CN1142855A

CN1142855A - 人源化抗体及其用途

Info

Publication number: CN1142855A
Application number: CN94194971A
Authority: CN
Inventors: 林毅然
Original assignee: T Cell Sciences Inc
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-11-21
Publication date: 1997-02-12
Anticipated expiration: 2014-11-21
Also published as: SG48420A1; US5861155A; AU699249B2; EP0737250A1; WO1995016038A3; LV11631B; FI962377A0; JPH09509307A; CZ287347B6; LV11631A; KR960706560A; HU9601574D0; NZ276170A; CA2178622A1; WO1995016038A2; CZ287298B6; GB9325182D0; FI962377A; CZ162896A3; CN1063792C

Abstract

本发明涉及人源化抗体或其结合蛋白，它能够结合到显示出特殊可变β链的T细胞上，尤其是可以结合到那些表现出人Vβ5.2和/或5.3以及Vβ8.1的T细胞亚群上。本发明还涉及这种抗体的制备，含有此抗体的药物组合物以及该抗体在医疗中尤其对自身免疫病的治疗中的应用。

Description

人源化抗体及其用途

本发明涉及人源化抗体及其结合蛋白，它能够结合到显示出特殊可变β链的T细胞上，尤其是可以结合到表达人Vβ5.2和/或5.3以及Vβ8.1的T细胞亚群上。本发明还涉及这种抗体的制备，含有此抗体的药物组合物以及此抗体在医疗中尤其对自身免疫病的治疗中的应用。

在免疫系统中，T细胞对于效应机制(effector mechanism)的分化和调节起着关键性作用(Paul et al.，(1987)Science 195：1293-1300)。由于不适当的免疫调节可导致自身免疫，因而T细胞对抗原和主要组织相容性分子的共同识别必须是特异性的并且应被精确调节。几个实验室已研究了涉及免疫调节不当的疾病，如自身免疫以及某些形式的免疫缺损。在这些疾病的病理中涉及到了T细胞。

已报道特定T细胞受体复合物的克隆或寡克隆扩充存在几种情况。最明显的例子是可导致T细胞白血病或淋巴瘤的恶性病变。对于T细胞白血病或淋巴瘤而言，由于T细胞受体被稳定地重排并呈现于细胞表面，T细胞受体即成为独特的肿瘤标记物。涉及到特定T细胞受体复合物的另一种情况是器官移植的受体，其T淋巴细胞具有T细胞受体，使他们可以攻击供体个体(如骨髓移植供体)的MHC分子。

更为重要的是：几个研究小组已报道了在某些自身免疫情况下选择性T细胞抗原受体V区域基因的使用。例如，Grunwald等人已注意到与肉样瘤病患者的外周血淋巴细胞相比，在支气管小泡灌注法中，Vα2.3基因产物优先在CD4+T细胞中表达(Grunwald et al.，(1992)Eur.J.Immunol.22：129)。在Kawasaki病中还注意到：此病一开始，Vβ2和Vβ8T细胞即优先扩充(Abe et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4066)。

在此方面还广泛研究了类风湿性关节炎。几个研究者已注意到T细胞亚群的优先扩充，例如：DerSimonian et al.，(1993)J.Exp.Med.177：1623(在CD8+外周血T淋巴细胞中具有Vα12.1的T细胞的优先扩充)；Stamenkovic etal.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：1179(由Southern印迹分析得知生长于IL2中的浸润滑液膜的T细胞是寡克隆的)；Paliard et al.，(1991)Science253：34(假设超级抗原激活包括自身反应性T细胞的Vβ14+T细胞，此T细胞克隆扩充并迁移至类风湿性关节炎患者的滑液中)；Howell et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10921(特别注意到Vβ3.14和17T细胞V区域基因在类风湿性关节炎患者滑液IL 2R+细胞中的使用)；Uematsu et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA88：8534(表明寡克隆T细胞V区域基因在单个RA患者滑液T细胞中的使用)；以及国际专利申请NO.WO 90/06758(涉及RA中的Vβ3.9和10)。

还广泛研究了肠炎病。几个研究小组已注意到扩充的T细胞群或优先的T细胞受体V区域基因的使用，例如：Posnett et al.，(1990)J.Clin.Invest.85：1770；Spencer et al.，(1991)J.Clin.Pathol.44：915；Trejjdosiewicz et al.，(1991)Clin.Exp.Immunol.84：440；和Van kerckhove et al.，(1992)J.Exp.Med.175：57。另外一些研究小组已报道了优先的T细胞V基因在麻风杆菌(Mycobacterium leprae)中的使用(Van Shooten et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11244；Wang et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：188。)

对于人而言，已发现炎症组织中Vβ8.1T细胞的扩充与几种自身免疫病相关，包括Crohn氏病(Posnett et al.，(1990)J.Clin.Invest.85：1770-1776)、Kawasaki病(Abe et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4066-4070和Abe et al，(1993)J.Exp.Med.177：791-796)以及类风湿性关节炎(Brennan etal，(1988)Clin.Exp.Immunol.73：417-423)。

另一种已被广泛研究的自身免疫病是多发性硬化病(MS)。MS是一种免疫介导的疾病，其特征在于中枢神经系统单核细胞浸润和脱髓鞘。尽管仍不知道MS的病理，但此疾病进程中涉及到遗传和环境因素。遗传因素的主要元素包括此疾病与特定II类主要组织相容性复合体(MHC)单倍型有关，具体地说是与HLA-DR21和DQW1有关(Terasaid et al.，(1976)Science 1933：1245-1247；HO et al.，(1982)Immunogenetics 15：509-517；Spielman et al.，(1982)Epidemiol.Rev.4：45-65；Francis et al.，(1986)Lancet 1：211；Elian etal.，(1987)Disease Markers 5：89-99；Urban et al.，(1988)Cell 54：577-592，Vandenbark et al.，(1989)Nature 341：541-544：Howell et al.，(1989)Science 246：668-670)。

已表明从MS患者的脑脊髓液中分离的T细胞可利用有限套V区域基因。MS患者体内激活髓鞘碱性蛋白特异性T细胞的实验表明，此疾病病理中涉及MBP反应性T细胞(Wucherpfennig et al.，(1990)Science 248：1016-1019)。用T细胞受体Vβ引物进行cDNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增以测定MBP反应性T细胞系对TCR Vβ的使用时，发现优先使用有限数量的Vβ基因(Wucherpfennig et al.，(1990)(文献同上)-Vβ17以及较小程度上Vβ12经常被用于识别人自身抗原MBP的优势免疫区域)；Oksenberg et al.，(1993)Nature 362：68。一些研究的结果也暗示在MS脑病灶中只有有限的T细胞受体Vα基因表达(Oksenberg et al.，(1990)Nature 345：344-346)。使用定量PCR和单克隆抗体(mAb)染色进行的T细胞全部组成成分分析表明：与对照相比，分离自MS患者的髓鞘碱性蛋白(MBP)特异性T细胞主要使用Vβ5.2和/或5.3(Oksenberg et al.，(1993)(文献同上)(在具有某种HLA表型病人的脑中检测到重排的Vβ5.2基因)和Kotzin et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9196(在MS患者的MBP特异性克隆中发现偏向于使用β链可变区5.2以及较小程度地使用Vβ6.1)。

目前，对于MS没有已知的有效治疗方法。(Harrison′s Principles of InternalMedicine，12 th ed.Wilson et al.，McGraw Hill.Inc.1991)。目前的治疗致力于改善急性病情、防止疾病复发或恶化以及缓解症状。

然而，已发现小鼠Vβ8.2可变区基因的表达与实验变应性脑脊髓炎(EAE)-一个人MS的小鼠模型相关。已阐明用鼠Vβ8.2特异性单克隆抗体治疗可预防和减轻病情(Achaorbea et al.，(1988)Cell 54：263和Urban et al.，(1988)Cell 54：577)。因此很需要开发适于治疗这种疾病的抗体或“抗体样”分子。

抗体一般包括两条以二硫键相连接的重链以及与每条重键的N-末端相联的轻链。每条重链的N-末端有一可变区，在其另一端紧跟着一恒定区。每条轻链的N-末端也有一可变区，紧随其后的是一恒定区。每对轻链和重链的可变区形成了抗原结合位点。轻链和重链上的可变区具有相同的一般性结构，每个区域包含四个区的构架，其序列相对保守，这四个区由三个互补性决定区(CDR)连接。这四个构架具有类似β-片层的构象，CDR形成了连接β-片层构建的环。构架区域使CDR靠得很近从而形成抗原结合位点。参考Kabat计数系统(Kabat et al.，(1987)“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，US Dept.of Health and Human Services，USGovernment Printing Office)，并结合WO 91/09967中所述的X-射线晶体学可测定抗体的CDR和构架区域。

为了产生可靶向特异性抗原的抗体，通常使用Kohler和Milstein的方法(kohler et al.，(1976)Nature 256：495-497)。此方法一般包括用抗原免疫小鼠，将来自免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，并从产生的杂交瘤中选择出一个或多个可分泌特异于靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。

在治疗中适合使用这种mAb(单克隆抗体)，但是这种mAb基本上来源于鼠，因此它们自身对人而言也是一种抗原。如果将这种mAb重复给人施用，人的免疫系统会对小鼠mAb产生应答，因此会使之变得无效。

因此，最初由Winter和他的同事们建议(例见Reichmann et al.，(1988)Nature 332：323-327和Verhoeyen et al.，(1988)Science 239：1534-1536)应将小鼠mAb的CDR移植到人构架上以产生CDR移植抗体。该抗体具有供体小鼠mAb的结合特性以及受体人构架的人相容性。

然而，抗体分子的功能取决于它的三维结构，而其三维结构反过来又取决于它的一级氨基酸序列。改变抗体的氨基酸序列会反过来影响其活性。同样，抗体片段不能维持结合活性所必需的适当的三维结构。另外，编码抗体的DNA序列中的变化会影响含有此DNA序列的细胞表达、分泌或装配抗体的能力。很难限定含有CDR的准确的残基，而且也没有必要象Kabat计数系统中所限定的那样，与高变区中所有残基相对应。有一些关键性的构架残基对于CDR为与抗原相互作用进行的定位至关重要，或者它们涉及重链和轻链之间的相互作用。有必要改变某些构架残基以使它们在某些位置与供体残基对应，从而提供在特征上较少“人化”的CDR移植抗体。

已公开了多种建议，可用于鉴定需要改变成供体残基的CDR和构架残基，以产生有用的CDR移植抗体(例见，Queen et al.，WO 90/07861；Kurrleet al.，Ep-A-0 403 156；Adair et al.，WO 91/09967；Queen et al.，WO92/11018；和Bendig et al.，WO 92/01568)。从这些文献中可看出，在任何具体情况下要产生有用的CDR移植抗体都是不容易的。

尽管在努力产生特异性CDR移植抗体的过程中本来存在的问题，在较优选的实施方案中本发明人仍成功地产生了CDR移植抗体。此抗体基于人构架区并具有某T细胞亚群特有的可变β链区域特异性的抗原结合位点。令人奇怪的是，本发明的人源化抗体与其鼠原型相比，表现出同样好或更好的与靶T细胞的结合亲和性。本申请要求保护的抗体或其部分提供了另一个优点，即它们比其鼠原型的免疫原性更低，因此当用于治疗时可减少对病人的有害反应。

本发明涉及对某些T细胞亚群具有选择结合特异性的人源化抗体，此抗体对于它们与这些亚群的结合高度敏感，并显示出该结合的特异性和亲和力如果不比原型mAb的更好，也是可与之相当。此人源化抗体的CDR区域的大部分来源于原型mAb。本发明还涉及利用新的编码某些高变和构架残基的cDNA，并将它们移植到人重链和人轻链构架中，以制备所述人源化抗体的方法。其它实施方案包括药物组合物以及使用这些抗体的治疗方法。

在一个特别优选的实施方案中，通过CDR移植将小鼠mAb的某些CDR和选定的构架残基移植到KOL重链和REI轻链构架来使识别人Vβ8.1的小鼠mAb，16G8，进行人源化。在具有Neo和DHFR选择性标记的哺乳动物细胞表达载体中分别编码人源化重链(IgG1)和轻链(K)的cDNA被传染进DHFR-中国仓鼠成纤维细胞(CHO)细胞系中，然后进行选择和扩增。被称作“TM29”的分泌出的人源化mAb保持了对人TCR Vβ8.1的特异性，其亲和力与原型小鼠mAb(16G8)的相当。本发明的抗体表明抗-TCR抗体的人源化是可以实现的，同时还可保持正确的亚群特异性和亲和力。

本发明其它的实施方案包括将这些人源化抗体用作治疗剂以治疗人自身免疫疾病，尤其是Crohn氏病。

在本发明的另一个特别优选的实施方案中，通过将CDR移植到NEWM重链和REI轻链构架中可使识别人Vβ5.2和5.3的小鼠mAb，TM23，人源化。在具有Neo和DHFR选择性标记的哺乳动物细胞表达载体中分别编码人源化重链(IgG1)和轻链(K)的cDNA被转染进DHFR-中国仓鼠成纤维细胞(CHO)细胞系中，然后进行选择和扩增。将分泌出的人源化mAb称作“TM27”，它保持了对人TCR Vβ5.2和5.3的特异性，其亲和力如果不比原型小鼠mAb(TM23)的更好，也与之相当。本发明其它的实施方案包括将TM27用作治疗剂以治疗人MS。

图1表示TM27的各种可变轻链序列和重链序列；

图2表示TM29的各种可变轻链序列和重链序列；

图3表示将TM27 L/NSO和TM27 L/CHO与4H11相比较的竞争性试验的结果；和

图4表示图3所示实验的Scatchard图。

本发明说明书中所用的某些术语的定义如下：

在本申请中，术语“抗体”被用来描述Ig或其任何片段、轻链或重链单体或二聚体、以及单链抗体，例如其重链和轻链可变区由肽接头连接的单链Fvs，无论所述抗体是天然的或是通过重组DNA技术或其它方式产生的或其它，只要这样的抗体包括至少一个抗原结合位点。抗体的其余部分不必仅包含衍生于Ig的蛋白质序列。例如，可构建一个基因，其中编码人部分Ig链的DNA序列与编码多肽效应或报道分子之氨基酸序列的DNA序列融合。因此“抗体”包含杂合抗体(见下文)。

本文所用术语“结合蛋白”指的是具有来自抗体或抗体的联合的特定氨基酸序列的构建体，所说序列所形成的空间构型可以形成至少一个抗原结合位点。

略语“mAb”用来表示杂交瘤或其衍生的细胞系所产生的单克隆抗体。

术语“重组抗体”被用来描述由涉及使用重组DNA技术的方法所产生的抗体。

术语“CDR”或“互补性决定区”指的是在三维空间并列排列以形成抗原结合表面的抗体重链或轻链可变区的那些部分。

术语“嵌合抗体”被用来描述一种抗体，其可变区作为一个整体来自于第一种哺乳动物的抗体，并已融合到不同种哺乳动物抗体的至少一个恒定区上。

术语“CDR-移植”被用来描述一种抗体或其部分，其CDR基本上来自第一种哺乳动物的抗体，并被移植到基本上来自第二种哺乳动物的可变构架区。所说构架区中的某些选定氨基酸也可以来自所说第一种哺乳动物。

术语“杂合抗体”被用来描述一种蛋白质，它至少含有Ig的结合部分，该部分通过肽键结合到至少部分其它蛋白质上。应说明的是某些本领域技术人员也会使用“嵌合”一词来描述这种构建体，但在本说明书中这种构建体是指杂合抗体，术语嵌合抗体表示上文限定的意义。

术语“人源化抗体”被用来描述一种抗体，其来自于第一种哺乳动物抗体的一个或两个可变区中具有至少一个，优选两个或三个CDR，应理解为它也包括与某些高变氨基酸序列结合的某些选定构架氨基酸。抗体剩下的Ig衍生部分来自一个或多个不同的抗体。可使用重组DNA技术或通过肽合成来制备可变区。

“表达载体”包括能够表达其中所含DNA序列的载体，即编码序列可操作地与能影响它们表达的其它序列相连接。有效表达载体的一个有用的，但不总是必需的(即昆虫细胞)要素是标记物编码序列，即编码能产生表型特征的蛋白质的载体序列(例如新霉素抗性、甲硫氨酸Sulfoximine抗性或色氨酸原养型)，从而使那些含有这些蛋白质的细胞易被鉴别出。简而言之，“表达载体”是一功能性限定，当其用于特定序列时，此术语还包括能影响特定所含DNA密码子表达的任何DNA序列。目前，这种载体通常的形式是质粒，因此“质粒”和“表达载体”经常互换使用。然而本发明意欲包括可行使等同功能的其它形式的表达载体，它们在本技术领域中时常成为公知，包括逆转录病毒、腺病毒、体外系统(Baranov et al.，(1989)Gene 84：2：463)等等。

上文已提到，当DNA序列被可操纵地连接到表达控制序列上(所处位置可确保表达控制序列的功能)之后，即可在宿主细胞中表达。这些表达载体在宿主生物体中一般可复制，或以附加体的形式或成为宿主染色体DNA的整合部分。

“重组宿主细胞”指的是已被使用重组DNA技术构建的载体转化的细胞。借助这种转化，宿主细胞可产生有效量的所需产物，而不是由非转化宿主所期望产生的较少量的、或往往少于检测量的所需产物。由重组宿主细胞产生的本发明抗体和结合蛋白的量可用于进行另外的实验或者为商业可接受的量，例如约100克或更多。

在描述从重组宿主中分离抗体或其结合蛋白的方法时，除非另有详细说明，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体的来源。换句话说，从“细胞”中回收意味着或者从旋转下来的全部细胞中，或者从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中，或者对骨髓瘤细胞系而言，还可以从腹水培养物中回收。

本发明的人源化抗体或其结合蛋白所具有的氨基酸序列包含基本上来自单克隆抗体的其CDR的全部或部分，所说单克隆抗体对T细胞的选定亚群，尤其是Vβ8.1亚群或Vβ5.2/5.3亚群具有特异性。在优选的实施方案中，单克隆抗体来源于鼠。在优选的实施方案中，抗体或其部分的可变区的构架氨基酸序列基本上来源于人，因此有了术语“人源化抗体”。据信当将抗体用于治疗病人时，此“人源化”可用来降低抗体的免疫原性。本文优选使用的是重链NEWM或KOL人构架区以及轻链REI人构架区。保留的某些选定构架残基是鼠的而不是人的。据信这样对使该分子获得适当的三维结构是必需的。从而增加它对特异性T细胞亚集的结合特异性和亲和力。

只要能维持对T细胞选定亚群的结合特异性和亲和力，根据本发明教导所制备的人源化抗体的任何部分(这里指广泛意义上的抗体)均属本发明构思的范围。因此，本发明范围中还明确地包括衍生于所说抗体的结合蛋白。保留了这些能力的其它片段也是如此，至少在某种程度上适于治疗用途，如下文所述。

本领域技术人员通过使用常规的结合试验可检测根据本文教导制得的多种构建体的结合参数，该试验是用被击靶的特异性T细胞或呈现出选定可变区的T细胞受体蛋白进行的。例如，可进行与原型mAb结合到多种细胞系的竞争结合试验，Scatchard分析及类似分析并将之与原型mAb所得结果相比较。另外，也可借助多种动物模型系统，如那些下文中将要描述的或者也可借助临床试验研究以估计根据本发明制得的构建体的治疗效力。应理解即使当构建体与靶抗原的结合模式不同于原型mAb，此构建体也可以是很合适的治疗剂。

在特别优选的实施方案中，人源化抗体或其结合蛋白的氨基酸序列含选自下列各组的可变轻链的全部或部分：

TM29轻链

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCOOFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT 106

TM27轻链

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107

或它与选自下列各组的可变重链的全部或部分的联合：

TM29重链1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 5051 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117

TM27重链1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWVGM 5051 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120

单个CDR附近选定的构架残基对于支撑CDR的三维结构至关重要(Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499)。因此，在某些较优选的实施方案中，设计了经修饰的重链。首次在残基66至69所包括在范围以及残基73处，用鼠序列Leu-Ser-Ile-Ser(66-69)和Asp(73)取代了人的相应部分序列。

在其它优选的实施方案中分别在第78和79位提供了鼠残基缬氨酸和苯丙氨酸，或在第92位提供了鼠精氨酸。

图1举例说明了这些取代，CDR以黑体并划线表示。这些优选的抗体构建体(包括其结合蛋白)结合到Vβ5.2/5.3上。

通过修饰重链残基23和24可提供本文其它优选的抗体及其结合蛋白，在这些位置处，鼠相应部分的序列Ala-被取代。其它构建体表明残基75可以是鼠脯氨酸残基，或者残基88、89和91分别为丙氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸。这些抗体构建体及其结合蛋白结合到Vβ8.1T细胞上，图2对此有更完整的描述。

本文特别优选使用的是CDR-移植抗体，它实质上含有与TM27重链相连接的TM27轻链，其中残基48或者是鼠亮氨酸或者是异亮氨酸。也特别优选的是实质上含有与TM29重链相连接的TM29轻链的CDR-移植抗体。

通过使用多种技术，在被转染细胞，如优选在酵母、昆虫、CHO或骨髓瘤细胞中表达，可产生本发明的人源化抗体或其结合蛋白，最优选的宿主细胞是CHO宿主细胞。

为了设计根据本发明的CDR-移植抗体或其结合蛋白，首先必需确定具有所需结合特性的抗体的可变区序列。这种DNA序列的适当细胞来源包括鸟类、哺乳动物或其它脊椎动物，例如鸡、小鼠、大鼠和兔，优选小鼠细胞。使用本领域公知的技术，由各自的mRNA合成重链和轻链的cDNA，再由此确定可变区序列(V_H和V_L)，然后使用Kabat法(文献同上)确定高变区序列。通过使用X-射线晶体学或分子造型技术的结构分析可测定CDR。然后可构建含有对应于高变区的所有残基以及某些选自构架区的残基的复合CDR。所得复合CDR作为“抗原结合位点”可被转移，而抗体的剩余部分如需构建成完整的Ig，则应包括重链和轻链恒定区以及其余的构架残基。后一部分可以不同类的人抗体为基础。

恒定区可选择成具有所需的效应子功能(effector fumction)，该效应子功能适合于如此构建的抗体的预期用途。例如，人IgG同种型IgG₁和IgG₃对于补体固定和细胞介导的裂解有效。为了其它的目的，其它同种型，如IgG₂和IgG₄，或其它类，如IgM和IgE也可能会更合适。

为了给人治疗，特别适于使用人同种型以降低治疗过程中的抗球蛋白反应。可根据公知的方法制备优选与其可变区构架区域相连接的人恒定区DNA序列。例如可使用Burroughs Wellcome Ltd的CAMPATH 1H。

本发明的优选实施方案提供了某些CDR-移植抗体，它们含有对人类构架区域(也即可变区CDR的外围)经选定的修饰，从而得到具有令人满意的结合亲和力的CDR-移植抗体。这种结合亲和力优选约为10⁵·M^-1至10¹²·M^-1，更优选至少约为10⁸·M^-1。最优选此结合亲和力约等于或大于原型抗体的结合亲和力(在较优选的情况下，此原型抗体为鼠抗体)。

在构建本发明的CDR-移植抗体的过程中，可通过诱变来改变V_H和/或V_L基因片段。本领域技术人员能够理解可用类似的方法改变编码抗体Fc部分或其它区域所含氨基酸残基或序列的那些核苷酸(例见PCT/US89/00297)。

只要能保留合适的阅读框架，则修饰方法包括增加、缺失或非保守性地替换有限数目的核苷酸或保守性地替换很多核苷酸。

可使用替换、缺失、插入或任何亚联合(Subcombination)来得到最终的构建体。因为有64个可能的密码子，但仅有20个已知的氨基酸。在此意义上遗传密码有简并性，不同的密码子可产生相同的氨基酸。然而对每个氨基酸而言密码是精确的，因此每个氨基酸至少有一个密码子，即每个密码子产生一单个氨基酸而不是其它。很显然，在转译过程中需保留适当的阅读框架以使最终产生的多肽得到适当的氨基酸序列。

在已知序列中预定的氨基酸位点增加、缺失或替换的技术是已知的。这些技术包括寡核苷酸介导的定点诱变以及PCR。

寡核苷酸定点诱变实质上包括使编码所需突变的寡核苷酸与含有需突变区域的单链DNA杂交，并使用该单链作为模板以使寡核苷酸延伸从而产生含有突变的链。多种形式的此项技术被描述于Zoller and Smith，(1982)Nuc.Acids Res.10：6487、Norris et al.，(1983)Nuc.Acids Res.11：5103，Zoller andSmith，(1984)DNA3：479，Kramer et al.，(1982)Nuc.Acids Res.10：6475。

PCR实质上包括使用序列特异性寡核苷酸体外指数扩增DNA。如有需要，寡核苷酸可带入序列变化。Mullis and Foloona.(1987)Meth.Enz.155：335中描述了PCR技术。使用PCR诱变的例子描述于Higuchi et al.，(1988)Nuc.Acids.Res.16：7351，HO et al.，(1989)Gene.77：51，HO et al.，EngineeringHybridization Restriction Genes Without the Use of Restriction Enzymes：GeneSplicing by Overlap Extension；Horton et al.，(1989)Gene 77：61。

从多种不同的多核苷酸(基因组DNA、cDNA、RNA或合成寡核苷酸)中可形成能最终表达所需抗体或其结合蛋白的本发明核苷酸序列。目前，优选多核苷酸序列含有cDNA和基因组DNA的融合。多核苷酸序列可编码多种Ig组分(例如V、J、D和C区域)。可使用多种不同的技术来构建它们。目前最常见的生产方法是将适当的基因组和cDNA序列相结合，但也可使用cDNA序列(见EP-A-0 239 400和Reichmann et al.，(1988)Nature332：323)。

US-A-4 816 567中描述了某此适当的表达载体和宿主细胞。

本文公开的载体和方法适用于广范围的原核和真核宿主细胞。

当然，一般来说克隆DNA序列以用于构建本发明所用的载体时优选使用原核生物，例如多种大肠杆菌(E.coli)质粒克隆载体特别有用，如Stratagene(San Diego California)的Bluescript M13载体可以用；pUC19c、Genbank Accession # VB0026、pBR322(下文中将描述)等等也可以用。当然这些例子只为了说明而不是限定范围。

原核生物还可以用来表达。可以使用上述E.coli菌株、如枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的杆菌以及其它肠细菌，如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)以及多种假单胞菌。

一般来说，将含有来自与宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的质体载体与这些宿主一起使用。载体普遍携有复制位点以及标记序列，该标记序列能给转化细胞提供表型选择。例如，典型地，可使用来自E.coli种的质粒pBR322的(Bolivar et al.，(1977)Gene 2：95)多种衍生物之一来转化E.coli。pBR322含有氨苄西林和四环素抗性基因，因此提供了鉴别转化细胞的简单方式。pBR322质粒，其衍生物或其它微生物质粒也可含有，或经修饰以含有启动子，它可被微生物利用以表达重组蛋白质。常用于重组DNA构建体的那些启动子包括乳糖启动子系统(Chang et al.，(1978)Nature 275：615；Itakura et al.，(1978)Science 198：1056；Goedell et al.，(1979)Nature 281：544)和色氨酸(trp)启动子系统(Goedell et al.，(1980)Nuc.Acids Res.8：4057和EP-A-0 036 776)。尽管这些是最常用的，已发现和使用了其它微生物启动子，已公开了涉及它们核苷酸序列的细节，熟练技术人员能够将它们连接到质粒载体上并具有功能(Siebenlist et al.，(1980)Cell 20：269)。

除原核生物以外，还可使用真核微生物，如酵母培养物。在真核微生物中，尽管通常使用各种其它菌株，但最常用的是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通的面包酵母。为了在糖酵母中表达，例如常可使用质粒YRp7(Stinchcomb et al.，(1979)Nature 282：39；Kingsman et al.，(1979)Gene7：141；Tschemper et al.，(1980)Gene 19：157)。此质粒已含有trpl基因，它可为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择性标记(Jones，(1977)Genetics 8：85：12)。通过在缺乏色氨酸的情况下生长，作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在为检测转化子提供了有效的环境。

酵母载体中适当的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶(Hess et al.，(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7：149；Holland et al.，(1978)Biochemistry 17：4900)。在构建适当表达质粒的过程中，还需将与这些基因相关的终止序列连接到表达载体中需表达序列的3′末端，以使mRNA聚腺苷酸化并且终止。具有由生长条件控制转录的附加优势的其它启动子是乙醇脱氢酶2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶和上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶(一个负责麦芽糖和半乳糖利用的酶)的启动子区域。含有与酵母相容的启动子、复制起点和终止序列的任何质粒载体都是适用的。

除了微生物外，得自多细胞生物体的细胞培养物也可以用作宿主。原则上，无论来自脊椎动物或无脊椎动物生物体的任何这种细胞培养物都可以使用。但迄今为止，人们兴趣最大的是脊椎动物细胞。近年来培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规方法(Kruse and Patterson，(1973)TissueCulture，Academic Press)。这种有用的宿主细胞系的例子有VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、MDCK和骨髓瘤、gs骨髓瘤(可从Celltech.Slough.U.K.得到)细胞系。这种细胞的表达载体可包括(如有必要)适当的复制起点、以及位于需表达基因前面的启动子、和任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸位点和转录终止序列。

为了在哺乳动物细胞中使用，表达载体上的控制功能常由病毒材料提供。例如，常用的启动子来自人巨细胞病毒(HCMV)、多瘤病毒、腺病毒2以及，最经常地来自猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，因为两者以也含有SV40病毒的复制起点的片段可容易地从病毒中获得(Fiers et al.，(1978)Nature 273：113)。另外，也可以并经常需要使用正常地与所需基因序列相关的启动子或控制序列，前提条件是这种控制序列与宿主细胞系统相容。

复制起点有两种方式提供，一种是通过载体的构建使其包含一个外源性起点，如来自SV40或其它病毒(如多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)的复制起点；另一种是由宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体整合进宿主细胞染色体，则经常后一种就足够了。

可通过公知的方法将含有所需DNA片段(例如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，所用方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，对于原核细胞常使用氯化钙转染法，而对于其它细胞宿主可使用磷酸钙处理、脂质转染法或电穿孔法(Maniatis et al.，(1990)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press)。

一旦表达，可根据本领域中的标准方法纯化本发明构建体，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析和凝胶电泳(Scopes，(1982)ProteinPurification，Springer Verlag，NY)。通过本领域已知的技术可确定如此表达的构建体的结合亲和力，这一点在本说明书实施例部分将更全面地举例说明。

对于药用而言，基本上纯化的CDR-移植抗体或其结合蛋白优选至少为90至95％均质、更优选98至99％或更高的均质性。一旦部分纯化或纯化至所需均质，CDR-移植抗体即可用于诊断或治疗(包括体外)或者用于开发和用于测定方法、免疫荧光染色等等(Lefkovite and Pernis，(1979 and 1981)Immunological Methods，Volumes I and II，Academic Press，NY)。

本发明的CDR-移植抗体或其结合蛋白的典型用途是治疗T细胞介导的疾病，例如，适于治疗的典型疾病包括自身免疫病，如I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、Crohn氏病和重症肌无力。

本发明T细胞抗体的治疗作用的前提是特定免疫相关疾病与特殊T细胞抗原受体V区基因产物的优选表达或特殊T细胞抗原受体V基因的扩充使用之间的联系。T细胞抗原受体V区是有用的，部分是因为它可通过利用T细胞抗原受体的特异性治疗来调节个体中的免疫应答。具体地说，特殊可变区基因座位的存在或表达已表明它与特殊的免疫相关疾病有关。通过确定与特定免疫疾病相关的特定V区基因座位，人们可通过抑制携该特殊V区的T细胞的攻击来对患者进行治疗。

本发明中的术语“治疗”，包括对疾病的“预防”、“抑制”或“治疗”这几种情况。“预防”是在疾病诱发之前施用保护性的组合物。因此，例如在动物模型EAE中，在注射致脑炎原诱导脑炎之前，成功施用保护性组合物可产生对脑炎的“预防”。

“抑制”是在疾病诱发之后，但在有临床表现之前施用此组合物。再如EAE的例子，在注射致脑炎原之后，但在神经学症状出现之前，成功地施用保护性组合物即为对疾病的“抑制”。

“治疗”是在疾病表现出来之后，施用保护性组合物。在EAE例子中，注射致脑炎原并出现临床症状之后，成功地施用保护性组合物即为对疾病的“治疗”。

可用来筛查抗体或其结合蛋白抗疾病保护或治疗疾病的效力的动物模型系统已经存在。Knight et al.，(1978)J.Exp.Med.147：1653和Reinersten etal.，(1978)New Eng.J.Med.299：515公开了在易感性小鼠中试验全身性红斑狼疮(SLE)。如Lindstrom et al.，(1988)Adv.Immunol.，42：233-284中描述，通过用来自另一物种的可溶性AChR蛋白诱导疾病，可在SJL/J雌性小鼠中试验重症肌无力(MG)。如Stuart et al.，(1984)Ann.Rev.Immunol.42：233-284中的描述，通过注射II型胶原可在小鼠易感品系中诱导关节炎。如Van Edenet al.，(1988)Nature 331：171-173中的描述，通过注射分枝杆菌热激蛋白可在易感大鼠中诱导辅助性关节炎(adjuvant arthritis)。如Maron et al.，(1980)J.Exp.Med.152：1115-1120中的描述，通过施用甲状腺球蛋白可在小鼠中诱导甲状腺炎。依赖胰岛素的糖尿病(IDDM)可以自然发生也可以如Kanasawaet al.，(1984)Diabetologia 27：113中所描述的，在小鼠某些品系中诱导此病。小鼠和大鼠中的EAE可作为人MS的模型。在此模型中，可按Paterson，(1986)Textbook of Immunopathology(Mischer et al.，eds.)Grune and Stratton，NewYork，pp 179-213；McFarlin et al.，(1973)Science 179：478-480；andSatoh et al.，(1987)J.Immunol.138：179-184中的描述，通过施用髓鞘碱性蛋白来诱导脱髓鞘病。

本发明的CDR-移植抗体或其结合蛋白也可与其它抗体联合使用，尤其是能与对此病有关之人细胞上的其它标记反应的mAb。例如，适当的T细胞标记可包括那些被划分在所谓的“分化簇”中的成员，“分化簇”是由第一次国际白细胞分化专题讨论会(Bernhard et al.，(1984)Leukocyte Typing，Springer Verlag，NY)命名的。

通常，本发明的CDR-移植抗体或其结合蛋白可以纯化的形式与药学上适当的载体一起被使用。一般，这些载体包括水或醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道载体包括氯化钠溶液，林格(Ringer′s)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏溶液。如有必要保持悬浮液中的复合体，则适当的生理上可接受的佐剂可选自如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐的增稠剂。

静脉内载体包括液体和营养补充剂以及电解质补充剂，如那些以林格葡萄糖为基础的补充剂。也可加入防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack，(1982)Remington′s Pharmaceutical Sciences，16 th Edition)。

本发明的构建体可用作单独施用的组合物，或用作与其它药剂联合施用的组合物。这些包括多种免疫治疗药物，如环孢菌素、氨甲蝶呤、阿霉素或顺氯氨铂、以及免疫毒素。药物组合物可包括多种细胞毒剂或其它试剂与本发明的CDR-移植抗体或其结合蛋白，或者甚至与根据本发明的构建体以及具有不同特异性的CDR-移植抗体相联合的“鸡尾酒剂”。

根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员普遍知道的任何一种。

对于包括而不局限于免疫疗法的治疗方法而言，可根据标准技术将本发明的CDR-移植抗体或其结合蛋白施用给任何病人。可以通过任何适当的方式给药，包括非肠道、静脉内、肌内、腹膜内给药，或者也可以通过用导管直接灌注给药。给药的剂量和频率依据年龄、性别、病人状态、同时服用的其它药物、不良反应和临床医师考虑到的其它因素而定。

本发明的构建体在使用之前可冻干保藏并在适当载体中重新构成。此技术对常规的免疫球蛋白效果很好，可使用本领域已知的冻干和重新构成技术。本领域普通技术人员应懂得冻干和重新构成可导致抗体活性不同程度的丧失(对常规的免疫球蛋白而言，IgM抗体比IgG抗体活性丧失得更多)，使用时调整剂量水平进行补偿。

服用含本发明CDR-移植抗体或其鸡尾酒剂的组合物可预防和/或治疗疾病。在某些治疗应用中，将选定细胞群体足以实行至少部分抑制、调制、杀伤或一些其它可测量的参数的量，定义为“治疗有效剂量”。达到此剂量所需的量依据疾病的严重程度和病人自身免疫系统的总体状况而定，但通常为每千克体重0.005至5.0mg CDR-移植抗体或其结合蛋白，更常使用的剂量是0.05至2.0mg/kg/剂。对于预防应用而言，可以类似或略低的剂量服用含有本发明构建体或其鸡尾酒剂的组合物。

含有根据本发明的构建体的组合物在预防和治疗情况下，用于辅助改变、灭活、杀伤或除去哺乳动物选定T细胞靶群。

在另一实施方案中，用本文所述的构建体可在体外有选择地从异质细胞群体中杀伤、排除或者有效地除去靶细胞群体。根据标准技术，将哺乳动物血液在体外与CDR-移植抗体或其结合蛋白混合，借此可杀死或者除去血液中不需要的细胞，然后将血流输回哺乳动物中。

除了治疗用途外，此构建体还可用于其它情况。在一个实施方案中，本发明抗体或其结合蛋白可用于研究用途。本发明的T细胞受体结合蛋白或抗体也可用于关于T细胞受体的结构和功能的研究。除了作为特定形式T细胞受体的底物或结合区外，这些抗体构建体也可作为构象研究的工具以阐明T细胞受体不同部分的天然构型。在另一实施方案中，T细胞抗体或其结合蛋白可用作诊断探针。在一个特定的实施方案中，本发明的构建体可用于测定生物样品中某一T细胞V区亚族的量或其存在。Rittershaus在WO92/08981(公开于1992年5月26日，题为“使用总白细胞表面抗原的治疗和诊断方法”)中描述了一个这种试验。照此，本发明根据检测生物样品中T细胞抗原受体特定亚群，提供了诊断如MS的免疫相关疾病的方法。

可根据本领域已知的技术标记CDR-移植抗体或其结合蛋白。此构建体也适于其它体内目的。例如，它们可用于外周血细胞的选择性细胞治疗，其中仅需要消除靶T淋巴细胞，或者类似地用于消除细胞培养物中不需要的T淋巴细胞。

下列实施例将更具体地描述本发明，不应认为是对本发明的限制。实施例1TM27-工作概况1.用T细胞白血病细胞系HPB-All免疫BALB/c小鼠(腹膜内一次，静脉内两次)。2.从这些小鼠中收获脾细胞，并与小鼠骨髓瘤无限增殖细胞系P3X53AG8.653融合。3.在HAT培养基中选择适当的克隆。4.通过免疫沉淀放射性标记的HPB-ALL以筛选如此选定的适于结合的克隆。5.通过有限稀释进行亚克隆。6.通过PBL刺激和CD3调节研究检查特异性。7.将分泌适当抗体的杂交瘤称为4H11。8.从此克隆中得到RNA，并分离mRNA。制备此mRNA的cDNA。9.测定cDNA的序列并检查准确度。10.将分离出的cDNA(H和K)克隆进M13载体。11.如实施例2中所述，通过诱变引入选定的人构架区域。12、从NS0转染子中纯化人源化抗体(每个约1mg)以进行初步评价。已制备了五个不同的TM27：

TM27L：重链的第48位为亮氨酸。

TM27I：重链的第48位为异亮氨酸。

TM27.1：KS变成VF(78-79)。

TM27.2：VTML/T变成LSIS/N(66-69/73)。

TM27.3：V变成R(92)。详细的实验描述概述

此方案的目的是使鼠抗人TCR(T细胞受体)Vβ5.2/5.3单克隆抗体(TM23)人源化以产生适于过程展开(process development)的表达人源化抗体的细胞系。此人源化抗TCR Vβ5.2/5.3单克隆抗体是TM27。鼠抗体

通过将小鼠骨髓瘤细胞系P3X63AG8.653与来自经T细胞白血病细胞系HPB-ALL免疫的Balb/c小鼠的脾细胞融合，产生4H11杂交瘤。此杂交瘤可表达对人T细胞受体(TCR)Vβ5.2和5.3具有特异性的单克隆抗体TM23。同种型是IgG2a/Kappa。人源化

从使用小鼠IgG2a和Kappa特异性3′末端引物构建出的4H11 cDNA文库中分离编码TM23重链和轻链的cDNA。通过DNA测序和内部氨基酸测序证实分离出的cDNA克隆。根据保守的小鼠构架序列的排列鉴别重链和轻链的CDR(互补决定区)。使用PCR分离出L、V、(D)、J(L、前导序列；V、可变区；D、多变区；J、连接区)DNA片段并克隆进CHO细胞表达载体pTCSLC_κDHFR和pTCSLCg1NeoAp中以表达小鼠V/人C嵌合抗体，所述载体分别携有人Kappa和IgG1恒定区cDNA。

根据由cDNA克隆推导出的氨基酸序列之间的比较，发现TM23重链属于Kabat亚组IB。V_κ序列属于Kabat V_κV。因此，选择了人NEWM和REI构架以分别使重链和轻链人源化。将重排的V(D)J片段(除了部分5′V和3′J)克隆进M13载体中以产生完整的基因组L-V(D)J构建体，所述载体的基因组构型中携有前导和内含子序列。骨髓瘤的表达

经诱变构建了CDR-移植V(D)J区后，将DNA片段克隆到分别携有人Kappa和IgG1恒定区的骨髓瘤表达载体上。构建出具有多种突变的五个人源化重链。将五个重链构建体中的每一个与人源化轻链一起共转染到NS0骨髓瘤细胞系中。从扩充的人IgG1/κ阳性转染子的细胞培养上清液中纯化人源化抗体以作评价。结果表明，具有最少的小鼠氨基酸序列的TM27L对Vβ5.3T细胞的染色如果不比其它人源化抗体更好，也和它们一样好。因此选择TM27L作进一步开发，并称之为TM27。CHO细胞表达

通过PCR从骨髓瘤构建体中分离TM27的重链和轻链前导区和V区，以cDNA构型将之克隆到如上所述的CHO细胞表达系统pTCSLCg1NeoAp^-(重链)和pTCSLC_κDHFR(轻链)中。选择CHO细胞转染子，克隆人IgG1/κ阳性细胞。扩充产量最高者之一，TM27L-662-35，以建立细胞库并制备少量人源化Ab(抗体)。在此方案整个过程中已鉴定了CHO表达的TM27抗体，它与来自骨髓瘤细胞系的那些以及亲代TM23是相当的。同时，扩充并克隆了CHO细胞克隆以增加抗体的表达，CHO细胞克隆表明此品系适于改良生产能力。详细描述用HPB-ALL免疫BALB/c小鼠

将得自Dr.Michael Brenner(Harvard Medical School)的人T细胞白血病HPB-ALL细胞(3×10⁷)的βF1(抗-人β链T细胞受体恒定区单克隆抗体)免疫沉淀物与完全弗氏(Freund′s)佐剂相混合并腹膜内注射(i.p.)到BALB/c小鼠体内。5周后，连续3天用盐水中的3×10⁷个细胞加强免疫，第一次为i.p.，后两次为静脉内(i.v.)。脾细胞与P3X63AG8.653融合

最后一次i.v.加强免疫后3天，用已有技术完成融合。使用50％聚乙二醇1500(BDH、Dorset、England)将5倍过量的脾细胞与P3X63Ag8.653细胞(小鼠骨髓瘤，得自BALB/c小鼠的不分泌Ig的细胞系，ATCC CRL 1580)融合。融合细胞的HAT选择

将融合细胞铺敷于每孔含2×10⁵BALB/c胸腺细胞作为饲养细胞的96孔培养板中，并在含有15％FBS(胎牛血清)和HAT(6M次黄嘌呤、50mM氨蝶呤和2mM胸苷)的RPMI-1640培养基中选择。于37℃、5％CO₂中，将细胞温育于潮湿空气中。杂交瘤的筛选

13至14天后，通过¹²⁵I-放射性标记的HPB-ALL细胞的免疫沉淀和ELISA筛选出具有生长细胞的孔。在免疫沉淀的条件下，CD3分子从TCRα和β链上分离下来。在T-75三角锥瓶中扩充与HPB-ALL反应的杂交瘤以进一步克隆。目的杂交瘤的克隆

通过有限稀释克隆对HPB-ALL TCAR(T细胞抗原受体)具有特异性的杂交瘤。将细胞铺敷于细胞密度范围为2至0.015细胞/孔的2倍系列稀释96孔培养板中，选择产率最高生长最好的集落并将上述步骤重复两次。两次附加选择循环之后鉴定出最终集落之一4H11。由克隆4H11表达的mAb免疫沉淀的分子与用βF1 mAb沉淀的TCRα和β链相同，βF1 mAb可与TCRβ链的恒定区反应。结果提示此mAb对HPB-ALL T细胞表达的TCRβ链具有特异性。为方便起见将此抗体称作TM23。对来自杂交瘤4H11的单克隆抗体TM23的鉴定

使用商品试剂盒(Zymed，South San Francisco，CA)进行TM23 mAb的同种型测定，结果表明它是小鼠IgG2a/κ同种型。

为了证实TM23 mAb的抗-TCR反应性，可筛选其共调节HPB-ALL细胞表面的CD3分子的能力。目前的研究表明，将细胞与抗-TCR mAb一起预保温时，TCRα或者β链的mAb可共调节细胞表面的CD3。当HPB-ALL细胞与TM23一起预保温时，与在未处理细胞中所见的Leu-4反应性相比，它与抗-CD3 mAb Leu-4的反应性显著降低。

检测正常人PBL(外周血淋巴细胞)与TM23的反应性。所研究的PBL T细胞中，有1.6％至3.0％与TM23反应。此结果是用几种其它mAb所得的结果的典型代表，这些mAb显示与特异性V区决定簇反应。

为了测定TM23是否与1C1(一种与人Vβ5.2和5.3亚族反应的mAb)(Boylston，et.al.，1986 J.Immunol.137：741)结合的表位相同，我们研究了一个mAb阻碍其它mAb结合的能力。当HPB-ALL细胞首先与TM23一起保温时，与荧光素偶联的1C1的结合受到抑制。当细胞首先与1C1一起保温时，对TM23的结合也会受到抑制。此结果暗示TM23和1C1结合到相同或紧邻的表位上。

为了进一步估计TM23和1C1是否具有类似的反应性，通过用其它mAb刺激可得到PBL细胞系。然后检查每个细胞系与各个mAb的反应性。当通过用TM23刺激确立了一个PBL细胞系时，1C1和4H11都可与类似百分数的细胞反应。用1C1刺激的PBL细胞系所得结果一样。4H11细胞培养物的培养

在添加了1％胎牛血清、100μ/ml青霉素、100μ/ml链霉素和12.5mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基(1∶1)中培养并扩充4H11克隆TM23.1 7-31-91。编码TM23重链和轻链之cDNA的制备

经离心分离约10⁸个4H11细胞并用冰冷的PBS洗涤一次。使用PromegaRNAgents总RNA分离试剂盒(Promega，Cat # Z5110)制备总RNA。使用Promega PolyATract mRNA分离系统(Promega Cat # Z5200)制备Poly(A)⁺RNA。使用BRL SuperScript试剂盒(BRL Cat # 82Y8SA)制备小鼠IgG2a和κ特异性cDNA文库。此试剂盒中具有IgG2a引物

5′ATATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGT3′和κ引物

5′ATATGCGGCCGCTTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT3′。

这两个引物含有Xho I限制性酶切位点及分别与小鼠IgG2a和κ编码区的3′末端互补的序列。将cDNA克隆到由试剂盒提供的质料pSPORT中并通过电穿孔将之转化到E.coli DH5α感受态细胞中。选择携有正确大小的插入片段的质粒克隆以测定其序列。编码TM23重链和轻链的cDNA克隆的鉴定

使用具有DNA插入片段5′端T7引物的测序试剂盒(USB Cat # 70770)对小量制备的具有正确大小插入片段的质粒DNA(轻链克隆#1、6、19、20、25和26；重链克隆#4、9、11、15、22和34)进行双链DNA测序。轻链克隆#6、20和25以及重链克隆#34的序列表明它们是小鼠Ig克隆。轻链克隆#6、20和25具有相同的序列，#6具有点突变且为无功能的克隆。使用κ

5′GACATTGATGTCTTTGGGGTAGAAGTTGTT 3′知IgG2a

5′GGTCACTGGCTCAGGGAAATAACCCTTGAC 3′恒定区特异性引物测定克隆#20和34的序列。此结果也表明克隆#6是无功能的克隆，克隆#20和34分别是轻链的重链的正确克隆。从这两个克隆中推导出的cDNA和氨基酸序列示于图1。

由于N-末端的封闭，可对分离自聚丙烯酰胺凝胶的经CNBr切割的肽片段进行微量氨基酸测序。得自此方法的内部V区氨基酸序列与从cDNA序列推导出的氨基酸序列是一致的。此结果证实了分离出的cDNA克隆就是编码TM23重链和轻链的那些。

根据Kabat和Wu(文献同上)的方法鉴定重链和轻链的CDR，即图1中划线部分。H和L链V区DNA的PCR分离和DNA测序嵌合TM23抗体的产生鼠VH DNA和NK DNA的分离

将TM23重链和轻链可变区适于插入表达载体中。通过PCR从TM23 MuVH.MuIgG2a中扩增编码TM23鼠VH的DNA序列，此PCR使用含有限制性酶PstI位点的寡核苷酸引物VH1BACK。

(5′AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG 3′)及也含有BstEII位点的寡核苷酸引物VH1FOR

5′TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3′M代表C或A、S代表C或G、R代表A或G、W代表A或T。将这些位点分别引入TM23VH DNA的5′和3′末端。用PstI和BstEII切割扩增的DNA并连接到用相同酶切割的载体M 13 VHPCR1双链复制型(RF)DNA的PstI和BstEII位点。

M13 VHPCR1是M13噬菌体载体，它衍生于M13-HuVHNP(Jones et al.，(1986)nature 321：522-525)并含有免疫球蛋白启动子、信号序列和适当的剪接位点(Orlandi et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：3833-3837)。

将连接过的DNA转化进感受态E.coli菌株TG1(K12，Δ(lac-pro)，supE，thi，hsd D5[F′tra D36，pro^A+B+，LacO^q，LacZ M 15]。从所得重组噬菌体噬斑中制备单链DNA。

通过PCR从TM23 MuVK.MuCK中扩增编码TM23鼠VK的DNA序列，此PCR使用含有PvuII位点的寡核苷酸引物VK1BACK

5′GACATCCAGCTGACCCAGTCTCCA 3′以及含有BglII位点的寡核苷酸引物VK1FOR

5′GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC 3′并联合使用了经设计以除去CDR3中HindIII位点的两个重叠内部引物，即寡943

5′CCGAGGAAGTTTACTATACTG 3′和寡944

5′GAGTATAGTAAACTTCCTCGG 3′(Horton et al.，(1990))。从而在TM23 VK DNA的5′和3′末端引入PvuII和BglII位点。用PvuII和BglII消化经扩增的DNA，并连接到被PvuII和BclI切割过的M13 VKPCR1上。用酶BglII和BclI切割DNA以产生可连接在一起的相容粘性末端。

M13VKPCR1含有与M13 VHPCR1相同的启动子、信号序列和剪接位点(Orlandi et al，(1989))。

将连接过的DNA转化到E.coli TG1中并从所得的重组噬菌体噬斑中制备单链DNA。

得到大小正确的PCR产物。VH为359个碱基对(bp)，VK为288bp。将VH DNA插入载体M13VHPCR1中，得到M13 TM23 MuVH。将VKDNA插入载体M13 VKPCR1中可得到M13 TM23MuVK。DNA序列的确证

已确证克隆了正确的DNA序列，而且PCR没有引入假突变。通过使用T7 DNA聚合酶或测序酶的双脱氧法(Sanger et al.，1977)得到了整个823碱基对(bp)VH区的单链M13噬菌体DNA序列，该区域包括启动子、信号序列、剪接位点和5′、3′非翻译序列。

如上所述，通过双脱氧法得到了整个630碱基对(bp)VK区的单链M 13噬菌体DNA序列，该区域包括信号序列，剪接位点和5′、3′非翻译序列。

已鉴定了具有适于插入表达载体的TM 23 VH所需序列的DNA克隆，选中其中之一#2以作进一步研究。将VH插入表达载体需引入必需的限制性位点，这会导致N-末端的一个氨基酸发生改变；即第5位的赖氨酸(K)变为谷氨酰胺(G)以及C-末端的一个氨基酸发生改变，即第108位的丝氨酸(S)变为苏氨酸(T)。

已鉴定了具有适于插入表达载体的TM23 VK所需序列的DNA克隆。选中其中之一#4以作进一步研究。除去Hind III位点，CDR3的氨基酸序列不会改变，但将VK插入表达载体需引入必要的限制性位点，由于使用了引物，会导致N-末端的三个氨基酸发生变化；即第4位的甲硫氨酸(M)变为亮氨酸(L)、第7位的苏氨酸(T)变为丝氨酸(S)、第8位的苏氨酸(T)变为脯氨酸(P)以及C-末端的一个氨基酸发生变化，即第105位的缬氨酸(V)变为谷氨酰胺(E)。将V区DNA片段克隆进M13载体

将已克隆的鼠可变区转移到含有人恒定区基因的表达载体上，用于随后在哺乳动物细胞内表达抗体。选择IgG同种型以供人源化

对于TM27而言需选择人IgG1同种型是由于下列原因：

1.IgG1具有介导ADCC(依赖抗体的细胞毒性)和CDC(依赖补体的细胞毒性)的能力，因此它对于减量调节Vβ5.2/5.3T细胞更加有效；和

2.在Ab人源化中更经常地使用IgG1。CDR移植的人构架选择人源化TM23抗体的产生人源化TM23可变区序列的设计

选择人构架序列以接受TM23 CDR，确定在人构架中必须被取代的必需的鼠残基。在计算机的帮助下，将TM23 VH和VK的氨基酸序列与其它鼠抗体的已知序列以及人抗体VH和VK序列进行比较。

使用了来自DNASTAR Ltd.London W 13 9BL，UK的程序ALLIGN，在Compaq 386信息处理机上运行此程序。通过使用Lipman-Pearson和Needleman-Wunsch法，ALLIGN列出了两个蛋白质序列。首先用Lipman-Pearson法测定了有最大同源性的区域，然后用Needleman-Wunsch法提供此序列的最终排列。

然后检查所得的排列结果，需格外注意某些因素，如CDR的长度和被认为对于支持CDR的构象至关重要的残基，如第71位和94位，以及与CDR相近的残基(Tramontano et al.，(1990)；Foote and Winter，(1992))。

通过与Kabat亚组的共有序列相比较，将TM23鼠VH分配到Kabat亚组VK V内。对于TM23构架中的这些亚组而言，没有不同寻常的氨基酸序列。

人抗体NEWM和REI分别为VH和VK提供了构架序列。对VH来说，除使用了CDR外，还使用了鼠残基27至30这一段以及残基71。据认为这些构架残基对于支持CDR的构象至关重要(Foote and Winter、(1992))。根据是否有庞大的侧链(赖氨酸或精氨酸)或较小的侧链(缬氨酸或丙氨酸)存在，残基71可固定CDR1和CDR2的相对位置(Tramontano et al.，(1990))。因此如同在TM23 VH中一样，用赖氨酸取代NEWM VH中的缬氨酸71。残基27至30形成了部分结构性的而不是高变的如Chothia和Lesk(1987)所限定的抗原结合环。构架残基47至49对于抗体结构也很重要(Foote and Winter、(1992))。因此构建了两个可任选其一的人源化重链：一个与NEWM中相同，第48位为异亮氨酸(I)；一个在第48位是亮氨酸(L)以使来自鼠VH的残基47至49得到保留。实施例2中显示了鼠VH序列与其人源化变体之间的比较。

为TM23 VK选定的人REI构架没作改变，实施例2中还显示了鼠VK序列与人源化变体之间的比较。哺乳动物表达载体pTCSNeo的描述

质粒pTCSNeo含有唯一的XhoI克隆位点，此处插入了目的基因。由位于腺病毒2主要晚期启动子(Ad2 MLP)上游的SV40增强子的调节序列控制着该插入基因的转录。Ad2 MLP自身位于腺病毒三重前导序列的上游。该插入基因的两侧为鼠免疫球蛋白Kappa(Igκ)位于3′末端的聚腺苷酸化信号。新霉毒抗性基因(Neo^r)使哺乳动物细胞可以被选择。此质粒还提供了细菌复制起点和β-内酰胺酶基因(Amp^r)。表达载体pTCSLNeo的构建

将两个互补寡核苷酸退火并连接到已被XhoI消化并用dT补平的pTCSNeo上，这两个寡核苷酸是，反义。

5′CGACATCGATGATATCGAATTCGCGGCCGCCAGCTGGGGCCCT -CTAGAC 3′和有义

5′CGAGTCTAGAGGGCCCCAGCTGGCGGCCGCGAATTCGATATC -ATCGATG 3′所得质粒pTCSLNeo具有由方向为5′XhoI/XbaI/ApaI/PvuII/NotI/EcoRI/EcoRV/ClaI 3′的多个限制性酶切位点组成的多接头，便于插入目的基因并表达。neo^r基因也可被改换为其它选择性标记基因。表达载体pTCSLDHFR^*的构建

经限制性酶HindIII和BamHI消化除去pTCSLNeo中的neo^r基因，并用鼠突变DHFR(二氢叶酸还原酶)(DHFR^*)基因片段重接连接，此片段是经用HindIII和BamHI消化得自Dr.Paul Berg(Department of Biochemistry，StanordUniversity Medical School)的质粒PSV2-DHFR^*而产生的。质粒pSV184H-Neo/DNS-V_κC_κ的描述

质粒PSV 184 ΔH-Neo/DNS-V_κC_κ(得自Dr.Lee Herzenberg，Stanford University Medical School-参见Jeffery Dargl的论文、第48-67页)是小鼠V和人C嵌合构建体，其中分离自Dansyl Chloride特异性鼠杂交瘤的重排κ链V-J区基因片段与人基因组Cκ片段(pSV 184 ΔH-Neo-C_κ)融合。通过PCR法分离人kappa链恒定区

使用含有人Kappa链恒定区的未经消化的质粒pSV 184 ΔH-Neo/DNS-V_κC_κ)pSVHuK)，用两个引物(一个正向、一个反向)进行PCR以分离恒定区。从操纵子得到寡聚体(引物)。PCR反应的试剂来自带有AmpliTaq的GeneAmp DNA扩增试剂盒(Perkin-Elmer Cetus)。在三种不同浓度的Mg²⁺中建立PCR反应。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物的等分试样。选择来自第一Mg²⁺(浓度为1.5mM)样品中的PCR产物，将跨越C区的引物设计成含有限制性酶切位点以便于克隆。因此扩增的DNA可被EcoRI消化(在3′末端)。位于5′末端的位点(PvuII)不被消化。接着在1％琼脂糖凝胶上电泳消化的DNA片段，切下300bp的带。从凝胶中抽提DNA，在1％琼脂糖凝胶上分析小的等分试样以测定其质和量。该300bp的带显得清晰，估计其DNA总量为约140ng。将人Kappa链恒定区克隆进pBS KS⁺载体并测序

使用T4 DNA连接酶，将经EcoRI消化的人Kappa链恒定区的DNA片段插入已被SmaI和EcoRI消化的载体pBS KS⁺中。用该连接混合物转化E.coliDH 5α感受态细胞。挑选单菌落并用来接种24份液体培养基。从每份培养物中制备DNA。用PvuII(C_κ的5′末端)和EcoRI(C_κ的3′末端)消化每个DNA样品，并在2％琼脂糖凝胶上分析。由于将较低分子量的带(300bp)分离出来有困难，故仅用PuvII消化DNA样品，在2％琼脂糖凝胶上分析过后，24个中有19个的Cκ插入是正确的。选择样品#1-5(19个正确样品中的)进行测序。测序使用的是T7和T3引物(其序列是横跨载体中插入物两侧的序列)。其它测序试剂来自Sequenase Version 2.0试剂盒(USB)。经证实样品#5具有人Kappa链恒定区的正确序列。将人Kappa链恒定区克隆进哺乳动物表达载体pTCSLDHFR^*以成为pTCSLC_κDHFR^*

使用PvuII和EcoRI限制性酶，从pBS KS载体(样品#5)中分离人Kappa链恒定区。然而，由于前述的带分离存在的困难，故需用构建体pBS/人C_κ进行第二次消化。第二次消化涉及EcoRI和XbaI(位于PvuII位点的5′侧)，产生约300bp的片段。接着用凝胶纯化此片段，并经PvuII消化以除C_κ5′末端残留的载体小片段。凝胶纯化此最终的片段，并在1％琼脂糖凝胶上分析以定性并估量。C_κDNA表现为约280bp处的清晰的带，估计其总量为约135ng。

由于表达载体pTCSLDHFR^*中三个EcoRI位点的存在，经测定只有克隆在PvuII位点才最好。由于C_κDNA是经PvuII-EcoRI消化制备的，故应使用Klenow片段修复EcoRI末端(以形成平头端)，将经修复的平头化C_κNA连接到已被PvuII消化并经磷酸酶处理(使用牛小肠磷酸酶)过的pTCSLDHFR^*载体上。用此连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。挑选单个菌落，并用来接种24份液体培养基。从每份中制备DNA。用PvuII和HindIII消化所有的DNA样品。并在1％琼脂糖凝胶上分析。经测定24个样品中有5个含有方向正确的C_κ插入。选择样品#7继续实验。用野生型DHFR基因取代突变的DHFR^*基因

为了在CHO(dhfr^-)DUX B11细胞中使载体pTCSLC_κDHFR^*能够表达，用DHFR基因取代DHFR^*基因。用限制性酶HindIII和BglII消化得自pTCSLC_κDHFR^*样品#7的DNA以及pSV 2-DHFR(该质粒来自Dr.Paul Berg，Department of Biochemistry，Stanford University Medical School)以分离各自的基因片段。通过分析确定了pTCSLC_κDHFR^*载体中另外的BglII位点也除去了部分poly A位点，这会影响到载体的功能。因此，使用HindIII和BamHI重复消化。用磷酸酶处理载体的(DHFR^*)pTCSLC_κ部分。然后用凝胶纯化两个分离片段(pTCSLC_κ和DHFR)并在1％琼脂糖凝胶上分析以定性并定量。两条带都显得清晰，且浓度相近，为～40-50ng/ml。使用T₄ DNA连接酶将DHFR基因连接到pTCSLC_κ载体上。用此连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。挑选单菌落，并用来接种24份液体培养基。从每份中制备DNA。用HindIII和BamHI限制性酶消化以分析DNA。在24份培养物中，有23个具有显示出DHFR基因插入pTCSLC_κ载体的正确的带。选择样品#22以供进一步使用。体外诱变以构建具有人构架的CDR-移植V区人源化可变基因的构建

通过M13 VHPCR1模板的定点诱变构建人源化VH基因，所述模板含有具有人骨髓瘤蛋白NEWM的构架区的合成VH基因(见Jones et al.，1986)。从生长于dut^-、ung^-E.coli菌株RZ 1032的M13 VHPCR1中制备单链模板DNA，以使模板DNA在胸腺嘧啶的地方含有尿嘧啶。合成诱变的寡核苷酸引物以编码TM23 CDR，并与位于任一侧的侧翼序列有大约15bp的精确配对。如果TM23 CDR序列与模板序列配对，使用较短的寡核苷酸引物。所使用的引物是CDR1

5′TGGCTGTCTCACCCAGTTTACACCATAGGCGGTTAATGAGAAG -CCAGACACGG 3′CDR2

5′TGCTGGTGTCCTTTCAGCATTGTCACTCTGGATTTGAGAGCTG -AATTATAGTCTGTATTTCCATCACCCCATATCATTCCAAT/C-CCACTCAAGACC 3′和CDR3

5′CCAGTAGTCCATAGCATAGAGGGTAGCCGTAACCCTATCTCTT -GCACAATAATAG 3′CDR的寡核苷酸引物在3′端延伸以包括第27至30位的必需残基。为CDR2制备混合的寡核苷酸，在CDR的3′端延伸，在VH碱基数402处为G或T以提供2个任选的密码子从而使VH的第48位变成L或I。在37℃下，在50μl总体积中用5单位T4多核苷酸激酶将寡核苷酸(每份10pmol)磷酸化1小时。通过加热至90℃达30秒、快速冷至70℃并缓慢冷至37℃，以在20μl的总体积内将1pmol每种诱变引物和1pmol V基因3′端的M13测序引物退火至0.5μg模板上。然后加入T7 DNA多聚酶和T4 DNA连接酶，室温下保温1小时以延伸并连接该退火的引物。在37℃下用1单位尿嘧啶DNA糖基化酶处理DNA达1小时以除去含有尿嘧啶的模板DNA，使突变链保持原样。通过PCR扩增此DNA，再通过琼脂糖凝胶电泳分析以检查正确大小的DNA是否产生。用HindIII和BamHI切割DNA，并连接到M13 mp19的HindIII和BamHI位点。

类似地，通过诱变M13噬菌体模板构建改造的TM 23 VK基因(TM23HuVK)，所述模板含有VK基因的DNA序列，它具有人Bence-Jones蛋白REI的构架区。它来自用于构建嵌合轻链的M13 VKPCR1，其中已除去了用于克隆的PvuII和BclI限制性酶切位点。所使用的引物是CDR1

5′TCTGCTTGGTACCAGTTTAAATAATTGCTAATGCCCTGACTTGCACTACAGGTGATGGTC 3′CDR2

5′TCTGCTTGGCACACCTGAGTGTAAACTTGATGTGTAGTAGA -TCAGCAGCTT 3′和CDR3

5′CCCTTGGCCGAACGTCCGAGGAAGTTTACTATACTGCTGGCAG -TAGTAG 3′

得到了预期大小的PCR产物，两个VH为823bp，VK为620bp，将这些PCR产物克隆进M14 mp19载体中。人源化可变区DNA序列的证实

已证实插入了所需CDR，没有假突变发生，并已构建出正确的人源化的VH和VK基因。使用T7 DNA聚合酶或测序酶，通过双脱氧法测定完整可变区的序列。将所得序列与设计的序列相比较。选择具有两个VH的预期序列的克隆，将这些克隆称作M13 TM23 NMVH和M13 TM23 NMVHL。选择具有重构VK的预期序列的克隆#11，并称之为M13 TM23 HuVK。将重排V区克隆进骨髓瘤表达载体中(将人源化的TM23可变区克隆进表达载体中)

将经克隆的人源化可变区转移到含有人恒定区基因的表达载体中以随后在哺乳动物细胞中表达抗体。以HindIII至BamHI的片段形式从M13TM23NMVH和M13 TM23NMVHL中分离两个人源化VH基因并连接到重链表达载体pSVgpt.HuIgG1的HindIII和BamHI位点。

以HindIII至BamHI的片段形式从M13 TM23HuVK中分离人源化VK基因并连接到轻链表达载体pSVhvg.HuCK的HindIII和BamHI位点。

限制性酶切分析表明，两个可供选择的人源化VH被正确插入到重链载体中，得到质粒pSVgpt TM23NMVH.HuIgG1和pSVgpt NMVHL.HuIgG1。

同样，人源化VK正确插入到轻链载体中，得到质粒pSVhyg TM23HuVK.HuCK。将H和L链构建体转染到NS0细胞中人源化重和轻链基因的共转染

将人源化表达质粒转移到哺乳动物细胞系NS0和P3-8.653F8879中。

使用与转染嵌合表达质粒相同的方法，将人源化表达质粒共染到NS0和P3-8.653F8879细胞中。

该两个人源化重链质粒pSVgptTM23NMVH.HuIgG1和pSVgpt NMVHL.HuIgG1中的每一个可与人源化轻链质粒pSVhygTM23 HuVK.HuCK一起共转染以产生可表达两个可供选择的人源化抗体TM23 HuVH/HuVK和TM23HuVHL/HuVK的细胞系。这些表达质粒也可以联合嵌合表达质粒一起共转染以产生能表达杂合抗体TM23HuVH/MuVK、TM23HuVHL/MuVK和TM23MuVH/HuVK的细胞系。这些杂合抗体为找出人源化抗体中重链或轻链的任何结合缺陷的原因提供了重要的工具。

转染后14天，对所有不同的质粒组合而言，都可看到NS0细胞集落。从所有接种的培养板中只得到一个P3-8.653F8879细胞的单个集落，因此它们被放弃。人IgG1/Kappa阳性克隆的选择产生人抗体的细胞的选择

分离可产生人源化和杂合嵌合/人源化抗体的NS0细胞系。通过ELISA从含有细胞集落的孔中筛选上清液样品。

TM23 HuVH/HuVK：从培养物上清液的ELISA读数最高的4个孔中选择NS0细胞；D5、D10、C6和E11。D5孔含有2个可见集落，其它孔含有一个。然而，从这些孔中产生的细胞系未必是克隆的。培养这些孔中的细胞系，在液氮中冷冻成TM23 HuVH/HuVK D5、D10、C6和E11。

TM23 HuVHL/HuVK：从培养物上清液的ELISA读数最高的4个孔中选择NS0细胞，B2、B7、D8和E9。E9孔含有2个可见集落，其它孔含有一个。然而，从这些孔中产生的细胞系未必是克隆的。培养这些孔中的细胞系，在液氮中冷冻成TM23 HuVHL/HuVK B2、B7、D8和E9。

TM23 HuVH/MuVK：从培养物上清液的ELLSA读数最高的4个孔中选择NS0细胞；D9、E6、F10和G10。F19孔和G10孔含有2个可见集落，其它孔含有一个。然而，从这些孔中产生的细胞系未必是克隆的。培养这些孔中的细胞系，在液氮中冷冻成TM23 HuVH/MuVK D9、E6、F10和G10。

TM23 HuVHL/MuVKL：从培养物上清液的ELISA读数最高的4个孔中选择NS0细胞；B8、C6、D2和D8。C6孔和D8孔含有2个可见集落，其它孔含有一个。然而，从这些孔中产生的细胞系未必是克隆的。培养这些孔中的细胞系，在液氮中冷冻成TM23 HuVHL/MuVK B8、C6、D2和D8。

TM23 MuVH/MuVK：从培养物上清液的ELISA读数最高的4个孔中选择NS0细胞；B9、G4、G6和G11。所有孔至少含有4个可见集落。从这些孔中产生的细胞系未必是克隆的。培养这些孔中的细胞系，在液氮中冷冻成TM23 MuVH/HuVK B9、G4、G6和G11。合成cDNA第一链以供CHO细胞表达胞质RNA的制备

制备RNA以供逆转录。通过在37℃快速解冻从液氮中回收一管NS0TM23 HuVHL/HuVK细胞。用10ml添加了抗生素和5％无γ球蛋白的胎牛血清(无GG-FBS)的Dulbecco氏经修饰Eagle氏培养基/Ham氏F12(DMEM/F12)逐步稀释细胞。在1500rpm下离心细胞5分钟，除去培养基并重新悬浮于75cm²三角锥瓶中的20ml新鲜培养基中。将培养物扩充至175cm²三角锥瓶中的30ml培养基内。离心收集生长活跃的细胞，用冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次。使用Favoloro et al.(1980)的方法从此细胞中制备胞质RNA。得到了总量为350μg的胞质RNA。cDNA的合成

制备了VH和VK区的cDNA第一链。在含有5μg RNA、250μM脱氧核苷三磷酸(dNTP)、15单位核糖核酸酶抑制剂(Pharmacia RNAguard)和25pM寡核苷酸引物的反应中合成可变区的cDNA第一链，对VH而言，引物是寡1109。

5′GGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGG-TGACC 3′对VK而言，引物是寡1095

5′AGATTTCAGCTGCTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACA -GATGG 3′将反应物加热至70℃达10分钟，再缓慢冷却至37℃。加入100单位Moloney鼠白血病病毒逆转录酶，在37℃下温育反应30分钟。

通过PCR扩增该cDNA，此PCR使用了上述引物并联合使用了VH所需的寡1096

5′GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTT -CTTGGTAG 3′以及VK所需的寡1094

5′GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCCAGATGACCCAGAG 3′通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，此PCR产物为预期大小(大约450个碱基对)，从凝胶中纯化DNA带。限制性酶消化

消化PCR产物以克隆到CHO载体中。用XhoI和ApaI消化VH PCR产物。用XhoI和PvuII消化VK PCR产物。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳经消化的DNA样品。观察到了预期大小(450bp)的带。通过PCR扩增V_H[TCS]从cDNA中分离V区(V_H)[TCS和S]和V_κ[S])

得到了TM27V_κ和TM27V_H的cDNA第一链样品以及用于通过PCR扩增这些分子的寡核苷酸引物。使用Taq聚合酶进行PCR，此PCR使用了TM27VH cDNA及适当引物。在琼脂糖凝胶上电泳此产物，并使用Geneclean II试剂盒(Bio101)纯化。估计回收率为1.5ng/ml。用pSR1Neo4H11(轻链)和pBJ14H11(重链)转染COS细胞以分离C区cDNA

如Lin，et al.，(1990)Science 249：677中的描述，哺乳动物表达载体pSR1Neo和pBJ1是pcDL-SRa296(Takebe，et al.，(1988)Mol.Cell Biol.8：466)的衍生物，其中位于SRα启动子与SV40聚腺苷酸化位点之间的XhoI位点被多接头取代以便于基因克隆，此多接头含有下列限制性位点：5′XhoI/XbaI/SfiI/NotI/EcoRI/EcoRV/HindIII/ClaI 3′。在pSR1Neo中，氨苄西林抗性基因和SRα启动子之间插入了新霉素抗性基因。首先将编码TM23重链之前导区和V-D-J区的cDNA与基因组重链恒定区融合，接着插入到经XhoI和NotI切割的pBJ1载体中以产生pBJ14H11(重链)。类似地，首先将编码前导区和V-J区的轻链cDNA与基因组κ片段融合，接着插入到经XhoI/NotI切割的pSR1Neo中以产生pSR1Neo4H11(轻链)。然后将这两个质粒pBJ14H11(重链)和pSR1Neo4H11(轻链)共转染到COS-7细胞(一种用SV40转化的非洲绿猴肾细胞系，ATCC CRL 1651)中以瞬时表达。人IgG1恒定区的分离

通过使用IgG1恒定区引物的PCR，由分离自被转染的COS细胞中的poly(A)⁺RNA制备人IgG1恒定区cDNA，所述引物包括：正向引物

5′GCGTGACAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC 3′和反向引物

5′GCGTGACAAGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG -CTCTT 3′将3′端具有EcoRI(编码区的侧翼)，5′端具有ApaI(编码区内)的PCR恒定区DNA片段克隆到pBS KS⁺质粒中，用于亚克隆和测序。使用与恒定区内部引物互补的T3和T7引物，测定整个恒定区的序列。然后将具有正确序列的克隆亚克隆进质粒pTCSLNeo中以产生pTCSLCg1Neo。质粒pTCSLCg1Neo的构建

使用限制性酶EcoRI和ApaI切割pBS KS⁺中具有正确序列的IgG1Cg1克隆，并连接到用相同酶消化过的pTCSNeo中。将所得质粒pTCSLCg1Neo用于进一步修饰以产生pTCSLCgNeoApa^-。消除pTCSLC_g1Neo中的ApaI位点以产生pTCLC_g1NeoApa

pTCSLCg1Neo CHO表达载体中含有两个限制性酶ApaI的位点：一个位点位于多接头区内，用来插入需克隆的片段；另一个位点就位于Neo^r基因的3′侧。为了简化随后的克隆步骤，除去Neo^r附近的ApaI位点。用ApaI部分消化pTCSLC_g1Neo；在琼脂糖凝胶上电源小量等分样品以检查线性分子(即只在两个ApaI位点中的一个处被切割的质粒)的存在。然后用T4 DNA聚合酶处理经消化的物质，它可选择性地除去因ApaI所致的单链伸出，而不会消化双链DNA。然后通过连接使质粒重新环化，并转化到E.coli HB101感受态细胞中。挑选出30个转化子，用来接种液体培养基。从每个培养物中制备DNA，用ApaI消化，在琼脂糖凝胶上电泳。不幸的是这些消化物中的质粒DNA被降解了。在30个样品中的21个中重复ApaI消化，两个分离物(#4和12)表现出被ApaI线性化，而所有其它样品都在两个位点处被切割。然后用ApaI和HindIII消化这两个候选克隆以测定哪个ApaI位点仍存在。在此试验中，pTCSLC_g1NeoApa^-分离物#12中neo^r3′侧的ApaI位点按需要已被消除。进行另外的限制性消化以确证此分离物的结构。将经PCR分离的人Kappa和重链V区分别克隆到CHO载体pTCSLC_κDHFR和pTCSLC_g1NeoApa^-上。将TM27V_κ片段克隆到pTCSLC_κDHFR上

凝胶纯化TM27 Kappa链V区的cDNA，用适当的限制性酶消化。在1％琼脂糖凝胶上分析小量等分DNA样品以估计量并证实其性质。在约800bp处观察到一个多余(污染)带，估计为1.25ng/ml。将V区连接到已经限制性酶XhoI和PvuII消化并经磷酸酶处理的pTCSLC_κDHFR载体中。用该连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子菌落的产量非常低。挑选单菌落以接种12份液体培养基。从每份培养物中制备DNA，用XhoI和PvuII消化并在1％琼脂糖凝胶上分析。有两个阳性样品#3和#4。测定每个阳性样品的序列。将TM27 V_H片段克隆进pTCSLC_g1NeoApa

凝胶纯化相当于TM27 V_H区的PCR产物，用适当的限制性酶(XhoI和ApaI)消化。然而；因为已注意到ApaI消化不完全，故应重复消化。在琼脂糖凝胶上分析小量等分样品以估计量并证实其性质。估计相当于V_H区的带浓度为0.4ng/ml。与V_κ片段的情况一样，在～800bp处观察到多余的带，这表明此物质的纯度也不是预期纯度。将V_H区连接到已经限制性酶XhoI和ApaI消化并经磷酸酶处理过的pTCSLC_g1NeoApa^-载体中。用该连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。得到很少的转化子。挑选6个菌落以接种液体培养基。从每份培养物中制备少量DNA，用XhoI和EcoRI消化并在琼脂糖凝胶上分析。从首次连接中回收一个候选克隆，pTCSLHuV_H4HCg1NeoApa(分离物#6)。为了得到更多的候选克隆(在随后的试验中单个分离物#6不含有正确序列的情况下)，还需建立另外的连接。该连接使用了1)V_HPCR产物，已在低熔点琼脂糖上重新纯化除去了高分子量的污染带，和2)使用cDNA和引物合成的V_H PCR产物。从这些连接反应中分析了8个其它转化子，回收的5个候选克隆是：分离物#9、10、11、12和14。测定已克隆V区的两条链的序列以证实预期的DNA序列

从Operon Research得到为便于载体pTCSLC_g1NeoApa^-和pTCSLC_κDHFR中所插入的V区DNA测序分析而设计的引物。正向引物位于pTCS载体序列中，可用于测定插入pTCSLC_g1NeoApa^-和pTCSLC_κDHFR载体中的V区序列。反向引物位于C_κ或C_g1序列中，可用于分别测定V_κ和V_H插入片段的序列。人Kappa链V区的双链测序

测定来自TM23(#3和#4)的两个样品的两条链的序列。使用引物HUCK5PR，经过限制性酶位点(3′-5′；PvuII-XhoI)，完整测定了反向链的序列。使用两个不同的引物，pTCSFOR和pTCSFWD测定了正向链的序列。通过联合每个引物产生的序列得到经过限制性酶位点(5′-3′；XhoI-PvuII)的全长序列。已发现正向链中存在小区域的压缩(compression)现象，使用可缓解这种压缩现象的引物或测序列方法都不能解决这一问题。然而，已证明反向链此区域的序列是正确的。样品#3和#4似乎具有正确的序列，故选择样品#4以转染哺乳动物细胞。TM27 gamma链V区的双链测序

完整地测定pTCSL HuV_H4HC_g1NeoApa中V_H片段(分离物#6和9)两条链的序列。分离物#6的人源化V_H片段与经过编码区的预期序列相吻合，意料之外影响表达的是第-2位(相对于起始的ATG)有一个单个碱基的替换(C变成T)。分离物#9的V_H片段的编码区内含有两个替换。未测定其它四个候选克隆的序列。用TM27和对照质粒共转染COS和CHO细胞

受体细胞是CHO dhfr^-DUX B11和COS-1。CHO DUX B11细胞系得自Biogen Inc。为了转染CHO，需用限制性酶AatII消化以使5微克TM27质粒pTCSLHuV_κ4HC_κDHFR(分离物#4)、pTCSLHuV_H4HC_g1NeoApa^-(分离物#6)和载体pTCSLDHFRApa^-和pTCSLNeoApa^-线性化。将含有TM27的质粒(称作“TM27L”)共沉淀于乙醇中并重新悬浮于水中。类似地，将载体质粒(称作“对照”)共沉淀并重新悬浮于水中。使用BioRad基因脉冲仪在250v、960mF下通过电穿孔将每种共沉淀质粒转染到10⁷个CHO细胞中。选择前，在添加有胸苷、腺苷和脱氧腺苷的α极限必需培养基(αMEM)(非选择性培养基)中将经转染的细胞培养两天。

为了转染COS，将5微克未被切割的TM27L质粒和载体质粒共沉淀于乙醇中并重新悬浮于水中。通过电穿孔将质粒染到4.1×10⁶ COS细胞中。在Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养经转染的细胞两天，然后收集上清液以检测。通过人IgG1 ELISA和染色分析COS转染子的上清液

通过对细胞培养物上清液进行人IgG1 ELISA试验可测量COS细胞的人IgG产生。用PBS中的小鼠抗-人IgG1 Fc抗体包被微量滴定板并在封闭缓冲液(于PBS中的1％BSA)中封闭之。以100μl样品的量加入上清液，检测封闭缓冲液中必要时适当的上清液。用与辣根过氧化物酶-偶联的山羊抗人Igκ抗体和OPD(邻苯二胺)检测被捕促的IgG。得自被TM27L转染之COS细胞的上清液表现出95ng/ml人IgG的水平。检测不到来自受对照质粒转染之COS细胞的人IgG。对来自受TM27L转染之COS细胞且被浓缩～6倍的上清液进行流式细胞计量术。如中波段荧光所示，HPB细胞上的染色强度比～2.5mg/ml的纯化TM27L(纯化自NS0细胞)所得数据约低9倍。Jurkat细胞上的染色为背景水平。选择CHO转染子

通过在缺乏核苷酸供给(以选择pTCSLHuV_κ4HC_κDHFR上的DHFR⁺)并含有遗传霉素(G 418：以选择pTCSLHuV_H4HC_g1NeoApa^-上的neo^r)的αMEM培养基中选择CHO转染子。将细胞以2.0×10⁵个细胞/ml的浓度铺敷于24孔培养板中。通过人IgG1 ELISA分析CHO转染子的上清液

在选择性培养基中培养12天后，收获铺满孔中的上清液，并用人IgG1/_κELISA检验。TM27L上清液中的浓度范围为182-236ng/ml，大多数＞200ng/ml。在对照上清液中检测不到人IgG1/κ。在T25三角锥瓶中扩充来自12个高产TM27孔中的细胞。将单个小管作为候补培养物冷冻并贮存于液氮中。在T25三角锥瓶中扩充来自两个对照孔的细胞并进行冷冻。CHO转染子的首次有限稀释铺敷

为了在96-孔培养板中进行有限稀释铺敷，选择了四个高产孔：孔#1B1(232.6ng/ml)、1D6(233.3ng/ml)、2B2(235.5ng/ml)和2C1(236.0ng/ml)。对于每个孔而言，设置了含选择性培养基的三块培养板：一个为1个细胞/孔，两个为0.5个细胞/孔。

用人IgG1/κELISA筛选得自首次克隆循环的上清液。将90个高产孔中的细胞扩充到24孔培养板中并使之生长至汇合状态。通过人IgG1/κELISA以及流式细胞计量术检测12个这种培养物的上清液。用人IgG1/κELISA测得的浓度范围为211-1048ng/ml。所有样品都使HPB细胞得以染色(中波段荧光范围为46.5至169.9)，但未染Jurkat细胞。扩充6个高产克隆并冷冻(作为候补)于液氮中。从中选择两个最高产克隆(1B1-C7和2B2-H9)以继续进行随后的克隆循环。

将两个对照构建体的初级培养物在96孔培养板中进行一轮有限稀释铺敷。从每种中选出一个克隆并扩充之。检测其上清液，人IgG1/κELISA未检测到信号(第640-83页)。在液氮中冷冻并保存细胞。将未克隆培养物扩充至滚瓶(roller bottle)规模以纯化抗体

扩充两个初级培养物(1B1和2B2)以产生足够的物质供TM27抗体的纯化。将细胞扩充至2升滚瓶中使之适应低血清浓度(通过含10％血清的T25→含10％血清的T75→含5％血清的3×T75→含1％血清的3×2L瓶)(第640-24页)。第一天设置2升瓶，第2、5和8天饲养(用含1％血清的新鲜培养基替换1/2体积)。第10天首次收获，第12天二次收获，第15天三次收获。离心收获到的上清液，贮藏于-20℃直至纯化。在A蛋白柱上纯化抗体

合并得自2B2培养物上清液(总体积为2.7升)并通过0.22微米尼龙膜过滤。人IgG1 ELISA表明起始物质的总量为1090mg。在Prosep-A(A蛋白)柱上纯化抗体，用pH 5.0、4.0和3.0的0.1M柠檬酸盐洗脱。将洗脱液透析到PBS中。用人IgG1 ELISA测量洗脱级分中的纯化抗体的量。pH为3.0的级分含有大多数纯化抗体，而pH为4.0的级分中仅发现少量纯化抗体，重复人IgG1 ELISA以得到更精确的浓度测量值，TM27的总产量(pH 3.0与pH4.0的级分相加)为960mg。来自NS0转染子培养物上清液的抗体的A蛋白纯化

如上所述，在A蛋白柱上纯化来自NS0转染子培养物上清液中的抗体。来自NS0骨髓瘤细胞系的TM27抗体的鉴定

将A蛋白柱层析从NS0转染子的培养物上清液中纯化TM27 mAb，并用于染色HPB-ALL细胞(Vβ5.2)和作为阴性对照的Jurkat(Vβ8.1)细胞，以和小鼠mAb，TM23，和嵌合TM27作比较。TM27对HPB-ALL染色呈阳性，但不染Jukat。

为了测定TM27的特异性，用TM27染色正常的PBL T细胞以和TM23mAb比较。TM27和TM23 mAb都染色～3.0％的总人PBLT细胞。建立竞争性试验，其中在不同浓度的未标记4H11或TM27 mAb中加入固定浓度的经FITC标记的TM 23 mAb。然后用该抗体混合物染色HBP-ALL细胞。未标记的TM23和TM27两者都阻断了FITC标记的TM23染色。为了测定TM27是否能与CD3抗原共调节，将HPB-ALL细胞与不同浓度的TM27或TM23 mAb一起保温过夜，再用抗-CD3 mAb染色。结果表明TM27和TM23能导致TCR/CD3复合体的胞吞作用。

进行Scatchard分析以测量TM27在HPB-ALL细胞上的结合亲和力。在Scatchard和竞争性(与TM23 mAb)试验中，结果表明，TM27大致保留了相同的亲和力(kd＝2.0×10^-8·M^-1)，可与4H11 mAb很好地竞争。

在竞争性试验中，将TM27L/NS0和TM27L/CHO与4H11进行比较，结果示于图3。进行Scatchard分析，结果示于图4。CHO转染子的第二次有限稀释铺敷

如上建立有限稀释铺敷。用人IgG1 ELISA筛选孔。将来自每种(1B1-C7和2B2-H9)6个孔的细胞扩充至24孔培养板中并通过人IgG1 ELISA分析。扩充得自每种的两个最高产克隆并冷冻于液氮中。选择得自每种的最高产克隆以供进行最后一轮亚克隆。CHO转染子的第三次有限稀释铺敷

如上建立有限稀释铺敷。用人IgG1 ELISA筛选孔。将来自每种(11-C7和2B2-H9)6个孔的细胞扩充至24孔培养板中并通过人IgG1 ELISA检测。将来自每种的三个最高产克隆扩充至T25三角锥瓶中并冷冻于液氮中。将来自每种的单个克隆扩充至T75三角锥瓶中。此时，从培养基中除去遗传霉素，因而放弃对neo^r的选择。保留对DHFR的选择。用人IgG1 ELISA测定上清液。1B1-C7克隆产生4.69mg/10⁶细胞/天。2B2-H9克隆产生2.65mg/10⁶细胞/天。因此选择C7分离物作为最终的克隆，将H9分离物称作候补克隆。冷冻细胞贮存物的制备

将以上选择出的最终克隆扩充至5个T225三角锥瓶中以提供足够数目的细胞来建立冷冻细胞贮存库。从这些三角锥瓶中收获细胞并合并。合并的悬浮液含有98.3％活细胞。总的活细胞数为1.58×10⁸，足以制备2×10⁶细胞/小管的72个小管所需细胞数。冷冻细胞并称之为“TM27L-662-35”。另外，将候补的H9克隆扩充至一个T225三角锥瓶中以建立小的冷冻细胞库。从这些三角锥瓶中收获的细胞有97.3％是活的。悬浮液含有足够的细胞以制备2×10⁶细胞/小管的9.7小管细胞(第662-89页)。在液氮中冷冻细胞并称之为“TM27L-662-89”。检验从冷冻贮存中复活的细胞生存力和支原体检验

使一管冷冻细胞贮存物TM27L-662-35解冻并在αMEM中恢复。通过台盼蓝染色测定的细胞存活为88％。使用Bionique Testing Laboratories试剂盒检测此小管中生长的汇合培养物的支原体污染情况。试验检测结果为无污染。另外，解冻一管冷冻细胞贮存物TM27L-662-89。经台盼蓝染色测定的细胞存活为93.8％。如上所述检测此小管中生长的汇合培养物的支原体污染情况，此试验未检测到污染。将这两个培养物扩充至T75三角锥瓶中，用人IgG1 ELISA检测细胞培养物上清液。TM27L-662-35克隆产生3.24μg/10⁶细胞/天，TM27L-662-89克隆产生2.52μg/10⁶细胞/天。在第二次测定中，TM27L-662-35产生了3.03μg/10⁶细胞/天，TM27L-662-89产生2.74μg/10⁶细胞/天。以滚瓶规模表达TM27L-662-35以纯化抗体

扩充TM27L-662-35培养物以产生足够的物质供TM27L抗体纯化。将细胞扩充至2升滚瓶中，并使之适应低血清浓度(通过含10％血清的T25→含10％血清的T75→含5％血清的3×T75→含1％血清的3×2L瓶)。在第一天设置2升瓶，第2、5、7和9天饲养(用含1％血清的新鲜培养基替换1/2体积)。第12天首次收获，第14天第二次收获，第16天三次收获。旋转收获到的上清液，过滤并贮藏于-70℃直至纯化。在A蛋白柱上纯化抗体

合并得自TM27L-662-35培养物的上清液，总体积为5.1升。使抗体结合剂Prosep-A(A蛋白)柱上并用pH 5.0和3.0的0.1M柠檬酸盐洗脱。将pH为3.0的洗脱液透析到PBS中。通过人IgG1/Kappa ELISA测量起始物质和洗脱级分中的纯化抗体的量。pH为3.0的级分大致含有3.9mg抗体/25ml。在Centriprep-30浓缩器(Amicon)上浓缩该材料。重复人IgG1/KappaELISA。TM27L的总产量为～3.2mg，其浓度为1.6mg/ml。纯化抗体的初次鉴定

对～2.5mg得自pH 3.0和pH 4.0级分之每一种的材料和纯化自NS0细胞的TM27进行流式细胞计量术。如下所述测量由中波段荧光(mean channelfluorence)所示的HPB细胞上的染色强度：pH 3.0级分为283.46；pH 4.0级分为321.98；来自NS0之TM27为506.79。对所有样品而言，Jurkat细胞上的染色为背景水平。实施例2CDR-移植的TM27抗体的序列与人构架盒(Human Framework Cassettes)的比较

TM27 Vκ1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50REI =======================Q===D=IK==================ETM23 ======TT======L======S================K=DGTV======WAL =======================R===S=====S====K==========A51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ100REI A=N=QA===================================QS==Y====TM23 =====================SL===N=E====================GWAL A===Q===T===========F=L=========S=========T= I====101 GTKLQIT 107REI =======TM23 ===VE=KWAL ==RIE=KTM27 VH1^* QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWIGM 50NEWM ====EQ====================STFSNDYYT==============YTM23 ====K=======A===S==I======================K====L==HIL ==K=VGA=G=V=Q=GRS=RIS=IA===TFSN==MH====A==K====VAV51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNOKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV100NEWM VFYH=TS=DTTPLR=====LV==========================NLITM23 ================LSIS==N==S=VF=KMN=LQTD===R========HIL ==YN=S=Y=GDSV=G=F=ISR=N==RTIYMZ===LRTE===V======PD

R101 TATLYAMDYWGQGSLVTYSS 120NEWM AGCIDV ========V==TM23 =============TS==V==HIL IL=AFSF======VL==V==^*HuVHL在#48具有LTM27L：重链的第48位为亮氨酸。TM27I：重链的第48位为异亮氨酸。TM27.1：KS变为VF(78-79)TM27.2：VTML/T变为LSIS/N(66-69/73)。TM27.3：V变为R(92)。实施例3TM23的Scatchard分析

实验 Kd 受体/细胞

617：096 3.27e-8M 3.04e5

617：115 2.30e-8M 2.43e5

617：119 2.46e-8M 2.46e5平均值

kd＝2.52(±0.67)e-8M

受体/细胞＝2.64e5TM27的Scatchard分析

实验 Kd 受体/细胞

613：78 1.48e-8M 3.31e4

613：82 1.14e-8M 2.47e4平均值

kd＝1.31(±0.24)e-8M

受体/细胞＝2.89e4实施例4TM27I工作概况COS/CHO中的TM27I(48)：^*从HSO生产细胞系的CDR-移植V区制备cDNA，经PCR扩增，测序。^*以cDNA构型将DNA片段克隆到pTCSLNeo中。^*将此质粒与pTCSLDHFRTM27_κ一起共转染到COS和CHO中。^*COS细胞上清液的人IgG1/κ表达的阳性ELISA结果表明质粒构建体良好。^*选择CHO细胞转染子，扩充并克隆之。一次克隆后将细胞冷冻于液氮中。实施例5得自16G8 cDNA的氨基酸序列数据重链

10 20 30 40 50

* * * * *

TTRAP RSSHS VISTE HRPLT MDSRL NLVFL VLILK GVQCD VQLVE SGGGL

60 70 80 90 100

* * * * *

VQPGG SRKLS CAASG FTFSN FGMHW VRQAP DKGLE WVAYI SSGSS TIYYA

110 120 130 140 150

* * * * *

DTLKG RFTIS RDNPK NTLFL QMTSL RSEDT AMYYC ARRGE GAMDY WGQGT

160 170

* *

SVTVS SAKTT PPSVY PLAPG轻链

10 20 30 40 50

* * * * *

ISQGT KFKYT MDFQV QIFSF LLISI SVVMS RGENV LTQSP AIMSA SLGEK

60 70 80 90 100

* * * * *

VTMSC RASSS VNYIY WYQQK SDASP KLWIY YTSNL APGVP TRFSG SGSGN

110 120 130 140 150

* * * * *

SYSLT ISSME GEDAA TYYCQ QFTSS PFTFG SGTKL EIKRA DAAPT VSIFP

153

*

PSS

蛋白质序列数据：

H＝DVQLVE？GGGLVQPG

L＝ENVLTQ实施例6TM29的工作概况^*基本上按实施例1的方法制备杂交瘤，分离cDNA(示于实施例5)^*将分离出的cDNA(H和κ)(来自16G8杂交瘤)克隆到M13载体中。^*通过诱变引入人构架(VH_KOL/VK_REI)。^*将CDR-移植V区克隆到骨髓瘤表达载体中。^*从NSO转染子中纯化人源化抗体(每个约1mg)以初步评价。已制备了四种不同的TM29：TM29TM29.1：SS变为AA(23-24)。TM27.2：S变为P(75)。TM27.3：GV/F变为AM/Y(92-93/95)。实验详述-TM29通过PCR法分离人kappa链恒定区

使用未经消化的质粒pSV184 DH-Neo/DNS-V_κC_κ(含有人Kappa链恒定区的pSVHuK)进行具有两个引物(一个正向，一个反向)的PCR以分离恒定区。寡聚体(引物)得自Operon。PCR反应试剂来自具有AmpliTaq的GeneAmp DNA扩增试剂盒(PerKin-Elmer Cetus)。在三种不同浓度的Mg²⁺中建立PCR反应。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物的等分试样。选择来自第一Mg²⁺样品(浓度为1.5mM)的PCR产物。将位于C区侧翼的引物设计成含有限制性酶切位点以供克隆。因此可用EcoRI消化(在3′末端)扩增的DNA。5′末端的位点(PvuII)不被消化。然后在1％琼脂糖凝胶上电泳经消化的DNA片段，切下300bp的带。从凝胶中抽提DNA，并在1％琼脂糖凝胶上分析小等分试样以测定质和估计量。300bp的带显得清晰，估计DNA总量为～140ng。将人Kappa链恒定区克隆进pBS KS⁺载体并测序

使用T4 DNA连接酶，将已被EcoRI消化的人Kappa链恒定区的DNA片段插入到已被SmaI和EcoRI消化的载体pBS KS⁺中。用此连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。挑选单菌落用于接种24份液体培养基。从每份培养物中制备DNA。用PvuII(C_κ的5′末端)和EcoRI(C_κ的3′末端)消化每个DNA样品，并在2％琼脂糖凝胶上分析。由于分离较低范围的带(300bp)有困难，故仅用PvuII消化DNA样品。在2％琼脂糖凝胶上分析之后，24个样品中有19个C_κ插入是正确的。选择样品#1-5(19个正确样品中的)测定序列，所使用的引物是T7和T3引物(其序列在载体中位于插入物的侧翼)。其它测序试剂来自Sequenase Version 2.0试剂盒(USB)。样品#5经证实具有人Kappa链恒定区的正确序列。将人Kappa链恒定区克隆到哺乳动物表达载体-pTCSLDHFR^*以成为pTCSLC_κDHFR^*。

使用PvuII和EcoRI限制性酶从pBS KS⁺载体(样品#5)中分离人kappa链恒定区。然而，因为如前述的带分离存在的问题，故需对构建体pBS/人C_κ进行第二次消化。第二次消化涉及EcoRI和XbaI(位于PvuII位点的5′侧)，产生了～300bp的片段。然后将此片段经过凝胶纯化，并经PvuII消化以除去C_κ5′末端残留的载体小片段。凝胶纯化最终的片段，然后在1％琼脂糖凝胶上分析质并估计量。C_κDNA显示出清晰的带，约为280bp，估计其总量为～135ng。

由于表达载体pTCSLDHFR^*中存在三个EcoRI位点，故在PvuII位点处克隆量最佳方案。既然C_κDNA是经PvuII-EcoRI消化制备的，故可使用Klenow片段修复EcoRI末端(以形成平头)。将经修复的平头C_κDNA连接到pTCSLDHFR^*载体中，此载体已被PvuII消化并经磷酸酶(使用牛小肠磷酸酶)处理过。用此连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选单菌落用于接种24份液体培养基。从每份中制备DNA。用PvuII和HindIII消化所有的DNA样品，并在1％琼脂糖凝胶上分析。经测定24份样品中有5个含有正确方向的C_κ插入。选择样品#7以继续实验。用野生型DHFR基因取代突变的DHFR^*基因

为了在CHO(dhfr)DUX B11细胞中使载体pTCSLC_κDHFR^*得以表达，用DHFR基因取代DHFR^*基因。用限制性酶HindIII和BglII消化来自pTCSLC_κDHFR^*样品#7的DNA以及来自pSV2-DHFR(此质粒得自Dr.PaulBerg，Department of Biochemistry，Stanford University Medical School)的DNA，从而分离出各个基因片段。通过分析可确定pTCSLC_κDHFR^*载体中的附加BglII位点去掉了部分polyA位点，它干扰载体的功能。因此使用HindIII和BamHI重复消化。用磷酸酶处理载体的(DHFR^*)pTCSLC_κ部分。然后凝胶纯化两个分离的片段(pTCSLC_κ和DHFR)，在1％琼脂糖凝胶上分析质并估计量，两条带都显得清晰，估计浓度类似，约为40-50ng/ml。使用T4 DNA连接酶将DHFR基因连接到pTCSLC_κ载体上。用该连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。挑选单菌落用于接种24份液体培养基。从每份中制备DNA。用HindIII和BamHI限制性酶消化来分析DNA。24个培养物中有23个具有显示出DHFR基因插入pTCSLC_κ载体的正确带，选择样品#22供进一步使用。将经PCR分离的人Kappa链V区克隆到CHO载体pTCSLC_κDHFR中

用凝胶纯化16G8 Kappa链V区的cDNA并用适当的限制性酶消化。在1％琼脂糖凝胶上分析DNA样品的小等分试样以估计量并证实质。在～800bp处观察到多余(污染)的带。估计其浓度为1.25ng/ml。将V区连接到已被限制性酶XhoI和PvuII消化并经磷酸酶处理过的pTCSLC_κDHFR载体中。用此连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。产生的转化子菌落非常少。挑选单菌落并用于接种12份液体培养基。从每份中制备DNA。用XhoI和PvuII消化并在1％琼脂糖凝胶上分析。有4个阳性样品：#1、#4、#7和#10。测定每个阳性样品的序列。将经PCR分离出的TM29γ链V区克隆到CHO载体pTCSLC_g1NeoApa。人kappa链V区的双链测序

测定16G8的4个样品(#1、#4、#7和#10)的双链序列。使用引物HUCK5PR，经过限制性酶切位点(3′-5′；PvuII-XhoI)，完整地测定反向链的序列。样品#1和#4似乎都具有正确的序列，样品#7未被测序，样品#10具有错误的序列。对于样品#1和#4而言，使用两个不同的引物，pTCSFOR和pTCSFWD测定正向链的序列。联合每个引物测出的序列即可得到经过限制性酶切位点(5′-3′；XhoI-PvuII)的全长序列。已发现正向链中存在小区域的压缩现象，使用可缓解这种压缩现象的引物或测序方法都不能解决这一问题。然而，已证明反向链此区域的序列是正确的。样品#1和#4似乎都具有正确的序列。故选择样品#4以转染哺乳动物细胞。将TM29轻链和重链质粒共转染到COS和CHO细胞中

在TM29轻链和重链质粒共转染过程中，使用了Cos-1和CHO(dhfr^-)DUX B11细胞。CHO DUX B11细胞系得自Biogen.Inc，它最初来自Dr.Lawrence Chaisin(Columbia Unversity)。

为了转染Cso-1细胞，将5mg每种未消化的TM29质粒(分别为pTCSLHuV_κ16GC_κDHFR和pTCSLHuV_H16GC_g1Neo Apa^-；TM29-4和TM29-26)沉淀于乙醇中并重悬浮于H₂O中，浓度为1mg/ml。然后使用BioRad基因脉冲仪在250V、960mFD条件下，通过电穿孔将上述质粒共转染到3.8×10⁶个细胞中。将经转染的细胞重新悬浮于Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)中，并培养3天。制备对照载体质粒(pTCSLDHFRApa^-和pTCSLNeoApa^-)并按照与TM29质粒类似的方法共转染。重新悬浮后来被转染的细胞，并按照与经TM29转染的Cos细胞类似的方法培养。

为了转染CHO DUX B11细胞，需用限制性酶AatII消化5mg每种TM29质粒(如上所述)以产生DNA的线形片段。在乙醇中沉淀此片段并以1mg/ml的浓度重新悬浮于H₂O中。然后如上所述通过电穿孔将质粒共转染到5×10⁶个细胞中。将经转染的细胞重新悬浮于添加了胸苷、腺苷和脱氧腺苷的α极限必需培养基(αMEM)(非选择性培养基)中并培养3天。制备对照载体质粒(如上所述)并按照与TM29质粒类似的方法共转染。重析悬浮后来被转染的细胞，并按照与被TM 29转染的CHO细胞类似的方法培养。通过人IgG_1κELISA分析经TM29转染的Cos细胞上清液

培养了3天后，经TM29转染的COS细胞似乎已铺满。因此，收集上清液，弃去细胞。使用人IgG_1κELISA测定培养物上清液中由细胞产生的人IgG。用已包被于96-孔培养板的小鼠抗-人IgG₁Fc抗体捕捉上清液中的IgG，通过与辣根过氧化物酶-偶联的山羊抗-人Igκ抗体以及用邻苯二胺(OPD)而产生的颜色变化来检测。将光密度测量值与已知浓度的纯化的人IgG_1κ抗体所形成的曲线进行比较即可测定上清液中IgG的浓度。经TM29转染的COS细胞上清液产生的人IgG浓度为201.3ng/ml，经对照DNA转染的COS细胞上清液产生的人IgG浓度为0ng/ml。选择经TM29转染的CHO细胞

培养了3天后，经TM29转染的CHO细胞似乎已铺满。因此，用0.25％胰蛋白酶(于Hank′s平衡盐溶液中)处理此细胞以使它们从培养三角锥瓶上解离下来。收集细胞，离心以除去上清液。将细胞沉淀物以2×10⁵细胞/ml的浓度重新悬浮于αMEM选择培养基中，并以1ml/孔的量铺敷于24孔培养板中。αMEM选择培养基具有双重选择能力，它缺乏核苷酸的供给，并用透析过的FBS取代了FBS以选择pTCSLHuVκ16GC_κDHFR上的DHFR⁺，并加入遗传霉素(G-418)以选择pTCSLHuV_H16GC_g1NeoApa^-上的neo^r。通过人IgG_1κELISA和流式细胞计量术分析经TM29转染的CHO细胞上清液

在选择培养基中培养14天后，从每孔中收集经TM29转染的CHO细胞上清液，并使用人IgG_1κELISA检测。经TM29转染的CHO细胞上清液中人IgG浓度范围为144.6ng/ml-291.9ng/ml，平均浓度为240.5ng/ml。经对照DNA转染的CHO细胞上清液中人IgG的浓度为0ng/ml。

通过流式细胞计量术检测经TM29转染的CHO细胞的3个高产孔的上清液(2C3、2C4、2B6)以及一个经对照DNA转染的CHO细胞孔的上清液(3D4)。3个TM 29样品，2C3、2C4和2B6正染了Jurkat细胞(中波段荧光范围为186.61-290.01)，但未正染HPB细胞(中波段荧光范围为11.77-13.82)。对照样品3D4未正染Jurkat细胞(中波段荧光为11.96)。通过有限稀释克隆经TM29转染的CHO细胞

选择经TM29转染的CHO细胞的3个最高产孔(2C3、291.9ng/ml；2C4，289.7ng/ml；2B6，289.5ng/ml)以供有限稀释克隆。对于每个孔而言，在αMEM选择培养基中稀释细胞浓度，并以2个细胞/孔、1个细胞/孔、和0.5个细胞/孔的量铺敷于96孔培养板中。克隆10天后，在2C3、2C4和2B6的每个0.5个细胞/孔培养板中的许多孔内观察到集落生长。因此，收集每个0.5个细胞/孔培养板的所有孔的上清液，并使用人IgG_1κELISA检测。表现出细胞生长的所有孔在ELISA中为阳性。选择总数为24的高产孔(2C3为10个，2B6为14个)以扩充至24孔培养板中并生长至铺满。从每孔中收集上清液，使用人IgG_1κELISA检测。人IgG浓度范围为0.7mg/ml-4.8mg/ml，平均浓度为2.9mg/ml。然后用流式细胞计量术检测经TM29转染的CHO克隆的6个高产孔的上清液(1C7、1D9、1G2、2G1、2G10、2H2a)。所有6个样品都正染了Jurkat细胞(中波段荧光范围为313.68-356.87)，但未正染HPB细胞(中波段荧光范围为7.59-8.16)。将6个样品中的每一个扩充至25cm²三角锥瓶中，在液氮中冷冻并贮存。选择了3个高产孔(2C3-1G2、2C3-2G10、2C3-2H2a)用以亚克隆。

通过与TM29孔类似的有限稀释，克隆经对照DNA转染的CHO细胞的一个孔(3D4)。将细胞浓度稀释至低于所需浓度的10倍，克隆10天后观察不到集落生长。因此，从冷却小管(3D4)开始重新培养。使用此新培养物重复有限稀释克隆。克隆16天后，选择0.5个细胞/孔培养板的最大程度铺满的孔中的6个(1B5、1C11、1D6、2E7、2F3、2F9)以扩充到24孔培养板中。随后将每个孔扩充到25cm²三角锥瓶中，再扩充到75cm²三角锥瓶中以生长至铺满。从每个三角锥瓶中收集上清液，并使用人IgG_1κELISA检测。人IgG的浓度为0ng/ml。然后在液氮中冷冻并保存每个三角锥瓶。将未克隆的经TM29转染的CHO细胞培养物扩充至滚瓶规模(roller bottlescale)

选择经TM29转染的CHO细胞的3个最高产孔(2C3，291.9ng/ml；2C4，289.7ng/ml；2B6，289.5ng/ml)以作为未克隆培养物扩充到25cm²三角锥瓶中。此时，在液氮中冷冻并贮存一小管各种TM29培养物(以及一小管经对照DNA转染的CHO细胞培养物)。再将各个未克隆培养物扩充至75cm²三角锥瓶中。从一个75cm²三角锥瓶中将每个培养物扩充至3个75cm²三角锥瓶，同时使αMEM培养基中的血清浓度从10％降低至5％。然后将2C3和2B6的每个75cm²三角锥瓶扩充至2升滚瓶中。在液氮中冷冻并保存2C4的所有3个75cm²三角锥瓶。一旦培养物在滚瓶中，αMEM培养基中的血清浓度从5％降至1％。培养9天后，2B6瓶似乎已铺满，而2C3瓶似乎为～25％铺满。在第9、14和16天，收集所有2B6和2C3瓶的上清液，然后弃去细胞。将收集到的上清液离心，贮存于-20℃中。使用人IgG_1κELISA检测2B6和2C3的各3个经收集上清液之每一个的等分试样。经测定2B6的人IgG总量为820mg；2C3为1923mg。通过有限稀释亚克隆经TM29转染的CHO细胞克隆

选择经TM29转染的CHO细胞克隆之三个最高产孔(2C3-1G2、4.8mg/ml；2C3-2H2a、4.1mg/ml；2C3-2G10、4.0mg/ml)以进行有限稀释亚克隆。亚克隆14天后，在1G2、2G10和2H2a的每个0.5个细胞/孔培养板中的许多孔内观察到集落生长。因此，收集那些有集落生长的孔中的上清液，使用人IgG_1κELISA检测。表现出细胞生长的所有孔在ELISA中为阳性，可产生100％的克隆效率。选择总数为24的高产孔(2H2a 2个，2G10 5个，1G2 17个)以扩充至24孔培养板中并生长至铺满。从每孔中收集上清液，使用人IgG_1κELISA检测。人IgG浓度范围为1.2mg/ml-9.2mg/ml，平均浓度为4.2mg/ml。通过流式细胞计量术检测经TM29转染的CHO亚克隆的4个高产孔的上清液(2G5、2H12、1H6、2E9)。所有4个样品都正染Jurkat细胞(中波段荧光范围为211.51-292.45)，但不能正染HPB细胞(中波段荧光范围为8.36-8.80)。将4个样品中的每一个扩充至25cm²的三角锥瓶中。通过有限稀释第二次亚克隆经TM29转染的CHO细胞克隆

根据ELISA和流式细胞计量术的联合结果，选择两个最好的经TM29转染的CHO细胞克隆(2C3-1G2-2G5和2C3-1G2-1H6)以通过有限稀释进行第二次亚克隆。此时，在液氮中冷冻并保存一管各种克隆(以及一管2C3-1G2-2H12和2C3-1G2-2E9中的每一种)。亚克隆12天后，在2G5和1H6的每个0.5个细胞/孔培养板中的许多孔内观察到集落生长。因此，收集那些具有集落生长的孔中的上清液，并使用人IgG_1κELISA检测。表现出细胞生长的所有孔在ELISA中为阳性，产生了100％的克隆效率。选择总数为24的高产孔(2G5为20个，1H6为4个)以扩充至24孔培养板(#646-101)并生长至铺满。从每孔中收集上清液，使用人IgG_1κELISA检测。由于检测中所用的人IgG_1κ标准的活性丧失，因此未能测定未知样品的浓度。因此通过光密度测定高产孔。选择6个最高产孔(2G5为5个，1H6为1个)以扩充至25cm²三角锥瓶中，然后扩充至75cm²三角锥瓶中并生长至铺满。从每个三角锥瓶中收集上清液，使用人IgG_1κELISA检测。人IgG浓度范围为14.6mg/ml-21.2mg/ml，平均浓度为18.6mg/ml。通过流式细胞计量术检测经TM29转染的CHO亚克隆的6个三角锥瓶的上清液(1B5、1D1、1F11、2B10、2F5、2F9)(#646-122)。所有6个样品都正染Jurkat细胞(中波段荧光范围为304.51-383.00)，但不能正染HPB细胞(中波段荧光范围为8.67-10.25)。经TM29转染的CHO细胞克隆的冷冻细胞贮存物的制备

选择用于制备冷冻细胞贮存物的经TM 29转染的CHO细胞克隆是2C3-1G2-1H6-2F5。将此克隆从一个75cm²三角锥瓶扩充至5个225cm²三角锥瓶中以提供足够量的细胞来建立冷冻细胞库用于研究。根据SOPTMB1-001.00来制备冷冻细胞库。用胰蛋白酶处理细胞，从每个三角锥瓶中收集细胞并合并。发现合并的细胞悬浮液中含有3.2×10⁸个细胞，其中有99％存活。制备72个小管，每个在1ml体积中含有2×10⁶个细胞。此克隆的所有小管被称作TM29-646-132。实施例7CDR-移植的TM29抗体序列与其它构架区序列的比较TM29 Vk1 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYOOTPGKAPKLLIYYT 50REI ======================Q==QDIIK=LN================EA16G8 ENVL====AIM===L=EK==MS====== ========KSDAS===W====HIC E=VL====GTI=I=P=ERA==S====O==SSYIA====K==Q==R====GA51 SNLAPGVPSRFSCSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQGT100REI ===QA=================================YQ=L=Y=======16G8=======T========NS=SL====MEG==A=================S==HIC =SR=T=I=D========DF=L===RLE=X=F=V=====YG===W=======101 KLQITREI =====16G8 ==E=KHIC =VE=K

TM29 VH

1 EVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVROAPGKGLEWVAY

KOL Q===========================IF=SYA=Y==============I

16G8 D=========L====G=RK===AA===== ============D========

WEA Q====D====L=E==G=======A===== =AND=N============LSF

51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLOMDSLRPEDTGVYFCARRG

KOL =WDDG=DQH===SV==================================D=

16G8 ========================P========T===S===AM=Y=====

WEA =GGSG=======SV========NB===S=Y===S===A===A=YY== ==

101 EGAM DYWGOGTPVTVSS

KOL GHGFCSSASCFGP=============

16G8 ==== =======S=====

WEA WLL N =====L=====TM29：具有第一种型式的序列TM29.1：SS变为AA(23-24)TM29.2：S变为P(75)TM29.3：GV/F变为AM/Y(92-93/95)实施例8TM29mAb的Scatchard分析

在三个独立的实验中进行TM29和16G8抗体的Scatchard分析。下表显示了每个实验测得的Kd值

实验 TM29(kd M^-1) 16G8(kd M^-1)

1 1.45×10^-9 2.86×10^-9

2 1.65×10^-9 2.65×10^-9

3 1.15×10^-9 2.44×10^-9

平均值 1.42×10^-9 2.65×10^-9实施例9嵌合TM29的工作概况COS和CHO中的嵌合体：^*以cDNA构型将V(D)J区cDNA克隆到CHO细胞表达载体pTCSLNeo(H)和TCSLDHFR(K)中。^*将表达质粒共转染到COS和CHO中。^*COS细胞上清液中的Ab浓度为～35ng/ml。^*分析CHO细胞转染子(通过FACS和ELISA)，克隆一次，用MTX(20nM、100nM和500nM)扩增。^*未经扩增的CHO细胞克隆的抗体浓度为～3μg/ml，它正染Jurkat细胞，在液氮中冷冻未经扩增的克隆。实施例10在COS和CHO细胞中表达嵌合的16G816G8嵌合体

在CDR-移植构建体所用的相同表达载体中，轻链和重链构建体含有具有人恒定区的完整的小鼠V区：pTCSDHFR连结pTCSNeo连结-该构建体具有双重选择能力。COS细胞转染子-～35ng/mlCHO细胞转染子-16个阳性孔/54个孔

ng/ml 校正量

1A1 151.6

1A6 166.6

1B3 107.2

1B6 179.6

1D2 101.0

1D5 215.1 * 2.2μg/ml

2A4 199.8

2B1 184.5

2B2 213.8 * 2.1μg/ml

2B4 130.6

2C2 119.6

2C6 214.4 * 2.1μg/ml

2D3 216.6 * 2.2μg/ml

2D6 139.7

3A1 198.7

3A2 172.2全部扩充到25cm²三角锥瓶中^*进行流式细胞计量术实施例11TM29的工作概况TM29COS/CHO中的TM29：^*从NSO生产细胞系的CDR-移植V区中制备cDNA，经PRCR扩增，测序。^*以cDNA的构型将DNA片段克隆到pTCSLNeo(H)和pTCSLDHFR(κ)中。^*将质粒共转染到COS和CHO中。^*COS细胞的上清液含有～2μg/ml Ab。^*在克隆和扩增之前，CHO细胞转染子分泌～3μg/ml Ab，上清液可正染Jurkat细胞。克隆3次后制备未扩增的Ab最佳产生者的细胞库。^*在不同浓度的MTX中扩增CHO细胞系。实施例12在4H11-FITC中比较TM27L、TM27I和TM23竞争性试验实验1：

TM23斜率/TM27L斜率＝1.56

TM23斜率/TM27I斜率＝2.04实验2：

TM23斜率/TM27L斜率＝1.82

TM23斜率/TM27I斜率＝2.44与TM23相比，TM27L和TM27I的值都＜3倍。实施例13TM27的氨甲喋呤扩增

产率(微克/10⁶个细胞/天)

氨甲喋呤水平(nM)

0 20 100 10-200 20-200

C7 ^*7/30 27 nd nd nd 265.8

^*7/22 3.5 nd 19.2 14.7 34.2

7/6 2.6 nd nd 9.1 nd

6/25 2 4.8 4.5 nd nd

6/18 3 8.9 nd nd nd

H9 ^*7/30 22.7 nd nd nd 181.9

^*7/22 3.9 nd 9.4 11.6 34.4

6/25 1.5 1.8 4.7 3.6 nd

6/18 1.8 1.5 nd nd nd

*没有试验之间的比较。

nd＝未测试验内相对值(Intra-assay relative value)

0 20 100 20-200 20-200

C7 ^*7/30 1 nd nd nd 9.8

^*7/22 1 nd 5.5 4.2 9.8

7/6 1 nd nd 3.5 nd

6/25 1 2.4 2.3 nd nd

6/18 1 3.0 nd nd nd

H9 ^*7/30 1 nd nd nd 8.0

^*7/22 1 nd 2.4 3.0 8.8

6/25 1 1.2 3.1 2.4 nd

6/18 1 0.8 nd nd nd情况(status)

0 20 100 10-200 20-200

C7 8/11 fm fm，s，sf4 fm fm fm，s^*

H9 8/11 fm 丢弃 fm，s，f2 fm fm，s^*解释：

fm＝冷冻一管混合培养物

s＝通过一次有限稀释来进行的次级培养

s^*＝进行中的首次有限稀释

f#＝每个#孔冷冻一管

nd＝未测

Claims

1、一种人源化抗体或其结合蛋白，其氨基酸序列包含基本上来自一种单克隆抗体的全部或部分CDR以及也来自所说单克隆抗体的选定可变构架残基，所说单克隆抗体对选定的T细胞亚群具有特异性，所说人源化抗体或其结合蛋白能结合到所说选定的T细胞亚群上，其结合亲和力至少与所说单克隆抗体表现出的相当。

2、如权利要求1的人源化抗体或其结合蛋白，它含有下列氨基酸序列的全部或部分：

TM27 Vk

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107

3、如权利要求2的人源化抗体或其结合蛋白，它进一步含有下列序列的全部或部分：

TM27 VH

1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50

51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100

101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120

4、如权利要求1的人源化抗体或其结合蛋白，它含有下列序列的全部或部分：

TM29 Vk

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVN YIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQGT 100

101 KLQIT 106

5、如权利要求4的人源化抗体或其结合蛋白，它进一步含有下列序列的全部或部分：

TM29 VH

1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTF SNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG

101 EGAM DYWGQGTPVTVSS

6、如权利要求1至5中任一项的人源化抗体，其为完整的Ig。

7、如权利要求6的人源化抗体，其为同种型IgG2a。

8、如权利要求6或7的人源化抗体，其中Ig恒定区中的一个或多个残基被改变以改变所说恒定区的效应子功能。

9、如权利要求1至8中任一项的人源化抗体或其结合部分由重组DNA技术产生。

10、生产如权利要求1至9中任一项的人源化抗体或其结合蛋白的方法，此方法包括：

a)分离编码至少一个基本上来自鼠单克隆抗体的CDR的第一DNA序列，所说单克隆抗体对T细胞的选定亚群具有特异性；

b)将所说第一DNA序列克隆到适当载体中；

c)通过诱变引入选定的人构架氨基酸，因而形成CDR-移植构建体；

d)用步骤c)中所说的构建体转化宿主细胞；和

e)培养如此转化的所说宿主细胞以产生所说人源化抗体或其结合蛋白。

11、如权利要求10的方法，其中该宿主细胞是CHO细胞。

12、根据权利要求1至9中任一项的人源化抗体或其结合蛋白在治疗中的应用。

13、一种药物组合物，它含有根据权利要求1至9中任一项的人源化抗体或其结合蛋白以及药用可接受的赋形剂。

14、治疗Crohn氏病的方法，包括给需要这种治疗的病人施用有效量的根据权利要求4至7中任一项的人源化抗体或其结合蛋白。

15、治疗MS的方法，包括给需要这种治疗的病人服用有效量的根据权利要求2、3、6或7中任一项的人源化抗体或其结合蛋白。