CN100445391C

CN100445391C - L-鼠李糖-诱导型表达系统

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Publication number: CN100445391C
Application number: CNB2003801047999A
Authority: CN
Inventors: M·凯塞勒; T·泽林斯基; B·豪尔
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2002-12-02
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2023-11-27
Also published as: DE50307835D1; DK1570060T3; AU2003288189A1; US8895310B2; CA2506999C; US20060014291A1; PT1570060E; JP4619126B2; CY1107772T1; CN1720328A; ATE368746T1; AU2003288189B8; EP1570060A1; WO2004050877A1; AU2003288189B2; EP1570060B1; ES2288630T3; JP2006507831A; CA2506999A1

Abstract

本发明涉及在原核宿主细胞中表达核酸序列的方法，其中将至少一个能在所述宿主细胞中游离型复制并包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下表达的核酸序列的DNA构建体导入所述宿主细胞，其中所述启动子与所述核酸序列异源并且通过加入L-鼠李糖诱导所述核酸序列的表达，其中原核宿主细胞至少为L-鼠李糖异构酶缺陷。

Description

L-鼠李糖-诱导型表达系统

本发明涉及在原核宿主细胞中表达核酸序列的方法，其中将能在此宿主细胞中游离型复制并包含在L-鼠李糖-诱导型启动子转录控制下表达的核酸序列的至少一个DNA构建体导入此宿主细胞并通过加入L-鼠李糖诱导此核酸序列的表达，其中所述的启动子与此核酸序列异源，原核宿主细胞至少为L-鼠李糖异构酶相关缺陷。本发明还涉及这样的原核宿主细胞，其至少为L-鼠李糖异构酶相关缺陷，并包含能在此宿主细胞中复制还包含在L-鼠李糖-诱导型启动子转录控制下表达的核酸的至少一个DNA构建体，其中所述启动子与此核酸序列异源。

基因的异源表达为生产酶和其他药学目的和工业目的蛋白质的经济方式。所述表达主要仍为使用大肠杆菌菌株进行。已知多种依赖于不同宿主生物和基因表达盒的系统用于产生重组蛋白质。虽然大量在微生物系统中表达重组蛋白质的系统和方法已有描述，但是革兰氏阴性细菌表达系统如大肠杆菌表达系统基于非常局限的细菌启动子。广泛使用的为乳糖启动子[lac](Yanisch-Perron等，(1985)Gene 33：103-109)和色氨酸启动子[trp](Goeddel等，(1980)Nature(London)287：411-416)和以上的杂合启动子[lac和trp](Brosius(1984)Gene 27：161-172；Amanna & Brosius(1985)Gene40：183-190)。其他例子为λ噬菌体的PL和PR启动子(Elvin等，(1990)Gene37：123-126)、噬菌体T7启动子(Tabor & Richardson(1998)Proc Natl AcadSci USA 82：1074-1078)和碱性磷酸酶启动子[pho](Chang等，(1986)Gene44：121-125)。

异源表达牵涉多种问题例如基因产物的毒性、过度的低表达率或不溶性蛋白质集合物(“包涵体”)的形成。上述许多启动子在待表达重组蛋白质对提及的宿主有毒性影响的情况下不适于应用。这些情况下需要有最严格的可表达调节。可用于此目的的启动子系统为已知的诱导型启动子系统，其可通过加入诱导物或另一外源刺激(例如热)诱导。通常，此诱导型启动子系统由启动子/调节物联合组成，其中调节物为例如与外源刺激联合诱导从提及的启动子开始转录的蛋白质。可提及的例子为启动子和阻遏物例如乳糖阻遏物的联合(Studier FW等，(1990)Methods in Enzymol185：60-89；Dubendorff JW & Studier FW(1991)J Mol Biol 219：45-59)。此阻遏物的抑制作用可通过加入天然诱导物(例如乳糖)或人工诱导物(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；IPTG)去除，由此开始表达。与乳糖相反，IPTG不能被代谢并由此保证了长期诱导。另一个此类诱导型启动子的例子为阿拉伯糖诱导型araB启动子(US 5,028,530；Guzman LM等，(1995)JBacteriol 177：4121-4130)。

IPTG和其他合成诱导物非常昂贵并在一些情况下对生物体生长具有不利影响，这使工业规模的应用很不经济。

而通常，生理诱导物如氨基酸(例如色氨酸)和糖(阿拉伯糖)较廉价，其可由生物进行代谢，所以当细胞生长尤其是高密度细胞发酵的情况下必需随后加入和/或喂饲大量诱导物。此外，这些化合物的代谢物其后可能对培养物有害，例如当由糖产生乙酸时对培养物有害。

WO 01/73082描述了诱导物阿拉伯糖主动转运缺陷的大肠杆菌(E.coli)宿主生物中在诱导型araB启动子控制下表达重组蛋白质的方法。优势为没有主动转运但只有被动转运(通过扩散)能发生。这是指更好地控制胞内阿拉伯糖浓度并这样也更好地控制表达诱导。在一些所述的例子中，使用阿拉伯糖代谢酶核酮糖激酶(AraB)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(AraD)缺陷的大肠杆菌菌株(E104)。然而与表达数据一致，此缺陷对表达水平无实质影响。阿拉伯糖诱导系统具有多种缺点：

a)阿拉伯糖对0.1mM及以上浓度的细菌培养物具有生长抑制作用，其即使当使用WO 01/73082(参见WO 01/73082表4)中描述的方法时也只能在某种程度上补偿。

b)阿拉伯糖诱导型启动子在不存在阿拉伯糖条件下不完全失活，但具有相当高的基础活性。(参见WO 01/73082表5)。

c)所表达的重组蛋白质的量取决于细胞密度，并随细胞密度增加而降低(De Lisa MP等，(1999)Biotechnol Bioeng 65：54-64)。

描述了具有转座子插入“rha-14::Tn10”的大肠杆菌菌株JB1204(CGSC6999，Bulawa & Raetz(1984)J Biol Chem 259：11257-11264)，但未提供“rha-14”序列或功能的详细信息。

描述了细菌中如大肠杆菌中L-鼠李糖的摄取和代谢。L-鼠李糖通过主动转运系统(RhaT)摄取到细胞中，通过异构酶(RhaA)转换成L-鼠李酮糖(L-rhamnulose)，然后L-鼠李酮糖进一步通过鼠李酮糖1-磷酸酶(RhaB)磷酸化并由醛缩酶(RhaD)水解产生磷酸二羟丙酮和乳醛。基因rhaBAD组成操纵子并在已知的rhaP_BAD启动子辅助下转录。鼠李糖系统与其他系统相比区别在于调节需要两个激活剂RhaS和RhaR的事实。这两者组成转录单位并以与rhaBAD相反的方向转录。当L-鼠李糖存在时，RhaR结合rhaP_RS启动子并起始其自身表达和RhaS的表达。RhaS一旦由L-鼠李糖活化，接下来作为效应物结合rhaP_BAD启动子和rhaT基因的独立rhaP_T启动子并活化结构基因的转录(Moralejo P等，(1993)J Bacteriol 175：5585-5594；Tobin JF等，(1990)J Mol Biol 211：1-4；Chen YM等，(1987)J Bacteriol169：3712-3719；Egan SM等，(1993)J Mol Biol 243：87-98)。两活化剂的联合造成rhaP_BAD启动子异常严格的表达控制。阿拉伯糖诱导型araB启动子和鼠李糖诱导型rhaP_BAD启动子的比较表明后者受控于更加严格的调节并在无诱导物鼠李糖条件下真正表现出零表型(Haldimann A等，(1998)JBacteriol 180(5)：1277-1286)。

WO 01/32890描述了使用大肠杆菌TG1 pDHE681或其衍生物产生L-泛解酸内酯(L-pantolactone)水解酶，其中使用L-鼠李糖作为酶基因表达的诱导物。因为大肠杆菌能很好地代谢L-鼠李糖，所以转换的L-鼠李糖必需通过加入来补充。这使实验相当复杂并增加了培养基的成本。

还描述了用于高细胞密度条件下使用L-鼠李糖诱导型rhaBAD启动子和定点引入L-鼠李酮糖激酶(rhaB)缺陷的大肠杆菌菌株发酵的表达系统(Stumpp T等，(2000)Biospectrum 6(1)：33-36；Wilms B等，(2001)Biotechnol Bioeng 73(2)：95-103)。在此特意选择RhaB是因为其为L-鼠李糖代谢中第一个不可逆步骤(参见Wilms B等，(2001)Biotechnol Bioeng73(2)98页，左栏，4-8行)。使用2g/L浓度的L-鼠李糖可在这些系统中获得最佳诱导(参见Wilms B等，(2001)Biotechnol Bioeng 73(2)102页，左栏，第二段，1-4行)。这些浓度仍非常高。L-鼠李糖的平均价格大约为100欧元/千克，10m³发酵意味着仅在L-鼠李糖上要花费2000欧元。

此外还描述了严谨调节的鼠李糖诱导型表达系统，其中通过同源重组方法用PhoB基因(转录激活子)替代位于内源rhaP_BAD启动子之后的鼠李糖操纵子(BAD)(Haldimann A等，(1998)J Bacteriol 180(5)：1277-1286)。虽然在此描述的系统由于确保了很严谨的调节而很适于调节物研究，但其不太适于过量表达-尤其不太适于在高密度细胞培养条件下过量表达-因为每一种情况下作为染色体鼠李糖操纵子替代的结果仅有一个拷贝rhaP_BAD启动子控制的表达盒可以导入。此外通过同源重组替代基因非常复杂并需要单调的筛选和研究适宜修饰生物体的特征。这使所述方法不适于常规目的。

本发明的目的是提供表达核酸的改进方法-优选地为表达重组蛋白质的改进方法-其中加入小量L-鼠李糖即可得到高的表达水平。此目的通过本发明获得。

本发明的第一方面涉及在原核宿主细胞中表达核酸序列的方法，其中：

a)向所述宿主细胞中导入至少一个这样的DNA构建体，其能在所述宿主细胞中游离型复制并包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下表达的核酸序列，其中所述启动子与所述核酸序列异源；

b)选择包含所述游离型形式DNA构建体的原核宿主细胞；

c1)通过向所述选择的宿主细胞培养物中加入L-鼠李糖诱导所述核酸序列的表达。

其中原核宿主细胞至少为L-鼠李糖异构酶缺陷。

在优选的实施方案中，待表达的核酸序列的表达引起所述核酸序列编码的蛋白质的产生，所以可使用根据本发明的方法生产重组蛋白质。

在更优选的实施方案中，存在一个或多个其他L-鼠李糖-代谢或-转运蛋白质的其他缺陷。

本发明的另一方面涉及这样的原核宿主细胞，其至少为L-鼠李糖异构酶缺陷并包含至少一个能在所述宿主细胞中复制的DNA构建体，其中所述DNA构建体包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下表达的核酸序列，其中所述启动子与所述核酸序列异源。

在优选的实施方案中，根据本发明的原核宿主细胞具有一个或多个其他L-鼠李糖-代谢或-转运蛋白质的其他缺陷。

此外，本发明涉及使用根据本发明的原核宿主细胞之一或其制备物产生重组蛋白质、酶和其他精细化学品的方法，例如产生手性羧酸的方法。

根据本发明的方法具有多种优势：

1.其使用简单，因为提及的表达菌株可通过简单的转化从宿主菌株产生，不需要通过同源重组方法插入基因组(如Haldimann A等，(1998)JBacteriol 180(5)：1277-1286)和对正确修饰生物体的艰苦筛选。

2.本发明范围之内提供的表达盒和表达载体易于操作。通过举例方式使用的rhaP_BAD启动子长度只有123个碱基对。

3.因为大肠杆菌能代谢L-鼠李糖，尤其是在碳源限制的发酵情况下，常规方法造成高的L-鼠李糖消耗(送料)并由此造成高的培养基成本。因为根据本发明的方法具有较低的L-鼠李糖需求(与L-鼠李糖代谢菌株相比＜1％)，发酵培养基的成本以及生物催化剂的产量在相当程度上降低。通过提供根据本发明的方法，重组蛋白质(例如腈水解酶、L-泛解酸内酯水解酶)可通过不需持续输送鼠李糖的高密度细胞发酵(例如提供的大肠杆菌TG10菌株)生产。

4.所述系统的调节证明为格外严谨并继续提供了甚至在非常低浓度的直到0.05g/l的诱导物L-鼠李糖条件下最大程度的诱导，而在无诱导物条件下检测不到任何启动子活性。这样，本系统也显著适于潜在的毒性蛋白质的表达并且由于只需要低L-鼠李糖浓度，使廉价生产成为可能，尤其是在工业条件下。

为本发明的目的，“原核宿主细胞”或“原核宿主生物体”是指革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，但尤其是那些天然能代谢L-鼠李糖作为碳源的革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。L-鼠李糖可作为碳源为多数原核生物体利用。

原核宿主细胞或原核宿主生物体优选地指肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和放线菌(Actinomycetales)科的所有属和种，非常特别优选的肠杆菌科的属为埃希菌属(Escherichia)、沙雷菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、爱德华氏菌属(Edwardsielle)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、摩根氏菌属(Morganella)、普罗威登斯菌属(Providencia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。

其他优选的为假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、诺卡菌属(Nocardia)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、蓝细菌属(Cyanobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、气杆菌属(Aerobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、红球菌属(Rhodococcus)和青霉属(Penicillium)。

最优选的为埃希菌属，尤其为大肠杆菌。

“L-鼠李糖诱导型启动子”一般指那些存在L-鼠李糖条件下比不存在L-鼠李糖条件具有较高表达活性的所有启动子。存在L-鼠李糖条件下的表达至少高达不存在鼠李糖条件下的两倍，优选地至少高达五倍，非常优选地为至少高达十倍，最优选地至少高达一百倍。为确定表达水平的目的，优选使用的核酸序列为那些与待检测的启动子功能性连接的、易于编码可定量蛋白质的核酸序列。本文中非常特别优选的为报告蛋白质(SchenbornE，Groskreutz D(1999)Mol Biotechnol 13(1)：29-44)例如“绿色荧光蛋白”(GFP)(Chui WL等，(1996)Curr Biol 6：325-330；Leffel SM等，(1997)Biotechniques 23(5)：912-8)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Millar等，(1992)Plant Mol Biol Rep 10：324-414)、β-葡糖苷酸酶或β-半乳糖苷酶。

本文中，培养基中L-鼠李糖的浓度通常为约0.0001g/l到约50g/l，优选地为0.001g/l到5g/l，尤其优选地为0.01g/l到0.5g/l/

尤其优选的为大肠杆菌L-鼠李糖操纵子rhaBAD的rhaP_BAD启动子(Egan & Schleif(1994)J Mol Biol 243：821-829)和其他原核生物体中的其功能等同物，尤其是肠杆菌科生物体中的其功能等同物。

非常尤其优选的启动子为那些包含至少一个如SEQ ID NO：5所示的RhaS结合元件或其功能等同物的启动子，或以上的功能等同片段。

尤其优选的启动子为那些包含SEQ ID NO：2、3或4所示序列和其功能等同物的启动子，以及以上的功能等同片段。

包含SEQ ID NO：2、3、4或5所示序列的启动子的功能等同物优选地包含下列启动子：

a)基本具有包含SEQ ID NO：2、3、4或5所示序列的启动子相同的启动子活性，以及

b)与所述启动子序列具有至少50％，优选的70％，优选的至少80％，尤其优选的至少90％，非常尤其优选的至少95％，最优选的99％的同源性，其中同源性延伸至少30碱基对长度，优选的至少50碱基对，尤其优选的至少100碱基对长度。

包含SEQ ID NO：2、3、4或5所示序列的启动子的的功能等同物尤其指所述启动子和来自其他生物体优选的为其他原核生物体，尤其为肠杆菌科家族生物体的同源序列和功能等同物的天然或人工突变，其基本具有所述启动子相同的启动子活性。

“基本相同的启动子活性”是指L-鼠李糖对表达活性的诱导性与以上L-鼠李糖诱导型启动子的总体定义一致。

如上所述，RhaR蛋白质在L-鼠李糖存在条件下与rhaP_RS启动子结合并起始其自身表达和RhaS的表达。RhaS接下来用L-鼠李糖作为效应物结合rhaP_BAD启动子，活化rhaP_BAD启动子并由此核酸序列的转录由所述启动子调节。由RhaR、RhaS和rhaP_RS启动子组成的上游调节单元可由原核宿主生物体天然提供，通过重组方法插入后者的基因组，或可通过使用本发明范围之内的DNA构建体提供。适于本文的一个启动子盒为SEQ ID NO：1描述的序列。

如果细胞中诱导所需的L-鼠李糖摄取不足，那么在例如天然不表达L-鼠李糖转运蛋白的生物体中转基因表达后者是有利的。然而到目前为止的经验表明鼠李糖的主动转运不代表根据本发明的表达系统的效率的限制因素。

“L-鼠李糖异构酶”一般指那些能将L-鼠李糖转换成不同己糖的所有蛋白质。L-鼠李糖异构酶优选地指能将L-鼠李糖转换成L-鼠李酮糖(L-rhamnulose)(EC 5.3.1.14)的蛋白质。尤其优选的为肠杆菌科生物体尤其是大肠杆菌的RhaA基因。L-鼠李糖异构酶最优选地指SEQ ID NO：9所示蛋白质和来自其他生物体优选的为其他原核生物体的同源序列。

SEQ ID NO：9所示的L-鼠李糖异构酶功能等同物优选地包含下列序列：

a)具有SEQ ID NO：9显示的L-鼠李糖异构酶基本相同的酶活性；

b)与SEQ ID NO：9显示的L-鼠李糖异构酶序列至少50％，优选的70％，优选的至少80％，尤其优选的至少90％，非常尤其优选的至少95％，最优选的99％的同源性，其中同源性延伸至少30氨基酸长度，优选的至少50氨基酸，尤其优选的至少100氨基酸，非常尤其优选的至少200氨基酸，最优选的蛋白质全部长度。

除L-鼠李糖异构酶外，也可存在其他具有代谢L-鼠李糖功能的基因的相关缺陷。本文中尤其提到的缺陷为鼠李酮糖1-磷酸酶/激酶缺陷(如RhaB；如SEQ ID NO：11所述)、磷酸鼠李酮糖(rhamnulosephosphate)醛缩酶缺陷(如RhaD；如SEQ ID NO：13所述)或至少一个控制上述蛋白质表达的调节元件的缺陷(如启动子、调节子等)。

在特定条件下，产生鼠李糖主动转运系统缺陷更有利(如RhaT；如SEQID NO：19所述)。

L-鼠李糖异构酶或另一L-鼠李糖摄取/代谢酶相关“缺陷”是指以其功能和/或活性基本抑制或修饰的方式基本完全抑制或阻止提及的目的基因或其产生的mRNA和/或由此编码蛋白质产物或基因产物修饰的蛋白质序列的表达，这种抑制或阻止使L-鼠李糖基本不再转换，其中所述的抑制或阻止基于不同的细胞生物学机制。

为本发明目的抑制或阻止尤其包含可量化降低目的基因表达的mRNA和/或由此编码的蛋白质产物到其基本完全消失。本文中，由此包括的细胞或生物体中特定mRNA和/或蛋白质产物的表达与未使用此方法的相同细胞或生物体相比优选地降低50％以上，尤其优选地80％以上，非常尤其优选地90％以上，最优选地95％以上。降低非常尤其优选地指内源基因的完全失活(敲除突变)。

抑制或阻止可基于不同的机制。抑制或阻止优选地基于提及的目的基因的突变，其可能为替代、删除和/或添加一个或多个核苷酸的突变。尤其优选的为通过转位子辅助诱变方法或通过定点敲除方法的抑制或阻止。

降低可通过技术人员熟悉的方法确定。这样，蛋白质数量的降低例如可通过蛋白质免疫检测确定。此外，可使用生物化学技术如Northern杂交、核酸酶保护分析、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附试验)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)或其他免疫测定和荧光激活细胞分析(FACS)。依据产生的蛋白质产物类型可确定后者的活性或对生物体或细胞表型的影响。

“蛋白质数量”指生物体、组织、细胞或细胞器中特定多肽的数量。

蛋白质数量的“降低”指与在相同框架调节下(例如培养条件、年龄、营养供给等)未应用此方法的同属和种的野生型相比生物体、组织、细胞或细胞器中特定多肽的数量的降低。本文中降低数量达到至少50％，优选地至少70％，尤其优选地至少90％，非常尤其优选地至少95％，最优选地至少99％。确定蛋白质数量的方法为技术人员已知。可提到的例子为：微缩二脲方法(Goa J(1953)Scand J Clin Lab Invest 5：218-222)、Folin-Ciocalteu方法(Lowry OH等，(1951)J Biol Chem 193：265-275)或测量CBB G-250吸附(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72：248-254)。

L-鼠李糖异构酶活性的降低尤其可通过酶促分析系统确定。适当的分析系统为技术人员已知(Bhuiyan SH等，(1997)J Ferment Bioeng 84(4)：319-323)。

“能在原核宿主细胞中游离型复制的DNA构建体”指那些与所述宿主细胞染色体DNA不同，与宿主细胞中前者平行存在并能使用同源或其他复制机制(如通过DNA构建体自身编码的复制机制)在所述宿主细胞中复制的所有DNA构建体。DNA构建体可组成单链或双链DNA结构。DNA构建体优选地至少在一些时间(如其复制周期中某一点)具有双链DNA结构。

能游离型复制的所述DNA构建体优选地在宿主细胞中以至少1个，优选地至少5个，尤其优选地至少10个拷贝数存在。

“筛选包含所述游离形式DNA构建体的原核宿主细胞”指选择包含所述游离形式DNA构建体的宿主细胞。其可例如使用下文描述的选择标记来选择。DNA构建体优选地不插入宿主细胞的染色体DNA。这可以例如通过缺少与宿主细胞染色体序列实际部分相同的序列的DNA构建体避免。

能游离型复制的所述DNA构建体优选地具有不多于100,000碱基或碱基对的大小/长度，尤其优选地不多于50,000碱基或碱基对，非常尤其优选地10,000碱基或碱基对(碱基或碱基对的数量取决于DNA构建体为单链还是双链DNA结构)

DNA构建体优选地为载体。举例来说，载体可为质粒、粘粒、噬菌体、病毒、逆转录病毒或农杆菌。载体优选地为包含欲以重组形式表达的核酸序列并能在原核宿主细胞中自主复制的环状质粒。在本发明范围之内，载体可为重组载体或重组表达载体。技术人员熟悉允许原核生物中DNA复制的多种序列。可提到的例子为ORI(DNA复制起点)、pBR322ori或P15Aori(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。

确保低拷贝数量的相应适当复制起点可从BACs(细菌人工染色体)、F-质粒、粘粒如pWE15中分离。确保中等拷贝数量的相应适当复制起点可从例如pBR322(Lin-Chao S，Bremer H，Mol Gen Genet 1986203(1)：143-149)和衍生物如pJOE系列、pKK223-3、pQE30、pQE40或带有R1起点的质粒如pRSF1010和衍生物如pML122、p15A、pSC101中分离。确保高拷贝数量的相应适当复制起点可从例如噬菌粒如pBluescript IISK/KS+/-、pGEM等中分离。每一种情况下细胞中存在的拷贝数量部分通过已知的复制起点(也称为复制子)来确定。pBR322系列的质粒包含pMB1的ColE1复制起点。此复制起点为相对严谨调节并造成约每个细胞约25个的拷贝数量。pUC质粒包含突变的ColE1形式并可以每个细胞中200到700个质粒拷贝存在。一些质粒包含p15A复制起点，其造成低拷贝数量。

可提到的载体的例子为：

a)下列在大肠杆菌中优选：pQE70、pQE60和pQE-9(QIAGEN，Inc.)；pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene Cloning Systems，Inc.)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia Biotech，Inc.)；pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、lgt11或pBdCI；

b)下列在链霉菌中优选：pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；

c)下列在芽孢杆菌中优选：pUB110、pC194或pBD214；

d)棒状杆菌中：pSA77或pAJ667，

或以上提到质粒的衍生物。提到的质粒为所选择的小部分可用质粒。其他质粒为技术人员熟知并可例如在Cloning Vektors(Eds.Pouwels P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中查到。

“转化”或“转化的”是指向原核宿主细胞中导入遗传物质如载体(例如质粒)。技术人员为此目的可使用下文描述的多种方法。导入所述遗传物质的原核宿主细胞和“后代”和由此细胞而来包含所述遗传物质的克隆称为“转化体”。

“转导”或“转导的”是指从噬菌体遗传物质开始在原核宿主细胞中导入遗传材料。导入所述遗传物质的原核宿主细胞和“后代”和由此细胞而来并包含所述遗传物质的克隆称为“转导体”。

“重组蛋白质”是指从待表达的核酸序列开始，可在L-鼠李糖诱导型启动子功能控制下表达并包括肽、多肽、蛋白质、寡蛋白质和/或融合蛋白的任何蛋白质产物。“重组蛋白质”优选地指微生物、细菌、动物或植物来源的蛋白质。

“融合蛋白”是指目的蛋白质和使在宿主细胞特定区室(例如周质或细胞质)表达或表达到周围培养基中成为可能的前导序列的融合。可提到的例子为pelB前导序列(US 5576,195；US 5,846,818)。

“表达盒”是指每一种情况下启动子和至少一个能在启动子控制下转录的核酸序列的联合。

L-鼠李糖诱导型启动子与在所述启动子控制下表达的核酸序列或表达盒或表达载体“异源”是指通过重组方法产生的所有那些构建体，其中：

a)至少一个待表达的核酸序列或

b)至少一个控制所述待表达核酸序列表达的L-鼠李糖诱导型启动子或

c)(a)和(b)

不在其天然遗传环境中(例如不在其天然染色体位点)或已经通过重组方法修饰，其可能修饰成包含例如一个或多个核苷酸残基的替代、添加、删除、倒位或插入。

在根据本发明的方法中，根据本发明的原核宿主细胞在允许这些生物体生长的培养基中生长。此培养基可为合成或天然培养基。依据生物体的不同而使用技术人员已知的培养基。为允许微生物生长，所用的培养基包含碳源、氮源、无机盐和根据需要包含少量的维生素和微量元素。

有利的碳源为例如多元醇如丙三醇、糖如单糖、二糖或多糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、淀粉或纤维素、复合糖源如糖蜜、磷酸糖如果糖-1，6-二磷酸、糖醇如甘露醇、醇类如甲醇或乙醇、羧酸如柠檬酸、乳酸或乙酸、脂肪如豆油或菜籽油、氨基酸如氨基酸混合物、例如所谓的水解酪蛋白氨基酸(Difco)或单一氨基酸如甘氨酸或天冬氨酸或可同时作为氮源使用的氨基糖。尤其优选的为多元醇，尤其是丙三醇。

作为基本培养基使用的培养基优选地不含L-鼠李糖以确保最严谨的可能表达调节。然后如果需要，可在需要的时间点或细胞密度点和每一种情况中需要的浓度下加入L-鼠李糖。

有利的氮源为包含这些化合物的有机或无机含氮化合物或物质。例子为铵盐如NH₄Cl或(NH₄)₂SO₄、硝酸盐、尿素或复合氮源如玉米浆、啤酒酵母自溶物、豆粉、麦麸、酵母提取物、肉提取物、酪蛋白水解物、酵母或马铃薯蛋白质、它们经常用作氮源。

无机盐的例子为钙盐、镁盐、钠盐、钴盐、钼盐、锰盐、钾盐、锌盐、铜盐和铁盐。这些盐的阴离子尤其要提到的为氯化物、硫酸盐和磷酸盐离子。对增加根据本发明方法中产量很重要的因素为控制生产培养基中Fe²⁺或Fe³⁺离子的浓度。

根据需要，可在营养培养基中加入其他生长因子，如维生素或生长促进剂如生物素、2-KLG、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸或吡哆醇、氨基酸如丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸或缬氨酸、羧酸如柠檬酸、蚁酸、庚二酸或乳酸、或如二硫苏糖醇的物质。

所述营养成分的混合比例根据发酵的类型并根据每一单独情况确定。培养基的所有成分可按需要在发酵开始时，根据需要分别或同时灭菌之后加入发酵容器，或可在发酵过程中连续或分批加入发酵容器中。

培养条件以微生物生长最佳且获得最好可能产量(这可通过例如基于表达的重组蛋白质的活性水平确定)的方式指定。优选的培养温度为15-40℃。25-37℃之间的温度尤其有利。pH值优选地保持在3-9。5-8之间的pH值尤其有利。一般而言，数小时到几天的孵育时间足够，优选地8小时到21天，尤其优选地4小时到14天。在这段时间内，培养基中累积产物的最大量。

有利的培养基优化可由技术人员在例如教科书Applied Microbiol.Physiology，“A Practical Approach(PM Rhodes，PF Stanbury编辑，IRL-Press，1997，53-73页，ISBN 0199635773)中查到。

根据本发明的方法可连续或间断地分批或分批加入进行。

“突变”是指一个或多过氨基酸或碱基/碱基对的替代、添加、删除、倒位或插入。

两个核酸序列之间的“同源性”是指每一种情况下指示的序列长度中核酸序列的同一性，其通过程序算法GAP(Wisconsin Package Version10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389ff)进行比较来计算，其设置有下列参数：

缺口权重：50 长度权重：3

平均匹配：10 平均不匹配：0

例如，核酸水平上与序列SEQ ID NO：2至少50％同源性的序列理解为是指使用以上程序算法用设置的以上参数与序列SEQ ID NO：2比对时具有至少50％同源性的序列。

两个多肽之间的“同源性”是指每一种情况下指示的序列长度中氨基酸序列的同一性，其通过程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)进行比较来计算，其设置下列参数：

缺口权重：8 长度权重：2

平均匹配：2912 平均不匹配：-2003

例如，蛋白质水平上与序列SEQ ID NO：9至少50％同源性的序列理解为是指使用以上程序算法用设置的以上参数与序列SEQ ID NO：9比对时具有至少50％同源性的序列。

为在生物体中最佳表达异源基因，根据生物体特定的密码子选择修饰核酸序列是有利的。密码子选择可基于所提及生物体的其他已知基因的计算机分析容易地确定。

包含L-鼠李糖诱导型启动子和在其控制下表达的核酸序列的DNA构建体由于所述启动子和所述核酸序列的功能性连接确保了所述核酸序列的转录和/或翻译。

功能性连接通常理解为是指遗传控制序列可发挥其表达核酸序列相关功能的排列。本文中功能是指例如表达控制如核酸序列的转录和/或翻译。本文中控制包含例如起始、提高、控制或抑制表达如转录和根据需要为翻译。功能性连接理解为是指例如启动子、待表达的核酸序列和根据需要其他调节元件如终止子以核酸序列表达时每一个调节元件可完成其功能的方式依次排列。技术人员熟悉得到根据本发明的DNA构建体之一的多种方法。可通过常规重组和克隆技术方法进行构建，如T Maniatis，EF Fritsch和J Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)以及TJ Silhavy，MLBerman和LW Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，FM等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)中所述。

所述DNA构建体可包含其他功能元件。功能性元件的概念广义地解释为并指那些对根据本发明的DNA构建体或生物体的产生、增殖或功能有影响的所有序列。功能性元件确保、提高、调节或修饰例如相应宿主生物体中的转录和根据需要，翻译。

在例如“Goeddel；Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)”或“Gruber和Crosby，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy，CRCPress，Boca Raton，Florida，Glick和Thompson编辑，第7章，89-108”和其中引用的参考文献中描述了功能元件。取决于下文中更详细描述的通过导入表达盒或载体转变成遗传修饰或转基因生物体的宿主生物体和起始生物体，不同的控制序列均是适当的。

“遗传控制序列”包含例如基因的5’非翻译区或非编码的3’区域。“遗传控制序列还指编码融合蛋白的信号肽序列的序列。下列可通过举例形式提到但不限于此：

a)选择标记

通常，选择标记为筛选成功转化细胞和防止DNA构建体随时间进程和在发生细胞分裂时从宿主细胞中丢失所必需。此类丢失尤其在核酸序列编码的待表达重组蛋白质对原核生物体具有毒性影响时发生。与表达构建体一起导入的选择标记赋予成功转化的细胞杀生物剂(例如抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素或潮霉素)抗性。提到的选择标记的例子为：

-Amp(氨苄青霉素抗性；β-内酰胺酶)

-Cab(羧苄青霉素抗性)

-Cam(氯霉素抗性)

-Kan(卡那霉素抗性)

-Rif(利福平抗性)

-Tet(四环素抗性)

-Zeo(zeocin抗性)

-Spec(壮观霉素)

通过适量的抗生素维持选择压力。提到的例子为：氨苄青霉素100mg/l、羧苄青霉素100mg/l、氯霉素35mg/l、卡那霉素30mg/l、利福平200mg/l、四环素12.5mg/l、壮观霉素50mg/l。

选择标记还包含那些使选择适当转化宿主细胞成为可能的基因及基因产物，例如通过补偿氨基酸或核苷酸合成的遗传缺陷的基因或基因产物。一般地，为此目的使用不包含所述氨基酸或核苷酸单位的培养基。技术人员熟悉多种此类系统。提到的例子为在例如大肠杆菌菌株KC8(Clontech)存在色氨酸(例如trpC)合成缺陷、亮氨酸(例如leuB)合成缺陷、组氨酸(例如hisB)合成缺陷。这些缺陷尤其可由选择标记TRP1、Leu2和HIS3补偿。

b)转录终止子

转录终止子减少不必要转录并增加质粒和mRNA稳定性。

c)Shine-Dalgarno序列

Shine-Dalgarno(SD)序列为翻译起始所需并与16S核糖体RNA 3’端互补。起始密码子处的起始翻译效率依赖于准确的序列。大肠杆菌适当的共有序列为例如5’-TAAGGAGG-3’。其位于起始密码子上游约4到14个核苷酸处，最佳的为8个核苷酸。为避免二级结构的形成(其可降低表达)，此区域应优选地富含A/T核苷酸。

d)起始密码子

起始密码子为翻译开始的点。在大肠杆菌中，ATG为最广泛使用的起始密码子；作为选择也可使用GTG。

e)标记物”和融合蛋白

将待表达的重组蛋白质和短肽(“标记物”)或其他蛋白质(融合配偶体(fusion partner))间进行N-端或C-端融合是有利的。例如其可使提高的表达水平、溶解性、可检测性和纯化成为可能。此类融合优选地与蛋白酶切割序列(如凝血酶或因子X)连接，这使表达和纯化发生之后去掉“标记物”和融合配偶体成为可能。

f)多克隆区域(多克隆位点；MCS)允许和辅助一个和多个核酸序列的插入。

g)终止密码子/转录终止子

三个可能的终止子中，TAA为优选的，因为TAG和TGA在一些情况下会造成不终止转录的通读。为确保可信的终止，也可在序列中使用多个终止子。

h)报告基因

报告基因编码易于量化的蛋白质，其确保通过其固有的颜色或酶活性来评估转化效率、表达水平、以及表达的时间和空间。报告基因可例如编码下列蛋白质：水解酶、荧光蛋白质、生物发光蛋白质、葡萄糖苷酶或过氧化物酶。优选的为萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、绿色荧光蛋白、乙酰转移酶、磷酸转移酶或腺嘌呤转移酶(也见于Schenborn E，Groskreutz D(1999)Mol Biotechnol 13(1)：29-44)。

在选择标记或报告基因时，编码所述蛋白质的核酸序列优选地功能性地与在所讨论的原核宿主细胞中有功能的启动子和根据需要其他控制序列连接以产生表达盒。有利的启动子和控制序列一般为技术人员已知。可提到的例子为启动子如cos、tac、trp、te、lpp、lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子。

经转化宿主细胞或经转化宿主生物体的产生需要在提到的宿主细胞中导入提到的DNA(例如根据本发明的表达盒或载体之一)。大量的方法可用于此过程，也称为转化法(也见于Keown等，(1990)Methods inEnzymology 185：527-537)。这样，DNA可例如通过显微注射、电穿孔或通过使用DNA包被的微粒的轰击(用基因枪的生物弹射击(biolistic)方法；粒子轰击)直接导入。细胞也可化学通透化，例如用聚乙二醇通透化以使DNA可通过扩散进入细胞。DNA也可通过与其他含DNA单位的如小细胞、细胞、溶酶体或脂质体融合的方法导入。电穿孔为另一个适当的导入DNA的方法，其中细胞可逆地通过电脉冲通透化。可提到的优选常用方法为磷酸钙介导的转化、DEAE-葡聚糖介导的转化、阳离子脂类介导的转化、电穿孔、转导、侵染。此类方法为技术人员已知并通过举例的方式在(Davis等，(1986)Basic Methods In Molecular Biology；Sambrook J等，(1989)Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel FM等，(1994)Current protocols in molecular biology，JohnWiley和Sons；Glover DM等，(1995)DNA Cloning Vol.1，IRL Press ISBN019-963476-9)中描述。

当选择标记为导入的DNA一部分时，可将转化细胞即那些包含所导入DNA的细胞从未转化细胞中选择。以上描述了多种选择标记。

根据本发明的方法不局限于待表达的核酸的性质和序列或基于其表达的重组蛋白质的性质和序列。在L-鼠李糖诱导型启动子控制下待表达的核酸序列可以是不同的。本文中，表达是指转录和根据需要是指翻译。除了表达编码重组蛋白质的核酸序列，也可表达例如引起反义RNA转录的核酸序列并由此降低原核宿主生物中内源基因的表达。可表达原核来源的序列，但也可表达真核来源的序列。优选地表达编码大量产生重组蛋白质的序列。以举例形式可提到下列各项，但不限于此：

a)酶例如凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、糖酶、脱氢酶、核酸酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、α-淀粉酶、氧化还原酶(如过氧化物酶或漆酶)、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、纤维素酶、胶原酶、半纤维素酶和脂肪酶。尤其优选的为：

-洗衣去污剂或其他去污剂中使用的酶例如辣根过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯酶或纤维素酶，

-食品工业中使用的酶如蛋白酶、脂肪酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶或果胶酶，

-工业生产中使用的酶如脂肪酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖异构酶，

-生产化学品和精细化学品的工业生产中使用的酶如脂肪酶、酰胺酶、腈水合酶、酯酶或腈水解酶，

-动物营养学中使用的酶如β-葡聚糖酶，

-造纸业或皮革工业中使用的酶如淀粉酶、胶原酶、纤维素酶或木聚糖酶。

b)哺乳动物蛋白质如血液蛋白质(例如血清白蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、组织纤溶酶原因子、蛋白C、血管性血友病因子、抗凝血酶III或促红细胞生成素)、集落刺激因子(CFS)(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、细胞因子(如白细胞介素)、整合蛋白、地址素、选择蛋白、抗体或抗体片段、结构蛋白质(例如胶原蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白或肌球蛋白)、生长因子、细胞周期蛋白、疫苗、血纤蛋白原、凝血酶、胰岛素。

待表达的核酸序列尤其优选地编码选自凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、糖酶、脱氢酶、核酸酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、α-淀粉酶、氧化还原酶、过氧化物酶、漆酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、纤维素酶、胶原酶、半纤维素酶、脂肪酶、乳糖酶、果胶酶、淀粉葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖异构酶、腈水解酶、酯酶、腈水合酶、酰胺酶、加氧酶、醇腈酶、裂合酶、内酯酶、羧化酶、胶原酶、纤维素酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、组织纤溶酶原因子、蛋白C、血管性血友病因子、抗凝血酶、促红细胞生成素、集落刺激因子、细胞因子、白细胞介素、胰岛素、整合蛋白、地址素、选择蛋白、抗体、抗体片段、结构蛋白质、胶原蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、生长因子、细胞周期蛋白、疫苗、血纤蛋白原和凝血酶的重组蛋白质。

在优选的实施方案中，重组蛋白质为腈水解酶，优选地为由选自以下的核酸序列编码的氨基酸序列描述的腈水解酶：

a)具有SEQ ID NO：6所示序列的核酸序列，

b)由于遗传密码的简并性从SEQ ID NO：6所示序列衍生的核酸序列，

c)SEQ ID NO：6所示核酸序列的衍生物，其编码的多肽与SEQ IDNO：6所示序列编码的具有SEQ ID NO：7氨基酸序列的多肽在氨基酸水平具有至少35％的同源性而多肽的酶活性基本不降低。

本发明的另一方面涉及上述根据本发明的宿主细胞或宿主生物体在产生食品、饲料、药物或精细化学品中的用途。精细化学品优选地指蛋白质、酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然和合成调味品、芳香化学品和着色剂。

本发明还涉及使用根据本发明的原核宿主细胞之一或其制品生产重组蛋白质、酶和其他精细化学品的方法，如生产醛、酮或羧酸(优选地为手性羧酸)的方法。优选的蛋白质和酶在下文中详述。

在本文中，原核宿主细胞可为生长、静止、固定或破裂状态。破裂的细胞理解为是指例如通过用例如溶剂处理通透化的细胞或通过酶处理、机械处理(例如法式压滤器(French press)或超声处理)或通过其他任何方法破裂的细胞。得到的粗提取物有利地适于根据本发明的方法。部分纯化的酶制品也可用于本方法。可有利地用于反应中的经固定微生物或酶同样适用。

本发明的另一方面涉及生产手性羧酸的方法，其中外消旋腈(或作为一种选择，其前体醛和氢氰酸/氰化物盐)通过用原核宿主细胞处理转换成所述手性羧酸，其中所述原核宿主细胞至少为一种L-鼠李糖异构酶缺陷并包含至少一个能在所述宿主细胞中复制并包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下编码腈水解酶的核酸序列的DNA构建体，其中所述的启动子与所述核酸序列异源。

编码腈水解酶的核酸序列优选地选自以上显示的编码腈水解酶的序列。

手性羧酸为有机合成化学中孜孜以求的化合物。它们为多种药物活性成分和作物保护活性成分的起始材料。手性羧酸可通过非对应异构物盐用于常规的外消旋物拆分。这样例如R-(-)-或S-(-)-扁桃酸用于外消旋胺的外消旋折分。R-(-)-扁桃酸还用作合成目的的中间体。

在优选的实施方案中，通式I的手性羧酸从通式II的外消旋腈开始制备。

其中

^＊为光学活性中心，

R¹，R²，R³相互独立地为氢、取代或未取代的、分支或不分支的C1-C10-烷基、C2-C10-链烯基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、OR⁴或NR⁴R⁵并且其中R¹、R²和R³基团总是不同，

R⁴为氢、取代或未取代的、分支或不分支的C1-C10-烷基、C2-C10-链烯基、C1-C10-烷基羰基、C2-C10-链烯基羰基、芳基、芳基羰基、杂芳基或杂芳基羰基，

R⁵为氢、取代或未取代的、分支或不分支的C1-C10-烷基、C2-C10-链烯基、芳基或杂芳基。

最优选的如腈为扁桃腈、邻氯扁桃腈、对氯扁桃腈或间氯扁桃腈。最优选的如手性羧酸为R-扁桃酸、S-扁桃酸、R-对氯扁桃酸、S-对氯扁桃酸、R-间氯扁桃酸、S-间氯扁桃酸、R-邻氯扁桃酸或S-邻氯扁桃酸。

例如WO 00/23577中详述了进行这些转换或纯化产物等的细节。明确地引用了其中描述的起始材料、产物和加工参数。

实施例

除非另外说明，常规的核酸方法如克隆、限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、连接DNA片段、转化微生物、细菌培养和重组DNA的序列分析如Sambrook等所述进行(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN0-87969-309-6)。重组DNA分子根据Sanger的方法(Sanger等，(1977)ProcNatl Acad Sci USA 74：5463-5467)用ABI激光荧光DNA测序仪测序。为避免待表达构建体中的聚合酶错误，对聚合酶链式反应后得到的片段进行测序并验证。

实施例1：大肠杆菌菌株JB1204的表征

依照文献，大肠杆菌菌株JB1204(CGSC6999，Bulawa CE & RaetzCRH(1984)J Biol Chem 259：11257-11264)具有转座子插入“rha-14::Tn10”，而未给出“rha-14”序列和功能的其他细节信息。由于其他许多突变，JB1204(K12衍生物)在生长方面不如如TGI和W3110菌株，这就是为什么此菌株本身不用于工业规模生产蛋白质。

为检测菌株大肠杆菌JB1204是否仍代谢鼠李糖以及在大肠杆菌JB1204中进行鼠李糖依赖性表达系统的诱导是否有不利影响，制备感受态JB1204细胞并用质粒pDHE1650转化，所述质粒为pJOE衍生物并携带鼠李糖启动子控制下的腈水解酶基因(质粒与DE 19848129中的pDHE19.2相对应)。37℃下于LB-氨苄青霉素-四环素中加入鼠李糖或不加入鼠李糖培养15小时后，测定培养物的光密度并于细胞洗好后在已知的静息细胞鉴定法中检测腈水解酶活性(见表1)。当在L-鼠李糖存在下生长时，JB1204和比较菌株TG1中发生腈水解酶表达，但是此表达在不存在鼠李糖下不发生。

表1

样品	鼠李糖补充[g/L]	鼠李糖消耗	OD<sub>600</sub>	扁桃腈转换
样品	鼠李糖补充[g/L]	鼠李糖消耗	OD<sub>600</sub>	扁桃腈转换	1	2	-	5.9	+
1	0	-	5.7	-	1	2	-	5.9	+
1	0	-	5.7	-	2	2	+	11.9	+
2	0	-	8.0	-	2	2	+	11.9	+

1，大肠杆菌JB1204pDHE1650于LB Amp Tet中；

2，大肠杆菌TG1pDHE1650于LB Amp中(阳性对照)

分析条件：10mM Tris-HCl，6mM扁桃腈，40℃

分析：用40μl 1M HCl/ml停止样品，去除细胞然后如DE 19848129所述通过HPLC分析

实施例2：制备鼠李糖缺陷宿主菌株TG10以产生重组蛋白质

用于产生重组生物催化剂的TG1菌株以其不再代谢鼠李糖的方式通过P1转导修饰，而pJOE和pDHE载体基于鼠李糖诱导的表达系统不受不利影响继续发挥功能(此新菌株衍生物的名称：TG10)。

大肠杆菌菌株的选择对能以廉价方式和高产量进行发酵方法很重要。这就是为什么选择因生产高密度细胞发酵(Korz等，(1995)J Biotechnol39：59-65)闻名的大肠杆菌TG1作为宿主菌。JB1204的鼠李糖缺陷通过P1转导传递到TG1pDHE1650中并在15μg/ml四环素上选择(＝TG10pDHE1650＝Lu10569)。

2.1从JB1204(rha14::Tn10)传递鼠李糖缺陷到TG1中的P1转导方法

a)制备供体裂解物

-37℃在3ml LB-Tet(15μg/ml)中培养供体即JB120415小时(预培养)。

-37℃孵育3ml LB-Tet+5mM CaCl₂+60μl预培养物(＝1∶50)到OD600＝0.3-0.5(约45分钟)

-+100μl(新鲜)P1噬菌体裂解物，继续充分振荡10-120分钟直到发生细胞裂解(注意，旧裂解物需要5小时)

-+60μl氯仿，涡旋30秒以破坏残留细胞，存于4℃。

b)受体的侵染

-37℃在3ml LB-Amp中培养受体即TG1 pDHE1650(＝Lu9682)约15小时(预培养)

-37℃孵育5ml LB-Amp+5mM CaCl₂+10mM MgCl₂+10mMMgSO₄+100μl预培养物(＝1∶50)到OD600＝0.3-0.5(约30分钟)，余下的预培养物放于冰上

-收获预培养物和主要培养物，重悬于2.5ml的LB-Amp-Ca-Mg中

-每种情况下用0、5、30、100μl供体裂解物处理2×100μl受体，并与无受体+100μl供体裂解物的对照一起30℃下不振荡分别孵育8分钟和24分钟(侵染)

-+100μl pH7.0的1M柠檬酸钠，7000转/分钟离心2分钟，1ml pH7.0的0.1M柠檬酸缓冲液中洗2-3次并重悬，37℃不振荡培养1小时

-收获，重悬于100μl pH 7.0的0.02M柠檬酸钠中

-每种情况下涂布80μl于LB-Amp-Tet平板上并每种情况下涂布10μl无供体裂解物加入的混合物于LB-Amp平板，37℃孵育过夜

-LB-Amp长出菌苔(对照)。从LB-Amp-Tet上挑选克隆并确认抗性、鼠李糖缺陷、鼠李糖诱导性和活性。

同样，平行转导带有陪伴分子共表达(GroESL)的TG1pDHE1650的等同物TG1pDHE1650pAgro4pHSG575(培养基中加入壮观霉素50μg/ml和氯霉素10μg/ml；名称TG10pDHE1650pAgro4pHSG575＝Lu10571)。

获得的克隆于3ml LB/氨苄青霉素/鼠李糖(约2g/l)培养基(±四环素10μg/ml)中培养过夜之后测量培养物的光密度(λ＝600nm)。培养物上清的HPLC分析显示得到的大肠杆菌菌株TG10pDHE1650不能代谢鼠李糖。细胞随后在缓冲液中洗并于静息细胞鉴定法中分析其腈水解酶活性(表2)。

鼠李糖缺陷克隆表现出与相应对照菌株(TG1pDHE1650)相似的腈水解活性。克隆中的鼠李糖浓度几乎不降低。

表2

分析条件：10mM Tris-HCl，6mM扁桃腈，40℃

分析：用40μl 1M HCl/ml停止样品，去除细胞然后如DE 19848129所述通过HPLC分析(1U＝1μmol扁桃酸/分钟)

实施例3：鼠李糖缺陷宿主菌株TG10pDHE1650的成熟

用大肠杆菌TG1pDHE1650的转导与用氨苄青霉素选择原始菌株JB1204相比具有选择优势。然而，随后的工作需要无质粒的宿主菌株，即需从TG10pDHE1650中去除pDHE1650质粒(TG10pDHE1650的处理)。为此目的，大肠杆菌TG10pDHE1650从冰上接种于3ml不合氨苄青霉素的LB-Tet中并37℃孵育过夜。此培养物用于1∶100接种LB-Tet中的3ml主培养物，其进行热休克处理(2.5分钟，42℃)。37℃振荡16小时后，培养物的OD₆₀₀为1.3(对应于约1.3×10⁹细胞/毫升)。每种情况下10^-4到10^-7稀释的100μl涂布于LB-Tet上，得到的克隆(560+140+15+0)通过影印方法转到含氨苄青霉素的LB-Tet上。此培养基上表现微弱生长的克隆再次涂布到LB-Amp-Tet上。其既不在LB-Amp-Tet上生长，且在微量制备后也不显现任何质粒DNA(LB-Tet培养物)。此氨苄青霉素敏感克隆命名为TG10(＝Lu10568)并用作新过量表达菌株的起始菌株。

实施例4：使用鼠李糖缺陷宿主菌株大肠杆菌TG10产生重组L-泛解酸内酯水解酶

制备感受态大肠杆菌TG10细胞并用质粒pDHE681、pAgro4和pHSG575(＝表3中样品1)转化。37℃过夜培养之后，细胞与提到的对照菌株(TG1pDHE681pAgro4pHSG575＝表3中样品2)相比表现较高的L-泛解酸内酯水解活性，通常孵育6-7小时后达到其最大活性(约1500U/L)并在更长的孵育中显著降低。鼠李糖(0.5g/L)不为TG10pDHE681 pAgro4pHSG575所代谢。

表3

样品	剩余鼠李糖[g/L]	OD<sub>600</sub>	细胞浓度[times x]	孵育时间[小时]	酸[mM]	活性(1x)[U/L]	活性/OD<sub>600</sub>[U/L]
样品	剩余鼠李糖[g/L]	OD<sub>600</sub>	细胞浓度[times x]	孵育时间[小时]	酸[mM]	活性(1x)[U/L]	活性/OD<sub>600</sub>[U/L]	空白	-		0	1.0	1.74	-
1	0.52	6.35	0.2	1.0	29.9	2344.2	369.2	空白	-		0	1.0	1.74	-
1	0.52	6.35	0.2	1.0	29.9	2344.2	369.2	2	0	6.64	0.2	1.0	6.27	377.5	56.9

1，TG10pDHE681pAgro4pHSG575；含氨苄青霉素(Amp；100μg/ml)、四环素(Tet；10μg/ml)、L-鼠李糖(Rha 0.5g/l)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG0.15mM)的LB

2，TG1pDHE681 pAgro4 pHSG575；含氨苄青霉素(Amp；100μg/ml)、L-鼠李糖(Rha 0.5g/l)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG 0.15mM)的LB

多次重复上述测试。培养基中加入四环素(15μg/ml)不是维持鼠李糖缺陷所必需。

实施例5：确定诱导对鼠李糖浓度的依赖性

菌株大肠杆菌TG10(pDHE1650，pAgro4，pHSG575)类似于实施例1在存在多种鼠李糖浓度(0到2g/l鼠李糖)的含氨苄青霉素(100mg/l)、氯霉素10mg/l、壮观霉素(50mg/l)、IPTG 0.15mM的LB上生长并分析(一式两份)其腈水解酶的比活性。0.01g/l的低浓度L-鼠李糖平均地造成表达的显著诱导，而在不存在鼠李糖情况下未检测到显著的表达(通过酶活性)。

也参见图1：

A：相对活性(相对活性％)作为L-鼠李糖浓度(浓度：g/l)的函数的图表

B：相对比活性(相对特异活性％)作为L-鼠李糖浓度(浓度：g/l)的函数的图表

表4

鼠李糖浓度 OD600相对活性相对比活性[g/l]

0.00 5.4 0.1％ 0.1％

0.01 6.2 66％ 65％

0.02 5.8 70％ 73％

0.04 5.7 85％ 92％

0.05 5.2 83％ 98％

0.07 5.9 90％ 93％

0.10 6.0 97％ 98％

0.15 5.6 101％ 111％

0.20 5.6 100％ 108％

0.30 5.3 99％ 115％

0.40 5.7 107％ 114％

0.50 6.2 102％ 100％

1.00 5.8 101％ 108％

2.00 6.1 100％ 100％

0+Tet 4.7 0％ 0％

0.5+Tet 5.1 81％ 98％

2.0+Tet 4.5 86％ 117％

实施例6：L-鼠李糖异构酶缺陷菌株大肠杆菌TG10中转座子整合位点分析

为更详细地描述转座子Tn10的整合位点的特征，通过PCR(Pfu聚合酶)研究鼠李糖基因rhaT、rhaB、rhaA和rhaD与TG1(pDHE681)和TG10(pDHE681)比较。当rhaA(L-鼠李糖异构酶)或rhaA-rhaD区域分别用引物MKe 259/260和MKe 258/259扩增时，经诱变菌株TG10未给出特异扩增产物，与野生型菌株TG1相反。

MKe2585’-CCCAAGCTTGGATCATGTTTGCTCCTTACAG (rhaD 3’端+HindIII)

MKe2595’-GCGAATTCGCATGACCACTCAACTGGAACA(rhaA 5’端+EcoRI)

MKe2605’-CCCAAGCTTACCCGCGGCGACTCAAAATTT(rhaA 3’端+HindIII)

实施例7：通过定点敲除产生L-鼠李糖异构酶缺陷的大肠杆菌菌株

为失活L-鼠李糖异构酶(rhaA)，首先用引物MKe001和MKe002扩增rhaA基因并克隆到pBluescriptSK⁺(XbaI/HindIII消化并连接)中。其后，通过用BamHI限制酶消化并用Klenow片段补平、然后连接，从而导入读框移位，相应的rha^＊片段再克隆到基因替代载体pKO3中(Link等，(1997)JBacteriol 179：6228-6237)。通过用rha^＊构建体同源重组对TG1pDHE1650中RhaA基因的敲除如Link等(Link等，(1997)J Bacteriol179：6228-6237)所述通过43℃下在氯霉素平板上选择，30℃下影印平板到蔗糖上并随后在补充1g/L鼠李糖的McConkey琼脂上确认的方法进行。

MKe001：5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGACCACTCAACTGGAACA-3’

MKe002：5’-CTAGCTCTAGATTACCCGCGGCGACTCAA-3’

实施例8：用鼠李糖缺陷宿主菌株TG10产生重组腈水解酶

TG10衍生物如TG10pDHE1650pAgro4pHSG575的补料分批发酵在用丙三醇作为碳源和鼠李糖作为诱导物的改良Riesenberg培养基上进行，以过量表达目的蛋白质，在这种情况下目的蛋白质为腈水解酶。使用此菌株获得了相对高的和比较高的细胞密度和酶活性。

8.1大肠杆菌TG1的发酵

大肠杆菌(TG1 pDHE1650 pAgro4 pHSG575)的发酵在20L生物反应器中进行。工作体积10L的反应器接种200ml摇瓶预培养物。预培养物培养基与主要培养物培养基对应。

培养基：

40g 丙三醇99.5％

15g 胰蛋白胨

13.3g 磷酸二氢钾

5g 酵母提取物

4g 磷酸氢二氨

1.7g 柠檬酸

1.1g 七水硫酸镁

1mL 微量元素溶液SL Korz 1000C

0.1mL Tego KS 911消泡剂

0.062g 七水硫酸铁(II)

10mg 盐酸硫胺素

到1L 完全脱矿质水

培养基121℃灭菌30分钟。其后在无菌条件下加入0.1g氨苄青霉素。

微量元素溶液

柠檬酸＊H₂O 20g

六水合氯化钴(II)(CoCl₂＊6H₂O) 2.5g

七水合氯化锰(II)(MnCl₂＊4H₂O) 3.0g

二水氯化铜(II)(CuCl₂＊2H₂O) 0.3g

硼酸(H₃BO₃) 0.6g

二水钼酸钠(Na₂MoO₄＊2H₂O) 0.5g

二水醋酸锌(Zn(CH₃COO)₂＊2H₂O) 2.6g

完全脱矿质H₂O到1L

丙三醇送料溶液

2L 完全脱矿质水

211g 硫酸钠

13.6g 七水硫酸铁(II)

8.8kg 丙三醇99.5％

220mL 微量元素溶液

鼠李糖送料溶液

703g 完全脱矿质水

297g 鼠李糖一水化物

发酵在37℃温度下进行。通风调整到8-30L/分钟搅拌速度调整到400至15001/分钟以避免pO₂降到低于20％。发酵1小时后，培养物用IPTG(0.15mM)诱导。其后加入76ml鼠李糖送料溶液。当发酵罐中的鼠李糖浓度降到1.0g/L以下时，将送料溶液用计量仪表计量加入。当最初加入的丙三醇量消耗之后，连续送入丙三醇。

结果：

8.2大肠杆菌TG 10的发酵

大肠杆菌TG 10(pDHE1650 pAgro4 pHSG575)的发酵除了诱导用18.5g鼠李糖送料溶液进行外根据实施例1中同样的方法进行。随后不送入鼠李糖。

结果：

8.3活性分析：

50μl细胞悬液滴入880μl磷酸钠/钾缓冲液(10mM)中并加热混合物到30℃。通过加入20μl甲醇扁桃腈溶液(12％)开始反应。10分钟后，通过加入50μl 1M HCl停止酶反应。离心去掉细胞生物质并通过HPLC(ODSHypersil 100＊2.0mm，流动相：75％H₃PO₄(14.8mM)/25％甲醇；流速：0.5ml/分钟；注入体积：2μl；柱温：40℃；检测：210nm；扁桃酸保留时间：0.9分钟)测量上清中的扁桃酸浓度。

8.4鼠李糖浓度的确定

使用陶制滤器和连续操作的旋转泵从发酵罐中联机取样。HPLC以每一分析结束之后注入新样品的方式安排。之间将滤液从发酵罐抽入废水容器中。

层析条件：

柱： HPX 87H，7.8×300mm

洗脱液： 0.005M H₂SO₄

流速： 0.5mL/分钟

注入体积： 1μL

柱温： 55℃

检测： RI

序列表

<110>巴斯福股份公司

<120>L-鼠李糖-诱导型表达系统

<130>AE20020689

<140>

<141>

<160>19

<170>PatentIn版本2.1

<210>1

<211>2046

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<222>(288)..(1121)

<223>编码rhaS(rhaBAD操纵子的正调节物)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1108)..(2043)

<223>编码rhaR(rhaRS操纵子的正调节物)

<220>

<221>protein_bind

<222>(56)..(72)

<223>潜在的RhaS结合位点

<220>

<221>protein_bind

<222>(89)..(105)

<223>潜在的RhaS结合位点

<220>

<221>protein_bind

<222>(172)..(203)

<223>潜在的RhaR结合位点

<220>

<221>protein_bind

<222>(210)..(241)

<223>潜在的RhaR结合位点

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)

<223>转录的潜在起始(互补)

<400>1

aatgtgatcc tgctgaattt cattacgacc agtctaaaaa gcgcctgaat tcgcgacctt 60

ctcgttactg acaggaaaat gggccattgg caaccaggga aagatgaacg tgatgatgtt 120

cacaatttgc tgaattgtgg tgatgtgatg ctcaccgcat ttcctgaaaa ttcacgctgt 180

atcttgaaaa atcgacgttt tttacgtggt tttccgtcga aaatttaagg taagaacctg 240

acctcgtgat tactatttcg ccgtgttgac gacatcagga ggccagtatg accgtattac 300

atagtgtgga tttttttccg tctggtaacg cgtccgtggc gatagaaccc cggctcccgc 360

aggcggattt tcctgaacat catcatgatt ttcatgaaat tgtgattgtc gaacatggca 420

cgggtattca tgtgtttaat gggcagccct ataccatcac cggtggcacg gtctgtttcg 480

tacgcgatca tgatcggcat ctgtatgaac ataccgataa tctgtgtctg accaatgtgc 540

tgtatcgctc gccggatcga tttcagtttc tcgccgggct gaatcagttg ctgccacaag 600

agctggatgg gcagtatccg tctcactggc gcgttaacca cagcgtattg cagcaggtgc 660

gacagctggt tgcacagatg gaacagcagg aaggggaaaa tgatttaccc tcgaccgcca 720

gtcgcgagat cttgtttatg caattactgc tcttgctgcg taaaagcagt ttgcaggaga 780

acctggaaaa cagcgcatca cgtctcaact tgcttctggc ctggctggag gaccattttg 840

ccgatgaggt gaattgggat gccgtggcgg atcaattttc tctttcactg cgtacgctac 900

atcggcagct taagcagcaa acgggactga cgcctcagcg atacctgaac cgcctgcgac 960

tgatgaaagc ccgacatctg ctacgccaca gcgaggccag cgttactgac atcgcctatc 1020

gctgtggatt cagcgacagt aaccactttt cgacgctttt tcgccgagag tttaactggt 1080

caccgcgtga tattcgccag ggacgggatg gctttctgca ataacgcgaa tcttctcaac 1140

gtatttgtac gccatattgc gaataatcaa cttcgttctc tggccgaggt agccacggtg 1200

gcgcatcagt taaaacttct caaagatgat ttttttgcca gcgaccagca ggcagtcgct 1260

gtggctgacc gttatccgca agatgtcttt gctgaacata cacatgattt ttgtgagctg 1320

gtgattgtct ggcgcggtaa tggcctgcat gtactcaacg atcgccctta tcgcattacc 1380

cgtggcgatc tcttttacat tcatgctgac gataaacact cctacgcttc cgttaacgat 1440

ctggttttgc agaatattat ttattgcccg gagcgtctga agctgaatct tgactggcag 1500

ggggcgattc cgggatttaa cgccagcgca gggcaaccac actggcgctt aggtagcatg 1560

gggatggcgc aggcgcggca ggttatcggt cagcttgagc atgaaagtag tcagcatgtg 1620

ccgtttgcta acgaaatggc tgagttgctg ttcgggcagt tggtgatgtt gctgaatcgc 1680

catcgttaca ccagtgattc gttgccgcca acatccagcg aaacgttgct ggataagctg 1740

attacccggc tggcggctag cctgaaaagt ccctttgcgc tggataaatt ttgtgatgag 1800

gcatcgtgca gtgagcgcgt tttgcgtcag caatttcgcc agcagactgg aatgaccatc 1860

aatcaatatc tgcgacaggt cagagtgtgt catgcgcaat atcttctcca gcatagccgc 1920

ctgttaatca gtgatatttc gaccgaatgt ggctttgaag atagtaacta tttttcggtg 1980

gtgtttaccc gggaaaccgg gatgacgccc agccagtggc gtcatctcaa ttcgcagaaa 2040

gattaa 2046

<210>2

<211>287

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(287)

<223>含rhaS和rhaR结合位点的rhaBAD启动子片段

<400>2

actggcctcc tgatgtcgtc aacacggcga aatagtaatc acgaggtcag gttcttacct 60

taaattttcg acggaaaacc acgtaaaaaa cgtcgatttt tcaagataca gcgtgaattt 120

tcaggaaatg cggtgagcat cacatcacca caattcagca aattgtgaac atcatcacgt 180

tcatctttcc ctggttgcca atggcccatt ttcctgtcag taacgagaag gtcgcgaatt 240

caggcgcttt ttagactggt cgtaatgaaa ttcagcagga tcacatt 287

<210>3

<211>125

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(125)

<223>含RhaS结合位点的rhaBAD启动子片段

<400>3

ttgtgaacat catcacgttc atctttccct ggttgccaat ggcccatttt cctgtcagta 60

acgagaaggt cgcgaattca ggcgcttttt agactggtcg taatgaaatt cagcaggatc 120

acatt 125

<210>4

<211>123

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(123)

<223>含RhaS结合位点的rhaBAD启动子片段

<400>4

atcaccacaa ttcagcaaat tgtgaacatc atcacgttca tctttccctg gttgccaatg 60

gcccattttc ctgtcagtaa cgagaaggtc gcgaattcag gcgcttttta gactggtcgt 120

aat 123

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(51)

<223>rhaBAD启动子的回文RhaS结合位点

<400>5

atctttccct ggttgccaat ggcccatttt cctgtcagta acgagaaggt c 51

<210>6

<211>1071

<212>DNA

<213>粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1068)

<223>编码腈水解酶

<400>6

atg cag aca aga aaa atc gtc cgg gca gcc gcc gta cag gcc gcc tct 48

Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser

1 5 10 15

ccc aac tac gat ctg gca acg ggt gtt gat aaa acc att gag ctg gct 96

Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala

20 25 30

cg tcag gcc cgc gat gag ggc tgt gac ctg atc gtg ttt ggt gaa acc 144

Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr

35 40 45

tgg ctg ccc gga tat ccc ttc cac gtc tgg ctg ggc gca ccg gcc tgg 192

Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp

50 55 60

tcg ctg aaa tac agt gcc cgc tac tat gcc aac tcg ctc tcg ctg gac 240

Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp

65 70 75 80

agt gca gag ttt caa cgc att gcc cag gcc gca cgg acc ttg ggt att 288

Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile

85 90 95

ttc atc gca ctg ggt tat agc gag cgc agc ggc ggc agc ctt tac ctg 336

Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu

100 105 110

ggc caa tgc ctg atc gac gac aag ggc gag atg ctg tgg tcg cgt cgc 384

Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg

115 120 125

aaa ctc aaa ccc acg cat gta gag cgc acc gta ttt ggt gaa ggt tat 432

Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr

130 135 140

gcc cgt gat ctg att gtg tcc gac aca gaa ctg gga cgc gtc ggt gct 480

Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala

145 150 155 160

cta tgc tgc tgg gag cat ttg tcg ccc ttg agc aag tac gcg ctg tac 528

Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr

165 170 175

tcc cag cat gaa gcc att cac att gct gcc tgg ccg tcg ttt tcg cta 576

Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu

180 185 190

tac agc gaa cag gcc cac gcc ctc agt gcc aag gtg aac atg gct gcc 624

Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala

195 200 205

tcg caa atc tat tcg gtt gaa ggc cag tgc ttt acc atc gcc gcc agc 672

Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser

210 215 220

agt gtg gtc acc caa gag acg cta gac atg ctg gaa gtg ggt gaa cac 720

Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His

225 230 235 240

aac gcc ccc ttg ctg aaa gtg ggc ggc ggc agt tcc atg att ttt gcg 768

Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala

245 250 255

ccg gac gga cgc aca ctg gct ccc tac ctg cct cac gat gcc gag ggc 816

Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly

260 265 270

ttg atc att gcc gat ctg aat atg gag gag att gcc ttc gcc aaa gcg 864

Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala

275 280 285

atc aat gac ccc gta ggc cac tat tcc aaa ccc gag gcc acc cgt ctg 912

Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu

290 295 300

gtg ctg gac ttg ggg cac cga gac ccc atg act cgg gtg cac tcc aaa 960

Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys

305 310 315 320

agc gtg acc agg gaa gag gct ccc gag caa ggt gtg caa agc aag att 1008

Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile

325 330 335

gcc tca gtc gct atc agc cat cca cag gac tcg gac aca ctg cta gtg 1056

Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val

340 345 350

caa gag ccg tct tga 1071

Gln Glu Pro Ser

355

<210>7

<211>356

<212>PRT

<213>粪产碱菌

<400>7

Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser

1 5 10 15

Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala

20 25 30

Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr

35 40 45

Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp

50 55 60

Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp

65 70 75 80

Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile

85 90 95

Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu

100 105 110

Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr

130 135 140

Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala

145 150 155 160

Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr

165 170 175

Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu

180 185 190

Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Ash Met Ala Ala

195 200 205

Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser

210 215 220

Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His

225 230 235 240

Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala

245 250 255

Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly

260 265 270

Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala

275 280 285

Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu

290 295 300

Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys

305 310 315 320

Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile

325 330 335

Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val

340 345 350

Gln Glu Pro Ser

355

<210>8

<211>1260

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1257)

<223>编码rhaA(L-鼠李糖异构酶)

<400>8

atg acc act caa ctg gaa cag gcc tgg gag cta gcg aaa cag cgt ttc 48

Met Thr Thr Gln Leu Glu Gln Ala Trp Glu Leu Ala Lys Gln Arg Phe

1 5 10 15

gcg gcg gtg ggg att gat gtc gag gag gcg ctg cgc caa ctt gat cgt 96

Ala Ala Val Gly Ile Asp Val Glu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Asp Arg

20 25 30

tta ccc gtt tca atg cac tgc tgg cag ggc gat gat gtt tcc ggt ttt 144

Leu Pro Val Ser Met His Cys Trp Gln Gly Asp Asp Val Ser Gly Phe

35 40 45

gaa aac ccg gaa ggt tcg ctg acc ggg ggg att cag gcc aca ggc aat 192

Glu Asn Pro Glu Gly Ser Leu Thr Gly Gly Ile Gln Ala Thr Gly Asn

50 55 60

tat ccg ggc aaa gcg cgt aat gcc agt gag cta cgt gcc gat ctg gaa 240

Tyr Pro Gly Lys Ala Arg Asn Ala Ser Glu Leu Arg Ala Asp Leu Glu

65 70 75 80

cag gct atg cgg ctg att ccg ggg ccg aaa cgg ctt aat tta cat gcc 288

Gln Ala Met Arg Leu Ile Pro Gly Pro Lys Arg Leu Asn Leu His Ala

85 90 95

atc tat ctg gaa tca gat acg cca gtc tcg cgc gac cag atc aaa cca 336

Ile Tyr Leu Glu Ser Asp Thr Pro Val Ser Arg Asp Gln Ile Lys Pro

100 105 110

gag cac ttc aaa aac tgg gtt gaa tgg gcg aaa gcc aat cag ctc ggt 384

Glu His Phe Lys Asn Trp Val Glu Trp Ala Lys Ala Asn Gln Leu Gly

115 120 125

ctg gat ttt aac ccc tcc tgc ttt tcg cat ccg cta agc gcc gat ggc 432

Leu Asp Phe Asn Pro Ser Cys Phe Ser His Pro Leu Ser Ala Asp Gly

130 135 140

ttt acg ctt tcc cat gcc gac gac agc att cgc cag ttc tgg att gat 480

Phe Thr Leu Ser His Ala Asp Asp Ser Ile Arg Gln Phe Trp Ile Asp

145 150 155 160

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His Cys Lys Ala Ser Arg Arg Val Ser Ala Tyr Phe Gly Glu Gln Leu

165 170 175

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180 185 190

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Ile Thr Val Asp Arg Leu Ala Pro Arg Gln Arg Leu Leu Ala Ala Leu

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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Gln Ala Val Trp Glu Met Tyr Cys Gln Arg His Asp Thr Pro Ala Gly

385 390 395 400

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Ser Glu Trp Leu Glu Ser Val Arg Ala Tyr Glu Lys Glu Ile Leu Ser

405 410 415

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Arg Arg Gly

<210>9

<211>419

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>9

Met Thr Thr Gln Leu Glu Gln Ala Trp Glu Leu Ala Lys Gln Arg Phe

1 5 10 15

Ala Ala Val Gly Ile Asp Val Glu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Asp Arg

20 25 30

Leu Pro Val Ser Met His Cys Trp Gln Gly Asp Asp Val Ser Gly Phe

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Glu Asn Pro Glu Gly Ser Leu Thr Gly Gly Ile Gln Ala Thr Gly Asn

50 55 60

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65 70 75 80

Gln Ala Met Arg Leu Ile Pro Gly Pro Lys Arg Leu Asn Leu His Ala

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Val Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ala Glu Ser Tyr Thr Val Gly

225 230 235 240

Ser Asn Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Ala Thr Ser Arg Gln Thr Ala Leu

245 250 255

Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr Glu Val Ile Ser Asp Lys

260 265 270

Ile Ser Ala Ala Met Leu Tyr Val Pro Gln Leu Leu Leu His Val Ser

275 280 285

Arg Pro Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val Val Leu Leu Asp Asp Glu

290 295 300

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305 310 315 320

Val His Ile Gly Leu Asp Phe Phe Asp Ala Ser Ile Asn Arg Ile Ala

325 330 335

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340 345 350

Leu Leu Glu Pro Thr Ala Asp Val Arg Lys Leu Glu Ala Ala Gly Asp

355 360 365

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370 375 380

Gln Ala Val Trp Glu Met Tyr Cys Gln Arg His Asp Thr Pro Ala Gly

385 390 395 400

Ser Glu Trp Leu Glu Ser Val Arg Ala Tyr Glu Lys Glu Ile Leu Ser

405 410 415

Arg Arg Gly

<210>10

<211>1470

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

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Arg Val Met Leu Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Cys Arg Ser Leu Thr Leu

20 25 30

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Arg Glu Ile His Arg Phe Asn Asn Gly Leu His Ser Gln Asn Gly Tyr

35 40 45

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Val Thr Trp Asp Val Asp Ser Leu Glu Ser Ala Ile Arg Leu Gly Leu

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

cag gca caa caa caa ctc ggc aaa cgc gat att tat caa cgt agc ggc 384

Gln Ala Gln Gln Gln Leu Gly Lys Arg Asp Ile Tyr Gln Arg Ser Gly

115 120 125

atc cag ttt ctg ccc ttc aat acg ctt tat cag ttg cgt gcg ctg acg 432

Ile Gln Phe Leu Pro Phe Asn Thr Leu Tyr Gln Leu Arg Ala Leu Thr

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

acc aac gcc acg acc acg caa ctg gtc aat atc aat agc gac gac tgg 576

Thr Asn Ala Thr Thr Thr Gln Leu Val Asn Ile Asn Ser Asp Asp Trp

180 185 190

gac gag tcg cta ctg gcg tgg agc ggg gcc aac aaa gcc tgg ttt ggt 624

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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Asn Asp Thr Ala Leu Ala Ala Asn Ile Thr Asn Glu Gly Gly Ala Glu

275 280 285

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290 295 300

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Arg Val Leu Gln Glu Gln Gln Ile Asn Asp Leu Pro Ala Leu Ile Ser

305 310 315 320

gcg aca cag gca ctt ccg gct tgc cgc ttc att atc aat ccc aat gac 1008

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325 330 335

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340 345 350

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Cys Arg Glu Thr Ala Gln Pro Ile Pro Glu Ser Asp Ala Glu Leu Ala

355 360 365

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370 375 380

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Glu Leu Ala Gln Leu Arg Gly Glu Asp Phe Ser Gln Leu His Ile Val

385 390 395 400

ggc gga ggc tgc cag aac acg ctg ctc aac cag cta tgc gcc gat gcc 1248

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405 410 415

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420 425 430

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Asn Ile Gly Ile Gln Leu Met Thr Leu Asp Glu Leu Asn Asn Val Asp

435 440 445

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Asp Phe Arg Gln Val Val Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Thr Phe Thr

450 455 460

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Pro Asn Pro Asp Ser Glu Ile Ala His Tyr Val Ala Gln Ile His Ser

465 470 475 480

aca cga cag aca aag gag ctt tgc gca tga 1470

Thr Arg Gln Thr Lys Glu Leu Cys Ala

485

<210>11

<211>489

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>11

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Arg Val Met Leu Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Cys Arg Ser Leu Thr Leu

20 25 30

Arg Glu Ile His Arg Phe Asn Asn Gly Leu His Ser Gln Asn Gly Tyr

35 40 45

Val Thr Trp Asp Val Asp Ser Leu Glu Ser Ala Ile Arg Leu Gly Leu

50 55 60

Asn Lys Val Cys Glu Glu Gly Ile Arg Ile Asp Ser Ile Gly Ile Asp

65 70 75 80

Thr Trp Gly Val Asp Phe Val Leu Leu Asp Gln Gln Gly Gln Arg Val

85 90 95

Gly Leu Pro Val Ala Tyr Arg Asp Ser Arg Thr Asn Gly Leu Met Ala

100 105 110

Gln Ala Gln Gln Gln Leu Gly Lys Arg Asp Ile Tyr Gln Arg Ser Gly

115 120 125

Ile Gln Phe Leu Pro Phe Asn Thr Leu Tyr Gln Leu Arg Ala Leu Thr

130 135 140

Glu Gln Gln Pro Glu Leu Ile Pro His Ile Ala His Ala Leu Leu Met

145 150 155 160

Pro Asp Tyr Phe Ser Tyr Arg Leu Thr Gly Lys Met Asn Trp Glu Tyr

165 170 175

Thr Asn Ala Thr Thr Thr Gln Leu Val Asn Ile Asn Ser Asp Asp Trp

180 185 190

Asp Glu Ser Leu Leu Ala Trp Ser Gly Ala Asn Lys Ala Trp Phe Gly

195 200 205

Arg Pro Thr His Pro Gly Asn Val Ile Gly His Trp Ile Cys Pro Gln

210 215 220

Gly Asn Glu Ile Pro Val Val Ala Val Ala Ser His Asp Thr Ala Ser

225 230 235 240

Ala Val Ile Ala Ser Pro Leu Asn Gly Ser Arg Ala Ala Tyr Leu Ser

245 250 255

Ser Gly Thr Trp Ser Leu Met Gly Phe Glu Ser Gln Thr Pro Phe Thr

260 265 270

Asn Asp Thr Ala Leu Ala Ala Asn Ile Thr Asn Glu Gly Gly Ala Glu

275 280 285

Gly Arg Tyr Arg Val Leu Lys Asn Ile Met Gly Leu Trp Leu Leu Gln

290 295 300

Arg Val Leu Gln Glu Gln Gln Ile Asn Asp Leu Pro Ala Leu Ile Ser

305 310 315 320

Ala Thr Gln Ala Leu Pro Ala Cys Arg Phe Ile Ile Asn Pro Asn Asp

325 330 335

Asp Arg Phe Ile Asn Pro Glu Thr Met Cys Ser Glu Ile Gln Ala Ala

340 345 350

Cys Arg Glu Thr Ala Gln Pro Ile Pro Glu Ser Asp Ala Glu Leu Ala

355 360 365

Arg Cys Ile Phe Asp Ser Leu Ala Leu Leu Tyr Ala Asp Val Leu His

370 375 380

Glu Leu Ala Gln Leu Arg Gly Glu Asp Phe Ser Gln Leu His Ile Val

385 390 395 400

Gly Gly Gly Cys Gln Asn Thr Leu Leu Asn Gln Leu Cys Ala Asp Ala

405 410 415

Cys Gly Ile Arg Val Ile Ala Gly Pro Val Glu Ala Ser Thr Leu Gly

420 425 430

Asn Ile Gly Ile Gln Leu Met Thr Leu Asp Glu Leu Asn Asn Val Asp

435 440 445

Asp Phe Arg Gln Val Val Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Thr Phe Thr

450 455 460

Pro Asn Pro Asp Ser Glu Ile Ala His Tyr Val Ala Gln Ile His Ser

465 470 475 480

Thr Arg Gln Thr Lys Glu Leu Cys Ala

485

<210>12

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<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

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<222>(1)..(822)

<223>编码rhaD(磷酸鼠李酮糖醛缩酶)

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Asn Val Gln Leu Asp Pro Ala Ala Asn Leu Gly Ile Val Lys Val Asp

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

acc aac ctg atc gcc ctc acc tat gta ctt gaa aac gac acc gcg gtc 480

Thr Asn Leu Ile Ala Leu Thr Tyr Val Leu Glu Asn Asp Thr Ala Val

145 150 155 160

ttc act cgc caa ctg tgg gaa ggc agc acc gag tgt ctg gtg gta ttc 528

Phe Thr Arg Gln Leu Trp Glu Gly Ser Thr Glu Cys Leu Val Val Phe

165 170 175

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180 185 190

atc ggc cag gcg acc gca caa gag atg caa aaa cat tcg ctg gtg ttg 624

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195 200 205

tgg ccc ttc cac ggc gtc ttc ggc agc gga ccg acg ctg gat gaa acc 672

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210 215 220

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Phe Gly Leu Ile Asp Thr Ala Glu Lys Ser Ala Gln Val Leu Val Lys

225 230 235 240

gtt tat tcg atg ggc ggc atg aaa cag acc atc agc cgt gaa gag ttg 768

Val Tyr Ser Met Gly Gly Met Lys Gln Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu

245 250 255

ata gcg ctc ggc aag cgt ttc ggc gtt acg cca ctc gcc agt gcg ctg 816

Ile Ala Leu Gly Lys Arg Phe Gly Val Thr Pro Leu Ala Ser Ala Leu

260 265 270

gcg ctg taa 825

Ala Leu

<210>13

<211>274

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>13

Met Gln Asn Ile Thr Gln Ser Trp Phe Val Gln Gly Met Ile Lys Ala

1 5 10 15

Thr Thr Asp Ala Trp Leu Lys Gly Trp Asp Glu Arg Asn Gly Gly Asn

20 25 30

Leu Thr Leu Arg Leu Asp Asp Ala Asp Ile Ala Pro Tyr His Asp Asn

35 40 45

Phe His Gln Gln Pro Arg Tyr Ile Pro Leu Ser Gln Pro Met Pro Leu

50 55 60

Leu Ala Asn Thr Pro Phe Ile Val Thr Gly Ser Gly Lys Phe Phe Arg

65 70 75 80

Asn Val Gln Leu Asp Pro Ala Ala Asn Leu Gly Ile Val Lys Val Asp

85 90 95

Ser Asp Gly Ala Gly Tyr His Ile Leu Trp Gly Leu Thr Asn Glu Ala

100 105 110

Val Pro Thr Ser Glu Leu Pro Ala His Phe Leu Ser His Cys Glu Arg

115 120 125

Ile Lys Ala Thr Asn Gly Lys Asp Arg Val Ile Met His Cys His Ala

130 135 140

Thr Asn Leu Ile Ala Leu Thr Tyr Val Leu Glu Asn Asp Thr Ala Val

145 150 155 160

Phe Thr Arg Gln Leu Trp Glu Gly Ser Thr Glu Cys Leu Val Val Phe

165 170 175

Pro Asp Gly Val Gly Ile Leu Pro Trp Met Val Pro Gly Thr Asp Glu

180 185 190

Ile Gly Gln Ala Thr Ala Gln Glu Met Gln Lys His Ser Leu Val Leu

195 200 205

Trp Pro Phe His Gly Val Phe Gly Ser Gly Pro Thr Leu Asp Glu Thr

210 215 220

Phe Gly Leu Ile Asp Thr Ala Glu Lys Ser Ala Gln Val Leu Val Lys

225 230 235 240

Val Tyr Ser Met Gly Gly Met Lys Gln Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu

245 250 255

Ile Ala Leu Gly Lys Arg Phe Gly Val Thr Pro Leu Ala Ser Ala Leu

260 265 270

Ala Leu

<210>14

<211>939

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(936)

<223>编码rhaR(rhaRS操纵子的正调节物)

<400>14

atg gct ttc tgc aat aac gcg aat ctt ctc aac gta ttt gta cgc cat 48

Met Ala Phe Cys Asn Asn Ala Asn Leu Leu Asn Val Phe Val Arg His

1 5 10 15

att gcg aat aat caa ctt cgt tct ctg gcc gag gta gcc acg gtg gcg 96

Ile Ala Asn Asn Gln Leu Arg Ser Leu Ala Glu Val Ala Thr Val Ala

20 25 30

cat cag tta aaa ctt ctc aaa gat gat ttt ttt gcc agc gac cag cag 144

His Gln Leu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Phe Phe Ala Ser Asp Gln Gln

35 40 45

gca gtc gct gtg gct gac cgt tat ccg caa gat gtc ttt gct gaa cat 192

Ala Val Ala Val Ala Asp Arg Tyr Pro Gln Asp Val Phe Ala Glu His

50 55 60

aca cat gat ttt tgt gag ctg gtg att gtc tgg cgc ggt aat ggc ctg 240

Thr His Asp Phe Cys Glu Leu Val Ile Val Trp Arg Gly Asn Gly Leu

65 70 75 80

cat gta ctc aac gat cgc cct tat cgc att acc cgt ggc gat ctc ttt 288

His Val Leu Asn Asp Arg Pro Tyr Arg Ile Thr Arg Gly Asp Leu Phe

85 90 95

tac att cat gct gac gat aaa cac tcc tac gct tcc gtt aac gat ctg 336

Tyr Ile His Ala Asp Asp Lys His Ser Tyr Ala Ser Val Asn Asp Leu

100 105 110

gtt ttg cag aat att att tat tgc ccg gag cgt ctg aag ctg aat ctt 384

Val Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Cys Pro Glu Arg Leu Lys Leu Asn Leu

115 120 125

gac tgg cag ggg gcg att ccg gga ttt aac gcc agc gca ggg caa cca 432

Asp Trp Gln Gly Ala Ile Pro Gly Phe Asn Ala Ser Ala Gly Gln Pro

130 135 140

cac tgg cgc tta ggt agc atg ggg atg gcg cag gcg cgg cag gtt atc 480

His Trp Arg Leu Gly Ser Met Gly Met Ala Gln Ala Arg Gln Val Ile

145 150 155 160

ggt cag ctt gag cat gaa agt agt cag cat gtg ccg ttt gct aac gaa 528

Gly Gln Leu Glu His Glu Ser Ser Gln His Val Pro Phe Ala Asn Glu

165 170 175

atg gct gag ttg ctg ttc ggg cag ttg gtg atg ttg ctg aat cgc cat 576

Met Ala Glu Leu Leu Phe Gly Gln Leu Val Met Leu Leu Asn Arg His

180 185 190

cgt tac acc agt gat tcg ttg ccg cca aca tcc agc gaa acg ttg ctg 624

Arg Tyr Thr Ser Asp Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ser Glu Thr Leu Leu

195 200 205

gat aag ctg att acc cgg ctg gcg gct agc ctg aaa agt ccc ttt gcg 672

Asp Lys Leu Ile Thr Arg Leu Ala Ala Ser Leu Lys Ser Pro Phe Ala

210 215 220

ctg gat aaa ttt tgt gat gag gca tcg tgc agt gag cgc gtt ttg cgt 720

Leu Asp Lys Phe Cys Asp Glu Ala Ser Cys Ser Glu Arg Val Leu Arg

225 230 235 240

cag caa ttt cgc cag cag act gga atg acc atc aat caa tat ctg cga 768

Gln Gln Phe Arg Gln Gln Thr Gly Met Thr Ile Asn Gln Tyr Leu Arg

245 250 255

cag gtc aga gtg tgt cat gcg caa tat ctt ctc cag cat agc cgc ctg 816

Gln Val Arg Val Cys His Ala Gln Tyr Leu Leu Gln His Ser Arg Leu

260 265 270

tta atc agt gat att tcg acc gaa tgt ggc ttt gaa gat agt aac tat 864

Leu Ile Ser Asp Ile Ser Thr Glu Cys Gly Phe Glu Asp Ser Asn Tyr

275 280 285

ttt tcg gtg gtg ttt acc cgg gaa acc ggg atg acg ccc agc cag tgg 912

Phe Ser Val Val Phe Thr Arg Glu Thr Gly Met Thr Pro Ser Gln Trp

290 295 300

cgt cat ctc aat tcg cag aaa gat taa 939

Arg His Leu Asn Ser Gln Lys Asp

305 310

<210>15

<211>312

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>15

Met Ala Phe Cys Asn Asn Ala Asn Leu Leu Asn Val Phe Val Arg His

1 5 10 15

Ile Ala Asn Asn Gln Leu Arg Ser Leu Ala Glu Va1 Ala Thr Val Ala

20 25 30

His Gln Leu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Phe Phe Ala Ser Asp Gln Gln

35 40 45

Ala Val Ala Val Ala Asp Arg Tyr Pro Gln Asp Val Phe Ala Glu His

50 55 60

Thr His Asp Phe Cys Glu Leu Val Ile Val Trp Arg Gly Asn Gly Leu

65 70 75 80

His Val Leu Asn Asp Arg Pro Tyr Arg Ile Thr Arg Gly Asp Leu Phe

85 90 95

Tyr Ile His Ala Asp Asp Lys His Ser Tyr Ala Ser Val Asn Asp Leu

100 105 110

Val Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Cys Pro Glu Arg Leu Lys Leu Asn Leu

115 120 125

Asp Trp Gln Gly Ala Ile Pro Gly Phe Asn Ala Ser Ala Gly Gln Pro

130 135 140

His Trp Arg Leu Gly Ser Met Gly Met Ala Gln Ala Arg Gln Val Ile

145 150 155 160

Gly Gln Leu Glu His Glu Ser Ser Gln His Val Pro Phe Ala Asn Glu

165 170 175

Met Ala Glu Leu Leu Phe Gly Gln Leu Val Met Leu Leu Asn Arg His

180 185 190

Arg Tyr Thr Ser Asp Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ser Glu Thr Leu Leu

195 200 205

Asp Lys Leu Ile Thr Arg Leu Ala Ala Ser Leu Lys Ser Pro Phe Ala

210 215 220

Leu Asp Lys Phe Cys Asp Glu Ala Ser Cys Ser Glu Arg Val Leu Arg

225 230 235 240

Gln Gln Phe Arg Gln Gln Thr Gly Met Thr Ile Asn Gln Tyr Leu Arg

245 250 255

Gln Val Arg Val Cys His Ala Gln Tyr Leu Leu Gln His Ser Arg Leu

260 265 270

Leu Ile Ser Asp Ile Ser Thr Glu Cys Gly Phe Glu Asp Ser Asn Tyr

275 280 285

Phe Ser Val Val Phe Thr Arg Glu Thr Gly Met Thr Pro Ser Gln Trp

290 295 300

Arg His Leu Asn Ser Gln Lys Asp

305 310

<210>16

<211>837

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(834)

<223>编码rhaS(rhaBAD操纵子的正调节物)

<400>16

atg acc gta tta cat agt gtg gat ttt ttt ccg tct ggt aac gcg tcc 48

Met Thr Val Leu His Ser Val Asp Phe Phe Pro Ser Gly Asn Ala Ser

1 5 10 15

gtg gcg ata gaa ccc cgg ctc ccg cag gcg gat ttt cct gaa cat cat 96

Val Ala Ile Glu Pro Arg Leu Pro Gln Ala Asp Phe Pro Glu His His

20 25 30

cat gat ttt cat gaa att gtg att gtc gaa cat ggc acg ggt att cat 144

His Asp Phe His Glu Ile Val Ile Val Glu His Gly Thr Gly Ile His

35 40 45

gtg ttt aat ggg cag ccc tat acc atc acc ggt ggc acg gtc tgt ttc 192

Val Phe Asn Gly Gln Pro Tyr Thr Ile Thr Gly Gly Thr Val Cys Phe

50 55 60

gta cgc gat cat gat cgg cat ctg tat gaa cat acc gat aat ctg tgt 240

Val Arg Asp His Asp Arg His Leu Tyr Glu His Thr Asp Asn Leu Cys

65 70 75 80

ctg acc aat gtg ctg tat cgc tcg ccg gat cga ttt cag ttt ctc gcc 288

Leu Thr Asn Val Leu Tyr Arg Ser Pro Asp Arg Phe Gln Phe Leu Ala

85 90 95

ggg ctg aat cag ttg ctg cca caa gag ctg gat ggg cag tat ccg tct 336

Gly Leu Asn Gln Leu Leu Pro Gln Glu Leu Asp Gly Gln Tyr Pro Ser

100 105 110

cac tgg cgc gtt aac cac agc gta ttg cag cag gtg cga cag ctg gtt 384

His Trp Arg Val Asn His Ser Val Leu Gln Gln Val Arg Gln Leu Val

115 120 125

gca cag atg gaa cag cag gaa ggg gaa aat gat tta ccc tcg acc gcc 432

Ala Gln Met Glu Gln Gln Glu Gly Glu Asn Asp Leu Pro Ser Thr Ala

130 135 140

agt cgc gag atc ttg ttt atg caa tta ctg ctc ttg ctg cgt aaa agc 480

Ser Arg Glu Ile Leu Phe Met Gln Leu Leu Leu Leu Leu Arg Lys Ser

145 150 155 160

agt ttg cag gag aac ctg gaa aac agc gca tca cgt ctc aac ttg ctt 528

Ser Leu Gln Glu Asn Leu Glu Asn Ser Ala Ser Arg Leu Asn Leu Leu

165 170 175

ctg gcc tgg ctg gag gac cat ttt gcc gat gag gtg aat tgg gat gcc 576

Leu Ala Trp Leu Glu Asp His Phe Ala Asp Glu Val Asn Trp Asp Ala

180 185 190

gtg gcg gat caa ttt tct ctt tca ctg cgt acg cta cat cgg cag ctt 624

Val Ala Asp Gln Phe Ser Leu Ser Leu Arg Thr Leu His Arg Gln Leu

195 200 205

aag cag caa acg gga ctg acg cct cag cga tac ctg aac cgc ctg cga 672

Lys Gln Gln Thr Gly Leu Thr Pro Gln Arg Tyr Leu Asn Arg Leu Arg

210 215 220

ctg atg aaa gcc cga cat ctg cta cgc cac agc gag gcc agc gtt act 720

Leu Met Lys Ala Arg His Leu Leu Arg His Ser Glu Ala Ser Val Thr

225 230 235 240

gac atc gcc tat cgc tgt gga ttc agc gac agt aac cac ttt tcg acg 768

Asp Ile Ala Tyr Arg Cys Gly Phe Ser Asp Ser Asn His Phe Ser Thr

245 250 255

ctt ttt cgc cga gag ttt aac tgg tca ccg cgt gat att cgc cag gga 816

Leu Phe Arg Arg Glu Phe Asn Trp Ser Pro Arg Asp Ile Arg Gln Gly

260 265 270

cgg gat ggc ttt ctg caa taa 837

Arg Asp Gly Phe Leu Gln

275

<210>17

<211>278

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>17

Met Thr Val Leu His Ser Val Asp Phe Phe Pro Ser Gly Asn Ala Ser

1 5 10 15

Val Ala Ile Glu Pro Arg Leu Pro Gln Ala Asp Phe Pro Glu His His

20 25 30

His Asp Phe His Glu Ile Val Ile Val Glu His Gly Thr Gly Ile His

35 40 45

Val Phe Asn Gly Gln Pro Tyr Thr Ile Thr Gly Gly Thr Val Cys Phe

50 55 60

Val Arg Asp His Asp Arg His Leu Tyr Glu His Thr Asp Asn Leu Cys

65 70 75 80

Leu Thr Asn Val Leu Tyr Arg Ser Pro Asp Arg Phe Gln Phe Leu Ala

85 90 95

Gly Leu Asn Gln Leu Leu Pro Gln Glu Leu Asp Gly Gln Tyr Pro Ser

100 105 110

His Trp Arg Val Asn His Ser Val Leu Gln Gln Val Arg Gln Leu Val

115 120 125

Ala Gln Met Glu Gln Gln Glu Gly Glu Asn Asp Leu Pro Ser Thr Ala

130 135 140

Ser Arg Glu Ile Leu Phe Met Gln Leu Leu Leu Leu Leu Arg Lys Ser

145 150 155 160

Ser Leu Gln Glu Asn Leu Glu Asn Ser Ala Ser Arg Leu Asn Leu Leu

165 170 175

Leu Ala Trp Leu Glu Asp His Phe Ala Asp Glu Val Asn Trp Asp Ala

180 185 190

Val Ala Asp Gln Phe Ser Leu Ser Leu Arg Thr Leu His Arg Gln Leu

195 200 205

Lys Gln Gln Thr Gly Leu Thr Pro Gln Arg Tyr Leu Ash Arg Leu Arg

210 215 220

Leu Met Lys Ala Arg His Leu Leu Arg His Ser Glu Ala Ser Val Thr

225 230 235 240

Asp Ile Ala Tyr Arg Cys Gly Phe Ser Asp Ser Asn His Phe Ser Thr

245 250 255

Leu Phe Arg Arg Glu Phe Asn Trp Ser Pro Arg Asp Ile Arg Gln Gly

260 265 270

Arg Asp Gly Phe Leu Gln

275

<210>18

<211>1035

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1032)

<223>编码rhaT(鼠李糖转运蛋白)

<400>18

atg agt aac gcg att acg atg ggg ata ttt tgg cat ttg atc ggc gcg 48

Met Ser Asn Ala Ile Thr Met Gly Ile Phe Trp His Leu Ile Gly Ala

1 5 10 15

gcc agt gca gcc tgt ttt tac gct ccg ttc aaa aaa gta aaa aaa tgg 96

Ala Ser Ala Ala Cys Phe Tyr Ala Pro Phe Lys Lys Val Lys Lys Trp

20 25 30

tca tgg gaa acc atg tgg tca gtc ggt ggg att gtt tcg tgg att att 144

Ser Trp Glu Thr Met Trp Ser Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Ile Ile

35 40 45

ctg ccg tgg gcc atc agc gcc ctg tta cta ccg aat ttc tgg gcg tat 192

Leu Pro Trp Ala Ile Ser Ala Leu Leu Leu Pro Asn Phe Trp Ala Tyr

50 55 60

tac agc tcg ttt agt ctc tct acg cga ctg cct gtt ttt ctg ttc ggc 240

Tyr Ser Ser Phe Ser Leu Ser Thr Arg Leu Pro Val Phe Leu Phe Gly

65 70 75 80

gct atg tgg ggg atc ggt aat atc aac tac ggc ctg acc atg cgt tat 288

Ala Met Trp Gly Ile Gly Asn Ile Asn Tyr Gly Leu Thr Met Arg Tyr

85 90 95

ctc ggc atg tcg atg gga att ggc atc gcc att ggc att acg ttg att 336

Leu Gly Met Ser Met Gly Ile Gly Ile Ala Ile Gly Ile Thr Leu Ile

100 105 110

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Val Gly Thr Leu Met Thr Pro Ile Ile Asn Gly Asn Phe Asp Val Leu

115 120 125

att agc acc gaa ggc gga cgc atg acg ttg ctc ggc gtt ctg gtg gcg 432

Ile Ser Thr Glu Gly Gly Arg Met Thr Leu Leu Gly Val Leu Val Ala

130 135 140

ctg att ggc gta ggg att gta act cgc gcc ggg cag ttg aaa gag cgc 480

Leu Ile Gly Val Gly Ile Val Thr Arg Ala Gly Gln Leu Lys Glu Arg

145 150 155 160

aag atg ggc att aaa gcc gaa gag ttc aat ctg aaa aaa ggg ctg gtg 528

Lys Met Gly Ile Lys Ala Glu Glu Phe Asn Leu Lys Lys Gly Leu Val

165 170 175

ctg gcg gtg atg tgc ggc att ttc tct gcc ggg atg tcc ttt gcg atg 576

Leu Ala Val Met Cys Gly Ile Phe Ser Ala Gly Met Ser Phe Ala Met

180 185 190

aac gcc gca aaa ccg atg cat gaa gcc gct gcc gca ctt ggc gtc gat 624

Asn Ala Ala Lys Pro Met His Glu Ala Ala Ala Ala Leu Gly Val Asp

195 200 205

cca ctg tat gtc gct ctg cca agc tat gtt gtc atc atg ggc ggc ggc 672

Pro Leu Tyr Val Ala Leu Pro Ser Tyr Val Val Ile Met Gly Gly Gly

210 215 220

gcg atc att aac ctc ggt ttc tgt ttt att cgt ctg gca aaa gtg aag 720

Ala Ile Tle Asn Leu Gly Phe Cys Phe Ile Arg Leu Ala Lys Val Lys

225 230 235 240

gat ttg tcg cta aaa gcc gac ttc tcg ctg gca aaa tcg ctg atc att 768

Asp Leu Ser Leu Lys Ala Asp Phe Ser Leu Ala Lys Ser Leu Ile Ile

245 250 255

cac aat gtg tta ctc tcg aca ctg ggc ggg ttg atg tgg tat ctg caa 816

His Asn Val Leu Leu Ser Thr Leu Gly Gly Leu Met Trp Tyr Leu Gln

260 265 270

ttc ttt ttc tat gcc tgg ggc cac gcc cgc att ccg gcg cag tat gac 864

Phe Phe Phe Tyr Ala Trp Gly His Ala Arg Ile Pro Ala Gln Tyr Asp

275 280 285

tac atc agt tgg atg ctg cat atg agt ttc tat gta ttg tgc ggc ggt 912

Tyr Ile Ser Trp Met Leu His Met Ser Phe Tyr Val Leu Cys Gly Gly

290 295 300

atc gtc ggg ctg gtg ctg aaa gag tgg aac aat gca gga cgc cgt ccg 960

Ile Val Gly Leu Val Leu Lys Glu Trp Asn Asn Ala Gly Arg Arg Pro

305 310 315 320

gta acg gtg ttg agc ctc ggt tgt gtg gtg att att gtc gcc gct aac 1008

Val Thr Val Leu Ser Leu Gly Cys Val Val Ile Ile Val Ala Ala Asn

325 330 335

atc gtc ggc atc ggc atg gcg aat taa 1035

Ile Val Gly Ile Gly Met Ala Asn

340

<210>19

<211>344

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>19

Met Ser Asn Ala Ile Thr Met Gly Ile Phe Trp His Leu Ile Gly Ala

1 5 10 15

Ala Ser Ala Ala Cys Phe Tyr Ala Pro Phe Lys Lys Val Lys Lys Trp

20 25 30

Ser Trp Glu Thr Met Trp Ser Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Ile Ile

35 40 45

Leu Pro Trp Ala Ile Ser Ala Leu Leu Leu Pro Asn Phe Trp Ala Tyr

50 55 60

Tyr Ser Ser Phe Ser Leu Ser Thr Arg Leu Pro Val Phe Leu Phe Gly

65 70 75 80

Ala Met Trp Gly Ile Gly Asn Ile Asn Tyr Gly Leu Thr Met Arg Tyr

85 90 95

Leu Gly Met Ser Met Gly Ile Gly Ile Ala Ile Gly Ile Thr Leu Ile

100 105 110

Val Gly Thr Leu Met Thr Pro Ile Ile Asn Gly Asn Phe Asp Val Leu

115 120 125

Ile Ser Thr Glu Gly Gly Arg Met Thr Leu Leu Gly Val Leu Val Ala

130 135 140

Leu Ile Gly Val Gly Ile Val Thr Arg Ala Gly Gln Leu Lys Glu Arg

145 150 155 160

Lys Met Gly Ile Lys Ala Glu Glu Phe Asn Leu Lys Lys Gly Leu Val

165 170 175

Leu Ala Val Met Cys Gly Ile Phe Ser Ala Gly Met Ser Phe Ala Met

180 185 190

Asn Ala Ala Lys Pro Met His Glu Ala Ala Ala Ala Leu Gly Val Asp

195 200 205

Pro Leu Tyr Val Ala Leu Pro Ser Tyr Val Val Ile Met Gly Gly Gly

210 215 220

Ala Ile Ile Asn Leu Gly Phe Cys Phe Ile Arg Leu Ala Lys Val Lys

225 230 235 240

Asp Leu Ser Leu Lys Ala Asp Phe Ser Leu Ala Lys Ser Leu Ile Ile

245 250 255

His Asn Val Leu Leu Ser Thr Leu Gly Gly Leu Met Trp Tyr Leu Gln

260 265 270

Phe Phe Phe Tyr Ala Trp Gly His Ala Arg Ile Pro Ala Gln Tyr Asp

275 280 285

Tyr Ile Ser Trp Met Leu His Met Ser Phe Tyr Val Leu Cys Gly Gly

290 295 300

Ile Val Gly Leu Val Leu Lys Glu Trp Asn Asn Ala Gly Arg Arg Pro

305 310 315 320

Val Thr Val Leu Ser Leu Gly Cys Val Val Ile Ile Val Ala Ala Asn

325 330 335

Ile Val Gly Ile Gly Met Ala Asn

340

Claims

1.在原核宿主细胞中表达核酸序列的方法，其中

a)将至少一个能在所述宿主细胞中游离型复制的、且包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下待表达的核酸序列的DNA构建体导入所述宿主细胞，其中所述启动子与所述核酸序列异源；

b)选择包含游离形式的所述DNA构建体的原核宿主细胞；以及

c)通过向所述经选择宿主细胞的培养物中加入L-鼠李糖诱导所述核酸序列的表达，

其中原核宿主细胞至少为L-鼠李糖异构酶缺陷。

2.根据权利要求1的方法，其中原核宿主细胞选自肠杆菌科的物种。

3.根据权利要求1或2的方法，其中原核宿主细胞为大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其中L-鼠李糖诱导型启动子为大肠杆菌rhaP_BAD启动子，或由通过一个或几个氨基酸的替换、添加或缺失而衍生自由SEQ ID NO：1、2、3或4中任一个编码，并具有大肠杆菌rhaP_BAD启动子功能的序列组成。

5.根据权利要求4所述的方法，其中L-鼠李糖诱导型启动子包含至少一个SEQ ID NO：5所示的RhaS结合元件，或通过一个或几个氨基酸的替换、添加或缺失而衍生自由该序列编码，并具有SEQ ID NO：5所示的RhaS结合元件功能的序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中L-鼠李糖异构酶由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成，或由通过一个或几个氨基酸的替换、添加或缺失而衍生自该序列的序列组成。

7.根据权利要求1所述的方法，其中能游离型复制的DNA构建体具有不多于100000个碱基或碱基对的大小。

8.根据权利要求1到8中任意一项所述的方法，其中能游离型复制的DNA构建体选自环状质粒载体、噬菌粒和粘粒。

9.根据权利要求1所述的方法，其中原核宿主细胞具有至少一个其他鼠李糖代谢中有功能的基因相关的缺陷，其中所述基因编码选自鼠李酮糖1-磷酸酶和磷酸鼠李酮糖醛缩酶的蛋白质。

10.根据权利要求1所述的方法，其中待表达核酸序列的表达引起所述核酸序列编码的蛋白质的产生。

11.根据权利要求1所述的方法，其中待表达的核酸序列编码选自以下的重组蛋白质：凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、糖酶、核酸酶、葡聚糖酶、氧化还原酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、胶原酶和脂肪酶。

12.根据权利要求1所述的方法，其中待表达的核酸序列编码选自以下的重组蛋白质：纤维素酶、半纤维素酶、乳糖酶、α-淀粉酶和支链淀粉酶。

13.根据权利要求1所述的方法，其中待表达的核酸序列编码选自以下的重组蛋白质：过氧化物酶、脱氢酶、加氧酶、漆酶和葡萄糖氧化酶。

14.根据权利要求1所述的方法，其中待表达的核酸序列编码选自以下的重组蛋白质：果胶酶、淀粉葡糖苷酶、葡糖淀粉酶和葡萄糖异构酶。

15.根据权利要求1所述的方法，其中待表达的核酸序列编码选自以下的重组蛋白质：酰胺酶、腈水合酶、酯酶、腈水解酶、醇腈酶、裂合酶、内酯酶和羧化酶。

16.根据权利要求1所述的方法，其中待表达的核酸序列编码选自以下的重组蛋白质：血清白蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、组织纤溶酶原因子、蛋白C、血管性血友病因子、抗凝血酶、促红细胞生成素、集落刺激因子、细胞因子、胰岛素、整合蛋白、地址素、选择蛋白、抗体、抗体片段、生长因子、细胞周期蛋白质、血纤蛋白原、凝血酶和结构蛋白质。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述结构蛋白质是胶原蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素。

19.根据权利要求1所述的方法，其中待表达的核酸序列编码重组蛋白质，所述重组蛋白质制备疫苗。

20.原核宿主细胞，其至少为L-鼠李糖异构酶缺陷并包含至少一个能在所述宿主细胞中复制并包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下待表达的核酸序列的DNA构建体，其中所述的启动子与所述核酸序列异源。

21.根据权利要求20的原核宿主细胞的用途，其用于生产食品、饲料、酶、化学品或药物。

22.根据权利要求20的原核宿主细胞的用途，其用于生产精细化学品。

23.制备重组蛋白质和精细化学品的方法，其通过使用根据权利要求13的原核宿主细胞或至少一个能在所述宿主细胞中游离型复制的、且包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下待表达的核酸序列的DNA构建体。

24.制备酶的方法，其通过使用根据权利要求20的原核宿主细胞或至少一个能在所述宿主细胞中游离型复制的、且包含在L-鼠李糖诱导型启动子转录控制下待表达的核酸序列的DNA构建体。