CN1064052C - 甲状旁腺素相关蛋白人源化抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次提供了一种对甲状旁腺素相关蛋白具有特异性的人源化抗体及其制备方法。该抗体主要由重链(VH+CH1)和轻链(L链)组成。其制备方法是使用基因工程的方法。该抗体作为药物可用于诊断、治疗和预防肿瘤。

Description

甲状旁腺素相关蛋白人源化抗体及其制备方法

本发明属于人源化基因工程抗体领域

甲状旁腺素相关蛋白(Parathyroid Hormone-Related Protein，PTHrP)具有与甲状旁腺素蛋白(Parathyroid Hormone PTH)相似的生物活性，它最早发现于恶性肿瘤所致的体液性高钙血症(HumoralHypercalcemia of Malignancy，HHM)患者的血液中，鳞状细胞癌、乳腺癌、泌尿系统癌、卵巢癌等肿瘤组织都能产生PTHrP，是引起HHM的因素之一。HHM在临床上表现为无食欲、恶心、多尿、精神异常甚至昏迷，一般多出现在癌症末期，严重影响其预后，而几乎在所有伴有HHM的肿瘤患者的血液中都能检测到PTHrP，因此对PTHrP的研究引起医学界极大的重视。目前得到医学界广泛认可的降低与肿瘤相关的高钙血症HHM的手段之一就是利用PTHrP的中和抗体对PTHrP进行免疫中和，在降低血钙的同时也抑制了分泌PTHrP的肿瘤细胞的生长，从而起到治疗肿瘤的目的。到目前为止人们已利用多克隆抗血清和鼠源性单克隆抗体对肿瘤细胞分泌的PTHrP进行免疫中和，从而降低了高钙血症，抑制了肿瘤细胞的生长。

目前，有关研究人员已利用杂交瘤技术得到抗PTHrP的单克隆抗体(专利号US5217896)，这种抗体能成功地检测、诊断和治疗由恶性肿瘤引起的高钙血症。建立鼠源性杂交瘤细胞系得到单克隆抗体的方法是抗体发展史上的一大革命，得到的抗体特异性强，已大量应用于临床。但是，单克隆抗体制作周期长，建株不稳定，重复性差。最主要的是杂交瘤所制单克隆抗体是鼠源性抗体，在人体上多次应用后会引起免疫反应，因而限制了其在临床上的普及应用。

自1989年首次报道利用抗体库技术制备人源化单克隆抗体以来，该技术已有了长足的发展(Ninnsim A,Hoogenboon HR,Tomlinson IM et ala.,Antibody fragments from a single pot phage display as immunochemicalreagentsa.EMBO J,1991；13:692)。目前已能从经过免疫或未经免疫的天然抗体库中筛选出多种抗半抗原、蛋白质、病毒粒子等人源化抗体或抗体片段。

在人体内，完整的抗体由四条链组成，即两条轻链L(VL+CL)和两条重链H(VH+CH1+CH2+CH3)。经修饰和改造后的人源化抗体片段可由VL+VH组成，也可由VL+CL和VH+CH1组成。如果抗体片段是单链形式，轻链和重链片段之间可由一个连接肽(Linker)相连，如果抗体片段VL+CL和VH+CH1由羧基端形成二硫键连接，即形成了体内抗体片段Fab。这种人源化抗体或抗体片段除了能达到和杂交瘤所制的单克隆抗体类似的效用，还有鼠源单克隆抗体无法比拟的优越性。

但到目前为止，还没有甲状旁腺素相关蛋白人源化基因工程抗体及其制备方法的报道。

本发明的目的是提供甲状旁腺素相关蛋白人源化基因工程抗体及其制备方法，其技术路线如下：

从肿瘤病人外周血中收集淋巴细胞，提取mRNA，逆转录成cDNA，设计引物，用PCR反应扩增出重链H的VH+CH1基因和轻链L的VL+CL基因。根据已经报导的人抗体基因家族性保守序列设计引物，引物两端设计的酶切位点与噬菌体递呈载体上相应的克隆位点一致。用聚合酶链反应扩增VH+CH1基因和VL+CL基因。

将重链VH+CH1基因和轻链VL+CL基因先后连接到载体上转化大肠杆菌。在辅助噬菌体的帮助下，有结合功能的免疫球蛋白分子片段Fab在丝状噬菌体的表面表达出来，构成抗体片段基因组合文库。噬菌体递呈载体pComb3上有相应的克隆位点，见图1。

重组载体转化大肠杆菌，重链VH+CH1和轻链VL+CL在导肽的带领下在大肠杆菌质周腔内装配成有结合功能的免疫球蛋白分子片段Fab，即二者在羧基端形成二硫键连在一起，和体内抗体装配的模式一样。Fab片段和噬菌体外膜蛋白gⅢ蛋白(由辅助噬菌体提供)融合表达，递呈在噬菌体表面，构成了抗体片段基因的组合文库，在此简称文库。

用PTHrP抗原对文库进行扩增、淘洗和筛选，得到阳性株。将文库进行扩增，加入已包被了抗原PTHrP的反应孔中进行孵育，递呈在噬菌体表面的Fab抗体与抗原牢固结合，其它非特异性噬菌体被冲洗掉，再扩增和抗原结合的噬菌体，如此反复，即可筛选到抗PTHrP的抗体片段Fab，序列分析已筛选到的抗体基因重链VH+CH1和轻链VL+CL，与人抗体基因序列数据库进行比较以确保其正确性。

将阳性株的抗体基因片段克隆到原核表达载体上组装成高效表达质粒。转化大肠杆菌得到重组菌，在可使所述抗体基因片段表达的条件下培养该重组菌。表达载体pIG110含有二价多顺反子操纵子、SD序列、转录终止子和相应的克隆酶切位点。转化大肠杆菌后，诱导其融合蛋白的表达。SDS-PAGE电泳表明融合蛋白分子量为52KD，以包涵体形式存在于大肠杆菌内，占菌体蛋白的30％左右。

分离表达的抗体。收集包涵体，变性后复性，过分子筛得到纯化的抗体蛋白。在细胞水平上检测其生物活性。Fab抗体蛋白能中和PTHrP的生物活性。

通过这一方法得到了对甲状旁腺素相关蛋白具有特异性的人源化抗体。具体地说，本发明得到甲状旁腺素相关蛋白，本发明也得到了编码甲状旁腺素相关蛋白的基因。氨基酸序列，核苷酸序列如下：VH+CH1链：CCC  CAG  CTC  ATA  GTG  GAA  GTG  TCT  TTC  AAC  GGT  ACA  TTC  GCT  CAC  AAA      48P    Q    L   I     V    E    V    S    F    N    G    T    F    A    H   KTTC GTG AGA TGC TGG GAT AAA TCG GTC TTC CCC AAG CTG CAC CCG GTC                     96F   V   R   C   W   D   K   S   V   F   P   K   L   H   P   VAGC TGG GTT GGG TAT GAG TCT TCG GAT AGA GAC TCT AAC TTT TGG GGC                    144S   L   V   G   Y   E   S   S   D   R   D   S   N   F   W   GAAT  ATG  GAC  TCT  CCC  CAC  CAG  AGA  TCG  AAC  ACA  GAC  GAT  AAG  ATG  TCG     192N    M    D    S    P    H    Q    R    S    N    T    D    D    K    M    STCT  AAG  TAC  TAT  GAC  GGT  AAA  ACC  ACT  GTG  TTC  AGA  CTG  AAC  CAC  TGG     240 S   K   Y   Y   D   G   K   T   T   V   F   R   L   N   H   WTCT GAA ATA CAG CCC ATG GTC GCT TTC GCT ATG AAG GTC GAG TGG AGA  288S   E   I   Q   P   M   V   A   F   A   M   K   V   E   W   RGAC ATA GGT CTG AAC CAC TCT CAG CCG ATG CAC CAG AAG TTC ACA TAC  336D   I   G   L   N   H   S   Q   P   M   H   Q   K   F   T   YGGG ACA TGG TTC GCT AGA TTT TCT CTG GAC ATG GAG CAC CAG AAG AGA  384G   T   W   F   A   R   F   S   L   D   M   E   H   Q   K   RCCC TTC GTC ATA TAT ACT TTC AGA CTG GCT GGT TCT GTC GGT GCT CAC  432P   F   V   I   Y   T   F   R   L   A   G   S   V   G   A   HTGG CAG TCT TGG TTC AAG GTC GAG ATG ACA TAC AGA ATA GCT GGT CTG  480W   Q   S   W   F   K   V   E   M   T   Y   R   I   A   G   LCCG GAC AAT ATC CAG TGG TCG GCC TAT CCC TTC TAT GTC ACA TAC CCC  528P   D   N   I   Q   W   S   A   Y   P   F   Y   V   T   Y   PTTC TGG GGT GCT CAC ATG GAG TAC CAC ATG AAG CAG TGC AGA TCT GTC 576F   W   G   A   H   M   E   Y   H   M   K   Q   C   R   S   VGCT AAA TGG CCC TCT CAG CAC TCT AGA CTG GTC CCC CAG GAC CAG AAG 624A   K   W   P   S   Q   H   S   R   L   V   P   Q   D   Q   KCTG GCT CAG TGG ATG AGA AAC ACA CCC TGT TCT TTC CCG ATC AAT     669L   A   Q   W   M   R   N   T   P   C   S   F   P   I   NL链：TAC ATG AAA TTC TCT AGA CTG GTC AAT ATC AGA GCT CAG TGG ATG TCT  48Y   M    K   F   S   R   L   V   N   I   R   A   Q   W   M   SCCG ATC AAT CTG GTC GAC GCT TGG CCG AAT GCT TAT TGG TGG GTC ACT  96P   I   N   L   V   D   A   W   P   N   A   Y   W   W   V   TCTG TTC CCG CCC TCC TCT GAG GAG GCA TGG GAT GAT AGC CTG AGT GGC 144L   F   P   P   S   S   E   E   A   W   D   D   S   L   S   GCCT AAT CAG CTC CCA GGA ACG GCC AAA TAT AAT TCT TGT CTC ATA AGT 192P   N   Q   L   P   G   T   A   K   Y   N   S   C   L   I   SGAC TTC TAC CCG GGA GCC CTG TTC CCG CCC TCT CTT CAA AAC AAG GCC 240D   F   Y   P   G   A   L   F   P   P   S   L   Q   N   K   ATAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT GAA ACC GTG GCA TGG GAT GAT AGC TGG 288Y   S   C   Q   V   T   H   E   T   V   A   W   D   D   S   WCAG GCG CAG ACT ATG CTC AAC ATA TGT ATA TTC GGA TCT AAT GTC ACT 336Q   A   Q   T   M   L   N   I   C   I   F   G   S   N   V   TCTG TTC AAA CCC CAC TAT TGG GAG TTC GCT ATG AGA AGA TTC GTC ATA 384L   F   K   P   H   Y   W   E   F   A   M   R   R   F   V   ITAT ACA AAC CAC TGG CAG AAG GGT TTC TTT AAG GCT CCC ATA TTC GGT 432Y   T   N   H   W   Q   K   G   F   F   K   A   P   I   F   GGAT TCT GCG ACT AAT TCT GCA ACT CTG CAC TAC ACG GGG AGC GAG TTC 480D   S   A   T   N   S   A   T   L   H   Y   T   G   S   E   FTCT  CTG  TGT  CAG  TGG  AAG  ACT  TCC  TAC  TCG  ACG  CCC  AAC  GTG  ACA  GTG  528S   L     C    Q    W    K    T    S    Y    S    T    P    N    V    T    VGCC  GTG  TTC  GGA  CTG  GGA  CAG  TGG  TTC  AAG  ACC  GCT  GTC  ACT  TGC  CTG  576A    V    F    G    L    G    Q    W    F    K    T    A    V    T    C    LTTC  CAG  CTG  ACC  AGG  TCT  AAC  ATC  GGC  TCA  CAG  TGG  CTG  ATC  CCT  TCC  624F    Q    L    T    R    S    N    I    G    S    Q    W    L    I    P    SCTG  CTC  TGT  TAC  ACT  CTC  CAG  GTG  TTC                                     651L    L    C    Y    T    L    Q    V    F

通过本发明的方法得到的抗体和PTHrP有高度的亲和性，能中和PTHrP的生物活性，当标记上一个生物记号(marker)，如酶、生物素、荧光素、生色化学基团或放射性同位素，能用于检测和分析PTHrP在人正常组织和肿瘤组织中的表达水平，达到检测正常情况下和病理情况下血钙代谢和调节情况(如骨质疏松症Osteoporosis和HHM)，也起到诊断恶性肿瘤所致的高钙血症的目的。

本发明的抗体基因还可以和人白细胞介素-2，肿瘤坏死因子等杀伤肿瘤因子连接在一起，共同表达成融合蛋白。抗体部分既起到免疫中和作用，又起到体内导向作用，从而更准确地杀伤肿瘤细胞。

本发明的抗体可以单独施用，也可以和药物可接受的载体一起施用。

本发明方法的优点在于：(1)工艺流程简单，成本较低，能在短期内得到大量产品，为大规模临床应用创造了条件；(2)特异性高，是血清多克隆抗体所无法比拟的；(3)消除了鼠源单克隆抗体对人体的免疫原性，保证了应用于人体的安全性；(4)整个工艺流程技术含量高，稳定性高，重复性好，这是基因工程药物能应用于临床的基础条件。

附图简要说明图1是pComb3载体构建图。图2是本发明方法的流程图。

实施例：

1．设计一组引物克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因。构建噬菌体文库。

根据已知的人免疫球蛋白可变区基因库数据可知抗体基因具有家族性保守序列，以此为基础设计出六条引物，利用多聚酶链式反应(PCR)克隆出全套免疫球蛋白可变区基因，这六条引物是：5’(CG)AG GTG CAG CTC GAG (CG)AG TCT GGG 3’5’GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG 3’5’GA(AC) AT(CT) GAG CTC AC(CG) CAG TCT CCA 3’5’GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC 3’5’(GC)AG GTG CAG CTG CTC GAC TCT GGG 3’5’GAC ATC GAC CTG ACC CAG TCT CCA 3’用DNA合成仪合成这六条引物，纯化后用于PCR，模板DNA的制备材料源于肿瘤病人血液中的淋巴细胞，从淋巴细胞中提取总的mRNA逆转录成cDNA，逆转录反应系统由Promega公司提供，第一条cDNA链的反应体系如下：

4ul      MgCl2，25mM

2ul      5×反转录缓冲液

2ul      10mM dNTP混合物

0.5ul   rRNasin核糖核酸酶抑制剂

1ul(15u) AMV反转录酶

5ul      RNA(2ug)

加无RNase水至20ul

混匀，42℃反应30分钟，得到第一条cDNA链。

PCR分别扩增H链和L链基因：

5ul     cDNA

1ul     Taq聚合酶(1-2u)

1ul     5’引物(50pmol)

1ul     3’引物(50pmol)

10ul    10×Taq酶缓冲液(含氯化镁)

1.5ul   dNTP

PCR反应条件为：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，35个循环后，取10ul反应混合物以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到660bp左右的H链带和660bp左右的L链带，分别与人免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区相近。

L链用SacⅠ和XbaⅠ酶切，H链用XhoⅠ和SpeⅠ酶切，将Pcomb3同样酶切后先后与上述PCR产物进行连接，用电穿孔法将转入大肠杆菌XLl-Blue，正确插有H链和L链的质粒定名为P24，筛选阳性克隆，确定连接正确，至此已构建成基因工程组合抗体的噬菌体文库。

2．文库的扩增淘洗和筛选

将上述文库扩大培养，加入辅助噬菌体M13，抗体的H链和L链蛋白即与M13外壳蛋白pⅢ融合表达在丝状噬菌体的表面，扩增过程如下：

1ml XLl-Blue(OD600≈1.0)+100ul文库+LB至10ml

37℃摇床震荡1小时。

扩大加入100ml培养基(LB)，37℃摇床震荡1小时

加入辅助噬菌体M131ml(效价＞10⁷)，37℃摇床震荡2小时

加入卡那霉素至终浓度70ug/ml 37℃摇床震荡过夜。第二天提取噬菌体进行文库的淘洗富集。

离心收集培养物上清

加PEG8000至终浓度4％，加NaCl至终浓度3％

充分溶解后冰浴30分钟

离心收集沉淀物，将沉淀物充分溶于3ml磷酸缓冲液中

加入包被有PTHrP抗原(2ug/孔)的反应孔中，孵育2小时

倒出噬菌体，注满水清洗一次

用TBS/Tween洗10-20次，在此过程中上下吹打数次

TBS/Tween洗10-20次，在此过程中上下吹打数次

TBS/Tween缓冲液体系为：50mM Tris-HCl，pH7.5

                       150mM NaCl

                       0.05％ Tween 20

最后注满水清洗一次，去掉TBS/Tween

注入50ul洗脱液EB，室温放置10分钟

EB洗脱液体系为：0.4M甘氨酸，0.39M盐酸，0.1％牛血清白蛋白

上下吹打几次，吸取出，每50ul洗脱液加入3ul中和液，充分中和至pH7.0左右，中和液为2M Tris。

每50ul中和后的洗脱产物感染2ml新鲜的大肠杆菌XLl-Blue，室温放置15min

加入10ml培养基(SB)37℃摇床震荡1小时

倒入100ml培养基(SB)，37℃扩大培养，1小时

加辅助噬菌体M13(10¹² PFU)37℃摇2小时

加入卡那霉素至终浓度为70ug/ml 37℃摇过夜

第三天，重复第一天和第二天的过程，如此重复三次。

将淘洗富集得到的产物铺于LB固体培养基上生长，37℃过夜。

挑取阳性克隆100个接种于2ml LB培养基中，37℃培养过夜。

收集噬菌体加入100个已包被有PTHrP抗原0.5ug/孔中孵育2小时。

用常规ELISA方法筛选，得到强阳性克隆。

3．甲状旁腺素相关蛋白人源基因工程抗体序列测定和分析

对所筛选的抗体进行序列测定，测定选用Amersham Life Science公司提供的United States Biochemical系统，重链VH+CH1的DNA序列和氨基酸序列如图1所示，轻链VL+CL的DNA序列和氨基酸序列如图1所示。

4．抗体基因在大肠杆菌中的表达

从质粒P24上分别切下抗体基因H链和L链，连接到原核表达型质粒pIG110的相同位点，pIG110含二价多顺反子，重组后质粒转化大肠杆菌BL21株系，经酶切签定H链和L链基因正确插入后，该质粒命名为pHLBl，含pHLBl的工程菌定名为PHLBl。

挑PHLBl单菌落到3ml含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃振荡培养过夜，按10％接种量转种于20ml LB培养基中，30℃培养至OD600值达0.5，升温至42℃，诱导6小时。取1ml培养液离心，收集菌体，溶于100ul蛋白上样缓冲液中。

50mmol/L      Tris-HCl   pH6.8

100mmol/L     DTT

2％           SDS

0.1％         溴酚蓝

10％          甘油

取10ul作10％SDS-PAGE电泳，鉴定表达产物，挑选表达量最大的菌株，做为菌种存于甘油管中。

5．工程菌的发酵和发酵后的纯化

LKB-Bromma发酵罐：PHLBl单菌落在6ul LB-Amp培养液中，30℃过夜培养，做为一级种子液，供发酵用。

按1∶50比例，将一级种子液接种于300ml MgCA-Amp培养液中，30℃摇16小时，做为二级种子液，供发酵用。

将发酵罐最压蒸汽灭菌(15P，30分钟)，冷却后安放在操作台上，设定温度为30℃，pH7.0，溶氧85％，搅拌速度450次/分。各项参数稳定后，1∶10接种二级种子液，维持上述参数条件不变，5小时后将温度升至42℃继续诱导10小时，自动调节pH7.0左右，溶氧此时大于100％。

收集菌体，超声破碎，收集包涵体，反复洗涤后，加含8M尿素的变性液。

8M        尿素

50mmol/L Tris-HCl(pH8.5)

1ul/ml   β-ME

溶解沉淀，将溶解后的包涵体过Sephrose CL600分子筛柱，上样的包涵体浓度调至10mg/ml，收集峰值样品，用12％SDS-PAGE检测，合并含有目的蛋白的各管溶液，加含1M尿素的复性液。

50mmol/L  Tris-HCl(pH9.0)

1mol/L    尿素

最后用无尿素的复性液透析后，回收样品，将样品再过一次分子筛柱，洗脱和平衡条件相同，收集各个洗脱峰值，鉴定目的蛋白后合并到一起超滤浓缩。

纯化后的成品在Solo细胞系上检测其生物活性，Solo细胞系为分泌PTHrP的细胞系，由澳大利亚墨尔本大学提供，经检测，该产品能抑制Solo细胞的生长。该检测方法请参阅美国专利No.5127896。

根据本文公开的内容，本领域普通技术人员可以得到本文所述的对甲状旁腺素相关蛋白具有特异性的人源化抗体。众所周知，抗体的可变区是高度变化的，且无法预知，因此重复本实验所得到的抗体在氨基酸一级结构上不会完全相同。因而本发明公开的，并且根据本发明的方法也是可以得到的是一类人源化抗体，其共同特征是对甲状旁腺素相关蛋白具有特异性。

Claims (6)

1、一种对甲状旁腺素相关蛋白具有特异性的人源化抗体，其中，VH+CH1和L链是通过羧基端的二硫键相连的。

2、根据权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于它具有如下所示的VH+CH1和L链的氨基酸序列：VH+CH1链：P    Q   L   I     V    E    V    S     F     N     G     T     F     A     H     KF    V   R   C     W    D    K    S     V     F     P     K     L     H     P     VS    L   V   G     Y    E    S    S     D     R     D     S     N     F     W     GN    M   D   S     P    H    Q    R     S     N     T     D     D     K     M     SS    K   Y   Y     D    G    K    T     T     V     F     R     L     N     H     WS    E   I   Q     P    M    V    A     F     A     M     K     V     E     W      RD    I   G   L     N    H    S    Q     P     M     H     Q     K     F     T      YG    T   W   F     A    R    F    S     L     D     M     E     H     Q     K      RP    F   V   I     Y    T    F    R     L     A     G     S     V     G     A      HW    Q   S   W     F    K    V    E     M     T     Y     R     I     A     G      LP    D   N   I     Q    W    S    A     Y     P     F     Y     V     T     Y      PF    W   G   A     H    M    E    Y     H     M     K     Q     F     R     S      VA    K   W   P     S    Q    H    S     R     L     V     P     Q     D     Q      KL    A   Q   W     M    R    N    T     P     S     S     F     P     I     NL链：Y    M   K   F     S    R    L    V     N     I     R     A     Q     W     M      SP    I   N   L     V    D    A    W     P     N     A     Y     W     W     V      TL    F   P   P     S    S    E    E     A     W     D     D     S     L     S      GP    N   Q   L     P    G    T    A     K     Y     N     S     C     L     I      SD     F    Y     P     G     A      L     F     P     P     S     L     Q     N      K      AY     S    C     Q     V     T      H     E     T     V     A     W     D     D      S      WQ     A    Q     T     M     L      N     I     C     I     F     G     S     N      V      TL     F    K     P     H     Y      W     E     F     A     M     R     R     F      V      IY     T    N     H     W     Q      K     G     F     F     K     A     P     I      F      GD     S    A     T     N     S      A     T     L     H     Y     T     G     S      E      FS     L    C     Q     W     K      T     S     Y     S     T     P     N     V      T      VA     V    F     G     L     G      Q     W     F     K     T     A     V     T      S      LF     Q    L     T     R     S      N     I     G     S     Q     W     L     I      P      SL     L    F     Y     T     L      Q     V     F

3、一种制备甲状旁腺素相关蛋白人源化抗体的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)从肿瘤病人外周血中收集淋巴细胞，提取mRNA，逆转录成cDNA，用PCR反应扩增出重链H的VH+CH1基因和轻链L的基因，

(2)将重链VH+CH1基因和轻链L基因先后连接到载体上转化大肠杆菌，在辅助噬菌体的帮助下，有结合功能的免疫球蛋白分子片段Fab在丝状噬菌体的表面表达出来，构成抗体片段基因组合文库，

(3)用PTHrP抗原对文库进行PTHrP抗体的扩增、淘洗和筛选，得到阳性株，

(4)将阳性株的抗体基因片段克隆到原核表达载体上组装成高效表达质粒，转化大肠杆菌得重组菌，在可使所述抗体基因片段表达的条件下培养该工程菌。

(5)分离表达的抗体。

4、一种编码权利要求1或2中任意一项所述的人源化抗体的基因。

5、根据权利要求4所述的人源化抗体基因，其特征在于它具有如下所示的VH+CH1和L链核苷酸序列：VH+CH1链：CCC CAG CTC ATA GTG GAA GTG TCT TTC AAC GGT ACA TTC GCT CAC AAA   48TTC GTG AGA TGC TGG GAT AAA TCG GTC TTC CCC AAG CTG CAC CCG GTC   96AGC TGG GTT GGG  TAT GAG TCT TCG GAT AGA GAC TCT AAC TTT TGG GGC  144AAT ATG GAC TCT  CCC CAC CAG AGA TCG AAC ACA GAC GAT AAG ATG TCG  192TCT AAG TAC TAT  GAC GGT AAA ACC ACT GTG TTC AGA CTG AAC CAC TGG  240TCT GAA ATA CAG  CCC ATG GTC GCT TTC GCT ATG AAG GTC GAG TGG AGA  288GAC ATA GGT CTG  AAC CAC TCT CAG CCG ATG CAC CAG AAG TTC ACA TAC  336GGG ACA TGG TTC  GCT AGA TTT TCT CTG GAC ATG GAG CAC CAG AAG AGA  384CCC TTC GTC ATA  TAT ACT TTC AGA CTG GCT GGT TCT GTC GGT GCT CAC  432TGG CAG TCT TGG  TTC AAG GTC GAG ATG ACA TAC AGA ATA GCT GGT CTG  480CCG GAC AAT ATC  CAG TGG TCG GCC TAT CCC TTC TAT GTC ACA TAC CCC  528TTC TGG GGT GCT  CAC ATG GAG TAC CAC ATG AAG CAG TTC AGA TCT GTC  576GCT AAA TGG CCC  TCT CAG CAC TCT AGA CTG GTC CCC CAG GAC CAG AAG  624CTG GCT CAG TGG  ATG AGA AAC ACA CCC TCG TCT TTC CCG ATC AAT      669轻链LTAC ATG AAA TTC TCT AGA CTG GTC AAT ATC AGA GCT CAG TGG ATG TCT  48CCG ATC AAT CTG GTC GAC GCT TGG CCG AAT GCT TAT TGG TGG GTC ACT  96CTG TTC CCG CCC TCC TCT GAG GAG GCA TGG GAT GAT AGC CTG AGT GGC 144CCT AAT CAG CTC CCA GGA ACG GCC AAA TAT AAT TCT TGT CTC ATA AGT 192GAC TTC TAC CCG GGA GCC CTG TTC CCG CCC TCT CTT CAA AAC AAG GCC 240TAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT GAA ACC GTG GCA TGG GAT GAT ACC TGG 288CAG GCG CAG ACT ATG CTC AAC ATA TGT ATA TTC GGA TCT AAT GTC ACT 336CTG TTC AAA CCC CAC TAT TGG GAG TTC GCT ATG AGA AGA TTC GTC ATA 384TAT ACA AAC CAC TGG CAG AAG GGT TTC TTT AAG GCT CCC ATA TTC GGT 432GAT TCT GCG ACT AAT TCT GCA ACT CTG CAC TAC ACG GGG ACC GAG TTC 480TCT CTG TGT CAG TGG AAG ACT TCC TAC TCG ACG CCC AAC GTG ACA GTG 528GCC GTG TTC GGA CTG GGA CAG TGG TTC AAG ACC GCT GTC ACT TCA CTG 576TTC CAG CTG ACC AGG TCT AAC ATC GGC TCA CAG TGG CTG ATC CCT TCC 624CTG CTC TTC TAC ACT CTC CAG GTG TTC                             651

6、根据权利要求1或2中任意一项所述的人源化抗体在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

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