JP7174990B2 - 原核生物用発現ベクター - Google Patents
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Description
本発明は原核生物用発現ベクターや、かかる原核生物用発現ベクターを含有する原核生物や、かかる原核生物を用いた発現対象のタンパク質の生産方法に関する。
近年の遺伝子組換え技術の進展とともに、微生物を用いて様々な有用なタンパク質の生産を行うことが行われるようになった。なかでも細菌は、アミノ酸、タンパク質等の有用物質を生産するために広く利用されている。特に近年は、医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を細菌に導入して形質転換し、かかる形質転換体を用いて有用タンパク質を効率的に生産する技術が知られるようになっている。
タンパク質発現に用いる細菌として、グラム陰性菌の一種である大腸菌が汎用されている。大腸菌をタンパク質発現に利用する技術は工業用タンパク質、食品加工用タンパク質及び医薬品用タンパク質の生産にまで幅広く用いられている。
大腸菌を用いたタンパク質生産において様々な発現系ベクターが開発されてきている。最も広く使われる発現系ベクターはｐＥＴ発現系ベクター（非特許文献１参照）である。ｐＥＴ発現系ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流にクローニングした目的遺伝子を非常に強力なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって発現させるベクターである。しかし、決して万能ではなく、うまく発現させることができないタンパク質も報告されている。また、ｐＣｏｌｄ発現系ベクター（非特許文献２、３参照）も広く使われている。このｐＣｏｌｄ発現系ベクターでは、ｃｓｐＡプロモーターを用いて低温下で目的遺伝子を発現させる点でＴ７プロモーター使うｐＥＴ発現系ベクターとは異なる。さらにこのｐＣｏｌｄ発現系ベクターではｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＥＥ）を用いて翻訳を促進させ、合成量を増加させている。しかし、このＴＥＥは目的遺伝子の開始コドン下流に位置するため、いわゆる”タグ”となり発現対象タンパク質との融合タンパク質として発現する。そのことにより、生来のタンパク質機能を失わせるという悪影響も想定される。
Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Dao-shan, C., Lin, S.-W., Dunn, J. J., & Studier, F. W. (1987). Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 56(1), 125－135.
Qing, G., Ma, L. C., Khorchid, A., Swapna, G. V. T., Mal, T. K., Takayama, M. M., et al. (2004). Cold-shock induced high-yield protein production in Escherichia coli. Nat Biotechnol, 22(7), 877－882.
Etchegaray, J. P., & Inouye, M. (1999). Translational enhancement by an element downstream of the initiation codon in Escherichia coli. J Biol Chem, 274(15), 10079－10085.
上記のように、ｐＥＴ発現系ベクターでは発現が十分でない場合があり、ｐＣｏｌｄ発現系ベクターではＴＥＥが目的遺伝子の開始コドン下流に位置するために目的の発現タンパク質とＴＥＥが融合したままになるという問題があった。そこで、本発明の課題は、翻訳促進効果のある配列を発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの非翻訳領域に含むように設計された原核生物用発現ベクターを提供することにある。
本発明者らは、細胞性粘菌のミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）遺伝子に着目し、ｍｌｃＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと共にリボソーム結合部位（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ：ＲＢＳ）をコードするポリヌクレオチドとｍＥＧＦＰ遺伝子コードするポリヌクレオチドを、汎用されているｐＵＣベクターに組み込んで大腸菌を形質転換したところ、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等の転写促進剤不含培地で培養した形質転換体においてＧＦＰが高発現していることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］以下の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えた原核生物用発現ベクター。
（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
［２］リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に４～２０塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする上記［１］記載の原核生物用発現ベクター。
［３］配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列が、配列番号２に示す塩基配列であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の原核生物用発現ベクター。
［４］原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれか記載の原核生物用発現ベクター。
［５］上記［１］～［４］のいずれか記載の原核生物用発現ベクターを含有する原核生物。
［６］上記［５］記載の原核生物を培養する工程と、培養した前記原核生物から発現対象のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の生産方法。
［７］タンパク質を発現するためのキットであって、上記［１］～［４］のいずれか記載の原核生物用発現ベクターと、タンパク質を発現するための説明書を含むキット。
［１］以下の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えた原核生物用発現ベクター。
（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
［２］リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に４～２０塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする上記［１］記載の原核生物用発現ベクター。
［３］配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列が、配列番号２に示す塩基配列であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の原核生物用発現ベクター。
［４］原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれか記載の原核生物用発現ベクター。
［５］上記［１］～［４］のいずれか記載の原核生物用発現ベクターを含有する原核生物。
［６］上記［５］記載の原核生物を培養する工程と、培養した前記原核生物から発現対象のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の生産方法。
［７］タンパク質を発現するためのキットであって、上記［１］～［４］のいずれか記載の原核生物用発現ベクターと、タンパク質を発現するための説明書を含むキット。
本発明により、発現対象のタンパク質の発現量を、変異を加えることなく高めることが可能となる。
本発明におけるベクターは、（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えた原核生物用発現ベクター（以下、「本件ベクター」ともいう）であればよく、かかるベクターを用いれば、翻訳促進効果のある配列がタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける開始コドンの５’側（上流）に位置するため、翻訳促進効果のある配列が翻訳されることなく発現対象のタンパク質を発現させることが可能となる。
本件ベクターにおけるミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）は、アクチン上を動くモータータンパク質であるミオシンＩＩの構成要素である。かかるミオシン調節軽鎖は、細胞分裂、細胞の運動、細胞の形態変化等の機能に関与していることが知られている。
上記ミオシン調節軽鎖の由来としては、細胞性粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、真正粘菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）、襟鞭毛虫、海綿、線虫等の環形動物、ショウジョウバエ等の昆虫、ホヤ等の尾索動物、ギボシムシ等の半索動物、ウニ等の棘皮動物、ナメクジウオ等の頭索動物、ゼブラフィッシュ等の魚類、アフリカツメガエル等の両生類、ニワトリ等の鳥類、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を挙げることができ、細胞性粘菌を好適に挙げることができる。
ミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドは、公知の文献やＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。細胞性粘菌由来のミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）の全長をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
ミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの部分配列とは、ミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）の全長をコードするポリヌクレオチドの一部が欠損した配列を意味する。かかるミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの部分配列としては、
配列番号２に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４７４～４８３番目の１０塩基）や、
配列番号３に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４６４～４８３番目の２０塩基）や、
配列番号４に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４５９～４８３番目の２５塩基）や、
配列番号５に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４５４～４８３番目の３０塩基）や、
配列番号６に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４４４～４８３番目の４０塩基）や、
配列番号７に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４３９～４８３番目の４５塩基）や、
配列番号８に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４２４～４８３番目の６０塩基）や、
配列番号９に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４１０～４８３番目の７４塩基）や、
配列番号１０に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の３７４～４８３番目の１１０塩基）や、
配列番号１１に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の２４９～４８３番目の２３５塩基）や、
配列番号１２に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の２１９～４８３番目の２６５塩基）や、
配列番号１３示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の１２９～４８３番目の３５５塩基）からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
配列番号２に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４７４～４８３番目の１０塩基）や、
配列番号３に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４６４～４８３番目の２０塩基）や、
配列番号４に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４５９～４８３番目の２５塩基）や、
配列番号５に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４５４～４８３番目の３０塩基）や、
配列番号６に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４４４～４８３番目の４０塩基）や、
配列番号７に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４３９～４８３番目の４５塩基）や、
配列番号８に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４２４～４８３番目の６０塩基）や、
配列番号９に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の４１０～４８３番目の７４塩基）や、
配列番号１０に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の３７４～４８３番目の１１０塩基）や、
配列番号１１に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の２４９～４８３番目の２３５塩基）や、
配列番号１２に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の２１９～４８３番目の２６５塩基）や、
配列番号１３示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列の１２９～４８３番目の３５５塩基）からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において、「配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含む」とは、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列、すなわち配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチド中の３’末端側の１０塩基を含んでいればよいことを意味する。具体的には、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）の全長をコードするポリヌクレオチドでもよく、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチド中の３’末端側の１０塩基を含んでいる限り、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）中の５’末端側の任意の塩基が欠損した部分配列をコードするポリヌクレオチドでもよい。
本明細書において、「少なくとも９０％以上の配列同一性」とは、配列同一性が９０％以上であることを意味し、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の配列同一性を意味する。
「上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有する塩基配列」とは、換言すると、「上記（１）記載のポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたポリヌクレオチド」であり、かつ、記（１）記載のポリヌクレオチドと同等の機能を有する塩基配列である。ここで、「１若しくは数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの長さに応じて適宜調整できるが、例えば１～３０個の範囲内、好ましくは１～２０個の範囲内、より好ましくは１～１５個の範囲内、さらに好ましくは１～１０個の範囲内、さらに好ましくは１～５個の範囲内、さらに好ましくは１～３個の範囲内、さらに好ましくは１～２個の範囲内の数のポリヌクレオチドが欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたポリヌクレオチドを意味する。これらポリヌクレオチドの変異処理は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により行うことができる。
本件ベクターにおけるリボソーム結合サイト（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ：ＲＢＳ）をコードするポリヌクレオチドとは、原核生物のｍＲＮＡにおいて翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＡＵＵ、ＣＵＧ）の約３～９塩基上流に位置するプリン塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））に富むポリヌクレオチドであり、ｍＲＮＡにリボソームを動員するのを助け、リボソームを開始コドンに配置することによってタンパク質合成を開始させるサイトである。リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドとしては、シャイン・ダガルノ配列（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に基づいて設計することができる。具体的には、プリン塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））に富む４～９塩基からなるポリヌクレオチドを挙げることができ、ＧＧＡＧ、ＡＧＧＡ、ＧＧＡＧＧ、ＡＧＧＡＧ、ＧＧＡＧＧＴ、ＡＧＧＧＡＧ、ＧＡＧＧＡＧ、ＡＧＧＡＧＧ、ＡＧＧＡＧＧＴ、ＡＧＡＧＧＡＧＡ等を挙げることができる。
リボソーム結合サイトとして機能する任意のプリン塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））に富む配列の活性は、任意の好適な方法を使用して試験することができる。例えば、発現は、国際公開第２００４／０４６３２１号パンフレットの実施例１に記載のとおり、ｍＲＮＡによりコードされるレポータータンパク質の活性を計測することにより計測することができる。
リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間には、任意の塩基配列からなるスペーサー配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、４～２０塩基、好ましくは５～１１塩基、より好ましくは６～１０塩基からなるポリヌクレオチドであり、かかる配列により、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける開始コドンが、翻訳制御機能を発揮できる適切な距離で配置されることなる。スペーサー配列の塩基としては特に制限されず、アデニン、グアニン、シトシン、チミンのいずれの塩基でもよい。
本明細書における発現対象のタンパク質としては、原核生物内で発現させる目的タンパク質であればよく、用途に合わせて全長のタンパク質でも、その一部のアミノ酸配列からなるタンパク質でもよい。また、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現が最適化されるように改変されていてもよい。
本明細書における原核生物としては、真正細菌又は枯草菌であればよく、真正細菌としては、大腸菌等のグラム陰性細菌や枯草菌等のグラム陽性細菌を挙げることができ、大腸菌を好適に挙げることができる。
本明細書にける原核生物用発現ベクターに用いるベクターとしては、プラスミドベクター、フォスミド、コスミド、ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等を挙げることができ、プラスミドベクターであることが好ましい。プラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＧＥＭ３、ｐＧＥＭ４等の大腸菌で複製可能なプラスミドベクターや、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌で複製可能なプラスミドベクターを挙げることができる。
また、上記ベクターには、生来のタンパク質機能を維持できる限り、プロモーター、複製開始点、オペレーター、薬剤耐性遺伝子、マルチクローニング部位、異化活性化タンパク質結合サイト（Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、シグナルペプチド、タグペプチド、又はプロテアーゼ認識サイトを有するペプチドをコードするポリペプチドを含んでもよい。
上記プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰ ｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐ ｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔ１プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
上記複製開始点としては、用いる宿主細胞に合わせて適宜選択すればよく、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｐＢＲ３２２由来の複製開始点を挙げることができる。
上記オペレーターとしては、用いる宿主細胞に合わせて適宜選択すればよく、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｌａｃオペレーターを挙げることができる。
上記薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
上記シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等を挙げることができる。
上記タグペプチドとしては、ＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ）タグ、ＨＡタグ、ＭＹＣタグ、ＰＡタグ、ＨＩＳタグ、Ｖ５タグ、ＣＢＤタグ、ＣＢＰタグ、ＴＡＲＧＥＴタグ、ＧＦＰタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ等を好適に挙げることができる。
本件ベクターを含有する原核生物は、本件ベクターを原核生物に導入して作製することができ、本件ベクターを原核生物に導入する方法としては特に制限されず、カルシウムリン酸法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を挙げることができる。
本明細書におけるタンパク質の生産方法としては、本件ベクターを含有する原核生物を培養する工程と、培養した前記原核生物から発現対象のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の生産方法あればよく、培養方法としては、通常の原核生物の培養に用いられる公知の方法を用いることができる。例えば、原核生物が大腸菌の場合は、３７℃前後、及び、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で培養することができる。培養液からタンパク質を回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティ等のクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。また、細胞外に分泌されるタンパク質又は細胞外分泌シグナルをもつタンパク質の場合には、細胞を破壊せずにタンパク質を回収することが好ましい。
上記原核生物を培養する培地としては、原核生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、原核生物を培養し得る培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。上述の培地に用い得る炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を挙げることができる。上述の培地に用い得る窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物や、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等の窒素源を含む物質を挙げることができる。上述の培地に用い得る無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を挙げることができる。
本明細書におけるキットとしては、タンパク質を発現するためのキットであって、本件ベクターと、タンパク質を発現するための説明書を含むキット（以下、「本件キット」ともいう）であればよい。
本件キットには、本件ベクター及び上記説明書の他に、例えば、滅菌水、生理食塩水、界面活性剤、緩衝剤、保存剤、形質転換用試薬等を必要に応じて含んでいてもよい。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。なお、大腸菌の培養、プラスミドベクターの作製、蛍光顕微鏡観察、大腸菌の増殖測定については以下の手順によって行った。また、発現対象のタンパク質として、蛍光で発現が観察可能なｍＥＧＦＰ又はｍＲｕｂｙ３を選択して用いた。
例示に限定されるものではない。なお、大腸菌の培養、プラスミドベクターの作製、蛍光顕微鏡観察、大腸菌の増殖測定については以下の手順によって行った。また、発現対象のタンパク質として、蛍光で発現が観察可能なｍＥＧＦＰ又はｍＲｕｂｙ３を選択して用いた。
［大腸菌の培養］
大腸菌はＫ－１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）又はＢＬ２１（ＤＥ３）（コスモバイオ社）を用いた。ＬＢ培地は市販のＬＢ培地（日本ジェネティクス社）を用いた。ＬＢ寒天培地は、市販寒天（和光純薬工業社）を上記ＬＢ培地に追添加し作製した。培養は、３７℃にて暗黒環境下で行なった。
大腸菌はＫ－１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）又はＢＬ２１（ＤＥ３）（コスモバイオ社）を用いた。ＬＢ培地は市販のＬＢ培地（日本ジェネティクス社）を用いた。ＬＢ寒天培地は、市販寒天（和光純薬工業社）を上記ＬＢ培地に追添加し作製した。培養は、３７℃にて暗黒環境下で行なった。
［プラスミドベクターの作製］
（１）ＧＦＰ発現プラスミドベクター「ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」の作製
ｍＥＧＦＰ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、単に「ＧＦＰ」ともいう）遺伝子が挿入されていたプラスミドベクターＧＦＰ－ｐＵＣ１９ｋａｎ（ファスマック社）を鋳型に、以下のプライマーを使ってＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、ｍＥＧＦＰ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー 配列番号１４
ＧＦＰ＿ＦＯＲ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧ
リバースプライマー 配列番号１５
ＧＦＰ＿ＲＥＶ：ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＡＴＡＣＡ
（１）ＧＦＰ発現プラスミドベクター「ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」の作製
ｍＥＧＦＰ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、単に「ＧＦＰ」ともいう）遺伝子が挿入されていたプラスミドベクターＧＦＰ－ｐＵＣ１９ｋａｎ（ファスマック社）を鋳型に、以下のプライマーを使ってＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、ｍＥＧＦＰ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー 配列番号１４
ＧＦＰ＿ＦＯＲ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧ
リバースプライマー 配列番号１５
ＧＦＰ＿ＲＥＶ：ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＡＴＡＣＡ
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＸｂａＩ（「５’－ＴＣＴＡＧＡ－３’」）及びＢａｍＨＩ（「５’－ＧＧＡＴＣＣ－３’」）で処理し、ｐＵＣ１９ベクター（タカラバイオ社）に挿入し、プラスミドベクター「ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を作製した。なお、上記フォワードプライマーＧＦＰ＿ＦＯＲには、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩサイト及びＧＦＰの開始コドン（下線：ＡＴＧ）が含まれ、上記リバースプライマーＧＦＰ＿ＲＥＶには、ＢａｍＨＩサイト及び停止コドン（下線：ＣＴＡ）が含まれる。
（２）ｍｌｃＲ、ＲＢＳ、スペーサー、及びＧＦＰ発現プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」の作製
（２－１）ｍｌｃＲ遺伝子の増幅
発明者らが公知の手法に基づいて作製した細胞性粘菌ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、耐熱性ＤＮＡ複製酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、ＰＣＲでｍｌｃＲ遺伝子を増幅した。このときＰＣＲは増幅効率を高めるために２種類のリバースプライマーを用いて２段階で行った。１回目のＰＣＲは、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ、ＢｇｌII切断サイトを含むフォワードプライマー（配列番号１６：ｍｌｃＲ－ＦＷ ５’－ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣ－３’と、３’末端側にＲＢＳ及びスペーサーの一部の配列の相補配列を含むリバースプライマー（配列番号１７：ｍｌｃＲ－ＲＶ１ ５’－ＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧ－３’）を設計して用いた。２回目のＰＣＲは、上記フォワードプライマー（配列番号１６：ｍｌｃＲ－ＦＷ）と、３’末端側にＲＢＳ、スペーサーの全配列及びＢａｍＨＩ切断サイトの相補配列を含むリバースプライマー（配列番号１８：ｍｌｃＲ－ＲＶ２ ５’－ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ－３’）を設計して用いた。ｍｌｃＲ遺伝子と上記フォワードプライマー、リバースプライマーの位置関係を示した図を図１に示す。
（２－１）ｍｌｃＲ遺伝子の増幅
発明者らが公知の手法に基づいて作製した細胞性粘菌ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、耐熱性ＤＮＡ複製酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、ＰＣＲでｍｌｃＲ遺伝子を増幅した。このときＰＣＲは増幅効率を高めるために２種類のリバースプライマーを用いて２段階で行った。１回目のＰＣＲは、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ、ＢｇｌII切断サイトを含むフォワードプライマー（配列番号１６：ｍｌｃＲ－ＦＷ ５’－ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣ－３’と、３’末端側にＲＢＳ及びスペーサーの一部の配列の相補配列を含むリバースプライマー（配列番号１７：ｍｌｃＲ－ＲＶ１ ５’－ＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧ－３’）を設計して用いた。２回目のＰＣＲは、上記フォワードプライマー（配列番号１６：ｍｌｃＲ－ＦＷ）と、３’末端側にＲＢＳ、スペーサーの全配列及びＢａｍＨＩ切断サイトの相補配列を含むリバースプライマー（配列番号１８：ｍｌｃＲ－ＲＶ２ ５’－ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ－３’）を設計して用いた。ｍｌｃＲ遺伝子と上記フォワードプライマー、リバースプライマーの位置関係を示した図を図１に示す。
（２－２）ｍｌｃＲ、ＲＢＳ、スペーサー、及びＧＦＰ発現プラスミドベクターの作製
上記で得られたｍｌｃＲ遺伝子の増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、分離及び精製後、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて制限酵素消化し、同様にＢｇｌＩＩで消化した上記プラスミドベクター「ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」とライゲーションを行い、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を作製した。さらに、大腸菌Ｋ－１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）に上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を導入し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養して形質転換を行なった。得られた形質転換体をさらにアンピシリン含有ＬＢ培地で培養後、市販のプラスミドベクター精製キット：ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ（日本ジェネティクス社）によりプラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を精製した。
上記で得られたｍｌｃＲ遺伝子の増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、分離及び精製後、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて制限酵素消化し、同様にＢｇｌＩＩで消化した上記プラスミドベクター「ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」とライゲーションを行い、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を作製した。さらに、大腸菌Ｋ－１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）に上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を導入し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養して形質転換を行なった。得られた形質転換体をさらにアンピシリン含有ＬＢ培地で培養後、市販のプラスミドベクター精製キット：ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ（日本ジェネティクス社）によりプラスミドベクター「ｍｌｃＲ４８０Ｇ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を精製した。
なお、配列番号１７に示すｍｌｃＲ－ＲＶ１の３～８番目の６塩基、及び配列番号１８に示すｍｌｃＲ－ＲＶ２の１２～１７番目の６塩基はＲＢＳ（リボソーム結合サイト）の相補配列、配列番号１７に示すｍｌｃＲ－ＲＶ１の１～２番目の塩基はスペーサー配列の一部の相補配列、配列番号１８に示すｍｌｃＲ－ＲＶ２の３～１１番目の塩基はスペーサー配列の相補配列である。
ここで、上記のｍｌｃＲ－ＲＶ１及びｍｌｃＲ－ＲＶ２プライマーを使うことによって配列番号１に示すｍｌｃＲをコードするポリヌクレオチドの４８０位に塩基置換（本来アデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ））が生じる。そこで、生じた塩基置換を修正（グアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に修正）するために、フォワードプライマー：ｍｌｃＲ－ｒｅｐａｉｒ－ＦＷ（配列番号１９：５’－ＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴ－３’）及びリバースプライマー：ｍｌｃＲ－ｒｅｐａｉｒ－ＲＶ（配列番号２０：５’－ＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧ－３’）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより増幅した。増幅産物を大腸菌Ｋ－１２由来株のＨＳＴ０８（タカラバイオ社）に導入してアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養して形質転換を行なった。得られた形質転換体をさらにアンピシリン含有ＬＢ培地で培養後、上記と同様の方法でプラスミドベクターを精製し、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を得た。得られたプラスミドベクターのマップを図２に示す。図２中、ＣＡＰはｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ、Ｐｌａｃはｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｌａｃＯはｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを示す。
（３）ＲＢＳ、スペーサー、及びＧＦＰ発現プラスミドベクター「ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｐＵＣ１９」の作製
ｍｌｃＲなしのコントロールとして、上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」をテンプレートとして、ｍｌｃＲをコードするポリヌクレオチドの３’末端のさらに３’側のグアニン（Ｇ）を含むフォワードプライマー：ＲＢＳ－ＦＷ（配列番号２１：５’－ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣ－３’）と上記リバースプライマー：ＧＦＰ＿ＲＥＶ（配列番号１５）を用いてＰＣＲにより増幅後、制限酵素（ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ）処理したｐＵＣ１９に挿入して、プラスミドベクター「ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｐＵＣ１９」を作製した。
ｍｌｃＲなしのコントロールとして、上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」をテンプレートとして、ｍｌｃＲをコードするポリヌクレオチドの３’末端のさらに３’側のグアニン（Ｇ）を含むフォワードプライマー：ＲＢＳ－ＦＷ（配列番号２１：５’－ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣ－３’）と上記リバースプライマー：ＧＦＰ＿ＲＥＶ（配列番号１５）を用いてＰＣＲにより増幅後、制限酵素（ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ）処理したｐＵＣ１９に挿入して、プラスミドベクター「ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｐＵＣ１９」を作製した。
（４）欠損ｍｌｃＲ－ＧＦＰキメラ遺伝子の作製
上記（２）で作製したプラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を鋳型に、ｍｌｃＲ遺伝子の全長４８３ｂｐにおける３’末端（停止コドンは含まず）から１０、２０、２５、３０、４０、４５、６０、７４，１１０、２３５、２６５、３５５ｂｐの部分塩基配列をＰＣＲによって増幅し、ｍｌｃＲ遺伝子の５’末端側から所定の領域を欠損させた欠損ｍｌｃＲ－ＧＦＰキメラ遺伝子断片（それぞれ順にｍｌｃＲ_Ｒ１０、ｍｌｃＲ_Ｒ２０、ｍｌｃＲ_Ｒ２５、ｍｌｃＲ_Ｒ３０、ｍｌｃＲ_Ｒ４０、ｍｌｃＲ_Ｒ４５、ｍｌｃＲ_Ｒ６０、ｍｌｃＲ_Ｒ７４、ｍｌｃＲ_Ｒ１１０、ｍｌｃＲ_Ｒ２３５、ｍｌｃＲ_Ｒ２６５、ｍｌｃＲ_Ｒ３５５断片）を作製した。ＰＣＲに用いたプライマーは、増幅産物の５’末端側にＸｂａＩ切断サイト、３’末端側にＢａｍＨＩ切断サイトを含むように設計した。
上記（２）で作製したプラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を鋳型に、ｍｌｃＲ遺伝子の全長４８３ｂｐにおける３’末端（停止コドンは含まず）から１０、２０、２５、３０、４０、４５、６０、７４，１１０、２３５、２６５、３５５ｂｐの部分塩基配列をＰＣＲによって増幅し、ｍｌｃＲ遺伝子の５’末端側から所定の領域を欠損させた欠損ｍｌｃＲ－ＧＦＰキメラ遺伝子断片（それぞれ順にｍｌｃＲ_Ｒ１０、ｍｌｃＲ_Ｒ２０、ｍｌｃＲ_Ｒ２５、ｍｌｃＲ_Ｒ３０、ｍｌｃＲ_Ｒ４０、ｍｌｃＲ_Ｒ４５、ｍｌｃＲ_Ｒ６０、ｍｌｃＲ_Ｒ７４、ｍｌｃＲ_Ｒ１１０、ｍｌｃＲ_Ｒ２３５、ｍｌｃＲ_Ｒ２６５、ｍｌｃＲ_Ｒ３５５断片）を作製した。ＰＣＲに用いたプライマーは、増幅産物の５’末端側にＸｂａＩ切断サイト、３’末端側にＢａｍＨＩ切断サイトを含むように設計した。
得られたそれぞれのｍｌｃＲの部分塩基配列をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、その後同じＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＵＣ１９とライゲーションすることで、プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」における配列番号１に示すｍｌｃＲの全長（ｆｕｌｌ）を、ｍｌｃＲの５’末端から所定の領域を欠損させた部分塩基配列（配列番号２～１３）に置き換えたプラスミドベクター「ｍｌｃＲ＿１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿６０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿７４－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿１１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２３５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２６５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３５５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」を作製した。
（５）ｍｌｃＲ、ＲＢＳ、及びｍＲｕｂｙ３発現プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｍＲｕｂｙ－ｐＵＣ１９」の作製
上記ｍＥＧＦＰ遺伝子の代わりにｍＲｕｂｙ３遺伝子（Bajar, B.T. et al., 2016. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Sci Rep, 6, p.20889.）を用いた以外は、上記と同様の用法を行って、「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｍＲｕｂｙ－ｐＵＣ１９」を作製した。
上記ｍＥＧＦＰ遺伝子の代わりにｍＲｕｂｙ３遺伝子（Bajar, B.T. et al., 2016. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Sci Rep, 6, p.20889.）を用いた以外は、上記と同様の用法を行って、「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｍＲｕｂｙ－ｐＵＣ１９」を作製した。
［蛍光顕微鏡観察］
カバーガラス（２４×６０ｍｍ：松浪硝子工業）に大腸菌培養液を５μＬ滴下し、その上に１．５％アガロース片（８×８×１ｍｍ）を被せ、さらにカバーガラス（１８×１８ｍｍ：松浪硝子工業）を被せ、励起光源として水銀ランプが搭載された倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、観察を行なった。ｍＥＧＦＰ又はｍＲｕｂｙ３の蛍光のＺ ｓｃｏｒｅは、以下のように計算した。なお、大腸菌の蛍光値は、大腸菌内の任意の１箇所を代表値として用いた。背景蛍光は、カバーガラス上で大腸菌が観察されない任意箇所を用いた。
カバーガラス（２４×６０ｍｍ：松浪硝子工業）に大腸菌培養液を５μＬ滴下し、その上に１．５％アガロース片（８×８×１ｍｍ）を被せ、さらにカバーガラス（１８×１８ｍｍ：松浪硝子工業）を被せ、励起光源として水銀ランプが搭載された倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、観察を行なった。ｍＥＧＦＰ又はｍＲｕｂｙ３の蛍光のＺ ｓｃｏｒｅは、以下のように計算した。なお、大腸菌の蛍光値は、大腸菌内の任意の１箇所を代表値として用いた。背景蛍光は、カバーガラス上で大腸菌が観察されない任意箇所を用いた。
Ｚ ｓｃｏｒｅ＝(大腸菌の蛍光値－１０箇所の背景蛍光の平均値)／(１０箇所の背景蛍光の標準偏差)
［大腸菌の増殖測定］
分光光度計（島津製作所）を用いて、６００ｎｍでの吸光度を測定し求めた。
分光光度計（島津製作所）を用いて、６００ｎｍでの吸光度を測定し求めた。
［実施例１］形質転換体の観察
上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」で形質転換した大腸菌（ｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）、及びコントロールとして上記プラスミドベクター「ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」で形質転換した大腸菌（ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）をＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩暗黒環境下にて培養し、青色ＬＥＤ照射下で撮影した写真を図３に示す。図３中、左上がＧＦＰ／ｐＵＣ１９株、右下がｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株である。
上記プラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」で形質転換した大腸菌（ｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）、及びコントロールとして上記プラスミドベクター「ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」で形質転換した大腸菌（ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）をＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩暗黒環境下にて培養し、青色ＬＥＤ照射下で撮影した写真を図３に示す。図３中、左上がＧＦＰ／ｐＵＣ１９株、右下がｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株である。
さらに、ＬＢ培地を加えたカルチャーチューブに、上記で緑色蛍光を発することが確認されたコロニーを加えて一晩暗黒環境下にて培養後、大腸菌培養液を上述の蛍光顕微鏡観察方法によって観察した結果を図４に示す。
図３、図４より、ｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株では、ＬＢ培地で培養するだけで恒常的に緑色蛍光を発することが確認された。したがって、ＧＦＰをコードするポリヌクレオチドの上流にｍｌｃＲ遺伝子及びＲＢＳをコードするポリヌクレオチドを配置するだけでＧＦＰを発現させることが可能であることが明らかとなった。
なお、上記における「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」の代わりに上記「ｍｌｃＲ４８０Ｇ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」で大腸菌を形質転換した場合も、同様に恒常的に緑色蛍光を発し、ＧＦＰが発現していることが確認された（図示なし）。すなわち、ｍｌｃＲをコードする塩基配列の一部が変異した配列であっても緑色蛍光を発し、ＧＦＰが発現していることに影響はないことが確認された。
さらに、上記における「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」の代わりに「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｍＲｕｂｙ－ｐＵＣ１９」で大腸菌を形質転換した以外は、上記と同様の方法で蛍光顕微鏡観察を行った。結果を図５に示す。図５に示すように、ｍＲｕｂｙ３をコードするポリヌクレオチドの上流にｍｌｃＲ遺伝子及びＲＢＳをコードするポリヌクレオチドを配置するだけで、赤色蛍光を発し、ｍＲｕｂｙ３が発現していることが可能であることが明らかとなった。
また、上記のようにＧＦＰ、ｍＲｕｂｙのいずれを発現させた場合にも、翻訳促進効果のあるｍｌｃＲ遺伝子及びＲＢＳをコードするポリヌクレオチドは、ＧＦＰ又はｍＲｕｂｙをコードするポリヌクレオチドの上流、すなわち非翻訳領域に含むように設計されているため、発現したＧＦＰ又はｍＲｕｂｙに変異は生じていない。
［実施例２］欠損ｍｌｃＲ－ＧＦＰ形質転換体の蛍光強度
ｍｌｃＲ全長の塩基配列の代わりに、ｍｌｃＲの５’末端から所定の領域を欠損させた部分塩基配列に置き換えたそれぞれのプラスミドベクターを用い、実施例１と同様の方法で大腸菌Ｋ－１２由来株のＨＳＴ０８に形質転換して培養し、ＧＦＰの蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した結果を図６に示す。図６中、（ａ）はｍｌｃＲの欠損部位を表す図であり、（ｂ）はそれぞれのプラスミドベクターで形質転換した株のＧＦＰ蛍光強度（Ｚ ｓｃｏｒｅ）を示す図である。また、図６中「ｍｌｃＲ＿１０」、「ｍｌｃＲ＿２０」「ｍｌｃＲ＿２５」「ｍｌｃＲ＿３０」「ｍｌｃＲ＿４０」「ｍｌｃＲ＿４５」「ｍｌｃＲ＿６０」「ｍｌｃＲ＿７４」「ｍｌｃＲ＿１１０」「ｍｌｃＲ＿２３５」「ｍｌｃＲ＿２６５」「ｍｌｃＲ＿３５５」、「ｍｌｃＲ＿ｆｕｌｌ」はそれぞれ上記で作製したプラスミドベクター「ｍｌｃＲ＿１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ＿２０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿６０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿７４－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿１１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２３５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２６５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３５５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」で形質転換した株を表す。さらに、ＧＦＰはプラスミドベクターＧＦＰ／ｐＵＣ１９株、ＲＢＳ＋Ｓｐａｃｅｒはプラスミドベクター「ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｐＵＣ１９」で形質転換した株を表す。
ｍｌｃＲ全長の塩基配列の代わりに、ｍｌｃＲの５’末端から所定の領域を欠損させた部分塩基配列に置き換えたそれぞれのプラスミドベクターを用い、実施例１と同様の方法で大腸菌Ｋ－１２由来株のＨＳＴ０８に形質転換して培養し、ＧＦＰの蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した結果を図６に示す。図６中、（ａ）はｍｌｃＲの欠損部位を表す図であり、（ｂ）はそれぞれのプラスミドベクターで形質転換した株のＧＦＰ蛍光強度（Ｚ ｓｃｏｒｅ）を示す図である。また、図６中「ｍｌｃＲ＿１０」、「ｍｌｃＲ＿２０」「ｍｌｃＲ＿２５」「ｍｌｃＲ＿３０」「ｍｌｃＲ＿４０」「ｍｌｃＲ＿４５」「ｍｌｃＲ＿６０」「ｍｌｃＲ＿７４」「ｍｌｃＲ＿１１０」「ｍｌｃＲ＿２３５」「ｍｌｃＲ＿２６５」「ｍｌｃＲ＿３５５」、「ｍｌｃＲ＿ｆｕｌｌ」はそれぞれ上記で作製したプラスミドベクター「ｍｌｃＲ＿１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ＿２０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿４５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿６０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿７４－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿１１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２３５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿２６５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」「ｍｌｃＲ＿３５５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」で形質転換した株を表す。さらに、ＧＦＰはプラスミドベクターＧＦＰ／ｐＵＣ１９株、ＲＢＳ＋Ｓｐａｃｅｒはプラスミドベクター「ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｐＵＣ１９」で形質転換した株を表す。
図６（ｂ）に示すように、ｍｌｃＲ遺伝子の５’末端側の一部を欠損してもＧＦＰの蛍光が観察され、ＧＦＰが発現していることが確認できた。特に、蛍光強度に関して、ｍｌｃＲの３’末端から１０塩基の部分塩基配列を用いた場合、コントロールのＲＢＳ＋Ｓｐａｃｅｒと比較して２７倍ものＺ ｓｃｏｒｅを有していた。また、ｍｌｃＲ遺伝子の３’末端から４０塩基、２３５塩基、２６５塩基の部分配列を用いた場合、部分塩基配列にも関わらずｍｌｃＲ遺伝子全長を用いた場合と同様のＺ ｓｃｏｒｅを有し、ｍｌｃＲ遺伝子の３’末端から２５塩基の部分塩基配列を用いた場合には、ｍｌｃＲ遺伝子全長を用いた場合の約２倍ものＺ ｓｃｏｒｅを有していた。また、図６（ｂ）に示すように、「ＲＢＳ＋Ｓｐａｃｅｒ」や「ＧＦＰ」ではほとんど蛍光が見られなかった。かかる結果より、配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｌｃＲ）をコードする塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドにより、リボソーム結合サイトの下流にある遺伝子を高発現させることが可能であることが明らかとなった。
［実施例３］ＧＦＰの発現による生育とプラスミドベクター収量への影響
ＧＦＰを発現させることよる宿主細胞の生育への悪影響がないか調べた。まず、ＧＦＰ発現の有無における菌の生育速度を比較した。培養はＬＢ培地で行った。その結果、ＧＦＰ蛍光なしの株（ｐＵＣ１９株：プラスミドベクター「ｐＵＣ１９」で形質転換した株）の生育とＧＦＰ蛍光ありの株（ｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）の生育は同程度であった（図７Ａ）。図７Ａ中、横軸は培養時間、縦軸は培養開始時を１とした場合の相対細胞密度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を吸光度測定した結果である。また、それぞれの株から公知の手法でプラスミドベクターを精製し、プラスミドベクターの収量を比較した。プラスミドベクターの収量は、分光光度計（島津製作所社）を用いて、２６０ｎｍでの吸光度を測定し求めた。その結果、ＧＦＰ蛍光ありの株（ｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）の方が平均的にＧＦＰ蛍光なしのｐＵＣ１９株に対して収量が約２倍であった（図７Ｂ）。上記結果から、ＧＦＰ発現による生育に対する悪影響は観察されず、かつプラスミドベクターの収量が多いことが明らかとなった。
ＧＦＰを発現させることよる宿主細胞の生育への悪影響がないか調べた。まず、ＧＦＰ発現の有無における菌の生育速度を比較した。培養はＬＢ培地で行った。その結果、ＧＦＰ蛍光なしの株（ｐＵＣ１９株：プラスミドベクター「ｐＵＣ１９」で形質転換した株）の生育とＧＦＰ蛍光ありの株（ｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）の生育は同程度であった（図７Ａ）。図７Ａ中、横軸は培養時間、縦軸は培養開始時を１とした場合の相対細胞密度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を吸光度測定した結果である。また、それぞれの株から公知の手法でプラスミドベクターを精製し、プラスミドベクターの収量を比較した。プラスミドベクターの収量は、分光光度計（島津製作所社）を用いて、２６０ｎｍでの吸光度を測定し求めた。その結果、ＧＦＰ蛍光ありの株（ｍｌｃＲ－ＧＦＰ／ｐＵＣ１９株）の方が平均的にＧＦＰ蛍光なしのｐＵＣ１９株に対して収量が約２倍であった（図７Ｂ）。上記結果から、ＧＦＰ発現による生育に対する悪影響は観察されず、かつプラスミドベクターの収量が多いことが明らかとなった。
［実施例４］グルコースによる発現量の制御
大腸菌を利用して発現を行う際には、発現量を制御、すなわち発現量を高めたり、発現量を抑制する必要がある場合も生じる。上記実施例で用いたｐＵＣ１９ベクターは図２に示すようにＣＡＰ、ｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ及びｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを有しているので、グルコースにより発現の制御（カタボライトリプレッション）ができるか否かを調べた。
大腸菌を利用して発現を行う際には、発現量を制御、すなわち発現量を高めたり、発現量を抑制する必要がある場合も生じる。上記実施例で用いたｐＵＣ１９ベクターは図２に示すようにＣＡＰ、ｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ及びｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを有しているので、グルコースにより発現の制御（カタボライトリプレッション）ができるか否かを調べた。
上記実施例で作製した４種類のプラスミドベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ＿２５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ＿１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、及び「ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｐＵＣ１９」を公知の手法によって作製したケミカルコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（コスモバイオ社）に導入し、アンピシリン及び１％グルコース含有ＬＢ培地、又はアンピシリン含有、グルコース不含ＬＢ培地にて一晩培養した。培養後の培養液を上記と同様の方法で倒立型蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰの蛍光のＺ ｓｃｏｒｅを求めた。結果を図８に示す。図８中、黒カラムがグルコース含有、白カラムがグルコース不含である。
図８に示すようにグルコースなしの場合、ｍｌｃＲ遺伝子を含む本件ベクターを用いれば、ＧＦＰを高発現していることが明らかとなった。具体的には、Ｚ ｓｃｏｒｅとしてＲＢＳのみの場合と比較してｍｌｃＲ＿１０を有している場合で３．４倍、ｍｌｃＲ＿２５を有している場合で８．４倍、ｍｌｃＲ全長を有している場合で６．３倍も高発現していた。一方、グルコースを加えるといずれも発現が抑制されていた。したがって、培地中のグルコース量を調整することで、タンパク質の発現を制御可能であることが確認できた。
［実施例５］ＩＰＴＧによる発現量の制御
上記実施例で用いたｐＵＣ１９ベクターは図２に示すようにｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ及びｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを有しているので、ＩＰＴＧにより発現の制御ができるか否かを調べた。
上記実施例で用いたｐＵＣ１９ベクターは図２に示すようにｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ及びｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを有しているので、ＩＰＴＧにより発現の制御ができるか否かを調べた。
上記実施例で作製した４種類のベクター「ｍｌｃＲ－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ＿２５－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、「ｍｌｃＲ＿１０－ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ＧＦＰ－ｐＵＣ１９」、及び「ＲＢＳ－Ｓｐａｃｅｒ－ｐＵＣ１９」を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（コスモバイオ社製）に導入し、アンピシリン及び１％グルコース含有ＬＢ培地にて一晩培養した。その培養液の一部を、アンピシリン及び１ｍＭ ＩＰＴＧ含有、グルコース不含ＬＢ培地、又はアンピシリン含有、グルコース不含ＬＢ培地（ＩＰＴＧなし）にてさらに培養した。培養後の培養液を上記と同様の方法で倒立型蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰの蛍光のＺ ｓｃｏｒｅを求めた。結果を図９に示す。図９中、ＩＰＴＧありを「Ｗ／」、ＩＰＴＧなしを「Ｗ／Ｏ」と示す。また、横軸がグルコース不含ＬＢ培地での培養時間、縦軸がＺ ｓｃｏｒｅである。
図９に示すようにＩＰＴＧなしでもｍｌｃＲ遺伝子を含む本発明のベクターを用いれば、ＧＦＰを高発現していることが明らかとなった。また、ＩＰＴＧを加えることによって、ｍｌｃＲ遺伝子の部分配列、特にｍｌｃＲ遺伝子の全長４８３ｂｐにおける３’末端（停止コドンは含まず）から２５ｂｐの部分塩基配列を含む本件ベクターを用いれば、より発現量が増えることが確認できた。したがって、培地中のＩＰＴＧ量を調整することで、発現を制御可能であることが確認できた。
なお、上記実施例の結果を踏まえて、１）ｐＵＣベクターを使って、ＩＰＴＧなしの培地でもＧＦＰ発現が確認できる；２）この時、ｐＵＣベクターではＬａｃＩ－ＬａｃＯによる転写抑制機能が働いている（この抑制は完全なものではなく、転写されてしまう”モレ”があることが知られている）；３）この状況下で、ｍｌｃＲが接続されていることで平時（ｍｌｃＲなし）では確認できないＧＦＰ発現が観察される；ということは「上記（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドを備えていれば、発現対象のタンパク質の翻訳が促進されている」と考えられる。
本件ベクターを用いれば、原核生物を用いて有用なタンパク質の生産が可能となる。
Claims (7)
- 以下の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えた原核生物用発現ベクター。
（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）配列番号１に示す塩基配列の４７４～４８３番目の塩基配列を含み、かつ上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド； - リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に４～２０塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする請求項１記載の原核生物用発現ベクター。
- 配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列が、配列番号２に示す塩基配列であることを特徴とする請求項１又は２記載の原核生物用発現ベクター。
- 原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載の原核生物用発現ベクター。
- 請求項１～４のいずれか記載の原核生物用発現ベクターを含有する原核生物。
- 請求項５記載の原核生物を培養する工程と、培養した前記原核生物から発現対象のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の生産方法。
- タンパク質を発現するためのキットであって、請求項１～４のいずれか記載の原核生物用発現ベクターと、タンパク質を発現するための説明書を含むキット。
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