KR100694820B1 - 박테리아 균주 및 인간 및 수의학적 사용을 위한 생균활성 조성물 - Google Patents
박테리아 균주 및 인간 및 수의학적 사용을 위한 생균활성 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
식물 추출물을 감압 하에 38℃ 이하의 베쓰 온도에서 증기 증류하여 제조한 식물 추출물의 휘발성 분획물(VF) 하나 이상을 포함하는 제제. 상기 추출물은 식물의 잎, 줄기, 뿌리 또는 과일에서 얻어질 수 있다. 상기 식물은 채소 또는 파슬리, 민트 또는 이논드와 같은 약초일 수 있다. 상기 채소는 대두, 알파파, 마늘, 사탕무 및 양배추일 수 있다. 본 발명의 제제는 밀랍 또는 다른 벌집 작물을 더 포함할 수 있다.
박테리아 균주, 식물 추출물, 휘발성 분획물, 생균활성 조성물
Description
본 발명은 비병원성 생균활성(probiotic) 미생물, 1종 이상의 식물 추출물로부터 제조된 휘발성 분획물(Volatile Fraction: VF)의 수용액을 포함하는 제제, 및 상기 생균활성 미생물 또는 상기 생균활성 미생물을 포함하는 상기 제제를 포함하는 생균활성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제제는 부유되어 있는 생균활성 미생물의 생존력을 냉장 상태에서 1년 이상 지속시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 제제는 동물의 체중 증가에 대한 효과가 향상되었다. 본 발명의 생균활성 미생물 및 조성물은 위장(GI)관에 유익하며 치료 활성을 갖는다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제제 및 생균활성 조성물을 제조하는 방법 및 그의 여러가지 용도에 관한 것이다.
정상 상태에서 위장(GI)관의 미생물총(微生物叢)은 개인의 건강과 복리에 크게 기여한다. 미생물총은 개인에게 유익한 효과와 유해한 효과를 모두 가질 수 있는 복잡하고 다양한 집단이다. 일반적으로, 자궁내 태아는 무균 상태이지만, 출산 중에 질을 통과하면서 소화관 미생물총을 형성하는 미생물을 획득하게 된다. 소화 관내 안정화되는 최종 토착 소화관 미생물총은 400 종의 다양한 박테리아로 이루어진, 수천개의 미생물의 매우 복잡한 집합체이다(Fuller R.J. Applied Bacteriology 66:365-378 (1989)). 미생물총의 조성은 숙주와 미생물 인자에 의해 결정되며, GI관 내에서 생존하여 생장할 수 있는 박테리아도 많지만, 생존할 수 없는 것도 많다. 생존 미생물은 그밖에도 통상적으로 음식물과 함께 박테리아가 씻겨 내려가는 연동운동 효과를 피해야 한다. 이는 박테리아가 스스로 소화관 벽에 부착되어 고정되거나 연동운동에 의해 제거되는 속도 보다 빠른 속도로 생장하여 이룩할 수 있다.
미생물총은 병원균에 의해 야기되는 감염으로부터 개인을 보호한다. 이 현상은 "박테리아 길항작용", "박테리아 간섭작용", "장벽 효과", "집락형성 저항(colonization resistance)", "경쟁적 배제" 및 그밖에 많은 이름으로 불리어왔다.
이러한 보호 미생물총은 매우 안정하다. 그러나 소아, 노인 및 저항력이 떨어지는 환자에게서는 효과가 떨어진다. 또한, 특정 음식물 및 환경적 요인에 영향을 받을 수 있는데, 그중 가장 중요한 세가지는 과다한 위생, 항생제 치료 및 스트레스이다.
소화관 미생물총의 균형에 좋치않은 영향을 미치는 조건 하에서는 생균활성제가 소화관 미생물총을 회복하고 개인 숙주를 정상으로 되돌리는데 매우 유용할 수 있다.
정장제는 동물 및 사람 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 세균성 미생 물로서 정의되는 일종의 미생물이다. 유익한 효과로는 장 미생물총의 세균 균형을 개선하거나 토착 미생물총의 특성을 개선하는 작용을 들 수 있다. 정장제의 유익한 효과는 특정 생물군에 대한 직접적인 길항 효과에 의해 그 수를 줄이거나, 물질 대사에 영향을 미치거나, 면역성을 자극하여 매개될 수 있다. 정장제는 항균성 화합물을 생성하거나, 영양소 또는 착상 부위를 경쟁함으로써 바람직하지 못한 생물의 생존수를 억제할 수 있다. 또한, 이들은 효소 활성을 증가시키거나 감소시켜 세균성 대사를 변경할 수도 있고 또는 항체 수준을 증가시키거나 대식세포 활성을 증가시켜 면역 체계를 자극할 수 있다.
본 발명은 E. coli(Escherichia coli, 에쉐리히아 콜리)로부터 유도된 신규한 비병원성 생균활성 미생물, 1종 이상의 식물 추출물로부터 제조된 휘발성 분획물(VF)의 수용액을 포함하는 제제, 및 상기 제제 중에 부유된 생균활성 생물을 포함하는 생균활성 조성물을 제공하고자 고안된 것이다.
국제출원 공개번호 제WO95/16461호에는 가축의 살모넬라 집락화를 제어하거나 억제하는데 효과적인 혐기성 박테리아 정장제 또는 조성물이 기재되어 있다. 이 정장제는 실질적으로 생물학적으로 순수한 박테리아 29종, 그 중에서도 E. coli 의 집단 또는 배양물이다. 그러나, 이 공보에 기재된 정장제 또는 조성물로 병원균을 억제하기 위해서는 많은 박테리아 균주의 통합된 작용이 요구된다.
국제출원 공개번호 제WO97/35596호에는 락토바실루스 로이테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)를 함유한 분 말을 액체와 혼합하여 얻어지는 새로이 제조되는 항균활성 혼합물의 투여 방법에 대해 기재되어 있다. 상기 혼합물은 인간에게서 나타나는 감염성 설사증 또는 항생제 치료에 의해 유발되는 설사증을 예방하는 데 효과적인 것으로 기재되어 있다. 그러나, 냉동건조시킨 살아있는 박테리아는 소생 상태에 있다. 그의 생명력을 회복시키기 위해서는 투여 전에 미생물을 적셔야하는 것이 문제가 되는데, 이는 통상적으로 많은 수의 박테리아가 재수화시 생존하지 못하기 때문이다. 또한, 생존 생물들도 즉시 대사적으로 활성을 갖지 못하며, 위의 극단적인 산성 조건에서 생존할 수 없다.
제제화를 통한 생균활성 생물의 생존력 유지 및 활성 보존 방법은 많은 공개문헌의 논점이 되어왔다. 국제출원 공개번호 제WO98/26787호에는 β-글루칸을, 임의로 선생물성(prebiotic) 및(또는) 생균활성 미생물과 배합하여 동물에게 제공함으로써 동물의 GI관 내 젖산 생성 미생물, 바람직하게는 락토바실리속 생물의 잔류 집단을 강화시키는 방법이 기재되어 있다.
국제출원 공개번호 제WO97/34591호에는 1종 이상의 생균활성 미생물의 단체로서 및 미생물의 생장 또는 보존 매질로서 작용하는 변성 또는 비변성 전분 또는 이들의 혼합물을 선택하여 개인에게 제공함으로써 미생물의 잔류 집단을 강화시키는 방법, 또는 개인의 GI관의 선택 부위에서 바람직한지 못한 잔류 집단을 억제하는 방법이 개시되어 있다. 담체에 결합된 생균활성 성분들이 GI관 중 대장 또는 다른 영역을 통과하는 중에 미생물을 보호 한다.
뜻밖에도 E. coli로부터 유도된 비병원성 생균활성 미생물 단일 종이 단독으 로 인간 및 다양한 동물 및 조류의 정상적인 GI 미생물총을 회복할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 미생물은 긴 시간 동안, 다양한 식물 추출물의 휘발성 분획물(들)의 수용액을 포함하는 제제 중에, 생존 및 신진대사적 활성 형태로 보존될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 제제 중에 생균활성 생물을 포함하는 생균활성 조성물은 각종 위장 장애의 치료 및 예방에 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
그 밖에도, 상기 제제는 그 자체로 체중 증가 증강제 및 포유 동물 및 조류에서 면역 자극제로서 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 비병원성 생균활성 미생물, 이른바, E. coli 균주 BU230-98(ATCC 기탁번호 제202226호)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 1종 이상의 식물 추출물로부터 제조된 휘발성 분획물(VF)의 수용액을 포함하는 제제에 관한 것이다. 식물 추출물의 휘발성 분획물은 상기 식물을 감압 하에 38℃ 이하의 베쓰 온도에서 증기 증류시켜 제조한다.
본 발명의 제제에 사용되는 식물 재료는 모든 과일, 채소, 잎, 줄기 또는 뿌리가 적합할 수 있으며, 사과, 감귤류 과일, 콩, 사탕무, 파슬리, 민트, 이논드, 마늘, 알파파 및 양배추가 바람직하다.
본 발명의 제제는 체중 증가를 촉진시키는 활성을 갖는 수의학적 제제 및 식품/사료 첨가제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 제제는 또한 생균활성 미생물의 부유 매질로서 사용될 수도 있다. 냉장 하에서, 본 발명의 제제는 그 중에 부유되 어 있는 생균활성 미생물의 생존력을 1년 이상 지속시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "식품/사료 첨가제"는 사람에게 사용하기 위한 식품 첨가제 또는 영양학적 첨가제, 또는 기타 사육 동물 뿐만 아니라 가축 및 가금류에 사용되는 사료 첨가제 또는 영양학적 첨가제를 의미하는 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제제 중에 부유된 세균성 미생물(들)을 포함하는 생균활성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 생균활성 조성물은 GI관에서 유익한 생물학적 활성 및 치료 효과를 가지며, 또한, 본 발명의 생균활성 조성물은 앞서 언급한 바와 같이, 식품/사료 첨가제로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품/사료 첨가제는 본 발명의 제제이거나 또는 조성물이거나 간에 매우 다양한 용도로 사용될 수 있는데, 그 중에 특히 위소장 감염을 예방하거나 치료하고, 감염성 설사증, 만성 설사증 또는 감염, 항생제 또는 화학 요법에 의해 유발되는 설사증을 치료하거나 예방하고, 소장결장염을 치료하고, GI 미생물총을 회복하는데 효과적이고, 소화불량 증상을 치료하고, 체중 증가를 촉진하고, 환자의 면역 체계를 자극하고, 상기의 질환을 앓고 있는 환자의 락토즈 불내성을 완화하고, GI 음식물 신진대사를 정상화하고, 변비를 치료하고(하거나) 혈중 콜레스테롤 수준을 저하시키는 것을 들 수 있다.
또 다른 양면에서, 본 발명은 식물 추출물의 휘발성 분획물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 식물 재료를 분쇄하여 바이오매스(biomass)를 얻는 단계; (b) 특정 비율, 바람직하게는 식물 바이오매스 1 중량부에 대해 물 3 중량부의 비율로 물과 혼합하고 혼합물을 주변 온도에서 2시간 이상 교반하는 단계; (c) 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 감압 하에 38℃ 이하의 베쓰 온도에서 증류시키는 단계; 및 (d) 휘발성 분획물을 수거하는 단계를 포함하며, 상기 얻어진 분획물은 적합한 완충제로 더 희석시킬 수 있다. 분획물 자체가 본 발명의 제제를 구성할 수 있다.
본 발명은 또한 각종 식물 추출물의 몇몇 휘발성 분획물들을 혼합하고, 임의로 그들을 물, 및 적합한 첨가제, 보조제 또는 담체와 혼합하여 본 발명의 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GI관에서 유익한 생물학적 활성 및(또는) 치료 활성을 갖는 1종 이상의 생존가능한 생균활성 미생물을 상기 본 발명의 방법에 의해 얻은 휘발성 분획물 중에 또는 그러한 몇몇 휘발성 분획물들의 혼합물 중에 부유시켜 생균활성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명의 제제, 식품/사료 첨가제 및 생균활성 조성물의 제조에 있어서 식물 추출물의 하나 이상의 휘발성 분획물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 GI관에서 유익한 생리학적 및(또는) 치료 활성을 가지며 ATCC에 기탁 번호 제202226호로 기탁되고 DSMZ에 기탁번호 제12799호로 기탁된 E. coli로부터 유도된 비병원성 박테리아인 생균활성 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식물 추출물을 감압 하에 38℃ 이하의 베쓰 온도에서 증류시켜 제조한 식물 추출물의 하나 이상의 휘발성 분획물을 포함하는 제제에 관한 것이다.
휘발성 분획물을 얻을 수 있는 식물 재료는 과일, 잎, 줄기 또는 뿌리와 같은 적합한 식물 부분일 수 있다. 많은 식물들이 휘발성 분획물의 공급원으로 적합하며, 그 예로는 파슬리, 민트 및 이논드와 같은 약초 뿐만 아니라 사과, 감귤류, 대두, 사탕무, 양배추, 마늘 및 알파파를 들 수 있다. 본 발명의 제제는 임의로 꿀, 밀랍 또는 다른 벌집 생산물과 같은 양봉 작물의 분획물을 적당량 더 포함할 수 있으며, 이러한 분획물은 식물 추출물로부터 휘발성 분획물을 얻는 것과 관련하여 기재한 것과 동일한 방식으로 제조할 수 있다.
이후 실시예에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명의 제제는 그 자체로 식품/사료 첨가제로 사용될 수 있다. 본 발명의 발명자들은 본 발명의 제제가 체중 증가 촉진 활성을 가짐을 발견하였으며, 이는 본 발명의 일 양면을 구성한다. 본 발명의 이 양면의 특정 실시양태에 따르면, 동물 체중 증가 촉진 제제 또는 사료 첨가제는 증류수 및 알파파, 대두, 사탕무 및 이논드의 휘발성 분획물들을 포함하며, 상기 휘발성 분획물들의 부피비는 2:8:1:4가 바람직하다.
또 다른 양면에서, 본 발명은 본 발명의 제제 및 GI관에서 치료 또는 유익한 생물 활성을 갖는 생존가능한 생균활성 미생물 1종 이상을 포함하는 생균활성 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 생균활성 조성물의 구체적인 잇점은 이것이 액상 제제라는 사실에서 유래한다. 생물학적 활성 상태에서, 본 발명의 제제는 또한 박테리아가 혐기성 상태인 동결건조 제제에 반해, 살아있는 박테리아를 부양하는 배지로서 사용될 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 생균활성 조성물은 경구 투여된 후, 대부분의 장 병 원균의 일차적 효과가 나타나 유해 위소장 증후군의 발병을 야기시키는 GI관의 상부에서부터 즉시 활성을 보이기 시작한다. 본 발명의 생균활성 조성물은 또한 체중증가용 제제 또는 식품/사료 첨가제로서 사용될 수도 있다.
균주 BU-230-98(ATCC 기탁번호 제202226호, DSM 기탁번호 제12799호)에 속하는 박테리아 이외의 것을 본 발명의 제제와 사용할 수 있음을 양지해야 한다. 그러한 박테리아는 매우 광범위한 길항 활성을 갖는다. 그들은 또한 대부분의 장 병원균과 계통발생적으로 동일한 군에 속하며, 동일한 생존 체제를 공유한다. 따라서, 장 병원균의 억제 및 배제는 매우 다양한 메카니즘, 예를 들면, 길항성 물질의 분비, 영양소 이용을 위한 경쟁 및 부착 수용체를 위한 경쟁을 포함한다. 그러므로, 이러한 기준에 부합되는 비병원성 박테리아는 본 발명의 생균활성 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양면에 따르면, 본 발명의 생균활성 조성물은 위소장 감염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "위소장 감염"은 장 병원균, 그 중에서도, 그램 음성 및 그램 양성 박테리아에 의해 유발되는 모든 감염을 의미한다. 본 발명의 제제 및 생균활성 조성물은 GI관의 전체적인 균형 및 건강을 개선함으로써, 효모, 바이러스 및 원생동물들에 의해 유발되는 GI 감염의 예방에 도움이 될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 또는 유효량"은 당 분야에 공지된 사항들을 고려하여 결정되는 양이다. GI 미생물총의 효과적으로 회복함으로써 GI 관의 기능을 정상화할 수 있는 데 충분해야 한다.
특정 실시양태에서, 위소장 감염의 발병을 예방하기 위한 본 발명의 생균활성 조성물은 증류수와 앞서 정의한 바와 같이 알파파, 대두, 사탕무, 이논드 및 민트의 분획물의 혼합물(부피비 5:1:5:15:1)로 형성된 본 발명의 제제 및 치료 유효량의 생균활성 박테리아, 예를 들면, E. coli ATCC 기탁 번호 제202226호(DSM 12799와 동일)를 포함한다.
위소장 감염의 구체적인 예는 살모넬라에 의해 유발되는 감염이며, 본 발명은 그에 의해 유발되는 위소장 감염의 예방 또는 치료에 특히 유리하다.
또한, 본 발명의 식품 첨가제 또는 제제는 단독으로 또는 유효량의 생균활성 미생물, 예를 들면, E. coli ATCC 기탁 번호 제202226호(DSM 12799와 동일)와의 배합물로서 감염성 설사증, 만성 설사증 또는 항생제 또는 화학 요법에 의해 유발되는 설사증을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에 따르면, 감염성 설사증을 치료하기 위한 생균활성 조성물은 증류수와 알파파, 대두, 사탕무, 이논드 및 민트의 분획물의 혼합물(부피비 5:1:5:15:1), 및 치료 유효량의 ATCC 기탁 번호 제202226호(DSM 12799와 동일)를 포함할 수 있다.
감염성 설사증은 여러가지 요인에 의해 유발될 수 있으며, 예를 들면, 클로스트리듐 디피실(C. difficile), 살모넬라(Salmonella), 특히 살모넬라 시겔라(S. Shigella), 캄필로박터(Campylobacter)속, E. coli, 프로테우스(Proteus)속, 수도모나스(Pseudomonas)속, 클로스트리듐(Clostridium)속, 장 포도구균(Staphylococcus) 중에서 선택되는 미생물에 의해 유발될 수 있다. 상기 는 많은 감염성 작용균 중 일부일 뿐이다.
또한, 본 발명의 생균활성 조성물은 GI관 미생물총의 회복을 위한 치료를 필요로 하는 환자에게 사용되어 GI관의 기능을 정상화하는데 효과적일 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들면, 증류수와 알파파, 대두, 사탕무, 이논드, 민트, 파슬리 및 양배추의 분획물들, 바람직하게는 분획물들의 1:5:5:2:2:1 혼합물 및 치료 유효량의 생균활성 박테리아 ATCC 기탁 번호 제202226호(DSM 12799)를 포함할 수 있다.
GI관에서 치료 효과를 갖는 1종 이상의 정장제를 포함하는 본 발명의 생균활성 조성물의 다른 용도로는 락토즈 불내성으로 고생하는 환자의 락토즈 불내성 완화, 소장결장염의 치료, 변비 치료, 혈중 콜레스테롤 수준의 저하, 소화불량 증후군의 치료 및(또는) 면역 억제 요법으로 인한 면역 장애일 수 있는 면역 체계 질환으로 고생하는 환자의 면역 체계 자극을 들 수 있다.
다른 양면에서, 본 발명은 (a) 식물 재료를 분쇄하여 바이오매스(biomass)를 얻는 단계; (b) 단계 (a)에서 얻은 식물 바이오매스를 물과 특정 비율, 바람직하게는 식물 바이오매스 1 중량부에 대해 물 3 중량부의 비율로 물과 혼합하고 혼합물을 주변 온도에서 2시간 이상 교반하는 단계; (c) 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 감압 하에 38℃ 이하의 베쓰 온도에서 증류시키는 단계; (d) 상기 증기 증류에 의해 얻은 휘발성 분획물을 수거하고, 상기 얻어진 분획물을 적합한 완충제로 더 희석시킬 수 있는 단계를 포함하는 식물 추출물의 휘발성 분획물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 휘발성 분획물을 물과 혼합하면 본 발명의 식품/사료 첨가제 또는 제제를 제공할 수 있다. 본 발명의 식품/사료 첨가제 또는 제제는 또한 본 발명의 방법에 의해 얻은 1종 이상의 식물 휘발성 분획물을 혼합하여 제조할 수 있다. 이 혼합물은 추가로 물과 혼합될 수 있다.
휘발성 분획물은 임의의 적합한 과일, 채소, 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리일 수 있다. 식물은 예를 들면, 사과, 감귤류, 대두, 사탕무, 마늘, 양배추 또는 알파파, 또는 파슬리, 민트 또는 이논드와 같은 약초일 수 있다. 적합하다면, 본 발명의 제제는 꿀 또는 밀랍 또는 다른 벌집 생산물과 같은 양봉 작물에서 얻은 휘발성 분획물을 더 포함할 수 있다. 이러한 휘발성 분획물은 식물 추출물의 휘발성 분획물과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 증류 단계는 5 내지 10 mbar의 감압 하에 수행하는 것이 바람직하다.
앞서 지적한 바와 같이, 본 발명의 식품/사료 첨가제 또는 제제는 1종 이상의 정장제와 배합되어 본 발명의 생균활성 조성물을 제공할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 제조 방법은 또한 GI관에서 유익한 치료 활성을 갖는 1종 이상의 생존가능한 생균활성 미생물을 상기 본 발명의 방법 중 단계 (d)에서 얻은 휘발성 분획물 중에 또는 상기 기재한 바와 같이 얻은 그러한 휘발성 분획물들의 혼합물 중에 부유시키는 단계를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 특정 제조 방법에 따르면, 부유되어 있는 생균활성 미생물은 E. coli로부터 유도되고, 기탁번호 제202226호로 ATCC(및 기탁번호 제12799호로 DSM)에 기탁되어 있는 본 발명의 신규한 박테리아일 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 식품/사료 첨가제의 제조에 있어서 식물 추출물의 휘발성 분획물(VF)의 용도에 관한 것으로, VF는 식물 추출물 또는 꿀 또는 밀랍과 같은 양봉 작물 추출물을 38℃ 이하의 베쓰 온도에서 증기 증류하여 제조한다.
본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되고, 그 내용은 명세서의 개시 내용에 포함되는 것으로 해석되어야 하며, 이제부터는 하기 실시예를 통해 보다 상세하게 설명할 것이다.
상기 설명은 본 발명의 몇몇 구체적인 실시태양만을 상세하게 설명한 것이며, 당업자라면, 본 발명이 그에 제한되지 않고, 다른 구성의 변형이 본원에 개시된 본 발명의 사상을 벗어나지않고 이루어질 수 있음을 인정할 것이다.
실시예 1
식물 추출물 또는 양봉 작물로부터 얻은 추출물의 휘발성 분획물 제조
시장에서 구입한 신선한 채소를 수돗물로 깨끗이 세척하고, 잘게 썰고, 산업용 블렌더로 곱게 분쇄하였다. 얻어진 식물성 바이오 매스에 증류수를 식물성 바이오 1 중량부 당 물 3 중량부의 비율로 첨가하고, 주변 온도에서 2 시간 이상 동안 교반하며 방치하였다.
이어서, 혼합물을 회전식 증발기의 증발 플라스크에 옮기고, 감압(5-10 mbar) 하에 수조의 온도가 38℃를 넘지않고 응축기 유입구의 온도는 2 내지 5℃인 조건으로 증발시켰다. 식물성 바이오매스 1 ㎏ 당 약 2.5 ℓ의 농축물(휘발성 분획물)을 회수하였다. 이 물질은 그의 특성을 상실하지 않고 6 개월 이상 냉장고에 보존될 수 있었다.
식물성 재료를 꿀 또는 밀랍과 같은 양봉 작물로 대체하여 동일한 절차를 수행할 수 있다.
통상적으로, 단일종의 채소로부터 각각의 "휘발성 분획물"을 제조하여 다양한 용도의 여러 혼합물을 제조하기 위해 여러 희석물에 사용하였다.
실시예 2
생균활성 미생물인 E. coli(ATCC 기탁 번호 제202226호)의 생장
생균활성 미생물 E. coli(ATCC에 1999년 5월 3일자로 기탁 번호 제202226호로 기탁되고 DSM에 1999년 5월 4일자로 기탁번호 제12799호로 기탁됨)을 다음의 배지 중에서 생장시켰다: (NH4)2SO4 5 g/ℓ, KH2PO4 13 g/ℓ, Na2HPO4 13 g/ℓ, MgCl2 3 g/ℓ, CaCl2 0.3 g/ℓ, 효모 추출물 10 g/ℓ, 콩 펩톤 10 g/ℓ, 글루코즈 5 g/ℓ. 배양물을 생장시킨 후, 추가 영양분(효모 추출물 1 g/ℓ, 콩 펩톤 2.5 g/ℓ, 글루코즈 90 g/ℓ)을 발효 육즙 중의 글루코즈 농도가 2 g/ℓ 수준에 유지되도록 연속해서 첨가하였다. 발효 육즙의 pH는 4N NH4OH를 계속해서 첨가하여 중성으로 유지하였다. 배양은 배양물이 융합되면 표준 발효 용기 내 30℃에서 0.5 vvm으로 통기하며 16 시간 동안 수행하였다. 이 절차를 완결한 후, 1010 내지 1011 세포/㎖를 얻었다. E. coli 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 생리염수 중에 재부유시키고, 재침전시켰다. 이 세균성 바이오매스는 생존력을 잃지 않고 48 시간 동안 냉장고에 보존될 수 있었다.
실시예 3
조류 및 동물에서 체중 증가를 가속화하기 위한 식품/사료 첨가제 제제의 제조
혼합물은 알파파 50 ㎖/ℓ, 대두 200 ㎖/ℓ, 사탕무 25 ㎖/ℓ 및 이논드 100 ㎖/ℓ의 휘발성 분획물을 함유하였다. 증류수를 첨가하여 1 ℓ가 되게하였다.
실시예 4
인간 GI관의 기능을 정상화하기 위한 식품 보강제의 제조
혼합물은 알파파 50 ㎖/ℓ, 대두 10 ㎖/ℓ, 사탕무 50 ㎖/ℓ, 이논드 50 ㎖/ℓ, 민트 20 ㎖/ℓ, 파슬리 20 ㎖/ℓ 및 양배추 10 ㎖/ℓ의 휘발성 분획물을 함유하였다. 증류수를 첨가하여 1 ℓ가 되게하였다. E. coli (ATCC 202226) 세포(실시예 3)를 107 세포/㎖의 세포 농도로 혼합물 중에 부유시켰다. 맛을 개선하기 위해 임의로 NaCl(4 내지 g/ℓ)을 첨가할 수 있다.
실시예 5
조류 및 동물의 GI 감염 예방을 위한 사료 첨가제 제제의 제조
혼합물은 알파파 50 ㎖/ℓ, 대두 10 ㎖/ℓ, 사탕무 50 ㎖/ℓ, 이논드 150 ㎖/ℓ 및 민트 20 ㎖/ℓ의 휘발성 분획물을 함유하였다. 증류수를 첨가하여 1 ℓ가 되게하였다. E. coli (ATCC 202226) 세포(실시예 2)를 107 세포/㎖의 세포 농도로 혼합물 중에 부유시켰다. 맛을 개선하기 위해 임의로 NaCl(4 내지 g/ℓ)을 첨가할 수 있다.
실시예 6
살모넬라 티피미리움(ATCC 14028)에 대한 E. coli(ATCC202226)의 길항 활성
살모넬라에 대한 선택적 생장 배지인 변성 브릴리언트 그린 아가(Brilliant Green Agar)를 함유한 페트리 플레이트를 살모넬라 티피미리움(S. typhimirium)으로 접종하였다. 배지에 직경 9 ㎜ 웰을 만들었다. 일정 부피의 식품 보강제(실시예 4)를 각각의 웰에 퇴적시키고, 플레이트를 24 시간 동안 35℃에서 인큐베이션시켰다. 식품 보강제 없이 동일한 절차를 반복하고, 세균 여과막(공극 크기 0.45 ㎛)를 통해 여과하여 얻어진 여액을 웰에 퇴적시켰다.
식품 첨가제를 함유한 각각의 웰 주변에 살모넬라 티피미리움 집락이 없는 억제 대역(10 내지 17 ㎜)이 관찰되었다. 생균활성 생물이 없는 여액을 함유한 웰 주변에서는 억제 대역이 관찰되지 않았다.
실시예 7
시겔라종에 대한 E. coli ATCC 202226 및 그의 모균주 E. coli M-17의 길항 활성
살모넬라 플렉스네리(S. flexneri), 살모넬라 손네이(S. sonnei), E. coli(ATCC 202226) 및 M-17을 37℃의 영양 배지 상에서 18 내지 20 시간 동안 따로 따로 생장시켰다. 모든 배양물을 생리염수 중에 수확하고, 10 Klett 단위의 광학 밀도록 희석시켰다. 시겔라 종의 희석 배양물 일부(1 ㎖)를 단독으로 또는 E. coli(ATCC 202226)의 희석 배양물과 배합하여 영양 육즙(5 ㎖)이 담긴 통기컵 검사 튜브에 씨딩하였다. 튜브를 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양물을 영양 배지 상에 플레이팅하여 병원균과 E. coli(ATCC 202226)의 집락 형성 단위 수(CFU)를 결정하였다. 순수한 배양물 및 두 생균활성 E. coli종과 혼합된 배양물 중에서 시겔라 종의 CFU 수를 표 1에 나타내었다.
생균활성 생물 | 시겔라 CFU의 생장/㎖ | |
살모넬라 플렉스네리 | 살모넬라 손넬 | |
E. coli ATCC 202226 | <5 x 104 | <5 x 104 |
E. coli M-17 | 1 x 106 | 2 x 106 |
순수한 시겔라 배양물 | 6 x 106 | 2 x 106 |
실시예 8
입원 치료중인 위소장염 환자에 대한 식품 보강제(실시예 4) 및 콜리박테린(E. coli M-17의 건조 제제)의 적용
입원 후 위소장염이 발병한 60명의 환자 군을 성별, 연령 및 위소장염 증상의 심도가 비슷한 분포를 갖는 3개 하위군으로 무작위로 나누었다. 모든 환자들은 정상적인 지지 치료, 수분보급, 비타민 등을 받았다. 항생제 치료가 요구되지 않는 정도의 상태였다. 첫번째 20 명의 환자들은 7일 동안 하루에 3회 식사 전 30 분에 식품 보강제(실시예 5) 10 ㎖를 투여받았다. 두번째 군은 콜리박테린(콜리박테리눔 시쿰)을 생산자가 권장하는대로(식사전 30분에 하루 2회 1 투여량) 투여받고, 세번째 군은 보강제를 전혀 투여받지 않았다. 모든 군에서 위소장염의 증상이 정상화되기 시작하는 시점(일수)을 기록하여 표 2에 나타내었다.
증상 | 증상이 정상화되는 일수 | ||
식품 보강제 | 콜리박테린 | 대조군 | |
체온 | 2.8 ± 0.2 | 2.7 ± 0.2 | 3.7 ± 0.2 |
중독 | 2.5 ± 0.1 | 3.6 ± 0.1 | 4.6 ± 0.1 |
복부 통증 | 3.3 ± 0.2 | 5.1 ± 0.2 | 6.1 ± 0.2 |
설사증 | 1.8 ± 0.2 | 3.4 ± 0.2 | 4.4 ± 0.2 |
콜리박테린(콜리박테리눔 시쿰)은 BIOMED Ltd.(러시아 모스코바)가 생산한 살아있는 E. coli M-17의 냉동건조 제제로 설사증에 대한 사용이 권장되고 있다([Vidal Handbook: Pharmaceutical preparations in Russia (N.B. Nikolaeva, B.P. Alperovich and V.N. Sovinov, Eds.) AstraPharmaService, 1997, Moscow, p. 275] 참조).
실시예 9
급성 GI 감염에 걸린 환자에 대한 식품 보강제(실시예 4)의 적용
환자들은 다양한 병인에 의한 심각한 GI 감염을 보였다:살모넬라증, 대장균 감염, 시겔라증, 포도구균 감염 및 미지의 병인에 의한 식중독. 입원가료된 모든 환자들에서 질환의 급성 개시와 급성 위소장염이 나타났다. 총 186명의 환자를 식품 보강제로 치료하고, 102명의 유사군은 표준 치료를 받았다.
모든 군에서 위소장염 증상이 정상화되는 시점(일수)를 기록하여 표 3에 나타내었다.
증상 | 정상화되는 일수 | |
처리군 | 대조군 | |
체열 | 1.2 ± 0.3 | 2.7 ± 0.3 |
허약도 | 1.6 ± 0.2 | 2.9 ± 0.3 |
복부통증 | 1.5 ± 0.2 | 2.4 ± 0.3 |
설사증 | 2.3 ± 0.2 | 4.7 ± 0.4 |
입원일수 | 4.8 ± 0.3 | 6.7 ± 0.4 |
별개의 조사에서, 장 장티푸스에 걸린 30 명 환자를 식품 보강제로 치료하였 다. 환자의 80%에서 질병의 증상이 3일만에 사라졌다. 3개에 사례에서만이 더 심각한 만성 대장염이 발병하여 보강 치료를 중단하였다.
실시예 10
항생제로 인한 GI 질환에 걸린 환자에 대한 식품 보강제(실시예 4)의 적용
심각한 GI 질환에 걸린 환자를 두 군으로 나누었다. I 군은 헬리코박터 파일로리(H. pylori)에 대한 항생제 치료 후 GI 질환이 발병한 소화성 궤양 질병에 걸린 환자 48명으로 이루어졌다. II 군은 폐렴의 항생제 치료 후 GI 질환이 발병한 환자 22명으로 이루어졌다. 식품 보강제(5 ㎖)를 7일 동안 하루에 3회 식사전에 제공되었다. 두 군 모두에서 모든 환자들의 설사 증상이 2 내지 3일 만에 사라졌다. 환자의 84.5%에서 보강제를 투여한 후 장 미생물총이 완전히 정상화된 것으로 관찰되었다. 락토바실루스(Lactobacilus) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria)가 급격히 증가하고, 전체적인 E. coli 수가 감소하고, 용혈성 E. coli와 스타피로코시(Staphylococci), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 심지어 칸디다(Candida) 종과 같은 기타 병원균이 완전히 사라지는 것으로 증명되었다. 나머지 15.5%의 환자에게서는 유의적 개선이 관찰되었다.
실시예 11
말기 소장결장염에 걸린 환자에 대한 식품 보강제(실시예 5)의 적용
방사선 요법 또는 방사선 및 화학요법을 병용한 후 소장결장염이 발병한 자궁, 결장 및 위암 환자 24명에게 식품 보강제를 투여하였다(10 ㎖, 14일 동안 하루에 3회, 식사전 30분).
식품 보강제를 사용하기 전, 모든 환자들은 빈번하고 고통스런 배변감을 호소했으며, 변 중에 점액질(9 사례)과 혈액(3 사례)이 나타나는 액상의 변(하루에 4 내지 12회)을 보았다.
보강제를 섭취한 고 2 또는 3일 후에, 모든 환자들에게서 통증이 약해지고, 배변 횟수가 감소된 것을 알 수 있었고, 변은 정상적인 외양을 보였다. 4 내지 5일 후 설사 증상이 사라졌으며, 혈액과 점액질이 보이던 것도 없어졌다. 혈액 분석에서 혈액 지표가 크게 개선된 것으로 나타났다.
유사한 크기의 대조군에서는 증상이 지속되었다.
실시예 12
AIDS 환자에 대한 식품 보강제(실시예 4)의 적용
AIDS에 걸린 환자들에게서는 빈번하게 만성 설사증이 발병한다. 이러한 환자 군에게 식품 보강제(실시예 5) 10 ㎖를 20일 동안 하루에 3회 식사전 30 분에 섭취하게 하였다. 대조군은 보강제를 섭취하지 않았다. 치료 결과를 표 4에 나타내었다.
변수 | 식품 보강제 처리군 | 대조군 |
환자 인원 | 30 | 20 |
평균 연령 | 38 ± 1 | 36 ± 2 |
1일 배변 회수 | ||
실험 초기 | 3.4 ± 0.3 | 3.6 ± 0.3 |
실험 말기 | 1.1 ± 0.1 | 3.2 ± 0.3 |
실험 후 1개월 | 1.5 ± 0.2 | 3.7 ± 0.3 |
평균적인 정상화 시점 | 6.0 ± 0.7 | 비정상 상태 유지 |
식품 보강제를 투여받은 환자들은 대장균군의 전체적인 수가 감소하고, 용혈성 E. coli가 사라지고, 락토바실리와 비피도박테리아의 수가 증가되며, 칸디다 종 이 감소되는 등 장 미생물총의 정상화를 보였다:
실시예 13
건강한 돼지 새끼에 대한 체중 증가 가속을 위한 식품/사료 첨가제의 적용
건강한 돼지 새끼에게 마리당 하루에 3 ㎖ 씩의 식품/사료 첨가제를 젖을 뗄때까지 경구 투여하였다. 젖을 뗄 무렵, 사료 첨가제를 투여받은 군은 대조군 보다 마리 당 평균 1.0 ㎏의 체중이 더 나갔다.
실시예 14
건강한 돼지 새끼에 대한 사료 첨가제(실시예 5)의 적용
건강한 수백마리의 돼지 새끼에게 출산 후 첫번째 날과 세번째 날 그리고, 젖을 뗄 무렵에 마리당 3 ㎖의 사료 첨가제를 경구투여하였다. 항생제를 함유한 표준 예방치료를 받은 대조군과 비교하여 사망율이 50% 감소하였다. 사료 첨가제를 투여받은 군은 젖을 뗄 무렵, 대조군 보다 마리 당 평균 0.39 ㎏의 체중이 더 나갔다. 사료 첨가제와 항생제 치료를 한배 새끼들에서 비교했을 때, 사료 첨가제를 투여받은 돼지 새끼의 체중 증가가 대조군 보다 2.4 ㎏ 더 큰 것으로 나타났다.
실시예 15
설사증을 보이는 돼지 새끼에 대한 사료 첨가제(실시예 4)의 적용
설사증을 보이는 수백마리의 돼지 새끼에게 매일 마리당 5 ㎖ 씩의 사료 첨가제를 경구 투여하였다. 동일한 크기의 대조군은 애드보신(advocin), 젠티아마이신(gentiamycin), 아목시실린(amoxicillin)의 항생제로 처리하였다. 사료 첨가제를 투여받은 군에서 설사 증상이 1 내지 2일 안에 사라졌다. 사망자는 없었고, 새 끼 돼지들은 정상적으로 발육하였다. 항생제는 대부분의 돼지 새끼에서 설사증을 멈추었지만 이 돼지 새끼들은 발육이 늦었다.
일주일 동안 설사증에 대한 항생제를 처리하고, 그 증상이 대체로 사라진것으로 보이는 약 70 마리의 발육이 늦은 돼지 새끼에게 3일 동안 사료 첨가제를 투여하였다. 두마리를 제외한 모든 돼지 새끼가 살아남았다.
실시예 16
건강한 송아지에 대한 사료 첨가제(실시예 4)의 적용
생후 1일된 건강한 송아지에게 7일 동안 하루에 5 ㎖ 씩의 사료 첨가제를 우유와 함께 투여하였다. 95% 이상의 송아지가 생후 14일 까지 설사증을 보이지 않았으며, 일부가 로타바이러스에 대해 양성으로 진단되었다.
실시예 17
설사증을 보이는 송아지에 대한 사료 첨가제(실시예 6)의 적용
설사증을 보이는 송아지에게 3 내지 5일 동안 매일 마리 당 10 ㎖ 씩의 사료 첨가제를 우유와 함께 투여하였다. 90 내지 95%의 송아지에서 1 내지 2일 안에 설사 증상이 사라졌다. 나머지 5 내지 10%는 설사증이 바이러스에 의해 유발된 것이었다. 이러한 송아지들은 항생제로 처리하였으며, 결과가 좋지 않았다.
실시예 18
건강한 양 및 염소 새끼에 대한 사료 첨가제(실시예 6)의 적용
생후 1일된 건강한 양 및 염소 새끼에게 7일 동안 하루에 3 ㎖ 씩의 사료 첨가제를 우유와 함께 투여하였다. 일부에서 약간의 미약한 설사증이 관찰되었다. 이러한 징후는 보통 자발적으로 사라지거나 사료 첨가제의 양을 증가시켜 처리하면(5 ㎖) 해결되었다.
실시예 19
설사증을 보이는 양 및 염소 새끼에 대한 사료 첨가제(실시예 5)의 적용
병원성 E. coli에 감염된 무리에 대해 사료 첨가제를 검사하였다. 실험 전 해에, 약 90 내지 120 마리의 양과 염소 새끼가 설사증으로 죽었다. 질병이 갑작스럽게 발병하고, 빠른 시일 내에 사망하였기 때문에 항생체 치료가 효과가 없었다. 설사증을 보이는 양 및 염소 새끼에게 3 내지 5일 동안 매일 마리 당 5 ㎖ 씩의 사료 첨가제를 우유와 함께 투여하였다. 그에 맞는 동물 군은 통상적으로 권장되는 항생제로 처리하였다. 사료 첨가제를 투여받은 양 및 염소 새끼의 약 90%에서 1 내지 2일 내에 설사 증상이 사라졌다. 발육 상태는 정상으로 나타났다. 항생제(젠타마이신, gentamycin)를 투여받은 대조군은 매우 불량한 결과를 보였다. 이 군에서는 설사증이 지속되어 반복적인 항생제 치료가 요구되었다. 대조군의 발육은 지연도가 심각하였다.
실시예 20
가금류에 대한 사료 첨가제(실시예 5)의 적용
부화 기간(42 내지 49일) 동안 닭 한마리당 하루에 평균 0.01 ㎖의 첨가제를 섭취하도록 마시는 물에 첨가하였다. 체중 증가율이 3.2% 증가된 것과 더불어 영계의 대조군 실험에서 사료 전환율이 4% 개선된 것으로 나타났다.
1일 내지 6주된 칠면조에서도 우수한 결과를 얻었다. 각각의 칠면조에게 하 루에 0.01 ㎖ 씩의 첨가제를 투여하였다. 체중 증가율이 10% 이상 증가되었으며, 사망율은 감소하였다. 여전히 설사증을 보이는 새들을 어떠한 항생제 처리 없이 하루에 사료 첨가제 0.1 ㎖로 처리하였을 때 항생제만으로 처리한 대조군 보다 회복율이 더 우수하였다.
실시예 21
개와 고양이에 대한 사료 첨가제(실시예 5)의 적용
강아지에게 사료 첨가제를 먹이면 24 내지 48 시간 내에 설사 증상이 멈추었다.
Claims (47)
- ATCC 기탁번호 제202226호(DSM12799)의 에쉐리히아 콜리(Escherichia coli) 균주 BU-230-98.
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- 제 1 항의 에쉐리히아 콜리(Escherichia coli) 균주 BU-230-98를 가지는 생균활성(probiotic) 조성물.
- 식물 추출물의 휘발성 분획물 하나 이상과 에쉐리히아 콜리(Escherichia coli) 균주 BU-230-98(ATCC 기탁번호 제202226호)을 포함하는 생균활성(probiotic) 조성물을 제조하는 방법으로서,(a) 식물 재료를 분쇄하여 바이오매스(biomass)를 얻는 단계;(b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 바이오매스를, 바이오매스 1 중량부에 대해 물 3 중량부의 비율로 물과 혼합하고, 혼합물을 주변 온도에서 2시간 이상 교반하는 단계;(c) 상기 단계 (b)에서 얻어진 혼합물을 감압 하에 그리고 38℃를 초과하지 않는 베쓰(bath) 온도에서 증기 증류시키는 단계;(d) 상기 증기 증류로부터 얻어진 휘발성 분획물로서, 적합한 완충제로 더 희석시킬 수 있는 휘발성 분획물을 수거하는 단계; 및(e) 에쉐리히아 콜리(Escherichia coli) 균주 BU-230-98(ATCC 기탁번호 제202226호)을 상기 단계 (d)에서 얻어진 휘발성 분획물에 부유시키는 단계를 포함하는 생균활성 조성물 제조방법.
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