JP2006507831A - L−ラムノース誘導性発現系 - Google Patents
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Abstract
Description
a) アラビノースはわずか0.1 mMまたはそれ以上の濃度から細菌培養物に対して増殖阻止効果を有し、WO 01/73082に記載された方法を用いた場合でも、ある程度までしか改善されない(WO 01/73082の表4参照)。
a)前記宿主細胞においてエピソーム複製が可能であり、かつL-ラムノース誘導性プロモーターの転写制御下で発現される核酸配列を含有する(ただし、前記プロモーターは前記核酸配列に対して異種である)少なくとも1つのDNA構築物を前記宿主細胞に導入すること、
b)前記DNA構築物をエピソームの形態で含有する原核宿主細胞を選択すること、
c)選択された宿主細胞の培養物にL-ラムノースを添加することによって前記核酸配列の発現を誘導すること、
を含んでなり、その際、原核宿主細胞は少なくともL-ラムノースイソメラーゼが欠損している。
1. 対象の発現菌株は、(Haldimann Aら(1998) J Bacteriol 180(5):1277-1286によるような)相同組換えを用いたゲノムへの挿入を行うことなく、また、必要とされる適正に改変された生物の厄介な選択を行うことなく、宿主菌株から出発して、単純な形質転換によって作製され得るため、使用するのが容易である。
a)配列番号2、3、4または5に示される配列を含むプロモーターと基本的に同じプロモーター活性を有し、かつ
b)前記プロモーターの配列に対して少なくとも50%、好ましくは70%、できれば少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、極めて好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは99%の相同性を有する(ここで、相同性は少なくとも30塩基対、好ましくは少なくとも50塩基対、特に好ましくは少なくとも100塩基対の長さにわたっている)。
a)配列番号9に示されるL-ラムノースイソメラーゼと基本的に同じ酵素活性を持ち、かつ
b)配列番号9に示されるL-ラムノースイソメラーゼの配列に対して少なくとも50%、好ましくは70%、できれば少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、さらに特に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは99%の相同性を有する(ここで、相同性は、少なくとも30アミノ酸、好ましくは少なくとも50アミノ酸、特に好ましくは少なくとも100アミノ酸、さらに特に好ましくは少なくとも200アミノ酸の長さ、最も好ましくは該タンパク質の全長にわたっている)。
a)E. coliでは以下のベクターが好ましい:すなわちpQE70、pQE60およびpQE-9(QIAGEN, Inc.); pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia Biotech, Inc.); pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11もしくはpBdCI;
b)Streptomycesでは以下のベクターが好ましい:すなわちpIJ101、pIJ364、pIJ702もしくはpIJ361;
c)Bacillusでは以下のベクターが好ましい:すなわちpUB110、pC194もしくはpBD214;
d)Corynebacteriumでは以下のベクターが好ましい:すなわちpSA77もしくはpAJ667;
または上述のプラスミドの誘導体。上記のプラスミドは可能性のあるプラスミドから小規模に選択したものである。更なるプラスミドは当業者によく知られており、例えばCloning Vektors(Pouwels P. H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)という書籍などで見いだすことができる。
a)少なくとも1つの発現されるべき核酸配列、または
b)発現されるべき前記核酸配列の発現を制御する少なくとも1つのL-ラムノース誘導性プロモーターのいずれか、あるいは
c)(a)および(b)が、
それらの天然の遺伝環境(例えばそれらの天然の染色体座)には存在しないか、または、組換え法によって改変され、それが例えば、1個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位、または挿入を含むように改変されている、組換え法によって作製されたすべての構築物を指す。
一般的に、選択マーカーは、形質転換に成功した細胞を選択し、時間の経過および細胞分裂の際の、宿主細胞からのDNA構築物の喪失を防ぐために必要である。このような喪失は、特に、発現されるべき核酸配列によってコードされる組換えタンパク質が原核生物にとって毒性作用を有する場合に起こり得る。発現構築物とともに導入される選択マーカーは、形質転換に成功した細胞に殺生物剤(例えば、アンピシリン、カナマイシンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質)への耐性を賦与する。選択マーカーの例を挙げると、以下の通りである。すなわち、
- Amp(アンピシリン耐性; β-ラクタマーゼ)
- Cab(カルベニシリン耐性)
- Cam(クロラムフェニコール耐性)
- Kan(カナマイシン耐性)
- Rif(リファンピシン耐性)
- Tet(テトラサイクリン耐性)
- Zeo(ゼオシン耐性)
- Spec(スペクチノマイシン)
転写ターミネーターは望ましくない転写を減少させ、プラスミドおよびmRNAの安定性を増加させる。
Shine-Dalgarno(SD)配列は翻訳を開始するために必要であり、16SリボゾームRNAの3'末端に相補的である。開始コドンでの翻訳開始の効率は、実際の配列に依存する。E. coliのための適切なコンセンサス配列は、例えば、5'-TAAGGAGG-3'である。それは開始コドンの約4〜14ヌクレオチド上流に位置し、最適条件は8ヌクレオチドである。二次構造の形成(発現を減少させうる)を避けるため、この領域は好ましくはA/Tヌクレオチドに富むべきである。
開始コドンは翻訳が開始される箇所である。E. coliでは、ATGが最も広く用いられる開始コドンであるが、代替的なGTGも使用されうる。
発現されるべき組換えタンパク質とより短いペプチド(「タグ」)または他のタンパク質(融合パートナー)との間のNまたはC末端融合物は有利でありうる。例えば、それらは改良された発現、安定性、検出能および精製を可能にする。好ましくは、このような融合物は(例えばトロンビンまたは第X因子に対する)プロテアーゼ切断配列と組み合わされるが、それは、発現および精製を行った後で「タグ」または融合パートナーを切り離すのに役立つ。
3つの可能性のある終止コドンのうち、TAG およびTGA はある状況下では翻訳を終止させずに読み進み(read-through)を起こすことがあるので、TAAが好ましい。信頼性のある終止を確実にするために、配列中に複数の終止コドンを用いることもまた可能である。
レポーター遺伝子は、それらに固有の色もしくは酵素活性により形質転換効率、発現レベルおよび発現の位置または時間の評価を確実にする、容易に定量化できるタンパク質をコードする。レポーター遺伝子は、例えば以下のタンパク質、すなわち、加水分解酵素、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、グルコシダーゼまたはペルオキシダーゼをコードし得る。ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アセチルトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼまたはアデニルトランスフェラーゼが好ましい(Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44も参照されたい)。
-洗濯洗剤または他の洗剤に使用されるような酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼもしくはセルラーゼ、
-食品産業において使用されるような酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、β-グルカナーゼ、セルラーゼまたはペクチナーゼ、
-産業プロセスに用いられるような酵素、例えば、リパーゼ、α-アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、
-化学物質およびファインケミカルの製造のための産業プロセスに用いられるような酵素、例えば、リパーゼ、アミダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、エステラーゼまたはニトリラーゼ、
-動物栄養に用いられるような酵素、例えば、β-グルカナーゼ、
-製紙または皮革産業に用いられるような酵素、例えば、アミラーゼ、コラゲナーゼ、セルラーゼまたはキシラナーゼ。
a)配列番号6に示される配列を有する核酸配列、
b)遺伝子コードの縮重により、配列番号6に示される核酸配列から誘導される核酸配列、
c)配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ該ポリペプチドの酵素活性の実質的な低下を伴わずにアミノ酸配列レベルで少なくとも35%の相同性を有する、配列番号6に示される核酸配列の誘導体。
*は、光学活性中心であり、
R1、R2、R3は、互いに独立して、水素、置換または非置換の、分枝または非分枝C1-C10-アルキル-、C2-C10-アルケニル-、置換または非置換アリール-、ヘタリール-、OR4またはNR4R5であり、ここでR1、R2、R3は常に異なっており、
R4は、水素、置換または非置換の、分枝または非分枝C1-C10-アルキル-、C2-C10-アルケニル-、C1-C10-アルキルカルボニル-、C2-C10-アルケニルカルボニル-、アリール-、ヘタリール-またはヘタリールカルボニル-であり、
R5は、水素、置換または非置換の、分枝または非分枝C1-C10-アルキル-、C2-C10-アルケニル-、アリール-、ヘタリール-である。]
E. coli菌株JB1204の特性決定
文献によれば、E. coli JB1204(CGSC6999, Bulawa CEおよびRaetz CRH (1984) J Biol Chem 259:11257-11264)は、トランスポゾンの挿入「rha-14::Tn10」を有するが、「rha-14」の配列または機能に関するより詳細な情報はない。JB1204(K12誘導菌株)は、多数の他の突然変異の結果として、増殖に関してはTG1およびW3110のような菌株に及ばず、そのためこの菌株自体は工業規模でのタンパク質の製造に使用されない。
2は、LB Amp中のE. coli TG1 pDHE1650 (陽性対照)である。
アッセイ条件: 10 mM Tris-HCl、6 mMマンデロニトリル、40℃
解析: 40μlの1M HCl/mlによってサンプルを停止させ、細胞を除去し、その後DE 19848129に記載されたようにHPLCによって解析する。
組換えタンパク質の製造のためのラムノース欠損宿主菌株TG10の調製
組換え生体触媒の製造のために利用される菌株TG1は、それがもはやラムノースを代謝しなくなると同時に、ラムノース誘導に基づくpJOEおよびpDHEベクターの発現系が悪影響を受けずに機能し続けるように、P1形質導入によって改変した(この新しい誘導菌株の名前はTG10である)。
a)供与菌の溶解液の調製
- 供与菌、すなわちJB1204を3 mlのLB-Tet(15μg/ml)中で15時間、37℃で増殖させる(前培養物)。
- 3 ml LB-Tet + 5 mM CaCl2 + 60μl前培養物(=1:50)をOD600 = 0.3〜0.5となるまで37℃で(約45分間)培養する。
- ファージP1の(新鮮な)100μl溶菌液を加え、細胞溶解が起こるまで10〜120分間(清澄化、古い溶菌液では5時間まで)十分に振とうし続ける。
- 60μlのクロロホルムを加え、残りの細胞を破壊するために30秒間ボルテックスし、4℃で保存する。
- 受容菌、すなわちTG1 pDHE1650(=Lu9682)を3 mlのLB-Amp中で15時間、37℃で増殖させる(前培養物)。
- 5 ml LB-Amp + 5 mM CaCl2 + 10 mM MgCl2 + 10 mM MgSO4 + 100μl前培養物(=1:50)をOD600 = 0.3〜0.5となるまで37℃で(約30分間)培養する(前培養物を氷上に静置しておく)。
- 前培養物および本培養物を集菌し、2.5 mlのLB-Amp-Ca-Mgに再懸濁する。
- 各々の場合において、2x 100μlの受容菌を0、5、30、100μlの供与菌溶解液で処理し、100μlの供与菌溶解液を加えた受容菌なしの対照とともにそれぞれ8分および24分間、振とうせずに30℃で培養する(感染)。
- 100μlの1 Mクエン酸ナトリウムpH 7.0を加え、2分間7000 rpmで遠心分離し、1 mlの0.1 Mクエン酸バッファーpH 7.0で2〜3回洗浄し、1時間37℃で振とうせずに再懸濁する。
- 集菌し、100μlの0.02 Mクエン酸ナトリウムpH 7.0に再懸濁する。
- 各々の場合において、80μlをLB-Amp-Tet上に、供与菌溶解液の添加なしの混合物の場合は10μlをLB-Amp上に播種し、一晩37℃で培養する。
- LB-Ampは細菌叢を生じる(対照)。LB-Amp-Tetからコロニーを採取し、耐性、ラムノース欠損、ラムノース誘導能および活性を確認する。
解析: 40μlの1M HCl/mlによってサンプルを停止させ、細胞を除去し、その後DE 19848129に記載されたようにHPLCによって解析する(1U = 1μmolマンデル酸/分)。
ラムノース欠損宿主菌株TG10 pDHE1650の回復
E. coli TG1 pDHE1650を用いた形質導入は、アンピシリンによって元の菌株JB1204から選択されるという利点を有した。しかし、次の作業はプラスミドを含まない宿主菌株を必要とし、すなわち、プラスミドpDHE1650がTG10 pDHE1650から除去されなければならなかった(TG10 pDHE1650の回復)。このために、E. coli TG10 pDHE1650を氷から3 mlのアンピシリン不含LB-Tetに植菌し、37℃で一晩培養した。この培養物を3 mlのLB-Tet中の本培養物1:100に植菌し、これを熱ショック処理(2.5分間、42℃)に供した。37℃で16時間振とうした後、培養物のOD600は1.3であった(約1.3×109細胞/mlに相当する)。各々の場合、10-4〜10-7の希釈段階を100μlづつLB-Tet上に播種し、その結果生じたコロニー(560+140+15+0)をレプリカ法によってアンピシリン含有LB-Tetに移した。この培地上で弱い増殖を示したクローンを再度LB-Amp-Tet上に播種した。それはLB-Amp-Tet上で増殖せず、また(LB-Tet培養物からの)ミニ調製後、少しもプラスミドDNAを示さなかった。このアンピシリン感受性クローンはTG10(=Lu10568)と命名され、新しい過剰発現菌株のための出発菌株として使用される。
ラムノース欠損宿主菌株E. coli TG10 を用いた組換えL-パントラクトン加水分解酵素の製造
コンピテントE. coli TG10細胞を調製し、プラスミドpDHE681、pAgro4 およびpHSG575で形質転換した(表3のサンプル1)。37℃で一晩培養後、細胞は、対照菌株(TG1 pDHE681 pAgro4 pHSG575 = 表3のサンプル2)と比較して、高いL-パントラクトン加水分解活性を示した。概して培養6〜7時間後にその最大活性に達し(約1500 U/L)、より長時間の培養で活性は急激に低下した。ラムノース(0.5 g/L)はTG10 pDHE681 pAgro4 pHSG575によって代謝されなかった。
2, TG1 pDHE681 pAgro4 pHSG575; アンピシリン(Amp; 100μg/ml)、L-ラムノース(Rha 0.5 g/l)およびイソプロピルチオガラクトシド(IPTG 0.15 mM)を含むLB。
L-ラムノース濃度に対する誘導の依存性の測定
菌株E. coli TG10(pDHE1650、pAgro4、pHSG575)を、実施例1と同様に、様々なラムノース濃度(0〜2 g/lラムノース)の存在下で、LBアンピシリン(100 mg/l)、クロラムフェニコール10 mg/l、スペクチノマイシン(50 mg/l)、IPTG 0.15 mMで増殖させ、その特異的なニトリラーゼ活性について(2回反復で)解析した。平均して、わずか0.01 g/l のL-ラムノース濃度で有意な発現誘導が引き起こされたが、ラムノースの不在下では有意な発現は(酵素活性により)測定されなかった。
A: L-ラムノース濃度(濃度g/l)の関数としての相対活性(Rel. Act.%)の図
B: L-ラムノース濃度(濃度g/l)の関数としての相対比活性(Rel. Spec. Act.%)の図
L-ラムノースイソメラーゼ欠損株E. coli TG10におけるトランスポゾンの組込み部位の解析
更に詳細にトランスポゾンTn10の組込み部位を解析するために、ラムノース遺伝子rhaT、rhaB、rhaAおよびrhaDを、PCR(Pfuポリメラーゼ)によってTG1(pDHE681)とTG10(pDHE681)との比較により研究した。rhaA(L-ラムノースイソメラーゼ)またはrhaA-rhaD領域をそれぞれプライマーMKe 259/260およびMKe 258/259で増幅した時、野生型株TG1とは対照的に、突然変異株TG10は特異的な増幅産物をまったく与えなかった。
MKe259 5'-GCGAATTCGCATGACCACTCAACTGGAACA (rhaA 5'末端+ EcoRI)
MKe260 5'-CCCAAGCTTACCCGCGGCGACTCAAAATTT (rhaA 3'末端 + HindIII)
部位特異的ノックアウトを用いたL-ラムノースイソメラーゼ欠損E. coli菌株の作製
L-ラムノースイソメラーゼ(rhaA)を不活性化するために、rhaA遺伝子を最初にプライマーMKe001およびMKe002で増幅し、pBluescriptSK+にクローニング(XbaI/HindIII消化およびライゲーション)する。その後、BamHIによる制限消化およびクレノー断片による埋め込みによってフレーム・シフトを導入し、続いてライゲーションし、対応するrha*断片を遺伝子置換ベクターpKO3(Linkら(1997) J Bacteriol 179:6228-6237)に再度クローニングする。rha*構築物を用いた相同組換えによるTG1pDHE1650中のrhaA遺伝子のノックアウトは次のように実施する。すなわち、Linkら(Linkら(1997) J Bacteriol 179:6228-6237)によって記載されたように、43℃でクロラムフェニコールにより選択し、30℃でスクロース上にレプリカプレーティングを行い、続いて1 g/Lラムノースを補給したMcConkey寒天上で検定する。
MKe001: 5'-ATAAGAATGCGGCCGCATGACCACTCAACTGGAACA-3'
MKe002: 5'-CTAGCTCTAGATTACCCGCGGCGACTCAA-3
ラムノース欠損宿主菌株TG10による組換えニトリラーゼの製造
TG10 pDHE1650 pAgro4 pHSG575のようなTG10誘導菌株の流加発酵は、目的タンパク質(この場合はニトリラーゼ)の過剰発現のために、炭素源としてのグリセロールおよび誘導物質としてのラムノースを含む改変Riesenberg培地で実施する。この菌株を用いて、比較的高いまたはより高い細胞密度および酵素活性が達成された。
E. coli(TG1 pDHE1650 pAgro4 pHSG575)の発酵は20 Lのバイオリアクターで行った。10 Lの処理容量を持つリアクターに振とうフラスコからの200 mlの前培養物を植菌した。前培養培地は本培養培地と一致する。
40 g グリセロール99.5%
15 g トリプトン
13.3 g リン酸二水素カリウム
5 g 酵母エキス
4 g リン酸水素二アンモニウム
1.7 g クエン酸
1.1 g 硫酸マグネシウム七水和物
1 mL 微量元素溶液SL Korz 1000 C
0.1 mL Tego KS 911消泡剤
0.062 g 硫酸鉄(II)七水和物
10 mg チアミン塩酸塩
を完全脱塩水で1 Lとする。
クエン酸*H2O 20 g
塩化コバルト(II)六水和物(CoCl2 * 6H2O) 2.5 g
塩化マンガン(II)四水和物(MnCl2 * 4H2O) 3.0 g
塩化銅(II)二水和物(CuCl2 * 2H2O) 0.3 g
ホウ酸(H3BO3) 0.6 g
モリブデン酸ナトリウム二水和物(Na2MoO4 * 2H2O) 0.5 g
酢酸亜鉛二水和物(Zn(CH3COO)2 * 2H2O) 2.6 g
を完全脱塩水で1 Lとする。
2 L 完全脱塩水
211 g 硫酸ナトリウム
13.6 g 硫酸鉄(II)七水和物
8.8 kg グリセロール99.5%
220 mL 微量元素溶液
703 g 完全脱塩水
297 g ラムノース一水和物
E. coli TG10(pDHE1650 pAgro4 pHSG575)の発酵は、18.5 gのラムノース補給溶液によって誘導を行ったこと以外、実施例1と同様の手順に従って行った。その後はラムノースを補給しなかった。
50μlの細胞懸濁液を880μlのリン酸ナトリウム/カリウムバッファー(10 mM)にピペットで分注し、この混合物を30℃に加温する。20μlのメタノール性マンデロニトリル溶液(12%)の添加によって反応を開始させる。10分後、50μlの1M HClの添加によって酵素反応を停止させる。細胞バイオマスを遠心分離し、上清中のマンデル酸濃度をHPLC(ODS Hypersil 100*2.0 mm、移動相: 75%H3PO4(14.8 mM)/25%メタノール; 流速: 0.5 ml/min; 注入量: 2μl; カラム温度: 40℃; 検出: 210 nm; マンデル酸の保持時間: 0.9分)によって測定する。
発酵槽の稼働中のサンプル採取のために、セラミックフィルターおよび連続作動ローラーポンプを使用する。HPLCシステムは、各分析が完了した後に新たなサンプルが注入されるようにプログラムする。その合間に、ろ過液を発酵槽から廃液容器にポンプ輸送する。
カラム: HPX 87 H, 7.8 x 300 mm
溶出液: 0.005 M H2SO4
流速: 0.5 mL/min
注入量: 1μL
カラム温度: 55℃
検出: RI
Claims (15)
- 原核宿主細胞において核酸配列を発現させる方法であって、
a)前記宿主細胞においてエピソーム複製が可能であり、かつL-ラムノース誘導性プロモーターの転写制御下で発現される核酸配列を含有する、少なくとも1つのDNA構築物を前記宿主細胞に導入すること、ただし、前記プロモーターは前記核酸配列に対して異種であること、
b)前記DNA構築物をエピソームの形態で含有する原核宿主細胞を選択すること、
c)選択された宿主細胞の培養物にL-ラムノースを添加することによって前記核酸配列の発現を誘導すること、
を含んでなり、その際、原核宿主細胞は少なくともL-ラムノースイソメラーゼに関して欠損している、上記方法。 - 原核宿主細胞が腸内細菌科または放線菌目の種より選択される、請求項1に記載の方法。
- 原核宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項1または2に記載の方法。
- L-ラムノース誘導性プロモーターが、大腸菌由来のrhaPBADプロモーター、またはその機能的同等物もしくは機能的に同等な前記プロモーターの断片である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- L-ラムノース誘導性プロモーターが、配列番号5に示される少なくとも1つのRhaS結合エレメント、またはその機能的同等物もしくは機能的に同等な前記エレメントの断片を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- L-ラムノース誘導性プロモーターが、配列番号1、2、3または4に示される少なくとも1つの配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- L-ラムノースイソメラーゼが、配列番号9に示されるアミノ酸配列またはその機能的同等物によって記載される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- エピソーム複製が可能なDNA構築物が、100 000塩基または塩基対以下のサイズを有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- エピソーム複製が可能なDNA構築物が、環状プラスミドベクター、ファージミドおよびコスミドからなる群より選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 原核宿主細胞が、ラムノースの代謝において機能する遺伝子に関して少なくとも1つの更なる欠損を有し、前記遺伝子が、ラムヌロース1-ホスファターゼ(RhaB)およびラムヌロースリン酸アルドラーゼ(RhaD)からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 発現されるべき核酸配列の発現が、前記核酸配列によってコードされるタンパク質の産生をもたらす、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 発現されるべき核酸配列が、キモシン、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、糖質分解酵素、デヒドロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-アミラーゼ、酸化還元酵素、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、コラゲナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ペクチナーゼ、アミログルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、ニトリラーゼ、エステラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、オキシゲナーゼ、オキシニトリラーゼ、リアーゼ、ラクトナーゼ、カルボキシラーゼ、コラゲナーゼ、セルラーゼ、血清アルブミン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、組織プラスミノーゲン因子、プロテインC、フォンビルブラント因子、アンチトロンビン、エリトロポエチン、コロニー刺激因子、サイトカイン、インターロイキン、インスリン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、抗体、抗体フラグメント、構造タンパク質、コラーゲン、フィブロイン、エラスチン、チューブリン、アクチン、ミオシン、増殖因子、細胞周期タンパク質、ワクチン、フィブリノゲンおよびトロンビンからなる群より選択される組換えタンパク質をコードする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくともL-ラムノースイソメラーゼに関して欠損しており、かつ少なくとも1つのDNA構築物を含む原核宿主細胞であって、前記DNA構築物は、前記宿主細胞において複製可能であり、かつL-ラムノース誘導性プロモーターの転写制御下で発現される核酸配列を含有し、前記プロモーターは前記核酸配列に対して異種である、上記原核宿主細胞。
- 食品、飼料、酵素、化学薬品、医薬品またはファインケミカルの製造のための、請求項13に記載の原核宿主細胞の使用。
- 請求項13に記載の原核宿主細胞またはその調製物を用いた、組換えタンパク質、酵素およびファインケミカルの製造方法。
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