PT1185618E - Estirpe bacteriana, extractos de plantas processados e composições probiotica para utilização humana e veterinária. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"ESTIRPE BACTERIANA, EXTRACTOS DE PLANTAS PROCESSADOS E COMPOSIÇÕES PROBIÓTICAS PARA UTILIZAÇÃO HUMANA E VETERINÁRIA" A presente invenção refere-se à estirpe de Escherichia coli (E. coli) de acordo com a reivindicação 1, a uma composição probiótica de acordo com a reivindicação 2, à utilização da estirpe de Escherichia coli de acordo com a reivindicação 3 e a um processo para preparar uma composição probiótica de acordo com a reivindicação 4. A presente invenção refere-se ao microrganismo probiótico não patogénico da estirpe de E. coli BU-230-98 N° de Depósito da ATCC 202226 (DSMZ 12799) e a composições probióticas compreendendo esse microrganismo probiótico, opcionalmente compreendendo também uma solução aquosa de uma fracção volátil (VF) preparada a partir do extracto de pelo menos uma planta.

As formulações compreendendo VF conseguem sustentar a viabilidade do microrganismo probiótico ai suspenso durante pelo menos um ano sob refrigeração. O microrganismo e composições probióticas da invenção têm actividade benéfica e terapêutica no tracto gastrointestinal (GI) . Suplementarmente, a invenção refere-se ao processo para preparar as composições probióticas de acordo com a invenção e às suas diferentes utilizações.

Em condições normais, a microflora do tracto gastrointestinal (GI) contribui muito para a saúde e bem-estar de um indivíduo. É bem conhecido que a microflora consiste numa população complexa e diversa que pode exercer 2 efeitos benéficos e nocivos no indivíduo. Em geral, o feto ín utero está esterilizado, mas, por passagem pela vagina durante o nascimento, adquire microrganismos que resultam na formação de uma microflora intestinal. A microflora intestinal final indígena que se estabiliza nos intestinos é um conjunto muito complexo de mais de mil microrganismos, consistindo em 400 tipos diferentes de bactérias [Fuller, R.J., Applied Bacteriology 6_6: 365-378 (1989)]. A composição da flora é determinada por factores do hospedeiro e microbianos, e apesar de haver muitas bactérias que conseguem sobreviver e crescer no tracto GI, há muitas que não conseguem. Adicionalmente, os organismos sobreviventes têm de evitar o efeito da peristalse, que normalmente faz sair as bactérias juntamente com os alimentos. As bactérias podem consegui-lo imobilizando-se por ligação à parede intestinal ou crescendo a uma taxa maior do que a taxa de remoção pela peristalse. A microflora protege o indivíduo de infecções causadas por patogenes. Este fenómeno foi descrito com nomes tais como "antagonismo bacteriano", "interferência bacteriana", "efeito de barreira", "resistência à colonização", "exclusão competitiva" e muitos outros.

Esta flora protectora é muito estável. No entanto, é menos eficaz nos pacientes novos, idosos e comprometidos. Além disso, pode ser influenciada por certos factores dietéticos e ambientais, em que os três mais importantes são higiene excessiva, terapia com antibióticos e "stress".

Em condições em que o equilíbrio da microflora intestinal é afectado adversamente, os probióticos adquirem valor potencial no restabelecimento da flora intestinal, 3 permitindo ao hospedeiro individual regressar ao estado normal.

Os probióticos consistem numa classe de microrganismos definida como organismos microbianos vivos que afectam de modo benéfico os hospedeiros animal e humano. Os efeitos benéficos incluem melhoria do equilíbrio microbiano da microflora intestinal ou melhoria das propriedades da microflora indígena. Os efeitos benéficos dos probióticos podem ser mediados por um efeito antagonista directo contra grupos específicos de organismos, resultando num decréscimo do número por um efeito no seu metabolismo ou por estimulação da imunidade. Os probióticos podem suprimir contagens viáveis de um organismo indesejado produzindo compostos antibacterianos, competindo para nutrientes ou para sítios de adesão. Suplementarmente, podem alterar o metabolismo microbiano por aumento ou diminuição da actividade enzimática, ou podem estimular o sistema imunológico aumentando níveis de anticorpos ou aumentando a actividade de macrófagos. A presente invenção destina-se a fornecer um novo microrganismo probiótico não patogénico, estirpe de E. coli BU-230-98 (N° de Depósito da ATCC 202226) e uma composição probiótica compreendendo o organismo probiótico suspenso numa formulação compreendendo uma solução aquosa de uma VF preparada a partir do extracto de pelo menos uma planta. A patente W095/16461 descreve um probiótico ou composição de bactérias anaeróbicas eficaz no controlo ou inibição da colonização por Salmonella de animais domesticados. O probiótico inclui populações ou culturas de 29 bactérias substancial e biologicamente puras, inter 4 alia, E. coli. No entanto, a supressão do patogene pelo probiótico ou composições descritos nesta publicação requer a acção combinada de um grande número de estirpes bacterianas. A patente W097/35596 descreve a administração de uma mistura probiótica preparada de fresco obtida por mistura de um pó contendo Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium infantis com um líquido. É descrito que a mistura é eficaz na prevenção de diarreia infecciosa ou diarreia causada por terapia com antibióticos em humanos. No entanto, as bactérias vivas liofilizadas estão num estado anabiótico. A necessidade de humedecer o microrganismo antes da administração, para restabelecer a sua vitalidade, é uma desvantagem pois, normalmente, muitas bactérias não sobrevivem à re-hidratação. Além disso, os organismos que sobrevivem não estão metabolicamente activos de forma imediata e não conseguem sobreviver às condições acídicas e extremas do estômago. A preservação da viabilidade e conservação da actividade de organismos probióticos pela sua formulação é o assunto de numerosas publicações. A patente W098/26787 descreve o aumento de uma população residente de microrganismos produtores de ácido láctico, preferivelmente lactobacillii, no tracto GI de um animal administrando-lhe β-glucano, opcionalmente em combinação com microrganismos prebióticos e/ou probióticos. A patente W097/34591 também descreve o aumento da população residente de microrganismos ou a supressão da população residente indesejada num sítio seleccionado do tracto GI de um indivíduo administrando ao indivíduo um 5 amido modificado ou não modificado seleccionado, ou respectivas misturas, que actua como transportador para um ou mais microrganismos probióticos e como meio de crescimento ou manutenção para os microrganismos. Os elementos probióticos são ligados ao transportador de modo a proteger os microrganismos durante a passagem para o intestino grosso ou outras regiões do tracto GI. A patente GB-A-1 501 098 refere-se a um método para a produção de óleo essencial de lúpulo que compreende destilar a vapor o óleo essencial de lúpulo em mistura com água de lúpulos sob vácuo a uma temperatura não superior a 50°C e arrefecer o destilado para uma temperatura inferior a 0°C, desse modo recolhendo o destilado na forma de uma dispersão de óleo essencial de lúpulo em gelo.

Foi inesperadamente descoberto que uma única espécie de um microrganismo probiótico não patogénico derivado de E. coli é capaz, isoladamente, de restabelecer a flora do GI normal do homem e de uma variedade de animais e pássaros. Também foi surpreendentemente descoberto que é possível preservar este microrganismo durante longos períodos de tempo, numa forma viável e metabolicamente activa, numa formulação compreendendo uma solução aquosa de fracções voláteis de vários extractos de plantas.

Verificou-se que a composição probiótica compreendendo o organismo probiótico na referida formulação é eficaz no tratamento e prevenção de várias perturbações gastrointestinais. 6

Inesperadamente, verificou-se também que a formulação per se é eficaz como intensif icador de ganho de peso corporal e como imunoestimulador em mamíferos e pássaros. A estirpe de Escherichia coli é definida na reivindicação 1, a composição probiótica é definida na reivindicação 2, a utilização da estirpe de Escherichia coli na reivindicação 3 e o processo para preparar uma composição probiótica na reivindicação 4. A presente invenção refere-se a um microrganismo probiótico não patogénico, nomeadamente a estirpe de E. coli BU-230-98 (N° de Depósito da ATCC 202226).

Também é descrita uma formulação compreendendo uma solução aquosa de uma fracção volátil (VF) preparada a partir do extracto de pelo menos uma planta. As fracções voláteis dos extractos de plantas são preparadas por destilação a vapor desse extracto de planta sob pressão reduzida e a uma temperatura do banho não superior a 38°C. O material vegetal utilizado nas formulações descritas pode consistir em qualquer fruto, vegetal, folha, caule ou raiz adequado, sendo preferivelmente maçã, citrinos, soja, beterraba, salsa, hortelã-pimenta, funcho, alho, alfalfa e couve.

As formulações descritas são utilizadas como meio de suspensão para o microrganismo microbiótico da invenção. Sob refrigeração, as formulações descritas podem sustentar a viabilidade do microrganismo probiótico da invenção ai suspenso durante pelo menos um ano. O termo aditivo alimentício/de alimentação, tal como é aqui utilizado, deve 7 ser entendido como um aditivo alimentício ou aditivo nutricional para utilização humana ou um aditivo de alimentação ou aditivo nutricional para utilização em gado e aves domésticas, bem como outros animais domesticados. A invenção refere-se suplementarmente a composições probióticas compreendendo o microrganismo microbiótico da invenção suspenso nas formulações descritas. As composições microbióticas da invenção têm actividade biológica benéfica e efeitos terapêuticos no tracto GI. As presentes composições probióticas podem ser utilizadas como aditivos alimentícios/de alimentação como definido acima. A composição probiótica da invenção pode ter numerosas aplicações, inter alia, prevenir ou tratar infecções gastroentéricas, tratar ou prevenir diarreia infecciosa, diarreia crónica ou diarreia causada por infecção, por terapia com antibióticos ou quimioterapia, tratar enterocolite, restabelecer eficazmente a microflora do GI, tratar sintomas dispépticos, aumentar o ganho de peso corporal, estimular o sistema imunológico num sujeito; atenuar a intolerância à lactose em sujeitos que dela padecem, normalizar o metabolismo alimentar no GI, tratar obstipação e/ou reduzir os níveis de colesterol no sangue. É descrito um processo para preparar uma fracção volátil de um extracto de planta, cujo processo compreende os passos seguintes: (a) triturar uma matéria vegetal para obter uma biomassa; (b) misturar a biomassa vegetal obtida no passo (a) com água numa certa proporção, preferivelmente numa proporção em peso de 3 partes de água para 1 parte da biomassa vegetal, e agitar o sistema durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente; (c) destilar a mistura obtida 8 no passo (b) sob pressão reduzida e a uma temperatura do banho não superior a 38°C; (d) recolher a fracção volátil, que pode ser suplementarmente diluida num tampão adequado. É descrito um processo para a preparação das formulações por mistura de várias fracções voláteis de vários extractos de plantas e, opcionalmente, misturando-os com água e aditivos, adjuvantes ou transportadores adequados. A invenção proporciona suplementarmente um processo para a preparação de composições probióticas por suspensão de pelo menos um microrganismo probiótico viável da invenção, com actividade biológica benéfica e/ou actividade terapêutica no tracto GI, na fracção volátil obtida pelo processo descrito, ou numa mistura de várias fracções voláteis.

Por fim, a invenção refere-se à utilização de pelo menos uma fracção volátil (VF) de um extracto de planta na preparação das composições probióticas da invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um microrganismo probiótico que é uma bactéria não patogénica derivada de E. coli, com actividade fisiológica benéfica e/ou terapêutica no tracto GI, e que está depositada na ATCC com o N° de depósito 202226 e na DSMZ com o N° de depósito 12799. É descrita uma formulação compreendendo pelo menos uma fracção volátil (VF) de um extracto de planta, em que a fracção volátil é preparada por destilação do referido 9 extracto de planta sob pressão reduzida e a uma temperatura do banho não superior a 38°C. A matéria vegetal de onde se pode obter a fracção volátil pode consistir em qualquer parte adequada de uma planta, como fruto, folha, caule ou raiz. Muitas plantas são adequadas como fonte das fracções voláteis, por exemplo, maçã, citrinos, soja, beterraba, couve, alho e alfalfa, bem como ervas aromáticas, como salsa, hortelã-pimenta e funcho. As formulações da invenção também podem compreender, opcionalmente, uma quantidade adequada de uma fracção volátil de um produto de apicultura, como mel, própolis ou outro produto de cortiços, que pode ser preparada da mesma forma descrita aqui para obter fracções voláteis de extractos de plantas.

Como será descrito mais pormenorizadamente nos Exemplos seguintes, a própria formulação pode ser utilizada como aditivo alimenticio/de alimentação.

Num aspecto suplementar, a invenção refere-se a uma composição probiótica compreendendo a formulação descrita e pelo menos o microrganismo probiótico da invenção com actividade terapêutica ou biológica benéfica no tracto Gl.

Uma vantagem particular da composição probiótica da invenção provém do facto de ser uma preparação liquida. Estando em condições biologicamente activas, a formulação também serve de meio de suporte para bactérias vivas, em oposição a formulações liofilizadas nas quais as bactérias estão num estado anabiótico. Em resultado, a composição probiótica da invenção está activa imediatamente após a administração oral, começando na porção superior do tracto 10 GI, onde ocorrem efeitos primários da maioria dos patogenes intestinais conducentes ao desenvolvimento de síndromas gastroentéricas adversas. As composições probióticas da invenção também podem ser utilizadas como preparações para aumentar o peso do corpo ou como aditivos alimentícios/de alimentação.

De acordo com outro aspecto da invenção, as composições probióticas da invenção podem ser utilizadas para prevenir ou tratar infecções gastroentéricas. Deve considerar-se que o termo "infecção gastroentérica" designa qualquer infecção causada por um patogene entérico, incluindo, inter alia, bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Ao melhorarem o

equilíbrio geral e saúde do tracto GI, as formulações e composições probióticas da invenção poderão ser um instrumento na profilaxia também de infecções do GI causadas por leveduras, vírus e protozoários.

Para os objectivos aqui descritos, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" é a quantidade determinada por considerações conhecidas na área. A quantidade deve ser suficiente para permitir o restabelecimento eficiente da microflora do GI, conduzindo assim à normalização da função do tracto GI.

Numa especificação particular, a composição probiótica para prevenir o desenvolvimento de infecções gastroentéricas compreende a formulação da invenção preparada a partir de água destilada e fracções voláteis de alfalfa, soja, beterraba, funcho e hortelã-pimenta, como definido aqui, numa razão de volumes, por exemplo, de 5:1:5:15:1, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma 11 bactéria probiótica, E. coli N° do Depósito da ATCC 202226 (idêntica a DSM 12799).

Um exemplo especifico de uma infecção gastroentérica é a causada por Salmonella, e a invenção é particularmente vantajosa na prevenção ou tratamento de infecções gastroentéricas causadas por aguelas.

Suplementarmente, o aditivo ou formulação alimentício descrito em combinação com uma quantidade eficaz da estirpe de E. coli N° do Depósito da ATCC 202226 (idêntica a DSM 12799) pode ser utilizado para tratar ou prevenir diarreia infecciosa, diarreia crónica ou diarreia causada por terapia com antibióticos ou quimioterapia.

De acordo com outra especificação particular da invenção, a referida composição probiótica para tratar diarreia infecciosa pode compreender água destilada e fracções voláteis de alfalfa, soja, beterraba, funcho e hortelã-pimenta numa razão de volumes, por exemplo, de 5:1:5:15:1, e uma quantidade terapeuticamente eficaz do N° do Depósito da ATCC 202226 (DSMZ 12799). A diarreia infecciosa pode ser causada por numerosos factores, por exemplo, por um microrganismo seleccionado de entre C. difficile, Salmonella, particularmente S. Shigella, Campylobacter, E. coli, Proteus, Pseudomonas, Clostridium, Staphylococcus entérico. Estes são apenas alguns de muitos agentes infecciosos.

Ainda suplementarmente, as composições probióticas da invenção podem ser utilizadas para restabelecer eficazmente a microflora do GI num sujeito necessitado desse tratamento 12 que conduz à normalização da função do tracto GI. Essas composições podem incluir, por exemplo, água destilada e fracções voláteis de alfalfa, soja, beterraba, funcho, hortelã-pimenta, salsa e couve, preferivelmente numa razão de fracções voláteis, por exemplo, de 1:5:5:2:2:1, e uma quantidade terapeuticamente eficaz da bactéria probiótica N° do Depósito da ATCC 202226 (DSM 12799).

Outras finalidades das composições probióticas da invenção, compreendendo pelo menos um probiótico com efeito terapêutico no tracto GI, incluem atenuação da intolerância à lactose em sujeitos que sofrem de intolerância à lactose, tratamento de enterocolite, tratamento de obstipação, para a redução dos niveis de colesterol no sangue, para o tratamento de sintomas dispépticos e/ou para a estimulação do sistema imunológico em sujeitos que sofrem de uma perturbação do sistema imunológico, que pode ser uma perturbação imunológica causada por terapia imunossupressora.

Num aspecto diferente é descrito um processo para preparar uma fracção volátil de um extracto de planta, cujo processo compreende os passos seguintes: (a) triturar matéria vegetal para obter uma biomassa vegetal; (b) misturar a biomassa vegetal obtida no passo (a) com água numa proporção em peso de 3 partes de água para 1 parte da biomassa vegetal, e agitar o sistema durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente; (c) destilar a mistura obtida no passo (b) sob pressão reduzida e a uma temperatura do banho não superior a 38°C, e (d) recolher a fracção volátil obtida da referida destilação a vapor, cuja fracção pode ser suplementarmente diluida num tampão adequado. 13 A fracção volátil pode ser misturada com água para dar origem a um aditivo ou formulação alimenticio/de alimentação. 0 aditivo ou formulação alimenticio/de alimentação também pode ser preparado por mistura de mais do que uma fracção volátil de planta obtida pelo processo. Esta mistura pode ser suplementarmente misturada com água.

As fracções voláteis podem ser preparadas a partir de qualquer fruto, vegetal, folha, caule ou raiz adequado de uma planta. A planta pode ser, por exemplo, maçã, citrinos, soja, beterraba, alho, couve ou alfalfa, ou uma erva aromática, como salsa, hortelã-pimenta ou funcho. Deve notar-se que, quando for apropriado, a formulação pode compreender suplementarmente fracções voláteis de produtos de apicultura, como mel ou própolis, ou outros produtos de cortiços. Estas fracções voláteis podem ser preparadas da mesma forma das fracções voláteis de extractos de plantas.

De acordo com o processo descrito, o passo de destilação é preferivelmente conduzido sob pressão reduzida de 5-10 mbar.

Tal como foi aqui indicado antes, o aditivo ou formulação alimentício/de alimentação descrito é combinado com o agente probiótico da invenção para dar origem às composições probióticas da invenção. Assim, o processo de preparação também compreende o passo de suspender pelo menos o microrganismo probiótico viável da invenção, com actividade terapêutica no tracto GI, na fracção volátil obtida no referido passo (d) ou numa mistura dessas fracções voláteis obtidas como descrito acima. O microrganismo probiótico suspenso é a nova bactéria da invenção, derivada de E. coli e depositada na ATCC com o 14 N° de Depósito 202226 (e na DSM com o N° de depósito 12799) . A presente invenção é definida pelas reivindicações adjuntas, cujo conteúdo deve ser lido como estando incluído na revelação da especificação, e será agora descrita mais pormenorizadamente através dos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

Exemplo 1 (apenas para fins ilustrativos)

Preparação da "fracção volátil" de extractos de plantas ou de extractos de produtos de apicultura

Vegetais frescos obtidos de mercados comerciais foram extensamente lavados com água canalizada, cortados e finamente triturados num misturador industrial. Adicionou-se água destilada à biomassa vegetal, na proporção de 3 partes de água para 1 parte da massa vegetal por peso, e deixou-se o sistema com agitação durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente.

Em seguida, a mistura foi transferida para o balão de evaporação de um evaporador rotativo e foi evaporada a pressão reduzida (5-10 mbar) em condições tais que a temperatura do banho de água não excedesse 38°C e a do orifício de admissão do condensador fosse 2-5°C. Recolheram -se cerca de 2,5 1 de condensado (fracção volátil) por um quilograma de biomassa vegetal. Foi possível conservar este material, sob refrigeração, durante pelo menos 6 meses sem perder as suas propriedades. 15

Pode seguir-se o mesmo procedimento substituindo o material de plantas por produtos de apicultura, como mel ou própolis.

Habitualmente, cada "fracção volátil" foi preparada a partir de um único tipo de vegetal e foi utilizada com diluições diferentes para preparar misturas diferentes destinadas a vários fins.

Exemplo 2

Crescimento do organismo probiótico E. coli N& do Depósito da ATCC 202226 O organismo probiótico E. coli (depositado na ATCC com o N° 202226 em 3 de Maio de 1999 e na DSM com o N° 12799 em 4 de Maio de 1999) cresceu no meio seguinte (g/1): (NH4)2S04 5, KH2P04 13, Na2HP04 13, MgCl2 3, CaCl2 0,3, extracto de levedura 10, Peptona de soja 10, glucose 5, , Nutrientes adicionais (extracto de levedura 1, Peptona de soja 2,5, glucose 90) foram continuamente adicionados após o crescimento da cultura de modo que a concentração de glucose no caldo de fermentação fosse mantida no nível de 2 g/1. O pH do caldo de fermentação foi mantido neutro por adição contínua de NH4OH 4 N. A cultura foi conduzida a 30°C num reactor de fermentação padrão com arejamento de 0,5 vvm durante 16 horas, depois o crescimento tornou-se confluente. Este procedimento resultou em 1010-10n células/ml. As células de E. coli foram recolhidas por centrifugação, foram novamente suspensas em solução salina e novamente precipitadas. Foi possível conservar a biomassa microbiana no refrigerador durante 48 horas sem perder viabilidade. 16

Exemplo 3

Preparação do suplemento alimentício para a normalização da função do tracto Gl humano A mistura continha fracções voláteis (ml/1) de: alfalfa 50, soja 10, beterraba 50, funcho 50, hortelã-pimenta 20, salsa 20 e couve 10. Equilibrou-se o sistema com água destilada. Células de E. coli (ATCC 202226) (Exemplo 2) foram suspensas na mistura na concentração de células de 107 células/ml. Opcionalmente, pode adicionar-se NaCl (4-10 g/1) para melhorar o sabor.

Exemplo 4

Preparação da formulação de aditivo de alimentação para a profilaxia de infecções do GI em pássaros e animais A mistura continha fracções voláteis (ml/1) de: alfalfa 50, soja 10, beterraba 50, funcho 150 e hortelã-pimenta 10. Equilibrou-se o sistema com água destilada. Células de E. coli (ATCC 202226) (Exemplo 2) foram suspensas na mistura na concentração de células de 107 células/ml. Opcionalmente, pode adicionar-se NaCl (4-10 g/1) para melhorar o sabor.

Exemplo 5

Actividade antagonista de E. coli (ATCC 202226) contra Salmonella typhymirium (ATCC 14028)

Inocularam-se placas de petri contendo Agar Verde Brilhante Modificado, um meio de crescimento selectivo para 17

Salmonella, com S. typhymirium. Fez-se no agar uma cavidade com 9 mm de diâmetro. Depositou-se em cada cavidade um volume do suplemento alimentício (Exemplo 3) e incubaram-se as placas durante 24 horas a 35°C. Repetiu-se o mesmo procedimento mas, em vez do suplemento alimentício, depositou-se na cavidade o fluido obtido pela sua filtração numa membrana de filtração microbiológica (dimensão dos poros de 0,45 μιη) .

Em redor de cada cavidade contendo o aditivo de alimentação observou-se uma zona de inibição (10-17 mm) sem colónias de S. typhymirium. Não se observou nenhuma zona de inibição em redor das cavidades contendo o filtrado sem o organismo probiótico.

Exemplo 6

Actividade antagonista de E. coli ATCC 202226, bem como da sua estirpe paterna E. coli M-17, contra Shigella sps

Culturas de S. flexneri, S. sonnei, E. coli (ATCC 202226) e M-17 cresceram separadamente no Agar de Nutrientes durante 18-20 horas a 37°C. Todas as culturas foram recolhidas em solução salina e diluídas para a densidade óptica de 10 unidades Klett. Alíquotas das culturas diluídas de espécies Shigella (1 ml), isoladamente ou em combinação com a cultura diluída de E. coli (ATCC 202226) (1 ml), foram cultivadas em tubos de teste em taça de ventilação contendo Caldo de Nutrientes (5 ml). Os tubos foram incubados durante 24 horas a 37°C. Determinou-se o número de unidades formadoras de colónias (CFU) dos patogenes e de E. coli (ATCC 202226) por plaqueamento das culturas em Agar de nutrientes. Apresentam-se na Tabela 1 18 os números de CFU de duas espécies Shigella na cultura pura e em culturas misturadas com ambas as espécies de E. coli probióticas.

Tabela 1

Organismo Probiótico Crescimento de Shigella CFU/ml S. flexneri S. sonnel E. coli ATCC 202226 <5xl04 <5xl04 E. coli M-17 lxlO6 2xl06 Cultura de Shigella pura 6xl06 2xl06

Exemplo 7

Aplicação do suplemento alimentício (Exemplo 3) e de Colibacterin (formulação seca de E. coli M-17) a pacientes hospitalizados com gastroenterite

Um grupo de 60 pacientes que desenvolveram gastroenterite após a hospitalização foi aleatoriamente dividido em 3 subgrupos com uma distribuição semelhante de sexo, idade e gravidade dos sintomas de gastroenterite. Todos os pacientes receberam tratamento de suporte normal, re-hidratação, vitaminas, etc. A gravidade do estado não requereu tratamento com antibióticos. O primeiro grupo de 20 pacientes recebeu 10 ml do suplemento alimentício (Exemplo 5) 3 vezes por dia 30 minutos antes das refeições, durante 7 dias. O segundo grupo com o mesmo número recebeu Colibacterin (Colibacterínum síccum) como recomendado pelo fabricante (uma dose duas vezes por dia 30 minutos antes da refeição) e o terceiro grupo não recebeu nenhum suplemento. Registou-se o inicio da normalização (em dias) dos sintomas 19 de gastroenterite em todos os grupos e os resultados estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Sintomas Início da normalização do sintoma, dias Suplemento alimentício Colibacterin Controlo Temperatura do corpo 2,810,2 2,710,2 3,710,2 Intoxicação 2,510,1 3,610,1 4,610,1 Dor abdominal 3,310,2 5,110,2 6,110,2 Diarreia 1,810,2 3,410,2 4,410,2

Colibacterin (Colibacterinum siccum) é a preparação liofilizada de E. coli M-17 viva produzida pela BIOMED Ltd., Moscovo, Rússia, e recomendada para utilização contra diarreia ["Vidal Handbook: Pharmaceutical preparations in Rússia" (N.B. Nikolaeva, B.P. Alperovich e V.N. Sovinov, Editores) AstraPharmService, 1997, Moscovo, página 275].

Exemplo 8

Aplicação do suplemento alimentício (Exemplo 3) a pacientes com infecções agudas do Gl

Pacientes com infecções graves do GI de várias etiologias: salmonelose, colibacilose, shigelose, infecções por estafilococos e intoxicações alimentares de etiologia desconhecida. A hospitalização foi indicada a todos os pacientes devido a um início agudo da doença e aparecimento de gastroenterite aguda. Os 186 pacientes, no total, foram tratados com o suplemento alimentício e um grupo semelhante de 102 pacientes recebeu tratamento padrão. 20

Registou-se o início da normalização (em dias) dos sintomas da gastroenterite em todos os grupos e os resultados estão apresentado na Tabela 3.

Tabela 3

Sintomas Início da normalização, dias Grupo de estudo Controlo Febre 1,2+0,3 2,7+0,3 Fraqueza 1,6+0,2 2,9+0,3 Dor abdominal 1,5±0,2 2,4±0,3 Diarreia 2,3+0,2 4,7+0,4 Dias acamados 4,8±0,3 6,7±0,4

Num estudo separado, um grupo de 30 pacientes com tifoide intestinal foi tratado com o suplemento alimentício. Em 80% dos pacientes, os sintomas da doença desapareceram em 3 dias. O tratamento com o suplemento só foi interrompido em 3 casos devido ao desenvolvimento de colite crónica mais grave.

Exemplo 9

Aplicações do suplemento alimentício (Exemplo 3) a pacientes com perturbações do GI causadas por antibióticos

Pacientes com perturbações graves do GI foram divididos em 2 grupos. O grupo I continha 48 pacientes com doença de úlcera péptica que desenvolveram perturbações do GI após tratamento com antibióticos contra H. pylori. O grupo II continha 22 pacientes que desenvolveram perturbações do GI após tratamento de pneumonia com antibióticos. 21 0 suplemento alimentício (5 ml) foi administrado 3 vezes por dia antes das refeições, durante 7 dias. Em ambos os grupos, os sintomas de diarreia desapareceram em 2-3 dias em todos os pacientes. Após a administração do suplemento, observou-se normalização completa da microflora intestinal em 84,5% dos pacientes. Este efeito foi demonstrado por um aumento dramático de lactobacilli e Bifidobacteria, redução da contagem geral de E. coli, desaparecimento completo da E. coli hemolítica e outros patogenes, como Staphylococci, Proteus vulgaris e mesmo Candida sps. Nos restantes 15,5% dos pacientes observaram-se melhorias significativas.

Exemplo 10

Aplicação do suplemento alimentício (Exemplo 4) a pacientes com enterocolite tardia por radiação 0 suplemento alimentício (10 ml, 3 vezes por dia durante 14 dias, 30 minutos antes das refeições) foi administrado a 24 pacientes com cancro do útero, cólon e gástrico que desenvolveram enterocolite após terapia com radiação ou uma combinação de terapia com radiação e quimioterapia.

Antes da utilização do suplemento alimentício, todos os pacientes queixaram-se do desejo frequente e doloroso de defecar, fezes líquidas (4-12 vezes por dia), aparecimento de muco (9 casos) e sangue (3 casos) nas fezes.

Dois ou três dias depois de ingerirem o suplemento, todos os pacientes notaram atenuação da dor e redução do número de defecações; as fezes tinham uma aparência normal. Quatro até cinco dias depois, a síndroma de diarreia tinha desaparecido e o aparecimento de sangue e muco tinha 22 cessado. A análise ao sangue revelou grandes melhorias dos indicadores do sangue.

No grupo de controlo de dimensão semelhante, os sintomas persistiram.

Exemplo 11

Aplicação do suplemento alimentício (Exemplo 3) a pacientes com SIDA

Os pacientes que sofrem de SIDA desenvolvem muitas vezes diarreia crónica. Um grupo desses pacientes recebeu 10 ml do suplemento alimentício (Exemplo 4) 3 vezes por dia 30 minutos antes das refeições, durante 20 dias. O grupo de controlo não recebeu nenhum suplemento. Os resultados do tratamento estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4

Parâmetro Suplemento alimentício Controlo N° de pacientes 30 20 Idade média, anos 38+1 36+2 Frequência da defecação diária: no início da Exp. 3,4±0,3 3,610,3 no final da Exp. 1,1+0,1 3,210,3 um mês após a Exp. 1,5+0,2 3,710,3 Início médio da 6,0+0,7 permaneceu normalização anormal

Os pacientes que receberam o suplemento alimentício exibiram normalização da microflora intestinal: redução do número geral de coliformes, desaparecimento da E. coli 23 hemolítica, aumento dos números de Lactobacilli e Bifidobacteria, redução de Candida sps.

Exemplo 12

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 4) a bacorinhos saudáveis

Administraram-se a várias centenas de bacorinhos saudáveis 3 ml per os do aditivo de alimentação, por bacorinho, no primeiro e terceiro dias após o parto e no desmame. A mortalidade desceu em 50% em comparação com o grupo de controlo que recebeu tratamento profiláctico padrão com antibióticos. O grupo que recebeu o aditivo de alimentação ganhou mais peso no desmame, em média 0,39 kg por bacorinho, do que o grupo de controlo. Ao comparar, na mesma ninhada, o aditivo de alimentação com o tratamento com antibióticos, verificou-se que o ganho de peso dos bacorinhos que receberam o aditivo de alimentação foi mais elevado, em 2,4 kg, do que no controlo.

Exemplo 13

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 3) a bacorinhos com diarreia Várias centenas de bacorinhos com diarreia receberam diariamente 5 ml per os do aditivo de alimentação, por bacorinho. O grupo de controlo, com a mesma dimensão, foi tratado com antibióticos: Advocin, gentamicina, amoxicilina. Os sintomas de diarreia no grupo que recebeu o aditivo de alimentação desapareceram em 1-2 dias. Não se observou mortalidade e os bacorinhos desenvolveram-se 24 normalmente. Os antibióticos pararam a diarreia na grande maioria dos bacorinhos, mas o seu desenvolvimento permaneceu retardado.

Cerca de 70 bacorinhos com desenvolvimento retardado, que tinham recebido tratamento com antibióticos contra a diarreia durante uma semana e geralmente considerados perdidos, receberam o aditivo de alimentação durante três dias. Sobreviveram todos menos dois.

Exemplo 14

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 3) a vitelos saudáveis

Administraram-se a vitelos saudáveis com dias de idade 5 ml do aditivo de alimentação por dia, no leite, durante 7 dias. Mais de 95% dos vitelos não desenvolveram diarreia até terem 14 dias de idade, altura em que foram diagnosticados alguns casos positivos de Rotavirus.

Exemplo 15

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 5) a vitelos com diarreia vitelos que desenvolveram diarreia receberam diariamente 10 ml do aditivo de alimentação, por animal, no leite, durante 3-5 dias. Os sintomas da diarreia desapareceram em 1-2 dias em 90-95% dos vitelos. Nos restantes 5-10%, a diarreia foi causada por virus. Estes vitelos foram tratados com antibióticos, com resultados fracos. 25

Exemplo 16

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 5) a borregos e cabritos bebés saudáveis

Administraram-se a borregos e cabritos bebés saudáveis com dias de idade 3 ml do aditivo de alimentação por dia, no leite, durante 7 dias. Nalguns casos observaram-se sinais ligeiros a moderados de diarreia. Habitualmente, estes sinais desapareceram de forma espontânea ou foram tratados com êxito com uma dose aumentada do aditivo de alimentação (5 ml).

Exemplo 17

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 4) a borregos e cabritos bebés com diarreia

Testou-se o aditivo de alimentação num rebanho que sofria de infecções por E. coli patogénica. No ano antes da experiência, cerca de 90 até 120 borregos e cabritos bebés morreram de diarreia. O tratamento com antibióticos foi ineficaz uma vez que a doença se desenvolveu subitamente e com mortalidade rápida. Borregos e cabritos bebés que desenvolveram diarreia receberam diariamente 5 ml do aditivo de alimentação, por animal, no leite, durante 3-5 dias. Tratou-se um grupo correspondente de animais, como é normalmente recomendado, com antibióticos. Os sintomas de diarreia desapareceram em 1-2 dias em cerca de 90% dos borregos e cabritos bebés que receberam o aditivo de alimentação. O seu desenvolvimento posterior aparentou normalidade. O grupo de controlo que recebeu antibióticos (gentamicina) exibiu resultados muito mais fracos. Neste 26 grupo a diarreia persistiu, requerendo tratamento repetido com antibióticos. 0 desenvolvimento do grupo de controlo foi gravemente retardado.

Exemplo 18

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 4) a aves domésticas

Adicionou-se o aditivo de alimentação à água potável, com uma ingestão média de 0,01 ml do aditivo por dia, por pinto, durante o periodo da criação (42-49 dias). Em ensaios controlados em frangos para assar notou-se um aumento de 3,2% do ganho de peso, acompanhado por 4% de melhoria da conversão de alimentos.

Também se obtiveram resultados excelentes com perus de 1 dia até 6 semanas de idade. Cada pássaro recebeu 0,01 ml do aditivo por dia. Observou-se um ganho de peso superior a 10% juntamente com taxa de mortalidade reduzida. Os pássaros que ainda exibiam diarreia foram tratados com 0,1 ml por dia do aditivo de alimentação, sem qualquer tratamento com antibióticos, e exibiram melhor recuperação do que os pássaros de controlo que só foram tratados com antibióticos.

Exemplo 19

Aplicação do aditivo de alimentação (Exemplo 4) a cães e gatos 27 A aplicação dos aditivos de alimentação a cachorrinhos resultou em cessação dos sintomas de diarreia em 24-48 horas.

Lisboa, 27 de Março de 2007

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe de Escherichia coli BU-230-98 com o N° de Depósito da ATCC 202226 (DSMZ 12799).

2. Composição probiótica compreendendo a estirpe de Escherichia coli da Reivindicação 1.

3. Utilização da estirpe de Escherichia coli da Reivindicação 1 na preparação de uma composição para a normalização da função do tracto gastrointestinal.

4. Processo para preparar uma composição probiótica compreendendo pelo menos uma fracção volátil de um extracto de planta e a estirpe de E. coli BU-230-98, N° de Depósito da ATCC 202226 (DSMZ 12799), em que o processo compreende os passos seguintes: a) triturar uma planta ou parte de planta para obter uma biomassa de planta; b) misturar a biomassa obtida no passo (a) com água, numa razão de pesos de 3 partes de água para 1 parte da biomassa, e agitar o sistema durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente; c) destilar a vapor a mistura obtida no passo (b) sob pressão reduzida e a uma temperatura do banho não superior a 38°C; d) recolher a fracção volátil obtida da referida destilação a vapor, cuja fracção pode ser suplementarmente diluída com um tampão adequado, e e) suspender a referida estirpe de E. coli BU-230-98, N° de Depósito da ATCC 202226 (DSMZ 12799), na referida fracção volátil obtida no passo d). Lisboa, 27 de Março de 2007