CN1160451C

CN1160451C - 鼠李糖乳酸杆菌菌株及其用途

Info

Publication number: CN1160451C
Application number: CNB001317598A
Authority: CN
Inventors: 林志锋
Original assignee: DINGJIAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY FOOD Co Ltd
Current assignee: DINGJIAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY FOOD Co Ltd
Priority date: 2000-10-16
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2004-08-04
Anticipated expiration: 2020-10-16
Also published as: CN1348989A

Abstract

本案揭露了一种新颖的鼠李糖乳酸杆菌菌株(以下称为Tcell-1菌株)，其在种系上不同于该物种中已经公开的所有菌株，且其能展现出优越的益生性质。本案亦揭露该菌株的药学及营养用途。

Description

鼠李糖乳酸杆菌菌株及其用途

技术领域

本发明是关于一种新颖的产乳酸微生物，它能展现出优越的益生(probiotic)性质。本发明亦关于该新颖微生物在食品、饮料、动物饲料及/或膳食补充组合物中作为一种益生菌的用途，以及作为一种控制非所欲肠道微生物在哺乳动物消化道中集生的药物的用途。

背景技术

经发现，将诸如L.(casei subsp.)rhamnosus GG(ATCC 53103)的鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)大量口服投予至一哺乳动物，有助于维持甚至增进该哺乳动物的健康状况。普遍认为，经摄取后，鼠李糖乳酸杆菌会暂时地集生在肠粘膜上，而这可抑制致病细菌与病毒(诸如轮状病毒(rotavirus))的生长，安定化肠道的通透性，以及抑制食物过敏的过敏反应。该细菌特别有效于藉由促进宿主体内的非专一性体液免疫反应来减轻胃肠不适的症状，诸如腹泻。

在1989年，鼠李糖乳酸杆菌被报导成从乳酪乳酸杆菌(L.casei)所衍生出的一个新物种，其与乳酸杆菌属中其他两个成员，即乳酪乳酸杆菌及外乳酪乳酸杆菌(L.paracasei)共同享有类似的表现型。该三个物种可藉由编码核糖体RNA的基因上的差异来进一步区别。许多的研究是基于此一发现来进行。例如，Rodtong et al.认识到16S rDNA的物种特殊性，从而发展出一种核酸型式鉴定法(ribotypingprocess)来鉴别乳酸杆菌菌株(Rodtong，S.and Tannock，G.W.(1993)Appliedand Environmental Microbiology 59：3480-3484)。另一方面，Ward et al.以及Alander et al.则利用聚合酶链反应PCR的便利性与有效性，依据16S rDNA的序列多形性(sequence polymorphism)并应用不同组别的引物(primers)来鉴定鼠李糖乳酸杆菌(Ward，L.J.H.，and Timmins，M.J.(1999)Letters in AppliedMicrobiology 29：90-92；and Alander，M.et al.，(1999)Applied andEnvironmental Microbiology 65：351-354)。

依据本发明，本案发明人已鉴定出一种新颖的鼠李糖乳酸杆菌菌株(以下称为Tcell-1菌株)，其在种系上(phylogenetically)不同于该物种中已经公开的所有菌株，且它能展现出优越的益生性质。

发明内容

本发明的首要目的在于，提供一种新颖的鼠李糖乳酸杆菌菌株。在本发明所进行的实验中，本案发明人已鉴定出该菌株的种系特殊性，并显示出该菌株的所欲益生性质。

本发明的另一目的在于提供一种组合物，其含有本发明菌株以及一种适用的赋形剂，可供制造食品、饮料、动物饲料或膳食补充品所用。

本发明的另一目的在于，提供一种含有本发明菌株的药物组合物，以及提供一种藉由将此种组合物给药至一个体，来治疗或预防该个体的胃肠不适的方法。

依据本发明，一个鼠李糖乳酸杆菌菌株由本地自愿者所捐赠的肠道样品中分离出。在一预备实验中，来自于这些样品的微生物用一系列选择性培养基来进行筛选，其中MRS琼脂培养基以及罗格莎SL琼脂培养基(Rogosa SL agar medium)能排它性地令乳酸杆菌增殖。接著，令依据前述流程所选出的细菌进行下列四步骤的筛选策略，以鉴定出鼠李糖乳酸杆菌：

步骤1：利用一个API 50CHL试剂盒(BioM’erieux，Lyon，France)测定发酵方式；

步骤2：依据Rodtong et al.(同前)中所述的方法进行核酸型式鉴定，其中利用EcoR I、Bcl I、Bgl II或HindIII等限制酶来处理从微生物所萃出的总体DNA，经Southern印迹(Southern blotting)后，藉由大肠杆菌的rDNA探针进行检测，以获得受测微生物的限制片段指纹图谱，用于由鼠李糖乳酸杆菌DNA所得者作比较；

步骤3：依据Ward et al.(同前)中所述的方法进行PCR分析，其中一个通用引物Y2(5’-CCCAC TGCTG CCTCC CGTAG GAGT-3’)以及一个物种专一性引物rham(5’-TGCAT CTTGA TTTAA TTTTG-3’)被使用于反应中，以使得当鼠李糖乳酸杆菌的染色体DNA出现在反应混合物中时，将会制出一个约290bp的主要产物；以及

步骤4：依据Alander et al.(同前)中所述的方法进行PCR分析，其中在鼠李糖乳酸杆菌DNA的存在下，一对物种专一性引物，rham(如步骤3中所述者)以及rham2(5’-CCGTC AATTC CTTTG AGTTT-3’)，将会扩增出一个约863 bp的特定产物。

因此，本发明的菌株被鉴定为属于鼠李糖乳酸杆菌此物种。然而，步骤4中所得的863bp产物的定序得出了一个令人意外的发现：本发明的菌株在种系上不同于鼠李糖乳酸杆菌此物种的所有公开菌株。

由此所鉴定出的菌株被命名为「鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1(Lactobacillusrhamnosus Tcell-1)」，并以CCRC 910145的保藏编号于2000年4月14日保藏于食品工业发展研究所(中国台湾新竹市)的菌种保存及研究中心(CCRC，台湾300新竹市食品路331号)。该细菌亦根据布达佩斯条约在专利程序用微生物保藏的国际认定上的效力，而在2000年8月22日以PTA-2406的保藏编号保藏在美国典型菌种保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)。

还进行了有关菌株Tcell-1的益生性质的进一步研究。结果显示，在被摄取的细菌于肠胃道中将会遇到的严苛环境下，包括在极酸性的pH值以及高浓度胆盐下，本发明菌株可存活甚至生长良好。鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1抵抗某些抗生素的能力，显然有利于将该细菌投予一个需要服用抗生素的个体。该菌株的优越性可藉由抑制各种肠道细菌(enterobacteria)生长的能力而进一步强化。

基于前述有利性质，本发明菌株是适用作为一种益生菌。依据本发明，菌株Tcell-1可被配制于广泛种类的可食性材料内，这些材料包括诸如流体乳品、发酵乳品、酸乳(yogurts)、果汁及运动饮料等饮料；诸如冰淇淋、乳酪及零食等食品；动物饲料；膳食补充品；以及幼儿配方。明显地，熟习本项技艺者可明了，本发明的菌株可藉由已知方法被配制成任何适用的形式，以供人类及非人类的动物吸收。更佳地，本发明的菌株与其他益生性生物共同配制于可食性材料内，这些生物诸如嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)、短乳酸杆菌(L.brevis)、乳酪乳酸杆菌(L.casei)、胚芽乳酸杆菌(L.plantarum)、唾液乳酸杆菌(L.salivarius)、双叉乳酸杆菌(L.bifidus)、保加利亚乳酸杆菌(L.bulgaricus)、高加索乳酸杆菌(L.causasicus)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)以及鼠李糖乳酸杆菌的其他菌株，或它们的组合。此外，鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1是较适合与乳果寡糖、几丁质、壳聚糖、甘露醇或其中多种共同配制。

鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1亦可单独地或与其他活性组份共同使用，作为控制非所欲肠道微生物在哺乳动物消化道内集生的药物，以减轻该微生物所造成的症状。所述组合物可被配制成溶液、乳剂、粉末、锭片、胶囊或适合口服给药的其他适合形式。

附图说明

本发明的此等及其他优点可通过对本发明的下列详细叙述，并参照附图，而变得更为明显，其中：

图1A-C是显示出一位自愿者的上空肠与直肠组织内的内视镜取样；

图2是本发明菌株的发酵方式；

图3A是本发明菌株的染色体DNA的限制图谱；

图3B显示出利用E.coli MRE600 16S+23S rDNA作为探针所得的Southern杂交结果；

图4显示出利用Ward及Timmins所设计的引物所得的PCR分析结果，其中用从本发明菌株萃取的DNA(第2跑道)以及水(第3跑道；作为一个负对照组)进行PCR；

图5显示出利用Alander et al.所设计的引物所得的PCR分析结果，其中两组物种专一性引物-rham-rham2(第2-3跑道)以及rham-casei(第4-5跑道)-被用于PCR中。

具体实施方式

下列实例仅供说明，而不限制本发明的范围。

实例1：鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的分离

六位年龄25至45岁、无酒或烟瘾且未长期服药的健康成人自愿地参与本实验。他们当中无一人为素食者或饮食不正常。令这些自愿捐赠者禁食12个小时，再进行内视镜采样。从各个捐赠者的上空肠及直肠的不同部位取得三个各约2mm²大小的活组织样品(第1A-C图)。随后，这些组织样品以生理盐水(0.9％NaCl在无菌水中的溶液)洗涤，并贮存在一种冰的保存溶液(0.9％的NaCl、0.1％的蛋白胨、0.1％的Tween-80以及0.02％的半胱胺酸)中供后续使用。在一超声波水浴内将这些样品处理5分钟，再剧烈振荡2分钟。所得的悬浮液不加稀释或稀释5-或10-倍，并将制备出的数个分量涂布在下列固态培养基上，以获得其中所含肠道细菌的分布情形(亦请参见Johansson et al.，Applied and Environmental Microbiology59(1)：15-20)：

1.脑心浸出液琼脂(Brain heart infusion agar)(购自于Difco)，是一种用以在37℃下将整个族群的肠道细菌予以有氧或无氧培养3天的增富培养基(enri ched medium)；

2.MRS琼脂(Difco)，其用以在37℃下将乳酸杆菌予以无氧培养5天；

3.酚醇琼脂(Phenol ethanol agar)(Difco)，其用以在37℃下将格兰氏阳性细菌(Gram(+)bacteria)予以有氧或无氧培养3天；

4.叠氮化物血琼脂(Azide blood agar)(购自于Oxoid)，其用以在37℃下将链球菌(Streptococcus)予以有氧培养2天；

5.史兰兹-巴特里琼脂(Slanetz-Bartley agar)(Oxoid)，其用以在37℃下将肠球菌(Enterococcus)予以无氧培养2天；

6．紫红胆盐葡萄糖琼脂(Violet red bile glucose agar)(Oxoid)，其用以在37℃下将肠菌科(Enterobacteriaceae)细菌予以培养2天；

7．罗格莎SL琼脂(Difco)，其用以在37℃下将乳酸杆菌予以无氧培养5天：以及

8．强化梭菌琼脂(Reinforced clostridial agar)(Difco)，其用以在37℃下将双叉乳酸杆菌(L bifidus)予以无氧培养5天。

其结果示于表1。

表 1在上空肠样品中：

在直肠样品中：

捐赠者	培养基
	培养基															BHIA			MRS			PEA			ABA			SBA
	lx	5x	10x	1x	5x	10x	1x	5x	10x	1x	5x	10x	1x	5x	10x	BHIA			MRS			PEA			ABA			SBA
	lx	5x	10x	1x	5x	10x	1x	5x	10x	1x	5x	10x	1x	5x	10x	JF	M	47	6	M	23	1	0	9	0	M	1	0	28	0	0
JS	M	15	1	M	0	0	0	12	0	M	0	1	0	1	0	JF	M	47	6	M	23	1	0	9	0	M	1	0	28	0	0
JS	M	15	1	M	0	0	0	12	0	M	0	1	0	1	0	HK	M	1	0	0	0	0	0	0	0	12	0	0	0	0	0
V	M	0	0	0	0	0	0	0	0	30	0	0	0	0	0	HK	M	1	0	0	0	0	0	0	0	12	0	0	0	0	0
V	M	0	0	0	0	0	0	0	0	30	0	0	0	0	0	B	M	28	11	M	67	3	0	10	0	M	14	0	M	4	4
RG	M	0	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	0	0	B	M	28	11	M	67	3	0	10	0	M	14	0	M	4	4

*缩写：BHIA代表脑心浸出液琼脂；MRS代表MRS琼脂；PEA代表酚醇琼脂；ABA代表叠氮化物血琼脂；SBA代表史兰兹一巴特里琼脂：VRBGA代表紫红胆盐葡萄糖琼脂；RA代表罗格莎SL琼脂；以及RCA代表强化梭菌琼脂。

称：1X、5X及lOX为细菌悬浮液的稀释倍数。

§：字母M表示培养基平盘上的菌落数目高于100个。

如表1所示，肠道细菌在上空肠及直肠中的分布情形极为不同。

实例2：乳酸杆菌的分离

从实例1的MRS琼脂及罗格莎SL琼脂培养基任意挑出200个菌落，并将它们分别转移至含有1％CaCO₃的新鲜MRS琼脂培养基。经培育后，挑出周围环绕有澄清区域的菌落，并将各个菌落转移至一补充有1％的鼠李糖与0.05％的酚红的基本basalMRS琼脂培养基。最后，挑选出似由乳酸杆菌所构成的呈黄色菌落，将它们移入新鲜的MRS液态培养基内，并在37℃下无氧培养2天，以供后续分析之用。

实例3：鉴定鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1为新菌株

(a)发酵方式

将实例2所制备出的乳酸杆菌液态培养基予以沉淀，以无菌水洗涤的，并将它们重悬于定量无菌水中。利用一个API 50CHL试剂盒并依据制造者所提供的操作流程来检测所得的细菌悬浮液。经此过程，鼠李糖乳酸杆菌的一个菌株因该物种所特有的发酵方式而被鉴定出来(图2)，并被称为鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1(L.rhamnosus Tcell-1)。

依据Sambrook et al.(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的一个常用方法，从一个生长于中间对数阶段的3毫升培养液中制备出菌株Tcell-1的总DNA，并将其悬浮于50μl的TE缓冲液(1mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH8.0)内。由此所得的DNA溶液被使用于下列分析中，用以进一步检测菌株Tcell-1。

(b)核酸型式鉴定分析

分别用EcoR I、Bcl I、Bgl II及Hind III等限制内切酶来消化数个10μl分量的DNA，历时3小时。将经消化的产物载入一片0.8％琼脂糖凝胶的格内，并在5V/cm下电泳2小时。随后，利用溴化乙锭将该凝胶予以染色，并获得该凝胶的影像，如图3A所示。如Sambrook et al.(同前)中所述，凝胶上的DNAs被变性并被转移至一片尼龙薄膜(Hybond-N+，Amersham)上。为了制备供Southern分析所用的探针，1μl的大肠杆菌MRE600 16S+23S rRNA(购自于Boehringer Mannheim)被用作为模板(template)，并用AMV反转录酶(Bethesda Research Laboratories)与随机引物经由掺入[α-³²P]dCTP，将该模板予以扩增。印迹在68℃下于一含有5X SSC、1X丹赫氏溶液(Denhardt’s solution)、1％SDS与100mg/ml的Harpin精子DNA的杂交溶液中进行杂交，历时16-24小时，再适当地洗涤以增进信号对杂讯的比例，并进行放射性显像。如图3B所示，菌株Tcell-1的核酸型式完全符合Rodtong etal.(同前)中所述的鼠李糖乳酸杆菌的典型形式。

(c)利用Ward&Timmins引物进行PCR分析

将1μl得自于实例3(a)的Tcell-1 DNA、1μl的引物Y₂、1μl的引物rham、0.5μl的DynaZyme II(Finnzymes Oy)与位在100μM下的各种dNTP(dATP、dTTP、dCTP及dGTP)加入一个1ml微型试管(eppendorf)内。将无菌水加入该反应混合物至一为50μl的最终浓度，再以矿物油覆盖的。将该反应混合物置入一个GeneAmpR PCRSystem 2400的循环加热仪(Perkin Elmer)中，并在下列条件循环加热：

起始条件： 94℃历时3分钟

45℃历时45秒

72℃历时1分钟

循环加热： 94℃历时45秒

45℃历时45秒

72℃历时1分钟

循环次数： 30

主链延长： 94℃历时45秒

45℃历时45秒

72℃历时5分钟

循环加热的后，在一片0.2％琼脂糖凝胶上，将扩增产物予以分离。利用溴化乙锭来染色该凝胶，在UV光源下，可在该凝胶上观察到一个290bp的主要扩增片段(图4)。

(d)利用Alander引物进行PCR分析

重复实例3(c)的PCR，但以Alander et al.(同前)所设计的rham与rham2引物来取代Ward&Timmins引物。在一片0.2％琼脂糖凝胶上所进行的电泳分析显示，经扩增出的产物中含有一个863bp的主要谱带(Fig.5)，如前所述，这已被报导为一个用以鉴定鼠李糖乳酸杆菌的重要指标。

实例3(a)至(d)中所进行的实验可总结为，菌株Tcell-1的生化与遗传性状与被认定为属于鼠李糖乳酸杆菌的相符。

(e)区辨菌株Tcell-1以及其他的鼠李糖乳酸杆菌菌株

利用TOPO TA cloningTM试剂盒(Invitrogen)并参照制造商所提供的操作流程，将实例3(d)中所得的863bp产物插入一个pCR-TOPOTM载体内。随后，用电穿孔法，将所得的质粒导入TOP10 One ShotTM电击感受态细胞(electrocompetentcells)(Invitrogen)中。令转化子(transformants)在一选定的培养基中增殖，获取该质粒，并对该863bp的嵌置片段进行测序。

利用该序列作为一个询问序列，用来搜寻GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov：80/entrez/query.fcgi？CMD＝search&DB＝nucleotide)中的核苷酸序列资料库。表2中所示的序列比对显示，基于16S rDNA序列，菌株Tcell-1在种系上不同于GenBank中可得的所有六个鼠李糖乳酸杆菌菌株。表2中所示的Tcell-1 DNA序列具有776bp的长度，并被编号为SEQ ID No.1。

表2

1 10 20 30 40 50

TCELL1 TATACACTGGTACCTCCCTAAGGGATACATTGAAACAATCTATCCGCATAATCAAGA

*** *** * * * * * * * *

AF21761 TTGTACACACCGCCC.GTCACACCATGAGAGTTTGTAACA...CCCGAAGCCGGTG

*************** ************************ *************

E08782 CTTGTACACACCGCCC.GTCACACCATGAGAGTTTGTAACA...CCCGAAGCCGGTG

* * * * * * * * ** *** * **** *

AF18273 CCTTTCTAAGGAAACAGACTGAAAGTCTGACGGAAACCTGCACA...CACGAAACTTTGT

* * *** **** **

A61362 CTAAGGAAACAGACTGAAAGTCTGACG................

***************************

U32966 CTAAGGAAACAGACTGAAAGTCTGACG................

*************************

AF12120 AAGGAAACAGACTGAAAGTCTGACG................

1 10 20

共有 A C CC A GA ACAGAC GAAA TCT AC C C A

1 10 20 30 40 50 60

70 80 90 100 110

TCELL1 CCGCATGTCTTGCTAAGATGCGTAACTATCGCTTTGGATGACCCCGCGTATAGCTAGTTG

** * * * * * * * ** * *

AF21761 GCGTAA......CCCTTTTAGGGAGCGA.............GCCGTGTAAGGTGGGACAA

****** ** *** ** * * * ** **

E08782 GCGTAA......CCTTTTAGGGAGCGAG.............CCGTCTAAGGTGGGACAAA

** * *

AF18273 TTAGTTTTGAGGGGATTACCCTCAAGCACCC.........TAGCGGGTGCGACTTTGTTC

A61362 ............................................................

U32966 ............................................................

AF12120 ............................................................

表2(续)

70 80 90 100 110 120

130 140 150 160 170

TCELL1 TAAGTAACGCTCACCAAGCAATGATGCTAGCCAACTAAGTTGATCGCCACATTGGACTAA

* * * * * * ** * * * * * ** * * **

AF21761 ATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCC

* ** * *****************************************

E08782 TGATTAGGGTGAAGTCGT.AACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCC

* * ** * * * * ** * * *

AF18273 TTTGAAAACTGGATATCATTGTTGTAAATGTTTTAAATTGCCGAGAACACAGGCTATTTG

A61362 ............................................................

U32966 ............................................................

AF12120 ............................................................

共有 A A C T

130 140 150 160 170 180

190 200 210 220 230

TCEL1 ACACGGCC.CAAACTCTACGGAGGCAGCAGTAGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTG

* **** ** ** * ** * *

AF21761 TTTCTAAG.GAAACAG.ACTGAAAGTCTGA...........CGGAAACCTGCACACACGA

******** ******* ************* *******************

E08782 TTTCTAAG.GAAACAG.ACTGAAAGTCTGA...........CGGAAACCTGCACACACGA

* * ** * * * * ** * * * ** ** * *

AF18273 TATGAGTTTCTAATAATAAAAATTCGCAT............CGCATAACCGCTGACGCAA

* * * ** ** * *

A61362 ...........................................GAAACCTGCACACACGA

*****************

U32966 ...........................................GAAACCTGCACACACGA

*****************

AF12120 ...........................................GAAACCTGCACACACGA

30 40

共有 AA A A C GAAACCTGCACACACGA

表2(续)

190 200 210 220 230 240

250 260 270 280 290

TCELL1 ATGGAGCAACGCCGCGTGACTGAAGAAGGCTTTCGGGGCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGA

* ** * * * **

AF21761 AACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGATTACCCTCAAGCACCCTAGCGGGTG.......CGACT

************************ **************** ****** *****

E08782 AACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGATCACCCTCAAGCACCCTAACGGGTG.......CGACT

* * * * * * * ** ***

AF18273 GTCAGTACAGGTTAAGTTACAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGGAGCCGATG

* * * * * * * **

A61362 AACTTTCTTTAGTTTTGAGGGGATTACCCTCAAGCACCCTAGCGGGTG............

************************************************

U32966 AACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGATTACCCTCAAGCACCCTAGCGGGTG............

************************************************

AF12120 AACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGATTACCCTCAAGCACCCTAGCGGGTG............

50 60 70 80 90

共有 AACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGATTACCCTCAAGCACCCTAGCGGGTG GA

250 260 270 280 290 300

310 320 330 340 350

TCELL1 AGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCT

***** ** * * * *

AF21761 TTGT.....TCTTTGAAAACTGGATATCATTGTTGTAAATGTTTTAAATTGCCGAGAACA

**** ************************ *** *********************

E08782 TTGT.....TCTTTGAAAACTGGATATCATTGTATTAATTGTTTTAAATTGCCGAGAACA

* ** * * ** * ** ** * * **

AF18273 AAGGACGGAACTAATACCGATATGCTTCGGGGAGCTATAAGTAAGCTTTGATCCGGAGAT

** * * *

A61362 ...............................CGACTTTGTTCTTTGAAAACTGGATATCA

*****************************

U32966 ...............................CGACTTTGTTCTTTGAAAACTGGATATCA

*****************************

AF12120 ...............................CGACTTTGTTCTTTGAAAACTGGATATCA

100 110

共有 T GACT T T CTTT AAAA TCGA A CA

表2(续)

310 320 330 340 350 360

370 380 390 400 410

TCELL1 AACTCAGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGG

* * * *

AF21761 CAGCGTATTTGTATGAGTTTCTAATAA...............................TA

***** ** ** ** *

E08782 CAGCG.TATTTGTATGAGTTTCTGAAA...............................AA

** * * * *

AF18273 TTCCGAATGGGGGAACCCAGTACACATCAGTGTATT......................GC

**

A61362 TTGTTGTAA.................................................AT

********* **

U32966 TTGTTGTAA.................................................AT

********* **

AF12120 TTGTTGTAA.................................................AT

130

共有 TTGT TA A

370 380 390 400 410 420

430 440 450 460 470

TCELL1 CGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAACTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGG

* * **** ** * ** * *

AF21761 GAAATTCGCATCGCA.......................TAACCGCTGACGCAAGTC....

*************** ******************

E08782 GAAATTCGCATCGCA.......................TAACCGCTGACGCAAGTC....

* ** ** * *

AF18273 CTGCAAGTGAATGCA.......................TAGCTTGTTGGCGGCAGACGCG

* * *

A61362 GTTTTAAATTGCCGA.............................................

***************

U32966 GTTTTAAATTGCCGA.............................................

***************

AF12120 GTTTTAAATTGCCGA.............................................

140

共有 GTT TA AGC CA A T

表2(续)

430 440 450 460 470 480

490 500 510 520 530

TCELL1 AAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTACAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAG

* ** * * * ** * * *

AF21761 AGTACCAGGTAAGTTACAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGGAGC.......C

***** * ******************************************* *

E08782 AGTACAGGTTAAGTTACAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGGAGC.......C

* * * * * ** **** * * * * * * *

AF18273 GGGAACTGAAACATCTCAGTACCCGCAGGAAGAGAAAGAAAACTCGATTCCCATAGTAGC

**** * * ** * * ** * *

A61362 ..GAACACAGCGTATTTGTATGAGTTTCTAATAATAGAAATTCGCATC............

**********************************************

U32966 ..GAACACAGCGTATTTGTATGAGTTTCTAATAATAGAAATTCGCATC............

**********************************************

AF12120 ..GAACACAGCGTATTTGTATGAGTTTCTAATAATAGAAATTCGCATC............

150 160 170 180 190

共有 GAACA AG ATT G A G T ACTAA AATA AA C C A C

490 500 510 520 530 540

550 560 570 580 590

TCELL1 CGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTA

* * * *** ** * * * * * *

AF21761 GATGAAGGACGGAACTAATACCGATATGCTTCGGGGAGCTATA................A

******************************************* *

E08782 GATGAAGGACGGAACTAATACCGATATGCTTCGGGGAGCTATA................A

* ** ** * * ** * * * ***

AF18273 GGCGAGCGAAGTGGGAAGAGCCCAAACCGAGAAGCTTGCTTCTCGGGGTTGTAGGACTGG

* * * * * ** * * *

A61362 .............GCATAACCGCTGACGCAAGTCAGTACAGG

*****************************

U32966 .............GCATAACCGCTGACGCAAGTCAGTACAGG

***************************

AF12120 .............GCATAACCGCTGACGCAAGTCAGTACA

200 210 218

共有 GCATAA CGCA ACGCA G GT CA

表2(续)

550 560 570 580 590 600

610 620 630 640 650

TCELL1 ACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT

* *** * * * * **** * **

AF21761 GTAAGCTTTGATCCGGAGATT...........TCCGAATGGGGGAACCCAGTA....CAC

********************* ********************* ***

E08782 GTAAGCTTTGATCCGGAGATT...........TCCGAATGGGGGAACCCAGTA....CAC

* ** ** * * * * * * * * * *

AF18273 ACATTGGAGTTACCAAAGTTCG..........ACGTAGTCGAAGTCAGCTGGAAAGCTGC

A61362

U32966

AF12120

共有 C C G

610 620 630 640 650 660

670 680 690 700 710

TCELL1 GCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCACTAACGC

* * *** * ** * * * * ****

AF21761 ATCAGTG.....TATTGCCTGCAAGTGAATACATAGCTTGT......TGGCGGCAGACGC

******* * * ** * * * * * *

E08782 ATCAGTGTGTTGCTTGTCAGTGAATACATAGCTGGCCGGCG......GCCAGACGCGGGG

** * * ** * ** * * * * *

AF18273 GCCATAGAAGGTGAAAGCCCTGTAAACGAAACGGCGGACTC....TCCGTCCAGGATCCT

A61362

U32966

AF12120

共有 C C

表2(续)

670 680 690 700 710 720

730 740 750 760 770 776

TCELL1 ATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGG

* * ** * **

AF21761 GGGGAACT......................GAAACATCTAAG

* * * **

E08782 AACTGAAA......................CATCTAAGTACCCGGA

* * * * * *

AF18273 GAGTACGGCGGAACACGTGAAATTCCGTCGGAATCCGGGAGGACCATCT

A61362

U32966

AF12120

共有 A A

730 740 750 760 770 778

实例4：鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的特征鉴定

(a)耐酸性

在pH2、3、4、5与6下分别制备MRS液体培养基，并补充以0.3％的胆盐。106个Tcell-1细胞种入1.5ml的各培养基中，并在37℃下无氧培育。于接种后第0与4小时时收集样品，并参照620nm下的吸光值来评估各培养液内的微生物群规模。其结果示于表3。

表3

培育时间	OD₆₂₀
	OD₆₂₀					pH2	pH3	pH4	pH5	pH6
	0小时	0.01	0.018	0.010	0.014	pH2	pH3	pH4	pH5	pH6	0.012
4小时	0小时	0.01	0.018	0.010	0.014	0.01	0.018	0.016	0.025	0.030	0.012

如表3所示，随着培养液被酸化至被摄入动物胃部的物质将会遭遇到的pH值(亦即低于3的pH值)，鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的生长速率会显著地降低。令人意外的是，培育在此酸性环境下历时4小时的细胞仍可在被转移至pH6.0的新鲜MRS培养基内后，恢后其正常生长(数据未示出)。此数据指出，鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1可耐受胃酸的攻击。

(b)对胆盐的耐受性

重复实例4(b)，但MRS液体培养基分别含有0.1、0.2、0.3与0.4％浓度的胆盐，而这些培养基的pH值则恒定在2.5。其结果示于表4。

表4

培育时间	OD₆₂₀
	OD₆₂₀				0.1％	0.2％	0.3％	0.4％
	0小时	0.011	0.010	0.013	0.1％	0.2％	0.3％	0.4％	0.018
4小时	0小时	0.011	0.010	0.013	0.028	0.025	0.023	0.032	0.018

表4显示，在高浓度胆盐下，鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1可维持其生长。

(c)对抗生素的耐受性

将2-3ml源自于鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的隔夜培养液的细菌悬浮液涂布在添加有10μg/ml的卡那霉素(kanamycin)、万古霉素(vancomycin)、氯霉素(chloramphenicol)或青霉素的MRS琼脂培养基上。经培育后，虽然鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的生长被含有氯霉素或青霉素的培养基所阻滞，但发现它可耐受卡那霉素与万古霉素。

(d)对于其他细菌的集生的抑制

将2-3ml分量的源自于鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的隔夜培养液的细菌悬浮液涂布在MRS琼脂培养基上。在30℃下，将各个培养皿培育22小时，再将7ml软琼脂倾倒于其上，该软琼脂中是混合有表5中所列示的九株肠道菌菌株(购自于FIRDI)中的一者的100μl悬浮液。

表5

细菌	培养基
细菌	培养基	产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)	DIFCO 0001
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)	脑心浸出液琼脂(无氧培养)	产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)	DIFCO 0001
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)	脑心浸出液琼脂(无氧培养)	肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)	DIFCO 0001
小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)	脑心浸出液琼脂	肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)	DIFCO 0001

单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)	脑心浸出液琼脂
单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)	脑心浸出液琼脂	变形链球菌(Streptococcus mutans)	脑心浸出液琼脂
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)	DIFCO 0001	变形链球菌(Streptococcus mutans)	脑心浸出液琼脂
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)	DIFCO 0001	痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)	DIFCO 0001
Yersinia ruckeri	DIFCO 0001	痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)	DIFCO 0001

在37℃下，将所得培养物再培育48小时，以肉眼观察。根据鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的菌落周围的抑制圈的存在与否，本案发明人发现，菌株Tcell-1可显著抑制产气肠杆菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增生利斯特氏菌、变形链球菌及弗氏柠檬酸杆菌的生长。这些结果强烈地显示，鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1能展现出值得信赖的益生性质，以控制或抑制肠道中非所欲细菌的集生。

实例5：含有鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1的益生配方

鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1可供用于各种形式的食品中，其中的两个实例被叙述如下：

配方1：

10种产生乳酸细菌的菌株：

嗜酸乳酸杆菌、短乳酸杆菌、乳酪乳酸杆菌、胚芽乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、双叉乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、高加索乳酸杆菌、乳酸链球菌以及鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1；

赋形剂：

乳果寡糖、甘露醇、几丁质、壳聚糖以及酸乳粉；

天然有机蔬果浓缩原：

紫花苜蓿、大麦小麦草汁的粉末、纯质大豆卵磷脂、胡萝卜汁的粉末、磷脂醯胆硷、夏威夷果(Spirulina pacifica)、苹果胶粉末、磷脂醯胆硷肌醇、CGF绿藻、非膳食性益生培养物：FOS为基质的鼠李糖乳酸杆菌及嗜酸乳酸杆菌、蜜蜂花粉粉末、斯替维亚(stevia)、冷冻乾燥芒果、黑葡萄乾、蒲公英根萃出物4∶1、西伯利亚参萃出物0.4％、太平洋海带4∶1萃出物、朝藓蓟4∶1萃出物2％、大豆萃出物、覆盆子萃出物5∶1、凤梨萃出物、蔓越莓汁萃出物18∶1、玫瑰果萃出物4∶1、蕃茄红素、生奶蓟PhytosomeTM、银杏PhytosomeTM以及葡萄子PhytosomeTM；

其他组份：

维生素C、钙、镁、锌。

配方2：

9种产生乳酸细菌的菌株：

嗜酸乳酸杆菌、短乳酸杆菌、乳酪乳酸杆菌、胚芽乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、双叉乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、高加索乳酸杆菌以及鼠李糖乳酸杆菌Tcell-1；

其他组份：

乳酸钙、乳果寡糖、乳糖、葡萄糖、奶粉、植物油以及少量乳化剂与天然调味料。

该配方被涂覆于葡萄乾与花生颗粒上，以制成一种益生性健康食品。

虽然本发明已被阐释如上，但显然有许多修改与变化可在不偏离本发明的范围与精神的前提下被完成。因此，本发明的范围是以权利要求的范围为准。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：T-CELL BIOTECHNOLOGY FOOD CO.，LTD.

(ii)发明名称：鼠李糖乳酸杆菌菌株及其用途

(iii)序列数量：1

(iv)通讯地址：

(A)地址：

(B)街道：

(C)城市：

(D)州：

(E)县：

(F)邮编：

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：

(D)软件：Microsoft Word

(vi)本申请信息：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类：

(ix)电讯信息：

(A)电话：

(B)传真：

(C)电传：

SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：776碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

TATACACTGG TACCTCCCTA AGTGGGATAC ATTGAAACAA TCTATCCGCA TAATCAAGAC....60

CGCATGTCTT GCTAAGATGC GTAACTATCG CTTTGGATGA CCCCGCGTAT AGCTAGTTGT...120

AAGTAACGCT CACCAAGCAA TGATGCTAGC CAACTAAGTT GATCGCCACA TTGGACTAAA...180

CACGGCCCAA ACTCTACGGA GGCAGCAGTA GGAATCTTCC ACAATGGACG CAAGTCTGAT...240

GGAGCAACGC CGCGTGACTG AAGAAGGCTT TCGGGGCGTA AAACTCTGTT GTTGGAGAAG...300

AATGGTCGGC AGAGTAACTG TTGTCGGCGT GACGGTATCC AACCAGAAAG CCACGGCTAA...360

CTCAGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTATCCGGAT TTATTGGGCG...420

TAAAGCGAGC GCAGGCGGTT TTTTAACTCT GATGTGAAAG CCCTCGGCTT AACCGAGGAA...480

GTGCATCGGA AACTGGGAAA CTTGAGTACA GAAGAGGACA GTGGAACTCC ATGTGTAGCG...540

GTGAAATGCG TAGATATATG GAAGAACACC AGTGGCGAAG GCGGCTGTCT GGTCTGTAAC...600

TGACGCTGAG GCTCGAAAGC ATGGGTAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCATGC...660

CGTAAACGAT GAATGCTAGG TGTTGGAGGG TTTCCGCCCT TCAGTGCCGC ACTAACGCAT...720

TAAGCATTCC GCCTGGGGAG TACGACCGCA AGGTTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGG.......776

Claims

1.一种鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的分离株，其是以CCRC910145的保藏编号被保藏在中国台湾食品工业发展研究所，并以PTA-2406的保藏编号被保藏在美国典型菌种保藏中心。

2.一种组合物，它含有如权利要求1所述的鼠李糖乳酸杆菌分离株，以及一可接受的赋形剂。

3.根据权利要求2所述组合物用于制造饮料、食品、动物饲料或膳食补充品的用途。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述赋形剂选自：乳果寡糖、几丁质、壳聚糖、甘露醇、酸乳粉或前述物质的组合。

5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，它还包含一种或多种选自以下组群的菌株：嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)、短乳酸杆菌(L.brevis)、乳酪乳酸杆菌(L.casei)、胚芽乳酸杆菌(L.plantarum)、唾液乳酸杆菌(L.salivarius)、双叉乳酸杆菌(L.bifidus)、保加利亚乳酸杆菌(L.bulgaricus)、高加索乳酸杆菌(L.causasicus)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)或鼠李糖乳酸杆菌属的其他菌株。

6.一种用以治疗或预防胃肠不适的药物组合物，它包含如权利要求1所述的鼠李糖乳酸杆菌分离株。