ES2621320T3 - Sistema de coexpresión inducible - Google Patents

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ES2621320T3 ES13756743.4T ES13756743T ES2621320T3 ES 2621320 T3 ES2621320 T3 ES 2621320T3 ES 13756743 T ES13756743 T ES 13756743T ES 2621320 T3 ES2621320 T3 ES 2621320T3
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Abstract

Una célula hospedadora que comprende dos o más tipos de estructuras artificiales de expresión, en donde la estructura artificial de expresión de cada tipo comprende un promotor inducible y una secuencia de polinucleótidos que codifica un producto génico que se va a transcribir desde el promotor inducible; y al menos uno de dichos promotores inducibles es sensible a un inductor que es diferente del inductor de otro de dichos promotores inducibles; y en donde cada promotor inducible no es un promotor inducible con lactosa; y en donde la célula hospedadora tiene un nivel reducido de función génica de al menos un gen que codifica una proteína que metaboliza un inductor de al menos uno de dichos promotores inducibles; y al menos uno de dichos productos génicos se selecciona a partir del grupo que consiste en un producto génico que forma un multímero con otro de dichos productos génicos, y un polipéptido que forma al menos dos enlaces disulfuro.

Description

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imagen8
xylFGHR se podría modificar de manera que se delecionen las secuencias que codifican xylFGH, dejando a XylR como la única proteína activa expresada a partir del promotor inducible con xilosa PxylF, y en donde la secuencia que codifica xylE se expresa a partir de un promotor constitutivo, en lugar de su promotor natural. Como otro ejemplo, la secuencia que codifica xylR se expresa a partir del promotor PxylA o el promotor PxylF en una estructura artificial de
5 expresión, mientras que el operón xylFGHR se deleciona y xylE se expresa constitutivamente o, alternativamente, un operón xylFGH (que carece de la secuencia que codifica xylR ya que está presente en una estructura artificial de expresión) se expresa a partir de un promotor constitutivo y la secuencia que codifica xylE se deleciona o se altera de manera que no produce una proteína activa.
Promotor de lactosa. La expresión "promotor de lactosa" se refiere al promotor inducible con lactosa para el operón
10 lacZYA, un promotor que también se denomina lacZp1; este promotor de lactosa se encuentra en aprox. 365603 365568 (cadena negativa, con el sitio de unión a la polimerasa de ARN ("-35 ') sitio a aprox. 365603 -365598, la caja de Pribnow ('-10') a 365579 -365573, y un sitio de iniciación de la transcripción a 365567) en el secuencia genómica de la subcepa MG1655 de E. coli K-12 (Secuencia de referencia en NCBI NC_000913.2, 11l-ENE-2012).
Tabla 1. Ubicaciones genómicas de promotores y genes relacionados inducibles de E. coli [1]
Promotor o Gen
Ubicación genómica: Comentarios:
promotor araBAD
[2] (aprox. 70165) 70074 (cadena negativa) Smith y Schleif [3]: unión a ARN pol [4] (‘-5’) 70110-70104, caja de Pribnow (‘-10’) 70092-70085
operón araBAD
70075 -65855 (cadena negativa) Smith y Schleif [3]: inicio transcrito 70075, araB ATG 70048; NCBI: araB final de TAA 68348; araA ATG 68337, final de TAA 66835; araD ATG 66550, final de TAA 65855
promotor araC
[2] (aprox. 70166) 70241 (cadena positiva) Smith y Schleif [3]: unión a ARN pol (‘-35’) 702107021, caja de Pribnow (‘-10’) 70230-70236
gen araC
70242 -71265 (cadena positiva) Miyada [5]: inicio transcrito 70242, araC ATG 70387; NCBI: final de TAA 71265
promotor araE
[2] (aprox. 2980349) 2980231 (cadena negativa) Stoner y Schleif [6]: unión a CRP 29803492980312, unión a ARN pol (‘-35’) 29802692980264, caja de Pribnow (‘-10’) 2980244-2980239
gen araE
2980230-2978786 (cadena negativa) Stoner y Schleif [6]: inicio transcrito 2980230, ATG 2980204; NCBI: final de TGA 2978786
promotor araFGH
[2] (aprox. 1984423) 1984264 (cadena negativa) Hendrickson [7]: unión a AraC aprox. 1984423aprox. 1984414 y 1984326-1984317, unión a CRP 1984315-1984297, unión a ARN pol (‘-35’) 1984294-1984289, caja de Pribnow (‘-10’) 19842751984270
Promotor o Gen
Ubicación genómica: Comentarios:
operón araFGH
1984263 -1980578 (cadena negativa) Hendrickson [7]: inicio transcrito 1984263; NCBI: araF ATG 1984152, final de TAA 1983163; araG ATG 1983093, final de TGA 1981579; araH ATG 1981564, final de TGA 1980578
gen lacY
362403 -361150 (cadena negativa) Expresado como parte del operón lacZYA. NCBI: ATG 362403, final de TAA 361150
promotor prpBCDE
[2] aprox. 347790 aprox. 347870 (cadena positiva) Keasling [8]: unión a ARN pol (‘-24’) 347844347848, caja de Pribnow (‘-12’) 347855-347859
operón prpBCDE
(aprox. 347871) 353816 (cadena positiva) Keasling [8]: inicio transcrito deducido aprox. 347871, prpB ATG 347906; NCBI: prpB final de TAA 348796; prpC ATG 349236, final de TAA 350405; prpD ATG 350439, final de TAA 351890; prpE ATG 351930, final de TAG 353816
promotor prpR
[2] aprox. 347789 aprox. 347693 (cadena negativa) Keasling [8]: unión a CRP 347775-347753, unión a ARN pol (‘−35’) 347728-347723, caja de Pribnow (‘−10’) 347707-347702
gen prpR
(aprox. 347692) 346081 (cadena negativa) Keasling [8]: inicio transcrito deducido aprox. 347692, prpR ATG 347667; NCBI: final de TGA 346081
operón scpA-argKscpBC (o sbm-ygfDGH)
3058872 -3064302 (cadena positiva) NCBI: scpA ATG 3058872, final de TAA 3061016; argK ATG 3061009, final de TAA 3062004; scpB ATG 3062015, final de TAA 3062800; scpC ATG 3062824, final de TAA 3064302
promotor rhaBAD
[2] (aprox. 4095605) 4095496 (cadena negativa) Wickstrum [9]: unión a CRP 4095595-4095580, unión a ARN pol (‘-35’) 4095530-4095525, caja de Pribnow (‘-10’) 4095506-4095501
operón rhaBAD
4095495 -4091471 (cadena negativa) Wickstrum [9]: inicio transcrito 4095495, rhaB ATG 4095471; NCBI: rhaB final de TGA 4094002; rhaA ATG 4094005, final de TAA 4092746; rhaD ATG 4092295, final de TAA 4091471
promotor rhaSR
[2] (aprox. 4095606) 4095733 (cadena positiva) Wickstrum [9]: unión a CRP 4095615-4095630, unión a ARN pol (‘-35’) 4095699-4095704, caja de Pribnow (‘-10’) 4095722-4095727
Promotor o Gen
Ubicación genómica: Comentarios:
operón rhaSR
4095734 -4097517 (cadena positiva) Wickstrum [9]: inicio transcrito 4095734, rhaS ATG 4095759; NCBI: rhaS final de TAA 4096595; rhaR ATG 4096669, final de TAA 4097517
operón rfbBDACX (o rmlBDACX)
2111085 -2106361 (cadena negativa) NCBI: rfbB GTG 2111085, final de TAA 2110000; rfbD ATG 2110000, final de TAA 2109101; rfbA ATG 2109043, final de TAA 2108162; rfbC ATG 2108162, final de TGA 2107605; rfbX ATG 2107608, final de TGA 2106361
promotor rhaT
[2] (aprox. 4098690) 4098590 (cadena negativa) Vía [10]: unión a CRP 4098690-4098675, unión a ARN pol (‘-35’) 4098621-4098616, caja de Pribnow (‘-10’) 4098601-4098596
gen rhaT
4098589 -4097514 (cadena negativa) Vía [10]: inicio transcrito 4098589, rhaT ATG 4098548; NCBI: rhaT final de TAA 4097514
promotor xylAB
[2] (aprox. 3728960) 3728831 (cadena negativa) Song y Park [11]: unión a CRP 3728919-3728901, unión a ARN pol (‘-35’) 3728865-3728860, caja de Pribnow (‘-10’) 3728841-3728836
operón xylAB
3728830 -3725940 (cadena negativa) Song y Park [11]: inicio transcrito 3728830, xylA ATG 3728788; NCBI: xylA final de TAA 3727466; xylB ATG 3727394, final de TAA 3725940
promotor xylFGHR
[2] (aprox. 3728961) 3729091 (cadena positiva) Song y Park [11]: unión a ARN pol (‘-35’) 37290583729063, caja de Pribnow (‘-10’) 3729080-3729085
operón xylFGHR
3729092 -3734180 (cadena positiva) Song y Park [11]: inicio transcrito 3729092, xylF ATG 3729154; NCBI: xylF final de TAA 3730146, xylG ATG 3730224, final de TGA 3731765; xylH ATG 3731743, final de TGA 3732924; xylR ATG 3733002, final de TAG 3734180
promotor xylE
[2] aprox. 4240482 aprox. 4240320 (cadena negativa) Davis y Henderson [12]: posible caja de Pribnow (‘10’) 4240354-4240349, posible caja de Pribnow (‘10’) 4240334-4240329
gen xylE
(aprox. 4240319) 4238802 (cadena negativa) Davis y Henderson [12]: inicio transcrito deducido aprox. 4240319, xylE ATG 4240277, final de TAA 4238802
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Notas para la Tabla 1:
[1]
Todas las ubicaciones de secuencias genómicas se refieren a la secuencia genómica de la subcepa MG1655 de
E.
coli K-12, proporcionada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) como Referencia de Secuencia NCBI NC_000913.2, 11-ENE-2012.
[2] La ubicación del extremo 5' (o “aguas arriba”) de la región promotora es aproximada; para los promotores “bidireccionales”', una ubicación de la secuencia de nucleótidos que es aproximadamente equidistante entre los sitios de inicio de la transcripción se selecciona como el “'extremo” 5’ designado para ambos promotores individuales. En la práctica, la porción de promotor de una estructura artificial de expresión puede tener algo menos de secuencia en su extremo 5' que las secuencias promotoras, tal como se indica en la tabla, o puede tener una secuencia de nucleótidos que incluye una secuencia adicional desde la región 5' (o “aguas arriba”) de las secuencias promotoras tal como se indica en la tabla, a la vez que conserva la capacidad de favorecer la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo, de una manera inducible.
[3] Smith y Schleif, “Nucleotide sequence of the L-arabinose regulatory region of Escherichia coli K12”, J Biol Chem 1978 Oct. 10; 253(19): 6931-6933.
[4] ‘ARN pol’ indica ARN polimerasa a lo largo de la tabla.
[5] Miyada, et al., “DNA sequence of the araC regulatory gene from Escherichia coli B/r”, Nucleic Acids Res 1980 Nov. 25; 8(22): 5267-5274.
[6] Stoner y Schleif, “E. coli araE regulatory region araE codes for the low affinity L-arabinose uptake protein”, Número de registro de la base de datos de GenBank X00272.1, fecha de revisión 6 JUL. 1989.
[7] Hendrickson et al., “Sequence elements in the Escherichia coli araFGH promoter”, J Bacteriol 1992 Nov; 174(21): 6862-6871.
[8] Documento de patente de EE.UU. nº 8178338 B2; 15 de Mayo, 2012; Keasling, Jay; Figura 9.
[9] Wickstrum et al., “The AraC/XylS family activator RhaS negatively autoregulates rhaSR expression by preventing cyclic AMP receptor protein activation”, J Bacteriol 2010 Jan; 192(1): 225-232.
[10] Vía et al., “Transcriptional regulation of the Escherichia coli rhaT gene”, Microbiology 1996 Jul; 142(Pt 7): 18331840.
[11] Song y Park, “Organization and regulation of the D-xylose operons in Escherichia coli K-12: XylR acts as a transcriptional activator”, J Bacteriol. 1997 Nov; 179(22): 7025-7032.
[12] Davis y Henderson, “The cloning and DNA sequence of the gene xylE for xylose-proton symport in Escherichia coli K12”, J Biol Chem 1987 Oct 15; 262(29): 13928-13932.
Estructuras artificiales de expresión. Las estructuras artificiales de expresión son polinucleótidos diseñados para la expresión de uno o varios productos génicos de interés y, por lo tanto, no son moléculas presentes en la naturaleza. Las estructuras artificiales de expresión se pueden integrar en un cromosoma de la célula hospedadora, o mantenerse dentro de la célula hospedadora como moléculas de polinucleótidos que se replican independientemente del cromosoma de la célula hospedadora, tales como plásmidos o cromosomas artificiales. Un ejemplo de una estructura artificial de expresión es un polinucleótido resultante de la inserción de una o varias secuencias de polinucleótidos en un cromosoma de la célula hospedadora, en donde las secuencias de polinucleótidos insertadas alteran la expresión de las secuencias que codifican cromosomas. Un vector de expresión es una estructura artificial de expresión plasmídica, utilizada específicamente para la expresión de uno o varios productos génicos. Una o varias estructuras artificiales de expresión se pueden integrar en un cromosoma de la célula hospedadora o se pueden mantener en un polinucleótido extracromosómico, tal como un plásmido o un cromosoma artificial. Las siguientes son descripciones de los tipos particulares de secuencias de polinucleótidos que se pueden utilizar en estructuras artificiales de expresión para la coexpresión de productos génicos.
Orígenes de replicación. Las estructuras artificiales de expresión deben comprender un origen de replicación, también denominado replicón, con el fin de mantenerse dentro de la célula hospedadora como polinucleótidos que se replican independientemente. Diferentes replicones que utilizan el mismo mecanismo para la replicación, no se pueden mantener juntos en una única célula hospedadora a lo largo de divisiones celulares repetidas. Como resultado de ello, los plásmidos se pueden clasificar en grupos de incompatibilidad en función del origen de replicación que contienen, como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Orígenes de replicación y plásmidos representativos para uso en estructuras artificiales de expresión [1]
Grupo de Incompatibilidad:
Origen de Replicación Número de Copias: Plásmidos Representativos (nº de depósito ATCC):
colE1
15 -20 colE1 (ATCC 27138)
colE1, pMB1
pMB1 15 -20 pBR322 (ATCC 31344)
pMB1 modificado
500 -700 pUC9 (ATCC 37252)
IncFII, pT181
R1(ts) 15 -120 pMOB45 (ATCC 37106)
F, P1, p15A, pSC101, R6K,
p15A 18 -22 pACYC177 (ATCC 37031); pACYC184 (ATCC 37033); pPRO33 (Addgene 17810) [3]
RK2 [2]
pSC101 ~5 pSC101 (ATCC 37032): pGBM1 (ATCC 87497)
RK2
4 -7 [2] RK2 (ATCC 37125)
CloDF13 [4]
CloDF13 20 -40 [4] pCDFDuet™-1 (EMD nº de catálogo de Millipore 71340-3)
ColA [4]
ColA 20 -40 [4] pCOLADuet™-1 (EMD nº de catálogo de Millipore 71406-3)
RSF1030 [4]
RSF1030 (también denominado NTP1) >100 [4] pRSFDuet™-1 (EMD nº de catálogo de Millipore 71341-3)
Notas para la Tabla 2:
[1] Adaptado de www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/Protocols/ORIs.html, y Sambrook y Russell, "Molecular 5 Cloning: A Laboratory Manual", 3ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
[2] Kües y Stahl, "Replication of plasmids in gram-negative bacteria", Microbiol Rev 1989 Dec; 53(4): 491-516.
[3] El plásmido pPRO33 (documento de Patente de Estados Unidos nº 8178338 B2, 15 mayo de 2012; Keasling, Jay) está disponible en Addgene (www.addgene.org) como plásmido 17810 de Addgene.
[4] openwetware.org/wiki/CH391L/S12/Origins_of_Replication; visitada 03 Ago de 2013.
10 Los orígenes de replicación se pueden seleccionar para uso en estructuras artificiales de expresión basándose en el grupo de incompatibilidad, el número de copias y/o el tipo de hospedador, entre otros criterios. Como se ha descrito anteriormente, si dos o más estructuras artificiales de expresión diferentes se van a utilizar en la misma célula hospedadora para la coexpresión de múltiples productos génicos, lo mejor es que las diferentes estructuras artificiales de expresión contengan orígenes de replicación procedentes de diferentes grupos de incompatibilidad: un
15 replicón pMB1 en una estructura artificial de expresión y un replicón p15A en otra, por ejemplo. El número promedio de copias de una estructura artificial de expresión en la célula, en relación con el número de moléculas de cromosomas del hospedador, se determina por el origen de replicación contenido en esa estructura artificial de expresión. El número de copias puede variar desde unas pocas copias por célula a varios cientos (Tabla 2). En una realización de la invención, se emplean diferentes estructuras artificiales de expresión que comprenden promotores
20 inducibles que se activan con el mismo inductor, pero que tienen diferentes orígenes de replicación. Mediante la selección de orígenes de replicación que conservan cada estructura artificial de expresión diferente en un cierto número de copias aproximado en la célula, es posible ajustar los niveles de producción total de un producto génico expresado a partir de una estructura artificial de expresión, en relación con otro producto génico expresado a partir de una diferente estructura artificial de expresión. A modo de ejemplo, para coexpresar subunidades A y B de una
25 proteína multímera, se crea una estructura artificial de expresión que comprende el replicón colE1, el promotor ara y una secuencia codificadora de la subunidad A expresada a partir del promotor ara: 'colE1-Para-A'. Otra estructura artificial de expresión se crea de modo que comprenda el replicón p15A, el promotor ara y una secuencia codificadora de la subunidad B: 'p15A-Para-B'. Estas dos estructuras artificiales de expresión se pueden mantener
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también llamado la secuencia de Shine-Dalgarno) que se encuentra en las especies de la célula hospedadora. En procariotas (arqueas y bacterias), la secuencia de consenso de RBS es GGAGG o GGAGGU, y en bacterias tales como E. coli, la secuencia de consenso de RBS es AGGAGG o AGGAGGU. El RBS se separa normalmente del codón de iniciación por 5 a 10 nucleótidos intermedios. En estructuras artificiales de expresión, la secuencia de RBS es preferiblemente al menos 55% idéntica a la secuencia de consenso AGGAGGU, más preferiblemente al menos 70% idéntica, y lo más preferiblemente al menos 85% idéntica, y se separa del codón de iniciación por 5 a 10 nucleótidos intermedios, más preferentemente por 6 a 9 nucleótidos intermedios, y lo más preferiblemente por 6 o 7 nucleótidos intermedios. La capacidad de un determinado RBS para producir una tasa de iniciación de la traducción deseable se puede calcular en el sitio web salis.psu.edu/software/RBSLibraryCalculatorSearchMode, usando la calculadora RBS; la misma herramienta se puede utilizar para optimizar un RBS sintético para una tasa de traducción a lo largo de un margen de 100.000 veces (Salis, "The ribosome binding site calculator", Methods Enzymol 2011; 498: 19-42).
Sitio de clonación múltiple. Un sitio de clonación múltiple (MCS), también denominado un polienlazador, es un polinucleótido que contiene múltiples sitios de restricción próximos o solapados entre sí. Los sitios de restricción en el MCS se presentan normalmente una vez dentro de la secuencia de MCS, y preferiblemente no aparecen dentro del resto del plásmido u otra estructura artificial de polinucleótidos, permitiendo que las enzimas de restricción corten el plásmido u otra estructura artificial de polinucleótidos solo dentro del MCS. Los ejemplos de secuencias de MCS son los de la serie pBAD de vectores de expresión, que incluyen pBAD18, pBAD18-Cm, pBAD18-Kan, pBAD24, pBAD28, pBAD30 y pBAD33 (Guzman et al., "Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter", J Bacteriol 1995 Jul; 177(14): 4121-4130); o los de la serie pPRO de vectores de expresión obtenidos a partir de los vectores pBAD, tales como pPRO18, pPRO18-Cm, pPRO18-Kan, pPRO24, pPRO30 y pPRO33 (documento de Patente de EE.UU. nº 8178338 B2; 15 de mayo 2012; Keasling, Jay). Un sitio de clonación múltiple se puede utilizar en la creación de una estructura artificial de expresión: mediante la colocación de un sitio de clonación múltiple en 3' (o aguas abajo) de una secuencia de promotor, el MCS se puede utilizar para insertar la secuencia que codifica un producto génico que se va a coexpresar en la estructura artificial, en la ubicación correcta en relación con el promotor, de modo que se produzca la transcripción de la secuencia codificante. Dependiendo de qué enzima de restricción se utiliza para cortar dentro del MCS, puede haber alguna parte de la secuencia de MCS que permanezca dentro de la estructura artificial de expresión después de que se inserte la secuencia codificante u otra secuencia de polinucleótidos en la estructura artificial de expresión. Cualquier secuencia de MCS que permanezca, puede ser aguas arriba o aguas abajo, o en ambos lados de la secuencia insertada. Un sitio de unión al ribosoma se puede colocar aguas arriba del MCS, preferiblemente inmediatamente adyacente, o separado del MCS por solo unos pocos nucleótidos, en cuyo caso el RBS estará aguas arriba de cualquier secuencia codificante insertada en el MCS. Otra alternativa es incluir un sitio de unión al ribosoma dentro del MCS, en cuyo caso la elección de las enzimas de restricción usadas para cortar dentro del MCS, determinará si el RBS se conserva, y en qué relación frente a, las secuencias insertadas. Una alternativa adicional es incluir un RBS dentro de la secuencia de polinucleótidos que se va a insertar en la estructura artificial de expresión en el MCS, preferiblemente en una relación apropiada con cualquiera de las secuencias codificadoras, para estimular el inicio de la traducción desde el ARN mensajero transcrito.
Expresión desde promotores constitutivos. Las estructuras artificiales de expresión de la invención también pueden comprender secuencias codificadoras que se expresan a partir de promotores constitutivos. A diferencia de los promotores inducibles, los promotores constitutivos inician una producción continua de producto génico bajo la mayoría de las condiciones de crecimiento. Un ejemplo de un promotor constitutivo es el del gen Tn3 bla, que codifica beta-lactamasa y es responsable del fenotipo de resistencia a la ampicilina (AmpR) conferido a la célula hospedadora a través de muchos plásmidos, incluyendo pBR322 (ATCC 31344), pACYC177 (ATCC 37031) y pBAD24 (ATCC 87399). Otro promotor constitutivo que se puede utilizar en estructuras artificiales de expresión, es el promotor para el gen de la lipoproteína de E. coli, Ipp, que se encuentra en las posiciones 1755731-1755406 (hebra positiva) en la subcepa MG1655 de E. coli K-12 (Inouye e Inouye, "Up-promoter mutations in the Ipp gene of Escherichia coli", Nucleic Acids Res 1985 May 10; 13(9): 3101-3110). Un ejemplo adicional de un promotor constitutivo que se ha utilizado para la expresión génica heteróloga en E. coli es el promotor trpLEDCBA, que se encuentra en las posiciones 1321169-1321133 (hebra negativa) de la subcepa MG1655 de E. coli K-12 (Windass et al., "The construction of a synthetic Escherichia coli trp promoter and its use in the expression of a synthetic interferon gene", Nucleic Acids Res 1982 Nov 11; 10(21): 6639-6657). Los promotores constitutivos se pueden utilizar en estructuras artificiales de expresión para la expresión de marcadores de selección, como se describe en el presente documento, y también para la expresión constitutiva de otros productos génicos, útiles para la coexpresión del producto deseado. Por ejemplo, reguladores de la transcripción de los promotores inducibles, tales como AraC, PrpR, RhaR y XylR, si no se expresan a partir de un promotor inducible bidireccional, se pueden expresar, alternativamente, a partir de un promotor constitutivo, ya sea en la misma estructura artificial de expresión que el promotor inducible que regulan, o una estructura artificial de expresión diferente. Del mismo modo, los productos génicos útiles para la producción o el transporte del inductor, tal como PrpEC, AraE o Rha, o proteínas que modifican el entorno de reducción-oxidación de la célula, como algunos ejemplos, se pueden expresar a partir de un promotor constitutivo dentro de una estructura artificial de expresión. Los productos génicos útiles para la producción de productos génicos coexpresados, y el producto resultante deseado, también incluyen proteínas chaperonas, transportadores de cofactores, etc.
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Péptidos señal. Los productos génicos de polipéptidos coexpresados por los métodos de la invención pueden contener péptidos señal o carecer de ellos, dependiendo de si es deseable que tales productos génicos se exporten desde el citoplasma de la célula hospedadora al periplasma, o que queden retenidos en el citoplasma, respectivamente. Los péptidos señal (también denominados secuencias señal, secuencias líder o péptidos líder) se caracterizan estructuralmente por un segmento de aminoácidos hidrófobos, con aproximadamente cinco a veinte aminoácidos de longitud y frecuentemente aproximadamente diez a quince aminoácidos de longitud, que tiene una tendencia a formar una sola hélice alfa. Este segmento hidrófobo, frecuentemente está precedido inmediatamente por un segmento más corto enriquecido con aminoácidos cargados positivamente (particularmente lisina). Los péptidos señal que se van a escindir del polipéptido maduro, por lo general terminan en un segmento de aminoácidos que es reconocido y escindido por la peptidasa señal. Los péptidos señal se pueden caracterizar funcionalmente por la capacidad para dirigir el transporte de un polipéptido, ya sea de modo cotraduccional o postraduccional, a través de la membrana plasmática de procariotas (o la membrana interna de bacterias Gramnegativas tales como E. coli), o dentro del retículo endoplásmico de las células eucariotas. El grado en que un péptido señal permite que un polipéptido sea transportado al espacio periplásmico de una célula hospedadora tal como E. coli, por ejemplo, se puede determinar mediante una separación de las proteínas periplásmicas procedentes de proteínas retenidas en el citoplasma, utilizando un método tal como el que se proporciona en el Ejemplo 12.
Células hospedadoras. Los sistemas de coexpresión inducible de la invención están diseñados para expresar múltiples productos génicos. En la invención, los productos génicos se coexpresan en una célula hospedadora. Se proporcionan ejemplos de células hospedadoras que permiten una coexpresión inducible eficaz y rentable de componentes de productos multímeros. Las células hospedadoras pueden incluir, además de las células aisladas en cultivo, células que forman parte de un organismo multicelular, o células que crecen dentro de un organismo o un sistema de organismos diferente. Además, las estructuras artificiales de expresión de los sistemas de coexpresión inducible de la invención se pueden utilizar en sistemas exentos de células, tales como los basados en extractos de germen de trigo o en extractos de células bacterianas, tales como un sistema de síntesis proteica exento de células con intercambio continuo (CECF), utilizando extractos de E. coli y un aparato de incubación, como el RTS ProteoMaster (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). (Jun et al., "Continuous-exchange cell-free protein synthesis using PCR-generated DNA and an RNase E-deficient extract", Biotechniques 2008 Mar; 44(3): 387-391).
Células hospedadoras procariotas. Las estructuras artificiales de expresión diseñadas para la coexpresión de productos génicos, se proporcionan en células hospedadoras, preferiblemente células hospedadoras procariotas. Las células hospedadoras procariotas pueden incluir arqueas (tales como Haloferax volcanii, Sulfolobus solfataricus), bacterias Gram-positivas (tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Brevibacillus choshinensis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactococcus lactis y Streptomyces lividans), o bacterias Gramnegativas, que incluyen las alfaproteobacterias (Agrobacterium tumefaciens, Caulobacter crescentus, Rhodobacter sphaeroides y Sinorhizobium meliloti), betaproteobacterias (Alcaligenes eutrophus), y gammaproteobacterias (Acinetobacter calcoaceticus, Azotobacter vinelandii, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida). Las células hospedadoras preferidas incluyen gammaproteobacterias de la familia Enterobacteriaceae, tales como Enterobacter, Erwinia, Escherichia (incluyendo E. coli), Klebsiella, Proteus, Salmonella (incluyendo Salmonella typhimurium), Serratia (incluyendo Serratia marcescens) y Shigella.
Células hospedadoras eucariotas. Muchos otros tipos de células hospedadoras se pueden utilizar para los sistemas de coexpresión inducible de la invención, incluyendo células eucariotas tales como levadura (Candida shehatae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, otras especies de Kluyveromyces, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus también conocido como Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, especies de Dekkera/Brettanomyces y Yarrowia lipolytica); otros hongos (Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Neurospora crassa, Penicillium, Tolypocladium, Trichoderma reesia); líneas celulares de insecto (células Schneider 2 de Drosophila melanogaster y células Sf9 de Spodoptera frugiperda); y líneas celulares de mamífero incluyendo líneas celulares inmortalizadas (células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster neonato (BHK), células de riñón de mono (COS), células de riñón embrionario humano (HEK, 293 o HEK-293) y células de carcinoma hepatocelular humano (Hep G2)). Las células hospedadoras anteriores están disponibles de la American Type Culture Collection.
Alteraciones de las funciones génicas de células hospedadoras. Se pueden realizar ciertas alteraciones de las funciones génicas de las células hospedadoras que comprenden estructuras artificiales de expresión inducible, para favorecer una inducción eficaz y homogénea de la población de células hospedadoras a través de un inductor. Preferiblemente, la combinación de estructuras artificiales de expresión, el genotipo de la célula hospedadora y las condiciones de la inducción, da como resultado que al menos 75% (más preferiblemente al menos 85%, y lo más preferiblemente, al menos 95%) de las células en el cultivo expresan el producto génico de cada promotor inducido, tal como se mide por el método de Khlebnikov et al., descrito en el Ejemplo 8. Para células hospedadoras distintas de E. coli, estas alteraciones pueden implicar la función de genes que son estructuralmente similares a un gen de E. coli, o a genes que llevan a cabo una función dentro de la célula hospedadora similar a la del gen de E. coli. Las alteraciones de las funciones de genes de células hospedadoras incluyen eliminar o reducir la función génica mediante una deleción de la secuencia génica que codifica la proteína en su totalidad, o la deleción de una gran porción suficiente del gen, la inserción de una secuencia en el gen, o alterando de otra forma la secuencia del gen, de modo que se produce un nivel reducido de producto génico funcional desde ese gen. Las alteraciones de las
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presente en E. coli K12, y que contiene dos operones transcritos de forma divergente que codifican proteínas implicadas en la captación y utilización de hemo: el operón de chuAS y el operón chuTWXYUhmuV. Este segmento genómico se encuentra en E. coli CFT073 e incluye la secuencia de referencia de NCBI NC_004431.1 (20-ENE2012) desde la posición 4.084.974 a 4.093.975. La transformación con el gen chuA (por ejemplo, nº de id. del gen de NCBI 1037196), que codifica un receptor específico de hemina en la membrana externa, era suficiente para conferir a una cepa de E. coli obtenida a partir de K12, la capacidad para crecer sobre hemina como fuente de hierro (Torres y Payne, "Haem iron-transport system in enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157:H7", Mol Microbiol 1997 Feb; 23(4): 825-833). Además de ChuA, algunos otros receptores de hemo heterólogos pueden permitir que cepas de E. coli obtenidas a partir de K12 capten el grupo hemo: Yersinia enterocolitica HemR, Serratia marcescens HasR y Shigella dysenteriae Shua; y a partir de bacterias Gram-negativas: Bordatella pertussis y B. bronchiseptica y Bhur, Pseudomonas aeruginosa Phur y P. fluorescens PfhR. La proteína ChuS también está involucrada en la utilización de hemo: es una hemo oxigenasa degradante de hemo. En una cepa de E. coli aroB, que es deficiente en la síntesis de la molécula enterobactina quelante de hierro, la transformación con chuS era útil para reducir la toxicidad celular causada por el crecimiento sobre hemina en ausencia de enterobactina. La transcripción de los operones chuAS y chuTWXYUhmuV, y varios otros operones que están involucrados en el metabolismo del hierro y presentes en las cepas de E. coli K12, está inhibida por el regulador transcripcional de E. coli Fur, cuando se asocia con Fe2+; la transcripción de estos genes se activa por tanto cuando hay una caída en la concentración intracelular de iones de hierro.
Células hospedadoras tales como cepas de E. coli obtenidas a partir de K12 se pueden alterar para que puedan captar hemo mediante transformación del mismo con la totalidad o parte de la región de chuAS -chuTWXYUhmuV que contiene al menos chuA, o con el operón chuAS, que incluye opcionalmente genes adicionales procedentes del operón chuTWXYUhmuV. En realizaciones en las que el promotor que dirige la transcripción de chuA se puede inhibir con Fur, la represión con Fur se puede eliminar o reducir delecionando el gen de la célula hospedadora que codifica Fur, cultivando las células hospedadoras en ausencia de hierro libre, cultivando las células hospedadoras en presencia de un agente quelante de iones de hierro libres tal como EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), o mediante la transformación de las células con estructuras artificiales de polinucleótidos (tales como plásmidos mantenidos con un número de copias elevado) que comprenden múltiples copias del sitio de unión a Fur, para reducir la cantidad de complejo Fur-Fe2+ disponible inhibir operones del metabolismo del hierro. En una realización preferida, una estructura artificial de expresión se introduce en la célula hospedadora, en donde la estructura artificial de expresión comprende un polinucleótido que codifica ChuA y, opcionalmente, también codifica ChuS, bajo el control transcripcional de un promotor constitutivo.
Entorno de reducción-oxidación de una célula hospedadora. Muchos productos génicos multímeros, tales como anticuerpos, contienen enlaces disulfuro. El citoplasma de E. coli y de muchas otras células se mantiene normalmente en un estado reducido a través de los sistemas enzimáticos de tiorredoxina y glutarredoxina/glutatión. Esto impide la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma, y las proteínas que necesitan enlaces disulfuro se exportan al periplasma en donde la formación de enlaces disulfuro y la isomerización están catalizadas por el sistema de Dsb, que comprende DsbABCD y DsbG. El aumento de la expresión de la cisteína oxidasa DsbA, la disulfuro isomerasa DsbC o combinaciones de las proteínas Dsb, las cuales se transportan todas normalmente al periplasma, se ha utilizado en la expresión de proteínas heterólogas que requieren enlaces disulfuro (Makino et al., "Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria", Microb Cell Fact 2011 May 14; 10:32). También es posible expresar formas citoplasmáticas de estas proteínas Dsb, tales como una versión citoplásmica de DsbC ('cDsbC'), que carece de un péptido señal y por lo tanto no se transporta al periplasma. Proteínas Dsb citoplasmáticas tales como cDsbC son útiles para hacer el citoplasma de la célula hospedadora más oxidante y, por lo tanto, más propicio para la formación de enlaces disulfuro en proteínas heterólogas producidas en el citoplasma. El citoplasma de la célula hospedadora también se puede hacer más oxidante alterando directamente los sistemas enzimáticos de tiorredoxina y glutarredoxina/glutatión: cepas mutantes defectuosas para la glutatión reductasa (gor) o glutatión sintetasa (gshB), junto con la tiorredoxina reductasa (trxB), vuelven el citoplasma oxidante. Estas cepas son incapaces de reducir ribonucleótidos y, por lo tanto, no pueden crecer en ausencia de un agente reductor exógeno, tal como ditiotreitol (DTT). Mutaciones supresoras (ahpC*) en el gen ahpC, que codifica la peroxirredoxina AhpC, lo convierten en una disulfuro reductasa que genera glutatión reducido, lo que permite la canalización de electrones a la enzima ribonucleótido reductasa y permite que las células defectuosas para gor y trxB, o defectuosas para gshB y trxB, crezcan en ausencia de DTT. Una clase diferente de formas mutadas de AhpC puede permitir que las cepas defectuosas en la actividad gamma-glutamilcisteína sintetasa (gshA) y defectuosas en trxB, crezcan en ausencia de DTT; estas incluyen AhpC V164G, AhpC S71F, AhpC E173/S71F, AhpC E171Ter y AhpC dup162-169 (Faulkner et al., "Functional plasticity of a peroxidase allows evolution of diverse disulfide-reducing pathways", Proc Natl Acad Sci U S A 2008 May 6; 105(18): 6735-6740, Epub 2008 May 2). En tales cepas con citoplasma oxidante, las cisteínas proteicas expuestas se oxidan fácilmente en un proceso que está catalizado por tiorredoxinas, en una inversión de su función fisiológica, lo que da lugar a la formación de enlaces disulfuro.
Otra alteración que se puede realizar en las células hospedadoras es expresar la sulfhidrilo oxidasa Erv1p desde el espacio de la membrana interna de las mitocondrias de levadura en el citoplasma de la célula hospedadora, lo que se ha observado que aumenta la producción de una variedad de complejos, proteínas enlazadas a disulfuro de origen eucariota en el citoplasma de E. coli, incluso en ausencia de mutaciones en gor o trxB (Nguyen et al., "Preexpression of a sulfhydryl oxidase significantly increases the yields of eukaryotic disulfide bond containing proteins
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expressed in the cytoplasm of E. coli" Microb Cell Fact 2011 Jan 7; 10:1). Las células hospedadoras que comprenden estructuras artificiales con coexpresión inducible, preferiblemente también expresan cDsbC y/o Erv1p, que son deficientes en la función del gen trxB, también son deficientes en la función génica de cualquiera entre gor, gshB o gshA, y expresan una forma mutante adecuada de AhpC, de modo que las células hospedadoras se pueden cultivar en ausencia de DTT.
Glicosilación de productos génicos de polipéptidos. Las células hospedadoras pueden tener alteraciones en su capacidad para glicosilar polipéptidos. Por ejemplo, las células hospedadoras eucarióticas pueden haber eliminado o reducido la función génica en los genes de glicosiltransferasa y/o oligosacariltransferasa, impidiendo una glicosilación eucariótica normal de los polipéptidos para formar glicoproteínas. Las células hospedadoras procariotas tales como E. coli, que normalmente no glicosilan polipéptidos, se pueden alterar para expresar un conjunto de genes eucariotas y procariotas que proporcionan una función de glicosilación (DeLisa et al., "Glycosylated protein expression in prokaryotes", documento WO2009089154A2, 2009 Jul 16).
Cepas de células hospedadoras disponibles con funciones génicas alteradas. Para crear cepas preferidas de células hospedadoras que se van a utilizar en los sistemas de coexpresión inducible y los métodos de la invención, es útil comenzar con una cepa que ya comprende las alteraciones genéticas deseadas (Tabla 3).
Tabla 3. Cepas de células hospedadoras
Cepa:
Genotipo: Fuente:
E. coli TOP10
FmcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG λ- Invitrogen Life Technologies nº de catálogo C4040-10, C4040-03, C4040-06, C4040-50 y C4040-52
E. coli Origami™ 2
Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F′[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxB (StrR, TetR) Merck (EMD Millipore Chemicals) nº de catálogo 71344
E. coli SHuffle® Express
fhuA2 [lon] ompT ahpC gal λatt::pNEB3-rlcDsbC (Spec, lacI) ΔtrxB sulA11 R(mcr73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb210::Tn10--TetS) endA1 Δgor Δ(mcrC-mrr)114::IS10 New England Biolabs nº de catálogo C3028H
Métodos para alterar las funciones génicas de células hospedadoras. Existen muchos métodos conocidos en la técnica para la realización de alteraciones en genes de células hospedadoras con el fin de eliminar, reducir o cambiar la función génica. Los métodos para realizar alteraciones específicas de genes en células hospedadoras tales como E. coli y otras procariotas, han sido descritos (Muyrers et al., "Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination", Nucleic Acids Res 1999 Mar 15; 27(6): 1555-1557; Datsenko y Wanner, "Onestep inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 6; 97(12): 6640-6645), y los kits para el uso de métodos similares de recombinación Red/ET están comercialmente disponibles (por ejemplo, el kit de deleción de genes en E. coli Quick & Easy de Gene Bridges GmbH, Heidelberg, Alemania). En una realización de la invención, la función de uno o varios genes de las células hospedadoras se elimina o se reduce mediante la identificación de una secuencia de nucleótidos dentro de la secuencia que codifica el gen que se va a alterar, tal como una de las secuencias codificadoras de la subcepa MG1655 de E. coli K-12 incorporada en este documento como referencia, para la ubicación genómica de la secuencia, y más específicamente mediante la selección de dos segmentos adyacentes de 50 nucleótidos cada uno, dentro de esa secuencia codificante. El kit de deleción de genes en E. coli Quick & Easy se utiliza a continuación de acuerdo con las instrucciones del fabricante para insertar una estructura artificial de polinucleótido que contiene un marcador seleccionable entre los segmentos adyacentes seleccionados de la secuencia codificante, eliminando o reduciendo la función normal del gen. Los métodos de recombinación Red/ET también se pueden utilizar para reemplazar una secuencia de promotor con la de un promotor diferente, tal como un promotor constitutivo, o un promotor artificial que se prevé que favorece un cierto nivel de la transcripción (De Mey et al., "Promoter knock-in: a novel rational method for the fine tuning of genes", BMC Biotechnol 2010 Mar 24; 10: 26). La función de los genes de la célula hospedadora también se puede eliminar o reducir por métodos de silenciamiento de ARN (Man et al., "Artificial transencoded small non-coding RNAs specifically silence the selected gene expression in bacteria", Nucleic Acids Res 2011 Apr; 39(8): e50, Epub 2011 Feb 3). Además, mutaciones conocidas que alteran la función génica de la célula hospedadora se pueden introducir en las células hospedadoras a través de métodos genéticos tradicionales.
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Sistemas de coexpresión inducible de la invención
Los sistemas de coexpresión inducible de la invención implican células hospedadoras que comprenden dos o más estructuras artificiales de expresión, en donde las estructuras artificiales de expresión comprenden promotores inducibles que dirigen la expresión de productos génicos, y las células hospedadoras tienen funciones alteradas de genes que permiten una expresión inducible homogénea de los productos génicos. La Fig. 1 muestra una representación esquemática de un sistema de coexpresión inducible de la invención, con los siguientes componentes: (1) célula hospedadora, (2) genoma del hospedador (incluyendo las alteraciones genéticas), (3) un vector de expresión 'X' que comprende un promotor inducible que dirige la expresión de un producto génico, (4) un vector de expresión diferente 'Y' que comprende un promotor inducible que dirige la expresión de otro producto génico, (5) inductores químicos de la expresión y (6) producto de coexpresión multímera.
La Fig. 2 muestra una representación esquemática de un ejemplo particular de un sistema de coexpresión inducible de la invención, que emplea el promotor araBAD sobre un vector de expresión pBAD24 en combinación con un promotor inducible con propionato (promotor prpBCDE) sobre un vector de expresión pPRO33 (documento de Patente de EE.UU. nº 8178338 B2, 15 mayo de 2012; Keasling, Jay), en una célula hospedadora E. coli que alberga las alteraciones genómicas apropiadas que permiten una expresión inducible de forma homogénea. De esta manera, se puede lograr un estrecho control y una optimización de la expresión de cada componente de un producto multímero, para uso en una variedad de aplicaciones de la coexpresión. En esta realización, la célula hospedadora
(1) es la bacteria Gram-negativa Escherichia coli, que se utiliza comúnmente en la técnica para la expresión de proteínas. El genoma del hospedador (2) es el genoma del organismo de la célula hospedadora con mutaciones u otras alteraciones que facilitan la coexpresión inducible de proteínas de forma homogénea, incluyendo la expresión de una forma citoplásmica de la disulfuro isomerasa DsbC que carece de un péptido señal. En una realización, las alteraciones genómicas incluyen tanto una mutación que inactiva el operón araBAD como la expresión de araE y araFGH desde promotores constitutivos, o una mutación puntual en el gen lacY (A117C) en un fondo que carece de araEFGH, para facilitar una inducción homogénea de promotores ara basados en plásmidos con L-arabinosa aplicada de forma exógena, y también un gen del metabolismo del propionato inactivado, prpD, para facilitar una inducción homogénea de promotores de propionato basados en plásmidos, con propionato aplicado de forma exógena, que se convierte en 2-metilcitrato in vivo. Otras alteraciones genómicas que son útiles para el sistema de coexpresión inducible y que se pueden introducir en la célula hospedadora, incluyen, sin limitación: una inactivación dirigida del operón scpA-argK-scpBC, para reducir la expresión de fondo desde el promotor prpBCDE; una expresión del regulador transcripcional (prpR) para la fuente de carbono menos preferida (propionato) desde un promotor inducible con L-arabinosa tal como el promotor araBAD, y/o una función génica eliminada o reducida para genes implicados en el sistema CCR, como crr y/o ptsG, para evitar la supresión mediante el sistema CCR de una inducción con propionato en presencia de L-arabinosa; reducciones del nivel de la función génica para la glutatión reductasa (gor) o la glutatión sintetasa (gshB), junto con la tiorredoxina reductasa (trxB) y/o la expresión de la sulfhidrilo oxidasa Erv1p mitocondrial de levadura en el citoplasma de la célula hospedadora, para proporcionar un entorno reductor menos fuerte en el citoplasma de la célula hospedadora y favorecer la formación de enlaces disulfuro; aumento de los niveles de expresión, por ejemplo, desde un promotor constitutivo fuerte, de proteínas chaperonas tales como DnaK/DnaJ/GrpE, DsbC/DsbG, GroEL/GroES, IbpA/IbpB, Skp, Tig (factor desencadenante) y/o FkpA; y otras mutaciones para reducir la actividad de proteasas endógenas (tal como la de las proteasas Lon y OmpT) y actividades de recombinasa.
Como se muestra en la Fig. 2, dos vectores de expresión compatible (3, 4) se mantienen en la célula hospedadora para permitir una expresión simultánea (coexpresión) de dos productos génicos diferentes. En esta realización, un vector de expresión (“vector de expresión inducido con L-arabinosa”) contiene un promotor inducido con Larabinosa, y es similar o idéntico a pBAD o plásmidos relacionados en los que un promotor araBAD dirige la expresión de una secuencia de expresión insertada, clonada en el sitio de clonación múltiple (MCS). El vector de expresión inducido con L-arabinosa también contiene una secuencia que codifica un gen de resistencia a antibióticos (tal como el gen Tn3 bla, que codifica la beta-lactamasa y confiere resistencia a la ampicilina) para facilitar la selección de células hospedadoras (colonias bacterianas) que contienen un vector de expresión intacto. Se requiere un origen de replicación (ORI) para la propagación del plásmido dentro de las células hospedadoras bacterianas. El plásmido de expresión inducida con L-arabinosa también contiene una secuencia de polinucleótidos que codifica araC, un regulador transcripcional que permite la inducción con L-arabinosa del promotor araBAD y a través de represión transcripcional reduce la expresión de fondo "con fugas" en el estado no inducido. El otro vector de expresión ("vector de expresión inducido con propionato") es similar o idéntico a pPRO o a plásmidos relacionados, en los que un promotor de expresión inducido con propionato dirige la expresión de una secuencia de expresión insertada, clonada en el sitio de clonación múltiple (MCS). El plásmido también contiene una secuencia que codifica un gen de resistencia a antibióticos (tal como el gen cat, que codifica la cloranfenicol acetiltransferasa, que confiere resistencia al cloranfenicol) para facilitar la selección de las células hospedadoras que contienen un vector de expresión intacto. Se requiere un origen de replicación (ORI) para la propagación del plásmido dentro de las células hospedadoras bacterianas. Además, el vector de expresión inducido con propionato contiene una secuencia de polinucleótidos que codifica prpR, un regulador transcripcional que permite la inducción con propionato (2metilcitrato) del promotor prpBCDE y reduce la expresión de fondo "con fugas" en el estado no inducido. Para facilitar una valoración por separado de la inducción, una compatibilidad de los plásmidos y la copropagación de los
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vectores de expresión, es útil que los vectores de expresión contengan promotores que respondan a diferentes inductores, orígenes de replicación compatibles y diferentes marcadores de resistencia a antibióticos. En una realización de la invención, un pBAD24 o un vector de expresión relacionado (pMB1 o 'pBR322' ORI, AmpR) que contiene un promotor araBAD inducible con L-arabinosa, se combina en una célula hospedadora con un pPRO33 o un vector de expresión relacionado (p15A ORI, CmR) que contiene un promotor prpBCDE inducible con propionato. Los vectores de expresión se propagan conjuntamente y se mantienen utilizando medio de crecimiento complementado con ampicilina y cloranfenicol. En una realización, un vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa, y el otro vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo de longitud completa, estando clonada cada secuencia codificadora en marco en el MCS del vector de expresión respectivo. Para la producción de ciertos productos génicos tales como anticuerpos, la optimización de la secuencia codificadora para el organismo hospedador (incluyendo el ajuste para el sesgo de codones y contenido en GC, entre otras consideraciones) determinará las secuencias codificadoras que se van a insertar en las estructuras artificiales de expresión del sistema de coexpresión.
Haciendo referencia de nuevo a la Fig. 2, la coexpresión de productos génicos es inducida por metabolitos químicos no costosos, aplicados exógenamente, L-arabinosa y propionato (5). El nivel de inducción de la expresión de cada producto génico se valora de forma independiente con su propio inductor químico, facilitando de este modo la optimización de la coexpresión de proteínas. Esto es útil para la expresión de complejos proteicos y proteínas que requieren una pareja de unión para la estabilización, y puede facilitar la expresión de proteínas que son difíciles de expresar de otro modo, tales como las que tienen una mala solubilidad o toxicidad celular. En este ejemplo, después de la inducción, las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos se expresan cada una por separado, a continuación, las proteínas se unen y forman puentes disulfuro intercatenarios (dentro del citoplasma de la bacteria hospedadora), lo que permite la formación y estabilización de un anticuerpo de longitud completa, compuesto por las cadenas pesadas y ligeras. Las proteínas se pueden dirigir a distintos compartimentos del organismo hospedador. Por ejemplo, en E. coli la proteína se puede expresar en el citoplasma, la membrana celular, el periplasma o se puede secretar en el medio. Después de un tiempo de incubación apropiado, se recogen las células y los medios, y la proteína total extraída, que incluye los productos génicos coexpresados (6). Después de la extracción, el producto deseado se puede purificar utilizando una serie de métodos bien conocidos en la técnica, dependiendo de la naturaleza de los productos génicos que se producen en el sistema de coexpresión (por ejemplo cromatografía líquida). En el ejemplo mostrado en la Fig. 2, el producto multímero (anticuerpo de longitud completa) se extrae y se purifica utilizando métodos cromatográficos. El anticuerpo intacto purificado se visualiza sobre un gel no desnaturalizante usando técnicas convencionales, incluyendo colorantes que se unen a proteínas o inmunohistoquímica. El producto de anticuerpo de longitud completa se puede utilizar entonces para una serie de aplicaciones en investigación, diagnóstico u otras aplicaciones.
Productos preparados por los métodos de la invención
Existe una amplia versatilidad en la utilización de los sistemas de coexpresión inducible de la presente invención en numerosas aplicaciones de la coexpresión, y en las propiedades de los productos.
Glicosilación. Los productos génicos coexpresados por los métodos de la invención pueden estar glicosilados o no. En una realización de la invención, los productos génicos coexpresados son polipéptidos. Los polipéptidos glicosilados son polipéptidos que comprenden un grupo glicosilo fijado covalentemente, e incluyen polipéptidos que comprenden todos los grupos glicosilo que están fijados normalmente a determinados residuos de ese polipéptido (polipéptidos totalmente glicosilados), polipéptidos parcialmente glicosilados, polipéptidos con glicosilación en uno o varios residuos, en donde la glicosilación no se produce normalmente (glicosilación alterada), y polipéptidos glicosilados con al menos un grupo glicosilo que difiere en la estructura del grupo glicosilo que está fijado normalmente a uno o varios residuos especificados (glicosilación modificada). Un ejemplo de glicosilación modificada es la producción de polipéptidos "desfucosilados" o "carentes de fucosa", polipéptidos que carecen de restos de fucosilo en los grupos glicosilo fijados a ellos, mediante la expresión de polipéptidos en células hospedadoras que carecen de la capacidad de fucosilar polipéptidos. Los polipéptidos no glicosilados son polipéptidos que no comprenden un grupo glicosilo unido covalentemente. Un polipéptido no glicosilado puede ser el resultado de la desglicosilación de un polipéptido, o de la producción de un polipéptido aglicosilado. Los polipéptidos desglicosilados se pueden obtener mediante polipéptidos glicosilados que están desglicosilados enzimáticamente, mientras que los polipéptidos aglicosilados se pueden producir mediante la expresión de polipéptidos en células hospedadoras que no tienen la capacidad de glicosilar polipéptidos, tales como las células procariotas o células en las que la función de al menos una enzima de glicosilación se ha eliminado o reducido. En una realización particular, los polipéptidos coexpresados están aglicosilados, y en una realización más específica, los polipéptidos aglicosilados se coexpresan en células procariotas tales como E. coli.
Otras modificaciones de productos génicos. Los productos génicos coexpresados por los métodos de la invención se pueden unir covalentemente a otros tipos de moléculas. Ejemplos de moléculas que pueden unirse covalentemente a los productos génicos coexpresados, sin limitar el alcance de la invención, incluyen polipéptidos (tales como receptores, ligandos, citocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptídicas, dominios de unión a ADN, dominios de interacción con proteínas, tales como dominios PDZ, dominios de cinasa, anticuerpos y fragmentos de cualquiera de tales polipéptidos); polímeros solubles en agua (tales como polietilenglicol (PEG),
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secundario con los siguientes componentes: epítopo, anticuerpo primario, anticuerpo secundario y sistema de detección. El epítopo es una porción de un antígeno (por lo general una proteína) que es el determinante antigénico que produce una respuesta inmunológica cuando se introduce en un animal vivo o puede ser reconocido de otra manera por un anticuerpo. En la práctica, el epítopo de interés puede estar presente dentro de una mezcla o un tejido. En una realización, el epítopo es una proteína expresada en células de carcinoma en el tejido humano. El anticuerpo primario es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo aislado de longitud completa (monoclonal), o una mezcla de diferentes anticuerpos de longitud completa (policlonales), que reconoce y se une al epítopo, y preferiblemente se une específicamente al epítopo. Un anticuerpo de longitud completa en este ejemplo comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas y dos cadenas polipeptídicas ligeras, unidas por puentes disulfuro. Cada una de las cadenas comprende una región constante (Fc) y una región variable (Fv). Hay dos sitios de unión a antígeno en el anticuerpo de longitud completa. En una realización de la presente invención, el anticuerpo primario es un anticuerpo aglicosilado de longitud completa (tal como el producido en un sistema de expresión basado en E. coli) que reconoce y se une a un epítopo de interés. El anticuerpo secundario es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo aislado de longitud completa (monoclonal), o una mezcla de diferentes anticuerpos de longitud completa (policlonales), que reconoce y se une al anticuerpo primario aglicosilado, y preferiblemente se une específicamente al anticuerpo primario aglicosilado. En una realización de la presente invención, el anticuerpo secundario es un anticuerpo de longitud completa que reconoce y se une a la porción Fc aglicosilada de un anticuerpo primario de longitud completa. En este caso, los sitios de unión al anticuerpo se seleccionan y/o se modifican genéticamente para reconocer específicamente la porción Fc del anticuerpo primario aglicosilado, con o sin el residuo de lisina Cterminal. En otras realizaciones, el anticuerpo secundario se podría modificar genéticamente para reconocer regiones adicionales (epítopos) del anticuerpo primario aglicosilado, o epítopos adicionales modificados genéticamente, incluyendo pero no limitados a secuencias de polipéptidos fijadas covalentemente al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se puede dirigir a sitios únicos o múltiples (epítopos) presentes en moléculas aglicosiladas de anticuerpos de longitud completa (incluyendo diversas clases de inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA, etc.) o fragmentos de anticuerpos, tales como Fab o Fc. Por lo tanto, algunos anticuerpos secundarios generados de esta forma, tendrían una amplia especificidad para cualquier anticuerpo aglicosilado de longitud completa. Los anticuerpos primarios y secundarios de la presente invención también pueden incluir los producidos por métodos tradicionales (producción de anticuerpos policlonales usando conejos inmunizados o producción de anticuerpos monoclonales usando hibridomas de ratón) y tecnología de ADN recombinante, tal como los métodos de presentación en fagos para identificar polipéptidos que se unen a antígeno.
Los sistemas de detección comprenden generalmente un agente que está ligado a o que se une al anticuerpo secundario, lo que permite una detección, visualización y/o cuantificación del anticuerpo secundario. Se conocen bien en la técnica diversos sistemas de detección, incluyendo pero no limitados a colorantes fluorescentes, enzimas, isótopos radiactivos o metales pesados. Estos pueden implicar o no una conexión física directa de polipéptidos adicionales con el anticuerpo secundario. Las aplicaciones de este sistema de anticuerpos secundarios incluyen, pero no se limitan a la inmunohistoquímica, transferencia de tipo Western y ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Por ejemplo, en una realización para uso en inmunohistoquímica, el epítopo de interés estará presente en una sección delgada de tejido, a continuación, un anticuerpo primario aglicosilado se aplica al tejido y se permite la unión con el epítopo. El anticuerpo primario no unido se elimina, y después un anticuerpo secundario capaz de unirse específicamente con el anticuerpo primario aglicosilado, se aplica al tejido y se permite que se una con el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario no unido se retira, y después se aplican los reactivos del sistema de detección. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario se uniera con una enzima, entonces sustratos enzimáticos con coloración se aplicarían al tejido y se dejaría que reaccionaran. Entonces se podría realizar una visualización microscópica o fluoroscópica directa de los sustratos enzimáticos reactivos. Otros métodos de detección son bien conocidos en la técnica. Las ventajas de un sistema que utiliza anticuerpos secundarios que reconocen anticuerpos aglicosilados incluyen, sin limitación, las siguientes: 1) aumento de la especificidad en la inmunohistoquímica debido a que el anticuerpo secundario está diseñado para unirse a la porción Fc aglicosilada del anticuerpo primario que no está presente de otro modo en los tejidos eucariotas; 2) disminución de la tinción de fondo debido a una mayor especificidad hacia el anticuerpo primario; 3) disminución de los costes de producción del sistema de anticuerpos secundarios debido a que los anticuerpos primarios y/o secundarios se pueden generar en procariotas tales como E. coli; y 4) se evita la utilización innecesaria de mamíferos, incluyendo ratones y conejos, ya que todo el proceso de desarrollo de los anticuerpos se puede realizar en procariotas tales como E. coli.
Enzimas utilizadas en aplicaciones industriales. Muchos procesos industriales emplean enzimas que se pueden producir por los métodos de la invención. Estos procesos incluyen el tratamiento de aguas residuales y otros procesos de biorremediación y/o descontaminación; blanqueo de materiales en la industria papelera y textil; y degradación de la biomasa en material que se puede fermentar de manera eficaz en biocombustibles. En muchos casos, sería deseable producir enzimas para estas aplicaciones en células hospedadoras microbianas o preferiblemente en células hospedadoras bacterianas, pero la enzima activa es difícil de expresar en grandes cantidades debido a problemas con el plegamiento de la enzima y/o el requisito de un cofactor. En las siguientes realizaciones de la invención, los métodos de coexpresión inducible de la invención se usan para producir enzimas con aplicaciones industriales.
Enzimas que emplean arabinosa y xilosa. La D-xilosa es la pentosa más abundante en la biomasa vegetal, que se encuentra en polisacáridos, hemicelulosa y pectina, siendo la L-arabinosa la segunda pentosa más abundante. Para
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el desarrollo y la producción de biocarburantes y otros bioproductos, es útil convertir D-xilosa y L-arabinosa en hexosas, tales como glucosa y fructosa, ya que las hexosas fermentan de manera más eficaz en biocombustibles tales como el etanol. Como se ha descrito anteriormente, el operón araBAD de E. coli codifica proteínas que metabolizan la L-arabinosa del modo siguiente: L-arabinosa con L-arabinosa isomerasa (AraA, EC 5.3.1.4) a Lribulosa; L-ribulosa con L-ribulocinasa (AraB, EC 2.7.1.16) a L-ribulosa-fosfato; L-ribulosa-fosfato con L-ribulosa-5fosfato 4-epimerasa (AraD, EC 5.1.3.4) a D-xilulosa-5-fosfato (también denominada D-xilulosa-5-P), que forma parte de la vía de la pentosa fosfato para la formación de fructosa y glucosa. Otra vía enzimática (una "vía oxo-reductora") que convierte la L-arabinosa en xilitol, que luego se puede convertir en D-xilulosa-5-P, es del modo siguiente: Larabinosa con L-arabinosa/D-xilosa reductasa (EC 1.1.1.21) a L-arabinitol; L-arabinitol con L-arabinitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.12) a L-xilulosa; y L-xilulosa con L xilulosa reductasa (EC 1.1.1.10) a xilitol. El operón xylAB de E. coli codifica una vía enzimática (la "vía isomerasa") para la utilización de D-xilosa, del modo siguiente: D-xilosa con D-xilosa isomerasa (XylA, EC 5.3.1.5) a D-xilulosa; D-xilulosa con xilulocinasa (XylB, EC 2.7.1.17) a Dxilulosa-5-P. Otra vía enzimática (una "vía oxo-reductora") para la conversión de D-xilosa en D-xilulosa-5-P es: Dxilosa con D-xilosa reductasa (EC 1.1.1.21) a xilitol; xilitol con xilitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.9) a D-xilulosa; Dxilulosa con xilulocinasa (XylB, EC 2.7.1.17) a D-xilulosa-5-P. Debido a los diferentes cofactores necesarios en las vías oxo-reductoras, como NADPH, NAD-y ATP, y el grado en que estos cofactores están disponibles para el uso, un desequilibrio puede dar lugar a una sobreproducción de subproducto xilitol. D-xilulosa-5-P más eritrosa 4-fosfato se pueden convertir mediante una transcetolasa (EC 2.2.1.1) en gliceraldehído 3-fosfato más fructosa 6-fosfato.
Los métodos de coexpresión inducible de la invención se pueden usar para producir enzimas que utilizan arabinosa y xilosa, que se definen como las enzimas que se mencionan con el número EC en el párrafo anterior. El número EC (o "Comisión de Enzimas", EC del inglés “Enzyme Commission”) para cada enzima se estableció por la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBBM). Más información sobre estas enzimas y ejemplos específicos de las mismas se puede obtener fácilmente a través de la base de datos de proteínas UniProt (www.uniprot.org/uniprot) y la base de datos BRENDA, (www.brenda-enzymes.org/index). En algunas realizaciones una enzima que emplea arabinosa y xilosa se coexpresa con una proteína chaperona; en realizaciones adicionales de la invención, una enzima que emplea arabinosa o xilosa se coexpresa con un transportador para un cofactor. En ciertas realizaciones, la L-arabinosa isomerasa (AraA, EC 5.3.1.4) o la L arabinosa reductasa (EC 1.1.1.21) es producida por los métodos de la invención; en estas realizaciones, un promotor inducible con arabinosa no se utiliza en ninguna estructura artificial de expresión debido a que el inductor, L-arabinosa, se convertiría en L-ribulosa o Larabinitol, respectivamente. Para la producción de enzimas que emplean arabinosa, distintas de L-arabinosa isomerasa (AraA, EC 5.3.1.4) o L-arabinosa reductasa (EC 1.1.1.21), un promotor inducible con arabinosa se puede utilizar si la célula hospedadora carece de EC 5.3.1.4 y/o EC 1.1.1.21, tal como un mutante araA, y no puede catabolizar la L-arabinosa. Del mismo modo, en realizaciones en las que la D-xilosa isomerasa (XylA, EC 5.3.1.5) o D-xilosa reductasa (EC 1.1.1.21) se produce por los métodos de la invención, un promotor inducible con xilosa no se utiliza en ninguna estructura artificial de expresión porque el inductor, D-xilosa, se convierte en D-xilulosa o xilitol, respectivamente. Para la producción de enzimas que emplean xilosa, distintas de la D-xilosa isomerasa (XylA, EC 5.3.1.5) o D-xilosa reductasa (EC 1.1.1.21), un promotor inducible con xilosa se puede utilizar si la célula hospedadora carece de EC 5.3.1.5 y/o EC 1.1.1.21, tal como un mutante de xylA, y no puede catabolizar la D-xilosa.
La xilosa isomerasa (XylA, EC 5.3.1.5) es una enzima que se encuentra en microorganismos, hongos anaerobios y plantas, que cataliza la interconversión de un azúcar aldo (D-xilosa) a un azúcar ceto (D-xilulosa). También puede isomerizar D-ribosa a D-ribulosa y D-glucosa a D-fructosa. Esta enzima pertenece a la familia de las isomerasas, específicamente a las oxidorreductasas intramoleculares que interconvierten aldosas y cetosas. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es D-xilosa aldosa-cetosa-isomerasa. Otros nombres de uso común incluyen D-xilosa isomerasa, D-xilosa cetoisomerasa, D-xilosa cetol-isomerasa y glucosa isomerasa. La enzima se utiliza industrialmente para convertir glucosa en fructosa en la fabricación de jarabe de maíz con alto contenido en fructosa y, como se ha descrito anteriormente, se puede utilizar en la conversión de pentosas a hexosas para la producción de biocombustible. La xilosa isomerasa es un homotetrámero y requiere dos cationes divalentes -Mg2+, Mn2+ y/o Co2+ -para una actividad máxima. La actividad xilosa isomerasa se puede medir usando un ensayo con arabitol deshidrogenasa ligado a NADH (Smith et al., "D-Xylose (D-glucose) isomerase from Arthrobacter strain N.R.R.L. B3728. Purification and properties", Biochem J 1991 Jul 1; 277 (Pt 1): 255-261), en el que una unidad de actividad xilosa isomerasa es la cantidad de enzima que convierte 1 micromol de D-xilosa en D-xilulosa en un minuto. En al menos algunas especies, la xilosa isomerasa requiere magnesio (o manganeso en el caso de plantas) para su actividad, aunque el cobalto puede ser necesario para estabilizar la estructura tetrámera de la enzima. Cada subunidad de xilosa isomerasa contiene un barril alfa/beta plegado de forma similar a la de otras enzimas TIM divalentes con barril (triosafosfato isomerasa) que dependen de metal, y la parte C-terminal más pequeña forma un plegamiento helicoidal extendido, implicado en la multimerización. Los residuos conservados en todas las xilosa isomerasas conocidas son una histidina en la sección N-terminal de la enzima, que se ha mostrado que está involucrada en el mecanismo catalítico de la enzima, y dos residuos de glutamato, una histidina y cuatro residuos de aspartato que forman los dos sitios de unión a metal, cada uno de los cuales se une a un ion de magnesio, cobalto o manganeso (Katz et al., "Locating active-site hydrogen atoms in D-xylose isomerase: time-of-flight neutron diffraction", Proc Natl Acad Sci USA 2006 May 30; 103(22): 8342-8347; Epub 2006 May 17).
En algunas realizaciones de la invención, la coexpresión inducible se utiliza para expresar una proteína xilosa isomerasa; en ciertas realizaciones, la xilosa isomerasa ("XI") se selecciona a partir del grupo que consiste en: XI de
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microlitros) del cultivo de una noche de BL21 (pBAD24-HC/pPRO33-LC), se utilizaron para inocular 5 ml de medio mínimo M9 con casaminoácidos y 0,2% de glicerol, más 30 microgramos/mL de CAM y 100 microgramos/mL de AMP. Estos cultivos se dejaron crecer hasta que la DO60 era de aproximadamente 0,5: 3,1 horas para las células SHuffle® Express (pBAD24-HC/pPRO33-LC) y 2,5 horas para las células BL21 (pBAD24-HC/pPRO33-LC). Antes de la inducción, se tomaron muestras de control de cada cultivo que había crecido sin inducción. El resto de cultivos celulares de SHuffle® Express (pBAD24-HC/pPRO33-LC) y BL21 (pBAD24-HC/pPRO33-LC) se indujo entonces con la adición de 0,2% de arabinosa y propionato 50 mM, y crecieron en paralelo con las muestras de control no inducidas durante 6 horas. Al final de ese tiempo, se centrifugaron todos los cultivos celulares para sedimentar las células, y se colocaron en un congelador a -80ºC. Los sedimentos celulares se descongelaron sobre hielo, y las células se lisaron usando un kit de lisis bacteriana Qproteome (QIAGEN), según las instrucciones del fabricante, con las excepciones de que se añadió un comprimido de mezcla de inhibidores de proteasas Complete Mini (Roche, Indianapolis, Indiana) a 10 mL de tampón de lisis natural, antes de añadir la lisozima y la nucleasa, y que las muestras se centrifugaron a 25°C en lugar de a 4°C.
Los extractos de proteínas solubles procedentes de las células inducidas y los controles no inducidos se separaron por electroforesis en gel de SDS en condiciones reductoras, en un gel de Bis-Tris al 4-12% de NuPAGE® (Life Technologies, Grand Island, Nueva York). El gel se tiñó usando RAPIDstain® (G-Biosciences, St. Louis, Missouri). Como se muestra en la Figura 3, se observó que una banda de proteína (cadena pesada) migraba a 51 kDa y otra banda de proteína (cadena ligera) a 26 kDa; estas bandas están presentes en las células inducidas, pero no en las células no inducidas. Los mismos extractos de proteínas solubles a partir de células SHuffle® Express y BL21 inducidas y no inducidas que contenían tanto los vectores de expresión inducibles pBAD24-HC como pPRO33-LC, se separaron por electroforesis en gel en condiciones naturales (no reductoras) sobre un gel NOVEX® de Tris-Glicina al 10-20% (Life Technologies). El gel se tiñó usando RAPIDstain® (G-Biosciences). Como se muestra en la Figura 4, una banda de proteína (anticuerpo IgG1 que comprendía las cadenas pesadas y ligeras) migra a 154 kDa; esta banda está presente en las células SHuffle® Express inducidas, pero se reduce significativamente o está ausente en las células BL21 inducidas y en las células no inducidas.
EJEMPLO 2
Caracterización de las estructuras artificiales de expresión y anticuerpos IgG1 de longitud completa producidos en células bacterianas
A. Caracterización de los vectores de expresión
La secuencia de las estructuras artificiales de expresión pBAD24-HC y pPRO33-LC se confirma utilizando los cebadores mostrados en la tabla siguiente, para iniciar las reacciones de secuenciación de terminación de cadena didesoxi, junto con otros cebadores diseñados según sea necesario. La secuencia de nucleótidos del promotor prpBCDE y la región del vector pPRO24 aguas arriba del MCS, como se muestra en la Figura 1C del documento de Patente de EE.UU. nº 8.178.338 B2, se utiliza para diseñar al menos un cebador directo de oligonucleótidos para secuenciar secuencias clonadas en el MCS de los vectores de expresión pPRO.
Tabla 4. Cebadores de oligonucleótidos
Cebador
SEQ ID NO: Secuencia Comentarios
IgG1HC Fc directo
8 5′-TTC ACC ATG GAA GTT TCA TCG GTC TTT ATT TTC CCG -3′ Bases apareadas 780-807 de SEQ ID NO: 5, añadidas al sitio NcoI en el extremo 5′
IgG1HC Fc inverso
9 5′-AGC CAA GCT TTT ATT TAC CCG GCG AGT GGG AC -3′ Emparejamiento en la orientación inversa con las bases 1398-1429 de SEQ ID NO: 6
pBAD24/33 directo
10 5′-CTG TTT CTC CAT ACC CGT T -3′ Localizado entre el promotor pBAD y el MCS en todos los vectores pBAD
pBAD24/33 inverso nº 1
11 5′-CTC ATC CGC CAA AAC AG -3′ Justo aguas abajo de MCS en los vectores pBAD y pPRO, separado del sitio HindIII de MCS por 2 bases (GG)
pBAD24/33
12 5′-GGC TGA AAA TCT TCT CT -3′ Aguas abajo del cebador inverso nº 1 en los
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B. Detección de los anticuerpos de longitud completa de IgG1 de ratón sobre una transferencia Western
Los geles de proteínas utilizados para separar los extractos de proteínas solubles mediante electroforesis (geles Bis-Tris al 4-12% de NuPAGE® o geles Tris-Glicina al 10-20% de NOVEX®), como se describen en el Ejemplo 1, se colocan en un módulo de transferencia XCell II® (Life Technologies, Grand Island, Nueva York). Se aplica corriente al gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante, lo que da lugar a la transferencia de proteínas desde el gel a una membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se incuba entonces con un anticuerpo primario, IgG antiratón, a 4°C durante una noche. La membrana de nitrocelulosa se lava después para eliminar el anticuerpo no unido, y se incuba con un anticuerpo secundario, IgG de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina, durante una hora a temperatura ambiente. La membrana de nitrocelulosa se lava entonces para eliminar el anticuerpo secundario no unido, se incuba con una solución que contiene tetrazolio de nitroazul (NBT) y 5-bromo-4-cloro-indolil-fosfato (BCIP) para teñir la o las bandas de proteínas, y después se lava para eliminar el exceso de solución de tinción.
EJEMPLO 3
Introducción de alteraciones genómicas en células hospedadoras para facilitar la coexpresión
Como se ha descrito anteriormente, ciertos cambios en la expresión génica de la célula hospedadora pueden mejorar la coexpresión del o de los productos génicos deseados. Las siguientes deleciones y alteraciones se realizaron en el genoma de la célula hospedadora de E. coli SHuffle® Express de Gene Bridges GmbH (Heidelberg, Alemania), utilizando un método de modificación por recombinación, descrito como una deleción por contraselección, que elimina perfectamente secuencias genómicas. Una deleción del operón araBAD de la célula hospedadora se realizó para reducir el catabolismo de la arabinosa a través de la célula hospedadora, de manera que estaba disponible más inductor arabinosa para la inducción de un producto génico coexpresado procedente de una estructura artificial de expresión que comprendía el promotor araBAD. Esta deleción elimina 4269 pares de bases del operón araBAD, correspondientes a la posición 70.135 hasta 65.867 (de la cadena negativa) del genoma de E. coli (las posiciones dentro de las secuencias de nucleótidos genómicas se proporcionan como en la Tabla 1), de modo que la mayor parte del promotor natural araBAD a lo largo de casi todos los codones de la región que codifica AraD, se elimina. La secuencia de nucleótidos (cadena negativa) alrededor de la unión en la deleción (posición 70.136 | posición 65.866) es: TTAT I TACG. Otra deleción se realizó dentro del operón sbm-ygfDGH (también llamado scpA-argK-scpBC), eliminando la función de los genes implicados en la biosíntesis de 2metilcitrato, para aumentar la sensibilidad del promotor inducible con propionato de las células hospedadoras, hacia el propionato suministrado exógenamente. La deleción sbm-ygfDGH elimina 5542 pares de bases (posición
3.058.754 hasta 3.064.295 del genoma de E. coli), extrayendo el promotor sbm-ygfDGH y todo el operón excepto el último codón de la secuencia que codifica ygfH, dejando la secuencia adyacente que codifica ygfl y el codón de parada intacto. La secuencia de nucleótidos (cadena positiva) alrededor de la unión en la deleción (posición 3058753 | posición 3064296) es: ACAA I GGGT. Además de estas deleciones realizadas en el genoma de la célula hospedadora de E. coli SHuffle® Express, Gene Bridges GmbH introdujo una mutación puntual en la secuencia genómica que codificaba el gen rpsL, que se extiende en la hebra negativa desde la posición 3.472.574 hasta 3.472.200, cambiando la A en la posición 3.472.447 por una G, alterando el codón de Lys43 a un codón de Arg, lo que da como resultado un fenotipo resistente a la estreptomicina cuando se expresa el gen mutante rpsL-Arg43. Otra alteración del genoma de la célula hospedadora, que permite una expresión inducible controlada más estrechamente como se ha descrito anteriormente, es hacer que el promotor araE sea constitutivo más que sensible a la arabinosa. La mayor parte del promotor araE natural, incluyendo los sitios de unión a CRP-cAMP y AraC, se eliminó mediante la deleción de 97 pares de bases (posición 2.980.335 hasta 2.980.239 (cadena negativa)) y la sustitución de esa secuencia por la secuencia de 35 pares de bases del promotor J23104 constitutivo, con las secuencias de sitios de unión resultantes: TGAA | TTGA← promotor J23104 → TAGC | TTCA. Una célula hospedadora de E. coli, tal como una célula hospedadora de E. coli SHuffle® Express, con cualquiera de estas alteraciones genómicas, o cualquier combinación de las mismas, se puede emplear en la coexpresión inducible de productos génicos.
EJEMPLO 4
Coexpresión inducible de manganeso peroxidasa y proteína disulfuro isomerasa en presencia de grupos hemo
A. Construcción de vectores de expresión
La manganeso peroxidasa ('ΜnΡ'; también denominada peroxidasa dependiente de manganeso) es una enzima que permite que algunos tipos de hongos degraden la lignina a dióxido de carbono, y median en la oxidación de una amplia variedad de contaminantes orgánicos. Un ejemplo de manganeso peroxidasa es la isoenzima H4 (denominada en este documento "ΜnΡ-Η4") del hongo de pudrición blanca Phanerochaete chrysosporium
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cambio en el codón GAG de Glu a un codón GGT o GGC de Gly en las posiciones 842-844 de SEQ ID NO: 19), o un cambio desde ácido glutámico a asparagina en la posición 262 de SEQ ID NO: 17 (codificado por un cambio en el codón GAG de Glu a un codón GAT o GAC de Asp en las posiciones 851-853 de SEQ ID NO: 19).
La optimización para la expresión en E. coli y la síntesis de polinucleótidos que corresponden a SEQ ID NOs 18, 19 y 22 se llevó a cabo mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA). SEQ ID NO: 18 codifica la proteína MnP-H4, y está diseñada para ser insertada inmediatamente aguas abajo de un promotor, tal como un promotor inducible. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 comienza en su extremo 5' con un sitio de restricción GCTAGC de NheI, y tiene un sitio de unión al ribosoma AGGAGG en los nucleótidos 7 hasta 12 de SEQ ID NO: 18, seguido de la secuencia optimizada que codifica MnP-H4 en los nucleótidos 21 hasta 1130 de SEQ ID NO: 18. Aguas abajo del codón de parada de MnP-H4 está el doble terminador B0015, desde la posición 1142 hasta 1270 de SEQ ID NO: 18, seguido por un sitio de restricción de XbaI, TCTAGA. La secuencia de nucleótidos del doble terminador B0015 se obtuvo a partir de la página web partsregistry.org. SEQ ID NO: 19 codifica ChuA e incluye un promotor constitutivo, por lo que esta estructura artificial de expresión para ChuA se podría colocar en cualquier vector de expresión o en el genoma de la célula hospedadora; debido a que la secuencia que codifica ChuA se ha colocado bajo el control del promotor constitutivo J23104, su transcripción ya no está sujeta a la represión por parte de Fur. En esta realización, SEQ ID NO: 19 comienza en su extremo 5' con un sitio de restricción de XbaI TCTAGA, y está diseñada para ser colocada dentro de un vector de expresión en 3' de las secuencias de SEQ ID NO: 18. Los nucleótidos 7 a 41 de SEQ ID NO: 19 son el promotor constitutivo J23104 y los nucleótidos 50 hasta 61 de SEQ ID NO: 19 son el sitio de unión al ribosoma de B0034, ambos situados aguas arriba de la secuencia que codifica ChuA en los nucleótidos 68 hasta 2047 de SEQ ID NO: 19; las secuencias de nucleótidos de J23104 y B0034 fueron obtenidas a partir de la página web partsregistry.org. SEQ ID NO: 19 termina con un sitio de restricción de SalI GTCGAC. Los sitios de XbaI en SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 permiten que estas secuencias de nucleótidos se liguen entre sí en un sitio de XbaI; la secuencia de nucleótidos de la estructura artificial de expresión MnP-H4 ChuA resultante se muestra en SEQ ID NO: 20. Los sitios NheI y SalI en SEQ ID NOs 18 y 19, respectivamente, y en SEQ ID NO: 20, permiten que la estructura artificial de expresión MnP-H4 ChuA se inserte en un vector de expresión, tal como pPRO33 utilizando los sitios de restricción NheI y SalI en su sitio de clonación múltiple.
Para facilitar la producción de la enzima MnP-H4 correctamente plegada, MnP-H4 se coexpresaba con la proteína chaperona disulfuro isomerasa ('PDI') procedente de Humicola insolens, un hifomiceto del suelo termófilo, celulolítico y saprófito (hongo de pudrición blanda). La secuencia de aminoácidos de la PDI que se coexpresaba se muestra como SEQ ID NO: 21; carece del péptido señal de la proteína natural, de manera que permanece en el citoplasma de la célula hospedadora mientras que se producen los polipéptidos MnP-H4. La secuencia de nucleótidos que codifica PDI también se optimizó para la expresión en E. coli; la estructura artificial de expresión de PDI se muestra como SEQ ID NO: 22. SEQ ID NO: 22 contiene un sitio de restricción de NheI GCTAGC en su extremo 5', un sitio de unión al ribosoma AGGAGG en los nucleótidos 7 a 12, la secuencia que codifica PDI en los nucleótidos 21 hasta 1478, y un sitio de restricción de SalI GTCGAC en su extremo 3'. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 fue diseñada para ser insertada inmediatamente aguas abajo de un promotor, tal como un promotor inducible. Los sitios de restricción de NheI y SalI en SEQ ID NO: 22 se utilizaron para insertarla en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pBAD24.
Las estructuras artificiales de expresión sintetizadas que comprenden SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22, y los vectores pPRO33 y pBAD24, se cortaron con las enzimas de restricción NheI y SalI, y los fragmentos de la estructura artificial de expresión sintetizada se ligaron en los vectores para crear pPRO33-MnP-ChuA y pBAD24-PDI, como se ha descrito inmediatamente antes, y en el Ejemplo 1. Células de E. coli SHuffle® Express (New England Biolabs (o 'ΝΕΒ'), Ipswich, Massachusetts) se cotransformaron con los vectores de expresión resultantes (pPRO33-MnP-ChuA y pBAD24-PDI) usando el método de choque térmico.
B. Coexpresión inducible de manganeso peroxidasa y proteína disulfuro isomerasa en células bacterianas
Las células hospedadoras cotransformadas con los vectores de expresión pPRO33-MnP-ChuA y pBAD24-PDI (células SHuffle® Express (pPRO33-MnP-ChuA/pBAD24-PDI)) se utilizaron para inocular cuatro tubos de agitación, en donde cada uno contenía 5 ml de medio LB más 34 microgramos/mL de CAM y 100 microgramos/mL de AMP. Después de la incubación (a 30°C con agitación rotatoria a 250 rpm) durante 16 horas, se centrifugaron las células a 4000 rpm durante 10 minutos a 4°C, el medio LB se separó por decantación, y las células se resuspendieron en 4 x 400 microlitros de medio mínimo M9 con casaminoácidos y 0,2% de glicerol, además de 34 microgramos/mL de CAM y 100 microgramos/mL de AMP ('M9-CA-gly + CAM + AMP'). A continuación, se añadieron 75 microlitros del volumen combinado de 1,6 ml de células resuspendidas a cada uno de los diez tubos de agitación que contenían 5 ml de M9-CA-gly + CAM + AMP, y se determinó que la DO600 del cultivo resultante era 0,6. La hemina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) se añadió hasta una concentración final de 8 micromolar en todos los tubos, excepto el tubo 1, el control no inducido. Los inductores L-arabinosa y propionato se añadieron a los tubos de 2-10 con las siguientes concentraciones:
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Tubo 1 No inducido (sin hemina, sin propionato, sin arabinosa)
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propionato 50 mM 0,002% de arabinosa
Tubo 3
propionato 25 mM 0,002% de arabinosa
Tubo 4
propionato 12,5 mM 0,002% de arabinosa
Tubo 5
propionato 50 mM 0,01% de arabinosa
Tubo 6
propionato 25 mM 0,01% de arabinosa
Tubo 7
propionato 12,5 mM 0,01% de arabinosa
Tubo 8
propionato 50 mM 0,05% de arabinosa
Tubo 9
propionato 25 mM 0,05% de arabinosa
Tubo 10
propionato 12,5 mM 0,05% de arabinosa
Se indujeron las células a 25°C durante 12 horas con agitación por rotación, a continuación, se centrifugaron y se colocaron en un congelador a -80ºC. Los sedimentos celulares se descongelaron sobre hielo, y se lisaron las células utilizando un kit de lisis bacteriana Qproteome (QIAGEN), según las instrucciones del fabricante; no se añadió una mezcla de inhibidores de proteasas y las muestras se centrifugaron a 4°C. Los extractos de proteínas solubles procedentes de las células inducidas y el control no inducido se separaron por electroforesis en gel de SDS, en condiciones reductoras sobre un gel de Bis-Tris al 10% (Life Technologies, Grand Island, Nueva York). El gel se tiñó usando RAPIDstain® (G-Biosciences). Como se muestra en la Figura 5, el lisado de las células inducidas contenía proteínas correspondientes a PDI (53 kDa) y MnP-H4 (39 kDa), lo que indicaba que estas proteínas se expresaban como proteínas solubles en las células bacterianas. La mayor cantidad de MnP-H4 soluble se producía por inducción con propionato 50 mM y 0,002% de arabinosa (carril 2).
C. Coexpresión inducible de una forma madura alternativa de manganeso peroxidasa junto con proteína disulfuro isomerasa, y medición de la actividad de MnP-H4 [Ejemplo Comparativo]
Los vectores de expresión se prepararon para expresar una versión de MnP-H4 truncada más completamente, denominada MnP-H4_FT, que se corresponde con la versión madura de la proteína MnP-H4 como se describe en Sundaramoorthy et al., 1994 (citado anteriormente). Por tanto, la secuencia de aminoácidos de MnP-H4_FT tiene un residuo de metionina inicial fijado a los aminoácidos 13 hasta 370 de SEQ ID NO: 13, y se proporciona como SEQ ID NO: 23. En este experimento, la secuencia que codifica MnP-H4_FT optimizada para la expresión en E. coli (obtenida a partir de la secuencia que codifica MnP-H4 optimizada, descrita anteriormente), y la secuencia que codifica ChuA, se expresaron en el vector pBAD24, y la secuencia que codifica PDI (optimizada de manera similar para la expresión en E. coli, como se ha descrito anteriormente) se expresó en el vector pPRO33. La estructura artificial de expresión pBAD24-MnP_FT-ChuA se preparó mediante amplificación con PCR de la secuencia que codificaba MnP-H4 y el terminador a partir de un molde que comprendía la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, utilizando el cebadore directo e inverso de SEQ ID NOs 24 y 25, respectivamente. El uso del cebador directo de SEQ ID NO: 24 coloca un sitio de restricción de NcoI y un codón ATG inmediatamente aguas arriba de la secuencia que codifica los aminoácidos 13 hasta 370 de SEQ ID NO: 13, y por lo tanto crea una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de MnP-H4_FT de SEQ ID NO: 23. Las secuencias de la estructura artificial de expresión de ChuA se amplificaron por PCR a partir de un molde que comprendía la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19, utilizando los cebadores directo e inverso de SEQ ID NOs 26 y 27, respectivamente. Los productos de la PCR de MnP-H4_FT y ChuA se cortaron con NcoI y SalI, y con SalI y HindIII, respectivamente, y se purificaron en gel y se ligaron juntos en el vector pBAD24, que se había cortado con NcoI y HindIII, tratado con CIP y purificado en gel. Los productos pBAD24-MnP_FT-ChuA ligados comprenden la secuencia que codifica MnP-H4_FT expresada a partir del promotor pBAD, seguida por el terminador doble B0015, el promotor constitutivo J23104, el sitio de unión al ribosoma B0034 y la secuencia que codifica la proteína ChuA. Esta estructura artificial de expresión pBAD24MnP_FT-ChuA tiene la secuencia de nucleótidos proporcionada en SEQ ID NO: 28.
La estructura artificial de expresión pPRO33-PDI se preparó cortando el vector pPRO33 y la estructura artificial de expresión PDI, optimizada para la expresión en E. coli como se ha descrito anteriormente y que comprendía la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 22, con NheI y SalI, tratando el vector pPRO33 cortado vector con CIP, purificando en gel los fragmentos y ligándolos entre sí. La estructura artificial de expresión pPRO33-PDI resultante tiene la secuencia de nucleótidos proporcionada en SEQ ID NO: 29. Las estructuras artificiales de expresión pBAD24-MnP_FT-ChuA y pPRO33-PDI se utilizaron para cotransformar células E. coli SHuffle® Express (NEB) a 37 grados C durante una noche, para formar células SHuffle® Express (pBAD24-MnP_FT-ChuA/pPRO33-PDI).
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como cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) con una columna de exclusión por tamaño o una columna de intercambio de iones.
E. Ensayo de la actividad manganeso peroxidasa
La cantidad de actividad manganeso peroxidasa en una muestra y, por lo tanto, la concentración de manganeso peroxidasa activa, se puede determinar mediante un ensayo de la capacidad para oxidar 2,6-dimetoxifenol (2,6-DMP) en coerulignona, en presencia de manganeso y peróxido de hidrógeno. El siguiente ensayo es para una muestra de 10 microlitros; cantidades alternativas para una muestra de 1 microlitro se proporcionan entre paréntesis. Se añade lo siguiente a una cubeta espectrofotométrica antes de la adición de la muestra: 0,590 ml de dH2O (0,599 ml de dH2O); 0,1 ml de solución de malonato monohidrato de sal disódica (MDSH) (5 g de MDSH en 60 ml de dH2O, pH 4,5); y 0,1 ml de solución MnSO4 · H2O (0,06 g de MnSO4 · H2O en 90 ml de dH2O). Inmediatamente antes de medir, 0,1 ml de solución 2,6-DMP (0,014 g de 2,6-dimetoxifenol en 90 ml de dH2O) y la muestra de 10 microlitros (1 microlitro) se añade a la cubeta. La cubeta se coloca en el espectrofotómetro y se hace una puesta a cero a 469 nm y, a continuación, se añaden 0,1 ml de H2O2 de nuevo aporte (3,4 microlitros de H2O2 al 30% en 30 ml de dH2O) a la cubeta. El contenido de la cubeta se mezcla pipeteando arriba y abajo tres veces. Un minuto después de la adición de H2O2, se mide la DO a 469 nm. Si la DO es mayor que 0,2, el tamaño de la muestra se reduce a 1 microlitro, o la muestra que se va a medir se diluye; si la DO es inferior a 0,005, el tamaño de la muestra se incrementa a 0,1 ml y el volumen de dH2O se reduce a 0,500 ml, permaneciendo todos los demás volúmenes iguales; a continuación, se repite el ensayo.
La absorbancia medida se utiliza para calcular la concentración de enzima (CE) en Unidades/L, de acuerdo con la siguiente ecuación:
CE [U/L] = (Absorbancia) (Volumen del ensayo [ml] (106 µmol/mol)(1 cm)
(ε1 cm)*(Volumen de la muestra [ml])
en donde ε1 cm = 49600 absorbancia/M·cm·min y la longitud de la vía = 1 cm. La concentración de enzima como se calculó anteriormente se convierte a mg/L, de acuerdo con la siguiente ecuación: CE [mg/L] = concentración de la enzima [U/L] / actividad enzimática específica [U/mg], en donde una actividad enzimática específica estándar para MnP es 160 U/mg. La actividad enzimática específica se calcula para cualquier muestra de MnP, midiendo independientemente la concentración de proteína en la muestra en mg/L, por ejemplo, mediante un análisis espectrofotométrico a 280 nm. Cuando la concentración enzimática (CE) se determina utilizando el ensayo de oxidación de 2,6-DMP anterior, la actividad específica en U/mg se calcula como: CE [U/L] / concentración [mg/L] = actividad específica [U/mg].
EJEMPLO 5
Coexpresión inducible de infliximab [Ejemplo Comparativo]
Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une a TNF-alfa, una citocina inflamatoria, y se utiliza en el tratamiento de afecciones que implican TNF-alfa, tales como enfermedades autoinmunes (enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, psoriasis, etc.). Infliximab se forma a partir de una cadena pesada (secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 30) y una cadena ligera (secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 31); cada una de estas cadenas tiene una secuencia de dominio variable obtenida a partir de anticuerpos anti-TNF-alfa de ratón, y un dominio constante humano. La optimización de codones para la expresión en E. coli y la síntesis de polinucleótidos que codifican SEQ ID NOs 30 y 31 se realizó mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA). La estructura artificial de expresión formada por ligación de la secuencia codificadora optimizada para la cadena pesada de infliximab en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector de expresión pBAD24, es pBAD24-Infliximab_HC, que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 32. La estructura artificial de expresión formada por ligación de la secuencia codificadora optimizada para la cadena ligera de infliximab en el MCS del vector de expresión pPRO33, es pPRO33-Infliximab_LC, que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO:
33. Las estructuras artificiales de expresión pBAD24-Infliximab_HC y pPRO33-Infliximab_LC se usan para transformar células de E. coli SHuffle® Express (NEB) a 37 grados C durante una noche, creando células SHuffle® Express (pBAD24-Infliximab_HC / pPRO33-Infliximab_LC). Estas células se cultivan generalmente como se describe en los Ejemplos 1 y 4, incluyendo la adición de compuestos selectivos tales como ampicilina y/o cloranfenicol, según sea necesario, con la excepción de que el hierro se añade preferiblemente, aunque opcionalmente al medio de crecimiento LB, por ejemplo, en forma de FeSO4·7H2O a una concentración de 3,0 miligramos por litro. Las células se centrifugan y se resuspenden en medio M9, preferiblemente, pero opcionalmente con acetato de etilo (por ejemplo, acetato de sodio al 0,27% (C2H3O2Na)) que se añade como fuente de carbono junto con casaminoácidos (que proporcionan aminoácidos esenciales, además de ser una fuente de carbono), y también preferiblemente, pero opcionalmente con la administración de suplementos de hierro a los medios, como se ha descrito anteriormente, y se cultivan hasta que la densidad óptica (DO600) del cultivo alcanza 0,8. (Véase, Paliy y Gunasekera, "Growth of E. coli BL21 in minimal media with different gluconeogenic carbon sources and salt contents", Appl Microbiol Biotechnol 2007 Jan; 73(5): 1169-1172; Epub 2006 Aug 30; Errata en: Appl Microbiol Biotechnol 2006 Dec; 73(4): 968). En ese momento, las células se inducen por la adición de arabinosa (inicialmente
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44) y el cebador BsaI-PrpR-LC-directo (SEQ ID NO: 48) en estas reacciones da lugar a secuencias que codifican HC y LC que carecen de secuencia señal, a las que se hace referencia como HC_NS (sin señal, del inglés “no signal”) y LC_NS: la secuencia que codifica HC_NS modificada da como resultado un polipéptido HC_NS que tiene un residuo de metionina inicial seguido por los aminoácidos 20 hasta 464 de SEQ ID NO: 2; la secuencia que codifica LC_NS modificada da como resultado un polipéptido LC_NS que tiene un residuo de metionina inicial seguido de un residuo de alanina y después los aminoácidos 21 hasta 239 de SEQ ID NO: 4. A continuación, se llevó a cabo una reacción de PCR adicional en cada conjunto de dos productos de PCR purificados, utilizando los cebadores BsaI-AraC-HCdirecto y HC-BsaI-inverso, y los cebadores BsaI-PrpR-LC-directo y LC-BsaI-inverso, respectivamente, para crear dos productos individuales (AraC-HC_NS, SEQ ID NO: 52 y PrpR-LC_NS, SEQ ID NO: 53) que se purificaron cada uno, se cortaron con BsaI y se ligaron en el vector pJ1231-03C cortado con BfuA1 (PrpR-LC_NS) o el vector pJ1234-03C cortado con BfuA1 (AraC-HC_NS) utilizando la ligasa de ADN de T4, para crear las estructuras artificiales de expresión pJ1231-PrpR-LC_NS y pJ1234-AraC-HC_NS.
Las mezclas de ligasa se transformaron en células de E. coli DH5alfa y se sembraron en placas de agar LB con cantidades suficientes de kanamicina o ampicilina para mantener los plásmidos en las células DH5alfa. La preparación de ADN plasmídico se realizó de acuerdo con métodos convencionales. (De forma opcional, pero preferiblemente, el ADN plasmídico preparado se utiliza en reacciones de secuenciación para confirmar las secuencias de los insertos de plásmidos).
Células INVSc-1 de S. cerevisiae competentes se prepararon usando el kit de transformación S.c. EasyComp® (Life Technologies, nº de catálogo K5050-01) según las instrucciones del fabricante. La cepa INVSc-1 de S. cerevisiae tiene el siguiente genotipo (MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52) y el fenotipo: His-", Leu-, Trp-, Ura-. Resumiendo, una sola colonia de la cepa INVSc-1 se inoculó en 10 ml de medio YPD (contiene, por litro: 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de glucosa) y se dejó crecer durante una noche a 30 grados C en una incubadora con agitación a 250 rpm. Al día siguiente, el cultivo de una noche se diluyó en 10 mililitros de medio YPD de nuevo aporte hasta una DO600 de 0,3 y se dejó crecer hasta que la DO600 alcanzó 0,8. Las células se recogieron por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, las células se resuspendieron en 10 ml de Solución de 1 (solución de lavado) y se recogieron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El material sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en 1 mililitro de Solución 2 (solución de resuspensión), se dividió en partes alícuotas de 50 microlitros y se almacenó a -80 grados C. Para transformar las células de levadura competentes con las estructuras artificiales de expresión, 50 microlitros de las células INVSc-1 competentes se mezclaron con 1,2 microgramos de cada vector de expresión o vector de control y 500 microlitros de Solución 3 (solución de transformación). Luego, las células se mezclaron vigorosamente y se incubaron en un baño de agua a 30 grados C durante 1 hora y se agitaron en vórtice durante 10 segundos cada 15 minutos. Partes alícuotas de 100 y 400 microlitros de las mezclas de transformación se sembraron en placas de agar mínimo SC, en ausencia de reactivo selectivo apropiado. El medio mínimo SC contiene, por litro: 6,7 g de base nitrogenada de levadura, 20 g de glucosa, 0,05 g de ácido aspártico, 0,05 g de histidina, 0,05 g de isoleucina, 0,05 g de metionina, 0,05 g de fenilalanina, 0,05 g de prolina, 0,05 g de serina, 0,05 g de tirosina, 0,05 g de valina, 0,1 g de adenina, 0,1 g de arginina, 0,1 g de cisteína, 0,1 g de leucina (omitida en los medios selectivos -Leu), 0,1 g de lisina, 0,1 g de treonina, 0,1 g de triptófano y 0,1 g de uracilo (omitido en los medios selectivos -Ura). Células INVSc-1 transformadas con pJ1231PrpR-PDI, con pJ1231-PrpR-LC_NS y con el vector de control pJ1231-03C, se seleccionaron sobre placas sin leucina a 30 grados C durante 48-72 horas. Células INVSc-1 transformadas con pJ1234-AraC-HC_NS y con el vector de control pJ1234-03C, se cultivaron en las mismas condiciones en placas de agar mínimo SC sin uracilo. (Preferiblemente, las células INVSc-1 transformadas con pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA, con pJ1234-AraC-MnPH4_FT-ChuA y con pJ1234-PrpR-PDI también se cultivan en las mismas condiciones en placas de agar mínimo SC sin uracilo). Células INVSc-1 cotransformadas simultáneamente con pJ1234-AraC-HC_NS y pJ1231-PrpR-LC_NS fueron seleccionadas en las mismas condiciones en placas de agar mínimo SC sin leucina o uracilo. (Preferiblemente, las células INVSc-1 cotransformadas de forma simultánea con pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA y pJ1234-PrpR-PDI, o con pJ1234-AraC-MnP-H4_FT-ChuA y pJ1231-PrpR-PDI, se seleccionan en las mismas condiciones en placas de agar mínimo SC sin leucina o uracilo).
Las células de todas las colonias de cada transformación se rasparon y se resuspendieron en 4 ml de medio mínimo SC líquido, en ausencia de reactivo selectivo apropiado y fuente de carbono. La DO600 en cada cultivo se midió y se normalizó a 0,4 unidades ópticas. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de 2% de arabinosa filtrada de forma estéril (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, nº de catálogo A3256-25G) a cultivos transformados con pJ1234-AraC-HC_NS. En las células transformadas con pJ1231-PrpR-PDI y con pJ1231-PrpR-LC_NS, la expresión de proteínas se indujo con la adición de 2% de propionato filtrado de forma estéril (Sigma-Aldrich, número de catálogo P188-100G). Y la coexpresión de pJ1234-AraC HC_NS y pJ1231-PrpR-LC_NS en el cultivo correspondiente fue inducida por la adición de 1% de arabinosa y 1% de propionato. (Preferiblemente, el medio de inducción para la expresión de proteínas a través de las células transformadas con pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA, y para las células cotransformadas con pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA y pJ1234-PrpR-PDI, o con pJ1234-AraCMnP-H4_FT-ChuA y pJ1231-PrpR-PDI, también contiene hemina (Sigma-Aldrich, nº de catálogo H9039 o 51280) añadida hasta una concentración final de 8 micromolar). El curso de tiempo para la expresión de proteínas era de 24 horas, a 30 grados C en una incubadora con agitación a 250 rpm. Las células procedentes de 0,5 mililitros de cada cultivo inducido previamente, se recogieron mediante centrifugación, se lavaron con 1 mililitro de agua desionizada y
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antígeno no marcado, a continuación, se captura el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., "Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen", J Mol Biol 1999 Nov 5; 293(4): 865-881). Para establecer las condiciones del ensayo, placas de microtitulación (Dynex Technologies, Inc., Chantilly, Virginia) se recubren durante una noche con 5 microgramos/mL de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs, West Chester, Pensilvania) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquean con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc nº 269620; Thermo Scientific, Rochester, Nueva York), se mezcla antígeno (125I) 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, en consonancia con la determinación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., "Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders", Cancer Res 1997 Oct 15; 57(20): 4593-4599). El Fab de interés se incuba después durante una noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubar a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con 0,1% de tensioactivo Tween-20® en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 microlitros/pocillo de líquido de centelleo (Microscint-20® PerkinElmer, Waltham, Massachusetts), y se hace un recuento de las placas en un contador gamma TOPCOUNT® (PerkinElmer) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos o igual a un 20% de unión máxima, se eligen para uso en ensayos de unión competitiva.
Alternativamente, la Kd o el valor de Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón de superficie, usando un instrumento BIAcore®-2000 o BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25°C con chips con antígeno CM5 inmovilizado, a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, chips de biosensores con dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc). se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 microgramos/mL (~0,2 micromolar) antes de la inyección con un caudal de 5 microlitros/minuto, para conseguir aproximadamente 10 UR de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones dobles en serie de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de tensioactivo Tween 20® (PBST) a 25°C con un caudal de aproximadamente 25 microlitros/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan usando un modelo simple de unión a uno-a-uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIAcore®, versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Si la tasa de asociación excede a 106 M-1 s-1 en el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la tasa de asociación se puede determinar mediante el uso de una técnica de extinción de la fluorescencia que mide el incremento o la disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, banda de paso de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno, tal como se mide en un espectrómetro, como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrómetro de 8000 series SLM-AMINCO® (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
EJEMPLO 11
Caracterización de los enlaces disulfuro presentes en los productos de coexpresión
La cantidad y la ubicación de los enlaces disulfuro en los productos de proteínas coexpresadas se pueden determinar mediante la digestión de la proteína con una proteasa, tal como tripsina, en condiciones no reductoras, y someter los fragmentos peptídicos resultantes a espectrometría de masas (MS) combinando etapas de MS de disociación de transferencia de electrones secuencial (ETD) y disociación inducida por colisión (CID) (MS2, MS3) (Nili et al., "Defining the disulfide bonds of insulin-like growth factor-binding protein-5 by tandem mass spectrometry with electron transfer dissociation and collision-induced dissociation", J Biol Chem 2012 Jan 6; 287(2): 1510-1519; Epub 2011 Nov 22).
Digestión de proteínas coexpresadas. Para evitar los reordenamientos de los enlaces disulfuro, cualquier residuo de cisteína libre se bloquea primero mediante alquilación: la proteína coexpresada se incuba protegida de la luz con el agente alquilante yodoacetamida (5 mM) con agitación durante 30 minutos a 20°C en tampón con urea 4 M, y a continuación, se separa mediante SDS-PAGE no reductor, usando geles prefabricados. Alternativamente, la proteína coexpresada se incuba en el gel después de la electroforesis con yodoacetamida, o sin ella como control. Las bandas de proteínas se tiñen, se destiñen con agua doblemente desionizada, se escinden y se incuban dos veces en 500 microlitros de bicarbonato de amonio 50 mM, 50% (v/v) de acetonitrilo, mientras que se agita durante 30 minutos a 20°C. Las muestras de proteína se deshidratan en 100% de acetonitrilo durante 2 minutos, se secan por centrifugación a vacío y se rehidratan con 10 mg/mL de tripsina o quimotripsina en tampón que contiene bicarbonato de amonio 50 mM y cloruro de calcio 5 mM durante 15 minutos sobre hielo. El exceso de tampón se elimina y se reemplaza con 50 microlitros del mismo tampón sin enzima, seguido de incubación durante 16 horas a 37°C o 20°C, para tripsina y quimotripsina, respectivamente, con agitación. Las digestiones se detienen mediante la adición de 3 microlitros de ácido fórmico al 88%, y después de una breve agitación en vórtice, se retira el material sobrenadante y se almacenan a -20°C hasta el análisis.
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5.
Añadir 3 ml de agua purificada a 4°C por cada gramo de peso de sedimento celular original (Etapa 2) y mezclar mediante inversión.
6.
Incubar durante 10 minutos en hielo.
7.
Las células lisadas se sedimentan por centrifugación a un mínimo de 4.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
8.
El material sobrenadante que contiene la fracción periplásmica se transfiere a un tubo limpio.
9.
Para degradar los ácidos nucleicos contaminantes, se añade opcionalmente la endonucleasa OmniCleave al tampón de lisis PeriPreps. La inclusión de una nucleasa generalmente mejora el rendimiento de la proteína y la facilidad de manejo de los lisados, pero la adición de una nucleasa no es deseable en algunos casos: por ejemplo, el uso de una nucleasa se debe evitar si la actividad nucleasa residual o una exposición transitoria al cofactor de magnesio va a interferir con ensayos o usos posteriores de la proteína purificada. La adición de EDTA al lisado para inactivar la endonucleasa OmniCleave, del mismo modo, puede interferir con el ensayo o el uso posterior de la proteína purificada. Si se va a añadir nucleasa, se diluyen 2 microlitros de endonucleasa OmniCleave y 10 microlitros de MgCl2 1,0 M hasta 1 ml con el tampón de lisis PeriPreps (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, KCl 50 mM, EDTA 1 mM y 0,1% de desoxicolato) por cada mililitro de tampón de lisis necesario en la Etapa 10.
10.
El sedimento se resuspende en 5 ml de tampón de lisis PeriPreps por cada gramo de peso de sedimento celular original.
11.
El sedimento se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos (si se incluye, la actividad de la endonucleasa OmniCleave causará una disminución significativa de la viscosidad; la incubación continúa hasta que la suspensión celular tiene la consistencia del agua).
12.
Los restos celulares se sedimentan por centrifugación a un mínimo de 4.000 x g durante 15 minutos a 4°C.
13.
El material sobrenadante que contiene la fracción de esferoplastos se transfiere a un tubo limpio.
14.
Si se había añadido endonucleasa OmniCleave al tampón de lisis PeriPreps, se añaden 20 microlitros de EDTA 500 mM por cada mililitro de la fracción esferoplástica resultante, para quelar el magnesio (la concentración final de EDTA en el lisado es 10 mM). Después de la hidrólisis de los ácidos nucleicos con endonucleasa OmniCleave, los lisados pueden contener cantidades sustanciales de monooligonucleótidos u oligonucleótidos. La presencia de estos productos de degradación puede afectar adicionalmente al procesamiento del lisado: por ejemplo, los nucleótidos pueden disminuir la capacidad de unión de resinas de intercambio aniónico mediante una interacción con la resina.
El protocolo anterior se puede utilizar para preparar proteína celular total con las siguientes modificaciones. Las células sedimentadas en la Etapa 2 pueden ser frescas o congeladas; en la Etapa 4, las células se incuban durante 15 minutos; las Etapas 5 a 8 se omiten; en la Etapa 10, se añaden 3 ml de tampón de lisis PeriPreps por cada gramo de peso de sedimento celular original.
Después de la preparación de muestras de proteínas periplásmicas o esferoplásticas o de células completas, las muestras se pueden analizar mediante cualquiera de una variedad de métodos de caracterización y/o cuantificación de proteínas. En un ejemplo, el fraccionamiento con éxito de proteínas periplásmicas y esferoplásticas se confirma mediante el análisis de una parte alícuota de ambas fracciones periplásmicas y esferoplásticas mediante SDS-PAGE (dos microlitros de cada fracción es generalmente suficiente para la visualización con una tinción con Coomassie Brilliant Blue). La presencia de proteínas únicas o el enriquecimiento de proteínas específicas en una fracción dada, indica un fraccionamiento exitoso. Por ejemplo, si la célula hospedadora contiene un plásmido con un número elevado de copias con el marcador de resistencia a la ampicilina, a continuación, la presencia de β-lactamasa (31,5 kDa) principalmente en la fracción periplásmica, indica un fraccionamiento exitoso. Otras proteínas de E. coli que se encuentran en el espacio periplásmico incluyen fosfatasa alcalina (50 kDa) y factor de elongación Tu (43 kDa). La cantidad de proteína que se encuentra en una fracción dada, se puede cuantificar utilizando cualquiera entre una serie de métodos (por ejemplo, SDS-PAGE y análisis densitométrico de bandas de proteínas teñidas o marcadas, recuento de centelleo de las proteínas radiomarcadas, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), o ensayo de centelleo de proximidad, entre otros métodos). La comparación de las cantidades de una proteína que se encuentra en la fracción periplásmica en comparación con la fracción esferoplástica, indica el grado en que se ha exportado la proteína desde el citoplasma al periplasma.
EJEMPLO 13
Determinación de la similitud de la secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos
El porcentaje de identidad de la secuencia de polinucleótidos o de la secuencia de aminoácidos se define como el número de símbolos alineados, es decir, nucleótidos o aminoácidos, que son idénticos en las dos secuencias alineadas, dividido por el número total de símbolos en la alineación de las dos secuencias, incluyendo los huecos. El grado de similitud (porcentaje de identidad) entre dos secuencias se puede determinar alineando las secuencias
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utilizando el método de alineamiento global de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), implementado por el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI) en la herramienta de alineación de secuencias global Needleman-Wunsch, disponible a través de la página web blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. En una realización, los parámetros de alineación de Needleman y Wunsch se establecen para los valores por defecto (Puntuaciones de Emparejamiento/No emparejamiento de 2 y -3, respectivamente, y los costes por huecos por su existencia y extensión de 5 y 2, respectivamente). Otros programas utilizados por los expertos en la técnica de comparación de secuencias, también se pueden utilizar para alinear secuencias, tales como, por ejemplo, la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico o programa Blast® (Altschul et al., "Basic local alignment search tool", J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3): 403-410), tal y como se implementa en el NCBI, usando los ajustes de parámetros por defecto que se describen en el sitio web blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. El algoritmo BLAST tiene varios parámetros opcionales, incluyendo dos que se pueden utilizar de la siguiente manera: (A) inclusión de un filtro para enmascarar segmentos de la secuencia de consulta que tienen baja complejidad composicional o segmentos que consisten en repeticiones internas de corta periodicidad, que preferiblemente no se utilizan o están desactivados, y (B) un umbral de significación estadística para informar de emparejamientos frente a secuencias de bases de datos, llamado el “Expect” o puntuación E (del inglés “E-score”) (la probabilidad esperada de emparejamientos que se encuentran simplemente por casualidad, si la significación estadística atribuida a un emparejamiento es superior a este umbral de puntuación E, no se informará del emparejamiento). Si este valor 'Expect' o puntuación E se ajusta desde el valor predeterminado (10), los valores umbrales preferidos son 0,5, o con el fin de aumentar la preferencia, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 y 0,000001.
En la práctica de la presente invención, se utilizan opcionalmente muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología y tecnología de ADN recombinante. Tales técnicas convencionales se refieren a vectores, células hospedadoras y métodos recombinantes. Estas técnicas son bien conocidas y se explican en, por ejemplo, Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Mc, San Diego, CA; Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000; y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., compiladores, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado hasta el 2006). Otras referencias útiles, por ejemplo, para el aislamiento y cultivo celular y para un aislamiento posterior de ácidos nucleicos o proteínas, incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en el mismo; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (compiladores) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York); y Atlas y Parks (compiladores) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Métodos para preparar ácidos nucleicos (por ejemplo, mediante amplificación in vitro, purificación a partir de células o síntesis química), métodos para la manipulación de ácidos nucleicos (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, digestión con enzimas de restricción, ligación, etc.), y diversos vectores, líneas celulares y similares, útiles en la manipulación y la preparación de ácidos nucleicos, se describen en las referencias anteriores. Además, esencialmente, cualquier polinucleótido (incluyendo polinucleótidos marcados o biotinilados) se puede ordenar de forma personalizada o convencional a partir de cualquiera entre una variedad de fuentes comerciales.
La presente invención se ha descrito en términos de realizaciones particulares, encontradas o propuestas para comprender ciertos modos para la práctica de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que, a de cara a la presente descripción, se pueden realizar numerosas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas, sin apartarse del alcance pretendido de la invención.
SECUENCIAS PRESENTADAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO:
Longitud: Tipo: Organismo: Descripción; “Otra información”
1
1526 ADN Mus musculus Secuencia codificadora para la cadena pesada de IgG1 de ratón anti-CD19 humano
2
464 PRT Mus musculus Secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena pesada de IgG1 de ratón anti-CD19 humano
3
958 ADN Mus musculus Secuencia codificadora para la cadena ligera de IgG1 de ratón anti-CD19 humano
4
239 PRT Mus musculus Secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera de IgG1 de ratón anti-CD19 humano
5
1429 ADN Secuencia Artificial Secuencia codificadora optimizada para la cadena pesada de IgG1 de ratón anti-CD19
SEQ ID NO:
Longitud: Tipo: Organismo: Descripción; “Otra información”
humano
6
757 ADN Secuencia Artificial Secuencia codificadora optimizada para la cadena ligera de IgG1 de ratón anti-CD19 humano
7
5874 ADN Secuencia Artificial vector pPRO33
8
36 ADN Secuencia Artificial cebador directo IgG1HC Fc
9
32 ADN Secuencia Artificial cebador inverso IgG1HC Fc
10
19 ADN Secuencia Artificial cebador directo pBAD24/33
11
17 ADN Secuencia Artificial cebador inverso nº 1 pBAD24/33
12
17 ADN Secuencia Artificial cebador inverso nº 2 pBAD24/33
13
370 PRT Secuencia Artificial Secuencia de aminoácidos de MnP-H4 de P. chrysosporium, sin péptido señal
14
1113 ADN Secuencia Artificial Secuencia codificadora optimizada para MnP-H4 de P. chrysosporium, sin péptido señal
15
370 PRT Secuencia Artificial Secuencia de aminoácidos de MnP-H4 A60C/A75C de P. chrysosporium, sin péptido señal
16
1113 ADN Secuencia Artificial Secuencia codificadora optimizada para MnP-H4 A60C/A75C de P. chrysosporium, sin péptido señal
17
660 PRT E. coli O157:H7 Secuencia de aminoácidos de O157:H7 cepa EC4113 ChuA de E. coli
18
1276 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión MnP-H4
19
2056 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión ChuA
20
3326 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión MnP-H4 ChuA
21
486 PRT Secuencia Artificial Secuencia de aminoácidos de PDI de Humicola insolens, sin péptido señal
22
1487 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión PDI
23
359 PRT Secuencia Artificial Secuencia de aminoácidos de MnP-H4 de P. chrysosporium, madura y “totalmente truncada”
24
25 ADN Secuencia Artificial Cebador directo MnP-H4_FT NcoI
25
27 ADN Secuencia Artificial Cebador inverso MnP-H4_FT SalI
26
24 ADN Secuencia Artificial Cebador directo ChuA SalI
27
31 ADN Secuencia Artificial Cebador inverso ChuA HindIII
28
7768 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión pBAD24MnP_FT-ChuA
29
7316 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión pPRO33-PDI
30
451 PRT Secuencia Artificial Cadena pesada de Infliximab quimérico
SEQ ID NO:
Longitud: Tipo: Organismo: Descripción; “Otra información”
(dominio variable murino, dominio constante humano)
31
215 PRT Secuencia Artificial Cadena ligera de Infliximab quimérico (dominio variable murino, dominio constante humano)
32
5875 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión pBAD24Infliximab_HC
33
6503 ADN Secuencia Artificial Estructura artificial de expresión pPRO33Infliximab_LC
34
6545 ADN Secuencia Artificial Plásmido pJ1231-03C
35
6009 ADN Secuencia Artificial Plásmido pJ1234-03C
36
42 ADN Secuencia Artificial Cebador BsaI-AraC-MnP-H4_FT
37
63 ADN Secuencia Artificial Cebador inverso MnP-H4_FT-6xHis
38
38
ADN Secuencia Artificial Cebador directo MnP-H4_FT-6xHis
39
66 ADN Secuencia Artificial Cebador ChuA-6xHis-BsaI
40
4569 ADN Secuencia Artificial Producto de PCR AraC-MnP-H4_FT-ChuA
41
42 ADN Secuencia Artificial Cebador BsaI-PrpR-PDI
42
55 ADN Secuencia Artificial Cebador PDI-5xHis-BsaI
43
3326 ADN Secuencia Artificial Producto de PCR PrpR-PDI
44
44
ADN Secuencia Artificial Cebador directo BsaI-AraC-HC
45
46 ADN Secuencia Artificial Cebador inverso HC
46
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ADN Secuencia Artificial Cebador directo HC
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45 ADN Secuencia Artificial Cebador inverso HC-BsaI
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43 ADN Secuencia Artificial Cebador directo BsaI-PrpR-LC
49
50 ADN Secuencia Artificial Cebador inverso LC
50
50
ADN Secuencia Artificial Cebador directo LC
51
43 ADN Secuencia Artificial Cebador inverso LC-BsaI
52
2615 ADN Secuencia Artificial Producto de PCR AraC-HC_NS
53
2584 ADN Secuencia Artificial Producto de PCR PrpR-LC_NS

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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104718284A (zh) * 2012-05-25 2015-06-17 塞勒克提斯公司 工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性t细胞的方法
US20180282405A1 (en) * 2012-08-05 2018-10-04 Absci, Llc Cytoplasmic expression system
US20150353940A1 (en) * 2013-08-05 2015-12-10 Absci, Llc Vectors for use in an inducible coexpression system
US11077144B2 (en) 2013-05-13 2021-08-03 Cellectis CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
JP6788255B2 (ja) * 2015-11-19 2020-11-25 国立大学法人信州大学 新規ベクター及びこれを用いた可溶化タンパク質の製造方法
CN106190940B (zh) * 2016-07-19 2019-06-14 北京三元基因药业股份有限公司 表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌
MX2019002835A (es) 2016-09-13 2019-09-04 Allergan Inc Composiciones no proteínicas de toxina clostridial.
WO2019175881A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Technion Research & Development Foundation Limited A prognostic biomarker in cancer
JP7174990B2 (ja) * 2018-07-23 2022-11-18 国立大学法人山口大学 原核生物用発現ベクター
WO2020069011A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Absci, Llc Protein purification methods
CN113166717B (zh) * 2018-11-08 2024-02-20 苏特罗生物制药公司 具有氧化细胞质的大肠杆菌菌株
CN109371049A (zh) * 2018-11-14 2019-02-22 天津大学 分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用
CN111269294B (zh) * 2018-12-05 2023-03-28 广州中国科学院先进技术研究所 纤维寡糖转运蛋白LacY的突变位点、突变转运蛋白LacY及其制备方法和应用
BR112021018925A2 (pt) * 2019-04-04 2022-01-18 Braskem Sa Modificação metabólica para consumo simultâneo de xilose e glicose para produção de produtos químicos a partir de açúcares de segunda geração
CN110616181A (zh) * 2019-09-27 2019-12-27 北京理工大学 一株基于大肠杆菌改造的工程菌株
CN112980891B (zh) * 2019-12-16 2023-12-12 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种基于CRISPR-Cas的大肠杆菌基因组编辑工具
CN113122552B (zh) * 2021-04-21 2022-07-26 西北农林科技大学 黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用
CN118339289A (zh) 2021-09-17 2024-07-12 艾伯赛公司 转移rna的组成和在含有非标准氨基酸的蛋白质产生中的用途
WO2024006269A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Absci Corporation Affinity screening method
WO2024040020A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Absci Corporation Quantitative affinity activity specific cell enrichment
US20240239854A1 (en) 2022-12-21 2024-07-18 Donald Danforth Plant Science Center Antimicrobial peptides and modifications thereof
CN116875524B (zh) * 2023-09-08 2024-03-26 清华大学 一种在微生物中调控多基因表达的方法及其应用
CN118064437B (zh) * 2024-04-24 2024-09-10 山东福洋生物科技股份有限公司 一种多启动子结构元件及其构建方法和应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997038123A1 (en) * 1996-04-05 1997-10-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US6083715A (en) * 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
CN1064052C (zh) * 1997-09-29 2001-04-04 中国科学院微生物研究所 甲状旁腺素相关蛋白人源化抗体及其制备方法
US6872563B1 (en) * 1999-10-05 2005-03-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for production of disulfide bond containing proteins in host cells
AU4926501A (en) 2000-03-24 2001-10-08 Xoma Technology Ltd Improved methods and cells for expression of recombinant protein products
US6979556B2 (en) * 2000-12-14 2005-12-27 Genentech, Inc. Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes
MXPA04001566A (es) * 2001-08-27 2004-05-17 Genentech Inc Un sistema para expresion y ensamblado de anticuerpos.
EP1511772B1 (en) * 2002-05-28 2011-11-23 Omrix Biopharmaceuticals Inc. Method for obtaining anti-idiotype antibodies
DE60325611D1 (de) * 2002-07-03 2009-02-12 Dow Global Technologies Inc Benzoat- und antranilatinduzierbare promotoren
DE50307835D1 (de) * 2002-12-02 2007-09-13 Basf Ag L-rhamnose-induzierbare expressionssysteme
BRPI0611112A2 (pt) * 2005-06-06 2010-08-10 Dow Global Technologies Inc sistemas promotores induzidos por manitol em células hospedeiras bacterianas
US7351563B2 (en) 2005-06-10 2008-04-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-free extracts and synthesis of active hydrogenase
US8178338B2 (en) 2005-07-01 2012-05-15 The Regents Of The University Of California Inducible expression vectors and methods of use thereof
JP4270466B2 (ja) * 2005-09-02 2009-06-03 国立大学法人福井大学 ＮＡＤａｓｅ、ＳＮＩおよびＳＬＯ遺伝子を含むオペロンから発現するタンパク質の製造方法、それにより得られるタンパク質およびその使用
US7816117B2 (en) 2006-04-26 2010-10-19 President And Fellows Of Harvard College Prokaryotic host cells for expressing proteins rich in disulfide bonds
EP2155868A2 (en) * 2007-04-19 2010-02-24 Codon Devices, Inc Engineered nucleases and their uses for nucleic acid assembly
US8629245B2 (en) 2007-05-01 2014-01-14 Research Development Foundation Immunoglobulin Fc libraries
CN107119095B (zh) 2008-01-03 2022-07-05 康乃尔研究基金会有限公司 原核生物中的糖基化蛋白表达
FI20095615A0 (fi) * 2009-06-02 2009-06-02 Oulun Yliopisto Menetelmä luonnollisesti laskostuneiden proteiinien tuottamiseksi prokaryootti-isännässä
WO2011116184A2 (en) * 2010-03-17 2011-09-22 Cornell University Methods and compositions for targeted mutagenesis in bacteria
EP2386641A1 (en) 2010-05-11 2011-11-16 Université Catholique De Louvain Method for extracellular production of recombinant biomolecules in a microorganism
FI20115115A0 (fi) 2011-02-04 2011-02-04 Oulun Yliopisto Menetelmä disulfidisidoksia sisältävien proteiinien tuottamiseksi prokaryoottisytoplasmassa

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