜ··<ΤΟΓΜΕηΟΟΕ-(00 onnnrjM-fSc-irMo^fQoJnt-ifSodoo XWWWWWW W W onnncJ-^rMrHrqotrcNoJ^rHMofMoo ο<\ιηηη·<3·(Νι-ι<Μθ r^«P ° ° otMn^nxrfSr-irsorMrHoooooooo oíMooHmnorJO^rnonOÉHOOOO onoor-imruorMonoOnoHoooo ^ýxWWWWWWWWW

O^lHHHnHHHH^n^DJTřHHOOOO rd

W

- - ,====- = Ό - ' (0 (tí p« •H e (0 ^w (tí o i (tí tn ui (tí I (0 ui

ω (0 ω (tí ω rtí Ό (0 Ό •Η Ό -H P -H P ftP Λ ω Λ ω ňdJ ft ΟΛΟ o q q -η h E q q •h q -η o -p p 3 «p ui <D (tí >í D) > u

	ω	(tí	(tí	(0
	(tí (tí p ω	m rtí	Ul (tí	Ui (tí	(0	3
q	(tí (tí	Ό	Ό	T3	Ui	Ul
•P	<P r—1	*P	P	•P	(tí	3
Ul	Ul o	ω	Ui	q	T3	Ό
Λ	o P	0	0	0	•P	•P
>i<H Ό	P	P	P	Ul	Ul
P	>.44	X	3	O	0
P	stí *q	(tí	(tí	44		44
O	rP 0	rp	rp	3	3	3
	<D P	(tí	(tí	H	.P	rp
ui ω	u	o	O	O 1	O 1
43	> o	1	1	1
O	Μ λ	tí	CJXCX	ti	00.

(0 P Ό

P

I .P ω >i o w p q o ω q 44 O (0 a < £ tu I i 1 £ « ti c\ <N

CO

ΓΜ

CM iO 4-> CM 'P

OOHE-lOOOOOOr-ltNE-lOOOHOOO

W\WWWWWWWW\

OOE-tHOOOOOOHNHOOOOOOO

O^O^O OOOOOOOCMipOOOOOOOO O O O O O O O O O O CM CM O O* O* O* O* O* O* O* omoHoHoooocMcorMCMncMorMoo wwwwwwwwww οιηοΗθΕΗθοοοΜ·ιηΜ·Μ·ιηηοηοΗ

OE-HOOOOOOOOrHrHOOOíMOOOO \>wwwwwwwww

OE-<OOOOOOOO.PrPOOOCMOOOO oinoooooooocMi-Hoooomooo w w W W w W W w w oinoooooooocMrHoooocMooo

Tabulka 8C j' , _Άητ ?vm

Zkoušky se semikvantifativním enzymatickým systémem API ZYM

O N ^H 1 Ή* tí rP 'P •PP o ^M

-P a;

P (fl o

CM

CM cm

CM '>1 ’ tí P > e o >, >υ n ρ c r> o

OOOE-IOOOOOOOCMOOOOOOOO W W W W W W W

OOOfHOOOOOOOCMOOOOOOOO ?£⁵Γ*Γ^ιΡ^{οοοθοο,Η}'^-,θθΕ^Η&^4θοο

OOrHMOOOOOOOrHtNOOrHrHOOO

OOOí-lOOOOOOOf-lOOOÍMEHOOA

WWWWW\WWWW\

OOOHOOOOOOEHHE-íEHOnHOOH

OOtHE-tOOOOOOOr-ICNOOOOOOO W\W w w w \ W\\

OOHE-lOOOOOOOr-lfMOOOOOOO (0 w

p

Ό

_,;m,.....

„ ... ...

•Η -

,=τ.

(ti (ti

C

w <d ω

•Η

(d

CO

(ti W (ti

β

in

u

Ό Ρ Ό

Ρ

(d

v—-

•ρ ’Ο ·Ρ

U)

P

•Ρ ·Ρ -Ρ

Ρ

0

(d

(ti

íi-p a

ω

Ρ Ρ

Ρ

Αί

<P

w

Φ Οι Φ

Ρ

ρ ω ω

ω

Ρ

ω

(ti

λ φ &

•Ρ

ω ρ ρ

Ρ Ρ

Ρ

γΡ

Ρ

o

Z—%

O ftO

c

Ρ

Ρ Ό Ό

Ό ω

ω

tn

ω

Ρ

HP

O

•P

ΤΓ

tí o c

Ρ

<Ρ

rP ·Ρ ·Ρ

•Ρ Ρ

Ρ

I

Ρ

ω

I—1

t~Í

•Ρ β ·Ρ

ω

ω

ο ω ω

tí Ό Ό CQ. Ό

Ρ

'(ti

U

© ·Η β

ft ο

ρ ο ο

0 ·Ρ

•Η

1

•Η

Ό

íp<p ό .p +J

Ή C -M rP υ o -p ρ —t +J P C A4 O rP « <

(d cd

W	ω			C β		,Μ	α;	Ρ
Ρ	Ρ	Ρ C		tí ·ρ -Ρ 'Ρ	X!	d	Ρ	α:
Μ	Ρ	(Λ ·Ρ	C	Ρ V) Ο Ρ	ο	ιΡ	τΡ	ρ
Φ	φ	ρ υ	Ή	Ρ ftfi Φ	U-I	ρ	Ρ	γΗ
-Ρ	-Ρ	Λ Ρ	ιΡ	ω >ι S ω	W	0	0	0
ω	ω	•Ρ Φ	Ρ	>1 β X >1	0	1	1	1
W	W	J tíl	>	0 Η Ο W	Ρρ	tí	CQ.	CQ-

ρ ω w η w -p o o >i ο ω

Aí aí -p c o

P P Φ tí Á rP rP O (d P

OOriJgp lilii tí co. 55 tí tí

0Ί +> Ή Sti « rd H

O

N •rd + + + + + + + I + I + d-l + l + l + + + I + + +

Ή

C rd '(ti b

<D

X iti m

π-

+		+	+	+ + +
Η + 1	1 + + + 1	1 + 1	1 + + + + +
+	+	+	+	+ + +

ιο rd >1 >tn

-b b

-Θ44 tn n

+	+	+ + +	+	+	+ + +
+	+ 1 1	1 1 H + + + + + i	1 + 1	1 + 1	1 + + + + +
+	+	+ + +	+	+	+ + +

C •H b

x tn <U (Ú ω tg

Tabulka 9A

Zkoušky za použití systému s miskami Presumpto •b b O) 44 +> υ

IO -rd

O β C OJ ChX o υ x o υ ·η ω m '<D > B O b b -rd (ti Ό tnO < B

44- .

b (ti b ·

Ό >O (ti > w

O

>1	X Ch e 3
44	tn
tn	0)
•rl	b
B	X

				d	d		N
			fO	N	c
			tn	'>1	•H		r4
			d	rH	X	d	0
	rH		rH	o	4->	tn	0)			d
4->	o	4->	<0	td 44	•H	d	4-1	X	4->	ω
ω	Ό	ω	X	Ό in	υ	a	O	ω	tn
o	C	·□	d	>ι·3	0)	•H	b	3	•3	X
X	K	X	X	X X	X	X	X	X	X	Q

b

						rH				>,
	>,					0		>1		tn
	tn		3			44		tn		0
	υ		C	3		•H		0
	44		•H	X		c		44		ě
	3		tu	o		c		44		ď
	r-H		tn	b		d		d		X
	tn		d	44		B		í—i		b
			44	•tn
	n>					f)		fl)		fll
	0		d	d		υ		0		u
	d		N	N		d		d		d
	4-1		'rd	'>1		44		44		X
	C		r—1	r-4		C		C		c
	<U		0	0		tu		tu		(U
4-1	b	44	b 4J	b	4-1	B	44	B	P	B	X
ω	b	ω	Ό tn	Ό	tn	b	ω	b	ω	b	ω
o	tu	o	>ι·3	>,	•3	(!)	o	tu		(U	•3
X	X	XXX	X	X	X	X	X	X	P-,	X

c •H

4-> .

3<U >N '>

rd

O b

X >1

X.

ω

4J b

o

	C	»N
e	•H	•
3	r-4	>υ
•H	3	<u	»□
Ό	44	•m
0)	tn	d	r~1	X
B	OJ 1	> 1	»N	Q
Q	1 0	1 Q	1 a	1 Q
o	bl	bl		bl

	r-H	(tí	d
ta			0	d	tn	C
tn			X	tn	0	*H
0	0	X	•H	O	c	P
44	44	O	c	P	B	d
3	'<U	b	c	X	(d	<—1
rd	rH	44	d	d	X	tu
tn 1	B |	>tn 1	e	r—1 1	b	>N
Q	1 Q	1 0	1 Q	1 0	1 O	1 Q
bl	bl	X	X	X	X	X

rd tS ΓΊ

T rd (N ’τ rd rs m s·

Ht

Ht

Hl

Porovnání růstu na LD-žlučovém agaru s LD růstem na LD agaru: I = menší růst; E = stejný růst ra

	3 μ	44 >ω 3 Ο 44
		ΐ	Ό
			44
		! μ	Ο
		(Λ	•Η
	O	ο	ε
	μ	c	ω
	a	ax
	E	ο	ο
	3	μ	ο
	ω	υ	Ή
	ω	(Ό	ra
	Μ
	a
	Ή
	ε
	3
	44	'<υ
	3	>	ε
	♦Η	ο	3
	ε	Ρ	•Η
		π3	•3
	ω	CPO
		<	ε
	3
	ε
	ό,
	μ
	ω
	>1	μ
	ω	C
		3
	'Ρ.	μ.	—
	μ	τ)	*
	•Η	3	>υ
	>Ν	>
	3	X
	0
	a
ra	rd
cn	Ν		ο
			μ
3	3		a
44	44		ε
r-l	>ω	ί>Ί	3
3	3	44	ω
Λ	0	ω	ω
(ti	44	•Η	Ρ
Η	(S3 .	a	a

—η— (Ο «Η μ ο μ 3 (Λ ό w μ •3 C ·□ 3 ΚΗΚ^ (0 Ο ω ω ra μ a ο •Η Ρ μ μ ω ω 3 ·3 ra ra « «

			rd			>,
μ			ο		ρ	σι
ω	α		μ		σι	ο
ο	C	3	•Η		0	C
44	•Η	μ	C		μ	Ε
3	0)	ο	C		44	řd
rd	(Λ	Ρ	<η		(3	μ
Cn	<d	44	ε		rd	ρ
	44	•σι
a)			ω		ω	ω
υ		3	υ		υ	υ
<0	Ν	Ν	(0-		-Φ-	-id—
μ	'>!	'>1	μ		μ	μ
C	rd	rd	C		C	C
ω	ο	0	ω		0)	Φ
Ε μ	ρ μ	Ρ μ	ε	μ	Ε μ	ε μ
ρ ω	τ> ΐΛ	3 σι	Ρ	(Λ	Ρ σι	Ρ (Λ
ω ·3	>ι·3	>•3	ω	•3	(1) <3	QJ ·3
Ρ. «	π «	Κ tó	Um	«	Ρ Κ	ρ, ra

	rd					rd		3	(d
C	»ίΌ		řd			0	řd	W	C
•Η	•		ω			μ	ω	O	•rd
Γ-ί	»υ		ο	O	Λ	•H	0	c	•P
3	ω	>υ	χ	μ	O	C	•P	E	řd
μ	•ΓΊ	3 <	α	•ω	P	C		3	rd
3	«5	»ρ ra	rd	rd	μ	3	rd	μ	<D
ω	> |	•Μ Ω 1 I	tn ι	E	•σι I	E	rd	P	»N
Ω	Q	1 1 ω ω	1 Ω	Ω	1 Ω	1 Ω	1 O	1 Ω	1 o
ra	Ρ1	ra ra	ra	ra	ra	ra	Pl	ra	P)

·?

4->

'3

O

Ν •Η '3 ω

X

Μ

r.

Γ4

UJ

Γ4 m

(Μ xf <Ν >ι

X >01

Ο 3 X (Ό Ν

	•3
ο 3 Ch ε	é Schopnost r Biochemické
3	> ε
σι	0 3
ω	$-4 ·Η
Μ	3 Ό
systému Ρ	tr>'3 < ε 3 3 3 !
Ή	3
= 3	ť
•Η	3
>Ν	> ·
9C za pou	χ >υ Ο
>1 >χ	3
X X	04
>w >σι	ε
3 3	>ι 3
Ο Ο	χ ω
X X	σι ω
CS3 CŠJ	•Η 3 S χ

ΙΛ •3

X ε

Ή τι β

Q

XI ι—I •Η ο

Η rH 3 <3 Μ 4J •3 <0 X X

Η γ*4

X σι

I

Ω

X σι

3

1/1 3 (0 Ν

Ν G '>, σΐ-'>ι—η-Μ-

f—ί	3	<0	ο
ο	3	W	3			«3
3 3	•Η	Π3	3	3	3	V)
Ό σι	υ	α	Ο	σι	σι	ι<
>ι·3	3	•Η	3	•3	•3	£
X χ	XI		X	X	X	Q

λ:

>,

ΙΛ

Ο

X <~Η tn υ

Ε 3 σι 3 σι •3 3 ·3 X X X

		ο
3		3
3	3	•Η
•Η	Λ	3
3	Ο	3
σι	3	σΐ
/α	X	Ε
X	>σι
		3
π3	ÍÚ	U
Ν	Ν	<d
		3
γΗ	3	3
ο	Ο	3
3 3	3 3	Ε
Ό σι	Ό σι	3
>ι·3	>ί·3	3
X X	X X	X

>,	>1 Μ
Μ	ο
ο	C
3	β
X	Φ
	3
rH	3
3	3
υ	υ
fÚ	Π3
3	3
3	3
ω	3
1 Ε 3	Ε 3
3 σι	3 σι
3 ·□	3 Ο
X X	X X

Hydrolýka želatiny ο

f—4					γΗ		rd
»Ν		3			0	ίθ	w	£
*		σι			3	V)	0	•H
>Ο		ο	ο	3	Ή	0	c	4-J
Φ	>υ	X		Ο	3	4J	β	rd
•η	3 <	Ρ	'3	3	3	Λί	flj
/0	3 X	3	Γ—1	X	ιϋ	Π3	Xí	Φ
> I	‘Ν Ω | |	tn I	ε	>σι	β	ι—1		»N
Q	Ω Ο	1 Ω	1 Ω	1 Ω	I Ω	1 ο	1 o	1 o
η!	XI X	XI	X	X	X

C4 r>

Γ4 η χτ η η χτ

- 60 p oti rP

O

N

Ή

Ή ' C i—1 'íti •H

P

0)

P (ti m

cr>

ci co

O >10 3 ' q O P-4ti—

Wí'' 'Μ'ί'ί Φί 'Η'Ι

Tabulka 9D j

Zkoušky za použití! systému s miskami Presupmto (0 N •q

Ρ '01 44

OJ O 10 -H o ε c o CM 4ti O O 4ti O υ -η ω ra

'01
>	g
O	3
P	•H
(ti
tP'Ql
	g

Ρ . c _nU._

P

Ό (ti > · « >O

O

4-1 g >i q 44 (0 (0 01 •H l-l g CM p o p 10 Ό to •3 C ·3 Cti H Cti g

•H

Ό tu g

Q >-4 (0 (0 r4 (0

P fti

K

C

Ή t—i (0

I o

P) ci

C •H »“4

4ti (0 tu (0

-No

P P Ό (0 Αι·3 3ti Cti 44 ' S

O

I—I >N >U •O (ti >

I

Q

PÍ (ti (0

-qH

4ti

P

Ή υ

Q)

PÍ

							r—i			>,
				>1			o		>,	ω
				V)	3		P		ω	o
				0	C	3	Ή		0	c
					•H	43	c		P	g
				3	0)	O	c		4ti	<Ú
					tfl	P	fÚ		Π3	4ti
				tP	Íú	4ti	g		rH	P
					4ti	>10
rO				0)			ω		O	0)
N				υ	Íú	<d	n		n	n
'>.				Π3	N	N	Π3		ní	fÚ
r—|				P	'>1		P		P	P
O				c	rH	rH	c		c	c
0)		d		0)	o	o	OJ		o	ω
P P	P	w	P	g P	P P	P P	g	P	g P	e
, O (0	w		ω	P (0	Ό (0	Ό 10	p	to	P (0	P
Ρ *3	•3		•3	0) ·3	>v3	>ι·3	<11	•3	Q ·3	OJ *
CM Cti	Cti	Q	Cti	(o Cti	3ti Cti	W fti	g	Cti	g fti	g

>u »-4 «Ν

I

Q

PÍ ·* H

			i—1		(ti	fO
(ti			o	(ti	to	c
to			44	to	o	•H
0	O	43	Ή	o	c	4-)
4ti	4ti	O	C	P	g
3	>0)	P	c	4ti	(ti	rH
r4	rH	4ti	(0	(0	4ti	Φ
Cn I	g I	>tn	g	r4	P	•N
Q	Q	1 Q	1 Q	Q	1 Q	1 Q
k3	t-3	>-3	i-3	h3	>3

Cl

Kyčtrolýza želatiny wwwn: μ ιη w W σι κ tí ιλ w μ & κ μ «ί σι «tntnintntntnpí toto wwtotntfitntfipít/jcnt/itnpítócnt/ic/jvjpíc/itfii/iinwjpí cncntnwpswtnwtntntótnininpiinpítnwKpiKtnPíBÍpiwcn ε

•β

Ό

-μ rH ο

Ν •, ‘γ4 β

Η '(ti

Μ=|— ωω KwoíMcnpiKpiPScnKoSoíPítówcninKwtftttnKtn winpjt/itótotot/itnpíPít/it/JOíKtnciitnt/itninpitnciíPicíviizi β

•Η >υ ε

Ή β

Γ-1 '(ti ·γ4

Λ

Ο β

Λί

Ή ε

•Η

Ρ β

β ε

ω

Ό

Φ rP

Χ3

Ν >

>1 ρ.. •Ρ ' re •Ρ Λ Ή Ρ & ω υ ιη β ω (ti >1 Λί Λί ι-ι >ιη β Ρ Λ Ο β Μ Η cp

Ρ ω

Ρ

Λί β

CQ

Μ

Ό •Ρ β

•Η •Ο (Λ W PíVlKwwtncoiZtomMtíKclMWmwrtWWKKWM ω ď. tí « κ p; w ω κ n; w w « β η: κ w « κ w & κ p:

ω (η w w w ρ; w w ρ; ω κ Ρ w « ο; ρ; ρ; κ _m w κ ρ; _{κ ω} jo, ρ; _{w ω}

KlWWOPOKWWtíKtóKWKCZKtóWWKKKwKtCíflWW

KwwctiwtowwtóPíPlKMKltiÍKPíwinKpíciíwPíKPítów β β ·Ρ •Η r-ί υ ·ρ (0 υ Λί ·Ρ Ή CU

II β ·Ρ ρ υ μ Λ β ρ ω ρ φ β ·Ρ Λ tn υ ρ β (ti ni < m tt

(0

β

•Η

β

rH

•Η

φ

r—1

γ—1

Μ

β

ο

Λί

>1

•Η

c

Λί

>1

β

ο

β

•Η

β

•Η

υ

β

·ρ4

Ρ

CQ

•Η C

•Ρ C

β

ίθ

•Ρ β

υ β

C C

'(ΰ

β

C

υ ·ρ

•Η

Ό ·Ρ

φ

Ρ

Ο ·Ρ

>ί·Η

β ·Ρ ·Ρ

>

ίΰ

•Ρ β

β

>1 Ν

υ

•Ρ JZ

Ρ

Ρ

>ιπ-1

β υ

Ή υ r—<

ο

β

Ρ

υ ·ρ

•Η

β

β φ

•Η

Ρ Ρ

β

φ

β ·ρ

Ο ·Ρ

υ >ι·ρ

X

Ή

β

Ο cd

X

•Η

Ο ·Ρ

β

ο ο

<0

Ρ

φ υ

Ρ Β

>ιβ υ

•Η

υ

<Ρ

•Η ·Η

xap-o

o β β a φ •P >i Φ <u <u β <P <H P r4

- . _ _ φ o -ρ ρ ρ

HPMMOlíJtiieeOP-OiOX} (d(tioocx4J4J(ti^í£-pepo IHPHH.HO>tCCC:HOP> ej<ux;x:<p>pp<U(ti-p(Uiú<u-Po ouau«wwo'' * β

•P c P -P c a ή ή O X u Jti >1 >1 ρ υ β 0) (ti o β p x •P p c Ρ φ Φ H H >

'P β

P β

<1>

P w

•P tn ω

p

Pí 'P β

rP •P

Λ •P

P a

<u υ

σι β

ιπ ιι ω

Tabulka 10B í

Zkoušky susceptibility vůči antimikrobiálním činidlům · !1 o

Γ4

4J rd

O

N •H ^SH (3 r4 'Φ

Ή β,

Φ β

Φ «

Pí tn pí tn tn tn tn uipípípípípípípípí ιηρίιηρίρίρίρίιη ch rd ¢0 rd

Pí tnpítntnininpítnpípípípipípípípí

Pí tqpítntntntnpítnpípípipípípípípí tn tnpíininwinpíinpiintntninpíinin co

H pí

Pí pí tn pí pí ta

LOPítnPÍPÍPÍPÍtn tnpíwpípípípítn

Pí tn tn tn pí pí ωρίιηρίρίρίρίρίρί pí Pí ta

Pí tn pí tn tn m

r4 W »r nt <d rd

O rd

Ό

Ή

C

Ή ιΟ tn pí tn pí m tn

Pí Pí tn tn ω pí pí tn tn tn tn pí tn pí tn tn pí tn pí tn tn Pítnpípíininpípípíincnpípíininininpípítncninininpí tnpí pítnpípíintnpípítnmtnpípíininpípípíininintnpíinpí inmtnpítnininintnpípítntntnpípítnintn pímintntninmpí tnpítnpítnpípíintnpípípítninpípí tn tn tn pjtnpítntntntnpí c

.-«4 u

(0 .44 ,•<4 e

(0 c

•<d

		C	rd
		•Η	φ
		rd rd	ω	C
		Ο 44	>.	•Η
c		44 >ι C	44	Ο
•H c		•η υ q ·η		β
C r-4 ·ι4	C	c φ ·η c υ c	C C >Φ	C C
C C -Η -Η β	•Η	φ β υ ·η >,·-4	C ·<4 -Η >	φ Ή C
Ή -rl U 0 ·<4	β	ΙΗ β >,<-4 β υ	·40ΗΟ	c β υ ·η
i-4 β Φ ·<4 β -Ρ	β φ β ·Η Ο ·<4	Ο >ν·4 X	•Η Ρ Ο <-4
•Η C β c o	Ο	φ β φ υ β β	>ι β Ο ·Η	ο (Η ·Η ·Η
0 φβ ΦΗ	--4	β β β Φ β Φ	β Ο ·4 β	>, ο β υ
•Η β ·Η Λ <0	Φ	Ο Ο C X β β	Φ 44 β ·<4	β β Ο ·<4
CL, & ϋ β Ή	Μ	r-4 r4 ·Η Ο X 3	C Εβ-4	Ο β > C
β Ρ (0 (0 Φ	Φ	β β *-4 r-4 β Φ	Φ ·Η φ Φ	φ ·Η ο φ
5 λ; to « ο	Ο	ο υ « « « ο	«332	53 53 55 Ρι

	c	β
ca	•Η C υ ·η	•r4 C β ·Η C
C	>, Ν	cil 1—4 ·Η
•η q	β φ	Ο 44 υ
X ·<4	Ο ·Η	β >, >«
>, η,β ό β υ β
e e	& φ	Φ Φ ο
5κ Φ	φ «Η	β Μ 44
γ4 <Η	β r-4	•η β q
Ο ·Η	β Ρ	β φ φ
Pt Pí	tn tn	Ε4 £4 >'

I co o* tn tn <Λ{4ΐΛΐηιηιηι/)ΐηρ4ιηιηιηιηρζιοιη

Wf4tn(nininininp4nintntnr4inin wtftninminpSinpírtrtttpjtfFEjp'

Píwwtnpípítnpí wpii/jtfpípsfijtn

Tabulka 10C ,

Zkoušky susceptibility vzhledem k antimikrobiálnim činidlům •P

O

N

Ή ή m β ι—I stí μ

ω

-Φm

Μ*

ΓΜ η

ΓΜ

ΓΜ

ΓΜ

Η

ΓΜ

O β

ιθ

Ρ4

Ρ4

C4

Γ4

Ρ4

W«tntnwin2tn«2222p522 wpjtninmtnpiintftfpítftftfpíp;

«nttwinintnrtinpÍWWWpítfPíp;

wpiwwinuifijuipjpíp; f4f4f4r4f4 <n«tntnininp4in«f4P4f4tóp:tftf β β β 2 2 2 2 3 2 β β 2 β 2 Η 2 Ο Ο υ φ 2 a &ι α μ Β β 3 Φ φ «< <ί < m χ β

β 2 2 2 X!

μ 2 Ο Ο 2 2 Φ (Ο Ή 2 Φ φ υ υ β

•Η ι—I rH Ο 2 >ι C 2 U β 2 β Φ 2 β Ο C Φ μ U 2 >ν2 •μ 2 >,2 Β Ο Β Φ Β 2 Ο 2 φ -μ φ υ μ Ε μ μ τι φ 2 φ Ο Ο β X 3 3 2 2 2 Ο >, β 2 2 2 2 μ φ UU44WU φ

'β· φ

V) >1 β β β 2 2 η υ 2 υ Χ2 χε ο Β ο 2 Λ 2 2 β β 3 Φ 2 φ 2 2 S β

Ο •Φ β β > Φ 2 ο β μ υ X 2 3 ο 2 0 3 2 Φ ΧΟΛ 2 ε μ ο 2 Ο 3 > Φ Φ 2 Ο 2 2: 2; ί;

MpímpípípíPíin tn ¢4 tn p4 pí « m in2m2222tn mpímpípípípíin tnpímpípípípíin inpítnpípípípítn α

c

Ή

X β Ή Ο

2 >ι >

Ο Ε >ι Ν 0,2 S Φ 02 >1 03 Ό 3 £?!

β 2 3 μ 2 2 3 β Φ0333ΜΦΦ

Tabulka 11

Účinnost léčení za použití charakterizované kultury cekálních bakterií vyjádřená jako koncentrace kyseliny propionové v cekálním obsahu tří- a desetidenních brojlerů¹

Skupina	Pokus 2	Pokus 3	Pokus 4
Den 3	Den 10	Den 3	Den 10	Den 3	Den 10
Kontrolní	0.61+ 0,58	1,821 0,61	0,681 0,60	2,461 0,93	0.541 0,58	2,871 0,88
Ošetřená	21,28115,75*	27,64110,15*	16,851 8,14*	27,011 9,48*	20,73110,78*	47,75112,4*

^Hodnoty jsou uvedeny jako středy ± směrodatné odchylky ze souboru 10 kuřat v mmol/g cekálního obsahu *Významný rozdíl od kontroly (P < 0,005)

Tabulka 12

Účinnost léčeni za použití charakterizované kultury cekálních bakterií vyjádřená jako koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady v cekálním obsahu tří- a desetidenních brojlerů¹

Skupina	Pokus 2	Pokus 3	Pokus.4
Den 3	Den 10	Den 3	Den 10	Den 3	Den 10
/Kontrolní	9,03+ 2,30	73,01+ 6,43	14,03+ 6,75	52.87+16.98	16.66+ 2.71	71.95+16.25
Ošetřená	14,75+ 5,80**80,84+20,69	45,60+ 8,05*'	'69,14+23,04*	50,67+22,59**	107,03+28,63'

¹Hodnoty jsou uvedeny jako středy ± směrodatné odchylky ze souboru 10 kuřat v mmol/g cekálního obsahu *Významný rozdíl od kontroly (P < 0,005)

Tabulka 13

Účinnost léčení za použití charakterizované kultury cekálních bakterií vyjádřená jako počet Salmonella typhimurium v cekálním obsahu desetidenních brojlerů

Skupina	Log10 Salmonella/g cekálního obsahu
Pokus 1	Pokus 2	Pokus 3 Pokus 4
Kontrolní	6,35±0,99	1 6,28±0,53	4,11±2,15 6,37±0,60
Ošetřená	0 ±0	0.89±1.50*	0,27±0.69* 0,6010,75*

^Hodnota je uvedena jako x ± směrodatná odchylka ze souboru 20 kuřat *Významný rozdíl od kontroly (P < 0,005)

Tabulka 14

Účinnost léčení za použití charakterizované kultury cekálních baktérií vyjádřená jako počet desetidenních brojlerů s cekální kulturou pozitivní na Salmoneila typhimurium¹

Skupina	Kuřata s cekální kulturou pozitivní na Salmonella/celkový počet kuřat x 100 (%)
Pokus 1 Pokus 2 Pokus 3 Pokus	4
Kontrolní	20/20 (100) 20/20 (100) 18/20 (90) 20/20	(100)
Ošetřená	0/20 (0)* 7/20 (35)* 3/20 (15)* 8/20	(40)*

*Významný rozdíl od kontroly (P < 0,01) ^Hodnoty jsou uvedeny jako středy ± směrodatné odchylky ze sou boru 10 kuřat; mmol/g cekálního obsahu *Významný rozdíl od kontroly (P < 0,005) •^Hodnoty jsou uvedeny jako středy ± směrodatné odchylky ze sou boru 10 kuřat; mmol/g cekálního obsahu *Významný rozdíl od kontroly * = (P < 0,005); ** = (P < 0,01)

Claims (2)

1) koncentrace kyseliny propionové u zkušebního zvířete je asi 10 mmol/g obsahu slepého střeva nebo vyšší a/nebo

1) koncentrace kyseliny propionové u zkušebního zvířete je asi 10 mmol/g obsahu slepého střeva nebo vyšší a/nebo

2) koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady u zkušebního zvířete je vyšší než koncentrace u kontrolního zvířete přibližně o 100 % nebo více.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se t í m , že koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady zahrnuje celkovou koncentraci kyseliny octové + kyseliny propionové + kyseliny máselné + kyselina isomáselné + kyseliny valerové + kyseliny isovalerové.

11. Probiotikum připravitelné způsobem podle nároku 5.

12. Bakteriální prostředek účinný pro inhibici kolonizace domácích zvířat salmonelou připravitelný screeningem na účinnost jako probiotika pro iňhiblči kolonizace domácích zvířat salmonelou, který zahrnuje

a) zaopatření zkušebního domácího zvířete a podání zkoušeného bakteriálního prostředku tomuto zvířeti,

b) zaopatření neošetřeného kontrolního zvířete,

c) chování zkušebního zvířete a kontrolního zvířete po dobu 2 až 3 dnů,

d) stanovení koncentrace kyseliny propionové a koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady v obsahu slepého střeva zkušebního a kontrolního zvířete a

e) porovnání hodnot koncentrace kyseliny propionové a koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady u zkušebního zvířete s příslušnými hodnotami u kontrolního zvířete;

přičemž prostředek se určí jako účinný pro inhibici kolonizace domácího zvířete salmonelou, když:

1) zaopatření zkušebního domácího zvířete a podání kultury v ustáleném stavu ze stupně^-č)~toisutO~“zvxřeti-;2) zaopatření neošetřeného kontrolního zvířete,

3) chování zkušebního zvířete a kontrolního zvířete po dobu 2 až 3 dnů,

4) stanovení koncentrace kyseliny propionové a koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady v obsahu slepého střeva zkušebního a kontrolního zvířete a

5) porovnání hodnot koncentrace kyseliny propionové a koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady u zkušebního zvířete s příslušnými hodnotami u kontrolního zvířete;

přičemž kultura v ustáleném stavu se určí jako účinná pro inhibicí kolonizace domácího zvířete salmonelou, když:

(1) první kmen Enterococcus faecalis, (2) druhý kmen Enterococcus faecalis, (3) první kmen Enterococcus faecium, (4) druhý kmen Enterococcus faecium, (5) třetí kmen Enterococcus faecium, (6) Enterococcus avium, (7) třetí kmen Enterococcus faecalis,

II. Fakultativní anaerobní gram-pozitivní kokobacily (8) Lactococcus lactis (9) první kmen Lactobacillus,

III. Fakultativní anaerobní gram-negativní bacily (10) první kmen Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii, (12) bakterie patřící do čeledi Enterobacteriaceae, (13) druh Pseunomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) druhý kmen Escherichia coli,

IV. Obligátní anaerobní gram-pozitivní bacily:

(16) první druh Propionibacterium, (17) druhý druh Propionibacterium, (18) druhý kmen Lactobacillus, (19) první kmen Bifidobacterium nebo třetí kmen Lactobacillus, (20) třetí kmen Propionibacterium, (21) první kmen Eubacterium (22) druhý kmen Eubacterium, (23) neznámý bakteriální kmen označený jako OAGPB-5, (24) třetí kmen Eubacterium, (25) druhý kmen Bifidobacterium nebo čtvrtý kmen Lactobacillus, (26) třetí kmen Bifidobacterium nebo pátý kmen Lactobacillus, (27) čtvrtý kmen Propionibacterium,

V. Obligátní anaerobní gram-negativní koky:

(28) druh Veillonella a

VIT-Ob 1-jgá -tni—anaerobní—gram^negativn í bacily:_ (29) druh Fusobacterium.

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že tento prostředek zahrnuje materiál uložený ve sbírce ATCC s přírůstkovým číslem 55 515 a/nebo tento prostředek zahrnuje 26 z výše uvedených bakterií a/nebo tento prostředek zahrnuje 27 z výše uvedených bakterií a/nebo tento prostředek zahrnuje 28 z výše uvedených bakterií a/nebo tento prostředek zahrnuje všechny výše uvedené bakterie a/nebo tento prostředek dále,zahrnuje laktosu a/nebo tento prostředek dále zahrnuje kokcidiostat, který není účinný proti gram-pozitivním bakteriím a/nebo tento prostředek dále obsahuje nosič a/nebo bakterie v tomto prostředku je zapouzdřena. ' ' ' ' ·

3. Krmivo, vyznačující se tím, že obsahuje krmivo pro zvířata v kombinaci s prostředkem podle nároku 1.

4. Způsob izolace probiotika, které je účinné pro inhibici kolonizace domácích zvířat salmonelou, vyznačující se tím, že se

a) kultivační médium zaočkuje trusem, obsahem slepého nebo tlustého střeva dospělého domácího zvířete, a vzniklé zaočkované médium se inkubuje v jednorázové kultuře za anaerobních podmínek za vzniku intermediární kultury;

b) intermediární kultura se inkubuje v průtokové kultuře při rychlosti výměny média v rozmezí od asi 0,029 do asi 0,10 h“¹, pH v rozmezí od asi 4,7 do asi 6,5 a za anaerobních podmínek po dobu postačující pro vznik ustáleného stavu a

c) kultura v ustáleném stavu ze stupně b) se shromáždí.

5. Způsob podle nároku 4, se t i m , že se dále vyznačuj i d) kultura v ustáleném stavu získaná ze stupně c) podrobí screeningu na inhibici kolonizace domácích zvířat salmonelou.

6. Způsob podle nároku 4, vyznačuj íš e t i m , že domácím zvířetem je pták.

7. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se stupeň inkubace jednorázové kultury provádí po dobu v rozmezí od asi 6 do asi 18 hodin a/nebo že se hodnota pH jednorázové kultury udržuje na asi 5,5 a/nebo že se stupeň inkubace jednorázové kultury provádí tak dlouho, dokud se nedosáhne optické density alespoň asi 1,0 a/nebo že se stupeň inkubace jednorázové kultury provádí po dobu asi do dvou hodin od okamžiku, kdy hodnota pH dosáhla asi 4,2 a/nebo že je rychlost výměny média asi 0,0416 h“¹ a hodnota pH v průtokové kultuře je asi 5,5 a/nebo hodnota pH v jednorázové kultuře není nižší než 4,2 a/nebo teplota jednorázové kultury a průtokové kultury je přibližně v rozmezí od 26 do 47°C.

8. Způsob podle nároku 4, vyznačuj ís e t i m , že kultivační médium obsahuje laktosu.

9.

s e

Způsob podle nároku 5, vyznačuj i tím, že stupeň screeningu zahrnuje

1. Prostředek pro inhibici kolonizace ptáků mikroorganismem Salmonella, vyznačující se tím, že obsahuje v podstatě všechny následující v podstatě biologicky čisté bakterie

I. Fakultativní anaerobní gram-pozitivní koky:

2) koncentrace všech těkavých mastných kyselin dohromady u zkušebního zvířete je vyšší než koncentrace u kontrolního zvířete přibližně o 100 % nebo více.