KR20060073937A - 안정한 액상 촉생제 조성물, 그의 제조 및 응용 - Google Patents

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Abstract

적어도 기초적인 생물학적 활성을 갖는 박테리아를 포함하는 액상 촉생제 (probiotic) 조성물의 제조 방법으로서, 상기 박테리아는 하나 이상의 선택압에 따라 선택된 것이고, 상기 조성물은 바람직하게는 자가용해물 (autolysate) (박테리아를 유지시키기 위한 완전 물질)을 포함하고, 상기 조성물은, 박테리아 성장에는 적합하나 포유류에게는 유사하게 적합하지 않고 특히 인간에게는 적합하지 않은 물질을 실질적으로 함유하지 않는 액상 촉생제 조성물의 제조 방법. 펩톤 및 완충염, 특히 인산염은 적은 투여량으로는 해롭지 않을 수 있으나, 이들은 인간에게는 특이적으로 적합하지 않고 박테리아에 의해 생성되는 물질을 함유하지 않는다.
촉생제, 박테리아, 이. 콜라이, 장질환

Description

안정한 액상 촉생제 조성물, 그의 제조 및 응용 {A STABLE LIQUID PROBIOTIC COMPOSITION, PREPARATION AND APPLICATIONS THEREOF}
본 발명은 촉생제 (probiotic) 조성물에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 장시간 동안 생물학적으로 활성인 형태로 보관될 수 있는 비병원성 박테리아 균주를 포함하는 액상 촉생제 조성물의 제조 방법을 비롯하여, 그의 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.
촉생 박테리아는 인간 및/또는 동물에 유익한 것들이다. 촉생 박테리아의 용도는, 장내 미생물총 (microflora) 조성의 변화 또는 조성에 대한 변화를 수반하고/하거나 유발하고, 및/또는 미생물총 조성에 임의의 변화를 일으키고, 및/또는 그러한 변화뿐만 아니라 상기 질환 또는 장애를 활성적으로 유발하거나 효력있게 하는 미생물총 조성에 대한 변화를 유지시키는 위장관 감염 및 기타 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위해, 포유류의 장관내 미생물 균형을 개선시키는 것으로 당업계에 알려져 있다.
그러나 현재까지 실시된 연구의 결과는 모순되고/되거나 모호하였다. 예를 들면, 일부 연구에서는, "여행자 설사 (traveler's diarrhea)"를 치료하는 데 촉생 박테리아를 단독으로 사용하는 것은 위약 (placebo)에 반해 환자들에게 현저한 효 과를 제공하는 데 충분하지 않았으나, 촉생제 치료와 항생제의 조합은 고도로 효과적인 것으로 밝혀졌다. 다른 연구에서는, 촉생제 치료 단독으로도 유익한 효과를 가졌으나, 그러한 효과는 종종 감지되기까지 3 내지 6 개월이 걸렸다 (또한 J. JAMA, 1996, 제 275권, 11호, 미국특허 제 5 433 826 호 (1995), 미국특허 제 5,589,168 호 (1996) 및 기타 참조).
최근의 연구는, 단독 또는 조합된 다양한 종류의 촉생 박테리아의 효과의 검토; 촉생 박테리아의 생존률의 향상 및 장기 보존을 가능하게 하는 방법; 바이오매스 (biomass) 축적, 및 인간 및 동물의 예방 및 치료에서의 촉생 박테리아의 용도에 대한 것이었다.
대략 400 종의 다양한 박테리아 및 박테로이드 (bacteroid)가 인간 및 기타 포유류의 소화기관 내에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 배설물 부피의 약 30 내지 40%를 제공할 수 있다. 이들 알려진 종류 중 약 15 종만이 그 특징 및 기능이 상세히 연구되었다.
이들 종류의 박테리아는 각각 소화기관 내 고유한 생태적 지위 (ecological niche)를 차지하고, 각각은 최적의 생존 및 증식률을 위한 특정 조건을 갖는다.
다양한 질환 및 장애를 일으킬 수 있는 병원성 박테리아 또한 그들 고유의 특정 환경적 지위 (environmental niche) 또는 서식지 (habitat)를 차지한다. 병원성 박테리아와 촉생 박테리아간의 경쟁은 다양한 조건 하에서 일어날 수 있으나, 최대 경쟁 효과는 병원성 박테리아와 촉생 박테리아의 최적 생존 및 증식률을 위한 조건이 유사할 때 발생한다. 그러한 조건 하에서는 생존이 영양분 또는 성장 인자 에 대한 보다 엄격한 경쟁에 의존할 뿐만 아니라, 공동상승적인 영양분 활용 및 수용체 부위에 대한 경쟁에도 의존한다. 항미생물 물질의 생성, 증식의 강도, 및 면역학적 프로세스의 유도 및 상피세포 교체 (epithelial cell turnover)의 자극을 포함한 제한적 환경의 생성과 같은 요인 또한 상기와 같은 조건 하에서는 매우 중요하다.
촉생제 조성물은 비병원성 이. 콜라이 (E. coli)와 기타 비병원성 박테리아의 배양물을 사용하여 개발되어 왔다 (미국특허 제 5,340,577 호; 미국특허 제 5,443,826 호; 미국특허 제 5,478,557 호; 미국특허 제 5,604,127 호).
독일 및 러시아에서는 높은 길항적 활성을 갖는, 락토오스-양성의 비병원성 이. 콜라이 균주가 동결건조된 제제로서 제조되었다 (예를 들면, [Vidal Handbook: Pharmaceutical Preparations in Russia, Astra Pharm Service, 1997, 모스크바]에 기재된 E. coli M17의 콜리박테린 시쿰 (Colibacterin siccum)의 동결건조된 제제의 사용).
최근 다수 (30 종 이하)의 상이한 종류의 박테리아 및 박테로이드를 포함하는 촉생제 조성물을 개발하려는 움직임이 있어왔다 (예를 들면, 미국특허 제 5,443,826 호; 미국특허 제 5,478,557 호).
그러나 하나 또는 두 종류만을 포함하는 제제에 비해 그렇게 광범위하게 다양한 박테리아를 사용하는 것에 대한 장점은 확인되지 않았다. 실제로는, 다수의 다양한 종으로 인해 효율의 감소가 발생할 수 있다는 증거가 몇몇 제공되었다. Behling 등은 25 가지의 락토스-양성 이. 콜라이를 연구하여, 두 가지 종류 (E. coli 125A 및 E. coli 128)가 병아리의 에스. 엔테리드 (S. enterids) 감염에 대해 억제 효과가 있음을 발견하였다. 그러나 125A 균주의 효과가 128의 효과보다 현저히 컸고, 상기 두 균주의 조합은 125A 단독으로 수득한 효과보다는 적은 효과를 나타내었다.
연구 결과에 따르면, 295 가지 맹장 분리물의 혼합물을 사용하면 살모넬라 (Salmonella)에 대해 보호 효과가 없는 반면 (Goren 등, 1984), 단지 4 가지 분리물의 혼합물을 사용하면 보호 효과가 제공되었다 (캐나다 특허 제 1,151,066 호).
따라서 사용된 박테리아 균주의 수와 수득되는 보호효과의 수준 간에는 명확한 관계가 없는 것으로 보인다. 이는 크게는 상이한 균주간의 다양한 상호작용으로 인한 것이며, 이는 공동상승적이거나 길항적 효과를 초래할 수 있다.
건조시키고 소형 캡슐에 혼입한 락토박테리아 (Lactobacteria)를 사용하여 연구를 수행하였다 (미국특허 제 5,501,857호; 제 5,614,209 호; 및 제 5,635,202 호). 저자들은 그러한 마이크로캡슐화된 제제는 위장을 통과하는 동안 통상적인 형태에 비해 더 나은 안정성을 갖는다고 주장한다.
박테리아 생균의 보존에 관한 연구는 대부분 동결건조된 제제 방향으로 이루어졌으며, 개선된 제조 방법 및 상기 제제의 적용을 단순화하기 위한 기술적 해결책에 대하여 이루어져 왔다 (미국특허 제 5,139,792 호 및 제 5,401,501 호).
매우 적은 수의 선행기술 특허만이 현탁액 중, 즉 즉시 사용가능한 상태의 액체 형태의 박테리아 보존 방법에 대해 다루었다. 미국특허 제 4,999,301 호는, 2 개월간 10 내지 30%의 고체 영양분을 함유하는 농축 매질 중에 락토바실러스 플 란트럼 (Lactobacillus plantrum) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 미생물을 보존하는 방법을 교시한다. 그러나 이는 실제로는, 다중의 부가적 조작을 필요로 하는 다단계 성장 사이클에 대해 기술한다. 0.5% 이상의 박테리아가 생존가능한 상태로 잔존한다.
미국특허 제 4,518,696 호는 해바라기씨 오일과의 오일-세포 혼합물을 사용한 락토바실라이의 현탁액에 대해 교시한다. 그러나 생존가능한 세포는 오일과 배합되기 전에 건조되며, 또한 낮은 내부 물 농도 (internal concentration of water)를 갖는 것으로 특징지어진다.
당업계 특허 중에서는 어느 것도 박테리아 세포가 생물학적 활성을 높은 수준으로 유지하게 되는 액상 촉생 매질에 대해 교시하거나 제시하지 않는다. 그러한 매질은, 예를 들면 염증성 장질환과 같은 질환에 명백히 필요하다.
염증성 장질환 혹은 IBD (Inflammatory Bowel Disease)는, 크론씨 병, 궤양성 대장염 (UC), 부정형 대장염, 미시적 대장염 및 교원질성 (collagenous) 대장염과 같은, 연관되지만 별개인 위장관의 만성 염증성 장애를 포괄하는 총체적 용어이며, 크론씨 병 및 궤양성 대장염이 가장 흔한 질환이다. 또다른 위장관의 만성 장애는 과민성 대장 증후군 (IBS: Irritable Bowel Syndrome)이다.
대부분의 환자의 경우, IBD 및 IBS는 증상이 수개월 내지 수년 동안 지속되는 만성적 상태이다. 젊은 성인에서 가장 흔하지만 어느 연령에서나 발생할 수 있다. 전세계적으로 발견되지만, 미국, 영국 및 북부 유럽과 같은 공업화된 나라에서 가장 흔하다. 예를 들면 미국에서만 2백만 명 가량이 IBD의 영향을 받는다.
IBD 및 IBS의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았다. 보편적인 가설에는, 예를 들면 면역체계의 장애 및 염증촉진성 (pro-inflammatory) 사이토라인 (cytoline)의 작용 및 림프구 서브세트의 선택적 활성화가 포함되며, 이들은 장 내에서 염증성 반응의 제한되지 않은 활성화를 지속시킨다. 병원성 및 잠재적으로 병원성인 박테리아에 의해 생성되는 대사물이 면역체계의 장애를 유발할 수도 있다. 따라서 이들 박테리아는 이러한 성질의 교란 (disturbance)에 연루될 수도 있고, 장내 미생물학적 균형의 교란에 관련될 수도 있다. 그러한 교란은 그 자체가 원인이 될 수 있거나, 대안적으로는 (또는 조합으로서) 이러한 교란이 다시 자가면역 반응 및/또는 면역체계의 기타 반응을 초래할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들면, IBS를 앓고 있는 환자들에 있어서 70%에 이르는 환자의 장 시스템 내에 박테리아 과다번식 (overgrowth)이 발생하는 것으로 최근 나타났으며; 이러한 과다번식의 치료는 다수의 IBS 환자에서 증상의 감소 또는 중단까지도 초래하였다 (캘리포니아 Cedars-Sinai Medical Center의 Mark Pimentel 박사의 연구에서).
IBD 및 IBS는 치료법이 없다. IBD 또는 IBS를 앓는 환자들은 일반적으로 현재는 염증성 프로세스를 감소시키고 환자에 대한 염증성 프로세스의 효과를 저하시키도록 하는 요법으로 치료되고 있다. 현재 알려진 IBD의 의학적 치료는 염증성 장질환의 급성 악화의 회수, 빈도수 및 심한 정도를 감소시키고, 이차 합병증을 방지하도록 의도되고 있으나, 그래도 그 결과는 기껏해야 실망스럽기만 하다.
현재 알려진 IBD 또는 IBS의 치료 방법은, 이들 방법이 (i) IBD의 실질적인 치료를 제공하기보다는 증상의 치료를 제공하는 데 그치고; (ii) 심한 악성 부작용 이 수반되는 약물 치료 또는 침습적인 (invasive) 외과수술 치료를 포함하여, 이들 모두 환자의 삶의 질에 영향을 미치므로, 적어도 일부 IBD 또는 IBS 환자를 위한 해결책을 제공하는 데 실패할 수도 있다.
발명의 개요
선행기술에서는 안정하고 효과적인 액상 촉생제 조성물에 대해 교시하거나 제시하고 있지 않다. 선행기술은 또한 미생물 감염, 과민성 대장 증후군 (IBS) 및 염증성 장질환 (IBD)을 포함하나 여기에 한정되지는 않는 다양한 장 장애의 치료를 위한 조성물에 대해 교시하거나 제시하지도 않는다.
본 발명은, 적어도 기초적인 생물학적 활성을 갖는 박테리아를 포함하는 액상 촉생제 조성물의 제조 방법으로서, 상기 박테리아가 하나 이상의 선택압에 따라 선택된 것이고, 상기 조성물은 박테리아 성장에는 적합하나 포유류에는 유사하게 적합하지 않으며 특히 인간에는 적합하지 않은 물질 (이하, "부적합 물질"로 정의됨)을 실질적으로 함유하지 않는 제조 방법을 제공함으로써, 선행기술의 상기 결함을 극복한다. 예를 들면 펩톤 및 완충염, 특히 인산염은 적은 투여량으로는 유해하지 않을 수 있으나, 인간에게는 특이적으로 적합하지 않다.
경우에 따라, 상기 선택압은 온도, 시간 (일정 시간동안 보관될 때의 안정성) 및 삼투압 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 선택압에 따라 박테리아를 선택하고, 상기 적어도 기초적인 생물학적 활성을 갖는 박테리아를 일정 시간동안 보관 유지하는 것을 포함하는 액상 촉생제 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 액상 촉생제 조성물을 그러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 치료 방법을 제공한다. 상기 액상 제형물은 장내 바이오매스 (biomass)의 생성을 필요로 하지 않으므로 경구 투여 바로 직후에 치료적으로 활성이 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 치료가 요망되거나 필요하고, 선택적으로 또한 보다 바람직하게는 박테리아 감염과 같은 미생물 감염, 및/또는 IBD 및/또는 IBS를 포함하는 위장관 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것이다. 본 발명은 또한 AAD (Antibiotic Associated Diarrhea: 항생제 유발 설사) 뿐만 아니라, 예를 들면 미생물 (장독소원성 (enterotoxigenic) 이. 콜라이, 살모넬라, 프로테우스 (Proteus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 클로스트리디움 (Clostridium), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 쉬겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri) 및 기타를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 의해, 또는 미검출 병원체에 의해 유발되는 임의 형태의 급성 설사; 여행자 설사 증후군; 병원 세팅 (hospital setting)에서의 급성 설사의 치료; 및 점액성 혹은 염증성의 설사 유발 IBS (과민성 대장 증후군), 및 방사선 또는 화학요법에 의해 유발되는 설사 증상의 치료에 유용하다.
본 발명은 또한 위장관내 "비정상적" 미생물총의 존재 또는 미생물총의 "비정상적" 분포와 관련된 다양한 질환 상태; 점액성 혹은 염증성의 IBD(염증성 장질환), 경직결장, 점액결장염, 항생제 유발 결장염, 특발성 또는 단순 변비, 및 클로스트리디움 디피실 (Clostridium difficile), 캄필로박터 제주니/ 콜라이 (Campylobacter jejuni/coli) 등 및 칸디다 (Candida)와 같은 특정 미생물로 인한 만성 위장관 감염; 및 항생제, 방사선 치료, 또는 화학요법, 장 감염, 소화기관의 외과적 수술, 면역결핍, 보다 높은 방사선 및 연령 변화를 포함하는 바람직하지 못한 환경적 상황의 영향에 의해 유발되는 소화기관 미생물 균형의 교란으로 인한 만성 설사의 치료에도 유용하다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물 및 방법은 경우에 따라 음식물 중독, 소화불량 증상 또는 급성 설사의 에피소드 (episode), 또는 미검출 병원체 또는 알려지지 않은 병인에 의해 유발되는 설사를 치료하는 데에 유용하다. 본 발명은 또한 경우에 따라 장의 미생물총의 미생물 균형의 교란에 의한, 및/또는 소장 내 박테리아 과다번식에 의해 유발되거나 유지되는 소화기관의 질환 및 장애를 치료하는 데에도 유용하다. 본 발명은 또한 경우에 따라 항생제 치료, 방사선요법 또는 화학요법으로 인한 소화기관 미생물총의 미생물 균형의 교란, 소화기관의 외과적 수술을 포함한 소화기관의 질환 또는 장애를 예방하거나 일정 수준 감소시키는 데에도 유용하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물 및 방법은 경우에 따라 소화기관 외의 질환, 특정 식이적 (dietary) 또는 환경적 요인으로 인한 소화기관 미생물총의 미생물 균형의 교반을 예방하거나 치료하는 데에 유용하다. 본 발명은 또한 노인 및 면역약화된 (compromised) 환자에 있어서 위장관의 생리학적 활성을 개선시키거나 정상화시키는 데에도 유용하다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에서는, 적어도 기초적인 생물학적 활성을 갖는 박테리아를 포함하는 액상 촉생제 조성물에 있어서, 상기 박테리아가 온도, 시간 안정성 (보관시 안정성) 및 삼투압으로부터 선택되는 하나 이상의 선택압에 따라 선택된 것이고, 상기 조성물은 박테리아 펩톤, 염을 포함하여 박테리아 성장에 적합한 물질은 실질적으로는 함유하지 않으며, 또한 성장 단계 중에 세포 자체에 의해 생성되는 억제 인자가 결핍되어 있는 액상 촉생제 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 상기 조성물은 초기 제조 단계 중에 박테리아 자체로부터 제조되는 자가용해물을 포함하는데, 상기 자가용해물은 박테리아를 최소한의 생물학적 활성을 가지고 살아있는 상태로 유지시키기에 적합하도록 필요한 영양분을 제공하나, 하위 포유류 또는 인간에게는 유해하지 않다. 또한 바람직하게는, 상기 조성물의 pH는 박테리아의 생존능력을 유지시키기에 적합하도록, 더욱 바람직하게는 약 pH 6 내지 약 pH 7로 조정된다.
따라서 본 발명의 한 측면에 따르면, 염증성 장질환/과민성 대장 증후군 (IBD 또는 IBS 및 기타)을, 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상에게 치료적 유효량의 촉생 대장균 (Escherichia coli) 균주를 액상 제형물로 경구 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 바람직하게는 1회 투여 당 약 106 내지 약 1012 마리의 생존가능한 박테리아의 범위이고, 1일 1 내지 10 회, 바람직하게는 약 2 내지 4 회 투여의 범위이다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 활성 성분으로서 촉생 대장균 (Escherichia coli) 균주를 액상 제형물로서 함유하는 촉생적 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 미생물 감염의 치료 방법이 제공되는데, 상기 방법은 대상에게 치료적 유효량의 촉생 균주, 바람직하게는 대장균 (Escherichia coli) 균주를 액상 제형물로 경구 투여하는 것을 포함한다.
하기 표는 각종 질환 및 장애의 치료를 위한 본 발명에 따른 조성물의 투여량을 제시하는데, 이것은 예시적인 목적만을 위한 것이며 어떻게든 제한하려는 의도는 없다.
예시적 질환/장애 및 제시되는 투여량 계획의 표
질환/장애 제시된 투여량
1. 설사
박테리아성 (살모넬라, 쉬겔라, 스타필로코쿠스, 이. 콜라이, 병원성 항원형 (serotype), 클렙시엘라 (Klebsiella) 등) 설사가 멈추거나 비율이 감소할 때까지 매 3-4 시간마다 1-3 테이블스푼씩; 그 후에는 7-10 일간 매일 1 테이블스푼씩 3 회
항생제 유발 설사 매일 1 테이블스푼씩 3 회
여행자 설사 매 3-4 시간마다 1-3 테이블스푼씩
알려지지 않은 병인의 간헐적 급성 설사 매 3-4 시간마다 1-3 테이블스푼씩
장의 외과적 수술 후 또는 담낭 제거 후의 설사 매일 2-3 회 1 테이블스푼씩
당뇨병 유발형 3-4 개월간 매일 3-4 회 1 테이블스푼씩
방사선 및 화학요법에 노출된 후 매일 3 회 1 테이블스푼씩
연령 관련형 3-4 개월간 매일 3 회 1 테이블스푼씩
바이러스성 매일 3 회 1 테이블스푼씩
기생충 관련형 바람직하게는 보충적 치료로서, 매일 3 회 1 테이블스푼씩
2. 변비
연령 관련형 매일 3 회 1 티스푼씩
화학요법 후 매일 3 회 1 테이블스푼씩
당뇨병 유발형 매일 3 회 1 티스푼씩
3. 과민성 장 증후군 3-4 개월간 매일 3 회 1 테이블스푼씩
4. 장내 미시생태학적 균형의 병리 (비정상) (불편함, 과다 고창 (flatulence) 및 위장의 주기적 통증이 수반되는 칸디다증, 트림, 입냄새, 비타민 B12, B1, B2 등의 결핍을 나타내는 증상을 포함하는 과세균증 ( dysbacteriosis )) 3-4 개월간 매일 3 회 1 테이블스푼씩
본 발명은 또한 기타 질환의 치료에 의해 유발되는 부작용으로서의 장애를 포함하는 면역체계 장애를 앓는 대상에 있어서 면역체계의 개선 또는 정상화에 유용하고, 또한 가축의 치료에도 유용하다.
상기한 바람직한 구현예의 또다른 특징에 따르면, 대장균 (Escherichia coli) 균주 M-17과 같은 촉생 비병원성 락토스-양성인 균주를 단독 또는 경우에 따라 하나 이상의 이. 콜라이 균주 및/또는 기타 박테리아 균주와 함께.
상기한 바람직한 구현예의 또다른 특징에 따르면, 상기 액상 제형물은 촉생 대장균 (Escherichia coli) 균주 1 ㎖ 당 약 106 내지 약 1012 CFU, 더욱 바람직하게는 촉생 대장균 균주 1 ㎖ 당 약 107 내지 약 1010 CFU를 포함한다.
본 발명은 촉생 이. 콜라이 균주로써 박테리아성 감염, 염증성 장질환/과민성 대장 증후군 (IBD 또는 IBS, 또는 기타)을 치료하기 위한 방법 및 촉생제 약제학적 조성물을 제공함으로써, 현재 알려진 구성의 단점을 성공적으로 해결한다. 그러한 촉생제 치료는 효능있고, 안전하고, 비침습적이며, 부작용이 없으므로, 상기한 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 기타 질환 또는 장애를 치료하는 현재의 방법들에 비해 매우 유리하다.
본 발명의 특징은 이. 콜라이 또는 기타 박테리아가 생물학적으로 활성인 형태로 보존된다는 것이다.
본 발명의 장점은 위장관에 도달하는 즉시 박테리아의 촉생 작용이 시작된다는 것이다.
본 발명의 또다른 장점은 제제가 박테리아의 생존능력의 상당한 손실 없이 장시간 보존될 수 있다는 것이다.
본 발명의 또다른 장점은 본 발명의 제제 조성물이 건조 제제에 비해 위장을 통과하는 동안 안정성이 더 높다는 것이다.
본 발명의 또다른 장점은 제제가 공지의 촉생제 제제에 비해 더 많은 투여량으로 훨씬 더 증가된 효과를 보인다는 것이다.
당업계에 공지된 촉생제 조성물은 제조되고 보존되는 방식에 있어서 명백히 열등한 바; 예를 들면, 앞서 본 바와 같이, 다수의 그러한 조성물이 동결건조에 의존하는데, 이는 생물학적 활성의 수준을 극심하게 저하시킨다.
본 발명은 또한 액상 촉생제 조성물의 광범위한 효능으로 인해 먼저 병원체를 확인하고 항박테리아 제제에 대한 그의 민감성을 확인하지 않고도 장 감염을 효과적으로 치료할 수 있게 한다는 장점을 갖는다.
본 발명은 단지 예시로서 수반되는 도면을 참조로 하여 본원에 기술한다.
도 1 은 본 발명에 따른 액상 조성물로부터 취한 박테리아의 성장률과 동결건조된 조성물로부터 취한 박테리아의 성장률을 비교한 것으로서; 전자가 후자에 비해 월등한 성장률을 명백히 나타낸다.
본 발명은 비병원성 촉생 미생물을 함유하는 조성물의 제조 방법, 및 상기 조성물, 및 위장관의 미생물 감염을 비롯하여 IBS, IBD, 항생제 유발 설사 (AAD) 및 임의의 다른 종류의 설사 또는 증후군의 치료에 있어서의 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 촉생 박테리아를 함유하는 액상 조성물의 용도를 포함한다. 박테리아 세포는, 대사작용에 불리한 조건에 처할 때에도 생존가능하게 남을 수 있는 세포를 선택하기 위해, 초기에 선택압 요인을 적용함으로써 선택된다. 이러한 선택압 요인은 경우에 따라, 또한 바람직하게는 시간 안정성 (보관 안정성), 온도, 및 삼투압 조건 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서 최대 생존 능력을 갖는 박테리아가 선택된다.
온도 선택 조건은 경우에 따라, 또한 바람직하게는 활성적이고 생생한 세포 대사작용의 최적 범위를 벗어나는 온도, 바람직하게는 40℃의 온도로, 4 내지 5 일의 기간 동안 세포를 처리하는 것을 포함할 수 있다.
바람직하게는 세포는 활성적이고 생생한 세포 대사작용의 최적 온도 범위 미만의 온도, 바람직하게는 2 내지 15℃의 온도로, 1 내지 12 개월, 더욱 바람직하게는 3 내지 12 개월의 기간 동안 처리함으로써 선택할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 선택된 박테리아는 바람직하게는, 선택된 생존가능한 비병원성 박테리아를 함유하고, 경우에 따라 또한 바람직하게는 1 ㎖ 당 선택된 촉생 대장균 (Escherichia coli)의 콜로니 형성 단위 약 107 내지 약 108 개를 포함하는 액상 촉생제 제형물을 제조하기 위한 바이오매스의 제조를 위해, 성장 배지에 접종하는 데 사용된다. 현탁액 매질은 본질적으로 성장 배지를 함유하지 않 는다.
현탁액 매질은 또한 박테리아 세포로 하여금 최소한의 에너지 소비 및 조직형성 (plastic) 대사작용으로써 기초적 생물학적 활성을 유지하게 하는 데 사용될 수 있는 물질의 복합체를, 박테리아 세포의 생분해 성분의 생성을 방지하는 조건 하에서의 자가용해 (autolysis)의 결과로 인해 세포 현탁액 자체로부터 그러한 물질을 공급받음에 따라, 함유할 수 있다. 자가용해는 경우에 따라 기계적 작용의 적용에 의해 및/또는 환경의 조성을 통해 증가될 수 있다. 예를 들면, 자가용해는 박테리아 세포 내의 삼투압과 현탁액 매질의 삽투압 사이의 삼투 불균형을 제공함에 따라 유발될 수 있다. 예를 들면, 자가용해는 낮은 삼투압을 갖는 적당한 현탁액 매질, 가장 바람직하게는 0.3 내지 0.4% 염화나트륨 용액을 사용함으로써 유도될 수 있다.
대안적으로는, 자가용해는 박테리아 현탁액의 밀도 변화를 통해, 예를 들면 밀도가 바람직하게는 ㎖ 당 약 1011 내지 약 1012 마리의 박테리아 (CFU; 이들 두 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨에 주의해야 한다.)가 되도록 유발함으로써 유도될 수 있다.
또한 대안적으로는, 박테리아의 생분해 성분의 생성을 방지하기 위해 또다른 방법이 사용될 수 있다. 그러한 방법의 예로는 초음파 또는 예를 들면 기타 방법을 포함하나 거기에 제한되지는 않는다.
경우에 따라 또한 바람직하게는, 박테리아 현탁액은 자가용해물의 축적이 일 어나도록 3 내지 7 일간 자가용해에 유리한 조건 하에 둔 후, 세포의 내부와 적당한 현탁액 매질, 바람직하게는 약 0.6% 내지 약 0.7%의 범위, 가장 바람직하게는 약 0.6% 염화나트륨 용액인 현탁액 매질 사이의 삼투 균형의 조건 하에 둔다.
핵산 성분과 같은 세포 성분은 자가용해에 유리한 조건 하에서, 바람직하게는 90 내지 110 ㎍/㎖ 에 이르는 양으로, ㎖ 당 1011 내지 1012 마리의 박테리아의 세포 농도로 축적된다.
상기 현탁액 매질은 세포를 생존가능할 뿐만 아니라, 세포를 생물학적으로 활성인 조건에서 유지시키는 조건 하에서 유지시킨다. 상기 매질은 또한 바람직하게는 (상기 언급한 바와 같이) 박테리아가 실질적으로 더 이상 성장하거나 증식하지 않도록 유지시키기는 데 필요한 성분을 포함하며, 상기 매질은 본질적으로 성장 중에 미생물에 의해 보통 생성되는 억제제를 함유하지 않는다.
상기 제형물은, 박테리아를 기초적인 생물학적 활성률로 생존가능하고 생물학적으로 활성인 조건 하에 유지시키는 조건 하에서 최대 시간 동안 보관된다. 이러한 조건은 약 6.0 내지 약 7.0, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 6.8의 pH, 및 약 2 내지 약 10℃의 온도를 포함한다.
본 발명의 액상 제형물은 인간 및 동물의 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 10 ㎖ 내지 20 ㎖의 제형물의 투여량이 대상에게 1일 2 내지 4 회 투여된다.
이하, 특정 물질이 "실질적으로 함유하지 않는다"라는 용어는 바람직하게는 상기 물질이 소량 또는 미량, 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 미만으로 존재하는 조 건을 가리킨다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "방법"은 주어진 과제를 달성하기 위한 방식, 수단, 기법 및 절차로서, 화학, 약학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 숙련자에게 공지되어 있거나, 공지된 방식, 수단, 기법 및 절차로부터 용이하게 개발되는 방식, 수단, 기법 및 절차를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 것이다.
본원에서, 용어 "처리"는 질환의 진행을 폐지, 실질적으로 억제, 감속 또는 역전시키거나, 질환의 임상적 증상을 실질적으로 개량시키거나, 질환의 임상적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다.
용어 "예방"은 애초에 대상이 장애 또는 질환을 습득하는 것을 막는 것을 가리킨다.
본원에서 사용된 바와 같은 "염증성 장질환 (IBD)"이란 구절은 위장관 내 염증성 활성에 의해 특징지어지는 장애 또는 질환을 가리키며, IBD의 점액 형태도 포함할 수 있다. 본 발명의 촉생 균주에 의해 치료가능한 IBD의 예에는 크론씨 병 (말초 및 중앙부 모두), 궤양성 대장염, 부정형 대장염, 미시적 대장염, 교원질성 대장염, 소장 및/또는 중앙부 장의 특발성 염증 및 IBD-관련 설사가 포함되나, 여기에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여"는 질환 또는 장애의 영향 하에 있는 위장관 내 구역 또는 부위로 촉생 이. 콜라이 균주(들) 또는 기타 균주(들)을 전달하는 방법을 가리킨다.
용어 "치료적 유효량"은 치료할 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 적어 도 어느 정도까지 완화시키는, 투여되는 촉생 이. 콜라이 균주 또는 기타 균주의 양을 가리킨다.
이하, 용어 "대상"은 치료제가 투여되는 인간 또는 하위 동물을 가리킨다.
경구 투여용 조성물은 물 또는 비수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 또는 용액 함유 캡슐을 포함한다. 증점제, 희석제, 향미제, 분산조제, 유화제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
투약은 증상의 심한 정도 및 치료제에 대한 대상의 반응 정도에 의존적이다. 당업자는 최적 투여량, 투약 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 치료적 유효량은 바람직하게는 1회 투여 당 약 106 내지 약 1012 마리의 생존가능한 박테리아, 더욱 바람직하게는 1회 투여 당 약 107 내지 약 1010 마리의 생존가능한 박테리아, 더욱 바람직하게는 1회 투여 당 약 108 내지 약 1010 마리의 생존가능한 박테리아, 가장 바람직하게는 1회 투여 당 약 5×109 내지 약 2×1010 마리의 생존가능한 박테리아의 범위이다.
본 발명에 따른 투여 회수는 바람직하게는 1일 1 내지 10 회 투여, 더욱 바람직하게는 1일 1 내지 5 회 투여, 가장 바람직하게는 1일 2 내지 4 회 투여의 범위이다. 매일 투여되는 생존가능한 박테리아의 총량은 바람직하게는 1일 약 109 내지 약 1011 마리의 생존가능한 박테리아의 범위이나, 경우에 따라 1일 약 106 내지 약 1012 마리의 생존가능한 박테리아의 범위일 수 있다.
본 발명의 촉생 균주는 바람직하게는, 하기 상세히 기재되고 뒤따르는 실시예 부분에서 또한 예시되는 바와 같이 액상 제형물로 제형되고 투여된다.
본 발명의 촉생 균주의 액상 제형물로의 제형은 매우 유리하다. 생물학적으로 활성인 조건 하에서, 상기 제형물은 살아있는 박테리아를 위한 지지적 (supportive) 매질로서도 역할을 하나, 이는 시판되는 M17 제제와 같은, 박테리아가 소생 (anabiotic) 조건 하에 있는 동결건조된 제형과는 반대된다. 그 결과, 본 발명의 액상 제형물은 예를 들면 장내 바이오매스 생성이 필요하지 않으므로, 경구 투여 후 즉시 치료적으로 활성을 갖게 된다.
본 발명에 따른 촉생 이. 콜라이 균주의 액상 제형물은 통상 수용액 중의 박테리아의 현탁액을 포함한다. 상기 수용액은 통상 바람직하게는 박테리아로부터의 자가용해물, 등장량의 염을 포함하는 증류수로 주로 이루어지고, 추가로 하기에 상세히 설명하는 기타 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 용액은 생존능력을 유지하는 데 바람직한 pH로 조정된다. 바람직하게는 상기 용액은 또한 질소 공급원을 포함하나, 더욱 바람직하게는 비교적 소량으로, 가장 바람직하게는 약 0.3% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 0.03% 미만으로 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원의 모든 백분율은 부피당 중량으로서 표기됨에 주목한다.
본 발명에 따른 촉생 이. 콜라이 균주의 액상 제형물은 통상 ㎖ 당 약 105 내지 약 1012 CFU (콜로니 형성 단위)의 촉생 대장균 (Escherichia coli) 균주를 포 함한다. 바람직하게는 상기 액상 제형물은 ㎖ 당 약 106 내지 약 1010 CFU, 더욱 바람직하게는 ㎖ 당 약 107 내지 약 108 CFU를 포함한다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, 1일 10 ㎖ 내지 20 ㎖의 액상 제형물이 대상에게 1일 2 내지 4 회 투여된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 액상 제형물은 경구 투여되며, 이와 같이 바람직하게는 한 이상의 향미제(들), 및/또는 하나 이상의 식물 추출물을 추가로 포함한다.
균주 M17과 같은 비병원성 락토스-양성 이. 콜라이, 균주 Nisle 및 기타 균주는 인간 및 동물의 장내 건강한 호기성 미생물총의 주요 군을 이루며, 미생물학적 균형을 제공하고, 영양 및 면역에 있어 중요한 역할을 한다.
상기 박테리아 균주는 설사를 유발하는 데 책임이 있는 장내 병원체의 대부분으로서 동일한 계통학적 (phylogenetic) 군에 속하므로, 이들의 생존 조건은 크게 유사하여, 균주 간에 높은 수준의 경쟁적 배제가 일어난다. 이러한 경쟁적 효과는 촉생 박테리아의 성장 중의 항미생물 물질의 생성, 영양분 및 성장 인자에 대한 경쟁, 공동상승적 영양분 활용, 및 수용체 부위에 대한 경쟁을 포함한다.
경쟁적인 길항 작용에 있어 주요 요인인 증식의 속도는, 예를 들면 락토바실러스 (Lactobacillus) 또는 비. 비피더스 (B. Bifidus)에 비해 본 발명의 박테리아 균주에서 더 높으며, 다수의 장내 병원체의 증식 속도와 적어도 대등하다. 또한, 본 발명의 박테리아 균주는 영양적 요건에 대해 락토바실러스 또는 비. 비피더스와 같은 균주보다 훨씬 덜 선택적이다.
현재 이용가능한 촉생제 제제는, 박테리아가 살아있기는 하나 소생 조건 하에 있도록, 건조된 박테리아를 사용한다. 그러한 제제의 투여 시, 활성이 회복되기 전에 지체 기간이 발생한다. 설사가 일어나는 경우 장의 내용물이 급속히 배출되므로, 단지 적은 퍼센트의 투여된 건조 박테리아 제제가 대장 내에 잔존하여 증식하고 생물학적 활성을 수득한다.
본 발명의 액상 촉생제 조성물은, 적응기간의 필요 없이 박테리아의 촉생 작용이 위장관에 도달하는 즉시 시작되도록, 박테리아가 생물학적으로 활성인 형태로의 보존을 가능하게 한다. 따라서 박테리아 성장이 시작하는 데 걸리는 시간은 동결건조된 박테리아를 사용하는 제제에 비해 본 발명의 액상 조성물에 있어 훨씬 더 빠르다.
본 발명의 촉생제 조성물의 박테리아 병원체에 대한 길항적 효과는 동결건조된 제제로부터의 촉생 박테리아의 효과에 비해 상당히 더 높은 것으로 밝혀졌다. "길항적"이라는 것은 특정 박테리아 균주가 다른 박테리아 또는 다른 미생물의 성장에 반작용 (antagonize)하는 능력을 의미함에 주목한다.
다량의 염산을 포함하는 위액의 작용은 다수의 박테리아가 죽게 하는 것으로 알려져 있다. 건조된 형태의 박테리아는 액상 매질에 함유된 것보다 더 약하며, 따라서 위액의 작용에 더 영향을 받는다. 따라서 본 발명의 액상 조성물에 함유된 박테리아는 동결건조된 제제의 박테리아에 비해 위장 통과 시 더 안정하다. 대장으로 들어간 박테리아는 증식하고, 그들의 길항적 특성을 발현하기 시작한다. 그 러나 장내 병원체의 대부분에 있어 일차 작용 부위는 대장이 아니라 위장관의 상부이다. 공지된 촉생제 제제는 경쟁적 농도의 살아있는 박테리아를 장의 상부로 전달하지 못하므로, 급성 박테리아 설사 및 장의 상부에서의 미시생태학적 균형의 교란에 의해 유발된 상태를 제거하는 데에는 현실적으로 비효과적이다.
종래의 촉생제 제제 제조 방법을 사용하면, 제제의 박테리아 양을 증가시키는 것이 문제가 된다. 상기와 같은 방법에서는, 박테리아가 배양 배지와 함께 건조되고, 각종 안정화제가 박테리아의 안정성을 증가시키기 위해 첨가된다. 따라서 투여되는 박테리아의 양을 증가시키는 것은 기타 성분의 소비 수준을 증가시키게 되고, 이는 심각한 부작용으로 이어질 수 있다.
반면, 본 발명의 조성물은 생물학적으로 순수한 박테리아의 액상 현탁액을 포함하여, 1일 투여되는 박테리아의 수가 바람직하게는 약 150 ㎖ 이하의 부피 중에, 몇천만 마리부터 약 2천억 마리 이하의 박테리아까지, 앞서 언급한 바와 같은 농도로 변할 수 있다. 이는 실용적인 경쟁적 농도의 박테리아가 소화기관의 상위 부분, 즉 대부분의 장내 병원체가 작용하는 부위로부터 시작하여 제공될 수 있게 한다. 목표 부위는 질환 또는 장애를 치료하는 데 필요한 농도를 결정짓게 한다.
본 발명의 액상 촉생제 조성물의 효과는, 치료될 질환 또는 장애에 따라 최대 투여량에 의존적인 효능을 제공하는 것으로 밝혀진 투약 회수에 따라 투여될 수 있다는 사실로 인해 더욱 증가한다. 예를 들면, 급성 설사를 치료함에 있어, 본 발명의 액상 촉생제 조성물은 변비 치료에 사용되는 효과량에 비해 10 내지 100 배 더 높은 양으로 투여될 수 있다.
본 발명의 액상 촉생제 조성물의 제조에 있어, 가장 높은 길항적 활성을 갖는 이. 콜라이 박테리아 세포 (혹은 기타 박테리아 세포) 및, 장시간, 바람직하게는 약 12 개월까지의 보관 하에 가장 존속적인 박테리아 세포가, 유익한 촉생 특성을 갖는 락토스-양성 비병원성 이. 콜라이 종으로부터 보다 바람직하게 우선적으로 선택된다.
본 발명의 촉생제 조성물에서의 사용을 위한 이. 콜라이 세포 또는 기타 박테리아는, 선택된 세포만이 생존가능하게 잔존하도록 세포에 선택압을 가함으로써 선택된다. 선택압의 적용은, 장기간 생존 능력을 갖는 세포가 선택되도록 시간 압력 (경시 안정성)의 사용; 삼투압의 적용; 기초 대사작용의 저하; 또는 온도 증가에 의해 달성될 수 있다. 온도 선택은 경우에 따라 또한 바람직하게는, 세포를 40℃의 온도에서 4 일 이상, 및/또는 더 높은 온도에서 더 짧은 기간 동안 두는 것을 포함한다. 이러한 수단에 의해 높은 생존 능력을 갖는 세포만이 초기 배양물에서 선택된다.
선택된 박테리아 세포는, 실시예 6 및 7을 참조로 하여 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 성장 배지의 접종에 사용되었다. 본 발명의 영양 조성물은, 예를 들면 효모 추출물 및/또는 효모 자가용해물로부터의, 실시예를 참조로 기술된 것과 같은 다양한 인자를 포함할 수 있다. 본 발명의 성장 배지의 영양 조성물은 경우에 따라 성장 인자를 포함할 수 있고, 예를 들면 효모 추출물로부터의 상기와 같은 성장 인자의 첨가로 인해 종래의 성장 배지로써 수득되는 것에 비해 축적되는 박테리아의 바이오매스를 상당히 증가시켜, 경제적으로 유익하다. 상기 효모 추출 물은 바람직하게는 리터 당 약 5 그램 내지 리터 당 약 25 그램, 더욱 바람직하게는 리터 당 약 15 그램 내지 리터 당 약 20 그램의 양으로 존재한다.
다른 영양 조성물의 공급원도 가능하지만, 바람직하게는 예를 들면 "Manual of Methods for General Bacteriology", P. Gerhardt 등, American Society for Microbiology, Washington, DC, 미국, 1981]에 기재된 것과 같은, 선행기술에 공지된 바와 같은 필요한 영양분, 성장 인자 등을 모두 포함한다.
본 발명의 방법은, 배양 배지 및 그에 수반되는 다량 투여 시의 부작용이 없고, 박테리아의 성장 및 활성의 시작을 지연시키는, 미생물이 성장 중에 보통 생성하는 억제제가 없는, 생물학적으로 순수한 박테리아를 제공한다.
그램-음성 박테리아, 특히 이. 콜라이의 세포내 삼투압은 성장의 대수기 (log phase)에는 15 대기압까지 도달하고, 성장의 정체기 (stationary phase)에는 2 내지 3 대기압에 도달할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 방법의 한 바람직한 구현예에서는, 낮은 삼투압, 바람직하게는 1 대기압 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 0.4 대기압의 현탁액 매질이 사용된다. 본 발명의 액상 촉생제 조성물의 제 1 제조 단계 중 삼투 불균형 및 높은 박테리아 밀도는, 대수기에 있어 가장 약하고 가장 작은 안정한 박테리아 세포의 자가용해를 위한 상태를 생성한다. 이들 용해된 세포는 현탁액 매질 중 박테리아로부터의 세포 성분이 축적되게 하고, 이는 잔존하는 세포의 영양 필수물을 제공한다. 이러한 절차를 이용하여, ㎖ 당 1011 내지 약 1012 마리의 박테리아 (CFU)의 세포 농도가 수득되지만, 세포 농도는 경우에 따라 더 넓은 범위로 존재할 수도 있다.
실시예 1 에 나타난 바와 같이, 최대 세포 안정성을 위한 본 발명의 현탁액 매질의 pH는 경우에 따라 또한 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.0의 범위이다. 더욱 바람직하게는, 현탁액 매질의 pH는 약 6.5 이다.
실시예 2 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 박테리아 세포는 경우에 따라 또한 바람직하게는 약 2 내지 약 20℃범위의 온도에서 보관된다. 더욱 바람직하게는, 보관 온도는 약 20 내지 약 10℃범위이다. 가장 바람직하게는, 보관 온도는 약 2 내지 약 4℃범위이다.
세포 안정성에 바람직한 조건 (예를 들면, 적당한 pH, ㎖ 당 107 내지 108 마리 박테리아의 세포 농도, 박테리아 세포가 최소한의 에너지 소비 및 조직형성 대사작용 등으로써 구조를 유지하는 데 사용되는 물질의 복합체 (자가용해물)) 하에서, 본 발명의 액상 촉생제 조성물은, 박테리아를 12 개월 이상 생존가능한 상태뿐만 아니라 즉각 활성인 생물학적 형태로 보존하는 인자의 조합을 생성한다. 이 단계에서의 박테리아의 농도는 경우에 따라 ㎖ 당 약 106 내지 약 1012 마리의 박테리아의 범위일 수 있음에 주목한다. 상기 물질의 복합체는 바람직하게는 핵산, 핵산 성분, 박테리아 지질다당류 (lipopolysaccharides), 펩티도글리칸 (peptidoglycan), 인지질 및 다수의 기타 바람직한 물질을 포함한다.
본 발명의 촉생제 조성물은 인간 및 동물의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 촉생제 조성물의 제형, 제조 및 용도를 하기의 비제한적인 실시예 를 참조로 예시한다.
실시예 1: 액상 촉생제 조성물의 제조 방법
선택된 박테리아를 먼저, 0.3% 내지 0.4% NaCl 용액 중에 ㎖ 당 1011 내지 1012 CFU 범위의 농축물의 형태로 바이오매스를 형성하여 자가용해물을 생성하도록 성장하게 제조하였다.
액상 촉생제 조성물을 제조하기 위해, 세포 농축물을 0.6% 내지 0.8% NaCl 용액 중에, 107 세포/㎖ 의 세포 농도 (그러나 경우에 따라 박테리아의 농도는 ㎖ 당 약 106 내지 약 1012 마리 박테리아의 범위일 수도 있다)로 희석시켰다. 상기 액상 촉생제 조성물을 세포 생존에 바람직한 pH로 조정하였다. 바람직한 pH는 약 6.5 내지 6.8 이하였다. 맛을 개선시키기 위해, 장시간 보존되는 박테리아의 생존능력을 감소시키지 않는 하나 이상의 식물 추출물, 향미제 및/또는 기타 첨가제를 첨가할 수도 있다. 실시예 15 에 예시적 식물 추출물 제조 방법에 대한 기재를 하기에 제공한다.
상기 액상 촉생제 조성물은 생물학적 특성의 상당한 손실 없이 12 개월 이상 냉장된 상태로 보존될 수 있다.
실시예 2
+2±8℃의 온도의 현탁액 매질 (삼투적으로 균형잡힌 용액을 함께 제공하는 자가용해물을 포함한 0.7% 염화나트륨 용액)의 pH에 따른, 박테리아 이. 콜라이 M- 17* (CFU/㎖)의 생존능력
[표 1]
보관시간 (개월) 현탁액 매질의 pH
5 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
0 1 2 3 6 9 12 108 105 103 <101 <101 <101 <101 108 105 104 102 <101 <101 <101 108 107 106 10 6 104 103 102 108 108 107 106 105 104 103 108 108 107 106 105 104 102 108 106 104 104 103 <101 <101 108 105 104 103 <101 <101 <101 108 102 <101
상기 나타난 바와 같이, 생존가능한 세포의 수는 pH 8.5의 현탁액 매질 중 보관 시 1 개월 내에 현저히 감소한다. 5.5 미만 혹은 7.5 초과의 pH에서는 보관 2 개월 이내에 현저한 감소가 보인다. 12 개월이 종료하는 시점에는 pH 6.0 내지 7.0의 배지에서만 상당한 수의 생존가능한 세포가 잔존한다.
실시예 3
현탁액 중, 본 발명에 따른 선택적 샘플링 후의 이. 콜라이 M-17 박테리아 세포 (1) 및 시판되는 동결건조된 제제로부터 단리된 세포들 (2)의, 보관 온도에 따른 생존능력. 0.7% 염화나트륨 용액을 현탁액 매질로 사용하였다. 현탁액 pH = 6.7.
[표 2]
노출시간 (개월) 온도 간격에서의 ㎖ 당 박테리아의 대수 (Log No.)
2℃- 4℃ 8℃- 10℃ 18℃- 20℃ 25℃- 30℃
1 2 1 2 1 2 1 2
0 1 2 3 6 9 12 108 108 108 108 108 108 107 108 106 106 105 105 104 102 108 108 108 108 108 107 107 108 106 105 105 104 104 103 108 108 108 107 106 106 105 108 105 104 103 <101 <101 <101 108 107 106 105 103 102 <101 108 103 102 <101 <101 <101 <101
상기 나타난 바와 같이, 현탁액 중 생존가능한 박테리아의 수는 2 내지 10℃의 온도에서의 12 개월에 걸친 보관 시 매우 조금 감소하는 반면, 18 내지 20℃에서의 보관 시에는 동일한 기간 동안에도 현저한 감소가 관찰된다. 25 내지 30℃의 온도에서는, 12 개월 후 생존가능한 세포가 거의 잔존하지 않는다.
실시예 4
동결건조된 살아있는 박테리아 (시판용 제제 Colibacterin) 및 액상 촉생제 조성물 (박테리아가 생물학적으로 활성인 형태로 존재함)로부터의 박테리아 이. 콜라이 M-17 동일량 (각 샘플 당 1 ㎖ 108 CFU)을 영양 배양액 (broth) 샘플 (200 ㎖)에 도입하였다. 혼합물을 37℃에서 90 분간 인큐베이션 하였다.
박테리아의 대사작용 활성의 감소, 즉 그들의 새로운 환경 배지의 상태로의 적응하는 속도를 그들의 초기 성장률과 관련하여 평가하였다. 상기 값을 얻기 위해, 박테리아를 영양 배양액에 도입하자마자 즉시, 그 후 인큐베이션 공정 중 30 분 간격으로, 박테리아의 양 (1 ㎖ 당 C.F.U.)을 측정하였다.
도 1 에 나타난 바와 같이, 액상 촉생제 조성물로부터 취한 세포를 사용한 박테리아의 성장 (○)이 동결건조된 촉생제로부터의 세포의 박테리아 성장률 (△)에 비해 상당히 더 빠르다.
실시예 5
에스. 플렉스네리 (S. flexneri) 및 에스. 소네이 (S. sonnei)의 10 내지 20 시간 배양물을 105 CFU/㎖ 의 농도로 식염수에 희석시켰다. 그 후, 이들을 단독으로, 또는 동결건조된 촉생제 (Colibacterin)로부터의 혹은 액상 촉생제 (Bio-Co)로부터의 이. 콜라이 M17 (1012 CFU/㎖ 의 농도로 식염수에 희석)의 배양물과 조합하여 영양 배양액 (5 ㎖)을 함유하는 시험관 내에 접종 (1 ㎖)하였다. 상기 시험관을 24 시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 상기 병원체 및 양 촉생제 제제로부터의 이. 콜라이 M17의 콜로니 형성 단위 (CFU)의 수를 영양 한천 (nutrient agar) 상의 플레이트 계수에 의해 구하였다.
이들 데이터를 하기 표에 나타내었다.
쉬겔라의 각종 균주에 비한, 동결건조 및 액상 촉생제 조성물로부터의 촉생 생물 이. 콜라이 M17의 길항적 활성
[표 3]
촉생제 혼합 박테리아 배지로부터의 배양 성장 (쉬겔라/이. 콜라이 M17) (CFU/㎖)
쉬겔라 플렉스네리 1a 쉬겔라 플렉스네리 2a 쉬겔라 소네이
동결건조 액상 (대조로서 쉬겔라 단독) 7/195 2/196 60 8/181 0/240 7 13/300 0/160 18
실시예 6
카세인 소화 대두 한천 배지 (TSA: tryptic soy agar) 및 카세인 소화 대두 액체 배지 (TSB: tryptic soy broth)로 나타낸 배양 배지 (고체 및 액체)에 동일량의 박테리아 배양물 이. 콜라이 M17을 접종하였다. 당업계에 공지된, TSA 및 TSB의 조성물 및 제제에 대한 기준에 대해서는, 예를 들면 본원에 전문이 참조문헌으로서 인용된 ["Culture Media for Microbiology", FEROSA/Scharlau, 1996]을 참조한다. 미생물을 최적 온도 (36℃)에서 24 시간 동안 (고체 배양 배지) 및 18 시간 동안 (액체 배양 배지) 호기 조건 하에서 배양하였다. 그 후, 1 ㎖ 당 박테리아의 농도를 영양 한천 상에서 플레이트 계수에 의해 구하였다.
최적 성장 배지 (T.S.A. 및 T.S.B.) 및 본 발명에 따른 성장 배지 상의 비병원성 이. 콜라이 (E. coli M17)의 바이오매스의 축적을 비교하여 하기 표에 예시하였다.
상이한 배양 배지 상의 배양 성장
[표 4]
배양 배지 박테리아의 농도 (배양 배지 1 ㎖ 당 대수 ivo)
본 발명의 고체 배양 배지 T.S.A. 본 발명의 액체 배양 배지 T.S.B. 1010 - 1011 108 - 109 1012 - 1013 1010 - 1011
실시예 7
0.4% 염화나트륨 용액 중 1011 내지 1012 CFU 박테리아 현탁액의 샘플을 3 일 및 30 일간 +2±4℃의 온도에서 보존한 후, 상기 샘플의 핵산 성분을 분석하였다.
먼저, 무세포 여과액을 얻기 위해 상기 샘플을 0.45 μ 미생물학적 필터로 여과하였다. 여과액에 핵산 성분 (아데닌 및 우라실)이 존재하는지 검사하였다. 방법의 민감도에 따라, 검출 한계는 2 ㎍r/㎖ 이었다. 이들 데이터를 하기 표에 나타내었다.
[표 5]
샘플 보존 기간 ㎍r/㎖ 아데닌 ㎍r/㎖ 우라실
3 일 30 일 > 0.2 > 0.2 7.4 102.1
실시예 8: 액체 배양 배지를 이용한 박테리아 바이오매스의 제조
박테리아 바이오매스 제조를 위해 폭기 (aeration) 표준 발효 용기를 사용할 수 있다. 박테리아 성장에 필요한 영양분을 두 단계로 첨가하였다.
통상적 발효 공정에서는, 배지가 10.0 g/℃의 대두 펩톤, 18.0 g/℃의 효모 추출물, 2.5 g/℃의 글루코스, 3.0 g/℃의 염화나트륨, 및 중성 또는 약염기 pH (7.2±0.2)를 제공하기에 충분한 제2인산나트륨 및 제1인산칼륨의 조합으로 구성될 수 있다.
부가적 영양분은 박테리아 성장 과정 중에 자동적으로 영양 배지에 공급된다.
부가적 글루코스는, 배양물의 성장 후에 발효 배양액 중 글루코스 농도가 2.5 g/℃의 수준으로 유지되도록 계속 첨가되어야 한다.
부가적 폭기 (0.5 vvm)가 박테리아 성장의 전체 기간 중에 행해진다.
발효 배양액의 pH는 4N NH4OH를 연속 첨가함으로써 중성으로 유지될 수 있 다.
배양액은 약 32 내지 약 36℃의 온도에서, 성장 사이클의 정체기에 도달할 때까지 인큐베이션된다.
16 내지 18 시간 후, 세포를 원심분리 또는 한외여과 (ultrafiltration)에 의해, 현탁액 1 ㎖ 당 107 내지 108 개의 미생물 세포의 세포 농도에 대해 총 질소 잔존량이 0.3% 이하, 바람직하게는 0.03% 이하가 되는 수준까지 수확하고, 식염수에 재현탁시키고, 재침전시킨다.
1011 내지 1012 마리의 박테리아 현탁액을 4 내지 8℃로 냉각된 0.4% 내지 0.6% NaCl 용액 중에 제조하고, 냉장 조건 하에 보관한다. 이 단계 (및/또는 대상에게 투여 시)에서의 박테리아 농도는 경우에 따라 ㎖ 당 약 106 내지 약 1012 마리 박테리아의 범위일 수 있음에 주목한다.
실시예 9: 고체 배양 배지를 이용한 박테리아 바이오매스의 제조
본 발명에 따라 최대 박테리아 바이오매스 축적을 제공하는 영양 조성물을 사용하여, 비병원성 이. 콜라이를 고체 배양 배지 상에 성장시켰다.
상기 배지의 조성은 다음과 같다.
[표 6]
조성 (g/ℓ)
대두 펩톤 10.0 효모 추출물 18.0 덱스트로스 2.5 염화나트륨 4.0 한천 12.0
최종 pH 7.0 (대략 0.2)
제조된 배지를 해당 매트릭스에 5 내지 7 밀리미터의 층 두께로 붓는다. 냉각 후, 배양 배지에 박테리아 배양물 이. 콜라이 M-17을 접종한다.
매트릭스를 인큐베이터에 넣고, 최적 온도 (34 내지 38℃)에서 약 24 내지 28 시간 동안 호기 조건 하에 인큐베이션 한다. 상기 절차로 배양 배지 ㎖ 당 1010 내지 1011 개의 세포를 얻었다.
상기 기간 후에, 단리된 순수 배양물은, 액체 (또는 적어도 실질적인 양의 액체)를 플레이트에 도입하지 않고 박테리아를 스파튤라와 같은 도구로 제거하는 "건식 방법"에 의해 플레이트로부터 제거되어야 한다. 이를 위해, 바이오매스 회수를 위한 특별한 조정 (adjustments)이 이루어졌다.
1011 내지 1012 CFU 박테리아 현탁액을 0.4% 내지 0.6% NaCl 용액 중에 제조한다. 현탁액을 냉장 조건 하에 보관한다.
실시예 10 - 설사의 치료
1일 환자에게 투여되는 촉생 박테리아의 양에 따른, 살모넬라 및 알려지지 않은 병인의 음식물 중독에 의해 유발되는 급성 설사 (여행자 설사 포함)의 에피소드를 제거하는 효과를 나타낸다 (투여량 의존적 효능).
총 64 명의 환자를 상이한 치료적 유효량의 본 발명의 액상 촉생제 조성물로 치료하였다. 이들 양은 1일 당 100억 내지 2천억 마리의 생 박테리아를 4 내지 6 회의 투여량으로 나눈 범위이다.
제 1 군의 환자에게는 1일 1천만 마리 박테리아의 치료적 유효량을 함유하는 본 발명의 액상 촉생제 조성물이 처방되었다. 이 환자들의 85%에서 3 일후에도 급성 설사의 증상이 여전히 존재하였다. 4일째부터는 이 환자들에게 1일 2천억 마리 박테리아의 치료적 유효량이 처방되었다. 상기 투여량의 투여 첫 날 내로 94%의 환자에서 설사가 멈추거나 용변 횟수가 상당히 감소되었다.
제 2 군의 환자에게는 관찰 첫 날부터 2천억 마리의 생 박테리아를 포함하는 치료적 유효량의 본 발명의 액상 촉생제 조성물을 투여하였다. 액상 촉생제 조성물을 투여한 첫 날 내로, 주로 처음 12 내지 14 시간 중에 현저한 효과 (설사가 멈추거나 용변 횟수의 상당한 감소)가 관찰되었다.
실시예 11: 항헬리코박터 요법으로 치료된 환자에서의 장내 미생물총 변화의 특성에 대한 액상 촉생제 조성물의 효과
항헬리코박터 요법으로 치료된 104 명의 환자군을 무작위로 2 개의 하위군으로 나누었다.
항생제 치료를 포함한 표준 요법 이외에도, 제 2 군의 환자에게 본 발명의 액상 촉생제 조성물을 투여하였다. 25 일간의 치료 후에, 건강한 미생물총 (호기성 및 혐기성)의 주요 대표로 여겨지는 박테리아의 정량적 조성을 모든 환자에게서 구하였다.
그 결과를 하기 표에 나타내었다.
[표 7]
미생물 각 군의 데이터
건강한 대상 (대조로서) 항헬리코박터 요법 하의 대상 1 2
이. 콜라이의 총량 (백만 마리/g) 락토스 음성 이. 콜라이 (이. 콜라이 총량의 %) 비피도박테리아 (중간 대수) 락토박테리아 (중간 대수) 300-400 5 109 107 124 17 107 106 318 6 108 107
타입 M17의 비병원성 이. 콜라이는 장내 호기성 미생물총의 주요 대표 역할을 한다. 본 발명의 액상 촉생제 조성물의 투여 시, 장내 이. 콜라이의 총수는 정상화되고, 이들의 질이 개선된다 (즉, 락토스-양성 박테리아의 수준이 증가하고, 락토스-음성 박테리아 및 발효 활성이 낮은 이. 콜라이의 수준이 감소한다). 또한, 건강한 호기성 장 미생물총의 가장 중요한 대표인 비피도박테리아의 수가 증가한다.
실시예 12: 촉생제 조성물의 제조 - 예시적 방법
본 발명에 따른 조성물은 경우에 따라서는 하기의 예시적 방법에 따라 제조될 수 있다. 경우에 따라 시드 스톡 (seed stock)으로부터의 촉생 이. 콜라이 (108 내지 109 개의 세포)를 표준 미생물 발효 기법을 사용하여 액체 또는 고체 배양 배지 성분에 접종한다. 성장 조건에는 바람직하게는 연속적 폭기, 중성 pH의 유지 및 글루코스의 보충이 포함된다. 상기 생물은 어떤 식으로든 유전적으로 변형되지 않고, 오히려 정상 인간의 위장관으로부터 수득된 미생물총으로부터 단리된 것이 바람직하다.
제조는 경우에 따라 또한 바람직하게는 하기의 중요한 제어 요점에 대해 제어된다:
* 배양물을 수득하고 취급하는 데 주의를 기울여야 함.
* 적절한 배양 조건을 보장하기 위한 제어 절차
* 무균상태 유지
* 완제품에서의 올바른 촉생제 수준을 보장하기 위한 제어 절차
경우에 따라 또한 바람직하게는, 시드 스톡 자체가 다음과 같이 제조될 수 있다. 이. 콜라이 M-17 균주의 동결된 바이알 하나를 -80℃의 보관소로부터 꺼내어, 실온에서 해동한 후, 살균된 카세인 소화 대두 액체 배지 (Difco)를 함유하는 무균 배플 (baffle) 장착 진탕 플라스크로 무균 상태로 옮긴다. 15 내지 20 시간 동안 성장시킨 후, 배양물을 현미경으로 검사하고, 순도를 검사하기 위해 Bacto m Endo Agar LES 플레이트 상에 스트리킹 (streaking) 하였다.
반응기 제조
각 반응기에 배지를 넣고, 배치화 (batch) 및 살균한다. 덱스트로스를 별도로 살균하고 배양물 접종 전에 2.5 g/℃의 농도로 첨가한다.
반응기 접종
시드 배양물을 무균 상태로 생물반응기 (bioreactor)로 옮기고, 온도, pH, 교반 및 용해된 산소가 확립된 조건 하에 상기 배양물을 성장시킨다. 접종 후 4 시간 후에 3.5 내지 3.9 g/℃의 글루코스 공급을 시작한다. 18 내지 22 시간의 성장 후에, 배양물을 현미경으로 검사하고, 순도 검사를 위해 Bacto m Endo Agar LES 플레이트 상에 스트리킹한다. 그 후 수확하기 위해 반응기를 <10℃로 냉각시킨다.
미세여과
0.2 ㎛ 공극 크기의 접선 흐름 미세여과 단위 (tangential flow microfiltration unit)를 사용하여 농축함으로써 생물반응기 내용물을 수확한다. 농축물을 무균 식염수 5 부피로써 정용여과 (diafiltering)한 후, 4 내지 6℃에서 보관을 위해 무균 병에 넣는다. 샘플을 현미경으로 검사하고, 순도 검사를 위해 Bacto m Endo Agar LES 플레이트 상에 스트리킹하고, 카세인 소화 대두 한천 배지 (Tryptic Soy agar) 플레이트 상에 평판배양 (plating)함으로써 계수한다.
실시예 13: 이. 콜라이를 이용한 IBD 관련 설사의 치료
2 년간 설사 에피소드가 있는 이완성 장운동을 앓고, 직장 출혈이나 체중 감소는 없는 23 세의 남자를 연구하였다. 그의 가족 병력은 장질환에 대해서는 별다른 점이 없었다.
환자의 실험실 검사는 하기를 나타내었다: 헤모글로빈 = 17.6 (흡연가), ESR = 10, 혈소판 = 219, 알부민 = 4.1, 조직 트랜스글루타미네이스 (tissue transglutaminase) TTG = 29.8 (정상 < 20).
또한, 환자는 양성 H2 호흡 검사에 의해 유당불내증 (lactose intolerance)이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 유제품이 없는 식단은 그의 상태를 호전시키지 못했다.
환자의 상승된 TTG 값으로 인해 셀리악 병 (Celiac disease)의 진단이 제시되었다. 상부 GI 내시경에서는 정상적으로 보이는 소장이 관찰되었다. 십이지장 의 제 2 부분으로부터의 무작위 생검에서는 정상적인 소장 점액이 존재하는 것으로 나타났다. 캡슐 내시경 검사를 행하여, 소장 중앙부에 몇몇 미란 (erosion), 점액성 출혈, 부종 및 융모 손실을 포함하는 염증성 변화가 있음을 알아내었다.
상기 환자를 실시예 12에 기재한 바와 같이 제조한 촉생제 조성물로써, 매일 2 회 한 테이블스푼씩, 대략 식사 30 분전에 투약하여 치료하였다. 2 주 후에, 환자의 상태는 호전되지 않았다. 상기 환자의 촉생제 치료는 일일 투여량을 매일 4 테이블스푼으로 증가시켜 계속하였다. 이 치료 후에, 환자는 2 년 만에 처음으로 실질적인 호전이 있음을 보고하였다. 소장의 두 번째 캡슐 내시경 검사에서는 중앙부 소장의 염증성 프로세스가 호전됨이 입증되었다.
실시예 14: 액상 촉생제 조성물을 사용한 치료방법
상기한 바와 같이, 본 발명의 액상 촉생제 조성물은, 미생물 감염, IBS 및 IBD를 포함하나 여기에 한정되지는 않는, 위장관 질환 및 상태에 대해 효과적인 치료인 것으로 나타났다. 하기 실시예는 그러한 위장관 질환 또는 장애 (또는 치료가 필요한 상태), 및 임의의 기타 적절한 상태를 본 발명의 액상 촉생제 조성물로써 치료하는 방법에 대한 예시일 뿐이며, 이로써 제한하려는 의도는 없다.
본 방법은 치료되어야 하는 대상에게 상기 액상 촉생제 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 액상 촉생제 조성물은 효과적인 투약 방법에 따른 약학적으로 유효한 양으로, 바람직하게는 상기 대상에서 위장관 질환, 장애 또는 상태 및 임의의 기타 적절한 상태의 증상의 부재, 또는 상기 대상에서의 상기와 같은 질환, 장애, 상태 또는 증상의 출현 예방과 같은 소정의 종점에 도달할 때까지, 투여된다.
실시예 15: 식물 추출물의 제조
생물학적으로 활성인 식용 추출물은 임의의 적당한 과일, 채소, 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리, 또는 허브로부터 제조될 수 있다. 상기 식물은 양배추, 마늘, 파슬리, 딜 (dill), 레몬 등, 또는 박하 등과 같은 허브일 수 있다.
식물 추출물은 경우에 따라 비등점을 40℃이하로 하는 감압 하에 증류함으로써 제조될 수 있다.
식물 추출물 제조에 있어서는, 시판되는 장비, 예를 들면 "Rotovapor" 장치를 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 첨가될 식물 추출물의 제조 방법은 바람직하게는 하기를 포함한다:
1. 식물 또는 식물 일부를 분쇄하여 식물 바이오매스를 수득하는 단계.
식물 추출물 제조를 위해서는 신선하게 제조된 바이오매스를 사용해야 함이 강조되어야 한다. 과일, 채소 또는 기타 식물을 파쇄한 후에는 미생물이 바이오매스를 형성하기 시작하여 제어불가능한 발효 및 기타 반응이 일어나므로, 실온에서 1 내지 2 시간 이하로 보관하는 것이 바람직하다. 이는 수득되는 추출물의 질을 현저히 저하시킨다. 보관을 연장시킬 필요가 있는 경우, 분쇄된 식물 물질은 12 시간 이내로 냉장고에서 보관해야 한다.
2. 감압 하에서 식물 바이오매스를 증기 증류하는 단계.
3. 상기 증기 증류로부터 수득된 휘발성 분획을 수집하는 단계. 상기 분획은 물로 추가 희석될 수 있다.
식물 추출물은 경우에 따라 능력 손실 없이 냉장된 상태로 12 개월 동안 보관될 수 있다. 상기 분획 자체는 식품/사료 첨가제를 구성하며, 또한 경우에 따라 1종 초과의 식물 추출물을 혼합하여 제조될 수도 있다.
본 발명을 그의 특정 구현예로써 설명하였으나, 다수의 대안예, 변형예 및 변화예가 당업자에게 자명함은 명백하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범위에 속하는 그러한 대안예, 변형예 및 변화예를 모두 포함하도록 의도된다.

Claims (74)

  1. 적어도 기초적인 생물학적 활성을 가지는 박테리아 및 액상 매질을 포함하는 액상 촉생제 (probiotic) 조성물로서, 상기 박테리아는 하나 이상의 선택압 (selection pressure)에 따라 선택된 것이며, 부적합한 물질은 실질적으로 함유하지 않는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아가 하나 이상의 이. 콜라이 (E. coli) 균주를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 박테리아가 길항적 특성을 갖는 비병원성 락토스-양성 균주를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 박테리아가 복수의 대장균 (Escherichia coli) 균주, 또는 하나 이상의 이. 콜라이 균주 및 하나 이상의 부가적 박테리아 균주를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 선택압이 온도 압력을 포함하는 것인 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 온도 압력이 상기 박테리아를 함유하는 매질의 온도 를 상승시키는 것을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 온도 압력이 상기 박테리아가 약 36 내지 약 50℃의 온도로 처리되는 것을 포함하고, 상기 박테리아는 현탁 상태로 있는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 박테리아가 약 40℃의 상기 온도로 4 일 이상 처리되는 것인 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 온도 압력이 상기 박테리아를 함유하는 매질의 온도를 저하시키는 것을 포함하는 것인 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 저하가 상기 온도를 약 1℃ 내지 약 12℃로 12 개월까지 저하시키는 것을 포함하는 것인 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 온도가 약 3 개월 이상 저하되는 것인 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 선택압이 보관 시간을 포함하고, 상기 박테리아가 약 1 개월 이상 보관되는 것인 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 박테리아가 약 12 개월까지 보관되는 것인 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 선택압이 삼투압을 포함하는 것인 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 선택압이 낮은 삼투압을 포함하는 것인 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 삼투압이 약 1 대기압 미만의 압력을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 삼투압이 약 0.3 내지 약 0.4 대기압의 압력을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 액상 매질이 물, 자가용해물 (autolysate) 및 등장량의 염을 포함하고, 질소 공급원이 약 0.3% 미만, 경우에 따라 약 0.03% 미만의 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
  19. 제 7 항에 있어서, 박테리아가 실질적으로 성장 또는 분화하지 않도록 유지시키기 위한 다수의 물질을 추가 포함하는 조성물.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 액체 1 ㎖ 당 약 10 7 내지 약 108 개의 상기 박테리 아의 콜로니 형성 단위를 포함하는 조성물.
  21. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 향미제 또는 식물 추출물을 추가 포함하는 조성물.
  22. 제 1 항에 있어서, pH 가 약 6.0 내지 약 7.0인 조성물.
  23. 제 14 항에 있어서, 상기 pH가 약 6.5인 조성물.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물을, 1회 투여 당 약 106 내지 약 1012 마리의 생존가능한 박테리아를 투여하기에 적합한 투여 형태로 포함하는 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 조성물을, 1일 약 1 내지 약 4 회 투여분으로 투여되기에 적합한 투여 형태로 포함하는 조성물.
  26. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아가 상기 액상 매질과 조합되기 전에 자가용해를 거치는 것인 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 자가용해는 기계적 교반, 낮은 삼투압 및 상기 현 탁액 중 박테리아의 밀도 변화로 이루어진 군에서 선택되는 기전을 통해 유발되는 것인 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 밀도가 ㎖ 당 약 1011 내지 약 1012 마리의 박테리아인 조성물.
  29. 제 26 항에 있어서, 상기 액상 매질이 상기 자가용해로부터 형성된 자가용해물을 포함하는 것인 조성물.
  30. 하기를 포함하는, 액상 촉생제 조성물의 제조 방법:
    복수의 박테리아를 성장시켜 성장 배지 중에 바이오매스를 형성시키는 단계;
    선택압에 따라 박테리아를 선택하는 단계; 및
    적어도 기초적인 생물학적 활성을 갖는 상기 박테리아를 일정 기간 보관 유지하는 단계.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 선택압이 온도 압력을 포함하는 것인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 온도 압력은 상기 박테리아를 약 36 내지 50℃의 온도로 처리하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 현탁 상태인 것인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 박테리아가 약 40℃의 상기 온도로 4 일 이상 처리되는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 상기 온도 압력은 상기 박테리아를 함유하는 매질의 온도를 저하시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 저하는 상기 온도를 약 1℃ 내지 약 12℃로 12 개월까지 저하시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 온도가 약 3 개월 이상 저하되는 방법.
  37. 제 30 항에 있어서, 상기 선택압은 보관 시간을 포함하고, 상기 박테리아는 약 1 개월 이상 보관되는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 박테리아가 약 12 개월까지 보관되는 방법.
  39. 제 30 항에 있어서, 상기 선택압이 삼투압을 포함하는 것인 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 선택압이 낮은 삼투압을 포함하는 것인 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 삼투압은 약 1 대기압 미만의 압력을 포함하는 것인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 삼투압은 약 0.3 내지 약 0.4 대기압의 압력을 포함하는 것인 방법.
  43. 제 30 항에 있어서, 하기를 추가 포함하는 방법:
    상기 성장 배지 및 억제제 인자로부터 상기 바이오매스를 분리하는 단계; 및
    상기 박테리아를 자가용해 처리하는 단계.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 자가용해는 기계적 교반, 삼투 변화, 낮은 삼투압 및 현탁액 중 상기 박테리아의 밀도의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 메커니즘을 통해 유발되는 것인 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 밀도는 ㎖ 당 약 1011 내지 약 1012 마리의 박테리아인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 박테리아를 액상 배지와 함께 보관하는 것을 포함 하고, 상기 액상 배지는 상기 자가용해로부터 형성된 자가용해물을 포함하는 것인 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 보관은 상기 액상 배지 중 상기 박테리아의 농도를 약 105 내지 약 1012 CFU로 조절하는 것을 포함하는 것인 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 농도는 약 107 내지 약 108 CFU인 방법.
  49. 제 30 항에 있어서, 상기 성장 배지는 고체 또는 액체 성장 배지를 포함하는 것인 방법.
  50. 제 30 항에 있어서, 상기 성장 배지는 효모 추출물을 포함하는 것인 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 효모 추출물은 리터 당 약 5 내지 약 25 그램의 양으로 존재하는 것인 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 효모 추출물은 리터 당 약 15 내지 약 20 그램의 양으로 존재하는 것인 방법.
  53. 제 30 항에 있어서, 하기를 추가 포함하는 방법:
    식물 물질을 분쇄하여 식물 추출물을 제조하고 상기 분쇄 물질을 증기 증류하는 단계; 및
    상기 식물 추출물을 상기 조성물에 첨가하는 단계.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 증기 증류는 감압 하에서 수행되는 것인 방법.
  55. 적어도 기초적인 생물학적 활성을 갖는 박테리아를 포함하는 액상 촉생제 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상의 치료 방법으로서, 상기 박테리아가 하나 이상의 선택압에 따라 선택된 것인 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 위장관 질환 또는 장애의 치료에 사용되는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 위장관 질환 또는 장애가 미생물 감염을 포함하는 것인 방법.
  58. 제 56 항에 있어서, 상기 위장관 질환 또는 장애가 염증성 장질환을 포함하는 것인 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 염증성 장질환이 크론씨 병, 궤양성 대장염, 부정 형 대장염, 미시적 대장염, 교원질성 대장염, 소장의 특발성 염증, 및 염증성 장질환 관련 설사로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 제 56 항에 있어서, 상기 위장관 질환 또는 장애가 살모넬라, 쉬겔라, 장독소원성 이. 콜라이 및 씨. 디피실 (C. difficile)로 이루어진 군으로부터 선택된 장내 병원체에 의해 유발되는 위-장 감염을 포함하는 것인 방법.
  61. 제 56 항에 있어서, 상기 위장관 질환 또는 장애는 음식물 중독, 소화불량 증상, 또는 급성 설사의 에피소드, 또는 알려지지 않은 병인의 미검출 병원체에 의해 유발되는 설사를 포함하는 것인 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 설사는 여행자 설사 및 병원 세팅 (hospital setting)에서의 설사를 포함하는 것인 방법.
  63. 제 55 항에 있어서, 장내 미생물총 (microflora)의 미생물 균형의 교란, 및/또는 소장내 박테리아 과다번식에 의해 유발되거나 유지되는 소화기관의 질환 및 장애를 치료하는 것을 포함하는 방법.
  64. 제 55 항에 있어서, 항생제 요법, 방사선 요법 또는 화학요법으로 인한 소화기관 미생물총의 미생물 균형의 교란, 소화기관의 외과적 수술을 포함한 소화기관 의 질환 또는 장애를 예방하거나 일정 수준 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  65. 제 55 항에 있어서, 소화기관 외의 질환, 특정 식이적 및 환경적 요인으로 인한 소화기관 미생물총의 미생물 균형의 교란을 예방하거나 치료하는 것을 포함하는 방법.
  66. 제 55 항에 있어서, 노인 및 면역약화된 (compromised) 환자의 위장관의 생리학적 활성을 개선시키거나 정상화시키는 것을 포함하는 방법.
  67. 제 55 항에 있어서, 상기 조성물은 경우에 따라 상기 박테리아 1 ㎖ 당 약 106 내지 1012 개의 콜로니 형성 단위를 포함하고, 바람직하게는 상기 박테리아 1 ㎖ 당 약 107 내지 108 개의 콜로니 형성 단위를 포함하는 것인 방법.
  68. 제 67 항에 있어서, 1일 약 106 내지 약 1012 마리의 상기 박테리아가 대상에게 투여되는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 1일 약 107 내지 약 109 마리의 상기 박테리아가 대상에게 투여되는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 1일 약 107 내지 약 108 마리의 상기 박테리아가 대상에게 투여되는 방법.
  71. 제 55 항에 있어서, 상기 조성물이 등장성 매질 중에 자가용해물을 포함하는 것인 방법.
  72. 제 55 항에 있어서, 상기 조성물이 부적합한 물질은 실질적으로 함유하지 않는 것인 방법.
  73. 제 55 항에 있어서, 다른 질환의 치료에 의해 부작용으로서 유발되는 장애를 포함하는 면역체계 장애를 앓는 대상에서의 면역체계의 개선 또는 정상화를 위한 방법.
  74. 제 55 항에 있어서, 가축의 치료에 사용되는 것인 방법.
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