CN1293185C - 具有降低与同化胆固醇能力的新颖耐酸与耐胆盐乳杆菌分离株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有耐胆盐与耐胃酸特性且同时具有降低与同化胆固醇能力的新颖乳杆菌分离株。本发明的乳杆菌分离株或其传代培养后代或由它们所衍生出的突变株可用于制备各种食品，以及用于制备供治疗与预防肠胃疾病以及降低血清胆固醇用的药物组合物。

Description

具有降低与同化胆固醇能力的新颖耐酸与耐胆盐乳杆菌分离株

本申请是2002年10月30日提交的，发明名称为“具有降低与同化胆固醇能力的新颖耐酸与耐胆盐乳杆菌分离株”的中国专利申请02146947.4的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有耐胆盐与耐胃酸特性且同时具有降低血清胆固醇能力的新颖乳杆菌分离株及它的用途。

背景技术

“乳酸菌(lactic acid bacteria)”为一群能发酵醣类并以乳酸为主要产物的细菌，其目前广为接受的形态与生理特征为：(1)革兰氏阳性菌；(2)外形为球菌或杆菌；(3)过氧化氢酶试验为阴性；(4)从它所代谢的葡萄糖可生成50％以上的乳酸；(5)不形成内生性孢子；以及(6)多不具游动性，可在微好氧情况下生长。

直到1980年众所皆知的一般乳酸菌包含乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)等4个菌属(W.C. Frazier和D.C.Westhoff，1978，Food Microbiology，3rd ed.McGraw-Hill，Inc.，New York，USA)，而广义的乳酸菌还包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)与芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)这两个菌属。而近年来，微生物在分类体系上已可依据DNA同源性和rDNA序列比对分析而被明确独立成为一个分类群，并被赋予分类学上的位置。就申请人所知，截至1999年12月，乳酸菌家族已扩增至包含16个菌属以及223个物种。

经由人类或动物宿主的摄食后，可改善该人类或动物宿主的肠内微生物相平衡的单一或混合菌种是所谓的益生菌(O’sullivan等，(1992)，Trends in Food Sci.Technol，3：309-314；Fuller，R.，P.J.Heidt，V.Rush和D.van der Waaij(eds.)(1995)，Probiotics：prospects of use in opportunisticinfections.Old Herborn University Seminar Monograph No.8，pp.1)其中最为人所熟知及使用的益生菌是乳杆菌(Lactobacillus)与双歧杆菌(Bifidobacterium)。

自1908年Eli Metchnikoff提出“食用含乳杆菌的酸乳，可以取代正常存在于肠内的产毒菌体，而不只有益健康更能延年益寿”(EliMetchnikoff，1908，The Prologation Of Life，Ed.P.Chalmers Mitchell，G.P.Putnam，s Sons，The Knicherbocker Press，New York & London)的理论后，近年来的研究及临床试验结果也显示“乳杆菌与健康具有重要关连性”。乳杆菌因此受到广泛的重视。

乳酸菌不只能在肠道复杂的生态系中占有重要地位，而且对宿主还有健康上的助益。乳酸菌已被发现的功效包括增进宿主所摄食的食物的营养品质与促进维生素合成及酶产生(J.Denter和B.Bisping，1994，Int.J.Food Microbiol.，22：23-31)、抑制肠道内致病菌的生长以及稳定肠道内正常菌相平衡(Hose，H.和Sozzi，T.(1991)，J. Chem.Technol.And Biotech.51：540-544)、产生抗体物质增加宿主的抵抗力(H.Majamaa等，(1995)，Journal of Pediatric Gastro-enterology and Nutrition，20：333-338)以及降低大肠癌的风险及抑制肿瘤(E.J.Schiffrin等，1997，Am.J.Clin.Nutr.，66：515S-520S)。同时，也有研究显示，服用经乳杆菌发酵的乳品也可以降低血清胆固醇的含量。

心血管疾病被列为工业国家人民的一主要死因。在美国，因心血管疾病而死亡的人数多于癌症及其它疾病，其中有四分之三的死因是归因于动脉粥样硬化及其并发症，而高血清胆固醇是造成心血管疾病及动脉粥样硬化的原因之一(Kannel等，(1979)，Ann.Intern.Med.，90：85-91；Pekkanen等，(1990)，New England J.Med.，322：1700-1707)。在台湾地区，近年来脑血管及心脏疾病也一直名列十大死因前茅，且更是老年人最主要的病因与死因，因此，高胆固醇血症是一不容忽视的病因。

1974年Mann及Spoerry发现，饮用经乳杆菌发酵后的酸牛乳可降低人体血清胆固醇浓度，而食用新鲜牛奶则无影响(Am.J.Clin.Nutr.，27：464-469，1974)。因此，近年来人们对乳酸菌降低胆固醇的处理与功效进行了广泛的研究。

1982年，K.K.Grunewald于J.of Food Science，47：2078-2079中报导，当大鼠被喂食以含有经过嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)发酵的10％酸牛乳的食物历时4周后，大鼠的血清胆固醇浓度显著下降。1989年，Danielson等人于J.Anim.Sci.，67：966-974中报导，以经嗜酸乳杆菌LA16分离株发酵的嗜酸菌酸牛乳(acidophilus yogurt)来喂食被给予高胆固醇饮食的猪历时56天后，会降低猪的血清胆固醇与低密度脂蛋白(LDL)，而对血清三酸甘油脂与高密度脂蛋白(HDL)则无效用。

上述有关嗜酸乳杆菌LA16分离株的论文，是Dr.khem M.Shahani所领导的研究组所进行的有关嗜酸乳杆菌的特性与生物活性的多项研究之一。特别地，Dr.khem M.Shahani所领导的研究组曾针对一人类来源的嗜酸乳杆菌DDS-1分离株的特性与生物活性而进行相当多的研究，其中包括降低血清胆固醇水平的研究，该DDS-1分离株后来有获得专利权保护(参见Nebraska Cultures，Inc.公开于网际互联网上有关于DDS-1^TM的资料， http://www.nebraskacultures.com.benefits.html)。

1997年，Akalin等人比较一般的酸牛乳[由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)及德氏乳杆菌物种(Lactobacillus delbrueckiisp.)发酵而来]与嗜酸菌酸牛乳[由嗜热链球菌及嗜酸乳杆菌发酵而来]对于小鼠血清胆固醇的影响，而发现嗜酸菌酸牛乳降低血清胆固醇浓度的能力明显要高于一般的酸牛乳(A.S.Akalin等，(1997)，J.Dairy Sci.，80：2721-2725)。

1998年Smet等人于British J.of Nutrition，79：185-194中报导：猪在食用嗜酸乳杆菌的第3至7周内，粪便中胆盐中的排出量有明显增加，且在第3至7周内，猪体内总血清胆固醇浓度也有明显的下降。因此，乳杆菌所具有的BSH的酶活性，可能是造成试验猪的血清胆固醇降低的作用机制之一。

人体内的胆固醇可由肝脏自行合成，也可由动物性食物中摄取。胆固醇的排泄作用途径有二：(1)因肝脏的代谢作用而形成胆酸，继而与甘氨酸或牛磺酸结合而可溶于水，再与钾或钠离子形成诸如甘氨胆酸盐(glycocholates)或牛磺胆酸盐(taurocholates)等的胆盐，这些盐类可经由粪便被排出体外；以及(2)形成类固醇激素，再因激素的代谢作用而由尿中排出体外，但此途径只占小部分。

胆盐是胆固醇代谢过程中的水溶性终产物物质，而这些胆盐可能进入至肠肝循环中，因为肠内菌[包括：乳杆菌属、肠球菌属(Enterococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、双歧杆菌属、梭菌属(Clostridium)和类细菌(Bacteroid)等]的胆盐水化酶(BSH，E.C.3.5.1.24)的酶作用可使胆酸与甘氨酸或牛磺酸分开，而产生去结合的胆盐(deconjugated bile salts)。这些去结合的胆盐不溶于水，且易与血清中胆固醇形成共沉淀而被排出体外。

除上述以外，根据报导，胆固醇的代谢机制尚有同化作用及共沉淀作用。

1985年，S.E.Gilliland等人在Appl. Environ.Microbiol，49：377-381中报导，嗜酸乳杆菌对胆固醇有吸附及同化作用，且在0.3％牛胆汁的环境下，乳杆菌降低胆固醇的能力较佳。同样地，Noh等人在J.Dairy Sci.(1997)，82：3107-3113报导，嗜酸乳杆菌的细胞膜可结合胆固醇，而被吸附的胆固醇会进一步被同化代谢成细胞所需物质。

另一方面，F.A.M.Kalver和R.van der Meer在Appl. Environ.Microbiol(1993)，59：1120-1124中报导，乳杆菌和双歧杆菌对于胆固醇没有同化作用，而是在pH值低于6.0时，因为菌体对胆盐的共轭活性增加(此现象也可能和菌体所具有的BSH活性有关)，而使胆固醇与胆盐形成共沉淀，而降低了培养基中的胆固醇含量。

1997年，M.M.Brashears和S.E.Gililland指出，在不控制pH值的情况下(即正常pH值为4.5至5.5)，乳杆菌具有良好的胆固醇共沉淀，而若控制pH值维持在6.0左右，该菌降低胆固醇的能力明显地减低(M.M.Brashears和S.E.Gililland(1997)，Influences of pH during growth onremoval of cholesterol from MRS broth by Lactobacillus casei andLactobacillus acidophilus，Animal Science Research Report，pp.32-37；http://www.ansi.okstate.edu/research/1997rr/006.htm)。

1998年，张佳程与骆承庠以高脂乳、食用油脂来进行试验，而认为“同化作用”是乳酸菌得以降低胆固醇的主要作用。(张佳程与骆承庠(1998)，“乳酸菌对食品中胆固醇脱除作用的研究--乳酸菌菌种(株)的筛选，”食品科学(中国)，19：20-22)。

1999年，Usman及Hosono于J.Dairy Sci.，82：243-248中报导，一种新发现的乳杆菌物种加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)在无胆盐的培养条件下可吸收胆固醇。

以生物方法来降低人体血清胆固醇含量是一种比较经济且有效的方式。而由以上文献资料可知，乳酸菌在体内和体外均可能展现出有效的降低胆固醇效用，其中可能的作用机制包括了胆盐水解酶的去结合作用、胆固醇与去结合的胆盐于酸性pH值下产生共同沉淀以及乳酸菌细胞对胆固醇的同化作用。

但乳酸菌在被摄入人体后，会面临人体肠胃环境压力以及对肠道吸附性的专一性，因此，乳酸菌要在肠道中发挥功效，首先就必须要能克服消化道的恶劣环境，并能够定居(colonization)在肠道。再者，嗜酸乳杆菌是一群营养要求复杂的菌种，除了在酸牛乳品中较稳定外，其余市售的各种乳酸菌是以干燥菌粉或其它加工型态(粉末状、粒状及锭状)而制成产品，菌体经长时间在室温或冷藏储存下皆存活不易，而造成菌数不易维持在起始储存的数目。因此，市售非酸牛乳品的产品内所含实际菌数，往往不及其包装上所标示的菌数。所以，在乳酸菌产品的生产上，在销售及储存过程中如何维持乳酸菌的菌数，是极为重要的课题。而具有耐酸、耐胆盐及良好降低血清胆固醇能力等特性的菌株筛选，是开发优良乳杆菌产品的一重要目标。

从上述可知，若在筛选菌种时能直接针对菌株的耐酸、耐胆盐以及储存稳定性等特性来进行筛选，可以节省后续过程的开销，更可将所筛选得的菌株做更广泛的应用。而分离源与地域性也和有效菌株的选出有关，因此，近年来人体来源已成为菌株筛选源的一主要诉求。

目前，在日本厚生省所核准的171件特定保健用食品中，有36件(约占全部的21％)为益生性菌种，但产值却占总数的82％。在欧洲，益生性菌种于食品市场的产值高达10亿美元。在美国，2000年酸酪乳的销售值即达18.6亿美元。在台湾，于2000年，益生性菌种的市场已成长至42亿元，而产品的应用形式也从发酵乳品、牛奶、冰淇淋、糖果、膳食补充剂等逐年扩增，应用的对象更包含了成人、婴儿及各种家禽、家畜类。由此可预期，益生性菌种的市场有一广大的成长空间。

截至目前为止，世界各地对乳酸菌的发展研究众多，其中有关于乳杆菌菌株的耐酸性以及降胆固醇能力所公开的专利与发表文献，大多以嗜酸乳杆菌菌株为主，且主要是揭示胆盐耐受性及耐酸性菌株，或是只有强调降低胆固醇能力及胆盐耐受性部分。目前有关乳杆菌的胆盐耐受性的研究，是强调菌株可在含0.3％甘氨胆酸盐(glycocholate)下生长，而耐酸性则以出现于胃液分泌初期的pH 2来进行耐胃酸状态试验。

查已公开的专利，乳杆菌降低血清胆固醇能力约在20％左右，而在发表文献方面，依照使用方法而有10～80％左右的差异。

在US 4,839,281、US 5,032,399中提到一种由人类粪便分离出的嗜酸乳杆菌GG(ATCC 53103)，它可生长在含0.15％胆盐中，而其在pH 1～2的酸性环境下培养2小时后的菌数残存数为10³CFU。

S.E.Gilliland与D.K.Walker于J.Dairy Sci.(1990)，73：905-911中报导，由猪为来源的嗜酸乳杆菌ATCC 43121(对应于CCRC 17064)及由人类来源的嗜酸乳杆菌ATCC 4356(对应于CCRC 10695)皆可在含0.3％胆盐中生长，并具有降低血清胆固醇能力。

又，Danieloson等人于J.Anim.Sci.(1989)，67：966-974中所报导的由猪分离出的嗜酸乳杆菌LA16菌株以及Dr.khem M.Shahani等人所研究并成为Nebraska Cultures，Inc.的专利产品的人类来源的嗜酸乳杆菌DDS-1分离株(为内源性人类菌株)显示具有降低血清胆固醇的能力(参见 http://www/nebraskacultures.com./benefits.html)。

Usman及Hosono于J. Dairy Sci.(1999)，82：243-248中报导，一株被分离出的乳杆菌物种加氏乳杆菌具有耐酸、耐胆盐及降胆固醇能力。

Yoshio Saito与Jun Mizutani在US 5,516,684与US 5,707,584中公开了两种嗜酸乳杆菌菌株，也即嗜酸乳杆菌FERM-P-14204与嗜酸乳杆菌FERM-P-14205，这些菌株不会展现胆汁酸的去结合作用、不会抑制养份吸收以及会降低血液与肝中的胆固醇。

就上述所提的非本土来源的乳杆菌菌株，若能由本土分离筛选出具有耐酸、耐胆盐及良好降低血清胆固醇能力等特性的本土性乳杆菌菌株，应较能确保其于国人肠道环境的适应性，这样的本土性乳杆菌菌株在作为引子或是添加至加工产品中，可确保食用后有效到达肠内并定居的诉求，而因此提高产品的机能性。

发明内容

于是，本发明的第一方面是从本土人类肠道样品中筛选出具有耐酸、耐胆盐及良好降低血清胆固醇能力等多重特性的乳杆菌分离株(isolate)。

申请人以台湾本土健康幼儿粪便作为菌株分离来源，就肠胃环境耐酸性、胆盐耐受性与降低胆固醇能力来筛选所分离出的菌株，而得到6株具有这些多重特性的新颖乳杆菌分离株，即加氏乳杆菌B21T1、B21T6、C21T1、X21B7与B38T38，以及嗜酸乳杆菌B6T7，这些分离株已于公元2002年6月18日保藏于食品工业发展研究所的“生物资源保存及研究中心”(BCRC，简称生资中心)](台湾省300新竹市食品路331号)，保藏号分别为CCRC 910195、CCRC 910196、CCRC910198、CCRC 910199、CCRC 910197以及CCRC 910194。这些分离株也有依据布达佩斯条约的规定，于公元2002年6月21日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，保藏号分别为PTA-4483、PTA-4484、PTA-4479、PTA-4480、PTA-4481以及PTA-4482。

经与以往的菌株嗜酸乳杆菌ATCC 43121、ATCC 4356与DDS-1比较，本发明的新颖乳杆菌分离株被证实具有更佳的降低胆固醇能力。

本发明的第二方面是提供一种包含有至少一种依据本发明的新颖乳杆菌分离株或其传代培养后代或由它们衍生出的突变株以及合适的赋形剂的组合物来供以制备诸如饮料、糕点、婴儿食品、酸牛乳、营养补充品、动物饲料等等的食用品。

本发明的第三方面是提供一种包含有益生有效量的至少一种依据本发明的新颖乳杆菌分离株或其传代培养后代或由它们衍生出的突变株的药物组合物，来供用于治疗与预防肠胃疾病以及降低血清胆固醇。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其它目的与特征，可借由参照下文的描述、随附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：

图1为显示本发明的新颖乳杆菌分离株与以往乳杆菌菌株在耐酸性上的比较，其中耐酸性以Δlog(a-b)来表示，a为以生理盐水(pH 7)处理2小时后的存活细胞数，而b为以生理盐水(pH 2)处理2小时后的存活细胞数；

图2为显示本发明的新颖乳杆菌分离株与以往乳杆菌菌株在胆盐耐受性上的比较，其中胆盐耐受性以Δlog(c-d)来表示，c为以MRS肉汤处理24小时后的存活细胞数，而d为以加有0.3％牛胆汁的MRS肉汤处理24小时后的存活细胞数；

图3为显示本发明的新颖乳杆菌分离株与以往的乳杆菌菌株，在加与未加0.3％牛胆汁的MRS肉汤内的生长比较；

图4为显示本发明所进行菌株降低胆固醇能力的试验而参考S.Razin等，(1980)，Biochimica Biophysica Acta，598：628-640所制备的磷脂酰胆碱-胆固醇容积与胆固醇浓度的关系。

图5为显示本发明所分离出的一株乳杆菌物种加氏乳杆菌B21T1分离株的16S rDNA的核苷酸序列；

图6显示本发明所分离出的一株乳杆菌物种加氏乳杆菌B21T6分离株的16S rDNA的核苷酸序列；

图7显示本发明所分离出的一株乳杆菌物种加氏乳杆菌C21T1分离株的16S rDNA的核苷酸序列；

图8显示本发明所分离出的一株乳杆菌物种加氏乳杆菌X21B7分离株的16S rDNA的核苷酸序列；

图9显示本发明所分离出的一株乳杆菌物种加氏乳杆菌B38T38分离株的16S rDNA的核苷酸序列；以及

图10显示本发明所分离出的一株嗜酸乳杆菌B6T7分离株与嗜酸乳杆菌以及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)之间的16S rDNA核苷酸序列差异，其中“以加框标示者”是该B6T7分离株与嗜酸乳杆菌之间的核苷酸差异地址处，而“以*标示者”是该B6T7分离株与植物乳杆菌之间的核苷酸差异地址处。

具体实施方式

为得到符合本土习性以确保能适应本国人的肠道环境的本土性乳杆菌，申请人以居住于台湾新竹地区的1至6岁健康婴幼儿的粪便作为期望菌株的筛选源，使用一系列以Rogosa琼脂基选择性培养基来筛选乳杆菌疑似菌株(suspected strains)，而从43个样品中所得的828个分离株中找到400株疑似菌株。这些疑似菌株被进一步测试是否具有于上述“发明内容”一节内所说的特性，也就是：

1.对酸的稳定性，

2.对胆盐的稳定性，以及

3.具有降低胆固醇的能力，

并将这些疑似菌株拿来与公开菌株就上述的特性作比较，而筛选出6株符合上述所求且具良好能力的新颖乳杆菌分离株。

所得到的6株分离株进一步使用API鉴定系统、微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)与16S rDNA序列分析等来作菌株鉴定，而依据鉴定结果，这6株分离株分别被分类命名为加氏乳杆菌B21T1、B21T6、C21T1、X21B7与B38T38，以及嗜酸乳杆菌B6T7，这些分离株已于公元2002年6月18日保藏于食品工业发展研究所(台湾省300新竹市食品路331号)，保藏号分别为CCRC 910195、CCRC 910196、CCRC 910198、CCRC 910199、CCRC 910197以及CCRC 910194。这些菌株也有依据布达佩斯条约的规定，于公元2002年6月21日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，保藏号分别为PTA-4483、PTA-4484、PTA-4479、PTA-4480、PTA-4481以及PTA-4482。

基于上述的有利特性，依据本发明的新颖乳杆菌分离株适用作为一种益生菌。例如，这些分离株可被配制于广泛种类的可食性材料内，可食性材料包括：流体乳品(牛奶、浓缩牛奶)、发酵乳品(优酪乳、酸乳、冷冻优格、乳酸菌发酵饮料)、奶粉、冰淇淋、乳酪、干酪、豆奶与发酵豆奶、蔬果汁、果汁及运动饮料等饮料、甜点、糖果、婴儿食品、食疗产品、动物饲料、膳食补充品等。每种产品的含菌量可为每公克或每毫升有约10⁶至10⁹菌落形成单位(CFU)。

明显地，本领域技术人员可明了，本发明的新颖乳杆菌分离株可被当作食品添加成分，借由以往的方法而在原料制备时被添加，或是不参与发酵而于发酵过程之后添加，以被配制成任何适用的形式来供人类及非人类动物的吸收。优选地，本发明的新颖乳杆菌分离株可单独地或与至少一种其它益生性生物共同配制于可食性材料内，所述其它益生性生物包括：乳杆菌属物种，如嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus lactis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、双歧双歧杆菌(Lactobacillus bifidus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、高加索乳杆菌(Lactobacillus causasicus)以及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)；链球菌属物种，如嗜热链球菌、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)；酵母菌，如念珠菌属物种Candida Kefyr、弗罗棱酵母菌(Saccharomyces florentinus)；或这些菌种的组合。

另有一种应用形式是将本发明的新颗乳杆菌分离株本身或含有此菌株的上述产品予以制成冷冻干燥粉末或喷雾干燥粉末，而使每个产品中约含10⁸至10⁹以上的活性乳杆菌菌体。将此产品添加以酵母粉、醣类或其它填充剂，可再制成锭剂或胶囊形式，例如含有乳杆菌的消化整肠药剂或者即溶冲泡食品以及供直接食用的菌体粉末。

另外，本发明也预期将上述新颖乳杆菌分离株单独地或与其它活性组份共同使用作为控制非期望肠道微生物在哺乳动物的消化道内集生的药物，以减轻该非期望肠道微生物所造成的不适肠胃症状。该组合物可被配制成溶液、乳剂、粉末、锭剂、胶囊或供用于口服给药的其它适合形式。

又，基于本发明的新颖乳杆菌分离株所具有的降低胆固醇能力，本发明也预期这些乳杆菌分离株用于制备用以降低血清胆固醇的保健食品与非处方医药品的使用。

就以上所述，预期落在本发明的技术概念范畴内的是那些具有与本发明的新颖乳杆菌分离株的细菌学特征的菌株，本发明的新颖乳杆菌分离株的传代培养后代，或是由本发明的新颖乳杆菌分离株衍生出的突变株。

如本文所用，术语“突变株”意指一种所具遗传组成相对于参考菌株或亲株有至少一个核苷酸差异(例如，经由核苷酸的取代、插入或删除所致)的菌株。除天然突变以外，本发明的突变株可借由多种方法来生成。例如，这些突变株可借由亲株的随机诱变，例如借由化学突变剂、转座子或辐射照射而获得。此外，本发明的突变株可包含重组型核酸序列。举例来说，突变株可为带有额外的核酸序列(例如经转化、转导或其他方式而插入至亲株的细胞内的序列)的菌株。该额外的核酸序列可被编码成通常地或有条件地表现的聚胜肽。另择地，该额外的核酸序列可被编码成一段能改变细胞生理学的核酸序列，例如反义、核酶或其它核酸序列。在另一例中，插入的核酸插入至内源性基因内，并改变(例如增强或破坏)该内源性基因的功能。举例来说，插入的核酸可为一种将内源性基因去活化的剔除建构物(knockout construct)；或为一种会增加内源性基因的转录作用的人工增强子或启动子。

本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，这些实施例只做为例示说明使用，而不应被解释为本发明的实施限制。

实施例1乳杆菌分离株的分离与筛选

材料与方法：

一、培养基及稀释液：

1.筛选培养基：

(A)蕃茄汁琼脂培养基

酪蛋白酶促水解产物(Sigma，Louis，Mo，USA)   10g

脱脂乳                                      10g

蕃茄汁                                      400ml

琼脂                                 12g

蒸馏水                               加至1L

(B)Rogosa琼脂培养基

Rogosa琼脂(Merck，Darmstadt，Germany)74.5g

蒸馏水                               1L

经微波加热溶解后，待冷却至55℃，以醋酸调整pH值至pH 5.5(C)乳杆菌选择培养基(LBS)

Rogosa琼脂                            8.4g

蕃茄汁                                40ml

蒸馏水                                60ml

经微波加热溶解后，待冷却至55℃，以醋酸调整pH值至pH 5.5(D)Rogosa+X-glu琼脂培养基

将80mg的5-溴-4-氯-3-吲哚基1-β-D-吡喃葡糖苷(X-glu)(Sigma，Louis，MO，USA)加入至100ml的0.2M Tris缓冲液(pH 8.5)中，并利用超声振荡溶解。将10ml所形成的溶液加入至190ml的55℃Rogosa琼脂中，即成为含X-glu最终浓度为40μg/mL的Rogosa+X-glu琼脂。

2.细菌活化培养基：

(A)Bacto乳杆菌MRS肉汤(Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)

(B)MRS琼脂：Bacto乳杆菌MRS肉汤再添加细菌琼脂(Agarbacteriological)(Scharlau Chemie S.A.，Barcelona，Spain，欧盟制造的)(15g/L)。

3.核糖利用性培养基：

基础培养基的组成：

Bacto蛋白胨3号                           10g

Bacto酵母提取物                            5g

(上述两种组份的制造商为Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)

吐温80                                     1g

柠檬酸氢铵                                 2g

乙酸钠                                     5g

硫酸镁                                     0.1g

硫酸锰                                     0.05g

磷酸氢二钾                                 2g

氯酚红                                     0.05％

蒸馏水                                     1L

利用HCl将pH值调整至pH 6.3

将配好的基础培养基分装至试管中，每管含4.5ml，经121℃灭菌15分钟后，再加入0.5ml经过滤灭菌后的10％核糖溶液。

4.稀释液

5.1％的蛋白胨水

(BACTO^TM Peptone，Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)

二、分离及筛选菌株的操作程序：

1.取1至6岁幼儿的粪便中段，以长竹签取出约一小截指头大小的样品，并将样品加入至一内含9ml稀释液(0.1％蛋白胨水)的试管中，而制成一经10倍稀释的检液，将试管管内的样品充分均匀搅拌后静置数分钟，以使样品中所含微生物释放至稀释液中；

2.取出1ml的上述稀释检液，并将稀释检液置入至另一支内含9ml稀释液的试管中，依此重复进行系列稀释直至达成10⁴-倍稀释。

3.就上述步骤2中所做的系列稀释，分别取出0.2ml已经过10²-、10³-、10⁴-倍稀释的检液，并将个别将取出的检液置于各种筛选培养基(Rogosa琼脂、蕃茄汁琼脂、乳杆菌选择培养基以及Rogosa+X-glu琼脂)上，以一L型玻棒予以涂抹均匀后，将筛选培养基置于一设定在37℃的温度下的厌氧培养箱(内含混和气体：5％H₂、10％CO₂与85％N₂)内培养2至4天；

4.挑选在Rogosa+X-glu琼脂上呈现蓝色且经显微镜检查为无移动性(non-mobile)的杆菌菌落，或是在其它筛选培养基上外观为半透明且经显微镜检查也为无移动性的杆菌菌落，以竹签挑菌并将挑出的菌置入一含有MRS肉汤以及一发酵内管的试管中，于37℃下培养1至2天后，收集生长但不产生气体且经革兰氏染色显示为阳性的菌株。

5.就上述步骤4所收集到的菌株，以MRS肉汤活化两次后，依下面所述来进行生长温度及核糖利用性试验：

(i)将1％接种物接种至一MRS肉汤内，并将该培养基置于15℃下静置培养历时14天，若有菌体生长，则表示该菌株可以于15℃生长，而若于第14天仍无菌体生长，则表示该菌株无法于15℃下生长；

(ii)将1％接种物接种至一MRS肉汤内，并将该培养基置于45℃下静置培养历时2天，若有菌体生长，则表示该菌株可以于45℃生长，而若无菌体生长，则表示该菌株无法于45℃下生长；

(iii)将1％接种物接种至一核糖利用性培养基，并于37℃下静置培养数天，若培养液由紫变黄，表示菌体可以利用核糖生长并产生酸；若7天后培养液仍为紫色，再继续静置培养，若第14天培养液仍未变成黄色，则表示此菌株无法利用核糖生长并产生酸。

三、结果：

在此实施例中，有关乳杆菌的筛菌培养基主要以Rogosa琼脂为基础，有的则再添加以番茄汁或X-glu。番茄汁含丰富维他命B群，而有利于乳杆菌的生长，而Rogosa琼脂中的醋酸除了降低pH值以抑菌外，高浓度的醋酸根离子同时也有抑制微生物生长的效果。

嗜酸乳杆菌生长在Rogosa琼脂上的外观是呈现白色菌落，而不易与其它的乳杆菌分辨。若于Rogosa琼脂中添加X-glu，嗜酸乳杆菌菌落的外观即会变成蓝色，这是因为嗜酸乳杆菌具有β-D-糖苷酶活性而会打断X-glu的β-D-糖苷键，而产生蓝色的发光团(chromogene)，进而使嗜酸乳杆菌菌落呈现蓝色。但是，于细胞中拥有此酶的微生物并不在少数，故仍须作进一步镜检、革兰氏染色及进行上述的醣类与生长温度等生理生化的试验，再挑出具有期望性质的疑似菌株。

申请人从居住于台湾新竹市地区的1至6岁健康婴幼儿粪便中，共收集了43个样品，每个样品经稀释后涂抹于各选择性培养基中，菌株长出后，再从选择性培养基中挑出颜色与型态不同的菌落进行镜检，若镜检结果为杆菌，再进行革兰氏染色，挑选出革兰氏阳性的杆菌，并将称为分离株。将这些分离株置于含发酵内管的MRS肉汤中，再从中挑选出不会产生气体的菌株来进行生长温度与核糖利用性试验。若测试的菌株能在45℃下生长但不能在15℃下生长，且不能利用核糖作为生长所需碳源的菌株则进行保存，于此阶段所收集的菌株被称作为疑似菌株。

参见表1，申请人在所收集的43个样品中总计挑选出828株分离株，其中有400株疑似菌株。关于菌株编号方式，举B6T7为例，B是指培养基种类(LBS)，6是指样品来源标号，T是指菌株颜色(外观透明)，而7是指菌落的流水标号。

              表1.收集的样品^*标号及其分离株数

样品标号	分离株数	疑似菌株	样品标号	分离株数	疑似菌株
						1	40	0	23	3	0
2	0	0	24	0	0
						3	0	0	25	100	100
4	26	0	26	0	0
						5	45	0	27	0	0
6**	68	55	28	0	0
						7	0	0	29	0	0
8	0	0	30	60	0
						9	0	0	31	0	0
10	0	0	32	0	0
						11	0	0	33	0	0
12	60	60	34	0	0
						13	0	0	35	0	0
14	0	0	36	139	115
						15	0	0	37	0	0
16	0	0	38**	120	40
						17	0	0	39	0	0
18	0	0	40	0	0
						19	0	0	42	60	0
20	14	0	42	0	0
						21**	30	30	43	60	0
22	3	0	总数	823	400

^*：样品来源：台湾新竹市的1至6岁幼儿的粪便

^**：本发明分离株的样品来源编号

这些疑似菌株接着进行下面实施例所描述的耐酸性、胆盐耐受性试验及降低胆固醇能力试验，其中6株经试验而显示具有良好特性的分离株，即B21T1、B21T6、C21T1、X21B7、B38T38与B6T7，被拿来下列以往的菌株进行这些性质的比较：

1.嗜酸乳杆菌CCRC 17064(对应于ATCC 43121，分离来源为猪)，此菌为具降低血清胆固醇能力的乳杆菌(S.E.Gilliland等，(1985)，Appl.Environ.Microbiol.，49：377-381；S.E.Gilliland和D.K.Walker)(1990)，J.Dairy Sci.，73：905-911；F.A.M.Kalver and R.van der Meer(1993)，Appl.Environ.Microbiol，59：1120-1124；D.O.Noh等，(1997)，J.Dairy Sci.，82：3107-3113)；

2.嗜酸乳杆菌CCRC 10695^T(对应于ATCC 4356，分离来源为人类)，此菌为来自人体的嗜酸乳杆菌标准株(D.K.Walker和S.E.Gilliland(1993)，J.Dairy Sci.，76：956-961)，

3.嗜酸乳杆菌DDS-1(分离来源为人类)，此菌为目前市面有售的产品(Nebraska Cultures，Inc.)；

4.嗜酸乳杆菌CCRC 14065[对应于CSCO 2401，商业上可获自于Commonwealth Scientific Industrial Research Organization(CSIRO)，Canberra，Austrilia]；以及

5.一种乳杆菌物种的保藏物加氏乳杆菌CCRC 14619^T(对应于ATCC 33323，分离来源为人类)(Int.J.Syst.Bacteriol.(1980)，30，601；E.Lauer and O.Kandler，Bakteriol.Parasitenkd.Infektionskr.Hyg.Abt.1Orig.Reihe C，1980，1，75-78)。

实施例2耐酸性试验

一、实验操作程序：

参考J.E.Holcombe等，(1991)，Cult.Dairg Prod.J.，26(3)：4-5以及授予Y.S.Yang等人的US 5,711,977中所公开的方法，以中性(pH 7)及仿胃酸环境(pH 2)中来作存活菌数的测试。

各试验菌株以MRS肉汤活化两次后，取其菌液离心(3000rpm，10分钟)，去除上清液后，添加1m1的生理食盐水溶液(0.85％NaCl，pH 7)，先以竹签将菌体搅散，再振荡均匀，然后分别取0.5ml经散浮的菌液置于pH 7及pH 2的生理食盐水溶液中，于37℃的恒温培养箱内静置2小时后，分别测其存活菌数。Δlog菌数[＝log(在pH 7下的菌数-在pH2下的菌数)]的数值越小，视为耐酸性较佳的菌株。

二、结果：

大部分的微生物在酸性环境中均无耐受性。乳酸菌本身虽为产酸菌，但其生长环境只能达pH 3.2至4.5，因此，在胃中极低pH的环境(pH2.0至3.2)也成为影响它存活的主要因素。胃酸pH值会随胃内容物进入时间及种类而有pH 1.5～4.5之不同，平均历时2小时，故试验时采用pH 2作为代表，且因酸性物质与盐酸相似，故以经盐酸调整pH值为2的生理食盐水(0.85％NaCl/0.01N HCl系统)，于37℃下处理2小时后测试存活的菌数，并与pH 7的对照组作比较。

试验结果显示，经不同pH值，37℃/2h处理后，以嗜酸乳杆菌CCRC 17064耐酸性为最佳(图1)，接受处理的菌数只降低1.9个log值，而嗜酸乳杆菌CCRC 10695^T与加氏乳杆菌CCRC 14619^T的耐酸性较差，菌数分别降低4.3及4.4个log值。

本发明于实施例1所得到的新分离株B21T1(后经细菌学特征鉴定被分类为加氏乳杆菌，如下面实施例所示)与CCRC 14065的耐酸性相近，菌数降低了3.9个log值。在本发明中另外5个分离株(B21T6、C21T1、X21B7、B38T38与B6T7)的耐酸性相近，且皆达到Δlog菌数小于4的耐酸性筛选指针(参见Y.S.Yang等人的US 5,711,977)。

实施例3.胆盐耐受性试验

一、实验操作程序：

各试验菌株以MRS肉汤活化两次后，再分别取1％接种物接种于10ml MRS肉汤以及10mL含0.3％牛胆汁的MRS肉汤(MRSO)中，于37℃培养24小时后，以分光光度计分别测定菌体浓度(OD₆₆₀)。另外，也计数其残存菌数，其中Δlog菌数值＝log(MRS肉汤的菌数-MRSO肉汤的菌数)，而Δlog菌数值越小，表示试验菌株的胆盐耐受性越佳。

二、结果：

乳酸菌经胆盐处理后，不同菌种间的存活率有很大差异，因此，筛选具有胆盐耐受性的乳酸菌株在选用益生菌上有其重要性(S.E.Gilliland等，(1984)，J.Dairy Sci.，67：3045-3051；P.Marteau等，(1997)，J.Dairy Sci，80：1031-1037)。于先前的研究中，牛胆汁被普遍使用于培养基中来供选择培养人类肠内菌，因此其效力应很类似于人类胆盐且平均浓度为0.3％(w/v)(S.E.Gilliland和D.K.Walker(1990)，J.Dairy Sci.，73：905-911；D.K.Walker和S.E.Gilliland(1993)，J.Dairy Sci.，76：956-961)。

试验结果显示，除CCRC 10695^T、CCRC 14619^T、CCRC 14065外，各试验菌株不论在含有或不含0.3％牛胆汁的培养基中，所测得的OD₆₆₀值(菌体浓度)皆在2以上(表2)，这显示0.3％牛胆汁对于试验菌株的生长，似乎影响不大。

表2.试验菌株培养物在含有或不含0.3％牛胆汁的MRS肉汤内培养24小时的生长比较

培养物	菌体浓度(OD660值)
				MRS肉汤	MRS肉汤+0.3％牛胆汁
B6T7	2.49	2.74
			C21T1	2.44	2.56
B38T38	2.45	2.03
			B21T1	2.57	2.53
B21T6	2.62	2.29
			X21B7	2.69	2.50
CCRC 17064	2.91	2.37
			CCRC 10695T	2.35	1.09
CCRC 14065	2.55	1.79
			CCRC 14619T	2.96	1.58
DDS-1	2.87	2.72

但是，要注意到本发明的B6T7及C21T1这两个菌株在MRSO肉汤的菌体浓度高于MRS肉汤，这显示可能有其它干扰因子形成而影响到吸光。因此，进一步观察试验菌株在两组培养基内培养24小时后的存活菌数。

参见图2，由观察到的菌数降低可知，CCRC 14619^T的胆盐耐受性较差，其次为CCRC 10695^T以及本发明的B38T38菌株。而胆盐耐受性最佳者为本发明的分离株B6T7，其余各菌株的胆盐耐受性相近，即于含0.3％牛胆汁的MRS肉汤中培养24小时后，其死灭菌数皆在1至2个log值内。

另外，观察部分菌株在含0.3％牛胆汁的MRS肉汤中的生长曲线，以生长曲线斜率代表生长速率，斜率越大，表示生长速率越快，即胆盐耐受性较佳。由图3可知，CCRC 17064的生长速率最快，其次为本发明的分离株X21B7与B21T1，而CCRC 14065、CCRC 10695^T及DDS-1的生长最慢。

虽然由不同观测方式所得的结果略有小差异，由这些试验可知，本发明所筛选出的乳杆菌皆具有耐酸性及胆盐耐受性。

实施例4.菌株降低胆固醇能力的分析

一、实验操作程序：

(A)胆固醇来源

关于菌株降低胆固醇能力的测试，以往文献与已公开的专利申请所用的胆固醇来源大多采用PPLO(BACT PPLO SERUM FRACTION)，但此产品目前已停止生产，因此，于本实施例中，申请人参考Huang，C.and T.E.Thomopson(1974)，Methods Enzymol.32：485-489以及S.Razin等，(1980)Biochimica Biophysica Acta，598：628-640中所揭示的磷脂酰胆碱-胆固醇制备方法，采用马血清及磷脂酰胆碱-胆固醇作为胆固醇来源，而制备出一均匀分布的磷脂酰胆碱-胆固醇溶液容积与所含胆固醇浓度呈一正相关曲线关系(图4)。

1.马血清

将马血清溶于水中，以孔径为0.45μm的过滤膜予以过滤后并存放于-20℃冰箱中。

2.磷脂酰胆碱-胆固醇[蛋卵磷脂(Egg Lecithin)+胆固醇]

依据S.Razin等，(1980)，Biochimica Biophysica Acta，598：628-640，将蛋卵磷脂及胆固醇加入至一真空旋转蒸发仪(EYELA)的磨砂塞瓶中，以足量的氯仿将其均匀溶解，再以氮气吹干，以使胆固醇与蛋卵磷脂均匀混合并在磨砂塞瓶内的玻璃壁上形成一均匀薄膜，接着以0.4M蔗糖溶液予以覆溶(re-dissolved)，将氮气吹入至该磨砂塞瓶内并封上瓶盖，再以铝箔包覆，以降低脂质氧化的机率。

在4℃下以水浴式超声震荡器震荡该经密封的磨砂塞瓶历时15分钟后，将上述混合溶液加压通过具一孔径为0.22μm的过滤膜2次，随即保存于4℃冰箱内(须于3天内使用)。

(B)试验组别

试验(1)：试验菌株以MRS肉汤活化两次后，取1％接种物接种于10mlMRSS(内含8.8ml MRS以及1.2ml胆固醇溶液与0.3％牛胆汁)中，并于37℃的厌氧培养箱(10％CO₂及90％N₂)内培养历时24小时，然后依下面(C)项中所述，收集接种有试验菌株的培养物的上清液样品以及细胞沉淀丸样品来供胆固醇含量测定使用。

试验(2)：菌株以MRS肉汤活化两次后，取1％接种物接种于10mLMRSO中，在37℃下培养历时20至22小时，再取出1％接种物接种于10mL MRSS中，并于一为37℃的厌氧培养箱(10％CO₂及90％N₂)内培养历时24小时，然后依下面(C)项中所述，收集接种有试验菌株的培养物的上清液样品以及细胞沉淀丸样品来供胆固醇含量测定使用。

(C)胆固醇含量的测定

胆固醇含量的测定是依据对苯二甲醛(o-phthalaldehyde)方法来进行(L.L.Rudel和M.D.Morris(1973)，Notes on Methodology，14：364-366；S.E.Gilliland等，(1985)，Appl.Environ.Microbiol，49：377-381)。

就上述试验(1)与试验(2)，各取1ml的测试菌液，以12000rpm离心10分钟后，将0.5ml上清液置于一试管中，此即为接种有试菌株的培养物的上清液样品。

就上述试验(1)与试验(2)，各取1ml的测试菌液，以3000rpm离心10分钟后，除去上清液，所形成的细胞团粒(cell-pellet)以10ml MRSO肉汤覆溶并混合均匀后，取出0.5ml溶液置于一试管中，此即为接种有试验菌株培养物的细胞沉淀丸样品。

各测试样品予以加入3ml的95％乙醇并振荡均匀，再加入2ml 50％KOH振荡均匀，接着于60℃水浴下加热10分钟，再置于室温下冷却。经冷却的溶液予以加入5ml己烷并振荡均匀，再加入3ml的H₂O。所形成的混合物在振荡均匀后于室温下静置15分钟，取出2.7ml的己烷层并移到另一试管内，于60℃下利用氮气将己烷蒸发。蒸发后的固体被加入4ml的对苯二甲醛试剂溶液(0.5mg对苯二甲醛/1ml乙酸)，振荡均匀后静置于室温下历时10分钟，再加入2ml浓硫酸，振荡均匀后静置于室温下历时10分钟，再以分光光度计来测定OD₅₅₀值。

(D)菌株降低胆固醇能力的评估

依据下列公式来评估菌株降低胆固醇的能力：

A＝100-[(B/C)×100]

A＝胆固醇的降低率(％)

B＝接种有试验菌株的培养物的上清液样品内的胆固醇含量(mg)

C＝未接种有试验菌株培养物的上清液样品内的胆固醇含量(对照组)

若A值达80％以上，即视为具有明显下降胆固醇能力。

(E)试验菌株的胆固醇同化作用的评估

A′＝100-[(B′+C′)×100]

A′＝胆固醇的同化作用(％)

B′＝接种有试验菌株培养物的上清液样品内的胆固醇含量(％)

C′＝接种有试验菌株培养物的细胞沉淀丸样品内的胆固醇含量(％)

若A′值达15％以上，即视为具明显胆固醇同化能力。

二、结果：

I、菌株降低胆固醇的能力

比较试验(1)(也即在MRS肉汤内的生长)与试验(2)(也即在MRSO肉汤内的生长)，两者间的差别在于试验(2)中的试验菌株有先被接种至MRSO肉汤内培养20至22小时，再取1％接种物予以接种至10ml MRSS中，此用意是在于再一次筛选菌株是否有好的胆盐耐性，同时也可筛选具有降胆固醇能力的菌株。

以马血清作为胆固醇来源的试验结果显示(表3)，以往的嗜酸乳杆菌CCRC 17064以及DDS-1，在此试验同样也有明显效果，降低胆固醇能力达88至98％。而CCRC 14065、CCRC 10695^T与CCRC 14619^T的降胆固醇能力则不明显，这可能是因为这些菌株的胆盐耐性较差，在MRSO肉汤内的生长较差，以致所观察到的降低胆固醇能力只达30至43％。

而本发明所得的分离株B6T7、C21T1、B21T1、B21T6、B38T38及X21B7在两组试验中，降低胆固醇的能力皆达91至99％以上，略高于CCRC 17064及DDS-1所具有的，而显示出本发明所筛选的菌株也具有良好的降低血清胆固醇的能力。

表3.试验菌株降低胆固醇(马血清模型)^a能力的评估

培养物	于MRS肉汤b内的生长		于MRSO肉汤c内的生长
					胆固醇d(μg/ml)	胆固醇降低率(％)	胆固醇d(μg/ml)	胆固醇降低率(％)
	B6T7C21T1B38T38B21T1B21T6X21B7CCRC 17064CCRC 10695CCRC 14065CCRC 14619DDS-1Control	6.710.692.243.102.841.341.128.0011.702.845.9486.06	92.299.297.496.696.798.498.790.786.496.793.1-	7.142.417.570.342.243.279.8156.9759.9049.145.1686.06					92.797.291.299.697.496.288.433.830.442.994.0-

^a：补充有0.3％牛胆汁与12％马血清的MRS肉汤。

^b：在试验前，所有培养物使用1％接种物被传代培养于MRS肉汤内，并于37℃下培养历时24小时。

^c：在试验前，所有培养物使用1％接种物被传代培养于MRSO肉汤(MRS肉汤加上0.3％牛胆汁)内，并于37℃下培养历时24小时。

^d：肉汤内的初始胆固醇含量为86.06μg/ml。

参见表4，比较马血清试验中具有降低胆固醇能力的菌株，改以磷脂酰胆碱-胆固醇作为胆固醇来源时，发现到各菌株的胆固醇降低率(％)有下降趋势，这显示乳杆菌菌株对于不同型态的胆固醇的降低能力会有变化，其中CCRC 17064对于磷脂酰胆碱-胆固醇的降低率为11至29％，而本发明所得到的菌株对于磷脂酰胆碱-胆固醇的降低率为23至48％，显然要比CCRC 17064为高，但略低于DDS-1所具有的50％。

表4.试验菌株降低胆固醇(磷脂酰胆碱-胆固醇模型)^a能力的评估

培养物	于MRS肉汤b内的生长		于MRSO肉汤c内的生长
					胆固醇d(μg/ml)	胆固醇降低率(％)	胆固醇d(μg/ml)	胆固醇降低率(％)
	B6T7C21T1B38T38B21T1B21T6X21B7CCRC 17064DDS-1Control	45.0530.7133.7532.3435.4335.1152.6629.2459.22	23.9248.1543.0145.3940.1640.7111.0750.63-	33.7043.5935.1632.8336.2539.2942.0129.4659.22					43.1026.4040.6244.5738.7933.6529.0650.26-

^a：补充有0.3％牛胆汁与12％磷脂酰胆碱-胆固醇的MRS肉汤。

^b：在试验前，所有培养物使用1％接种物被传代培养于MRS肉汤内，并于37℃下培养历时24小时。

^c：在试验前，所有培养物使用1％接种物被传代培养于MRSO肉汤(MRS肉汤加上0.3％牛胆汁)内，并于37℃下培养历时24小时。

^d：肉汤内的初始胆固醇含量为59.22μg/ml。

II、试验菌株对胆固醇的同化作用

有关乳酸菌降低胆固醇的机制，主要是利用胆固醇和去结合的胆盐(deconjugated bile salt)产生共沉淀而将胆固醇排除(F.A.M.Kalver和R.van der Meer(1993)，同前述；M.M.Brashears和S.E.Gililland(1997)，同前述)，以及菌株本身对胆固醇的同化作用(Gilliland等，(1985)，同前述；D.O.Noh等，(1997)；同前述；以及张和骆等人(1998)，同前述)。

参见表5所示，可看出CCRC 17064、本发明所得到的6个分离株以及DDS-1对胆固醇皆具有同化作用，但不同菌株对于胆固醇的同化能力略有差异，所观察到的同化率约在11至40％左右。而CCRC 14065及CCRC 10695^T及CCRC 14619^T的胆固醇同化能力则不明显。

                      表5.试验菌株的胆固醇^a同化率的评估

培养物	MRS肉汤b内的生长			于MRSO肉汤c内的生长
							用过的肉汤培养基内的胆固醇d(％)	细胞沉淀丸内的胆固醇(％)	被同化的胆固醇(％)	用过的肉汤培养基内的胆固醇(％)	细胞沉淀丸内的胆固醇(％)	被同化的胆固醇(％)
	B6T7C21T1B38T38B21T1B21T6X21B7CCRC 17064CCRC 10695CCRC 14065CCRC 14619DDS-1	7.80.82.63.43.31.61.39.313.63.36.9	51.486.079.181.767.267.068.571.782.080.678.5	40.813.218.314.929.531.430.219.04.416.114.6	7.32.88.80.42.63.811.666.269.657.16.0	74.172.383.788.481.471.372.933.427.842.781.3							18.624.97.511.216.024.915.50.42.60.211.2

^a：补充有0.3％牛胆汁与12％马血清的MRS肉汤。

^b：在试验前，所有培养物使用1％接种物被传代培养于MRS肉汤内，并于37℃下培养历时24小时。

^c：在试验前，所有培养物使用1％接种物被传代培养于MRSO肉汤(MRS肉汤加上0.3％牛胆汁)内，并于37℃下培养历时24小时。

^d：对照组内的胆固醇浓度被界定为100份。

综合以上试验结果，本发明所筛选出的6株本土性乳杆菌分离株显示具有良好耐酸、耐胆盐及降胆固醇能力的特性。于下进一步进行这些分离株的细菌学特征鉴定。

实施例5.乳杆菌分离株的鉴定和表征

一、实验操作程序

(1)初步试验

将新鲜培养(18至24小时)的菌株进行初步鉴定，试验项目包括：革兰氏染色、形态观察、过氧化氢酶反应、游动性(motility)、在好氧与厌氧条件下的长情形等试验(O.Kandler和N.Weiss(1986)，Regular，nonsporing Gram-positive rods and Cocci.In：Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology.(Sneath，P.H.A.，Mair，N.S.，Sharpe，M.E.和Hotl，J.G.，ed.)Vol.II.pp.1208-1234.The Williams & Wilkins Co.，Baltimore，USA)。

(2)API鉴定系统

此鉴定试验是依据G.H.Fleet等，(1984)，Appl. Environ.Microbiol.48：1034-1038，而乳酸菌鉴定是使用API 50 CHL套组(法国APIBioMerieux Research laboratory，La Balme Les Grottes，Montalien，Jeraeh，France)，所用的测试项目为：甘油、赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、L-木糖、侧金盏糖醇、β-甲基-木糖苷、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、甘露糖醇、山梨糖醇、α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊粉(inuline)、松三糖、D-棉籽糖、淀粉(amidon)、糖原、木糖醇、β-龙胆二糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸等49种碳源的产酸试验。

此系统的操作程序为：以无菌棉棒沾取平板上的菌落，将菌落均匀悬浮于2ml的0.85％生理食盐水中，以灭菌过的滴管吸取悬浮菌液，置n滴于另一5ml的0.85％无菌生理食盐水中，使其浓度与McFarland No.2(由9.8ml的1％H₂SO₄与0.2ml的1％BaCl₂所构成的混合溶液)的标准液浓度相当。此时另取悬浮菌液，置2n滴于API 50CHL培养液的玻璃管中，予以混合均匀后，分别加入适当体积至每个测试条的孔洞(tubes of the strip)中，并加盖矿物油，然后放入培养盒(incubation tray)中(盒内事先加水，以使培养时培养液不被蒸干)，加上盖子(incubation lid)后置于37℃下培养历时48小时，之后取出判读。将结果记录下来，并与API LAB Software鉴定系统的数据库做比对，以鉴定出最适当的属名与种名。

(3)微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)

此鉴定试验是依据M.Rogosa等，(1971)，Method for coding data onmicrobial strains for computers(edition AB)，Int.J.Syst.Bacteriol.21：1A-184A，利用Micro-IS System的Matrix 5[乳杆菌物种适用]，所用的测试项目包括：游动性；温度生长试验(15℃、45℃)；好氧下生长；D-葡萄糖及葡萄糖酸产气试验，苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、乳糖、麦芽糖、D-甘露糖醇、D-甘露糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、L-鼠李糖、D-核糖、水杨苷、D-山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、D-木糖等的产酸试验，七叶苷的水解以及L-精胺酸脱氨基作用的生长试验等。将各项试验的正、负结果输入Micro-IS计算机鉴定程序中，即可得到鉴定的属名或种名。

(4)16S rDNA序列分析

此鉴定试验是依据Rosenblum等，(1997)，Nucleic Acid Res.，25：4500-4504，将新鲜的菌体刮取少许放入1.5ml微量离心管中，以蛋白酶K及RNA酶处理后，利用自旋管柱(spin column)取得基因组DNA后，进行聚合酶链反应扩增，接着纯化。PCR扩增后的产物经电泳确认后，以MicroSeq^TM 16SrDNA Gene Kit(PE Co.，USA)进行反应，接着利用ABI Prism 310 Genetic Analyzer进行DNA序列分析，再将所得的12条DNA序列以MicroSeq^TM软件(PE Co.，USA)来进行分析、整合，可得到约1500bp的16S rDNA序列，然后再与DNA数据库(MicroSeq^TMReference Manual，1999，PE CO.，USA)进行比对分析。

二、结果

1.本发明的分离株B21T1

(i)依初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具过氧化氢酶，无移动性，于好氧及厌氧条件下均可生长；

(ii)利用API System的API 50CHL鉴定套组，所得的测试结果如表6所示，鉴定分数为91.0(％ID)，鉴定结果为嗜酸乳杆菌；

(iii)以微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)进行本发明的分离株B21T1的鉴定，所得结果如表7所示，鉴定菌名为嗜酸乳杆菌，鉴定分数达0.682(ID计分)；

本发明的分离株B21T1的16S rDNA序列分析结果如图5所示，将所得序列与DNA数据库(MicroSeq^TM Reference Manual，1999，PE CO.，USA)进行比对，发现本发明的分离株B21T1的16S rDNA序列(SEQ IDNO：1)与加氏乳杆菌[为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群]的16S rDNA序列相似度最高(G.Klein等，(1998)，International Jourmal of Food Microbiology.41：103-125)；

                                      表6

菌株编号：B21T1

鉴定效果的描述：可疑的结果

---------------------------------------------------------------------

测试条：API 50CHL

结果(profile)：------------ -+-+？---- --++-++++- -+-------+-------------

50种醣类反应结果

0     -  GLY   -  ERY   -  DARA  -  LARL  -  RIB  -  DXYL -  LXYL -  ADO  -MDX  -  GAL   -

GLU   +  FRU   -  MNE   +  SBE   ？ RHA   -  DUL  -  INO  -  MAN  -  SOR  -MDM  -  MDG   -

NAG   +  AMY   +  ARB   -  ESC   +  SAL   +  CEL  +  MAL  +  LAC  -  MEL  -SAC  +  TRE   -

INU   -  MLZ   -  RAF   -  AMD   -  GLYG  -  XLT  -  GEN  +  TUR  -  LYX  -TAG  -  DFUC  -

LFUC  -  DARL  -  LARL  -  GNT   -  2KG   -  5KG-

---------明显的分类---------------------％Id.----------T------针对菌种的试验----------

可能的菌株名

 嗜酸乳杆菌                                1       91.0       0.53      3

下一个选择

一种乳杆菌物种卷曲乳杆菌(Lacto.crispatus)  2       5.4        0.35      4----------------------------------------------------------------------------------------------

嗜酸乳杆菌              1∶3针对下列的试验(注：若要确立为嗜酸乳杆菌所建议的部分醣类再测试)

半乳糖             (GAL)    75％                   D-果糖     (FRU)     100％

海藻糖             (TRE)    77％

                         表7

Micro-IS系统

菌株名称：B21T1、B21T6、C21T1、X21B7、B6T7

-013001游动性            -006001内孢子

-017013生长15℃          +017017生长45℃

+016059好气性生长        -024045葡萄糖成为CO₂

-028528葡萄糖酸，气体    +025203苦杏仁苷，酸

-025181L-阿拉伯糖酸      +025211纤维二糖，酸

+025193D-果糖，酸        +025194D-半乳糖，酸

+025195D-葡萄糖，酸      +025212乳糖，酸

+025213麦芽糖，酸        -026371D-甘露糖醇，酸

+025196D-甘露糖，酸      -025217落叶松糖，酸

+025214木蜜二糖，酸      +025218棉籽糖，酸

-025191L-鼠李糖，酸      -025184D-核糖，酸

+025210水杨苷，酸        -026374D-山梨糖醇，酸

+025215蔗糖，酸          +025216海藻糖，酸

-025186D-木糖，酸        +028060L-苹果酸利用性

^*检验^{*             **}ID计分   ^**可能性      ^**最佳可能性。

1嗜酸乳杆菌           0.68224     0.079110108    0.0791101

2犊乳杆菌(L.vitulinus)0.31761     0.036828671    0.1104860

建议再做的试验                ^**成组的数值^**单独的数值

1 024029(L+)乳酸生成                      1

依上述鉴定结果，本发明的分离株B21T1最可能为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群--加氏乳杆菌。

2.本发明的分离株B21T6

(i)依初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具过氧化氢酶，无移动性，在好氧及厌氧条件下均可生长；

(ii)利用API System的API 50CHL鉴定套组，所得的测试结果如表8所示，鉴定分数为93.6(％ID)，鉴定结果为嗜酸乳杆菌；

(iii)以微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)进行本发明的分离株B21T6的鉴定，所得结果如表7所示，鉴定菌名为嗜酸乳杆菌，鉴定分数达0.682(ID计分)；

(iv)本发明的分离株B21T6的16S rDNA序列分析结果如图6所示，将所得序列与DNA数据库(MicroSeq^TM Reference Manual，1999，PECO.，USA)进行比对，发现本发明的分离株B21T6的16S rDNA序列(SEQ ID NO：2)与加氏乳杆菌[为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群]的16S rDNA序列相似度最高；

(v)依上述鉴定结果，本发明的分离株B21T6最可能为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群--加氏乳杆菌；

                               表8

菌株编号：B21T6

鉴定效果的描述：对于此菌属显示出有极佳的鉴定结果

--------------------------------------------------------------------

测试条：API 50CHL

结果(profile)：---------- -++------- --+--+++-- -+-------- -------------

50种醣类反应结果

0     -  GLY  -  ERY   -  DARA  -  LARL  -  RIB  -  DXYL  -  LXYL  -  ADO  -  MDX  -  GAL  -

GLU   +  FRU  +  MNE   -  SBE   -  RHA   -  DUL  -  INO   -  MAN   -  SOR  -  MDM  -  MDG  -

NAG   +  AMY  +  ARB   -  ESC   +  SAL   +  CEL  +  MAL   +  LAC   -  MEL  -  SAC  +  TRE  -

INU   -  MLZ  -  RAF   -  AMD   -  GLYG  -  XLT  -  GEN   +  TUR   -  LYX  -  TAG  -  DFUC -

LFUC  -  DARL -  LARL  -  GNT   -  2KG   -  5KG  -

---------明显的分类-----------------------％Id.---------T--------针对菌种的试验---------------

可能的菌株名

嗜酸乳杆菌                       3    93.6      0.80      1

德氏乳杆菌德氏亚种Lacto.Delb.delb.    6.0       0.65      5

下一个选择

卷曲乳杆菌                            0.2       0.39      4

---------------------------------------------------------------------

嗜酸乳杆菌      1∶1针对下列的试验(注：若要确立为嗜酸乳杆菌所建议的部分醣类再测试)

D-麦芽糖              (MAL)         75％

3.本发明的分离株C21T1

(i)依初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具过氧化氢酶，无移动性，在好氧及厌氧条件下均可生长；

(ii)利用API System的API 50CHL鉴定套组，所得的测试结果如表9所示，鉴定分数为95.6(％ID)，鉴定结果为嗜酸乳杆菌；

(iii)以微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)进行本发明的分离株C21T1菌株的鉴定，所得结果如表7所示，鉴定菌名为嗜酸乳杆菌，鉴定分数达0.682(ID计分)；

(iv)本发明的分离株C21T1的16S rDNA序列分析结果如图7所示，将所得序列与DNA数据库(MicroSeq^TM Reference Manual，1999，PECO.，USA)进行比对，发现本发明的分离株C21T1的16S rDNA序列(SEQID NO：3)与加氏乳杆菌[为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群]的16S rDNA序列相似度最高；

(v)依上述鉴定结果，本发明的分离株C21T1最可能为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群--加氏乳杆菌。

                                表9

菌株编号：C21T1

鉴定效果的描述：良好的鉴定-----------------------------------------------------------------------

测试条：API 50CHL

结果(profile)：---------- -++------- --++-++++- -+-------+ ---------------

50种醣类反应结果

0     -  GLY   -  ERY   -  DARA  -  LARL  -  RIB  -  DXYL  -  LXYL   -  ADO   -  MDX  -  GAL   -

GLU   +  FRU   +  MNE   -  SBE   -  RHA   -  DUL  -  INO   -  MAN    -  SOR   -  MDM  -  MDG   -

NAG   +  AMY   +  ARB   -  ESC   +  SAL   +  CEL  +  MAL   +  LAC    -  MEL   -  SAC  +  TRE   -

INU   -  MLZ   -  RAF   -  AMD   -  GLYG  -  XLT  -  GEN   +  TUR    -  LYX   -  TAG  -  DFUC  -

LFUC  -  DARL  -  LARL  -  GNT   -  2KG   -  5KG  -

-------------明显的分类-------------------------％Id.-----T---------针对菌种的试验--------------

可能的菌株名

嗜酸乳杆菌              1            95.6       0.70       3

下一个选择

卷曲乳杆菌                           1.5        0.53       5

----------------------------------------------------------------------------------

嗜酸乳杆菌       1∶3针对下列的试验(注：若要确立为嗜酸乳杆菌所建议的部分醣类再测试)

半乳糖           (GAL)       75％     D-甘露糖     (MNE)     96％

海藻糖           (TRE)       77％

4.本发明的分离株X21B7

(i)依初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具过氧化氢酶，无移动性，在好氧及厌氧条件下均可生长；

(ii)利用API System的API 50CHL鉴定套组，所得测试结果如表10所示，鉴定分数为94.3(％ID)，鉴定结果为嗜酸乳杆菌；

(iii)以微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)进行本发明的分离株X21B7的鉴定，所得结果如表7所示，鉴定菌名为嗜酸乳杆菌，鉴定分数达0.682(ID计分)；

(iv)本发明的分离株X21B7的16S rDNA序列分析结果如图8所示，将所得序列与DNA数据库(MicroSeq^TM Reference Manual，1999，PECO.，USA)进行比对，发现本发明的分离株X21B7的16S rDNA序列(SEQ ID NO：4)与加氏乳杆菌[为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群]的16S rDNA序列相似度最高；

(v)依上述鉴定结果，本发明的分离株X21B7最可能为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群--加氏乳杆菌。

                                 表10

菌株编号：X21B7

鉴定效果的描述：良好的鉴定

-----------------------------------------------------------------

测试条：API 50CHL

结果(profile)：---------- ++?------- --++-++++- -+-------+ ----------

50种醣类反应结果

0     -  GLY   -  ERY    -  DARA   -  LARL   -  RIB   -  DXYL   -  LXYL  -  ADO   -  MDX   -  GAL    +

GLU   +  FRU   ？ MNE    -  SBE    -  RHA    -  DUL   -  INO    -  MAN   -  SOR   -  MDM   -  MDG    -

NAG   +  AMY   +  ARB    -  ESC    +  SAL    +  CEL   +  MAL    +  LAC   -  MEL   -  SAC   +  TRE    -

INU   -  MLZ   -  RAF    -  AMD    -  GLYG   -  XLT   -  GEN    +  TUR   -  LYX   -  TAG   -  DFUC   -

LFUC  -  DARL  -  LARL   -  GNT    -  2KG    -  5KG  -

--------明显的分类---------------------％Id.------T------针对菌种的试验----------

可能的菌株名

嗜酸乳杆菌                         1   94.3    0.65    2

下一个选择

有害片球菌(Pediococcus Damnosus)   2   2.0     0.43    3

----------------------------------------------------------------

嗜酸乳杆菌                1∶2针对下列的试验(注：若要确立为嗜酸乳杆菌所建议的部分醣类再测试)

D-甘露糖E           (MNE)      96％       海藻糖       (TRE)      77％

5.本发明的分离株B38T38

(i)依初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具过氧化氢酶，无移动性，在好氧及厌氧条件下均可生长；

(ii)利用API System的API 50CHL鉴定套组，所得的测试结果如表11所示，鉴定分数为90.8(％ID)，鉴定结果为嗜酸乳杆菌；

(iii)以微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)进行本发明的分离株B38T38菌株的鉴定，所得结果如表12所示，鉴定菌名为嗜酸乳杆菌，鉴定分数达0.646(ID计分)；

(iv)本发明的分离株B38T38的16S rDNA序列分析结果如图9所示，将所得序列与DNA数据库(MicroSeq^TM Reference Manual，1999，PECO.，USA)进行比对，发现本发明的分离株B38T38的16S rDNA序列(SEQ ID NO：5)与加氏乳杆菌[为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群]的16S rDNA序列相似度最高；

(v)依上述鉴定结果，本发明的分离株B38T38最可能为嗜酸乳杆菌族群中的B₁群--加氏乳杆菌。

                                表11

菌株编号：B38T38

鉴定效果的描述：良好的鉴定

-------------------------------------------------------------------

测试条：API 50CHL

结果(profile)：---------- ++++------ --+-+++++- -++------+ ----------

50种醣类反应结果

0     -  GLY    -  ERY    -  DARA   -  LARL   -  RIB   -  DXYL   -  LXYL   -  ADO   -  MDX    -  GAL    +

GLU   +  FRU    +  MNE    +  SBE    -  RHA    -  DUL   -  INO    -  MAN    -  SOR   -  MDM    -  MDG    -

NAG   +  AMY    -  ARB    +  ESC    +  SAL    +  CEL   +  MAL    +  LAC    -  MEL   -  SAC    +  TRE    +

INU   -  MLZ    -  RAF    -  AMD    -  GLYG   -  XLT   -  GEN    +  TUR    -  LYX   -  TAG    -  DFUC   -

LFUC  -  DARL   -  LARL   -  GNT    -  2KG    -  5KG   -

------明显的分类-------------------％Id.-----T----------针对菌种的试验-------

可能的菌株名

嗜酸乳杆菌                           1    90.8    0.93    0

下一个选择

德氏乳杆菌乳亚种(Lacto.deld.lactis)  2    6.2     0.74    2

---------------------------------------------------------------

嗜酸乳杆菌    1∶0针对下列的试验(注：若要确立为嗜酸乳杆菌所建议的部分醣类再测试)

                        表12

Micro-IS系统

菌株名称：B38T38

-013001游动性               -006001内孢子

-017013生长15℃             +017017生长45℃

+016059好气性生长           -024045葡萄糖成为CO₂

-028528葡萄糖酸，气体       +025203苦杏仁苷，酸

-025181L-阿拉伯糖，酸       +025211纤维二糖，酸

+025193D-果糖，酸           +025194D-半乳糖，酸

+025195D-葡萄糖，酸         +025212乳糖，酸

+025213麦芽糖，酸           -026371D-甘露糖醇，酸

+025196D-甘露糖，酸         +025217落叶松糖，酸

+025214木蜜二糖，酸         +025218棉籽糖，酸

-025191L-鼠李糖，酸         -025184D-核糖，酸

+025210水杨苷，酸           -026374D-山梨糖醇，酸

+025215蔗糖，酸             +025216海藻糖，酸

-025186D-木糖，酸           -028060L-苹果酸利用性

^*检验^{*                 **}ID计分     ^**可能        ^**最佳可能性

1L.delbrueckll ssp lactis 0.64607       0.145038024    0.4351140

2嗜酸乳杆菌               0.35240       0.079110108    0.0791101

建议再做的试验              ^**成组的数值^**单独的数值

1024029(L+)乳酸生成                                  2

2029268L-精胺酸脱胺作用                              2

6.本发明的分离株B6T7

(i)依初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具过氧化氢酶，无移动性，在好氧及厌氧条件下均可生长；

(ii)利用API System的API 50CHL鉴定套组，所得的测试结果如表13所示，鉴定分数为92.4(％ID)，鉴定结果为植物乳杆菌。

(iii)以微生物计算机鉴定系统(Micro-IS System)进行本发明的分离株B6T7的鉴定，所得结果如表7所示，鉴定菌名为嗜酸乳杆菌，鉴定分数达0.682(ID计分)；

(iv)本发明的分离株B6T7的16S rDNA序列分析结果如图10所示。由于在API 50CHL鉴定套组所的结果与Micro-IS System鉴定系统所得结果分别为乳杆菌属中的植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌，故将本发明的分离株B6T7所得的16S rDNA序列(SEQ ID NO：6)，与嗜酸乳杆菌的DNA序列(SEQ ID NO：7)以及植物乳杆菌的DNA序列(SEQ IDNO：8)进行比对，发现本发明的分离株B6T7的16S rDNA序列与嗜酸乳杆菌的16S rDNA序列相似度最高，而与植物乳杆菌的16S rDNA序列相差甚大；

                                  表13

菌株编号：B6T7

鉴定效果的描述：可疑的态样

----------------------------------------------------------------

测试条：API 50CHL

结果(profile)：----++---- ++++-+--+- --+++-++++ +++--+---+ ----------

50种醣类反应结果

0     -  GLY    -  ERY   -  DARA  -  LARL   +  RLB  +  DXYL  -  LXYL  -  ADO   -  MDX  -  GAL    +

GLU   +  FRU    +  MNE   +  SBE   -  RHA    +  DUL  -  INO   -  MAN   +  SOR   -  MDM  -  MDG    -

NAG   +  AMY    +  ARB   +  ESC   -  SAL    +  CEL  +  MAL   +  LAC   +  MEL   +  SAC  +  TRE    +

INU   -  MLZ    -  RAF   +  AMD   -  GLYG   -  XLT  -  GEN   +  TUR   -  LYX   -  TAG  -  DFUC   -

LFUC  -  DARL   -  LARL  -  GNT   -  2KG    -  5KG  -

------明显的分类--------------------％Id.-----------T----------针对菌种的试验---------

可能的菌株名

植物乳杆菌              1         92.4     0.59         3

下一个选择

唾液乳杆菌                        3.4      0.45         4

-----------------------------------------------------------------------------

植物乳杆菌          1∶3针对下列的试验(注：若要确立为嗜酸乳杆菌所建议的部分醣类再测试)

D-山梨糖醇         (SPR)      75％     七叶苷    (ESC)    99％

落叶松糖           (MLE)      92％

(v)依上述的鉴定结果，本发明的分离株B6T7最可能为嗜酸乳杆菌。

综合以上鉴定结果，本发明所筛选的6株分离株皆属于嗜酸乳杆菌株，其中B6T7为嗜酸乳杆菌，而B21T1、B21T6、C21T1、X21B7及B38T38为其B₁群的加氏乳杆菌。

参见表14，当与以往专利案以及文献中所揭示的乳杆菌菌株相比较，本发明所得的乳杆菌分离株不但可在含0.3％胆盐环境下生长，在pH 2的酸性环境下培养2小时后具有较高的存活率，具有良好降低胆固醇作用，且同时对胆固醇具有共沉淀作用及同化作用。由此显见，本发明的分离株及其传代培养的后代会是优良的益生菌(probioticbacteria)，而能供用于制备诸如饮料、糕点、婴儿食品、酸牛乳、营养补充品、动物饲料等的食用品，还有用于制备治疗与预防肠胃疾病以及降低血清胆固醇用的药物组合物。

举例而言，可以参照US 5,516,684所揭示的参考例1与参考例2，将本发明所得的乳杆菌分离株拿来制造乳酸饮料以及酸牛乳饮料。

 表14.本发明的分离菌与公开于前案专利及文献中的已知菌株的比较

菌株	分离源	特征	专利/文献
				嗜酸乳杆菌GG(ATCC 53103)	人类	1.耐胆盐可生长于含0.15％胆汁酸的环境中2.耐酸在pH 5环境中，可生长至109CFU在pH 3环境中，可生长至107CFU在pH 2.5的胃汁中30分钟后，菌数减少2个log值以内在pH 1～2/2hr后，菌数残存103CFU3.降胆固醇可降低人类粪便中胆固醇的排泄量	US 4839281US 5032399
嗜酸乳杆菌LA16	公猪	1.降胆固醇可降低血清胆固醇60％(于含0.4％牛胆汁及10mg胆固醇系统中)动物试验，喂食56天后，血清胆固醇可降低10.5％，LDL-胆固醇含量可降低9％(注：LA16为嗜酸乳杆菌DDS-1(人类来源)制成的酸酪乳喂食猪后，再由猪粪中所分离出具有降胆固醇能力的菌株)	Danielson etal.，1989
				嗜酸乳杆菌ATCC 43121ATCC 4356	猪人类	1.耐胆盐0.3％牛胆汁下分别生长2.93及7.4小时，菌体浓度(OD620nm)可增加0.3单位2.降胆固醇可降低血清胆固醇55.4％及12.9％(于含0.3％牛胆汁及0.1％PPLO系统中培养14小时后)	Gilliland andWalker，1990
L.gasseriSBT 0274SBT 0270	人类	1.耐胆盐可在含0.3％牛胆汁环境中生长2.耐酸在pH 2.5，37℃/3h，菌数下降2个log值在pH 1.5，37℃/2h，菌数下降4～5个log值3.降胆固醇在含0.3％牛胆汁及100μg胆固醇微胞/ml系统中培养20小时后，可分别降低胆固醇含量47％及36％	Usman andHosono，1999
				L.gasseriB21T1B21T6C21T1X21B7B38T38嗜酸乳杆菌B6T7	健康幼儿	1.耐胆盐在含0.3％牛胆汁下生长24h，菌株残存量达80％，即菌数减少0.5～2个log值2.耐酸在pH 2，37℃/2hr处理菌数减少3～4个log值(0.85％NaCl/0.01N HCl系统)3.降胆固醇在含0.3％牛胆汁及12％马血清的MRS肉汤系统中，厌氧培养24hr，可降低胆固醇含量达93％以上在含0.3％牛胆汁及12％胆固醇微胞的MRS肉汤系统中，厌氧培养24hr，可降低胆固醇含量达25～45％对胆固醇吸附同化效果达12～40％	本发明菌株

注：ATCC 43121＝CCRC 17064    ATCC 4356＝CCRC 10695

PPLO(BACT PPLO SERUM FRACTION)是由DIFCO LABORARORIES所出品，目前已经停产

于本说明书中被引述的所有专利和文献引入本文作参考。若有所冲突时，本发明的详细说明(包含界定在内)将占上风。

虽然本发明已参考上述特定的具体例得到描述，明显地在不背离本发明的范围和精神的下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文所附的权利要求书的范围所示者的限制。

                             序列表

<110>食品工业发展研究所

<120>具有降低与同化胆固醇能力的新颖耐酸与耐胆盐乳杆菌分离株

<160>8

<170>Microsoft Word 2000

<210>1

<211>500

<212>DNA

<213>加氏乳杆菌B21T1

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>1

caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa      60

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gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt      480

tatttgacgg taattactta                                                  500

<210>2

<211>500

<212>DNA

<213>加氏乳杆菌B21T6

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>2

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tatttgacgg taattactta                                                  500

<210>3

<211>500

<212>DNA

<213>加氏乳杆菌C21T1

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>3

caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa      60

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gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt      480

tatttgacgg taattactta                                                  500

<210>4

<211>500

<212>DNA

<213>加氏乳杆菌X21B7

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>4

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<210>5

<211>500

<212>DNA

<213>加氏乳杆菌B38T38

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>5

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<210>6

<211>480

<212>DNA

<213>嗜酸乳杆菌B6T7

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>6

cagacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgacctgaa ccaacagatt      60

cacttcggtg atgacgttgg gaacgcgagc ggcggatggg tgagtaacac gtggggaccc      120

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<210>7

<211>480

<212>DNA

<213>嗜酸乳杆菌

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>7

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<210>8

<211>480

<212>DNA

<213>植物乳杆菌

<220>

<223>16S核糖体DNA

<400>8

caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgaactct ggtattgatt      60

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cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg      480

Claims (14)

1.一种乳杆菌物种(Lactobacillus sp.)的分离株，其细菌学特征与嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)B6T7所具有的相同，所述嗜酸乳杆菌B6T7保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCCPTA-4482。

2.一种食品产品，其包含有可食性材料与如权利要求1的乳杆菌物种分离株或其传代培养后代。

3.如权利要求2的食品产品，其进一步包含至少一种选自下列群组中的益生性生物：乳杆菌属物种；链球菌属物种(Streptococcussp.)；酵母菌；或这些菌种的组合。

4.如权利要求3的食品产品，其中所述乳杆菌属物种选自下列群组：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus lactis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、双歧双歧杆菌(Lactobacillus bifidus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、高加索乳杆菌(Lactobacilluscausasicus)以及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)；

5.如权利要求3的食品产品，其中所述链球菌属物种选自下列群组：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)以及乳酸链球菌(Streptococcus lactis)；

6.如权利要求3的食品产品，其中所述酵母菌选自下列群组：念珠菌属物种Candida Kefyr以及弗罗棱酵母菌(Saccharomycesflorentinus)。

7.如权利要求2的食品产品，其中所述可食性材料选自下列群组：流体乳品、发酵乳品、奶粉、冰淇淋、乳酪、干酪、豆奶与发酵豆奶、蔬果汁、果汁及运动饮料、甜点、糖果、婴儿食品、食疗产品、动物饲料，以及膳食补充品。

8.如权利要求7的食品产品，其中所述流体乳品选自下列群组：牛奶以及浓缩牛奶。

9.如权利要求7的食品产品，其中所述发酵乳品选自下列群组：优酪乳、酸乳、冷冻优格以及乳酸菌发酵饮料。

10.如权利要求2的食品产品，其被制造成为即溶冲泡食品。

11.一种药物组合物，其含有益生性有效量的如权利要求1的乳杆菌物种分离株或其传代培养后代。

12.如权利要求11的药物组合物，其中所述组合物被配制成选自下列群组的供用于口服给药的形式：溶液、乳剂、粉末、锭剂以及胶囊。

13.如权利要求11的药物组合物，其中所述组合物被制成消化整肠药剂。

14.如权利要求11的药物组合物，其中所述组合物被制成用以降低血清胆固醇的药品。

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