HUT75553A - Humanized antibodies and uses thereof - Google Patents

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.

HUMANIZÁLT ELLENANYAGOK ÉS ALKALMAZÁSOK

A találmány tárgyát olyan humanizált ellenanyagok és azokból származtatható kötőfehérjék képezik, melyek képesek bizonyos variábilis béta-láncokat a felszínükön hordozó T-sejtekhez kötődni, különösen azokhoz a T-sejtszubpopulációkhoz, melyek humán VB5.2 és/vagy 5.3, valamint V58.1 típusú láncokat expresszálnak. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások az ilyen ellenanyagok előállítására, valamint az ilyen ellenanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények.

A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti ellenanyagok terápiás alkalmazása is, elsősorban autoimmun megbetegedések kezelésére.

A T-sejtek kulcsszerepet játszanak az immunrendszeren belüli effektormechanizmusok differenciálódásában és szabályozásában [ Paul és mtsai.: Science, 195, 1293 (1987)] . A T-sejteknek specifikusan és precízen szabályozottan kell együttesen felismerniük az antigént és a fő hisztokompatibilitási molekulákat, mivel a helytelen immunszabályozás elősegíti az autoimmunitás kialakulását. Számos munkacsoport vizsgált olyan betegségeket, melyek kialakulásában a helytelen immunszabályozás szerepet játszik, ilyen

Aktaszámunk: 83906-7215B/PÁ például az autoimmunitás, valamint az immundeficiencia bizonyos formái, és úgy találták, hogy a T-sejtek szerepet játszanak az ilyen betegségek patogenezisében.

Megfigyeltek olyan eseteket, melyekben szerepet játszik egy bizonyos T-sejt-receptorösszetétel klonális vagy oligoklonális expanziója. Az legnyilvánvalóbb ilyen esetek a rákos elváltozások, melyek T-sejtes leukémiát vagy limfómát eredményeznek. A T-sejtes leukémiák és limfómák esetén a T-sejt-receptor különleges tumormarker szerepét tölti be, mivel az ilyen esetekben a T-sejt-receptor stabilan átrendeződik és a sejt felszínén prezentálódik. A szervátültetésen átesett páciensek esetén is szerepet játszik egy bizonyos T-sejt-receptor összetétel, mivel a recipiens T-limfocitái olyan T-sejt-receptorokkal rendelkeznek, melyek azokat a donor MHC-molekuláival szemben agresszívvé teszik, például a donorból származó átültetett csontvelővel szemben.

Fontos az a felismerés, melyet több kutatócsoport is megerősített, miszerint bizonyos autoimmun rendellenességek esetén szelektív T-sejt-antigénreceptor-V-régiógénhasználat figyelhető meg. Grunwald és mtsai. például megfigyelték a Vcc-2.3-géntermék preferenciális expreszszióját a broncheoalveoláris váladékban található CD4⁺-Tsejtekben, Sarcoidosis-ban szenvedő betegek esetén, a perifériális vérben található limfocitákkal összehasonlítva [Grunwald és mtsai.: Eur. J. Immunoi. 22, 129 (1992)] . A Kawasaki-kór esetén a VB-2- és VB-8-T-sejtek preferenciális expanzióját figyelték meg a betegség kialakulásával egyide• · jűleg [Abe és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 9, 4066 (1992)] .

Ebben a vonatkozásban a reumás ízületi gyulladást is alaposan tanulmányozták. Több kutatócsoport is megfigyelte bizonyos T-sejt-csoportok preferenciális expanzióját, például: DerSimonian és mtsai.: J. Exp. Med. 177, 1623 (Va-12.1-et hordozó T-sejtek preferenciális expanziója CD8⁺ perifériális vérben található T-limfocitákban); Stamenkovic és mtsai.: (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1179 (IL2ben növekvő synovialis membránon átszűrődó T-sejtek növekedése Southern-blot-analízissel vizsgálva oligoklonálisnak bizonyult; Paliard és mtsai.: (1991) Science 253, 34 (feltételezték, hogy egy szuperantigén által aktivált Vfi14+-T-sejtek expanzióját, például olyan autoreaktív Tsejtekét, melyek klonálisan expandálnak, és a reumás izületi gyulladásban szenvedő páciensek synovialis folyadékába vándorolnak); Howell és mtsai.: (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10921 (kimutatták VB-3-, -14- és -17-T-sejtek V-régió-génhasználatát reumás ízületi gyulladásban szenvedő páciensek synovialis folyadékából származó IL-2R⁺sejtekben); Uematsu és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8534 (kimutatták egy reumás ízületi gyulladásban szereplő páciens synovialis folyadékában található T-sejtek oligoklonális T-sejt-V-régió-génhasználatát); valamint a W090/06758 számú nemzetközi közzétételi irat (amelyben kimutatják a VB-3-, -9 és -10 szerepét reumás ízületi gyulladás esetén).

Alaposan tanulmányozták a gyulladásos bélbetegséget is. Több kutatócsoport is beszámolt expandált T-sejtpopulációkról és preferenciális T-sejt-receptor-V-régiógénhasználatról, például: Posnett és mtsai.: J. Clin. Invest. 85, 1770 (1990); Spencer és mtsai.: J. Clin. Pathol. 44, 915 (1990); Trejjdosiewicz és mtsai.: Clin. Exp. Immunoi. 84, 440 (1991); és Van Kerckhove és mtsai.: J. Exp. Med. 175, 57 (1992). Más kutatócsoportok beszámoltak preferenciális T-sejt-V-génhasználatról Mycobacterium leprae esetén is [van Shooten és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11244 (1992); Wang és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 188 (1993)] .

Bizonyos autoimmun megbetegedések esetén, például a Chron-kór esetén, emberekben megfigyelték a VB-8.1-T-sejtek expanzióját a gyulladásos szövetekben [ Posnett és mtsai.:

J. Clin. Invest. 85, 1770 (1990)] , Kawasaki-kór [ Abe és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA 8 9, 4066 (1992) és Abe és mtsai.: J. Exp. Med. 177, 791 (1993)] , valamint reumás ízületi gyulladás esetén is [Brennan és mtsia.: Clin. Exp. Immunoi. 73, 417 (1988)] .

A szklerózis multiplex (Multiple Sclerosis , MS) egy további olyan autoimmun megbetegedés, melyet alaposan tanulmányoztak. Az MS egy olyan betegség, melynek kialakulásában szerepet játszik az immunrendszer, és a betegségre jellemző a központi idegrendszer mononukleáris sejtjeinek infiltrációja és demielinizációja. Bár az MS patogenezise jelenleg még ismeretlen, a betegség kialakulásában szerepet játszanak mind genetikai, mind pedig környezeti tényezők. A • · · • · * 1 betegséggel összefüggő genetikai prediszpozíció fő elemei többek között bizonyos II. osztályba tartozó fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) haplotípusok, különösen a HLA-DR21 és DQW1 [ Terasaid és mtsai.: Science 1933, 1245 (1976); Ho és mtsai.: Immunogenetics 15, 509 (1982); Spielman és mtsai.: Epidemiol . Rév. j4, 45 (1982); Francis és mtsai.: Láncét 3^, 211 (1986); Elian és mtsai.: Disease Markers, 5, 89 (1987); Urban és mtsai.: Cell 54, 577 (1988); Vandenbark és mtsai.: Natúré 341, 541 (1989);

Howell és mtsai.: Science 246, 668 (1989)] .

Kimutatták, hogy az MS-ben szenvedő páciensek cerebrospinális folyadékából izolált T-sejtek a V-régió géneknek csak egy korlátozott csoportját használják. Az a megfigyelés, hogy MS-páciensekben in vivő aktivált mielin bázikus proteinre specifikus T-sejtek mutathatók ki, arra utal, hogy az MBP-reaktív T-sejtek szerepet játszanak a betegség patogenezisében [Wucherpfennig és mtsai.: Science 248, 1016 (1990)] . Megvizsgálták az MBP-reaktív Tsejtvonalak TCR-Vfi-használatát polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával, oly módon, hogy cDNS-t T-sejt-receptor-VBláncindítokkal amplifikáltak, és ily módon kimutatták korlátozott számú VL-gén preferenciális használatát [Wucherpfennig és mtsai.: (1990) fent; a V5-17 és kisebb mértékben a Vfi-12 gyakran használatos az MBP humán autoantigén immundomináns régiójának felismerésében] ; Oksenberg és mtsai.: Natúré 362, 68 (1993). Bizonyos kutatások eredményei arra utalnak, hogy az MS-agysérülések esetén korlátozott a T-sejt-receptor-Va-génexpresszió • ·

- 6 [Oksenberg és mtsai.: Natúré 345, 344 (1990)] . A T-sejtrepertoár analízise kvantitatív PCR és monoklonális ellenanyag-festés (mAb-festés) alkalmazásával kimutatta, hogy az MS-páciensekből izolált mielin bázikus proteinre (MBP) specifikus T-sejtek a kontrolihoz viszonyítva lényegesen nagyobb mértékben használták a VB-5.2 és/vagy 5.3 géneket [Oksenberg és mtsai.: (1993) fent; a páciensek agyában átrendeződött VB-5.2-géneket lehetett kimutatni, melyek egy bizonyos HLA-fenotípushoz tartoztak; és Kotzin és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9196 (1991); eltérés volt megfigyelhető az 5.2-B-lánc variábilis régió használatában, és kisebb mértékben a VB-6.1 használatában, az MSpáciensekből izolált MBP-specifikus kiónokban] .

A MS vonatkozásában jelenleg hatásos kezelés nem ismeretes [Harrison's Principles of Internál Medicine,

12. kiadás, Wilson és mtsai.: McGraw Hill,Inc. (1991)] . A terápiás erőfeszítések jelenleg az akut epizód javítására, a betegség rosszabbodásának és előrehaladásának megelőzésére, valamint a tünetek enyhítésére irányulnak.

Kimutatták viszont, hogy az egér-VB-8.2-variábilisrégió-gén expressziója korrelációban van a kísérletes allergiás enkefalomielitisszel (EAE), amely az emberi MS egérmodellje. Kimutatták, hogy egér-VB-8.2-specifikus monoklonális ellenanyagokkal történő kezelés alkalmas a betegség megelőzésére és a betegség tüneteinek csökkentésére [ Acha-Orbea és mtsai.: Cell 54, 263 (1988); és Urban és mtsai.: Cell 54, 577 (1988)] . Az elmondottakból következően jelentős igény van olyan ellenanyag vagy ellenanyagszerű

- Ί molekula kifejlesztésére, amely alkalmas ennek a betegségnek a kezelésére.

Az ellenanyagok tipikusan két nehéz láncot tartalmaznak, melyeket diszulfid-hidak kapcsolnak össze, valamint tartalmaznak egy-egy könnyű láncot, a nehéz láncok Nterminális végéhez kapcsolódva. Mindkét nehéz lánc Nterminális végén variábilis domént tartalmaz, melyet a lánc másik végén egy konstans dómén követ. Mindkét könnyű lánc is tartalmaz egy-egy variábilis domént a lánc N-terminális végén, melyeket itt is konstans dómén követ. A könnyű és nehéz lánc párok variábilis dóménjai együttesen alkotják az antigénkötő helyet. A könnyű és nehéz láncokon található variábilis doménok azonos általános szerkezettel rendelkeznek, és valamennyi dómén tartalmaz egy négy régióból álló vázat (framework) , mely régiók szekvenciája viszonylag konzervált, és amely régiókat három komplementaritást meghatározó régió (CDR) kapcsol össze. A négy vázrégió bétaredőzött réteg szerű konformációt vesz fel, és a CDR-ek a béta-redőzött rétegeket összekötő hurkokat alkotják. A CDReket a vázrégiók egymás közelében tartják, ily módon hozzájárulva az antigénkötőhely kialakításához. Az ellenanyagok CDR-jei és vázrégiói osztályozhatók a Kabat-féle számozási rendszer segítségével [Kábát és mtsai.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. of Health of Humán Services, US Government Printing Office (1987)], és az osztályozásban segítséget nyújthat a röntgenkrisztallográfia is, a WO 91/09967 számú közzétételi iratban ismertetettek szerint.

<

- 8 Specifikus antigéneket felismerni képes ellenanyagokat általában Kohler és Milstein eljárása szerint állítanak elő [Kohler és mtsai.: Natúré 256, 495 (1976)] . Ez általában úgy történik, hogy egy egeret a kívánt antigénnel immunizálnak, az immunizált egérből származó lépsejteket fuzionáltatják egérmielóma-sejtekkel, és az így előállított hibridómák közül kiválasztanak egy vagy több olyan hibridómát, amely a célzott antigénre specifikus monoklonális ellenanyagot szekretál.

Kívánatos lenne az ilyen monoklonális ellenanyagok terápiás alkalmazása. Az ilyen ellenanyagok azonban lényegében egéreredetűek, és ezért emberekben antigén sajátságának bizonyulnak. Amennyiben ilyen monoklonális ellenanyagokat ismétlődően beadunk embernek, az emberi immunrendszer immunválaszt fog kialakítani az egéreredetű monoklonális ellenanyagok ellen, és ily módon hatástalanítja azokat.

Az elmondottak értelmében felvetették - eredetileg Winter és mtsai. (lásd például Reichman és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988); és Verhoeyen és mtsai.: Science 239, 1534 (1988)], hogy az egéreredetű monoklonális ellenanyagból származó CDR-eket át kellene ültetni egy humán ellenanyagból származó vázba, és ily módon olyan CDR-átültetett ellenanyagot kellene előállítani, amely a donor egéreredetű monoklonális ellenanyag kötési sajátságaival rendelkezne, azonban az akceptor humán váz miatt az emberi szervezettel kompatíbilis lenne.

Egy ellenanyagmolekula működése azonban teljes háromdimenziós szerkezetétől függ, ami viszont a molekula • · » ·· • · aminosavsorrendjétől. Éppen ezért, ha egy ellenanyag aminosavsorrendjét megváltoztatjuk, az károsan befolyásolhatja a molekula aktivitását. Az elmondottak értelmében egy ellenanyag fragmensei lehetséges, hogy nem tartják meg a kötési aktivitás meglétéhez szükséges megfelelő háromdimenziós szerkezetet. Ezenfelül, amennyiben az ellenanyagok kódoló DNS-molekula szekvenciáját megváltoztatjuk, az károsan befolyásolhatja a sejt képességét a DNS-szekvencia expreszszálására, szekretálására, vagy az ellenanyag összeszerelésére. A CDR-eket alkotó aminosav szekvenciarészleteket nehéz pontosan behatárolni, és ezek nem feltétlenül azonosak a Kabat-féle osztályozási rendszer által meghatározott hipervariábilis régiók teljes szekvenciájával. Szerepet játszanak bizonyos kritikus váz-aminosavak is, melyek fontosak a CDR-ek megfelelő pozicionálásához, az antigénnel történő kölcsönhatás során, vagy amelyek szerepet játszanak a nehéz és könnyű láncok közötti kölcsönhatásokban. Ezért szükséges lehet bizonyos váz-aminosavakat is megváltoztatni, hogy azok bizonyos pozíciókban megfeleljenek a donor aminosavaknak, miáltal a CDR-átültetett ellenanyag kevésbé humán-sajátságúvá válik.

Számos elképzelés napvilágot látott azzal kapcsolatosan, hogy hogyan lehet azonosítani azokat a CDR- és vázaminosavakat, melyeket donor-aminosavakkal kell felcserélni, ahhoz, hogy alkalmas CDR-átültetett ellenanyagot nyerjünk (lásd például: Queen és mtsai.: W090/07861; Kurrle és mtsai.: EP-A-0 403 156; Adair és mtsai.: WO91/09967; Queen és mtsai.: WO92/11018; és Being és mtsai.:

- 10 WO92/01568). A fenti publikációkból világos, hogy a megfelelő CDR-átültetett ellenanyagok előállítása semmilyen esetben sem egyszerű feladat.

A specifikus CDR átültetett ellenanyagok előállításával kapcsolatos jelentős nehézségek ellenére egy előnyös megvalósítási mód szerint sikerült olyan CDR átültetett ellenanyagot előállítanunk, amely emberi vázrégiókon alapult, és bizonyos T-sejt-szubpopulációkra jellemző variábilis béta-láncrégiókat tartalmazott. A találmány szerinti humanizált ellenanyagok meglepő módon egéreredetű megfelelőikkel azonos vagy azoknál jobb kötési affinitással rendelkeznek a cél-T-sejtek vonatkozásában. A találmány szerinti ellenanyagok és azok részei azzal a további előnyös tulajdonsággal is rendelkeznek, hogy egéreredetű megfelelőiknél kevésbé immunogének, és ezért terápiás felhasználásuk esetén káros immunreakciók kisebb mértékben lépnek fel. A találmány tárgyát olyan humanizált ellenanyagok képezik, melyek szelektív kötőképességgel rendelkeznek bizonyos T-sejtszubpopulációk irányában, mely ellenanyagok rendkívül érzékenyen képesek ezekhez a szubpopulációkhoz kötődni, és amely ellenanyagok kötési specifitása és affinitása hasonló vagy nagyobb, mint azon prototípus monoklonális ellenanyagok kötési specifitása és affinitása, melyekből a találmány szerinti ellenanyagok CDR-régióinak jelentős része származik. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti humanizált ellenanyagok előállítására szolgáló eljárások is, mely eljárásokban bizonyos hipervariábilis és vázaminosavakat kódoló új cDNS-molekulákat alkalmazunk, és a

- 11 kódolt aminosavakat humán nehéz lánc és humán könnyű lánc vázba ültetjük. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti ellenanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények és terápiás eljárások is.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a 16G8-jelű egéreredetű monoklonális ellenanyagot - mely a humán VÜ-8.1-láncot ismeri fel - CDRátültetéssel humanizáltuk oly módon, hogy bizonyos CDR- és kiválasztott vázaminosavakat az egéreredetű monoklonális ellenanyagból egy KOL nehéz láncból és egy REI könnyű láncból álló vázba ültettünk. A humanizált nehéz (IgGl) és könnyű (k) láncokat kódoló cDNS-molekulákat sorrendben Neo^r és DHFR szelekciós markereket tartalmazó emlős sejtekben alkalmazható expressziós vektorokban DHFR kínai hörcsög fibroblaszt (CHO) sejtvonalba transzfektáltuk, amit szelekció és amplifikáció követett. A kiválasztott humanizált monoklonális ellenanyagot TM2 9-nek neveztük el, és ez az ellenanyag megőrizte a humán TCR VE-8.1-lánc iránti specifitását, a prototípus egéreredetű monoklonális ellenanyaggal (16G8) összehasonlítható affinitással. A találmány szerinti ellenanyagok igazolták, hogy lehetséges anti-TCRellenanyagokat humanizálni oly módon, hogy azok megtartsák a megfelelő alcsoporttal szembeni specifitásukat és affinitásukat .

A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti humanizált ellenanyagok alkalmazása is, humán autoimmun megbetegedések - különösen Chron-kór - kezelésére alkalmas terápiás hatóanyagként.

• ·

- 12 A találmány egy másik különösen előnyös megvalósítási módja szerint a TM23-jelű egéreredetű monoklonális ellenanyagot - amely a humán VB-5.2- és 5.3 láncokat ismeri fel - humanizáltuk oly módon, hogy CDR-átültetést végeztünk NEWM nehéz láncot és REI könnyű láncot tartalmazó vázakba. A humanizált nehéz (IgGl) és könnyű (κ) láncokat kódoló cDNS-molekulákat sorrendben Neo^r és DHFR szelekciós markereket tartalmazó emlős sejtekben működőképes expressziós vektorokban DHFR- kínai hörcsög fibroblaszt (CHO) sejtvonalba transzfektáltuk, amit szelekció és amplifikálás követett. A kiválasztott humanizált monoklonális ellenanyagot TM27-nek neveztük el, és az így előállított ellenanyag megtartotta a humán TCR VŰ-5.2 és 5.3 láncok iránti specifitását, az egéreredetű prototípus ellenanyagéhoz (TM23) hasonló vagy nagyobb affinitással. A találmány tárgyát képezi a TM27 ellenanyag alkalmazása humán MS kezelésére alkalmas terápiás hatóanyagként.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1 . ábrán a TM27-ellenanyag könnyű láncának és nehéz láncának különböző variábilis szekvenciarészleteit láthatjuk.

A 2. ábrán a TM29-ellenanyag könnyű láncának és nehéz láncának különböző variábilis szekvenciarészleteit láthatjuk.

A 3. ábrán egy kompetíciós vizsgálati eljárás eredményeit láthatjuk, amelyben a TM27L/NSO- és TM27L/CHOellenanyagokat hasonlítottuk össze a 4Hll-ellenanyaggal.

····

- 13 A 4 . ábrán a 3. ábrán látható kísérlet Scatchard plot-ját láthatjuk.

Az alábbiakban a leírásban használt néhány fogalmas definiálunk.

A leírás szerinti értelemben az ellenanyag kifejezés valamely immunglobulint vagy annak a fragmensét jelenti, könnyű vagy nehéz lánc monomereket vagy dimereket, egyláncú ellenanyagokat, például egyláncú Fv-ket, melyekben a nehéz és könnyű láncok variábilis dóménjait egy kapcsolópeptid köti össze, az ellenanyag-fragmensek lehetnek természetesek vagy előállíthatok rekombináns DNStechnológiával vagy másképp, feltéve, hogy az ellenanyag legalább egy antigénkötőhelyet tartalmaz. A leírásban használt értelemben az ellenanyag nem feltétlenül csak Igeredetű fehérjeszekvenciákat tartalmaz. Előállíthatunk például egy olyan gént, amelyben egy humán Ig-láncrészletet kódoló DNS-szekvencia fuzionáltatva van egy polipeptid effektor- vagy riportermolekula aminosavsorrendjét kódoló DNS-szekvenciával. Tehát az ellenanyag kifejezés a hibrid ellenanyagokat is magában foglalja (lásd alább).

A kötőfehérje kifejezés a leírásban használt értelemben olyan konstrukciót jelöl, amely tartalmaz egy ellenanyagból vagy ellenanyagok kombinációjából származó aminosavsorrend-részletet, mely szekvenciarészlet térben úgy helyezkedik el, hogy legalább egy antigénkötőhelyet képez .

- 14 A mAb rövidítés olyan monoklonális ellenanyagot jelent, melyet egy hibridóma vagy hibridóma-származék sejtvonal termel.

A rekombináns ellenanyag kifejezést olyan ellenanyag megnevezésére használjuk, melyet rekombináns DNStechnológiát is magában foglaló eljárással állítottunk elő.

A CDR vagy komplementaritást meghatározó régió kifejezések egy ellenanyag nehéz vagy könnyű lánca variábilis régiójának azon részleteit jelenti, melyek a háromdimenziós térben egymáshoz képest úgy helyezkednek el, hogy antigénkötő felszínt képeznek.

A kiméra ellenanyag kifejezést olyan ellenanyag megjelölésére használjuk, amelyben a variábilis doménok teljes egészükben egy első emlős fajból izolált ellenanyagból származnak, és fuzionáltatva lettek legalább egy konstans doménnal, amely egy másik emlős fajból izolált ellenanyagból származik.

Egy ellenanyagot vagy annak valamely részletét CDR-átültetett -nek nevezzük, amennyiben az ellenanyag CDR-jei lényegében egy első emlős fajból származnak, és amely CDR-ek be vannak ültetve olyan vázrégiókba, melyek lényegében egy második emlős fajból származnak. A vázrégiók bizonyos kiválasztott aminosavai származhatnak az említett első emlős fajból is.

A hibrid ellenanyag olyan proteint jelöl, amely tartalmaz legalább egy Ig-eredetű kötőrégiót, amely peptidkötéssel hozzá van kapcsolva egy másik fehérjéhez vagy annak valamely részletéhez. Megjegyezzük, hogy a szak·«··

- 15 irodalomban a kiméra ellenanyag kifejezés bizonyos esetekben használatos lehet az ilyen konstrukciók leírására, azonban a leírásban használt értelemben az előzőekben definiált konstrukciókat hibrid ellenanyagoknak nevezzük, és a kiméra ellenanyag kifejezést a fenti definíció értelmében használjuk.

A humanizált ellenanyag kifejezés olyan ellenanyagot jelöl, amely tartalmaz legalább egy - előnyösen kettő vagy három - olyan CDR-t, amely egy első fajból származik (ezek a CDR-ek tartalmazhatnak bizonyos kiválasztott vázrégióhoz tartozó aminosavakat is, a hipervariábilis aminosavszekvenciákhoz kapcsoltan). Az ellenanyag fennmaradó Ig-eredetű részei egy vagy több különböző ellenanyagból származnak. A variábilis doménokat előállíthatjuk rekombináns DNS-technológia vagy peptidszintézis alkalmazásával .

Az expressziós vektor kifejezés olyan vektorokat jelöl, melyek képesek a bennük található DNS-szekvenciák expresszálására, azaz a kódoló szekvenciák funkcionálisan hozzá vannak kapcsolva egyéb szekvenciákhoz, melyek alkalmasak az expresszió vezérlésére. Hasznos - bár nem minden esetben szükséges (például rovarsejtek esetén) - eleme a hatékony expressziós vektornak a markert kódoló szekvencia, azaz egy olyan szekvencia, amely fenotípusosan megnyilvánuló sajátságot kódol (például neomicin-rezisztenciát, metionin-szulfoximil-rezisztenciát vagy triptofánprototrófiát) , mely sajátság a fehérjét expresszáló sejteken megnyilvánul, és azokat könnyen azonosíthatóvá teszi.

····

- 16 Összegezve tehát az expressziós vektor kifejezés definíciója funkcionális, és ebbe a kifejezésbe beleértünk minden olyan DNS-szekvenciát, amely képes egy bizonyos általa hordozott DNS-kód expresszióját vezérelni, amennyiben a DNSkód a vektorban megfelelő módon van elhelyezve. Jelenleg az ilyen vektorok gyakran plazmidok. A plazmid és expressziós vektor kifejezéseket tehát felcserélhetően használjuk. A találmány tárgyát képezik azonban egyéb expressziós vektorok is, melyek hasonló módon alkalmazhatók, és amelyek a technika állása szerint időről-időre ismertté válnak, például retrovírusok, adenovírusok, ín vitro rendszerek [ Baranov és mtsai.: Gene 84, 2 (1989)] és hasonlók.

Ahogy arra már utaltunk, a DNS-szekvenciákat a gazdasejtek akkor expresszálják, ha azok előzetesen funkcionálisan hozzá lettek kapcsolva (azaz a működést biztosltóan pozícionálva) valamely expressziós szabályozószekvenciához. Az expressziós vektorok a gazdaszervezetben tipikusan episzómaként vagy a gazda kromoszómális DNS-nek integráns részeként replikálódnak.

A rekombináns gazdasejtek kifejezés olyan sejtekre utal, melyeket rekombináns DNS-technikával előállított vektorokkal transzformáltak. A transzformáció következtében a gazdasejt hasznos mennyiségben képes a kívánt terméket termelni, nem pedig elhanyagolható mennyiségben, azaz általánosabban nem kisebb, mint detektálható mennyiségben, a transzformálatlan gazdasejt termelésével összehasonlítva. A találmány szerinti ellenanyagokat és kötőfehérjéket a ···· t · ♦··.

- 17 rekombináns gazdasejtek a további kísérletezéshez megfelelő mennyiségben képesek termelni, vagy kereskedelmileg elfogatható mennyiségben, azaz például körülbelül 100 g-os nagyságrendben, vagy ennél nagyobb mértékben.

Az ellenanyagok vagy az azokból származtatott kötőfehérjék rekombináns gazdasejtekből történő izolálási eljárásainak vonatkozásában a sejt és sejttenyészet kifejezéseket egymással felcserélhetően használjuk, az ellenanyag forrásának megjelölésére, hacsak a kifejezéseket világosan másképpen nem definiáljuk. Más szavakkal, amennyiben arról beszélünk, hogy valamilyen anyagot sejtekből nyertünk ki, az jelenthet lecentrifugált egész sejteket, de jelenthet sejttenyészetet is, amely tartalmazza mind a tápközeget, mind a felszuszpendált sejteket, továbbá mielóma sejtvonalak esetén aszcitesz-tenyészetet is jelenthet.

A találmány szerinti humanizált ellenanyagok vagy belőlük származtatott kötőfehérjék tartalmaznak olyan aminosavszekvenciákat, melyek teljes egészükben vagy részleteiben tartalmazzák az ellenanyagok vagy kötőfehérjék CDR-jeit, melyek lényegében olyan monoklonális ellenanyagból vannak származtatva, melyek a T-sejtek egy kiválasztott szubpopulációjára specifikusak, különösen a VB-8.1szubpopulációra vagy a Vfi-5.2/5.3-szubpopulációra. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a monoklonális ellenanyag egéreredetű. Az ellenanyagok vagy részeik variábilis dóménjainak vázaminosavszekvenciái lényegében humán eredetűek a találmány előnyös megvalósítási módjai szerint, ezért az ilyen ellenanyagokat humanizált ellenanyagoknak • ·

- 18 nevezzük. Ez a humanizálás feltételezhetően hasznos az ellenanyag immunogenitásának csökkentésében, amennyiben az adott ellenanyagot terápiásán humán pácienseknek adjuk be. A nehéz lánc vonatkozásában a találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazzuk az NEWM vagy KOL humán vázrégiókat, valamint a könnyű lánc vonatkozásában a REI humán vázrégiókat. Bizonyos meghatározott váz-aminosavakat egéreredetűnek hagyunk meg, nem pedig humán eredetűnek. Erre feltehetőleg azért van szükség, hogy a molekula megfelelő háromdimenziós térszerkezete kialakuljon, és ily módon fokozódjék kötési specifitása és affinitása a kívánt Tsejt-alcsoport irányában.

A jelen kitanítás alapján előállított humanizált ellenanyagok bármely részlete (az ellenanyag tágabb értelemben vett definíciója szerint) a találmány tárgyát képezi, amennyiben rendelkezik kötési specifitással és affinitással a T-sejtek egy kiválasztott szubpopulációja iránt. Az ilyen ellenanyagokból előállított kötőfehérjék tehát nyilvánvalóan a találmány tárgyát képezik, csakúgy, mint az említett sajátsággal rendelkező egyéb ellenanyag fragmensek, mindazok a fragmensek, melyek az említett sajátsággal legalább terápiásán felhasználható mértékben rendelkeznek, az alábbiakban leírtak szerint.

Szakember képes a jelen kitanítás szerint előállított különböző konstrukciók kötési paramétereit tesztelni önmagában ismert kötésvizsgálati eljárások alkalmazásával, melyek specifikusan T-sejteken vagy T-sejt-receptorfehérjéken hajthatók végre, melyek a megcélzott kiválasz- 19 tott variábilis régióval rendelkeznek. Végrehajthatunk például a prototípus monoklonális ellenanyagokkal kompetíciós kötésvizsgálási eljárásokat, különböző sejtvonalakon, és végrehajthatunk scatchard-analíziseket és hasonlókat, és összehasonlíthatjuk a kapott eredményeket a prototípus mAbok esetén kapott eredményekkel. Eljárhatunk úgy is, hogy különböző állatkísérletes modellrendszereket alkalmazunk, például az alább leírtakat, de végezhetünk klinikai vizsgálatokat is a találmány szerinti konstrukciók terápiás hatékonyságának megállapítására. Szakember számára kézenfekvő, hogy egy adott konstrukció abban az esetben is lehet rendkívül hatásos terápiás hatóanyag, ha a célzott antigénnel szembeni kötődés mintázata különbözik a prototípus mAb kötődésmintázatától .

A találmány különösen előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti humanizált ellenanyag vagy belőle származtatott kötőfehérje aminosavszekvenciája tartalmazza az alábbi variábilis könnyű láncok szekvenciáját vagy annak valamely részletét:

TM29 könnyű lánc

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT 106

TM27 könnyű lánc

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT

107 .

- 20 önmagában, vagy kombinációban az alábbi variábilis nehéz lánc szekvenciák valamelyikével vagy azok valamelyik részletével :

TM29 nehéz lánc

EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117.

TM27 nehéz lánc

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM 50

IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100

101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120.

Az egyes CDR-ek szomszédságában található kiválasztott váz-aminosavak fontosak a CDR-ek háromdimenziós komformációjának kialakításában [Foote és Winter: J. Mól. Bioi. 224, 487 (1997)]. A találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjai szerint tehát módosított nehéz láncokat terveztünk. Az első ilyen előnyös megvalósítási mód szerint a nehéz láncban a 66-69. aminosavat, valamint a 73. aminosavat a humán szekvenciában kicseréltük a megfelelő egéreredetű szekvenciára: Leu-Ser-Ile-Ser (66-69) és Asp (73).

A találmány egyéb előnyös megvalósítási módjai szerint a 78. és 79. pozíciókban az aminosavakat sorrendben az egéreredetű valin és fenilalanin aminosavakra cseréltük, vagy a 92. pozícióban az aminosavat az egéreredetű argininra cseréltük.

Az 1. ábrán példákat láthatunk ilyen szubsztitúciókra, melyen a CDR-eket félkövér betűkkel és aláhúzással • ·

- 21 jelöltük. Ezek az előnyös ellenanyagkonstrukciók (valamint az azokból származtatott kötőfehérjék) a Vfi-5.2/5.3 géntermékekhez kötődnek.

A találmány tárgyát képezik további előnyös ellenanyagok és azokból származtatható kötőfehérjék, melyek a nehéz láncok 23. és 24. aminosavainak módosításával állíthatók elő. Ezekbe a pozíciókba az egéreredetű Alaaminosavat helyettesítjük be. Egyéb találmány szerinti konstrukciók igazolják, hogy a 75. pozícióban előnyös lehet az egéreredetű prolin aminosav, valamint a 88., 89. és 91. pozíciókban előnyös lehet sorrendben az alanin, metionin és tirozin aminosav. Ezek az ellenanyagkonstrukciók és a azokból származtatható kötőfehérjék νβ-8.1 T-sejtekhez kötődnek, és részletesen szemléltetve vannak a 2. ábrán.

Különösen előnyös találmány szerinti ellenanyagok az olyan CDR-átültetett ellenanyagok, melyek lényegében a TM27 könnyű láncból és a TM27 nehéz láncból állnak, mely ellenanyagokban a 48. aminosav egéreredetű leucin vagy izoleucin. Szintén különösen előnyösek azok a CDRátültetett ellenanyagok, melyek lényegében a TM29 könnyű láncból és a TM29 nehézláncból állnak.

A találmány szerinti humanizált ellenanyagok és az azokból származtató kötőfehérjék különböző módszerekkel állíthatók elő, transzfektált sejtekben történő expresszió útján, az expresszió előnyösen történhet élesztő-, rovar-, CHO- vagy mielómasejtekben. Legelőnyösebben a gazdasejt CHO-gazdasejt.

- 22 Ahhoz, hogy egy találmány szerinti CDR-átültetett ellenanyagot vagy egy belőle származtatható kötőfehérjét megtervezhessünk, először is szükséges a kívánt kötési sajátságokkal rendelkező ellenanyag variábilis dómén szekvenciáját azonosítanunk. Alkalmas DNS-szekvenciákat izolálhatunk például majomsejtekből, egyéb emlőssejtekből, valamint más gerincesek sejtjeiből, például csirkék, egerek, patkányok és nyulak sejtjeiből, előnyösen egérsejtekből. A variábilis dómén szekvenciákat (V_H és V_L) azonosíthatjuk a könnyű és nehéz láncokat kódoló cDNS-ből, melyet a megfelelő mRNS-ről szintetizálhatunk, önmagukban ismert eljárások alkalmazásával. A hipervariábilis régiókat ezután a Kabatféle eljárással (lásd fent) határozhatjuk meg. A CDR-eket strukturális analízissel azonosíthatjuk, röntgenkrisztallográfia vagy molekuláris modellezés alkalmazásával. Ilyen módon előállíthatunk olyan összetett CDR-eket, melyek tartalmazzák a hipervariábilis régiók valamennyi aminosavát, valamint bizonyos kiválasztott vázrégiókhoz tartozó aminosavakat. Az így előállított összetett CDR-eket antigénkötőhely-ként átültethetjük, az ellenanyag további része pedig - amennyiben teljes Ig-t kívánunk előállítani, tartalmazni fogja a nehéz és könnyű lánc konstans doménjait, valamint a fennmaradó vázrégióhoz tartozó aminosavakat. Ez utóbbi részletek különböző osztályokhoz tartozó humán ellenanyagokból származhatnak.

A konstans doménokat úgy választhatjuk meg, hogy rendelkezzenek az előállítandó ellenanyag tervezett felhasználásának megfelelő effektorfunkciókkal. Például a hu.... ,. ... .... .·· • ··· · . ·. :··. ·..· ·..· . ··

- 23 mán IgG-izotípusok, az IgGi és IgG₃ hatékonyak a komplement fixálásban és a sejt által közvetített lízisben. Más célokra egyéb izotípusok, így például az IgG₂ és IgG₄, vagy egyéb osztályok, mint például az IgM és IgE alkalmasabbak lehetnek.

Humán terápiás célból különösen kívánatos humán izotípusokat használni, a terápia alatti antiglubolinimmunválasz minimalizálása céljából. A humán konstans dómén DNS-szekvenciákat - előnyösen variábilis dómén vázrégióikkal együtt - önmagukban ismert eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő. Egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető példa a CAMPATH 1H, amely a Burrough Wellcome Limited cégtől szerezhető be.

A találmány előnyös megvalósítási módjait jelentik bizonyos olyan CDR átültetett ellenanyagok, melyek kiválasztott eltéréseket tartalmaznak a humán-szerű vázrégióktól (más szavakkal: a variábilis doménok CDR-jein kívül), az ilyen CDR átültetett ellenanyagok kielégítő kötési affinitással bírnak. A találmány szerinti ellenanyagok kötési affinitása előnyösen körülbelül 10^-5 mól/1 és 10“¹² mól/1 közötti, előnyösebben pedig legalább 10“⁸ mól/1. Legelőnyösebben a kötési affinitás körülbelül egyenlő vagy nagyobb, mint a prototípus ellenanyag kötési affinitása (előnyösen a prototípus ellenanyag egéreredetű ellenanyag).

A találmány szerinti CDR átültetett ellenanyagok előállításakor eljárhatunk úgy, hogy a V_H- és/vagy V_Lgénszegmenseket mutagenezissel megváltoztatjuk. Szakember számára kézenfekvő, hogy mutagenezissel megváltoztathatók ···· 4« • · • *·· « « · · • ·'« • · «·

- 24 egyéb olyan nukleotidok is, melyek az FC-régióhoz tartozó aminosav-szekvenciarészleteket kódolnak, vagy az ellenanyag más részeihez tartozó szekvenciarészleteket (lásd például PCT/US89/00297).

Alkalmazható megoldások például különböző korlátozott számú nukleotidok addíciója, deléciója vagy nem konzervatív szubsztitúciója, mely eljárásokat úgy kell végrehajtanunk, hogy a helyes leolvasási fázis megmaradjon.

A végső konstrukció kialakítása során végrehajthatunk szubsztitúciókat, deléciókat, inszerciókat vagy ezek bármilyen szubkombinációját. Mivel összesen 64 lehetséges kódonszekvencia létezik, az élő szervezeteket pedig csak 20 ismert aminosav építi fel, a genetikai kód degenerált abban az értelemben, hogy különböző kódonok is kódolhatják ugyanazt az aminosavat. Mindazáltal a kód valamennyi aminosav vonatkozásában precíz. Ezért elmondható, hogy valamennyi aminosavat legalább egy kódon kódol, más szóval valamennyi kódon egy és csak egy aminosavat kódol. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a transzláció során a leolvasási fázisnak változatlannak kell maradnia, ahhoz, hogy a termelődött polipeptid aminosavsorrendje megfelelő legyen.

A technika állása szerint előre meghatározott pozíciókban aminósavak addíciójára, deléciójára vagy szubsztitúciójára szolgáló eljárások közismertek. Ilyen technikák például az oligonukleotid-közvetítette helyspecifikus mutagenezis és a PCR.

Az oligonukleotidok alkalmazásán alapuló helyspecifikus mutagenezis azon az elven alapul, hogy a kívánt mutá-

• ·

- 25 ciót hordozó oligonukleotidot a mutálandó régiót tartalmazó egyszálú DNS-hez hibridizáljuk, és az egyszálú DNS-t az oligonukleotid meghosszabbításához templátként használjuk, és ily módon egy mutációt tartalmazó DNS-szálat állítunk elő. Ennek az eljárásnak különböző megvalósítási formáit megtalálhatjuk a következő publikációkban: Zoller és Smith,

Nuc. Acids. Rés. 10, 6487 (1982); Norris és mtsai.: Nuc. Acids. Rés. 11, 5103 (1983); Zoller és Smith: DNA 3_, 479 (1984); Kramer és mtsai.: Nuc. Acids Rés. 10, 6475 (1982).

A PCR-eljárás azon az elven alapul, hogy szekvenciaspecifikus oligonukleotidok segítségével bizonyos szekvenciarészletet exponenciálisan amplifikálunk. Kívánt esetben az alkalmazott láncindító oligonukleotidok mutációt is magukban foglalhatnak. A PCR-eljárás leírása megtalálható Mullis és Foloona publikációjában [Meth. Enz. 155, (1987)]. PCR-rel létrehozott mutagenezisre találhatunk példákat a következő közleményekben: Higuchi és mtsai.: Nuc. Acids Rés. 16, 7351 (1988); Ho és mtsai.: Gene, 77, 51 (1989); Ho és mtsai.: Engineering Hybridization Restriction Genes without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension; Horton és mtsai.: Gene 77, (1989)] .

A találmány szerinti nukleotid szekvenciákat - melyek alkalmasak a kívánt ellenanyagok vagy azokból származtatható kötőfehérjék expresszáltatására - számos különböző polinukleotid molekula felhasználásával előállíthatok (genomi DNS, cDNS, RNS vagy szintetikus oligonukleotidok). Jelenleg előnyösnek tartjuk, ha a polinukleotid szekvencia

- 26 • ··· · · : . ···· ···· • · ·· ···· ♦ ·· cDNS és genomi DNS fúziójával jön létre. A találmány szerinti polinukleotid szekvencia különböző Ig-komponenseket kódolhat (például V, J, D és C doménokat). A találmány szerinti polinukleotid molekulákat számos különböző eljárás alkalmazásával előállíthatjuk. Jelenleg a legáltalánosabban alkalmazott eljárás a genomi és cDNS-szekvenciák kombinálása, de alkalmazhatunk kizárólag cDNS-szekvenciákat is [lásd

EP-A-0 239 400 valamint Reichmann és mtsai.: Natúré 332 (1988)].

Bizonyos alkalmas expressziós vektorok és gazdasejtek leírását megtalálhatjuk a következő szabadalmi leírásban: US-A-4 816 567.

A jelen leírásban feltárt vektorok és eljárások alkalmazhatók számos különböző gazdasejtben, mind prokarióta mind eurókarióta élőlényekből származó gazdasejtekben.

Általánosságban elmondható, hogy a DNS-szekvenciák klónozására és a találmány szerinti megoldásban alkalmazható vektorok előállítására természetesen a prokarióta gazdaszervezetek előnyösek. Például különböző Escherichia coli plazmid klónozó vektorok különösen előnyösek, ilyenek például a pBluescript M13-vektorok, melyek a Stratagene cégtől szerezhetők be (San Diego, Kalifornia), a pUC19c-plazmid (Genbank nyilvántartási szám: VB0026), a pBR322 (az alábbiakban ismertetjük) és hasonlók. A felsorolt példák természetesen a szemléltetést szolgálják és semmi esetre sem korlátozzák az igényelt oltalmi kört.

A prokarióta gazdaszervezeteket expresszálásra is használhatjuk. Alkalmazhatjuk például a korábban említett • ··· » · · ·· ··

Escherichia coli törzseket, alkalmazhatunk Bacillusfajokat, például Bacillus subtilis-t, valamint egyéb enterobacteriaceae nemzetséghez tartozó fajokat, például Salmonella typhimurium-ot vagy Serratia marcescens-t, valamint különböző Rseudomonas-fajokat.

A felsorolt gazdaszervezetekben általában olyan plazmid-vektorokat alkalmazunk, melyek olyan replikont és szabályozó szekvenciákat tartalmaznak, melyek a gazdasejtekkel· kompatíbilis fajokból származnak. Az alkalmazott vektorok általában tartalmaznak replikációs origót, valamint marker-szekvenciákat, melyek alkalmasak arra, hogy a transzformált sejtek fenotípusos szelekcióját lehetővé tegyék. Az Escherichia coli sejteket például nagyon gyakran a pBR322-plazmid különböző származékaival transzformáljuk, mely plazmidot egy Escherichia coli fajból izolálták [Bolivár és mtsai.: Gene 2, 95 (1977)]. A pBR322-plazmid ampicillin- és tetraciklin-rezisztenciagéneket tartalmaz, ily módon lehetővé téve a transzformált sejtek könnyű azonosítását. A pBR322-plazmid, annak származékai, valamint egyéb mikrobiális plazmidok tartalmazhatnak - vagy módosíthatók oly módon, hogy tartalmazzanak - promóter szekvenciákat is, melyek lehetővé teszik, hogy a mikrobiális gazdaszervezetek rekombináns fehérjéket expresszáljanak. A rekombináns DNS-technikában gyakran alkalmazzák például az alábbi promótereket: laktóz promóterrendszer [Chang és mtsai.: Natúré 275 (1978); Itakura és mtsai.: Science 197 (1978); Goedell és mtsai.: Natúré 281 (1979)], valamint triptofán- (trp) promóterrendszer [Goedell és mtsai.: Nuc.

• ·

- 28 Acids Rés. 8y 4057 (1980) és EP-A-0 036 776]. Bár az említettek a legáltalánosabban használt promóterek, egyéb mikrobiális promótereket is izoláltak és használnak, és számos promóter nukleotidszekvenciáját publikálták, ami szakember számára lehetővé teszi, hogy a kiválasztott promótert funkcionálisan valamely plazmidvektorba ligáija [Siebenlist és mtsai.: Cell 20, 269 (1980)].

A prokarióta gazdaszervezeteken túl eukarióta mikrobákat is - például élesztőtenyészeteket - alkalmazhatunk. A Saccharomyces cerevisiae - vagy közismert nevén a sütőélesztő - a legáltalánosabban használt eukarióta mikroorganizmus, bár számos egyéb törzs is általánosan hozzáférhető. A Saccharomyces-íaj okban történő expresszióra általánosan használt például az YRp7-plazmid [Stinchcomb és mtsai.: Natúré 282, 39 (1979); Kingsman és mtsai.: Gene J_, 141 (1979); Tschemper és mtsai.: Gene 19, 157 (1980)]. Ez a plazmid tartalmazza a trpl-gént, amely szelekciós markerként működik olyan mutáns élesztőtörzsben, amely triptofán hiányában nem képes növekedni, ilyen például az ATCC No. 44076 számú törzs vagy a PEP4-l-törzs [Jones, Genetics 8_, 85 (1977)]. Mivel a gazdasejt genomjára jellemző, hogy a trpl-gén sérült, lehetőség nyílik arra, hogy a vektorral történő transzformációt a triptofán növekedés hiányában történő növekedés alapján azonosítsuk.

Élesztő vektorokban alkalmazható promóterszekvenciák többek között: a 3-foszfo-glicerát kináz vagy más glikolitikus enzimek promóterei, például az enoláz, a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, a hexokináz, a • · ·

- 29 piruvát dekarboxiláz, a foszfofruktokináz, a glükóz-6foszfát izomeráz, a 3-foszfo-glicerát mutáz, a piruvát kináz, a trióz-foszfát izomeráz, a foszfo-glükóz izomeráz, valamint a glükokináz promóterei [Hess és mtsai.: J. Adv. Enzyme Reg. J_, 149 (1968); Holland és mtsai.: Biochemistry 17, 4900 (1978)]. Alkalmas expressziós plazmidokat úgy állíthatunk elő, hogy a felsorolt gének terminációs szekvenciáit is az expressziós vektorba ligáljuk, az expresszáltatni kívánt szekvenciától 3’-irányban, ily módon biztosítva az mRNS poliadenilációját és terminációját. Alkalmazhatunk olyan promótereket is, melyek azzal a további előnnyel járnak, hogy a róluk induló transzkripciót növekedési feltételek szabályozzák, ilyenek például az alkohol dehidrogenáz-2, az izocitokróm-C, a savas foszfatáz, a nitrogén metabolizmusban szerepet játszó degradatív enzimek, valamint a fentiekben említett gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz enzim promóterei, mely enzim szerepet játszik a maltóz és a galaktóz hasznosításában. A találmány szerinti megoldás megvalósítására alkalmas bármely olyan plazmid vektor, amely tartalmaz egy élesztővel kompatíbilis promotert, replikációs origót és terminációs szekvenciát.

A mikroorganizmusokon túl többsejtű élőlényekből előállított sejttenyészeteket is használhatunk gazdaszervezetként. Általában bármely ilyen sejttenyészet alkalmas lehet, akár gerinces, akár gerinctelen élőlényből származik. Mindazáltal a mai napig legelterjedtebben a gerinces sejtekből előállított sejttenyészeteket alkalmazzák, és a gerinces sejtek tenyészetben (szövettenyészetben) történő

- 30 szaporítása jelenleg már szakember számára rutinfeladat [Kruse és Patterson, Tissue Culture, Academic Press (1973)]. Ilyen alkalmas gazdasejtek például a VERŐ-, a HeLa-, a kínai hörcsög petefészek (CHO), a W138-, a BHK-, a COS-7-, az MDCK-, a mielóma- és a gs-mielóma-sejtvonalak (hozzáférhetők a Celltech cégtől, Slough, Nagy-Brittania).

Az ilyen sejtekben használható expressziós vektorok (szükség esetén) tartalmazhatnak egy megfelelő replikációs origót, az expresszáltatni kívánt gén előtt egy promótert, riboszómakötő helyekkel együtt, RNS-érési hasítóhelyeket (splice-helyeket), poliadenilációs szignálokat és transzkripciós terminátor szekvenciákat.

Az emlős sejtekben alkalmazható expressziós vektorokon a szabályozó funkciókat gyakran virális eredetű szekvenciák biztosítják. Általánosan használt promóterek származnak például a humán citomegalovírusból (HCMV), a poliómavírusból, az adenovírus-2-ből, valamint - legelterjedtebben - a 40-es számú majomvírusból (SV40). Az SV40vírus korai és késői promóterei különösen alkalmasak, mivel ezeket könnyedén izolálni lehet a vírusból egy olyan DNSfragmensként, amely tartalmazza az SV40-eredetű virális replikációs origót is [Fiers és mtsai.: Natúré 273, 113 (1978)] . Továbbá, az is lehetséges - sőt gyakran kívánatos -, hogy az expresszáltatni kívánt génszekvenciával természetesen kapcsolt promóter vagy szabályozó szekvenciákat alkalmazzuk, feltéve, hogy az ilyen szabályozó szekvenciák kompatibilisek a gazdasejt rendszerrel.

- 31 A replikációs origót biztosíthatjuk oly módon, hogy olyan vektort állítunk elő, amely exogén replikációs origót tartalmaz - például az SV40-ből vagy egyéb vírusból származó replikációs origót (például polióma-vírusból, adenovírusból, VSV- vagy BPV-vírusból származó origót), de használhatjuk a gazdasejt kromoszómális replikációs mechanizmusát is. Amennyiben a vektor a gazdasejt kromoszómájába integrálódik, gyakran elégséges az utóbbit használni.

A kívánt DNS-szegmenseket tartalmazó vektorok (például a nehéz és könnyű láncokat kódoló szekvenciákat, valamint expressziós szabályozó szekvenciákat) bejuttathatok a gazdasejtekbe önmagukban ismert eljárások alkalmazásával, az alkalmazandó eljárások a gazdasejt milyenségétől függnek. Prokariota sejtek esetén például általánosan alkalmazzák a kalcium-kloridos transzfekciót, egyéb gazdasejtek esetén pedig alkalmazható például a kalcium-foszfátos kezelés, a lipofekció vagy az elektroporáció [Maniatis és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press (1990)].

A találmány szerinti ellenanyag konstrukciókat expresszáltatás után önmagukban ismert eljárások alkalmazásával tisztíthatjuk, ilyenek például az ammóniumszulfátos kicsapás, az affinitás-kromatográfia, az oszlopkromatográfia, valamint a gélelektroforézis [Scopes: Protein Purification, Springer Verlag, NY (1982)]. Az expreszszáltatott konstrukciók kötési affinitását a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával határozhatjuk • · ·

- 32 meg, ilyen eljárásokat részletesen bemutatunk a leírás részét képező példákban.

Gyógyászati célokra előnyösen lényegében tiszta CDR átültetett találmány szerinti ellenanyagokat vagy belőlük származtatott kötőfehérjéket alkalmazunk, melyek legalább 90-95 %-ban homogének, a találmány szerinti fehérjék legelőnyösebben 98-99 %-osan homogének. A kívánság szerint részlegesen vagy homogenitásig tisztított találmány szerinti CDR átültetett ellenanyagokat felhasználhatjuk diagnosztikailag vagy terápiásán (beleértve az extrakorporális terápiát is), vagy felhasználhatjuk azokat vizsgálati eljárások kifejlesztésére, immunfluoreszcens festésre és hasonló eljárásokban [Lefkovite és Pernis: Immulogical Methods,

I. és II. kötet, Academic Press, NY (1979 és 1981)].

A találmány szerinti CDR átültetett ellenanyagok és a azokból származtatható kötőfehérjék tipikusan a T-sejtek által közvetített rendellenességek kezelésére alkalmasak. Ilyen tipikus rendellenes állapotok - melyek kezelésére a találmány szerinti fehérjék alkalmasak - többek között az autoimmun megbetegedések, mint például az I-típusú diabétesz, a szklerózis multiplex, a reumás ízületi gyulladás, a szisztémás lupus erythematosus, a Chron-kór, valamint a myasthenia gravis.

A találmány szerinti T-sejteket felismerő ellenanyagok terápiás felhasználása azon alapul, hogy korreláció van bizonyos specifikus immunrendszeri rendellenességek és bizonyos T-sejt-antigén-receptor-V-régió-géntermékek preferenciális expressziója között, vagy bizonyos T-sejt• · · ···· ·· • · • ··· • · · · • « · ·

- 33 antigén-receptor-V-gének kiterjedt használata között. A Tsejtek antigén-receptorának V-régiója részben azért fontos, mert lehetővé teszi, hogy valamely egyén immunválaszát specifikus terápiás beavatkozással szabályozzuk, a T-sejtantigén-receptor felhasználásával. Közelebbről, bizonyos variábilis régió lókuszok expressziójáról illetve a géntermék jelenlétéről kimutatták, hogy korrelál bizonyos immunrendszeri rendellenességgel. Amennyiben meghatározzuk azt a V-régió-lókuszt, ami egy bizonyos immun-rendellenességgel asszociált, lehetőség nyílik az egyén kezelésére azáltal, hogy gátoljuk azon T-sejtek támadását, melyek azt a bizonyos V-régió-génterméket hordozzák.

A leírásban használt értelemben a kezelés kifejezés magában foglalja a megelőzést, a szuppressziót, valamint a betegség kezelését. A megelőzés azt jelenti, hogy a páciensnek védőhatású készítményt adunk be a betegség kialakulását megelőzően. így például az EAE állatkísérletes modellben, amennyiben egy védőhatású készítményt sikeresen beadunk az enkefalitogén beinjektálása előtt, amely a betegség kialakulását indukálja, a betegség kialakulását megelőzzük.

A szuppresszió azt jelenti, hogy valamely készítményt a betegség indukálódása után adunk be, de még azelőtt, hogy a betegség klinikai tünetei megjelennének. Az EAE-modell példájából kiindulva, amennyiben a védőhatású készítmény az enkefalitogén beinjektálása után adjuk be, de még azelőtt, hogy a neurológiai tünetek megjelennének, a betegséget szuppresszáljuk.

• · · · • · ·

- 34 A kezelés kifejezés szűkebb értelemben azt jelenti, hogy a védőhatású készítményt a betegség tüneteinek megjelenése után adjuk be. Az EAE-modell példáját alkalmazva, amennyiben a védőhatású készítményt az enkefalitogén beinjektálása és a klinikai tünetek megjelenése után adjuk be sikeresen, akkor a betegséget kezeljük.

Szakember számára rendelkezésre állnak azok az állatkísérletes modellrendszerek, melyek alkalmasak a találmány szerinti ellenanyagok és azokból származtatható kötőfehérjék hatékonyságának szkrínelésére. A szisztémás lupus erythematosus-t (SLE) szuszceptibilis egereken lehet tesztelni, Knight és mtsai., valamint Reinersten és mtsai. eljárásai szerint [J. Exp. Med. 147, 1653 (1978); és New Eng. J. Med. 299, 515 (1978) ] . A myasthenia gravis (MG) SJL/J-típusú nőstény egerekben tesztelhető, amely rendszerben a betegséget más fajból izolált oltható AChR-fehérjével indukáljuk, Lindstrom és mtsai. eljárásai szerint [Adv. Immunoi. 42, 233 (1988)]. Az ízületi gyulladás szuszceptibilis egértörzsben II. típusú kollagén injektálásával indukálhatjuk, Stuart és mtsai. eljárása szerint [Ann. Rév. Immunoi. 42, 233 (1984)]. Az adjuváns ízületi gyulladás szuszceptibilis patkányokban mikobakteriális hősokkfehérje injektálásával indukálhatjuk, Van Edén és mtsai. eljárása szerint [Natúré 331, 171 (1988)]. A thyroiditis-t egerekben indukálhatjuk thyroglobulin beadásával, Maron és mtsai. eljárása szerint [J. Exp. Med. 152, 1115 (1980)]. Az inzulinfüggő diabetes mellitus (IDDM) bizonyos egértörzsekben természetesen előfordul vagy indukál• · • ·♦* • · ·

- 35 ható is, ilyen egértörzseket például Kanasawa és mtsai. írtak le [Diabetologia 27, (1984)]. Egerekben és patkányokban az EAE az emberi MS modelljeként szolgál. Ebben a modellrendszerben a demielinizációt okozó betegség mielin bázikus fehérje beadásával indukálható, ahogy azt a következő közlemények feltárják: Paterson: Textbook of

Immunopathology, szerk.: Mischer és mtsai., Grune and

Stratton, New York, 179-213. old. (1986); McFarlin és mtsai.: Science, 179, 479 (1973); Satoh és mtsai.: J.

Immunoi. 138, 179 (1987)].

Találmány szerint CDR átültetett ellenanyagokat és a azokból származtatható kötőfehérjéket felhasználhatjuk egyéb ellanyagokkal kombinációban is, különösen olyan mAbokkal, melyek az adott betegségért felelős sejtek egyéb markereivel reagálnak. Ilyen alkalmas T-sejt-markerek lehetnek például az ún. Clusters os Differentation csoportba sorolt markerek, melyet az Első Nemzetközi Leukocita Differenciációs Munkaértekezleten határoztak meg [Bernhard és mtsai.: Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY (1984)].

A találmány szerinti CDR átültetett ellenanyagokat és kötőfehérjéket általában tisztított formában alkamazzuk, valamilyen gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt. Ilyen hordozók lehetnek például a vizes és alkohol/vizes oldatok, emulziók és szuszpenziók, beleértve a sóoldatokat és puffereit oldatokat is. Parenteráiisan alkalmazható hordozók például a nátrium-klorid-oldat, a Ringer-féle dextróz-oldat, a dextróz és nátrium-klorid-oldat, valamint a laktált Ringer-féle oldat. Alkalmas fiziológiásán elfogad- 36 • · » a · · • · • ··* • · · ···· ható adjuvánsok például - amennyiben ilyenekre szükség van a komplex szuszpenzióban tartásához - az olyan töltőanyagok, mint a karboximetil-cellulóz, a polivinil-pirolidon, a zselatin és az alginátok.

Intravénásán alkalmazható hordozók például a folyékony töltőanyagok, a táplálékkiegészítők, valamint az elektrolit-töltőanyagok, például a Ringer-féle dextrózoldat összetevői. A találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak tartósítószereket és egyéb adalékanyagokat is, például antimikrobiális szereket, antioxidánsokat, kelátorokat és inért gázokat [Mack: Remington’s Pharmaceuticals Sciences, 16. kiadás (1982)].

A találmány szerinti konstrukciókat alkalmazhatjuk önmagában beadott készítmények hatóanyagaként vagy egyéb hatóanyagokkal kombinációban. Ilyen hatóanyagok lehetnek például az immunterápiás hatóanyagok, mint például a cylcosporine, methotrexate, adriamycin vagy cisplatinum, és immunotoxin-ok. A találmány szerinti gyógyászati készítmények tartalmazhatnak különböző citotoxikus és egyéb hatóanyagokból előállított koktélokat, a találmány szerinti CDR-átültetett ellenanyagokkal vagy a azokból származtatható kötőfehérjékkel kombinációban. A találmány szerinti gyógyászati készítmények tartalmazhatják a találmány szerinti konstrukciókat más specifitásu CDR-átültetett ellenanyagokkal kombinációban is.

A találmány szerinti gyógyászati készítményeket a technika állása szerint ismert bármely módon beadhatjuk. Terápiás céllal - nem korlátozó módon beleértve az immunte- 37 rápiát is - a találmány szerinti CDR-átültetett ellenanyagokat és azokból származtatható kötőfehérjéket a pácienseknek önmagukban ismert eljárások alkalmazásával adhatjuk be. Bármely alkalmas módon beadhatjuk a találmány szerinti készítményeket, például parenterálisan, intravénásán, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, vagy szükség szerint katéter alkalmazásával végrehajtott közvetlen infúzióban. A találmány szerinti készítmények dózisa és az adagolás gyakorisága a páciens korától, nemétől és egészségi állapotától függ, valamin attól, hogy a páciens ugyanabban az időben kap-e egyéb gyógyszereket, vannak-e ellenjavallatok vagy egyéb klinikus számára fontos paraméterektől.

A találmány szerinti konstrukciókat tárolás céljából liofilizálhatjuk, és a liofilizált készítményt felhasználás előtt alkalmas hordozóban felvehetjük. Ez az eljárás a konvencionális immunglobulinok vonatkozásában közismerten hatásos, és a liofilizáláshoz, valamint az újraoldáshoz a technika állása szerint ismert eljárásokat alkalmazhatunk. Szakember számára kézenfekvő, hogy a liofilizálás és az újraoldás bizonyos mértékű ellenanyag-aktivitáscsökkenéshez vezethet (a hagyományos immunglobulinok esetén például az IgM-ellenanyagok nagyobb mértékben hajlamosak aktivitáscsökkenésre, mint az IgG-ellenanyagok), és a felhasználandó ellenanyagmennyiség meghatározásakor figyelembe kell venni a várható aktivitáscsökkenést.

A találmány szerinti CDR-átültetett ellenanyagokat vagy az ezekből készült koktélt beadhatjuk profilaktikusan és/vagy terápiás kezelés céljából. Bizonyos terápiás alkal···» ·· • • · · ·· ·· ··«·

4» ··· « · ♦ · » ··

- 38 mazások esetén a terápiásán hatékony dózist úgy definiáljuk, hogy az az az ellenanyag mennyiség, amely legalább részlegesen képes gátolni, szuppresszálni, modulálni, elpusztítani, vagy más mérhető módon befolyásolni a kiválasztott sejtek egy populációját. A terápiásán hatékony dózis nagysága a betegség előrehaladottságától és a páciens saját immunrendszerének általános állapotától függ, de a hatékony dózis általában a találmány szerinti CDR-átültetett ellenanyagok és azokból származtatható kötőfehérjék esetén testsúly kilogrammonként 0,005 és 5,0 mg közötti, leggyakrabban azonban 0,05 és 2,0 mg/kg közötti dózist alkalmazunk. Profilaktikus alkalmazás esetén a találmány szerinti konstrukciókat vagy azokból készült koktélokat tartalmazó készítmények hasonló vagy valamivel kisebb dózisban alkalmazhatók.

A találmány szerinti konstrukciókat tartalmazó készítmények profilaktikusan és terápiásán is alkalmazhatók, egy kiválasztott T-sejt-célpopuláció megváltoztatására, inaktiválására, elpusztítására, vagy eltávolítására valamely emlősben.

A találmány szerinti megoldás egy más megvalósítási módja szerint a találmány szerinti konstrukciók alkalmazhatók extrakorporálisan vagy in vitro egy heterogén sejtcsoporthoz tartozó célsejtpopuláció szelektív elpusztítására, legyengítésére vagy hatékony eltávolítására. Az emlős vérét extrakorporálisan elegyíthetjük a találmány szerinti CDRátültetett ellenanyagokkal vagy azokból származtatható kötőfehérjékkel, és ily módon a nem kívánatos sejteket el• · · · • · • · • ··· · . 1 . ····· ·. ·· ·· ·· ···· · ··

- 39 pusztíthatjuk vagy egyéb módon eltávolíthatjuk a vérből, majd az ily módon kezelt vért önmagában ismert eljárás alkalmazásával visszajuttathatjuk az emlősbe.

A találmány szerinti konstrukciókat terápiás célokon kívül más célokra is használhatjuk. A találmány szerinti megoldás egy megvalósítási módja szerint a találmány szerinti ellenanyagokat vagy kötőfehérjéket felhasználhatjuk kutatási célokra is. A találmány szerinti T-sejtreceptorkötő fehérjék és ellenanyagok alkalmasak a T-sejtreceptor strukturális és funkcionális tanulmányozására. Amellett, hogy a találmány szerinti fehérjék bizonyos formájú T-sejt-receptorok szubsztrátjaiként vagy kötődoménjeiként használhatók, a találmány szerinti ellenanyagkonstrukciókat eszközül használhatjuk a T-sejt-receptor különböző részletei natív konfigurációjának tanulmányozását célzó konformációs tanulmányokban. A találmány egy más megvalósítási módja szerint a találmány szerinti T-sejt-kötő ellenanyagokat és a azokból származtatható kötőfehérjéket diagnosztikai reagensként is alkalmazhatjuk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti konstrukciókat felhasználhatjuk egy bizonyos T-sejt-Vrégió-alcsalád mennyiségének meghatározására vagy jelenlétének kimutatására valamely biológiai mintában. Egy ilyen vizsgálati eljárás leírását megtalálhatjuk Rittershaus szabadalmi bejelentésében, melyet WO92/08981 számon 1992. május 26-án tettek közzé, Therapeutic and Diagnostic Methods Using Totál Leukocyte Surface Antigens címmel. A találmány tárgyát képezik tehát eljárások immunrendszerrel kapcsola• · · ·· ·· ···

- 40 tos megbetegedések - például MS - diagnosztizálására, melyeljárások azon alapulnak, hogy valamely biológiai mintában kimutatjuk egy specifikus T-sejt-antigénreceptor-alcsoport jelenlétét. A találmány szerinti CDR-átültetett ellenanyagokat és az azokból származtatott kötőfehérjéket a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával jelölhetjük. A találmány szerinti konstrukciók alkalmasak egyéb in vitro felhasználásra is. Alkalmasak például perifériális vérsejtek szelektív kezelésére, olyan esetben amikor csak bizonyos cél-T-limfociták eltávolítására van szükség, vagy fel lehet használni a találmány szerinti konstrukciókat nem kívánatos T-limfociták sejttenyészetből történő eltávolítására is.

Az alábbiakban bemutatott példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk részletesebben szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

1. példa

TM27-ellenanyagok előállítása - az ellenanyagok előállításának vázlata

1. BALB/c-egereket immunizáltunk a HPB-All-elnevezésű Tsejtes leukémia-sejtvonallal (egyszer intraperitoneálisan, kétszer pedig intravénásán).

2. Az immunizált egerekből lépsejteket izoláltunk, és ezeket fuzionáltattuk a P3X53AG8.653-jélű egéreredetű halhatatlanná tevő mielóma sejtvonallal.

3. A megfelelő kiónokat HAT-tápközegben szelektáltuk.

• ·

- 41 4. A szelektált kiónokat megfelelő kötőképességre szkríneltük, radioaktívan jelzett HPB-ALL-sejtekkel végrehajtott immunprecipitáció útján.

5. Határhigításos módszerrel szubklónozást végeztünk.

6. A specifitást PBL-stimulálással és CD3-modulációs vizsgálatokkal teszteltük.

7. A megfelelő ellenanyagot szekretáló hibridómát 4Hll-nek neveztük el.

8. A 4Hll-klónból RNS-t nyertünk ki, és abból mRNS-t izoláltunk. Az mRNS-ről cDNS-kópiát készítettünk.

9. Az előállított cDNS-t megszekvenáltuk és a szekvenciát ellenőriztük.

10. Az izolált cDNS-eket (H és K) M13-vektorokba klónoztuk.

11. A 2. példa szerint mutagenezis útján kiválasztott humán vázrégiókat juttattunk be a cDNS-be.

12. Előzetes értékelés céljából humanizált ellenanyagokat (ellenanyagonként körülbelül 1 mg-ot) tisztítottunk NSUtranszfektánsokból.

Öt különböző TM27-ellenanyagot állítottunk elő: TM27L: a nehéz lánc 48. pozíciójában leucint tartalmaz. TM27I: a nehéz lánc 48. pozíciójában izoleucint tartalmaz.

TM27.1: FS —» VF (78-79) cserét tartalmaz.

TM27.2: VTML/T LSIS/N (67-70/73) cserét tartalmaz.

TM27.3: V —> R (92) cserét tartalmaz.

A kísérletek részletes ismertetése

Összefoglalás

A továbbiakban ismertetett kísérletek célja az volt, hogy humanizáljunk egy egéreredetű anti-humán-TCR (T• · · · • ·

- 42 sejt-receptor) νβ-5.2/5.3 monoklonális ellenanyagot (TM23) valamint hogy előállítsunk egy humanizált ellenanyagot expresszáló sejtvonalat, amely alkalmas az eljárások továbbfejlesztésére. A humanizált anti-TCR-VB-5.2/5.3 monoklonális ellenanyag jelzése TM27.

Az egéreredetű ellenanyag előállítása

A 4Hll-jelű hibridómát úgy állítottuk elő, hogy a P3X63AG8.653-jelű egérmielóma-sejtvonalat fuzionálhattuk a HPB-ALL-jelű T-sejtes leukémia sejtvonallal immunizált Balb/c-egerekből izolált lépsejtekkel. Ez a hibridóma a TM23-jelű monoklonális ellenanyagot expresszálja, amely specifikusan kötődik a VB-5.2- és -5.3-jelű humán T-sejtreceptorokhoz (TCR).

Az ellenanyag izotípusa: IgG2a/K.

Az ellenanyag humanizálása

A TM23-ellenanyag nehéz és könnyű láncait kódoló cDNS-eket egy 4Hll-cDNS-könyvtárból izoláltuk, melyet egérIgG2a- és κ-specifikus 3'-végi láncindítók alkalmazásával állítottunk elő. Az izolált cDNS-klónok pontos szekvenciáját DNS-szekvenálással, valamint belső aminosav-szekvenálással igazoltuk. A könnyű és nehéz láncok CDR-jeit (komplementaritást meghatározó régióit) konzervált egéreredetű vázszekvenciákkal történő összehasonlítás útján azonosítottuk. Az L-, V-, (D)-, és J-jelű (L: leader ; V:

variable; D: diversity ; J: joining) DNS-fragmenseket PCR-eljárással izoláltuk, majd a pTCSaDHFR- és PTCSLCglNeoAp-jelű CHO-sejtekben működő expressziós vektorokba klónoztuk őket, mely vektorok sorrendben humán κ és • · • · · · * • · · · · · .· ·· ···· ·

- 43 IgGl konstans régió cDNS-t hordoztak, és egér-V/humán-C szerkezetű kiméra ellenanyagok expresszáltatására alkalmasak .

A cDNS-klónok szekvenciái alapján kikövetkeztetett aminosavsorrendek vizsgálata alapján kitűnt, hogy a TM23ellenanyag nehéz lánca az ΙΒ-jelű Kabat-alcsoportba tartozik. A V_K szekvencia az 5. Kabat-V_K-csoportba tartozik.

Ezért a nehéz és könnyű láncok humanizálásához sorrendben a humán NEWM- és REI-vázrégiókat használtuk. Az átrendezett V(D)J-fragmenseket (bizonyos 5'-végi V- és 3'-végi Jszekvenciák kivételével) olyan M13-vektorokba klónoztuk, melyek a genomi konfigurációnak megfelelő módon tartalmazták a vezető (leader) és intron-szekvenciákat, és ily módon alkalmasak voltak a teljes genomi L-V(D)J-konstrukciók kialakítására.

Az ellenanyagok expresszálása mielóma-sejtekben

Miután mutagenezissel előállítottuk a CDRátültetett V(D)J-régiókat, a DNS-fragmenseket mielómasej tekben működőképes expressziós vektorokba klónoztuk, melyek vagy a humán kappa vagy a humán IgGl konstans régiót tartalmazták. Előállítottunk öt különböző humanizált nehéz láncot, melyek különböző mutációkat hordoztak. Mind az öt nehézlánc-konstrukciót kotranszfektáltuk a humanizált könynyű lánccal NSO-mielóma-sejtvonalba. Kiértékelés céljából humanizált ellenanyagokat tisztítottunk az expandált humán IgGl/K-pozitív transzfektánsok tenyészetének felülúszóiból. Az eredmények azt mutatták, hogy a TM27L-jelű ellenanyag, amelyben a legrövidebb egéreredetű aminosavszekvencia ta• · ·· • · • ·

- 44 lálható, ugyanolyan jól festette a λ/β-5.3-T-sej teket, mint a többi humanizált ellenanyag, ha nem jobban. Ezért a TM37L-jelű ellenanyagot választottuk ki továbbfejlesztés céljára és a TM27-jelzést adtuk neki.

Az ellenanyagok expresszáltatása CHO-sejtekben

A TM27 nehéz és könnyű láncainak vezető is Vrégióit PCR-eljárás alkalmazásával izoláltuk a mielómakonstrukciókból, hogy átklónozzuk azokat cDNSkonfigurációban a CHO-sejtekben működőképes pTCSLCglNeoAp (nehéz) és pTCSLC_KDHFR (könnyű) expressziós vektorokba, a fent leírtak szerint. A transzfektáns CHO-sejteket szelektáltuk, és a humán IgGl/_K pozitív sejteket megklónoztuk. Az egyik legjobban termelő kiónt, a TM27L-662-35-jelűt, sejtbank-eljárással expandáltuk, kis léptékű humanizált ellenanyag-előállítás céljára. A CHO-sejtek által expreszszált TM27-ellenanyagot az egész előállítási eljárás során folytonosan jellemeztük, és annak aktivitása összehasonlíthatónak bizonyult a mielóma sejtvonalakban előállított TM27-ellenanyagokéval, valamint a szülői TM23ellenanyagéval. Az ismertetett kísérletekkel egyidejűleg a CHO-sejtklónokat amplifikáltuk, és tovább klónoztuk, az ellenanyag expresszió fokozása céljából, valamint annak igazolására, hogy a sejtvonal alkalmas a termelékenység fokozására .

A kísérletek részletek ismertetése

A BALB/c-egerek immunizálása HPB-ALL-sejtekkel

A HPB-ALL-jelű T-sejtes leukémia sejtek (3xl0⁷) βFl-ellenanyaggal (egy β-lánc-T-sejt-receptor-konstansrégió- 45 antihumán monoklonális ellenanyag) képzett immunprecipitátumot - melyet dr. Michael Brennertől (Harvard Medical School) szereztünk be - összekevertünk komplett Freund-adjuvánssal, és az elegyet intraperitoneálisan (i.p.) egy BALB/c-egérbe injektáltuk. Öt héttel később az egereket ismételten immunizáltuk sóoldatban felvett 3xl0⁷sejttel, három egymást követő napon, először i.p., majd kétszer intravénásán (i.v.).

Lépsejtek fuzionáltatása P3X63AG8.653-sejtekkel

A fúziót a technika állása szerint ismert eljárással hajtottuk végre, három nappal az utolsó megerősítő i.v. immunizálás után. A lépsejteket ötszörös feleslegben fuzionáltattuk P3X63Ag8.653-sejtekkel (egérmielóma, Ig-t nem szekretáló sejtvonal, BALB/c-egerekből izolálva, ATCC CRL 1580), 50 % polietilén-glikol-1500 alkalmazásával (BDH,

Dorset, Anglia).

A fuzionált sejtek szelektálása HAT-tápközegben

A fuzionált sejteket 96 mélyületű tálcákra szélesztettük mélyületenként 2xl0⁵ BALB/c timocitával együtt, melyek tápláló sejtekül szolgáltak, majd a szelekciót 15 % FBS-t (fetal bovine serum, azaz magzati borjúsavó) tartalmazó RPMI-1640-tápközegben hajtottuk végre, valamint HAT-tápközegben (6 mmól/1 hipoxantin, 50 mmól/1 aminopterin, 2 mmól/1 timidin). 5 % CO₂-t tartalmazó megnedvesített levegőn inkubáltuk, 37 °C-on.

Hibridoma-szkrínélés

13-14 nap elteltével szkríneltük azokat a mélyületeket, melyekben növekedést tapasztaltunk, mind ELISA• ·

- 46 125 eljárással, mind pedig ímmunprecipitacióval, melyet Iizotóppal radioaktívan jelölt HPB-ALL-sejtek alkalmazásával hajtottunk végre. Az alkalmazott immunprecipitációs körülmények között a TCR a- és β-láncairól a CD3-molekulák ledisszociáltak. A HPB-ALL-sejtekkel reagáló hibridómákat Τ-75-lombikokba expandáltuk, további klónozás céljából.

A kiválasztott hibridómák klónozása

A HPB-ALL-TCAR-specifikus (T-sejt-antigén-receptorra specifikus) hibridómákat határhígitásos módszerrel klónoztuk. A sejteket 96 mélyületű tenyésztőtálcákra széleztettük felezősorozat hígítással, a sejtsűrűség 2 és 0,015 sejt/mélyület között változott. Az ismertetett eljárást a legjobban növő és legnagyobb termelőképességű klón kiválasztása után kétszer megismételtük. A két további szelekciós lépés után kiválasztottunk egy kiónt, melyet 4H11jelzéssel láttunk el. A 4Hll-klón által expresszált mag képes volt kicsapni a β-Fl-mAb által kicsapott TCR-a- és -βláncokkal azonos molekulákat, a β-Fl-mAb a TCR-E-lánc konstans régiójával reagál. A kísérleti eredmények arra utaltak, hogy a 4Hll-klón által expresszált mAb a HPB-ALL-Tsejtek által expresszált TCR-B-láncra specifikus. Az ellenanyagot az egyszerűség kedvéért TM23-jelzéssel láttuk el.

A 4Hll-hibridómából izolált TM23-jelű monoklonális ellenanyag jellemzése

A TM23-mAb izotípusának meghatározását kereskedelmi forgalomban beszerezhető reagenskészlet alkalmazásával végeztük (Zymed, South San Francisco, CA). Az eredmények arra utaltak, hogy a TM23-mAb egér-IgG2a/K-izotípusú.

- 47 A TM23-mAb anti-TCR reaktivitását úgy igazoltuk, hogy vizsgáltuk az ellenanyag képességét a HPB-ALL-sejtek felszínéről származó CD3-molekulák komodulálására. Előzetes kísérletek arra utaltak, hogy a TCR a- vagy β-láncával reagálni képes mAb-ok képesek komodulálni a sejtfelszínről származó CD3-molekulákat, amennyiben a sejteket előinkubáljuk az anti-TCR-mAb-okkal. Timikor HPB-ALL-se j teket előinkubáltunk TM23-ellenanyaggal, a Leu-4-jelű anti-CD3mAb reaktivitásának jelentős csökkenését figyeltük meg, a Leu-4 kezeletlen sejtekkel szemben kifejtett reaktivitásához viszonyítva.

Megvizsgáltuk a TM23-ellenanyag reaktivitását normális humán PBL-ek (peripheral blood lymphocyte, azaz perifériás vérből izolált limfociták) vonatkozásában. A vizsgált PBL-T-sejtek 1,6-3,0 %-a reagált a TM23-ellenanyaggal. Ez az eredmény megegyezik az egyéb olyan mAb-ok vizsgálatakor kapott eredménnyel, melyekről kimutatták, hogy bizonyos V-régió-determinánsokkal reagálnak.

Meg kívántuk határozni, hogy a TM23-ellenanyag ugyanahhoz az epitóphoz kötődik-e, mint az 1C1, amely egy humán VB-5.2- és -5.3-alcsaládokkal reagáló mAb [ Boylston és mtsai.: J. Immunoi. 137, (1986)] , és ezért megvizsgáltuk, hogy az egyik ellenanyag képes-e gátolni a másik kötődését. Amennyiben a HPB-ALL-sejteket először TM23-ellenanyaggal inkubáltuk, a fluoreszceinnel konjugált 1C1kötődése gátlódott. Amennyiben a sejteket először 1C1ellenanyaggal inkubáltuk, a TM23-ellenanyag kötődése szintén gátlódott. Ez az eredmény arra utal, hogy a TM23 és az

- 48 1C1 ugyanahhoz az epitóphoz, vagy egymáshoz nagyon közeli epitópokhoz kötődik.

További bizonyítékokat kívántunk szerezni arra vonatkozóan, hogy a TM23- és lCl-ellenanyagok hasonló reaktivitásúak, ezért mindkét ellenanyaggal történő stimulációval előállítottunk PBL-sejtvonalakat. Mindkét sejtvonal reaktivitását azután mindkét mAb-bal megvizsgáltuk. Amennyiben a TM23-mal történő stimuláció útján előállított PBL-sejtvonal reaktivitását vizsgáltuk, mind az 1C1- mind pedig az 4H11ellenanyag hasonló százalékban reagált a sejtekkel. Hasonló eredményeket kaptunk az lCl-ellenanyaggal stimulált PBLse j tvonal esetén is.

A 4Hll-klón növesztése sejttenyészetben

A TM23.1-7-31-91-jélű 4Hll-klónt felszaporítottuk és expandáltuk DMEM/F12-tápközegben (1:1), amely 1 % magzati borjúsavót, 100 pg/ml penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint, valamint 12,5 ml/1 glutamint tartalmazott.

A TM23 könnyű és nehéz láncait kódoló cDNS előállítása

Körülbelül 10 4Hll-sejtet izoláltunk centrifugálással·, majd a sejteket egyszer mostuk jéghideg PBS-sel. Ezután össz-RNS-t izoláltunk a Promega cég által forgalmazott RNAgents Totál RNS-izoláló reagenskészlet alkalmazásával (Promega Katalógusszám: Z5110) . A poli (A)⁺-RNS-t a Promega által forgalmazott PolyATract mRNS-izoláló reagenskészlet alkalmazásával izoláltuk (Promega Katalógusszám: Z5200). Az egéreredetű IgG2a- és κ-specifikus cDNS-könyvtárat a BRL által forgalmazott SuperScript reagenskészlet alkalmazá- 49 savai készítettük. (BRL Katalógusszám: 82Y8SA), az alábbi szekvenciájú IgG2a-láncindító:

5’-ATATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTA GT-3’, valamint az alábbi szekvenciájú κ-láncindító alkalmazásával :

5’-ATATGCGGCCGCTTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT-3'.

A két láncindító tartalmaz egy-egy Xhol restrikciós hasítóhelyet, és szekvenciájuk komplementer sorrendben az egér-IgG2a- és egér-K-kódolórégió 3'-végeivel. Az előállított cDNS-t a pSPORT-plazmidba klónoztuk, amely a fenti reagenskészlet tartozéka volt, majd a rekombináns plazmidokkal Escherichia coli DH5a kompetens sejteket transzformáltunk elektroporáció útján. A megfelelő méretű inszertet tartalmazó plazmid-klónokat szekvenálás céljára kiválasztottuk.

A TM23-ellenanyag nehéz és könnyű láncait kódoló cDNSklónok azonosítása

A megfelelő méretű inszertet tartalmazó miniprep-eljárással előállított plazmid-DNS-eket (könnyű lánc kiónok sorszámai: 1, 6, 19, 20, 25 és 26; nehéz lánc kiónok sorszámai: 4, 9, 11, 15, 22 és 34) egy szekvenáló reagenskészlet (USB Katalógusszám: 70770) kettősszálú formában megszekvenáltuk, a reagenskészlet a DNS-inszertektől 5'-irányban hibridizálódó T7-láncindítót tartalmazott. A könnyű lánc kiónok közül a 6, 20 és 25 számú, valamint a nehéz lánc kiónok közül a 34 számú szekvenciája bizonyult egéreredetű Ig-szekvenciának. A 6, 20 és 25 számú könnyű lánc kiónok azonos szekvenciájú inszertet tartalmaztak, és

• ·· · ···· ·· • · · · · • · · · • ··

- 50 a 6 számú kiónban egy pontmutáció volt található, és ez a klón működésképtelen volt. A 20 és 34 számú kiónokat megszekvenáltuk az alábbi szekvenciájú K-konstansrégió-specifikus:

5'-GACATTGATGTCTTTGGGGTAGAAGTTGTT-3', valamint IgG2akonstansrégió-specifikus láncindítók alkalmazásával:

5'-GGTCACTGGCTCAGGGAAATAACCCTTGAC-3'.

Az eredmények ismét arra utaltak, hogy a 6 számú klón egy működésképtelen volt, a 20 és 34 kiónok viszont sorrendben a megfelelő könnyű és nehéz lánc kiónok voltak. A két klón alapján meghatározott cDNS- és aminosavszekvenciákat az 1. ábrán mutatjuk be.

Az N-terminális blokkoltság miatt a mikroaminosavszekvenálást CNBr-nal hasított peptidfragmenseket hajtottuk végre, melyeket poliakrilamid-gélekből izoláltunk. Az ily módon meghatározott belső V-régió aminosavsorrend megegyezett a cDNS-szekvenciákból következtetett aminosavsorrenddel. A kapott eredmények igazolták, hogy az izolált cDNS-klónok valóban a TM23-ellenanyag nehéz és könnyű láncait kódolták.

A nehéz és könnyű láncok CDR-régióit Kábát- és Wueljárása szerint (lásd fent) azonosítottuk, és azokat az 1. ábrán kiemeléssel és aláhúzással jelöltük.

- 51 A Η- és L-láncok V-régióját kódoló DNS izolálása PCReljárással, DNS-szekvenálás

Kiinéra TM23-ellenanyag előállítása

Az egéreredetű VH- és VK-DNS-ek izolálása

A TM23-ellenanyag nehéz és könnyű lánc variábilis régióit kódoló DNS-t alkalmassá tettük expressziós vektorban történő inszertálásra. Az egéreredetű TM23-VH-régiót kódoló DNS-szekvenciát PCR-eljárással amplifikáltuk

TM23MuVH.Mu.IgG2 a-DNS-bői kiindulva az alábbi szekvencájú oligonukleotid láncindítók alkalmazásával: VH1BACK (5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'), amely Pstl restrikciós hasítóhelyet tartalmaz, valamint VH1F0R

5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' amely BstEII-hasítóhelyet tartalmaz. A megadott első szekvenciában az M C vagy A bázist jelöl, az S C vagy G bázist, az R A vagy G bázist, a W pedig A vagy T bázist jelöl. Az említett restrikciós hasítóhelyeket tehát bejuttattuk a TM23-VH-DNS sorrendben 5'- és 3’-végeire. Az amplifikált DNS-terméket Pstl- és BstEII-enzimekkel elhasítottuk, majd a hasított fragmenst beligáltuk az azonos enzimekkel hasított M13-VHPCRl-vektor kettősszálú replikatív formájú (RF)

DNS-ébe.

Az M13-VHPCR1 egy Ml3-fágból származó vektor, melyet az M13-HuVHNP-fágból állítottak elő [Jones és mtsai.: Natúré 321, 522 (1986)] és tartalmaz egy immunglobulin promotert, szignálszekvenciát és megfelelő RNS-érési (splice) helyeket [Orlandi és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833 (1989)].

«· ····

- 52 A ligáit DNS-t kompetens Escherichia coli TG1sejtekbe (K12, Á(lac-pro), supE, thi, hsd D5 [F' tra D36, pro^A+Bt, lacO^q, lacZ M15] ) transzformáltuk. Az így előállított rekombináns fág-plakkokból egyszálú DNS-t izoláltunk. Az egéreredetű TM23-VK-régiót kódoló DNS-szekvenciát TM23MuVK.MuCK-DNS-ből kiindulva PCR-eljárással amplifikáltuk, az alábbi szekvenciájú láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: VK1BACK ' -GACATCCAGCTGACCCAGTCTCCA-3 ' , amely tartalmaz egy PvuII-hasítóhelyet, valamint VK1F0R 5’-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3' , amely egy BglII-hasítóhelyet tartalmaz. Az amplifikálás során alkalmaztunk két átfedő belső láncindítót is, melyeket úgy terveztünk, hogy a CDR3-ból eltávolítsák a HindlIIhasítóhelyet, melyek szekvenciája a következő volt: oligo 943

5' -CCGAGGAAGTTTACTATACTG-3 ' , valamint oligo 944

5'-CAGTATAGTAAACTTCCTCGG-3’ [Horton és mtsai.: (1990), lás fent]. Ily módon a TM23-VKDNS 5'- és 3'-végeire beiktattunk egy PvuII- és egy BglIIhasítóhelyet. Az amplifikált DNS-terméket megemésztettük PvuII- és BglII-enzimekkel, majd beligáltuk az előzetesen

PvuII- és BclI-enzimekkel hasított M13-VKPCRl-vektorba. A

BglII- és BclI-enzimek úgy hasítják el a DNS-t, hogy egymással kompatíbilis ragadós végek keletkeznek, melyek ősszelágálhatok.

.........

—·.· .· .· :··.

- 53 Az M13-VK-PCRl-vektor ugyanazt a promotert, szignálszekvenciát és RNS-érési helyeket tartalmazza, mint az M13-VHCPRl-vektor [Orlandi és mtsai.: (1989) lásd fent].

A ligáit DNS-t Escherichía coli TGl-sejtekbe transzformáltuk, majd a kapott rekombináns fágplakkokból egyszálú DNS-t izoláltunk.

Ezután PCR-eljárással sikerült előállítanunk a megfelelő méretű termékeket, a VH-régió esetében 359 bázispárhosszú PCR-terméket, a VK-régió esetében pedig 288 bázispáros terméket kaptunk. A VH-DNS-t az M13-VHPCR1vektorba inszertáltuk, előállítva ily módon az M13TM23MuVH-vektort. A VK-DNS-t az M13VKPCRl-vektorba inszertáltuk, előállítva ily módon az M13-TM23MuVK-vektort. A DNS-szekvencia igazolása

Igazoltuk, hogy a helyes DNS-szekvenciákat klónoztuk meg, és hogy a szekvenciában a PCR-eljárás során mutációs hiba nem keletkezett. Egyszálú M13-fág-DNS-en meghatároztuk a promotert, szignálszekvenciát, RNS-érési helyeket, valamint 5'- és 3'-végi nem transzlálódó szekvenciákat is magába foglaló teljes 823 bázispáros VH-régió szekvenciáját, a didezoxi-láncterminációs eljárás alkalmazásával [Sanger és mtsai.: (1977) lásd fent], a szekvenáláshoz

T7-DNS-polimeráz vagy Seguenase-enzimet használtunk.

Meghatároztuk a szignálszekvenciát, RNS-érési helyeket és 5'- valamint 3’-végi nem-transzlálódó szekvenciákat is magába foglaló teljes, 630 bázispáros VK-régió szekvenciáját is, egyszálú M13-fág-DNS-en, a didezoxi-eljárás alkalmazásával, mint fent.

• · · ····

- 54 Azonosítottuk az expressziós vektorba történő inszercióhoz adaptált kívánt szekvenciájú TM23-VH-DNS-t tartalmazó DNS-klónokat. Ezek közül az egyiket, a 2-es számút kiválasztottuk további analízis céljára. A restrikciós hasítóhelyek bejuttatása - melyekre a VH-régió expressziós vektorba történő inszertálása céljából volt szükség - azt eredményezte, hogy a szekvencia N-terminális végén egy aminosav megváltozott, az 5. pozícióban levő lizin (K) glutaminra változott (G) , és történt egy változás a szekvencia C-terminális végén is, a 108. pozícióban levő szerin (S) treoninra (T) változott.

Azonosítottuk azokat a DNS-klónokat, melyek az expressziós vektorba történő inszertáláshoz adaptált, kívánt szekvenciájú TM23-VK-DNS-t tartalmazták. Ezek közül a 4-es számút választottuk ki további analízis céljára. A CDR3-régió aminosavsorrendje a HindlII-hasítóhely eltávolítása során nem változott meg, de az inszercióhoz szükséges hasítóhelyek bejuttatása azt eredményezte, hogy a szekvencia N-terminális részén három aminosav megváltozott, a 4. pozícióban található metionin (M) leucinra (L) változott, a 7. pozícióban található treonin (T) szerinre (S) módosult, a 8. pozícióban található treonin (T) pedig prolinra változott (Ρ), és a szekvencia C-terminális részén is bekövetkezett egy változás, a 105. pozícióban található valin (V) glutaminra (E) módosult, az alkalmazott láncindító oligonukleotidok szekvenciájából következően.

- 55 A V-régió-DNS-fragmense klónozása Ml3-vektorba

A megklónozott egéreredetű variábilis régiót átvittük olyan expressziós vektorokba, melyek tartalmazták a humán konstans régió géneket, az ellenanyagok emlőssejtekben történő expresszálásának céljából.

Az IgG-izotípus kiválasztása humanizálás céljából

A TM27-ellenanyagból az IgGl-izotípust választottuk ki, a következő okok miatt:

1. Az IgGl-ellenanyag képes mind ADCC-(antibody dependent cell cytotoxicity, azaz ellenanyagfüggő sejtcitotoxicitás), mind pedig CDC-immunválaszt (complement dependent cytotoxicity, azaz komplementfüggő citotoxicitás) kiváltani. Éppen ezért ez az izotípus nagyobb hatékonyságú lehet a νβ-5.2/5.3-T-sejtek gátlásában.

2. Ellenanyag humanizálásra gyakrabban használják az IgGlizotípust .

A humán vázrégió kiválasztása CDR-átültetéshez

Humanizált TM23-ellenanyag előállítása

A humanizált TM23-variábilis régió szekvenciák tervezése

Kiválasztottuk azokat a humán vázrégió szekvenciarészleteket, amelyek alkalmasak voltak a TM23-CDR-ek befogadásra, és meghatároztuk azokat az esszenciális egéreredetű aminosavakat, melyeket a humán vázrégióba be kell helyettesíteni. A TM23-ellenanyag VH- és VK-régióinak aminosavsorrendjeit számítógép segítségével összehasonlítottuk mind ismert egéreredetű ellenanyagok, mind pedig humán ellenanyagok VH- és VK-szekvenciáival.

• · · ·

- 56 Az AALIGN elnevezésű programot (DNASTAR Ltd., London W13 9BL, Nagy Britannia) egy Compaq 386 processzoron futtattuk. Az AALIGN-program két protein-szekvenciát képes összehasonlítani a Lipman-Pearson- és a NeedlemanWunsch-eljárások alkalmazásával. A program először a Lipman-Pearson-eljárás alkalmazásával meghatározza a leginkább homológ régiókat. Ezt követően a Needleman-Wunscheljárás szerint a lehető legnagyobb homológiát figyelembe véve egymás alá rendezi a két összehasonlítandó szekvenciát .

Az egymás alá rendezett szekvenciákat ezután megvizsgáltuk, különös figyelmet szentelve az olyan faktoroknak, mint a CDR-ek hosszúsága, valamint a CDR-ek konformációjának rögzítésében kritikus szerepet játszó aminosavak azonosítása, ilyenek például a 71. és a 94. pozícióban található aminosavak, melyek a CDR-ek közelében vannak [Tramontano és mtsai.: (1990); Foot és Winter (1992), lásd fent].

A Kabat-féle alcsoportok konszenzus szekvenciáival történő összehasonlítás útján az egéreredetű TM23-VH-régiót a VK-V. Kabat-alcsoportba soroltuk. A TM23-vázrégiókban nincsenek olyan aminosavszekvenciák, melyek ezekben az alcsoportokban szokatlanok lennének.

A VH- és VK-régiók számára a vázrégiókat sorrendben az NEWM- és REI-jelzésű humán ellenanyagokból izoláltuk. A VH-régió kialakításához a CDR-eken kívül a 27-30. és a 71. egéreredetű aminosavakat használtuk fel. Ezek a vázrégióhoz tartozó aminosavak feltételezhetően fontosak a CDR-ek kon- 57 • · a · a

·. :”· · · *··

·.. ......

formációjának stabilizálásában [Foot és Winter (1992), lásd fent]. A 71. aminosav feltehetően rögzíti a CDR1 és CDR2 egymáshoz viszonyított elhelyezkedését, annak megfelelően, hogy az itt található aminosav oldallánc nagyméretű (lizin vagy arginin), vagy kisméretű [valin vagy alanin;

Tramontano és mtsai.: (1990), lásd fent]. Az elmondottak értelmében a 71. pozícióban az NEWM-VH-régióban található valint a TM23-VH-régióban található lizinre cseréltük. A

27-30. aminosavak az antigénkötő huroknak inkább a strukturális, mind a hipervariábilis részéhez tartoznak, ahogy azt Chothia és Lesk meghatározta [(1987), lásd fent]. A 47-49.

vázaminosavak szintén fontosak lehetnek az ellenanyagszerkezet stabilizálása szempontjából [Foot és Winter (1992), lásd fent]. Ezért két különböző humanizált nehézláncot állítottunk elő: az egyik a 48. pozícióban izoleucin (I) aminosavat tartalmazott, mint az NEWM; a másik pedig a 48. pozícióban leucint (L) tartalmazott úgy, hogy az egéreredetű VH-régió 47-49. aminosavai megőrződtek. Az egér VHszekvencia összehasonlítását a humanizált változattal a 2.

példában mutatjuk be.

A TM23-VK-régió humanizálására kiválaszott REIvázrégióban semmilyen változtatást nem hajtottunk végre. Az egér VK-szekvencia és a humanizált változat összehasonlítását szintén a 2. példában mutatjuk be.

A pTCSNeo emlős expressziós vektor leírása

A pTCSNeo-plazmid tartalmaz egy egyedi Xholklónozóhelyet, ahova az expresszáltatni kívánt gént kell inszertálni. A beépített gén transzkripcióját egy szabályo- 58 zó szekvencia irányítja, amely tartalmaz egy SV40enhanszert, az adenovírus-2 fő késői promóterétől (Ad2-MLP) 5'-irányban elhelyezve. Az Ad2-MLP pedig az adenovírus háromszoros vezető szekvenciájától 5'-irányban található. A beépített gént 3'-irányban egy egéreredetű kappaimmunglobulin (Ig_K) poliadenilációs szignálja szegélyezi. Emlős expressziós rendszerekben a szelekciót a neomicinrezisztencia gén (Neo^r) biztosítja. A plazmid tartalmaz egy bakteriális replikációs origót is, valamint egy β-laktamáz gént (Amp^r) .

A pTCSLNeo-expressziós vektor előállítása

Összehibridizáltuk az alábbi szekvenciájú két oligonukleotidot: antiszensz,

5'-CGACATCGATGATATCGAATTCGCGGCCGCCAGCTGGGGCCCTCTAGAC-3', és szensz, ’ -CGAGTCTAGAGGGCCCCAGCTGGCGGCCGCGAATTCGATATCATCGATG-3 ' , majd az így előállított DNS-fragmenst beligáltuk a pTCSNeoplazmidba, melyet előzőleg Xhol-enzimmel hasítottunk, és a ragadós végeket dT alkalmazásával feltöltöttük. Az egy előállított pTCSLNeo-plazmid tartalmaz egy polylinker szekvenciát, amely az alábbi restrikciós hasítóhelyeket foglalja magában: 5'-XhoI/Xbal/Apal/PvuII/Notl/EcoRI/EcoRV/Clal3', és az így kialakított plazmid jól használható különböző expresszáltatni kívánt gének beépítésére. A neo^r-gén cserélhető egyéb szelekciós markergénekre is.

A pTCSLDHFR*-expressziós vektor kialakítása

A pTCSLNeo-plazmidból Hindin- és BamHI-enzimekkel végzett hasítás útján eltávolítottuk a neo^r-gént, majd he····

- 59 lyére az egéreredetű mutáns DHFR-gént (dihidrofolát reduktáz gén; DHFR*) , egy olyan DNS-fragmensen, melyet a pSV2-DHFR*-plazmidból állítottunk elő Hindin- és BamHIenzimekkel végzett hasítás útján (Dr. Paul Bergtől beszerezve, Department of Biochemistry, Stanford University

Medical School).

A pSV184AH-Neo/DNS-VKCK-plazmid leírása

A pSV184ÁH-Neo/DNS-V_KC_K-plazmid (beszerezve Dr. Lee Herzenbergtől, Stanford University Medical School, lásd Jeffrey Dangl doktori értekezésének 48-67. oldalait) egy egér-V- és humán-C-kiméra konstrukció, amelyben a Dansylklorid specifikus egér hibridómából izolált átrendeződött κ-lánc V-J-régió génszegmens fuzionáltatva van egy humán genomi C_K-fragmenssel (pSV184ÁH-Neo-C_K) .

A humán kappa-lánc konstans régiójának izolálása PCRel járással

Az emésztetlen pSV184ÁH/Neo-DNS-V_KC_K-plazmidból (pSVHuK) kiindulva - amely tartalmazza a humán kappa-lánc konstans régióját - PCR-eljárást hajtottunk végre két láncindító alkamazásával (egy előre- és vissza-láncindító) alkalmazásával, a konstans régió izolálása céljából. A láncindító oligonukleotidokat az Operon cégtől szereztük be. A PCR-reakciót a GeneAmp DNS-amplifikációs reagenskészlettel, AmpliTaq enzim alkalmazásával hajtottuk végre (Perkin-Elmer Cetus). A PCR-reakciókat három különböző Mg²⁺-koncentráció alkalmazásával hajtottuk végre. A PCR-termékeket 1 %-os agaróz-gélben analizáltuk. Az első PCR-reakció termékét választottuk ki (Mg²⁺-koncentráció:

- 60 1,5 mmól/1). A C-régiót szegélyező szekvenciákhoz hibridizálódó láncindítók szekvenciáját úgy terveztük meg, hogy klónozási célokra használható restrikciós hasítóhelyeket is tartalmazzanak. Az amplifikált DNS-t tehát EcoRI-enzimmel emésztettük (a 3'-végénél). A DNS 5'-végét (PvuII) nem hasítottuk el. Az emésztett DNS-fragmenst ezután 1 %-os agarózgélben megfuttattuk, és a 300 bázispáros csíkot kivágtuk. A DNS-t ezután kinyertük a gélből, majd egy kis részletét 1 %-os agarózgélben megvizsgáltuk, minőségellenőrzés és mennyiségbecslés céljából. A kapott 300 bázispáros DNS-fragmens preparátum tisztának tűnt, és teljes mennyiségét körülbelül 140 ng-ra becsültük.

A humán kappa-lánc konstans régió klónozása a pBS-KS⁺vektorba, és szekvenálása

A humán kappa-lánc konstans régióját tartalmazó EcoRI-el emésztett DNS-fragmenst beligáltuk a pBS-KS⁺vektorba, melyet előzőleg Smal- és EcoRI-enzimekkel emésztettünk, T4-DNS-ligáz alkalmazásával. A ligációs eleggyel kompetens Escherichla coli DH5a-sejteket transzformáltunk. Különálló kiónokat vettünk fel, és ezekkel 24 folyadéktenyészetet oltottunk le. Valamennyi tenyészet sejtjeiből DNS-t izoláltunk. Valamennyi izolált DNS-mintát megemésztettük PvuII (a C_K-régió 5’-vége) és EcoRI-enzimekkel (a C_K-régió 3'-vége), majd az emésztett DNS-t 2 %-os agarózgélben analizáltuk. Mivel a kisebb méretű DNS-csíkok elválasztása problémásnak bizonyult, a DNS-mintákat másodszorra csak PvuII-enzimmel emésztettük meg. Miután az emésztett mintákat ismételten megvizsgáltuk 2 %-os

- 61 agarózgélben, kitűnt, hogy a 24 vizsgált plazmid közül 19 a megfelelő C_K-inszertet tartalmazta. Az 1-5. számú mintákat (a 19 megfelelő klón közül) kiválasztottuk szekvenálás céljából, és a szekvenálást T7- és T3-láncindítók alkalmazásával végeztük (a láncindítók szekvenciája az inszertet szegélyező vektorszekvenciákkal volt komplementer). A szekvenáláshoz használt többi reagens a Sequenase Version 2.0 reagenskészletből származtak (USB). Az 5-ös számú minta a humán kappa-lánc konstans régiójának pontos szekvenciáját tartalmazta.

A pTCSLCKDHFR*-vektor előállítása a humán kappa-lánc konstans régiójának a pTCSLDHFR* emlős expressziós vektorba történő klónozásával

A humán kappa-lánc konstans régióját izoláltuk a pBS-KS⁺-vektorból (5-ös minta), PvuII- és EcoRI-enzimes hasítás útján. Az előzőekben leírt elektroforetikus szétválási probléma miatt ezúttal is szükség volt egy második emésztésre, a pBS/humán-C_K-konstrukciók esetén. A második emésztéshez EcoRI- és Xbal-enzimeket használtunk (a Xbalhasítóhely PvuII-hasítóhelytől 5’-irányban található), ez az emésztés egy körülbelül 300 bp fragmenst eredményezett. Ezt a fragmenst gélből tisztítottuk, és PvuII-vel hasítottuk, a fennmaradó rövid 5'-végi fragmens eltávolítása céljából a C_K-régió végéből. Az így előállított fragmenst gélből tisztítottuk, majd 1 %-os agarózgélben analizáltuk minőség és mennyiség vonatkozásában. A C_K-DNS-fragmens tisztának tűnt, mérete körülbelül 28 bp-nak adódott, és az előállított teljes mennyiséget körülbelül 135 ng-ra becsültük.

··»·

- 62 Mivel a pTCSLDHFR*-expressziós vektorban 3 EcoRIhasítóhely található, úgy döntöttünk, hogy a legjobb az lenne, ha a klónozáshoz csak a PvuII-hasítóhelyet használnánk fel. Mivel a C_K-DNS-fragmenst PvulI/EcoRI-emésztéssel állítottuk elő, az EcoRI-véget Klenow-enzimmel tompavégűvé töltöttük fel. A tompavégűvé tett C_K-DNS-fragmenst beligáltuk a pTCSLDHFR*-vektorba, melyet előzetesen PvuIIenzimmel hasítottunk, és foszfatázzal kezeltünk (borjúbélfoszfatáz alkalmazásával). A ligációs eleggyel kompetens Escherichia coli DH5a-sejteket transzformáltunk. Különálló kiónokat vettünk fel, és azokkal 24 folyadéktenyészetet oltottunk be. Minden tenyészetből DNS-t izoláltunk. Valamenynyi izolált DNS-mintát megemésztettünk PvuII- és HindlIIenzimekkel, és 1 %-os agarózgélben vizsgáltuk az emésztett mintákat. Megállapítottuk, hogy a 24 vizsgált plazmid közül öt tartalmazta a C_K-inszertet a megfelelő orientációban. A további klónozási munkákhoz a 7-es számú mintát választottuk ki.

A mutáns DHFR*-gén vad típusú DHFR-génre történő cseréje génre cseréltük. pTCSLC_KDHFR* -DNS-t, pSV2-DHFR-plazmidot

Abból a célból, hogy a pTCSLC_KDHFR*-vektort CHO (dh.fr’ DUX-Bll-sejtekben expresszáltassuk, a DHFR*-gént DHFRA 7-es számú mintából izolált valamint a (beszerezve Dr. Paul Berg-től, Department of Biochemistry, Stanford University Medical School) megemésztettük HindlIIés BglII-restrikciós enzimekkel, a megfelelő fragmensek izolálása céljából. Az emésztett DNS-ek analízise során kitűnt, hogy a pTCSLC_KDHFR*-vektorban található addicionális ···» • »*· • ♦ ··

- 63 BglII-hasítóhely következtében a poliA-szignál egy részlete is eltávolítódott, ami károsan befolyásolta volna a vektor működését. Az emésztéseket ezért megismételtük Hindin- és BamlII-enzimek alkalmazásával. A vektor (DHFR*) pTCSLC_Krészét foszfatázzal kezeltük. Ezután az izolált fragmenseket (pTCSLC_K és DHFL) gélből tisztítottuk, és 1 %os agarózgélben analizáltuk minőség és mennyiség vonatkozásában. Mindkét csík tisztának tűnt, és a DNS-preparátumok koncentrációját hasonlónak becsültük, körülbelül 40-50 ng/ml-nek. A DHFR-gént ezután beligáltuk a pTCSLC_Kvektorba, T4-DNS-ligáz alkalmazásával. A ligációs eleggyel kompetens Escherichia coli DH5a-sejteket transzformáltunk. Különálló kiónokat vettünk fel és azokkal 24 folyadéktenyészetet oltottunk le. Valamennyi tenyészetből DNS-t preparáltunk. Az előállított DNS-mintákat Hindin- és Bamhlrestrikciós emésztéssel analizáltuk. A 24 mintából 23 emésztési képe megfelelő volt, ami arra utalt, hogy a DHFRgén beépült a pTCSLC_K-vektorba. A 22-es számú mintát választottuk ki további klónozási munkák céljára.

In vitro mutagenezis humán vázat tartalmazó CDR-átültetett

V-régiók előállítása céljából

Humanizált variábilis gének előállítása

Előállítottunk egy humanizált VH-gént M13-VHPCR1templátról kiindulva helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával, az előállított konstrukció szintetikus VH-gént tartalmazott az NEWM-jelű humán mielóma fehérje [lásd Jones és mtsai.: (1986)] vázrégióiba építve. Az egyszálú templátDNS-t M13-VHPCRl-fágból állítottuk elő, melyet az RZ1032- 64 jelű Escherichia coli törzsben (dut, ung) szaporítottunk, és ily módon a templát-DNS timin-bázisok helyett uracilt tartalmazott. A mutagén oligonukleotid-láncindítókat úgy szintetizáltuk, hogy kódolják a TM23-CDR-eket, és körülbelül 15 bázispárnyi tökéletesen hibridizálódó régiót, a szekvencia mindkét oldalán. Amennyiben a TM23-CDR-szekvencia tökéletesen hibridizálódott a templátszekvenciához, rövidebb láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk. Az alkalmazott láncindítók szekvenciái a következők voltak:

CDR1

5'-TGGCTGTCTCACCCAGTTTACACCATAGGCGGTTAATGAGAA GCCAGACACGG-3',

CDR2

5'-TGCTGGTGTCCTTTCAGCATTGTCACTCTGGATTTGAGAGCTG

AATAATAGTCTGTATTTCCATCACCCCATATCATTCCAA^t/_cCCACTCAAGACC-3 ' és CDR3

5'-CCAGTAGTCCATAGCATAGAGGGTAGCCGTAACCCTATCTCTTGCACAATAATAG-3'.

A CDR-t kódoló oligonukleotid láncindítót 3'-végén meghoszszabbítottuk, hogy tartalmazza a kívánt 27-30. pozícióban lévő aminosavakat kódoló régiót. Előállítottunk egy kevert oligonukleotidot, a CDR2-régió kódolására, melyet meghoszszabbítottunk a CDR3'-vége felöl oly módon, hogy a VH-régió 402. bázisa vagy G vagy T legyen, és így két különböző kódont hoztunk létre a VH-régió 48. aminosavpozíciójában, melyek vagy L-t vagy I-t kódoltak. Az oligonukleotidokat (valamennyiből 10 pmól-t) öt egység T4-polinukleotid kinázzal foszforiláltuk, a teljes reakciótérfogat 50 μΐ volt, a reakciót 1 órán keresztül 37 °C-on végeztük. Valamennyi mutagén láncindítóból 1 pmól-nyit, valamint 1 pmól • ·

- 65 V-gén szekvenálására alkalmas M13-szekvenáló láncindítót összehibridizáltunk 0,5 μς templát-DNS-sel, 20 μΐ végtérfogatban, a hibridizálást úgy végeztük, hogy a reakciőelegyet 90 °C-on hevítettük 30 másodpercig, majd hirtelen 70 °C-ra hűtöttük, és ezután lassan 37 °C-ra. A templáthoz hibridizált láncindítókat azután meghosszabbítottuk és összeligáltuk T7-DNS-polimeráz és T7 DNS ligáz alkalmazásával, a reakciót 1 órán keresztül szobahőmérsékleten végeztük. Az uracilt tartalmazó templát-DNS-t ezután a reakcióelegyből eltávolítottuk úgy, hogy a DNS-t egy egység uracil-DNS glikolilázzal 37 °C-on egy órán kezeltük, ez a kezelés a mutáns szálat érintetlenül hagyta. Az így előállított mutáns DNS-t PCR-eljárással amplifikáltuk, majd agarózgélelektroforézissel analizáltuk, és ellenőriztük, hogy a megfelelő méretű DNS termelődött-e. A DNS-terméket HindlIIés BamHI-enzimekkel elhasítottuk, majd az M13mpl9-vektor HindlII- és BamHI-hasítóhelyeire ligáltuk.

Az átalakított T23-VK-gént (T23HuVK) hasonlóképpen mutagenezis útján állítottuk elő, olyan M13-fág-templát alkalmazásával, amely tartalmazott egy olyan DNS-szekvenciát, amely magába foglalta a VK-gént, a humán Bence-Jonesfehérje (REI) vázrégióival együtt. A templát DNS-t az M13VKPCRl-fágból állítottuk elő, melyet a kiméra könnyű lánc előállításához használtunk, a fágból a klónozáshoz használt PvuII- és BclI-hasítóhelyeket eltávolítottuk. A konstrukció kialakításához használt láncindítók szekvenciái a következők voltak:

• · · ·

- 66 CDR1

5' -TCTGCTTGGTACCAGTTTAAATAATTGCTAATGCCCTGACTTG

CACTACAGGTGATGGTC-3' ,

CDR2 ’ -TCTGCTTGGCACACCTGAGTGTAAACTTGATGTGTAGTAGATCAGCAGCTT-3 ’ , és CDR3

5’-CCCTTGGCCGAACGTCCGAGGAAGTTTACTATACTGCTGGCAGTAGTAG-3’.

PCR-amplifikáció után a várt méretű termékeket kaptuk, mindkét VH esetén 823 bázispáros terméket, a VK esetén pedig 620 bázispáros terméket, és a PCR-termékeket M14mpl9vektorba klónoztuk.

A humanizált variábilis régió DNS-szekvenciák igazolása

Igazoltuk, hogy a kívánt szekvenciájú CDR-eket inszertáltuk a vektorokba, hogy véletlenszerű mutáció nem történt, valamint azt, hogy a megfelelő szekvenciájú humanizált VH- és VK-géneket állítottuk elő. Megszekvenáltuk a teljes variábilis régiókat, didezoxi-eljárás és T7-DNSpolimeráz vagy Sequenase alkalmazásával. A szekvenálás során kapott szekvenciákat összehasonlítottuk a kívánt szekvenciákkal. Kiválasztottuk azokat a kiónokat, melyek szekvenciája megegyezett a VH-régiók kívánt szekvenciájával. Ezeket a kiónokat M13-TM23NMVH-nak és M13-TM23NMVHLnek neveztük el. Kiválasztottunk egy kiónt, melynek szekvenciája megegyezett az átalakított VK kívánt szekvenciájával, ez a 11-es számú klón volt, majd ezt a kiónt M13TM23HuVK-nak neveztük el.

• · • · • ··· -* • · · · · ·· ·· ····

Az átalakított V-régiók klónozása mielóma expressziós vektorokba

A humanizált TM23-variábilis régiók klónozása expressziós vektorokba

A megklónozott humanizált variábilis régiókat humán konstans régió géneket tartalmazó expressziós vektorba vittük át, abból a célból, hogy az ellenanyagot emlős sejtekben expresszáltassuk. A két humanizált VH-gént izoláltuk az es

M13-TM23NMVHHindlII/BamHI-fragmenseken, pSVgpt.HulgGl-jelű nehéz az

M13-TM23NMVHL-vektorokból majd a fragmenseket a lánc expressziós vektor

HindiII/BamHI-hasítóhelyeire ligáltuk.

Az M13-TM23HuVK-vektorból izoláltuk a humanizált

VK-gént egy HindlII/BamHI-fragmensen, majd az izolált fragmenst a pSVhvg.HuCK-jelű könnyű lánc expressziós vektor HindlII/BamHI-helyeire ligáltuk.

Restrikciós enzimes analízissel kimutattuk, hogy a két különböző VH-régió megfelelő módon inszertálódott a nehéz lánc expressziós vektorba, és az így kialakított plazmidok a következő jelzéseket kapták: pSVgptTM23NMVH.HulgGI és pSVgptNMVHL.HulgGI.

Azt is igazoltuk, hogy a humanizált VK-régió a megfelelő módon inszertálódott a könnyű lánc expressziós vektorba, és az így előállított plazmidnak a pSVhygTM23HuVK.HuCK elnevezést adtuk.

- 68 A H- és L-lánc-konstrukciók kotranszfektálása NSO-sejtekbe A humanizált nehéz és könnyű lánc gének kotranszfektálása

A humanizált expressziós plazmidokat az NSO- és a P3-8.653F8879-jelű emlős sejtvonalakba juttattuk.

A humanizált expressziós plazmidokat ugyanazzal az eljárással kotranszfektáltuk NSO- és P3-8.653F8879-sejtekbe, mint amit a kiméra expressziós plazmidok bejuttatására használtunk.

A két humanizált nehéz lánc plazmidot, a pSVgptTM23NMVH.HulgGl-et és a pSVgptNMVHL.HulgGl-et különkülön kotranszfektáltuk a humanizált könnyű lánc plazmiddal, a pSVhygTM23HuVK.HuCK-val, és így két olyan sejtvonalat állítottunk elő, melyek különböző humanizált ellenanyagokat termeltek, a TM23HuVH/HuVK-t és a TM23HuVHL/HuVK-t. Ezek az expressziós plazmidokat a kiméra expressziós plazmidokkal kombinációban is kotranszfektáltuk, és így olyan sejtvonalakat állítottunk elő, melyek a következő hibrid ellenanyagokat termelték: TM23HuVH/MuVK, TM23HuVHL/MuVK és TM23MuVH/HuVK. Ezek a hibrid ellenanyagok fontos eszközül szolgáltak azoknak az okoknak behatárolására, melyek a humanizált ellenanyagok nehéz láncát vagy könnyű láncát érintő kötődési problémákat eredményezhetnek. A transzfekció után 14 nappal valamennyi transzfektált plazmidkombináció esetén találtunk látható NSOsejtklónokat. A P3.8-653F8879-sejtek esetén az összes szélesztett tálcát figyelembe véve csak egyetlen kiónt tudtunk izolálni, a többi szélesztőtálcát tehát eldobtuk.

• · · · • ·

- 69 Humán IgGl/kappa pozitív kiónok szelekciója

Humán ellenanyagot termelő sejtek szelekciója

Olyan NSO-sejtvonalakat izoláltunk, melyek humanizált és hibrid kiméra/humanizált ellenanyagokat termeltek. A sejttenyészetek felülúszóiból vett mintákat ELISAeljárással szkríneltük.

A TM23HuVH/HuVK:-NSO-sejtek esetén kiválasztottunk négy mélyületet, melyekben található felülúszók adták a legmagasabb ELISA-értékeket, a következő mélyületeket választottuk ki: D5, D10, C6 és Eli. A D5-jelű mélyület két látható kiónt tartalmazott, a többi mélyület egy azonosítható kiónt. Mindazáltal a mélyületekben található sejtvonalak nem feltétlenül voltak monoklonálisak. A kiválasztott mélyületekben található sejtvonalakat tovább tenyésztettük, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk őket, TM23HuVH/HuVK-D5, -D10, -C6 és -Eli megjelöléssel.

A TM23HuVHL/HuVK:-NSO-sejtek esetén is kiválasztottuk azt a négy mélyületet, melyben található kiónok felülúszói a legmagasabb ELISA-értékeket adták, a kiválaszott mélyületek a következők voltak: B2, B7, D8 és E9. Az E9mélyületben két látható kiónt találtunk, a többi mélyület egy-egy látható kiónt tartalmazott. Mindazáltal nem bizonyos, hogy az előállított sejtvonalak monoklonálisak voltak. Az említett mélyületekben talált sejteket ezután tovább tenyésztettük, majd folyékony nitrogénben megfagyasztottuk őket a következő jelzésekkel: TM23HuVHL/HuVK-B2,

B7, -D8 és -E9.

- 70 A TM23HuVH/MuVK:-NSO-sejtek esetén is kiválasztottuk azt a négy mélyületet, melyekben található felülúszók a legnagyobb ELISA-értékeket adták, a kiválasztott mélyületek a következők voltak: D9, E6, F10 és G10. Az F19- és G10mélyületek két-két látható kiónt tartalmaztak, a több mélyületek egyet-egyet. Mindazáltal az így előállított sejtvonalak nem bizonyos, hogy monoklonálisak voltak. A kiválasztott mélyületekben található sejtvonalakat tovább tenyésztettük, majd a következő megjelölésekkel lefagyasztottuk őket folyékony nitrogénben: TM23HuVH/MuVK-D9, -E6, -F10 és -G10.

A TM23HuVHL/MuVKL:-NSO-sejtek esetén is kiválasztottuk azt a négy mélyületet, melyekben található felülúszók a legmagasabb ELISA-értékeket adták, a kiválasztott mélyületek a következők voltak: B8, C6, D2 és D8. A C6- és D8-mélyüIetek két-két látható kiónt tartalmaztak, a másik két mélyület egyet-egyet. Mindazáltal az előállított sejtvonalak nem biztos, hogy monoklonálisak voltak. A kiválasztott mélyületekben található sejtvonalakat ezután tovább tenyésztettük, majd folyékony nitrogénban lefagyasztottuk őket, a következő megjelölésekkel: TM23HuVHL/MuVK-B8, -C6,

-D2 és -D8.

A TM23MuVH/HuVK:-NSO-sejtek esetén is kiválasztottuk azt a négy mélyületet, melyekben található felülúszók a legmagasabb ELISA-értékeket adták, a kiválasztott mélyületek a következők voltak: B9, G4, G6 és Gll. Valamennyi mélyület legalább négy látható kiónt tartalmazott. A klónokból előállított sejtvonalak nem feltétlenül mono- 71 klonálisak. A mélyületekből előállított sejtvonalakat tovább tenyésztettük, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk őket, a következő megjelölésekkel: TM23MuVH/HuVK-B9, -G4, -G6 és -Gll.

Első szál cDNS-szintézis CHO-sejtekben történő expresszió célj ára

Citoplazmatikus RNS előállítása

Reverz transzkripció céljára RNS-t preparáltunk.

Felélesztettünk egy adag lefagyasztott NSO-TM23HuVHL/HuVKsejtet oly módon, hogy a reakcióedényt a folyékony nitrogénból kivéve 37 °C-on gyorsan felolvasztottuk. A sejteket fokozatosan felhígítottuk 10 ml Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg / Ham-féle F12-tápközeggel (DMEM/F12), amely tartalmazott antibiotikumokat is, valamint 5% gammaglobulin-mentes magzati borjúsavót (GG-mentes FBS-t). A sejteket ezután 5 percig 1500 ford/perc-cel centrifugáltuk, ezután a tápközeget eltávolitottuk, majd a sejteket felszuszpendáltuk 20 ml friss tápközegben, egy 75 cm -es lombikban. A tenyészetet ezután 30 ml-re expandáltuk, egy 175 cm²-es lombikban. Az aktívan növekvő sejteket ezután begyűjtöttük centrifugálással, majd háromszor mostuk őket hideg foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS). Az ily módon izolált sejtekből citoplazmatikus RNS-t izoláltunk Favoloro és mtsai. eljárásával (1980, lásd fent). Összesen 350 μg citoplazmatikus RNS-t állítottunk elő.

cDNS-szintézis

A VH- és VK-régiókat kódoló első szál cDNS-t állítottunk elő. A variábilis régiókat kódoló első szál cDNS-t

- 72 a következő összetételű reakcióelegyekben állítottuk elő: 5 μg RNS, 250 μιηόΐ/ΐ dezoxi-nukleotid-trif oszf átok (dNTP-k) , 15 egység ribonukleáz inhibitor (Pharmacia RNAguard), valamint 25 pmól láncindító oligonukleotid. Az alkalmazott láncindító a VH-régió esetén a 1109 számú oligonukleotid volt, szekvenciája:

5'-GGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGG TGACC-3', valamint a VK-régió esetén a 1095 számú oligonukleotid, szekvenciáj a:

5'-AGATTTCAGCTGCTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGA TGG-3'.

A reakcióelegyeket 10 percig 70 °C-on hevítettük, majd lassan 37 °C-ra hűtöttük őket. A reakcióelegyekhez ezután 100 egység Moloney-féle egérleukémia-vírus eredetű reverz transzkriptázt adtunk, majd a reakcióelegyeket 30 percig 37 °C-on inkubáltuk.

Az előállított cDNS-eket ezután PCR-eljárással amplifikáltuk, a fenti láncindítók alkalmazásával, valamint a VH-régió esetén a 1096 számú oligonukleotid alkalmazásával, melynek szekvenciája:

5'-GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTT CTTGGTAG-3', valamint a VK-régió esetén a 1096 számú oligonukleotid alkalmazásával, melynek szekvenciája:

5'-GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTT

CTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCCAGATGACCCAGAG-3'. A

PCR-termékeket agarózgélelektroforézissel ellenőriztük, és méretüket a várakozásnak megfelelőnek találtuk (körülbelül 450 bp), majd a DNS-termékeket a gélből izoláltuk.

·«·· • ·

- 73 Restrikciós enzimes emésztések

A PCR-termékeket megemésztettük CHO-vektorokba történő klónozás céljából. A VH-PCR-termékeket Xhol- és Apaienzimekkel emésztettük. A VK-PCR-termékeket Xhol- és PvuIIenzimekkel hasítottuk. Az emésztett DNS-termékeket 0,8 %-os agarózgélben elektroforézissel analizáltuk. A vizsgálat során a várt méretű - 450 bp-os termékeket kaptuk.

A V-régiók (V_H [ TCS és S] és V_s [ S] ) izolálása cDNS-ből kiindulva és PCR-amplifikációval (V_H[ TCS] )

Előállítottuk a TM27-V_K- és TM27-V_H elsőlánc-cDNSmintákat, valamint az ezen molekulák PCR-amplifikálásához szükséges láncindító oligonukleotidokat. A TM27-VH-cDNS- és megfelelő láncindítók felhasználásával PCR-amplifikálást hajtottunk végre, Taq-polimeráz alkalmazásával. A PCRterméket agarózgélben futtattuk, majd Geneclean II reagenskészlet alkalmazásával tisztítottuk (BiolOl). Becslésünk szerint körülbelül 1,5 ng/ml töménységű DNS-oldatot kaptunk.

COS-sejtek transzfektálása pSRlNeo4Hll- (könnyű) és pBJ14Hll- (nehéz) vektorokkal, C-régió cDNS-izolálásához

A pSRINeo és pBJl emlős expressziós vektorok a pcDL-SRa296-vektor származékai [ Takebe és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 8^, 466 (1988)] , melyek előállítását Lin és mtsai. írták le [Science 249, 677 (1990)] , az említett plazmidokban az SRa-promóter és az SV40-poliadenilációs hely között található Xhol-hasítóhely a klónozás megkönnyítése céljából egy többszörös klónozóhelyre lett cserélve, amely a következő restrikciós hasítóhelyeket tartalmazza:

...... ·♦. ···: .·· ·· * * _ ··· • ·’·. . . · ·

·..· .......

- 74 5’-Xhol/Xbal/Sfil/NőtI/EcoRI/EcoRV/HindIII/ ClaI-3'. A pSRINeo-vektorba az ampicillin-rezisztenciagén és az SRapromóter közé egy neomicin-rezisztenciagént iktattunk be. A TM23 nehéz lánc vezető szekvenciáját és V-D-J-régióját kódoló cDNS-t először fuzionáltattuk a genomi nehéz lánc konstans régióval, majd a fuzionált terméket beinszertáltuk az Xhol- és Notl-enzimekkel hasított pBJl-vektorba, előállítva ily módon a pBJ14Hll-(nehéz)-vektort. Hasonló módon a vezető szekvenciát és a V-J-régiót kódoló könnyű lánc cDNSt először fuzionáltattuk a genomi κ-fragmenssel, majd a fuzionáltatott terméket az XhoI/Notl-hasított pSRlNeovektorba építettük, előállítva ily módon a pSRlNeo4Hll(könnyű)-vektort. Ezután az előállított két plazmidot - a pBJ14Hll-(nehéz)- és pSRlNeo4Hll-(könnyű)-plazmidokat C0S-7-sejtekbe kotranszfektáltuk (a C0S-7-sejtvonal egy afrikai zöldmajom veseeredetű sejtvonal, mely SV40-el van transzformálva, ATCC CRL 1651), tranziens expresszió céljából .

A humán IgGl konstans régió izolálása

A humán IgGl konstans régió cDNS-t transzfektált

COS-sejtekből izolált poli (A) ⁺-RNS-ből kiindulva állítottuk elő, PCR-eljárás alkalmazásával, az alábbi szekvenciájú IgGl konstans régió láncindítókat felhasználva: előreláncindító:

5'-GCGTGACAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC-3', és vissza-láncindító:

5'-GCGTGACAAGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT-3'.

- 75 A PCR-rel amplifikált konstans régió DNS-fragmenst, amely 3'-végén EcoRI-hasítóhelyet (közvetlenül a kódoló régió mellett) és 5'-végén Apai-helyet (a kódoló régióban) tartalmazott, szubklónozás és szekvenálás céljából pBS-KS⁺plazmidba klónoztuk. Megszekvenáltuk a teljes konstans régiót, T3- és T7-láncindítók felhasználásával, melyeket a konstans régióhoz hibridizálódó belső láncindítókkal egészítettünk ki. A pontos szekvenciájú kiónt pTCSLNeoplazmidba szubklónoztuk, előállítva ily módon a pTCSLCglNeo-plazmidot.

A pTCSLCglNeo-plazmid előállítása

Az IgGICgl-szekvenciát kihasítottuk a megfelelő inszertet tartalmazó pBS-KS⁺-plazmidból, EcoRI/Apalhasítással, majd a kihasított fragmenst a pTCSNeo-plazmidba ligáltuk, melyet előzőleg ugyanazokkal az enzimekkel megemésztettünk. Az eredményül kapott plazmidot - a pTCSLCglNeo-plazmidot - használtuk további módosítások céljára, miáltal előállítottuk a pTCSLCgNeoApa -plazmidot.

Az Apai-hasítóhely eliminálása a pTCSLC_KlNeo-plazmidból, a pTCSLCicNeoApa^-plazmid előállítása céljából

A pTCSLC_KNeo-j élű CHO-expressziós vektor két Apaihasítóhelyet tartalmaz, az egyik Apai-hasítóhely a többszörös klónozóhelyen belül található, és klónozandó fragmensek inszertálására lehet használni, a másik Apai-hasítóhely a neo^r-gén mellett közvetlenül 3'-irányban található. A további klónozási lépések egyszerűsítése céljából a neo^r-gén mellett Apai-hasítóhelyet elimináltuk. A pTCSLC_KlNeoplazmidot részlegesen megemésztettük Apai-enzimmel, majd az • · · · • · · ·

- 76 emésztési reakcióelegyből egy kis mintát agarózgélben megfuttattunk, és megvizsgáltuk, hogy jelen vannak-e benne lineáris molekulák (azaz olyan plazmidmolekulák, melyek csak az egyik Apal-hasítóhelynél hasadtak el) . Az emésztett plazmidot ezután T4-DNS-polimerázzal kezeltük, amely szelektíven eltávolítja az Apai-hasítás során keletkezett egyszálú túlnyúló végeket, anélkül, hogy a kettősszálú DNS-t megemésztené. A lineáris plazmid-molekulákat ezután ligálással recirkularizáltuk, majd kompetens Escherlchla coli HBlOl-sejtekbe transzformáltuk őket. Felvettünk 30 transzformáns kiónt, és azokkal folyadéktenyészeteket oltottunk be. Valamennyi tenyészetből DNS-t izoláltunk, majd a plazmidokat Apai-enzimmel megemésztettük, és az emésztett DNS-mintákat agarózgélben megfuttattuk. Ezekben a kísérletekben a plazmid-DNS sajnos degradálódott. Ezért az Apaienzimmel végrehajtott emésztéseket megismételtük a 30 minta közül 21 izolált plazmidon. Két mintát találtunk (a 4-es és a 12-es számúakat), melyek az emésztés során linearizálódni látszottak. Az összes többi mintát az Apai-enzim két helyen hasítottak el. A két alkalmasnak tűnő plazmidot ezután együttesen emésztettük Apai- és HindlII-enzimekkel, annak eldöntése céljából, hogy melyik Apai-hasítóhely maradt meg a plazmidokon. Ebből az emésztésből kitűnt, hogy a 12-es számú minta esetén a pTCSLC_KlNeo-Apa-plazmid neo^rrezisztencia génjétől 3'-irányban található Apai-hasítóhely eliminálódott, ahogy azt el kívántuk érni. Végrehajtottunk további restrikciós emésztéseket is az izolált plazmid szerkezetének igazolására.

• · ·· ·· ···· · · ·

-77 A PCR-rel izolált humán kappa- és nehéz lánc V-régiók klónozása CHO-vektorokba, sorrendben a pTCSLCkDHFR- és pTCSLCglNeoApa'-vektorokba

A TM27-V_K~fragmens klónozása pTCSLC_KDHFR-plazmidba

A TM27 kappa-láncának V-régióját kódoló cDNS-t gélből tisztítottuk, és a megfelelő restrikciós enzimekkel megemésztettük. Az emésztett DNS-ből egy kis mintát 1 %-os agarózgélben analizáltunk, mennyiségbecslés és minőségellenőrzés céljából. A koncentrációt körülbelül 1,25 ng/ml-re becsültük, és megfigyeltünk egy szennyező csíkot körülbelül 800 bázispárnál. A V-régiót kódoló fragmenst beligáltuk az előzetesen Xhol- és PvulI-restrikciós enzimekkel megemésztett és foszfatázzal kezelt pTCSLC_KDHFR-vektorba. A ligációs eleggyel kompetens Escherichia coli CH5a-sejteket transzformáltunk. Nagyon kevés transzformáns kiónt kaptunk. Különálló kiónokat vettünk fel és azokkal 12 folyadéktenyészetet oltottunk le. Valamennyi tenyészetből plazmidot izoláltunk, az izolált DNS-t Xhol- és PvuII-enzimmel megemésztettük, majd 1 %-os agarózgélben megfuttattuk. Két pozitív mintát találtunk, a 3-as és a 4-es számút. Mindkét pozitív mintát megszekvenáltuk.

A TM27-V_H-fragmensének klónozása pTCSLCglNeoApa -vektorba

A TM27-V_H-régióját kódoló PCR-terméket gélből tisztítottuk, és megemésztettük a megfelelő restrikciós enzimekkel (Xhol-el és Apal-el). Mivel azonban észrevettük, hogy az Apai-emésztés feltehetőleg nem volt teljes, az emésztést megismételtük. Az emésztett DNS-ből egy kis mintát agarózgélben megfuttattunk, mennyiségbecslés és minő···· ·· ·· ···· ·· • · · · · ·

- 78 ségellenőrzés céljából. A V_H-régiónak megfelelő csík koncentrációját 0,4 ng/ml-re becsültük. Csakúgy, mint a V_Kfragmens esetén körülbelül 800 bázispárnál megfigyeltünk egy szennyező csíkot, amiből arra következtettünk, hogy a DNS-minta tisztasága ebben az esetben sem volt a várakozásnak megfelelő. A V_H-régiónak megfelelő fragmenst beligáltuk a pTCSLC_KlNeoApa -vektorba, melyet előzőleg megemésztettünk Xhol- és Apai-restrikciós enzimekkel, és foszfatázzal kezeltünk. A ligációs eleggyel kompetens Escherichia coli DH5a-sejteket transzformáltunk. Nagyon kevés transzformáns kaptunk. Hat kiónt vettünk fel, és ezekkel folyadéktenyészeteket oltottunk le. Valamennyi tenyészetből plazmidminiprep-et készítettünk, az izolált plazmidokat Xhol- és EcoRI-enzimekkel megemésztettük, majd agarózgélben analizáltuk őket. Az első ligálási reakció eredményeként pTCSLHuV_H4HC_KlNeoApa - egy kiónt tudtunk izolálni (6-os számú minta). További kiónokat kívántunk előállítani (arra az esetre, ha az izolált 6-os számú minta nem a megfelelő szekvenciájú inszertet tartalmazná), ezért további ligálási reakciókat hajtottunk végre, a következő összetevők felhasználásával: (1) az újra megtisztított V_H-PCR-termék, melyet alacsony olvadáspontú agarózból ismételten izoláltunk, a nagy molekulatömegű szennyező csík eltávolítása céljából, és (2) egy V_H-PCR-termék, mely a cDNS és láncindítók alkamazásával szintetizáltunk. A ligálási reakciók eredményeként nyolc további transzformánst analizáltunk, és izolálni tudtunk öt további feltételezhetően megfelelő

- 79 inszertet tartalmazó kiónt: a 9-es, 10-es, 11-es, 12-es és

14-es számú izolátumot.

A klónozott V-régió szekvenálása mindkét szálon, a megfelelő DNS-szekvencia igazolása

A pTCSLC_KlNeoApa - és pTCSLC_KDHFR-vektorokba inszertált V-régiók szekvencia analíziséhez szükséges láncindító oligonukleotidokat az Operon Research cégtől szereztük be. Az előre láncindító a pTCS-vektor szekvenciáihoz hibridizálódott, és fel tudtuk használni mind a pTCSLC_KlNeoApa -, mind pedig a pTCSLC_KDHFR-vektorokba inszertált V-régiók szekvenálásához. A vissza láncindítók a C_K- vagy C_Kl-szekvenciákhoz hibridizálódtak, és ezeket használtuk sorrendben a V_K- és V_H-inszertek szekvenálására.

A humán kappa-lánc V-régiójának szekvenálása kettősszáiú

DNS-en

A két TM23-mintát (a 3-as és a 4-es számút) mindkét szálán megszekvenáltuk. A vissza szálat teljesen megszekvenáltuk, keresztül a restrikciós enzim hasítóhelyeken (3' —> 5'; PvuII - Xhol) a HUCK5PR-jelű láncindító alkalmazásával. Az előre-szál szekvenciáját két különböző láncindító - a PTCSFOR és a PTCSFWD - alkalmazásával határoztuk meg. A teljes hosszúságú szekvenciát a restrikciós enzim hasítóhelyeken keresztül (5' —» 3'; Xhol - PvuII) úgy határoztuk meg, hogy a különböző láncindítók alkamazásával meghatározott szekvenciákat egymással kombináltuk. Az előre lánc szekvenciájában találtunk egy rövid kompressziót tartalmazó szakaszt, melyet nem sikerült feloldanunk semelyik láncindító alkalmazásával, és semmilyen • ·

- 80 olyan eljárás alkamazásával sem, melyet általában a kompressziók feloldására használnak. Mindazáltal a vissza szál segítségével meg tudtuk határozni ennek a szakasznak a pontos szekvenciáját. Mind a 3-as mind a 4-es minta a megfelelő szekvenciájú inszertet tartalmazta, emlős sejtek transzfektálására a 4-es számú mintát választottuk ki.

A TM27-gamma-lánca V-régiójának szekvenálása mindkét szálon

A pTCSLHuV_H4HC_KlNeoApa -plazmid V_H-fragmensének (6-os és 9-es számú izolátumok) szekvenciáját mindkét szálon meghatároztuk. A humanizált V_H-fragmens 6-os számú izolátumában a vizsgált szekvencia megegyezett a várt szekvenciával az egész kódoló régión keresztül. Egyetlen báziscserét tapasztaltunk a -2-es pozícióban (az ATG iniciációs kódontól számítva; C cseréje T-re), de feltételeztük, hogy ez a báziscsere nem fogja károsan befolyásolni az expressziót. A 9-es számú izolátum V_H-fragmense két báziscserét tartalmazott a kódoló régióban. A további négy izolált klón szekvenciáját nem határoztuk meg.

COS- és CHO-sejtek kotranszfektálása TM27- és CONTROLplazmidokkal

A recipiens sejtek CHO-dhfr’-DUX-Bll- és COS-1sejtek voltak. A CHO-DUX-Bll-sejtvonalat a Biogen Inc. cégtől szereztük be. CHO-sejtek transzfektálása céljából 5 pg TM27-plazmidot: pTCSLHuV_K4HC_KDHFR (4-es számú izolátum), és pTCSLHuV_H4HC_KNeoApa (6-os számú izolátum), valamint a pTCSLDHFRApa és pTCSLNeoApa’-plazmidokból linearizáltunk AatlI-enzimmel történő hasítás útján. A TM27-tartalmú plazmidokat (jelzésük: TM27L) együtt csaptuk ki etanol• « · lal, majd vízben feloldottuk őket. Hasonló módon a vektorplazmidokat is (jelölésük: CONTROL) együtt csaptuk ki, majd vízben feloldottuk őket. Mindkét együttesen kicsapott két-két plazmidból származó oldattal elektroporáció útján 10⁷ CHO-sejtet transzfektáltunk, a BioRad által forgalmazott Gene Pulser alkalmazásával, 250 V és 960 mFértékek beállításával. A transzfektált sejteket ezután a Minimál Essential Médium (aMEM) tápközegben tenyésztettük, amely timidinnel, adenozinnal és dedoxi adenozinnal ki volt egészítve (nem szelektív tápközeg) a szelekciót megelőzően két napon keresztül.

COS-sejtek transzfektálása céljából 5 pg hasítatlan TM27L-plazmidokat valamint a vektorplazmidokat együttesen kicsaptuk etanollal, majd a csapadékokat vízben felvettük. A plazmidokat ezután 4,lxl0⁶ COS-sejtbe transzfektáltuk elektroporáció útján. A transzfektált sejteket Dulbeccoféle módosított Eagle-tápközegben (DMEM) tenyésztettük három napon keresztül, majd a felülúszókat vizsgálat céljára begyűjtöttük.

A COS-transzfektánsok felülúszóinak analízise humán IgGlELISA-alkalmazásával és festéssel

A sejttenyészetek felülúszóit megvizsgáltuk humán Ig-termelés vonatkozásában, humán IgGl-specifikus ELISA alkalmazásával . A mikrotiter-tálcákat egérben képzett antihumán IgGl-Fc-ellenanyaggal burkoltuk, PBS-pufferben, majd a tálcákat blokkoló pufferrel blokkoltuk (1 % BSA PBSpufferben). A felülúszókból 100 pl mintákat adtunk a mélyületekbe, és a kívánt hígításokat blokkoló pufferben hoztuk • ·

V

- 82 * létre. A megkötődött IgG-t torma-peroxidázzal konjugált kecskében termeltetett antihumán Ig_K-ellenanyaggal és OPDszubsztráttal (o-fenilén-diamin) muttattuk ki. A TM27Ltranszfektált COS-sejtek felülúszói 95 ng/ml koncentrációban termeltek humán IgG-t. A kontroll vektorokkal transzfektált COS-sejtekben humán IgG-t nem lehetett kimutatni. A TM27L-transzfektált COS-sejtek felülúszóit áramlási citometriás vizsgálatnak vetettük alá, a felülúszókat előzőleg hatszorosra töményítettük. Ahogy az az átlagos csatorna-fluoreszenciából kitűnt, a festés intenzitása a HPB-sejtek esetén körülbelül kilencszer kisebb volt, mint a tisztított TM27L esetén (NSO-sejtekből tisztítva), körülbelül 2,5 mg/ml koncentrációban. Jurkat-sejtek esetén a festődés a háttér szintjén maradt.

CHO-transzfektánsok szelektálása

A CHO-transzfektánsokat úgy szelektáltuk, hogy nukleotidokkal nem kiegészített aMEM-tápközegben tenyésztettük őket (ily módon DHFR⁺-sej tekre szelektáltunk, azaz a pTCSLHuV_K4HC_KDHFR-plazmidra) , a tápközeg geneticint is tartalmazott (G418-ellenanyag, ez az ellenanyag a pTCSLHuV_H4HC_KlNeoApa -plazmidon kódolt neo^r-génre szelektál) . A sejteket ezután 24 mélyületű tálcákba szélesztettük 2,0xl0⁵ sejt/ml koncentrációban.

A CHO-transzfektánsok vizsgálata humán IgGl-specifikus

ELISA-val nap szelektív tápközegben végrehajtott tenyésztés után a konfluens sejteket tartalmazó mélyületekből a felülúszókat begyűjtöttük és humán IgGl/_K-specifikus ELISA9 9 • · · · * * * ·· 9· ···· · ·· eljárással vizsgáltuk őket. A TM27L-felülúszókban a koncentrációk 182-236 ng/ml között voltak. A legtöbb mélyületben a koncentráció nagyobb volt 200 ng/ml-nél. A kontroll felülúszókban humán IgGl/_K nem volt kimutatható. A 12 legjobban termelő TM27-mélyülétből származó sejteket T25lombikokban expandáltuk. Tenyészetenként egy fagyasztócsövet lefagyasztottunk, backup-tenyészetként, és ezeket a csöveket folyékony nitrogénben tároltuk. Két CONTROL mélyületből származó sejteket szintén expandáltunk T25lombikokban, és lefagyasztottuk őket.

A CHO-transzfektánsok első határhígításos szélesztése

Kiválasztottuk a négy legjobban termelő mélyületet, és az ezekben található sejteket 96 mélyületű tálcákra széleztettük határhígítás alkalmazásával, ezek a következő mélyületek voltak: IBI (232,6 ng/ml), 1D6 (233,3 ng/ml), 2B2 (235,5 ng/ml) és 2C1 (236,0 ng/ml). Valamennyi mélyületben található sejteket három különböző tálcába széleztettük, szelektív tápközegben: az egyik tálcát egy sejt/mélyület koncentrációt alkalmazva, a másik két tálcát pedig 0,5 sejt/mélyület koncentrációt alkalmazva töltöttük fel.

Az első klónozási lépcsőben kapott felülúszókat humán IgGl/_K-specifikus ELISA-val szkríneltük. 90 jól termelő mélyületből származó sejteket 24 mélyületű tálcákban expandáltunk, majd a sejteket konfluenciáig engedtük növekedni. Ezek közül a tenyészetek közül 12-t vizsgáltunk meg humán IgGl/_K-specifikus ELISA-val, valamint áramlási citometriával. A humán IgGl/_K-specifikus ELISA-val meghatá• · • · • · · · · ·

- 84 rozott koncentrációk 211 és 1048 ng/ml között voltak. Valamennyi minta megfestette a HPB-sejteket (az átlagos csatornafluoreszcencia 46,5 és 169,9 között változott), a Jurkat-sejteket azonban nem festették meg. A hat legjobban termelő kiónt expandáltuk és lefagyasztottuk (backuptenyészetként) folyékony nitrogénben. Ezek közül a kiónok közül kiválasztottuk a két legjobban termelő kiónt (1B1-C7 és 2B2-A9), és a további klónozási lépéseket ezekből kiindulva hajtottuk végre.

Két CONTROL-konstrukcióval transzformált elsődleges tenyészetet is alávetettünk határhígításos szélesztésnek 96 mélyületű tálcákban. Mindkét elsődleges tenyészetből egy kiónt kiválasztottuk és expandáltuk. A felülúszókat megvizsgáltuk, és kimutattuk, hogy humán IgGl/_K-specifikus ELISA-val nem adnak kimutatható jelet. A sejteket lefagyasztottuk és folyékony nitrogénben tároltuk.

A klónozatlan tenyészetek expandálása lombikméretre ellenanyag tisztítás céljából

Két elsődleges tenyészetet (ΙΒΙ-t és 2B2-t) expandáltunk megfelelő mennyiségű TM27-ellenanyag tisztítása céljából. A sejteket 2 l-es lombikban expandáltuk, és alacsony szérum-koncentrációhoz szoktattuk őket (a következő módon: T25-ös lombikokban 10 % szérum —> T75-ös lombikokban % szérum —» 3 x T75-ös lombikokban 5 % szérum —> 3 x 2 l-es lombikokban 1 % szérum) . A 2 l-es lombikokig az első napon jutottunk el, és azokat friss táptalajjal 2., 5. és 8. napon töltöttük fel (oly módon, hogy a felülúszó felét 1 % szérumot tartalmazó friss tápközeggel cseréltük le) . A • · • · · · felülúszókból először a 10. napon vettünk mintát, majd a 12. és 15. napokon. A begyűjtött felülúszókat lecentrifugáltuk, és az üledéket a tisztítás megkezdéséig -20 °C-on tároltuk.

Ellenanyagtisztítás protein-A-oszlopon

A 2B2-tenyészetekből származó felülúszókat összeöntöttük (össztérfogat: 2,7 1), majd az összeöntött felülúszót 0,22 mikronon nylonmembránon keresztülszűrtük. Humán IgGl-specifikus ELISA-val meghatároztuk a kiindulási anyag mennyiségét, ami 1090 mg-nak adódott. Az ellenanyagot egy Prosep-A-jelű (protein-A) oszlopon tisztítottuk, az eluálást 0,1 mól/1 citrátpufferrel végeztük, a pH-értékek a következők voltak: 5,0, 4,0 és 3,0. Az eluátumokat PBSpufferrel szemben dializáltuk. Az eluált frakciókban a tisztított ellenanyag mennyiségét humán IgGl-specifikus ELISA-val határoztuk meg. A pH =3,0 értéken eluált frakció tartalmazta a legnagyobb mennyiségű tisztított ellenanyagot, de található volt egy kis mennyiségű ellenanyag a pH 4-es frakcióban is. Megismételtük a humán IgGl-specifikus ELISA-t, hogy pontosabb koncentrációértékeket kapjunk. A TM27-ellenanyag teljes kitermelt mennyisége (a pH 3, 0-ás és pH 4,0-ás frakciókban) 960 mg volt.

Ellenanyagtisztítás protein-A-oszlopon, az NSO-transzfektáns tenyészet felülúszójából

Az NSO-transzfektáns-tenyészet felülúszójából lényegében a fent leírtak szerint tisztítottunk ellenanyagot, protein-A-oszlop alkalmazásával.

- 86 Az NSO-mielóma sejtvonalból izolált TM27-ellenanyag jellemzése

Az NSO-transzfektánsok tenyészeteinek felülúszóiból protein-A-oszlopkromatográfiával tisztított TM27-mAb-bal HPP-ALL-sejteket (Vfi-5.2) festettünk, negatív kontrollként Jurkat-sejteket (VE-8.1), és összehasonlítottuk az egérmAb-ot a TM23-at és a kiméra-TM27-et. A TM27-ellenanyag a HPB-ALL-sejteket pozitívan festette, a Jurkat-sejteket viszont nem.

A TM27-specifáfásának meghatározására normális PBLT-sejteket festettünk TM27-ellenanyaggal, TM23-mAb-bal öszszehasonlítva. Mind a TM27, mind pedig a TM23-mAb-ok festették a PBL-T-sejteket (az összes humán PBL-T-sejtek 3,0 %-át) . Beállítottunk egy kompetíciós vizsgálati eljárást, amelyben rögzített koncentrációjú FITC-cel jelzett TM23mAb-ot adtunk a változó koncentrációjú jelöletlen 4H11- és TM27-mAb-okhoz. Az ellenanyagkeverékekkel ezután HPB-ALLsejteket festettünk. Mind a jelöletlen TM23, mind pedig a TM27 gátolta a FITC-cel jelzett TM23-al történő festődést. Annak eldöntése érdekében, hogy a TM27-ellenanyagok komodulálhatók-e CH3-antigénnel, HPB-ALL-sejteket inkubáltunk egy éjszakán át különböző koncentrációjú TM27- és TM23-mAb-okkal, majd az előinkubált sejteket anti-CD3-mAbal festettük. Az eredmények arra utaltak, hogy mind a TM27, mind pedig a TM23-ellenanyag képes volt a TCR/CDR3komplex endocitózisát kiváltani.

A TM27-ellenanyag HPB-ALL-sejtek iránti kötési affinitását Scatchard-analízissel vizsgáltuk. Mind a • ·

- 87 Scatchard, mind pedig a kompetíciós (TM23-mAb-bal) vizsgálati eljárással olyan eredményeket kaptunk, melyek arra utaltak, hogy a TM27 közel azonos mértékben megőrizte affinitását (Kd = 2.0 x 10 ⁸ 1/mól) , és jól kompetált a 4H11mAb-bal.

A TM27L/NSO- és TM27L/CHO-ellenanyagokat is összehasonlítottuk kompetíciós vizsgálati eljárással a 4Hll-mAbbal, a kapott eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be.

Scatchard-analízist is végeztünk, melynek eredményeit a 4. ábrán mutatjuk be.

A CHO-transzfektánsok második határhígitásos szélesztése

A határhígitásos szélesztést a fent leírtak szerint végeztük. A mélyületeket humán IgGl-specifikus ELISA-val szkríneltük. Mindkét klónból (1B1-C7 és 2B2-H9) származó hat-hat mélyületből a sejteket 24 mélyületű tálcákba expandáltuk, majd a mélyületeket humán IgGl-specifikus ELISA-val vizsgáltuk. A két legjobban termelő kiónt valamennyi tálcáról expandáltuk, és a sejteket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Mindegyik tálcáról kiválasztottuk a legjobban termelő kiónt, és ezeket használtunk az utolsó szubklónozási lépéshez.

A CHO-transzfektánsok harmadik határhígitásos szélesztése

A határhígitásos szélesztést a fentiek szerint végeztük. A mélyületeket humán IgGl-specifikus ELISA-val szkríneltük. Mindkét klónból (1B1-C7 és 2B2-H9) származó hat mélyületből a sejteket 24 mélyületű tálcákba expandáltuk, és a felülúszókat humán IgGl-specifikus ELISA-val vizsgáltuk. Mindegyik tálcáról a 3 legjobban termelő kiónt • ·

- 88 T25-lombikokba expandáltuk, majd a sejteket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Mindegyik tenyészetből egy-egy egyedi kiónt T75-ös lombikokban expandáltunk. Ennél a lépésnél a geneticint kihagytuk a tápközegből, megszűntetve ily módon a neo^r-génre történő szelekciót. A DHFR-génre továbbra is szelektáltunk. A felülúszókat humán IgGlspecifikus ELISA-val vizsgáltuk. Az lBl-C7-klón 4,69 mg/10⁶ sejt/nap ellenanyagot termelt. A 2B2-H9-klón 2,65 mg/10⁶ sejt/nap termelésűnek bizonyult. A C7-izolátumot választottuk tehát végső klónként, a H9-izolátumot pedig alternatív klónként megőriztük.

Lefagyasztott sejtszuszpenziók előállítása

A fentiek szerint kiválasztott végső kiónt öt T225ös lombikban expandáltuk, hogy fagyasztott sejtszuszpenziók készítéséhez elegendő mennyiségű sejtet kapjunk. A lombikokból a sejteket begyűjtöttük és egyesítettük. Az egyesített sejtszuszpenzió 98,3 % életképes sejtet tartalmazott. Az életképes sejtek száma összesen 1,58 x 10 volt, ami elegendőnek bizonyult ahhoz, hogy előállíthassuk a kívánt 72 fagyasztott sejtszuszpenziót, melyek fagyasztócsövenként 2 x 10⁶ sejtet tartalmaztak. A sejtszuszpenziókat lefagyasztottuk, és a csöveket TM27L-662-35 jelöléssel láttuk el. Ezen felül az alternatív H9-klónt egy T225 lombikban expandáltuk, és ebből a kiónból is létrehoztunk egy kisebb méretű fagyasztott sejtszuszpenzió gyűjteményt. Az ebből a lombikból begyűjtött sejtek 97,3 %-a volt életképes. A kapott sejtszuszpenzióból 9,7 lefagyasztható sejtszuszpenziót tudtunk előállítani, melyek csövenként 2 x 10⁶ sejtet tar• 9

- 89 talmaztak. A sejtszuszpenziókat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és a csöveket a MT27L-662-89-jelzéssel láttuk el.

A fagyasztott sejtszuszpenziókból fölélesztett sejtek vizsgálata

Életképesség- és mikoplazma-vizsgálat

Felolvasztottunk egy TM27L-662-35-jélű sejtszuszpenziót, és a sejteket aMEM-közegben felélesztettük. A sejtek életképességét trypan blue festéssel 88 %-osnak találtuk. A felolvasztott sejtszuszpenzióból konfluens tenyészetet állítottunk elő, és azt megvizsgáltuk mikoplazmaszennyezés vonatkozásában, a Bionique Testing Laboratories cég által forgalmazott reagenskészlet alkalmazásával. A vizsgálat során szennyezést nem tudtunk kimutatni. Ezen felül felolvasztottunk egy TM27L-662-89-jélű sejtszuszpenziót is. A sejtek életképessége 93,8 %-nak bizonyult trypán blue festéssel. Ebből a sejtszuszpenzióból is előállítottunk egy konfluens tenyészetet, melyet a fentiek szerint vizsgáltunk mikoplazma-szennyezésre. A vizsgálat szennyezést nem mutatott ki. Mindkét tenyészetet T75 lombikokban expandáltuk, és a tenyészetek felülúszóit humán IgGl-specifikus ELISA-val vizsgáltuk. A TM27L-662-35-klón 3,24 mikrogram/10 sejt/nap mennyiségű ellenanyagot termelt, a TM27L-662-89-klón termelőképessége 2,52 μg/10⁶ sejt/napnak bizonyult. A termelőképességet még egyszer megvizsgáltuk, ekkor a TM27L-662-35 klón 3,03 μg/10^δ sejt/nap mennyiséget, a TM27L-662-89 klón pedig 2,74 μg/10⁶ sejt/nap mennyiséget termelt.

• · ·

- 90 A TM27L-662-35-ellenanyag expresszálása 2 1-es lombik méretben ellenanyag tisztítása céljából

A TM27L-662-35 tenyészetet expandáltuk, hogy elegendő TM27L-ellenanyagot tudjunk előállítani az ellenanyag megtisztításához. A sejteket 2 1-es lombikokban expandáltuk, és kisebb szérumkoncentrációhoz szoktattuk őket (a következő módon: T25 lombik: 10 % szérum —» T75 lombik: 10 % szérum —> 3 x T75 lombik: 5 % szérum —> 3 x 2 1-es lombik:

% szérum) . A 2 1-es tenyészeteket az első napon hoztuk létre és a 2., 5., 7. és 9. napokon friss táptalajt adtunk a tenyészethez (oly módon, hogy a felülúszó térfogatának felét 1 % szérumot tartalmazó friss tápközegre cseréltük). A felülúszóból először a 12. napon vettünk mintát, majd a 14. és 16. napokon. A begyűjtött felülúszó mintákat lecentrifugáltuk, leszűrtük és a tisztítás megkezdéséig -70 °C-on tároltuk.

Az ellenanyag tisztítása protein-A-oszlopon

A TM27L-662-35-tenyészetekből összesen 5,1 1 felülúszót gyűjtöttünk be. Az ellenanyagot egy Prosep-Aoszlopra (protein-A-oszlop) kötöttük fel, majd 0,1 mól/l-es citrátpufferrel eluáltuk, pH 5,0 és 3,0 értékeken. A pH 3,0 eluátumot PBS-sel szemben dializáltuk. A kiindulási anyagban és az eluált frakciókban az ellenanyag mennyiségét humán IgGl/_K-specif ikus ELISA-val határoztuk meg. A pH 3,0 frakció körülbelül 3,9 mg ellenanyagot tartalmazott 25 ml oldatban. A frakciót Centriprep-30 koncentrátor (Amicon) alkalmazásával betöményítettük, és megismételtük a humán

IgGl/_K-specifikus ELISA-t. A TM27L-ellenanyag teljes kitermelt mennyisége körülbelül 3,2 mg volt, 1,6 mg/ml oldatban. A tisztított ellenanyag elsődleges jellemzése

A pH 3,0 és pH 4,0 frakciókból, valamint az NSOsejtekből tisztított TM27-ellenanyagbói körülbelül 2,5-2,5 mg-ot áramlási citometriás vizsgálatnak vetettünk alá. A

HPB-sej tek	festódési	értékei - az	átlagos	csatorna-
fluoreszcia	alapján -	a következőknek	adódtak:	a pH 3,0
frakció értéke 283,46;	a pH 4,0 frakció	értéke	321,98; az
NSO-eredetű	TM27-ellenanyag festódési	értéke	: 506,79.

Jurkat-sejtek esetén egyik vizsgált minta sem adott a háttértől különböző festódési értéket.

2. példa

A CDR-átültetett TM27-ellenanyagok szekvenciái humán vázrégió részletekkel összehasonlítva

TM27 V_s

REI

TM23

WAL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

>R—

REI

TM23

WAL

TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100 •F-L«SYSTLI·

101 GTKLQIT 107

TM23 —E-K

WAL — R-E-K » ·

1· QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM 50

HIL —K-VQA-G-V-Q-GRS-R-S-IA—TFSN—ΜΗ——A—K—-VAV • *·

- 92 ΤΜ27 V_H

NEWM

TM23

HIL

I WGDGNTD YNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV10 0 VFYH«TS«DTTPLR— V—— mj ”T

LSIS—N· Y-GDSV-G-F-ISR-N' 'S-VF-KMN-LQTD—R—-—— 'RTLYMZMN—LRTE - —PD

101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120

NEWM AGCIDV ·ί . ——

HIL XL-AFSF—— VL—*: a HuVHL a 48. pozícióban L-et tartalmaz.

TM27L: a nehéz lánc 48. pozíciójában leucint tartalmaz. TM27I: a nehéz lánc 48. pozíciójában izoleucint tartalmaz TM27.1: FS -» VF (78-79) cserét tartalmaz.

TM27.2: VTML/T -> LSIS/N (67-70/73) cseréket tartalmaz. TM27.3: V —> R (92) cserét tartalmaz.

3. példa

A TM23 Scatchard-analízise

Exp	Kd		Receptor/sej t
617:096	3,27e-8	mól/1	3.04e5
617:115	2.30e-8	mól/1	2,43e5
617:119	2.46e-8	mól/1	2.46e5

Átlag

Kd = 2,52 (± 0,67) e-8 mól/1 Receptor/sejt = 2,64e5 ·« ···» ·· «« »·»· * ·*·

- 93 A ΤΜ27 Scatchard-analízise

Exp Kd

613:78 l,48e-8 mól/1

613:82 1.14e-8 mól/1

Receptor/sej t

3.31e4

2,47e4

Átlag

Kd = 1,31 (± 0,24) e-8 mól/1 Receptor/sejt = 2,89e4

4. példa

A TM27I előállításának vázlata

TM27I (48) előállítása COS/CHQ-sejtekben

CDR-átültetett V-régiót kódoló cDNS-t állítottunk elő termelő HSO-sejtvonalból, a cDNS-t PCR-rel amplifikáltuk, és megszekvenáltuk.

A DNS-fragmenseket pTCSLNeo-vektorba klónoztuk cDNS-konfigurációban.

Az előállított plazmidot pTCSLDHFRTM27_K-vektorral együtt COS- és CHO-sejtekbe kotranszfektáltuk.

A COS-sejtek felülúszójában humán IgGl/_K-specifikus ELISA-val kimutattuk, hogy a plazmid-konstrukciók előállítása sikeres volt.

A CHO-transzfektánsokat szelektáltuk, expandáltuk és klónoztuk. A sejteket egy klónozási lépés után folyékony nitrogénben lefagyasztottuk.

5. példa

A 16G8-cDNS alapján meghatározott aminosav-sorrend nehéz lánc

- 94 • · • ···.

• · · · · • · • ·· • · ·

	10	20	30	40		50
	*	*	*	*		*
TTRAP	RSSHS VISTE	HRPLT MDSRL	NLVFL VLILK	GVQCD	VQLVE	SGGGL
	60	70	80	90		100
	*	*	*	*		*
VQPGG	SRKLS CAASG	FTFSN FGMHW	VRQAP DKGLE	WVAYI	SSGSS	TIYYA
	110	120	130	140		150
	*	*	*	*		*
DTLKG	RFTIS RDNPK	NTLFL QMTSL	RSEDT AMYYC	ARRGE	GAMDY	WGQGT

160 170 * *

SVTVS SAKTT PPSVY PLAPG könnyű lánc

	10	20	30	40	50
	•	*	*	*	*
ISQGT	KFKYT MDFQV	QIFSF LLISI	SWMS RGENV	LTQSP AIMSA	SLGEK
	60	70	80	90	100
	*	*	*	*	*
VTMSC	RASSS VNYIY	WYQQK SDASP	KLWIY YTSNL	APGVP TRFSG	SGSGN
	110	120	130	140	150
	*	*	*	*	*
SYSLT	ISSME GEDAA	TYYCQ QFTSS	PFTFG SGTKL	EIKRA DAAPT	VSIFP

153 *

PSS

A fehérjeszekvenálással kapott eredmény:

• ·

- 95 Η = DVQLVE7GGGLVQPG

L = ENVLTQ.

6. példa

A TM29-ellenanyag előállításának vázlataű

Hibridómákat állítottunk elő lényegében az 1. példában leírtak szerint, és cDNS-t izoláltunk (lásd 5. példa) .

Az izolált cDNS-eket (H és _K, a 16G8-hibridómából)

M13-vektorokba klónoztuk.

A humán vázrégiót (VH_K0L/Vk_REi) mutagenezissel juttattuk be.

A CDR-átültetett V-régiókat mielóma expressziós vektorokba klónoztuk.

Az NSO-transzfektánsokból elsődleges jellemzés céljából humanizált ellenanyagokat (körülbelül 1-1 mg-ot) tisztítottunk.

Négy különböző TM29-ellenanyagot állítottunk elő:

TM29

TM29.1: SS —> AA (23-24) cseréket tartalmaz.

TM29.2: S —> P (75) cserét tartalmaz.

TM29.3: GV/F -> AM/Y (92-93/95) cseréket tartalmaz.

A TM29-ellenanyag előállításának részletes leírása

A humán kappa-lánc konstans régiójának izolálása PCRelj árással

A konstans régiót úgy izoláltuk, hogy PCR-reakciót hajtottunk végre az emésztetlen pSV184DH-Neo/DNS-V_KC_K• ·

- 96 plazmid (pSVHuK-plazmid, ami tartalmazza a humán kappa-lánc konstans régóját) és két láncindító (egy előre és egy vissza) alkalmazásával. A láncindító oligonukleotidokat az Operon cégtől szereztük be. A PCR-reakcióhoz a GeneAmp DNS-amplifikációs reagenskészletet és AmpliTaq polimerázt használtunk (Perkin-Elmer Cetus). A PCR-reakciókat három különböző magnézium koncentrációt használva hajtottuk végre. A PCR-termékekből mintát vettünk, és a mintákat 1 %-os agarózgélben analizáltuk. Az első mintából származó PCRterméket választottuk (Mg²⁺-koncentráció: 1,5 mmól/1). A Crégiót szegélyező szekvenciákkal hibridizálódó láncindítókat úgy terveztük, hogy a klónozás megkönnyítése céljából restrikciós hasítóhelyeket is tartalmazzanak. Az amplifikált DNS-t megemésztettük EcoRI-enzimmel (a 3'végén). A PCR-termék 5’-végén található hasítóhelyet (PvuII) nem emésztettük meg. A megemésztett DNS-fragmenst 1 % agarózgélben megfuttattuk, és a 300 bázispáros fragmenst kivágtuk. A DNS-t a gélből kivontuk, és az izolált DNS-ből egy kis mintát 1 %-os agarózgélben megvizsgáltunk, minőségellenőrzés és mennyiségbecslés céljából. A 300 bázispáros csík tisztának látszott, és a DNS teljes mennyiségét körülbelül 140 ng-nak becsültük.

A humán kappa-lánc konstans régiójának klónozása pBS-KS⁺vektorba, és szekvenálása

A humán kappa-lánc konstans régióját kódoló EcoRIel emésztett DNS-fragmenst beinszertáltuk a pBS-KS⁺vektorba, melyet előzőleg Smal- és EcoRI-enzimekkel emésztettünk, T4-DNS-ligáz alkalmazásával. A ligációs eleggyel ····

- 97 kompetens Escherichia coli DH5a-sejteket transzformáltunk. Különálló kiónokat vettünk fel, és 24 folyadéktenyészetet oltottunk le velük. Valamennyi tenyészetből DNS-t izoláltunk. Az izolált DNS-mintákat PvuII (a C_K régió 5’-vége) és EcoRI (a C_K régió 3’-vége) restrikciós enzimekkel megemésztettük, és 2 %-os agarózgélben analizáltuk. Mivel a kisméretű DNS-t tartalmazó csíkok (300 bp) a gélben nem váltak szét megfelelőképpen, az emésztést megismételtük kizárólag PvuII-enzimmel. Ezután 2 %-os agarózgélben végzett vizsgálattal megállapítottuk, hogy a 24 klónból 19 tartalmazta a

C_K inszertet. A 19 megfelelő plazmidból az 1-5. számúakat kiválasztottuk szekvenálás céljára, és a szekvenálást T7és T3-láncindítók (az inszertet szegélyező vektorszekvenciákkal hibridizálódnak) hajtottuk végre. A szekvenáláshoz használt többi reagens a Sequenase Version 2.0 reagenskészlet tartozéka volt (USB). Az 5-ös számú minta a humán kappa-lánc konstans régió pontos szekvenciáját tartalmazta .

A humán kappa-lánc konstans régiójának klónozása a pTCSLDHFR*-jélű emlős expressziós vektorba - a pTCSLCKDHFR*-vektor előállítása

A humán kappa-lánc konstans régióját a pBS-KS⁺vektorból (5-ös számú minta) izoláltuk, PvuII- és EcoRIrestrikciós enzimes emésztés útján. A már korábban leírt fragmens szeparálási probléma miatt végre kellett hajtani egy második emésztést is a pBS/humán-C_K-konstrukción. A második emésztés alkalmával EcoRI- és Xbal-enzimet alkalmaztunk (a Xbal-hasítóhely a PvuII-hasítóhelytől 5'-irányban

- 98 található), és így egy körülbelül 300 bázispáros fragmenst kaptunk. Ezt a fragmenst gélből izoláltuk, majd PvuIIenzimmel megemésztettük, eltávolítva ily módon a C_K-lánc 5'-végén megmaradt rövid vektoreredetű fragmenst. A lerövidített C_K-fragmenst gélből tisztítottuk és 1 %-os agarózgélben megfuttattuk, minőségellenőrzés és mennyiségbecslés céljából. A C_K-DNS egy tiszta csíkot adott körülbelül 280 bázispárnál, az izolált fragmens teljes mennyiségét körülbelül 135 ng-ra becsültük.

Mivel a pTCSLDHFR*-vektorban három EcoRI-hasítóhely található, úgy döntöttünk, hogy a klónozást kizárólag a PvuII-hasítóhely felhasználásával hajtjuk végre. Mivel a C_K-DNS-f ragmenst PvuII/EcoRI-emésztéssel állítottuk elő, az EcoRI-véget Klenow-enzim alkalmazásával tompavégűvé töltöttük fel. A feltöltött tompavégű C_K DNS-fragmenst az előzetesen PvuII-enzimemmel emésztett és foszfatázozott pTCSLDHFR*-vektorba ligáltuk (a foszfatázozást borjúbél foszfatázzal végeztük). A ligációs eleggyel kompetens Escherichia coli DH5a-sejteket transzformáltunk. Ezután különálló transzformáns kiónokat vettünk fel, és ezekkel 24 folyadéktenyészetet oltottunk le. Valamennyi tenyészetből DNS-t izoláltunk. Az izolált plazmidokat PvuII- és HindlIIenzimekkel megemésztettük, és 1 %-os agarózgélben analizáltuk. Megállapítottuk, hogy a 24 izolált plazmid közül öt tartalmazta a C_K-inszertet a megfelelő orientációban. A további klónozási lépésekhez a 7-es számú mintát választottuk ki.

- 99 A mutáns DHFR*-gén cseréje vad típusú DHFR-génre

A pTCSLC_KDHFR*-vektor CHO (dhfr) -DUX-Bll-sej tekben történő expresszálása céljából a vektorban a DHFR*-gént kicseréltük a vad típusú DHFR-génre. A pTCSLC_KDHFR*-plazmidot (7-es számú minta), valamint a pSV2-DHFR-plazmidot (beszerezve Dr. Paul Berg-től, Department of Biochemistry, Stanford University Medical School) megemésztettük HindlIIés BglII-enzimekkel, a megfelelő génfragmensek izolálása céljából. Megállapítottuk, hogy a pTCSLC_KDHFR*-vektorban található addicionális BglII-hasítóhely következtében eltávolítódott a poli(A)-szignál egy részlete is, ami károsan befolyásolná a vektor működését. Az emésztéseket ezért megismételtük Hindin- és BamHI-enzimek alkalmazásával. A vektor (DHFR*) pTCSLC_K-részletét foszfatázzal kezeltük. Ezután az izolált fragmenseket (pTCSLC_K és DHFR) gélből tisztítottuk, majd a tisztított fragmenseket 1 %-os agarózgélben megfuttattuk, minőségellenőrzés és mennyiségbecslés céljából. Mindkét DNS-csík tisztának tűnt, és koncentrációjukat hasonlóképpen körülbelül 40-50 ng/ml-re becsültük. A DHFRgént ezután a pTCSLC_K-vektorba ligáltuk T4-DNS-ligáz alkalmazásával. A ligációs eleggyel kompetens Escherichia coli DH5oc-sej teket transzformáltunk. Ezután különálló transzformáns kiónokat vettünk fel, és ezekkel 24 folyadéktenyészetet oltottunk le. Valamennyi tenyészetből DNS-t izoláltunk. Az izolált plazmidokat Hindin- és BamHIenzimekkel végzett restrikciós emésztéssel analizáltuk. 24 tenyészetből 23 a megfelelő csíkokat adta az emésztés után, ami igazolta, hogy a DHFR-gén beinszertálódott a pTCSLC_K• ·

-100vektorba. További felhasználásra a 22-es számú kiónt választottuk ki.

A PCR-el előállított humán kappa-lánc V-régió klónozása a

PTCSLCkDHFR-jélű CHQ-vektorba

A 16G8-izolátumból előállított kappa-lánc V-régió

C-DNS-t gélből tisztítottuk és a megfelelő restrikciós enzimekkel megemésztettük. A DNS-minta egy kis részletét 1 %os agarózgélben megfuttattuk minőségellenőrzést és mennyiségbecslés céljából. Találtunk egy extra (szennyező) csíkot, amely körülbelül 800 bázispáros volt, a DNSkoncentrációt 1,25 ng/ml-re becsültük. A V-régiót kódoló DNS-fragmenst beligáltuk a pTCSLC_KDHFR-vektorba, melyet előzőleg Xhol- és PvuII-restrikciós enzimekkel megemésztettünk, és foszfatázzal kezeltünk. A ligációs eleggyel kompetens Escherichia coli DH5a-sejteket transzformáltunk. Nagyon kevés transzformáns kiónt kaptunk. Különálló transzformáns kiónokat felvettünk és velük 12 folyadéktenyészetet oltottunk le. Valamennyi tenyészetből DNS-t izoláltunk, az izolált plazmidokat megemésztettük Xhol- és PvuII-enzimekkel, és 1 %-os agarózgélben analizáltuk. Négy pozitív mintát találtunk: az l-es, 4-es, 7-es és 10-es számúakat. Valamennyi pozitív mintát megszekvenáltuk. A PCRrel izolált TM29-gamma-lánc-V-régiót a pTCSLCglNeoApa-j élű

CHO-vektorba klónoztuk.

A humán kappa-lánc V-régiójának szekvenálása mindkét szálon A 16G8-izolátumból származó mind a négy mintát (1es, 4-es, 7-es és 10-es számúakat) mindkét szálukon megszekvenáltuk. A vissza szálat teljes mértékben « · « ····

-101megszekvenáltuk, a restrikciós hasítóhelyeken keresztül (3' —» 5'; PvuII-XhoI), a HUCK5PR-jelű láncindító alkalmazásával. Az 1-es és 4-es számú izolátum szekvenciája pontosnak tűnt, a 7-es számú minta nem szekvenálódott meg, a 10-es számú minta pedig rossz szekvenciát tartalmazott. Az 1-es és 4-es számú minták esetén az előre szálat két különböző láncindító alkalmazásával szekvenáltuk meg: a pTCSFOR és a PTCSFWD alkalmazásával. Meghatároztuk a teljes hosszúságú szekvenciát a restrikciós hasítóhelyeken keresztül (5' —> 3’; XhoI-PvuII) oly módon, hogy a két láncindító segítségével meghatározott szekvenciarészleteket kombináltuk. Az előre szálon találtunk egy rövid kompressziós szakaszt, melyet nem sikerült feloldanunk semelyik láncindítóval sem, sem pedig a kompressziók feloldására általánosan használt eljárások alkalmazásával. A vissza láncok szekvenciája azonban ezen a szakaszon is pontosan bizonyult. Mind az 1es, mind a 4-es számú minta a helyes szekvenciát tartalmazta, emlős sejtek transzfektálására a 4-es számú mintát választottuk ki.

A TM29 könnyű és nehéz lánc plazmidok kotranszfektálására COS- és CHO-sejtekbe

A TM29 nehéz és könnyű láncokat tartalmazó plazmidokkal COS-1- és CHO (dhf r) DUX-Bll-sej teket transzformáltunk. A CHO-DUX-Bll-sejtvonalat a Biogen Inc. cégtől szereztük be, a sejtvonalat eredetileg Dr. Lawrence Chaisin (Columba University) állította elő.

A COS-l-sejtek transzfektálása céljából mindkét emésztetlen

TM29-plazmidból (pTCSLHuV_Kl 6GC_KDHFR és «··« ··

-102pTCSLHuV_Hl6GC_KlNeoApa ; sorrendben TM29-4 és TM29-26) 5-5 mg-ot etanollal kicsaptunk, majd az üledéket vízben feloldottuk, 1 mg/ml töménységben. A plazmidokkal ezután 3,8 x 10⁶ sejtet kotranszfektáltunk elektroporációval, a BioRad által gyártott Gene Pulser alkalmazásával, 250 V és 960 mFD érték beállításával. A transzfektált sejteket Dulbeccoféle módosított Eagle-táptalajban (DMEM) felszuszpendáltuk, és három napig tenyésztettük őket. A TM29-plazmidokhoz hasonlóan előállítottunk kontrol-vektor plazmidokat is (pTCSLCHFRApa és pTCSLNeoApa ) és azokkal hasonlóképpen COS-l-sejteket kotranszfektáltunk. A kapott transzfektált sejteket felszuszpendáltuk, és a TM29-el transzfektált COSsejtekhez hasonlóan tenyésztettük.

A CHO-DUX-Bll-sejtek transzfektálásához mindkét TM29-plazmidból (mint fent) 5-5 mg-ot megemésztettünk AatlI restrikciós enzimmel, és az így előállított lineáris DNSfragmenseket etanollal kicsaptuk, és vízben feloldottuk 1 mg/ml koncentrációban. A plazmidokat ezután elektroporáció útján 5 x 10⁶-sejtbe kotranszfektáltuk, mint fent. A transzfektált sejteket a Minimál Essential médiumtápközegben (aMEM) felszuszpendáltuk, a táptalaj ki volt egészítve timidinnel, adenozinnal és dezoxi-adenozinnal (nem szelektív táptalaj) és a sejteket három napig tenyésztettük. Előállítottunk kontroll-vektorplazmidokat is (mint fent) és azokat a TM29-plazmidokhoz hasonlóan CHO-DUX-B11sejtekbe kotranszfektáltuk. A kapott transzfektáns sejteket a TM29-el transzfektált CHO-sejtekhez hasonlóan felszuszpendáltuk és tenyésztettük.

• · · · • ·

-103Α ΤΜ29-transzfektált COS-sejtek felülúszójának analízise humán IgGl_K-specif ikus ELISA-val

Három nap tenyésztés után a TM29-transzfektált COSsejtek konfluensnek tűntek. A felülúszót tehát begyűjtöttük, a sejteket pedig megsemmisítettük. A sejtek humán IgGtermelését a tenyészet felülúszójából határoztuk meg, humán IgGl_K-specif ikus ELISA alkalmazásával. A felülúszóban található IgG-t egy 96 mélyületű tálcára felvitt antihumán IgGl-Fc-ellenanyaggal kötöttük meg, majd a kimutatást tormaperoxidázzal konjugált kecskében termeltetett antihumán Ig_K-ellenanyaggal, és o-fenilin-diamin (OPD) szubsztráttal hajtottuk végre. A felülúszó IgGkoncentrációját úgy határoztuk meg, hogy a mért optikai denzitás értéket ismert koncentrációjú tisztított humán IgGl_K-ellenanyaggal felvett kalibrációs görbével vetettük össze. A TM29-transzfektált COS-sejtek felülúszója 201,3 ng/ml humán IgG-t tartalmazott. A kontroll-DNS-sel transzfektált COS-sejtek felülúszója 0 ng/ml IgG-t tartalmazott .

A TM29-transzfektált CHQ-sejtek szelektálása

Három nap tenyésztés után a TM29-transzfektált CHOsejtek konfluensnek tűntek. A sejteket ezért 0,25 % tripszinnel kezeltük (Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban), hogy ledisszociáltassuk őket a tenyésztő lombikokról. A sejteket ezután begyűjtöttük, lecentrifugáltuk és a felülúszót eltávolítottuk. A sejteket tartalmazó üledéket aMEM szelekciós táptalajban felszuszpendáltuk, a szuszpenzió koncentrációja 2 x 10⁵ sejt/ml volt, majd a sejteket 24

-104mélyületű tálcára széleztettük, mélyületenként 1 ml sejtszuszpenzió hozzáadásával. Az alkalmazott otMEM szelekciós táptalaj egyidejűleg két markerre szelektált, mivel kiegészítőket nem tartalmazott, és FBS helyett dializált FBS volt benne, ezért a tápközeg alkalmas volt a pTCSLHuV_Kl 6GC_KDHFR-plazmidon található DHFR⁺-génre történő szelekcióra, és az alkalmazott tápközeg tartalmazott geneticin (G-418) antibiotikumot, ami lehetővé tette a pTCLHuV_Hl 6GC_KlNeoApa -plazmidon található neo^r-génre történő szelekciót.

A TM29~transzfektált CHO-sejtek felülúszójának analízise humán IgGl_K-specifikus ELISA-val és áramlási citometriával

Tizennégy nap szelekciós tápközegben végzett tenyésztés után a TM29-transzfektált CHO-sejtek felülúszóit valamennyi mélyületből begyűjtöttük, és a felülúszókat humán IgGl_K-specifikus ELISA-val vizsgáltuk. A TM29transzfektált CHO-sejtek felülúszóiban a humán IgGkoncentrációja 144,6 ng/ml és 291,9 ng/m között változott, az átlagos koncentráció 240,5 ng/ml volt. A kontroll-DNSsel transzfektált CHO-sejtek felülúszóiban 0 ng/ml humán IgG-t találtunk.

A három legjobban termelő mélyületből (2C3, 2C4, 2B6) származó TM29-transzfektált CHO-sejtfelülúszókat és egy kontroll-DNS-sel transzfektált CHO-sejtfelülúszót (3D4) áramlási citometriával is megvizsgáltuk. A három TM39izolátum (2C3, 2C4 és 2B6) a Jurkat-sejteket pozitívan festette (az átlagos csatornafluoreszcencia 186,61 és 291,01 között változott), de a HPB-sejteket nem festette meg (az

-105átlagos csatornafluoreszcencia 11,77 és 13,82 között változott) . A kontroli-minta (3D4) nem festette meg a Jurkatsejteket pozitívan (átlagos csatornafluoreszcencia 11,96).

A TM29-transzfektált CHO-sejtek klónozása határhígítással

A TM29-transzfektált CHO-sejtek esetén a három legjobban termelő mélyületből (2C3: 291,9 ng/ml; 2C4: 289,2 ng/ml; 2B6: 289,5 ng/ml) származó sejteket választottuk ki határhígításos klónozás céljára. Mindhárom mélyület esetén az előállított sejtszuszpenziót aMEM szelekciós tápközeggel hígítottuk, majd a szuszpenziókat 96 mélyületű tálcákra széleztettük, 2 sejt/mélyület, 1 sejt/mélyület és 0,5 sejt/mélyület koncentrációt alkalmazva. 10 nappal a klónozás után a 0,5 sejt/mélyület koncentrációt tartalmazó tálcák sok mélyületében sejtnövekedést tapasztaltunk, mindhárom kiindulási izolátum esetén (2C3, 2C4 és 2B6). A 0,5 sejt/mélyület koncentrációjú tenyésztőlemezek mélyületeiből származó felülúszókat tehát begyűjtöttük, és azokat humán IgGl_K-specifikus ELISA-val megvizsgáltuk. Valamennyi mélyületből származó felülúszó, amelyben sejtnövekedést tapasztaltunk, pozitívnak bizonyult az ELISA-ban. A legjobban termelő mélyületek közül összesen 24-et (a 2C3 izolátum esetén 10-et, a 2B6 izolátum esetén 14-et) kiválasztottunk, és az izolált sejteket 24 mélyületű tálcákban expandáltuk, majd a sejteket konfluenciáig növesztettük. Ezután a felülúszókat valamennyi mélyületből begyűjtöttük, és humán IgGl_K-specif ikus ELISA-val vizsgáltuk őket. A felülúszók humán IgG-koncentrációja 0,7 mg/ml és 4,8 mg/ml között változott, az átlagos koncentráció 2,9 mg/ml volt. Ezután ki• · • · ·

-106választottuk a hat legjobban termelő TM29-transzfektált CHO-klónt tartalmazó mélyületet (1C7, 1D9, 1G2, 2G1, 2G10, 2H2a), és a kiválasztott kiónokat áramlási citometriával megvizsgáltuk. Mind a hat minta pozitívan festette a Jurkat-sejteket (az átlagos csatornafluoreszcencia 313,68 és 356,87 között változott), a HPB-sejteket azonban nem festették pozitívan a minták (az átlagos csatornafluoreszcencia 7,59 és 8,16 között változott). Mind a hat mintát 25 cm²-es lombikban expandáltuk, majd a sejteket lefagyasztottuk és folyékony nitrogénben tároltuk. Szubklónozás céljára a három legjobban termelő mélyületben (2C2-1G2, 2C3-2G10, 2C3-2H2a) található kiónokat választottuk ki.

A kontroll-DNS-sel transzfektált CHO-sejteket tartalmazó mélyületből (3D4) származó sejteket is határhígításos klónozásnak vetettük alá, a TM29-sejtekhez hasonlóan. Amennyiben a sejtkoncentrációt a kívántnál 10-szer jobban meghígítottuk, 10 nappal a klónozás után sem tapasztaltunk sejtnövekedést. Ezért egy friss tenyészetet indítottunk egy lefagyasztott csőből (3D4). Ebből az új tenyészetből kiindulva megismételtük a határhigításos klónozást. A klónozás után 16 nappal a hat leginkább konfluens mélyületet (1B5, 1C11, 1D6, 2E7, 2F3, 2F9) kiválasztottuk a 0,5 sejt/mélyület koncentrációjú szuszpenzióval szélesztett tálcáról, és a kiválasztott mélyületekben található sejteket 24 mélyületű tálcákban expandáltuk. Ezután valamennyi mélyületben található sejteket 25 cm²-es lombikban expandáltuk, majd 75 cm²-es lombikban, és a sejteket • · ·

-107konfluenciáig növesztettük. A felülúszókat ezután valamenynyi lombikból begyűjtöttük, és humán IgG/K-specifikus ELISA-val megvizsgáltuk azokat. A humán IgG-koncentrációt 0 ng/ml-nek találtuk. A lombikokat azután lefagyasztottuk és folyékony nitrogénben tároltuk.

Klónozatlan TM29-transzfektált CHO-sejttenyészet expandálása 2 1-es lombikban

A 3 legjobban termelő mélyületben található TM29transzfektált CHO-sejteket (2C3: 291,9 ng/ml; 2C4: 289,2 ng/ml; 2B6: 289,5 ng/ml) kiválasztottuk klónozatlan tenyészetként is 25 cm²-es lombikokban történő expandálásra. Ebben az időpontban valamennyi TM29-tenyészetből egy csövet lefagyasztottunk (csakúgy mint a kontroll-DNS-sel transzfektált CHO-sejttenyészetből) és a lefagyasztott sejteket folyékony nitrogénben tároltuk. Valamennyi klónozatlan tenyészetet ezután a 75 cm²-es lombikokban expandáltunk. Ezután minden 75 cm²-es lombikban található tenyészetet három 75 cm²-es lombikban expandáltunk, és ezzel a lépéssel egyidejűleg az αΜΕΜ-tápközeg szérumkoncentrációját 10 %-ról 5 %-ra csökkentettük. A 2C3- és 2B6izolátumokból előállított 75 cm²-es lombikokban található tenyészeteket ezután 2 1-es lombikban expandáltuk. A 2C4izolátumból származó mindhárom 75 cm²-es lombikot lefagyasztottuk, és folyékony nitrogénben tároltuk. Timikor a tenyészeteket átvittük a 2 1-es lombikokba, az αΜΕΜtápközeg szérumkoncentrációját ismét csökkentettük, 5 %-ről 1 %-ra. Kilenc nap tenyésztés után a 2B6 izolátumból származó lombikokban a sejttenyészet konfluensnek tűnt, a 2C3

-108izolátumból előállított lombikokban viszont a tenyészet körülbelül 25 %-ig tűnt konfluensnek. A 2B6 és 2C3 lombikokból a felülúszókat a 9.,14. és 16. napon begyűjtöttük, majd a sejteket megsemmisítettük. Az összegyűjtött felülúszókat lecentrifugáltuk és -20 °C-on tároltuk. Mindhárom begyűjtött felülúszóból (mind a 2B6, mind a 2C3 izolátumok esetén) mintákat vettünk, és azokat humán IgGl_K-specif ikus ELISA-val megvizsgáltuk. A 2B6-izolátumból kiindulva összesen 820 mg humán IgG-t állítottunk elő, a 2C3 izolátumból kiindulva pedig 1923 mg-ot.

A TM29-transzfektált CHO-sejtek szubklónozása határhígítással

A három legjobban termelő mélyületben található TM29-transzfektált CHO-sejtklónokat (2C3-Ig2: 4,8 mg/ml; 2C3-2H2a: 4,1 mg/ml; 2C3-2G10: 4,0 mg/ml) kiválasztottuk határhígításos szubklónozás céljára. Tizennégy nappal a szubklónozás után valamennyi 0,5 sejt/mélyület koncentrációval szélesztett tálca (1G2, 2G10 és 2H2a) számos mélyületében sejtnövekedést tapasztaltunk. A felülúszókat kinyertük azokból a mélyületekből, melyekben sejtnövekedést tapasztaltunk, és a felülúszókat humán IgGl_K-specif ikus ELISA-val vizsgáltuk. Valamennyi mélyület, amelyben sejtnövekedést tapasztaltunk, pozitívnak bizonyult az ELISAvizsgálatban, ami 100 %-os klónozási hatékonyságot jelent. Kiválasztottuk a 24 legjobban termelő mélyületet (kettőt a 2H2a-izolátumból, ötöt a 2G10-izolátumból, tizenhetet az lG2-izolátumból), a kiválasztott mélyületekből származó sejteket 24 mélyületű tálcában expandáltuk, és a sejteket

-109konfluenciáig növesztettük. Valamennyi mélyületből begyűjtöttük a felülúszókat, és humán IgGl_K-specif ikus ELISA-val megvizsgáltuk azokat. A humán IgG-koncentráció 1,2 mg/ml és 9,2 mg/ml között változott, az átlagos koncentráció 4,2 mg/ml volt. A TM29-transzfektált CHO-szubklónok közül kiválasztott négy legjobban termelőt (2G5-, 2H12-,1H6- és 2E9mélyületek) megvizsgáltuk áramlási citometriával is. Mind a négy minta pozitívan festette a Jurkat-sejteket (az átlagos csatornafluoreszcencia 211,51 és 292,45 között volt), a HPB-sejteket viszont nem festették pozitívan a minták (az átlagos csatornafluoreszcencia 8,36 és 8,80 között volt). Mind a négy kiválasztott mintát 25 cm²-es lombikokban expandáltuk.

A TM29 transzfektált CHO-sejtklónok 2. szubklónozása határhlgításos módszerrel

Az ELISA és áramlási citometriás eredmények összevetése alapján legjobban termelő két TM29-transzfektált CHO-sejtklónt kiválasztottuk (2C3-1G2-2G5 és 2C3-1G2-1H6) és belőlük kiindulva egy második szubklónozási lépést hajtottunk végre határhígításos módszerrel. Ebben az időpontban mindkét klón sejtjeiből egy csőre valót lefagyasztottunk (csakúgy mint a 2C3-1G2-2H12- és 2C3-1G2-2E9klónokból), és a lefagyasztott csöveket folyékony nitrogénben tároltuk. A szubklónozás után 12 nappal mind a 2G5-, mind az lH6-izolátum esetén számos mélyületben sejtnövekedést tapasztaltunk a 0,5 sejt/mélyület koncentrációban szélesztett tálcákon. A felülúszókat begyűjtöttük azokból a mélyületekből, melyekben klónképződést tapasztaltunk, és a

-110begyűjtött felülúszókat humán IgGl_K-specifikus ELISA-val vizsgáltuk. Az ELISA-vizsgálat során valamennyi mélyület pozitívnak bizonyult, amelyikben sejtnövekedést tapasztaltunk, ami 100 %-os klónozási hatékonyságot jelent. Kiválasztottuk a 24 legjobban termelő mélyületet (20-at a 2G5izolátumból és 4-et az lH6-izolátumból) , és a kiválasztott mélyületben található sejteket 24 mélyületű tálcában expandáltuk, és a sejteket konfluenciáig növesztettük. Valamenynyi mélyületből begyűjtöttük a felülúszókat és humán IgGlKspecif ikus ELISA-val megvizsgáltuk azokat. Mivel a vizsgálati eljárásban használt IgGl/K-standard aktivitása elveszett, az ismeretlen töménységű minták koncentrációit nem tudtuk meghatározni. A legjobban termelő mélyületeket ezért egyszerűen az OD-értékek alapján határoztuk meg. A hat legjobban termelő mélyületet kiválasztottuk (ötöt a 2G5- és egyet a lH6-izolátumból), és a kiválasztott mélyületekben található sejteket 25 cm²-es lombikokban expandáltuk, majd 75 cm²-es lombikokban, és a sejteket konfluenciáig növesztettük. Valamennyi lombikból begyűjtöttük a felülúszókat, és humán IgGl_K-specifikus ELISA-val vizsgáltuk azokat. A humán IgG-koncentráció 14,6 mg/ml és 21,2 mg/ml között változott. A lombikok átlagos koncentrációja 18,6 mg/ml volt.

A TM29-transzfektált CHO-szubklónokat tartalmazó hat lombikból származó felülúszókat (1B5, 1D1, 1F11, 2B10, 2F5, 2F9) áramlási citometriával is megvizsgáltuk. Mind a hat minta pozitívan festette a Jurkat-sejteket (az átlagos csatornafluoreszcencia 304,51 és 383,00 között változott),

-111• · · · · · ··· · · ··· ·· ·· · · · · ·· ···· · ·· viszont a HPB-sejteket nem festették a minták pozitívan (az átlagos csatornafluoreszcencia 8,67 és 10,25 között volt). Fagyasztott sejtszuszpenzió készítése a TM29-transzfektált

CHO-sej tklónból

Fagyasztott sejtszuszpenziók készítéséhez a TM29transzfektált CHO-sejtklónok közül a 2C3-lG2-lH6-2F5-jelűt választottuk ki. Ezt a kiónt egy 75 cm²-es lombikból öt 225 cm²-es lombikba expandáltuk, a további kutatási célokra elegendő mennyiségű sejtet tartalmazó fagyasztott sejtszuszpenzió készítése céljából. A fagyasztott sejtbankot a SOP TMB1-001.00 leírás szerint készítettük. A sejteket tripszinnel kezeltük, majd valamennyi lombikból begyűjtöttük a sejteket és egyesítettük őket. Az egyesített sejtszuszpenzió 3,2 x 10® sejtet tartalmazott, 99 %-os életképességgel. A sejtszuszpenziót 72 fagyasztócsőbe osztottuk szét, valamennyi cső 2 χ 10⁶ sejtet tartalmazott 1 ml térfogatban. Valamennyi csövet, amely ennek a .kiónnak a sejtjeit tartalmazta, TM29-646-132 jelzéssel láttunk el.

7. példa

A CDR-átültetett TM29-ellenanyagok szekvenciái egyéb vázrégiókkal összehasonlítva

TM29 V_K

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50 REI I—Q—QDXIKYUt-- I- ' -EA

15G8 ENVL—AIM““L“EK“—MS·-· KSDASW·»

HlC E-VL^{7 * * * 11} —GT—L- P-ÉRA-LS—Q—SimA—K—Q—R—G A • · ·

-11251 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

REI —QA··— - YQ-L-YHIC -SR-T-I-P—— F-L—R—E-_—F—V¹ ' YG—W—

101 TKLQIT

16G8 —E-K HIC —VE-K

106

TM29 VH

EVQLVESGGCWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50 KOL Q·'···'' ..11-,....-11-11. I—SYA-Y-—'·-' I

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100 •NB——S—Y—S—A—A—YY— —

WEA	-ggsg—-	—»S'
101	EGAM
KOL	GHGFCSSASCFGP
16G8	—
WEA	WLL

TM29: az első változat szerinti szekvenciát tartalmazza

TM29.1:SS -> AA (23-24) cseréket tartalmaz TM29.2: S —> P (75) cserét tartalmaz.

TM29.3:GV/F -> AM/Y (92-93/95) cseréket tartalmaz.

8. példa

A TM29-mAb Scatchard-analízise

Három független kísérletben Scatchard-analízist hajtottunk végre a TM29- és 16G8-ellenanyagok alkalmazása-113val. Az alábbi táblázat mutatja a különböző kísérletekben meghatározott K_d-értékeket.

Exp.	TM2 9	Kd	(mól/1)	16G8	Kd	(mól/1)
1	1,45	X	10~9	2,86	X	io~9
2	1, 65	X	10'9	2,65	X	10'9
3	1,15	X	10'9	2,44	X	10'9
Átlag	1,42	x	10'9	2,65	X	10‘9

9. példa

A TM29-kiméraellenanyag előállításának vázlata

Kimérák készítése COS- és CHO-sejtekben:

A V(D)J-régiót kódoló cDNS-eket CHO-sejtekben működő expressziós vektorokba klónoztuk, a pTCSLNeo(H)- és a pTCSLDHFR(k)-plazmidokba, cDNS-konfigurációban.

Az expressziós plazmidokat kotranszfektáltuk COSés CHO-sejtekbe.

A COS-sejtek felülúszóiban az Ab-koncentráció körülbelül 35 ng/ml volt.

A transzfektáns CHO-sejteket analizáltuk (FACS és ELISA alkalmazásával), egyszer megklónoztuk őket, majd a sejteket MTX alkalmazásával amplifikáltuk (20 nmól/1, 100 nmól/1 és 500 nmól/1).

Az amplifikálatlan CHO-sejtklónokban az ellenanyagkoncentráció körülbelül 3 pg/ml volt, és az ellenanyagok pozitívan festették a Jurkat-sejteket. Az amplifikálatlan kiónokat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk .

• « • · ·

-11410. példa

A kiméra 16G8-ellenanyag expresszálása COS- és CHOsej tekben

A 16G8-kimérára vonatkozó kísérleti adatok

A könnyű lánc és nehéz lánc konstrukciók a teljes egéreredetű V-régiót tartalmazták, humán konstans régiókkal· együtt, ugyanazon expressziós vektorokban, melyeket a CDRátültetett konstrukciókhoz használtunk: pTCSDHFR és pTCSNeo, a konstrukciók kétszeresen szelektálhatok voltak. COS-sejt transzfektánsok - körülbelül 35 ng/ml

CHO-sejt transzfektánsok - 16 pozitív mélyület/54 mélyület

1A1	ng/ml 151.6
1A6	166.6
1B3	107.2
1B6	179.6
1D2	101.0
1D5	215.1
2A4	199.8
2B1	184.5
2B2	213.8
2B4	130.6
2C2	119.6
2C6	214.4
2D3	216.6
2D6	139.7
3A1	198.7
3A2	172.2

térfogatra korrigál

2.2 gg/ml

2.1 gg/ml

2.1 gg/ml

2.2 gg/ml • · « · · · • ··· · · ··· ····· ···· ·· ·· ···· · ··

-115_f 2 valamennyi vizsgált melyületet 25 cm -es lombikokban expandáltunk.

A * magyarázata: áramlási citometriás vizsgálatot is végeztünk .

11. példa

A TM29-ellenanyag előállításának vázlata

TM29 előállítása COS/CHO-sejtekben:

A CDR-átültetett V-régiókról NSO-termelőtörzsből cDNS-t készítettünk, a cDNS-t PCR-rel amplifikáltuk, és megszekvenáltuk.

A DNS-fragmenseket pTCSLNeo(H)- és pTCSLDHFR(k) vektorokba klónoztuk, cDNS-konfigurációkban.

A plazmidokat ezután COS- és CHO-sejtekbe kotranszfektáltuk.

A COS-sejtek felülúszói körülbelül 2 pg/ml ellenanyagot tartalmaztak.

A CHO-transzfektánsok körülbelül 3 pg/ml ellenanyagot termeltek klónozás és amplifikáció előtt, a felülúszó a Jurkat-sejteket pozitívan festette. A legjobban termelő amplifikálatlan klónból három klónozási ciklus után sejtbankot hoztunk létre.

A CHO-sejtvonalakat különböző koncentrációjú MTXalkalmazásával amplifikáltuk.

• ··<

··

-116»**

12. példa

A TM27L-, TM27I- és TM23~ellenanyagok összehasonlítása kompetíciós vizsgálati eljárással 4Hll-FITC-ellenanyag alkalmazásával

1. kísérlet:

TM23-meredekség = 1,56

TM27L-meredekség

TM23-meredekség = 2,04

TM2 71-meredekség

2. kísérlet:

TM23-meredekség = 182

TM27L-meredekség

TM23-meredekség = 2,44

TM2 71-meredekség

A TM23-hoz viszonyítva a TM27L-re és TM27l-re vonatkozó értékek mind több mind háromszorosak.

13. példa

A TM27-ellenanyag amplifikálása methotrexate alkalmazásával

Termelőképesség (mikrogramm/10⁶ sejt/nap)

Methotrexate-koncentráció (nmól/1)

	0	20	100	10-200	20-200
*7/30	27	na	na	na	265.8
*7/22	3.5	na	19.2	14.7	34.2
7/6	2.6	na	na	9.1	na
6/25	2	4.8	4.5	na	na
6/18	3	8,9	na	na	na

♦ ·

-117-

H9	*7/30	22.7	na	na	na	181.9
	*7/22	3.9	na	9.4	11.6	34.4
	6/25	1.5	1.8	4.7	3.6	na
	6/18	1.8	1.5	na	na	na

Α * magyarázata nincs összehasonlító adat.

Vizsgálati eljáráson	belüli	relatív	értékek
	0	20	100	20-100	20-200
C7 *7/30	1	na	na	na	9.8
*7/22	1	na	5.5	4.2	9.8
7/6	1	na	na	3.5	na
6/25	1	2.4	2.3	na	na
6/18	1	3.0	na	na	na

H9	*7/30	1	na	na	na	8.0
	*7/22	1	na	2.4	3.0	8.8
	6/25	1	1.2	3.1	2.4	na
	6/18	1	0.8	na	na	na

Státusz:

		0	20	100	20-100	20-200
C7	8/11	fm	fm,s,sf4	fm	fm	fm, s*
H9	8/11	fm	megsemmisítve	fm, s,f2	fm	fm, s*

rövidítések magyarázata:

fm = egy cső kevert tenyészet lefagyasztva; s = egy szubklónozás határhígítással; s* = az első határhigításos klónozása folyamatban; f# = a megfelelő számú mélyületből egy-egy cső lefagyasztva.

- 118 SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 106 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Asn Tyr He 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Alá Pro Lys Leu Leu He Tyr 35 40 45

Tyr Thr Ser Asn Leu Alá Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr De Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80

Asp He Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Thr Ser Ser Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin De Thr 100 105 A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

- 119 MOLEKULATÍPUS: prctein

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp üe Gta Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly 15 10 Β

Asp Ara Val Thr üe Thr Cys Ser Alá Ser Gin Gly He Ser Asn Tyr

25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Alá Pro Lys Leu Leu Ile

40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 «Ο

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr De Ser Ser Leu Gin Pro

70 75 80

Glu Asp ne Alá Thr T>t Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Arg 85 ^{90 95}

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin Ile Thr 100 Ι⁰⁵

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: prctein

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val CHn Pro Gly Arg ¹⁵ 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30

- 120 Gly Met His Trp Vil Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

40 45

Alá Tyr De Ser Ser Gly Ser Ser Thr De Tyr Tyr Alá Asp Thr Leu 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr De Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Alá Arg Arg Gly Glu Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Pro 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Alá Tyr 20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met De Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Leu Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Alá Alá Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá 85 90 95

Arg Asp Arg Val Thr Alá Thr Leu Tyr Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 • · ··

- 121 AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Alá Tyr 20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met De Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Leu Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Alá Alá Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá 85 90 95

Arg Asp Arg Val Thr Alá Thr Leu Tyr Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris ·· ··

• · · · · ·

- 122 MOLEKULATÍPUS: protein

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser G!y Phe Ser Leu Thr Ala Tyr 20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp De 35 40 45

Gly Met De Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Leu Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Arg Val Thr Ala Thr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein • · · · • ·

- 123 A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Alá Tyr 20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Leu Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val Phe Leu 65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Alá Alá Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Ab 85 90 95

Arg Asp Arg Val Thr Ab Thr Leu Tyr Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: prorein

- 124 A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Gin Ghi Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pbc Ser Leu Thr Alá Tyr 20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser De Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Alá Alá Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá 85 90 95

Arg Asp Arg Val Thr Alá Thr Leu Tyr Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATiPUS: protein

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Alá Tyr 20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met De Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Leu Lys 50 55 60

- 125 Ser Arg Val Thr Met Leu Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu

70 75 80

Arc Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala ⁸ 85 90 95

Arg Asp Arg Val Thr Ala Thr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 45 bázispér

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATATGCGGCC GCTCATTTAC CCGGAGTCCG GGAGAAGCTC TTAGT 45

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 45 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATATGCGGCC GCTTAACACT CATTCCTGTT GAAGCTCTTG ACAAT 45 • ·

- 126 A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACATTGATG TCTTTGGGGT AGAAGTTGTT 30

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT Í PUS: cDNS

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTCACTGGC TCAGGGAAAT AACCCTTGAC 30

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS • · • ·

- 127 A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG 22

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 34 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CCAG 34

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT Í PUS: cDNS

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACATCCAGC TGACCCAGTC TCCA 24

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

- 128 TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTTAGATCTC CAGCTTGGTC CC 22

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCGAGGAAGT TTACTATACT G 21

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT Í PUS: cDNS

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGTATAGTA AACTTCCTCG G 21

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 49 bázispár ·«·

- 129 TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGACATCGAT GATATCGAAT TCGCGGCCGC CAGCTGGGGC CCTCTAGAC 49

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 49 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGAGTCTAGA GGGCCCCAGC TGGCGGCCGC GAATTCGATA TCATCGATG 49

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 53 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TGGCTGTCTC ACCCAGTTTA CACCATAGGC GGTTAATGAG AAGCCAGACA CGG 53 • · ·· · ·

- 130 A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 95 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TGCTGGTGTC CTTTCAGCAT TGTCACTCTG GATTTGAGAG CTGAATTATA 50

GTCTGTATTT CCATCACCCC ATATCATTCC AAKCCACTCA AGACC 95

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 55 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCAGTAGTCC ATAGCATAGA GGGTAGCCGT AACCCTATCT CTTGCACAAT 50

AATAG 55

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 60 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris • · ··

- 131 MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTGCTTGGT ACCAGTTTAA ATAATTGCTA ATGCCCTGAC TTGCACTACA 50

GGTGATGGTC 60

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 51 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT Í PUS: cDNS

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTGCTTGGC ACACCTGAGT GTAAACTTGA TGTGTAGTAG ATCAGCAGCT T 51

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 49 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCTTGGCCG AACGTCCGAG GAAGTTTACT ATACTGCTGG CAGTAGTAG 49

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 46 bázispár

- 132 TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGGGAAGACC GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACC 46

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 45 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGATTTCAGC TGCTCATCAG ATGGCGGGAA GATGAAGACA GATGG 45

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 51 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCGCTCGAG CCTCACCATG GGATGGAGCT GTATCATCCT CTTCTTGGTA G 51 r« ···· ·· • · · « · ·»· ····> ··

- 133 A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 94 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCGCTCGAG CCTCACCATG GGATGGAGCT GTATCATCCT CTTCTTGGTA 50

GCAACAGCTA CAGGTGTCCA CTCCGACATC CAGATGACCC AGAG 94

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGTGACAAG GGCCCATCGG TCTTCCCCCT GGCACCCTC 39

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 45 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

- 134 A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ

GCGTGACAAG AATTCTCATT

SZEKVENCIA

TACCCGGAGA

LEÍRÁSA:

CAGGGAGAGG

CTCTT 45

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: prcsein

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp De Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ¹⁵ 10 15

Asp Arg Val Thr De Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp De De Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu De 35 40 45

Tyr Ghi Ala Ser Asn Leu Gin Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr De Ser Ser Leu Gin Pro ⁶⁵ 70 75 80

Glu Asp Ile Ab Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gin Ser Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin Ile Thr 100 105

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav

TÍPUSA: aminosav ···· ·· ·· ···· ·· • · · · · · «, · ·· ···· · · ·

- 135 HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Alá Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Vei Thr De Ser Cys Ser Alá Ser Gin Gly De Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu De 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp TyT Ser Leu Thr De Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp De Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu De Lys 100 105

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein • · ·

- 136 A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Gin Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Leu Leu De 35 40 45

Tyr Alá Alá Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Thr Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ser Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Leu De 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Πβ Lys 100 105

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: prorein

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Glu Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser Asn Asp 20 25 30

Tyr Tyr Thr Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 •··· ·· ·· ····

- 137 Gly Tyr Val Phe Tyr His Gly Thr Ser Asp Asp Thr Thr Pro Leu Arg

55 60

Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Lys Ser Leu 65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Alá Alá Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá 85 90 95

Arg Asn Leu Ile Alá Gly Cys De Asp Val Trp Gly Gin Gly Ser Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Alá Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Alá Tyr 20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met He Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Alá Arg Tyr Tyr Cys Alá 85 90 95

Arg Asp Arg Val Thr Alá Thr Leu Tyr Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 • · ·

- 138 A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 120 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Lys Leu Val Gin Alá Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys De Alá Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Alá Val Ile Trp Tyr Asn Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Met Glx Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Alá Arg Asp Pro Asp Ile Leu Thr Alá Phe Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Val Leu Val Thr Val Ser 115 120

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 170 aminosav

TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

- 139 MOLEKULATÍPUS: prcsein

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Thr Arg Alá Pro Arg Ser Ser His Ser Val De Ser Thr Glu His 15 10 15

Arg Pro Leu Thr Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu 20 25 30

Πβ Leu Lys Giy Val Gin Cys Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Giy Gly 35 40 45

Gly Leu Val Gin Pro Gly Giy Ser Arg Lys Leu Ser Cys Alá Alá Ser 50 55 60

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro 65 70 75 80

Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val Alá Tyr He Ser Ser Gly Ser Ser Thr 85 90 95

Πβ Tyr Tyr Alá Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 100 105 110

Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gin Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu 115 120 125

Asp Thr Alá Met Tyr Tyr Cys Alá Arg Arg Gly Glu Gly Alá Met Asp

--- MA

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Alá Lys Thr Thr 145 150 155 160

Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Alá Pro Gly 165 170

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 153 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris • ·

- 140 MOLEKULATÍPUS: prorein

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ile Ser Gin Gly Thr Lys Phe Lys Tyr Thr Met Asp Phe Gin Val Gin 15 10 15

De Phe Ser Phe Leu Leu De Ser De Ser Val Val Met Ser Arg Gly 20 25 30

Glu Asn Val Leu Thr Gin Ser Pro Alá De Met Ser Alá Ser Leu Gly 35 40 45

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Asn Tyr De 50 55 60

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Asp Alá Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 65 70 75 8θ

Tyr Thr Ser Asn Leu Alá Pro Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu 100 105 ¹¹⁰

Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Thr Ser Ser Pro Phe Thr 115 120 125

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Alá Asp Alá Alá Pro 130 135 140

Thr Val Ser De Phe Pro Pro Ser Ser 145 150

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: prorein

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Leu Val Gin Pro Gly

- 141 A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 6 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Asn Val Leu Thr Gin

5

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 amincsav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Tyr De Ser Ser Gly Ser Ser Thr He Tyr Tyr Ala Asp Thr Leu 50 55 60 • ··· · ♦ ··· ····· ···» • ti · · ···· » ··

- 142 Lys Gfy Arg Phe Thr De Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gta Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Al* Arg Arg Gly Glu Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Pro • 100 105 110

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 amincsav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Alá Tyr De Ser Ser Gly Ser Ser Thr De Tyr Tyr Alá Asp Thr Leu 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr De Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Alá Arg Arg Gly Ghi Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Pro 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 amincsav

9

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu. Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Alá Tyr De Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Alá Asp Thr Leu 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Alá Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Alá Arg Arg Gly Glu Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Pro 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

• · ·

- 144 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gin Alá Ser Gln Asp Ile Ile Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Alá Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Glu Alá Ser Asn Leu Gin Alá Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin 65 70 75 80

Pro Glu Asp He Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Tyr Gin Ser Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin Ile Thr 100 105

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 106 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Asn Val Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Asp Alá Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45

Tyr Thr Ser Asn Leu Alá Pro Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Tyr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu 65 70 75 80

- 145 Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Thr Ser Ser Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lle Lys 100 105

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly l 5 10 15

Glu Arg Alá Thr Leu Ser Cys Arg Alá Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Alá Pro Arg Leu Leu De 35 40 45

Tyr Gly Alá Ser Ser Arg Alá Thr Gly De Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80

Asp Phe Alá Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu De Lys 100 105

AZ 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 127 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein • · ·

- 146 AZ 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg ¹ 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe De Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gin Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Tyr De De Trp Asp Asp Gly Ser Asp Gin His Tyr Ala Asp Ser 50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr De Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Phe Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe 85 90 95

Cys Ala Arg Asp Gly Gly His Gly Phe Cys Ser Ser Ala Ser Cys Phe 100 105 HO

Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

AZ 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

AZ 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Tyr De Ser Ser Gly Ser Ser Thr De Tyr Tyr Ala Asp Thr Leu 50 55 60

- 147 Lys Gly Arg Phe Thr De Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe

70 75 80

Leu Gin Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Alá Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Alá Arg Arg Gly Glu Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

AZ 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 114 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

AZ 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val Gin Leu Val Asp S er Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Alá Ser Gly Phe Thr Phe Ser Alá Asn 20 25 30

Asp Met Asn Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Ser Phe De Gly Gly Ser Gly Ser Thr De Tyr Tyr Alá Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr De Ser Arg Asn Asx Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Alá Glu Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Alá Arg Gly Trp Leu Leu Asn Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110

Claims (13)

1. Humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje, melynek aminosavsorrendje részben vagy egészben tartalmaz olyan CDR-eket, melyek lényegében egy olyan monoklonális ellenanyagból származtathatók, amely képes reagálni T-sejtek egy olyan kiválasztott szubpopulációjával, melyek a T-sejt antigénreceptor β-láncának Vh-5.2 vagy Vfi5.3 variábilis régióját expresszálják, az ellenanyag vagy kötőfehérje aminosavsorrendje tartalmaz továbbá bizonyos kiválasztott variábilis vázrégióhoz tartozó aminosavakat, melyek szintén a T-sejt-specifikus ellenanyagból származtathatók, és a humanizált ellenanyag vagy belőle származtatható kötőfehérje a kiválasztott T-sejt-szubpopulációhoz legalább olyan affinitással kötődik, amely összehasonlítható a T-sejt-specifikus monoklonális ellenanyag kötődési affinitásával, és amely humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje tartalmazza az alábbi TM27-Vkaminosavsorrendet:

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107, és az ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje tartalmazza az alábbi TM27-VH-aminosavszekvenciák valamelyikét is :

1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM 50

51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100

101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, ···· • ·

-149a TM27-VH-szekvencia azzal a különbséggel, hogy a 48. aminosav izoleucinra (I) van cserélve, a TM27-VH-szekvencia, azzal a különbséggel, hogy a 78. és

79. aminosav valin (V) és fenilalanin (F), a TM27-VH-szekvencia, azzal a különbséggel, hogy a 67-70. aminosavak, melyek szekvenciája VTML, LSIS-szekvenciára vannak cserélve, a 73. aminosav pedig aszparaginra (N) van cserélve, vagy a TM27-VH-szekvencia azzal a különbséggel, hogy a 92. aminosav arginin (R).

2. Humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje, melynek aminosavsorrendje részben vagy egészben tartalmaz olyan CDR-eket, melyek lényegében egy olyan monoklonális ellenanyagból származtathatók, amely képes reagálni T-sejtek egy olyan kiválasztott szubpopulációjával, amely a T-sejt antigénreceptor β-láncának νβ-8.1 variábilis régióját expresszálják, az ellenanyag vagy kötófehérje aminosavsorrendje tartalmaz továbbá bizonyos kiválasztott variábilis vázrégióhoz tartozó aminosavakat, melyek szintén a T-sejt-specifikus ellenanyagból származtathatók, és a humanizált ellenanyag vagy belőle származtatható kötőfehérje a kiválasztott T-sejt-szubpopulációhoz legalább olyan affinitással kötődik, ami összehasonlítható a T-sejt-specifikus monoklonális ellenanyag kötődési affinitásával, és amely humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje tartalmazza az alábbi TM29-Vk-aminosavsorrendet:

-150···· ·· ·· · · · · ·· • · · a · · • ··* · φ ··· • ·· ·· · ·· ·

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT 106, és az ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje tartalmazza az alábbi TM29-VH-aminosav-szekvenciák valamelyikét is:

1 EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50

51 ESSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, a TM29-VH-szekvencia azzal a különbséggel, hogy a 23. és 24. aminosavak alaninra (A) vannak cserélve, a TM29-VH-szekvencia, azzal a különbséggel, hogy a 75. aminosav prolinra (P) van cserélve, vagy a TM29-VH-szekvencia, azzal a különbséggel, hogy a 92. és 93. aminosavak sorrendben alaninra (A) és metioninra (M) vannak cserélve, a 95. aminosav pedig tirozinra (Y) van cserélve.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag, amely IgG2a-izotípusú.

4. A 3. igénypont szerinti humanizált ellenanyag, amelyben az Ig-konstans dóménjaiban egy vagy több aminosav módosítva lett, a konstans dómén effektorfunkciójának megváltoztatása céljából.

5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag vagy annak egy részlete, amely rekombináns DNStechnológiával· lett előállítva.

• · ··

6. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy

i) izolálunk egy első DNS-szekvenciát, amely legalább egy CDR-t kódol, amely lényegében egy egéreredetű anti-Vfi5.2/Vh-5.3 vagy anti-Vh-8.1 monoklonális ellenanyagból származtatható, és egy kiválasztott T-sejtszubpopulációra specifikus;

ii) az első DNS-szekvenciát alkalmas vektorba klónozzuk;

iii) a DNS-szekvenciába mutagenezis útján kiválasztott humán vázrégió aminosavakat kódoló szekvenciarészleteket juttatunk, ily módon CDR-átültetett konstrukciót kialakítva;

iv) az iii) lépés szerinti DNS-konstrukcióval gazdasejteket transzformálunk; és

v) a transzformált gazdasejteket humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje termeltetése céljából tenyésztjük.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként CHO-sejteket alkalmazunk.

8. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag, vagy abból származtatható kötőfehérje terápiás alkalmazásra.

9. Gyógyászati készítmény, amely 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyagot vagy abból származtatható kötőfehérjét tartalmaz, gyógyászatilag elfogadható kötőanyaggal kombinációban.

-152···· ·· * ··· • · · · ·· «· ·· ···· ·*·, • · · · • « ·· • · · · · ···· · ··

10. Eljárás Chron-kór kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelésre szoruló páciensnek 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje hatékony mennyiségét beadjuk.

11. Eljárás szklerózis multiplex kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelésre szoruló páciensnek az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje hatékony mennyiségét beadjuk.

12. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje alkalmazása Chron-kór kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására .

13. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált ellenanyag vagy abból származtatható kötőfehérje alkalmazása szklerózis multiplex kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.