CN114127113A

CN114127113A - 与钙网蛋白结合的多功能分子及其用途

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Publication number: CN114127113A
Application number: CN202080030475.9A
Authority: CN
Inventors: A·洛; 伊拉里亚·兰贝托; 谭申来; 乔纳森·徐; B·E·瓦什; 尼迪·马尔霍特拉; 马丹·卡特拉加达; 约翰·伦纳德·赫尔曼; 斯蒂芬妮·J·马奥科
Original assignee: Marengo Treatment Co
Current assignee: Marengo Treatment Co
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2022-03-01
Also published as: AU2020224154A1; JP2022521750A; GB2599229A; US20210380670A1; GB202112797D0; AU2020224154A8; WO2020172601A1; GB2599229B; SG11202109056TA; CA3131016A1; EP3927746A1

Abstract

公开了多功能分子，其包括i)结合钙网蛋白的抗原结合结构域；以及以下的一项、两项或全部：(ii)免疫细胞衔接物(例如，选自NK细胞衔接物、T细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物)；(iii)细胞因子分子；和/或(iv)基质修饰部分。还公开了编码其的核酸、生产上述分子的方法和使用上述分子治疗癌症的方法。

Description

与钙网蛋白结合的多功能分子及其用途

相关申请

本申请要求于2019年2月21日提交的美国临时申请62/808,779、于2019年3月14日提交的美国临时申请62/818,427和于2020年1月3日提交的美国临时申请62/956,866的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表，并在此通过引用整体并入。所述ASCII副本——创建于2020年2月19日——命名为E2070-7021WO_SL.txt，大小为1,760,247字节。

发明背景

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是一组导致骨髓中血细胞异常生长的病况。常见的骨髓增殖性肿瘤包括原发性或特发性骨髓纤维化(MF)、原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)和慢性髓细胞性白血病(CML)。原发性骨髓纤维化是一种慢性血癌，其中骨髓中形成过多的瘢痕组织并损害其产生正常血细胞的能力。鉴于对骨髓增殖性肿瘤(如骨髓纤维化)的改进治疗的持续需要，非常需要靶向骨髓增殖性肿瘤的新型组合物和治疗。

发明内容

本公开内容尤其是涉及新型多特异性或多功能分子，其包含：(i)结合钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)的抗原结合结构域；以下中的一个、两个或全部：(ii)免疫细胞衔接物(例如，选自NK细胞衔接物、T细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物)；(iii)细胞因子分子；和/或(iv)基质修饰部分。术语“多特异性”或“多功能”在本文中可互换使用。

不希望受理论束缚，预期本文公开的多特异性或多功能分子在表达钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)的靶细胞、例如癌细胞中，靶向(例如，定位、桥接和/或激活)免疫细胞(例如，选自NK细胞、T细胞、B细胞、树突细胞或巨噬细胞的免疫效应细胞)，和/或改变肿瘤间质，例如，改变癌症部位附近的肿瘤微环境。期望使用本文所述的多特异性分子增加免疫细胞的接近度(proximity)和/或活性来增强针对靶细胞(例如，癌细胞)的免疫应答，从而提供更有效的治疗(例如，更有效的癌症治疗)。不受理论束缚，据信针对靶细胞(例如，癌细胞)的靶向、定位性免疫应答降低本文所述的多特异性分子的全身毒性作用。

因此，本文提供尤其是包括上述部分的多特异性分子(例如，多特异性或多功能抗体分子)、编码其的核酸、生产上述分子的方法和使用上述分子治疗癌症的方法。

因此，在一个方面，本公开内容的特征在于一种多功能分子，其包含：

(i)第一抗原结合结构域，其结合钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)，和

(ii)结合TCRβV的第二抗原结合结构域，例如，表1A、表2A、表3A、表10A、表11A、表12A或表13A中任一个公开的抗TCRβV抗原结合结构域；或结合NKp30的第二抗原结合结构域，例如，表7-10或18中公开的抗NKp30抗原结合结构域。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合TCRβV。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域激活T细胞或第二抗原结合结构域不激活T细胞。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合TCRβV12或TCRβV6(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1044)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含表1A、表2A、表3A、表10A、表11A、表12A或表13A中列出的一个或多个氨基酸序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含：重链互补决定区1(VHCDR1)，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VHCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHCDR2，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VHCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VHCDR3，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VHCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)VL包含：轻链互补决定区1(VLCDR1)，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VLCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VLCDR2，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VLCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VLCDR3，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VLCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含：重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：3(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：4(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO：5(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)VL包含：轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：7(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO：8(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(c)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含：重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：45(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：46(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：47(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)VL包含：轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：51(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：52(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：53(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(d)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：48(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：49(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO：50(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)VL包含：轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：54(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：55(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：56(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VH的氨基酸序列(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)VL包含表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中VL的氨基酸序列(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)

(iii)VH包含氨基酸序列SEQ ID NO：9(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(iv)VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：10(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含氨基酸序列SEQ ID NO：9(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：11(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(c)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含氨基酸序列SEQ ID NO：1312(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：1314(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含：重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：17(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：18(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：19(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)VL包含：轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：20(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：21(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：22(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含：重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：57(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：58(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：59(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)VL包含：轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：63(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：64(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：65(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(c)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含：重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：60(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：61(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：62(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)VL包含：轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：66(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：67(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：68(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含氨基酸序列SEQ ID NO：15(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：16(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)VH包含：

氨基酸序列SEQ ID NO：23(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO：24(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，或

氨基酸序列SEQ ID NO：25(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)VL包含：

氨基酸序列SEQ ID NO：26(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO：27(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO：28(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO：29(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，或

氨基酸序列SEQ ID NO：30(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，多功能分子包含：

第一多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VL和第一CL；

第二多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VH、第一CH1、第一二聚化结构域(例如，第一Fc)和结合TCR(例如，TCRVβ)的第一部分(例如，与TCR(例如，TCRVβ)结合的第一scFv)；

第三多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VH、第二CH1、第二二聚化结构域(例如，第二Fc)、和任选地结合TCR(例如，TCRVβ)的第二部分(例如，结合TCR(例如，TCRVβ)的第二scFv)；

第四多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VL和第二CL，

其中：

第一VL和第一VH形成结合第一钙网蛋白的第一抗原结合结构域，并且第二VL和第二VH形成结合第二钙网蛋白的第三抗原结合结构域，

任选地其中第一钙网蛋白和第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285或6286，

任选地其中第一钙网蛋白和第二钙网蛋白突变蛋白各自独立地选自：包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313的分子，或包含氨基酸序列SEQ ID NO：6314的分子，

任选地其中多功能分子包含图3A或图3B的构型。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合NKp30。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域选自结合(例如，激活)NKp30的抗体分子(例如抗原结合结构域)或配体，例如，第二抗原结合结构域为结合(例如，激活)NKp30的抗体分子或配体。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含：重链互补决定区1(VHCDR1)，其具有表7、表9、表10或表18的VHCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHCDR2，其具有表7、表9、表10或表18的VHCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VHCDR3，其具有表7、表9、表10或表18的VHCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(ii)轻链可变区(VL)，其包含：轻链互补决定区1(VLCDR1)，其具有表8、表9、表10或表18的VLCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VLCDR2，其具有表8、表9、表10或表18的VLCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VLCDR3，其具有表8、表9、表10或表18的VLCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含：重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：7313(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6001(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：7315(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：7326(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：7327(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：7329(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

VH，其包含SEQ ID NO：7298或7300-7304中的任一项的氨基酸序列(或与SEQ IDNO：7298或7300-7304中的任一项具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

VL，其包含SEQ ID NO：7299或7305-7309中的任一项的氨基酸序列(或与SEQ IDNO：7299或7305-7309中的任一项具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

VH，其包含SEQ ID NO：7302的氨基酸序列(或与7302具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；以及VL，其包含SEQ ID NO：7305的氨基酸序列(或与7305具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；或

VH，其包含SEQ ID NO：7302的氨基酸序列(或与7302具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；以及VL，其包含SEQ ID NO：7309的氨基酸序列(或与7309具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

SEQ ID NO：7310的氨基酸序列(或与7310具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；或

SEQ ID NO：7311的氨基酸序列(或与7311具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6000、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6001，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6002；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6063、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6064，和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：7293。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含：重链框架区1(VHFWR1)，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR1的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；VHFWR2，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR2的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；VHFWR3，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR3的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；或VHFWR4，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR4的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(2)轻链可变区(VL)，其包含：轻链框架区1(VLFWR1)，其具有表8、表9、表10或表18的VLFWR1的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；VLFWR2，其具有表8、表9、表10或表18的VLFWR2的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；VLFWR3，其具有表8、表9、表10或表18的VLFWR3的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；或VLFWR4，其具有表8、表9、表10或表18的VLFWR4的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6003、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6004、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6005、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6006；和

(3)轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6066、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6067、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：7292、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6069.

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含表7、表9、表10或表18的VH的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(ii)VL，其包含表8、表9、表10或表18的VL的氨基酸序列(或与其具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含重链，其包含表10的重链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含轻链，其包含表10的轻链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含重链，其包含表10的重链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和轻链，其包含表10的轻链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，多特异性分子包含：

第一多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VL和第一CL；

第二多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VH、第一CHl、第一二聚化结构域(例如，第一Fc)和结合NKp30的第一部分(例如，与NKp30结合的第一抗体分子或配体)；

第三多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VH、第二CH1、第二二聚化结构域(例如，第二Fc)、和任选地结合NKp30的第二部分(例如，结合NKp30的第二抗体分子或配体)；

第四多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VL和第二CL，

其中：

任选地其中多功能分子包含图3A或3B的构型。

在一些实施方案中，钙网蛋白包含选自SEQ ID NO：6285-6312的氨基酸序列，任选地其中钙网蛋白包含选自SEQ ID NOs：6313-6346的氨基酸序列。

在一些实施方案中，钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285。

在一些实施方案中，钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至位于钙网蛋白C-末端内的表位，任选地其中第一抗原结合结构域结合至位于氨基酸序列SEQ ID NO：6285或6286内的表位。

在一些实施方案中，多特异性分子还包含：

结合第二钙网蛋白的第三抗原结合结构域，例如，其中第二钙网蛋白突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285或6286，任选地其中：

(i)第三抗原结合结构域与第一抗原结合结构域不同，或

(ii)第三抗原结合结构域与第一抗原结合结构域相同。

在一些实施方案中，第二钙网蛋白分子与第一抗原结合结构域所结合的钙网蛋白分子相同。

在一些实施方案中，第二钙网蛋白分子与第一抗原结合结构域所结合的钙网蛋白分子不同。

在一些实施方案中，第二钙网蛋白包含选自SEQ ID NOs：6285-6312的氨基酸序列，任选地其中第二钙网蛋白包含选自SEQ ID NO：6313-6346的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合的钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ IDNO：6285，并且第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286。

在一些实施方案中，第三抗原结合结构域结合至位于第二钙网蛋白C-末端内的表位，任选地其中第三抗原结合结构域结合至位于氨基酸序列SEQ ID NO：6285或6286内的表位。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含：重链互补决定区1(VHCDR1)，其具有表4、表7A或表17中的VHCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHCDR2，其具有表4、表7A或表17中的VHCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VHCDR3，其具有表4、表7A或表17中的VHCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(ii)轻链可变区(VL)，其包含：轻链互补决定区1(VHCDR1)，其具有表5、表7A或表18中的VLCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHCDR2，其具有表5、表7A或表18中的VLCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VHCDR3，其具有表5、表7A或表18中的VLCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(iii)VH，其包含表7A或表16中的VH的氨基酸序列(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；

(iv)VL，其包含表7A或表16中VL的氨基酸序列(或与其具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；

(v)VH，其包含：重链框架区1(VHFWR1)，其具有表4或表6中的VHFWR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHFWR2，其具有表4或表6中的VHFWR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHFWR3，其具有表4或表6中的VHFWR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VHFWR4，其具有表4或表6中的VHFWR4的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(vi)VL，其包含：轻链框架区1(VLFWR1)，其具有表5或表6中的VLFWR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VLFWR2，其具有表5或表6中的VLFWR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VLFWR3，其具有表5或表6中的VLFWR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VLFWR4，其具有表5或表6中VLFWR4的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，多功能分子还包含肿瘤靶向部分。

在一些实施方案中，肿瘤靶向部分与肿瘤抗原结合。

在一些实施方案中，肿瘤抗原选自G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

在一些实施方案中，肿瘤靶向部分包含抗体分子，例如其结合选自以下的肿瘤抗原：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

在一些实施方案中，肿瘤靶向部分包含VH和/或VL序列，例如，如表A或表20中所列的。

在一些实施方案中，多功能分子相比于非肿瘤细胞优先结合骨髓增殖性肿瘤细胞，任选地其中多功能分子与骨髓增殖性肿瘤细胞之间的结合是多功能分子与非肿瘤细胞之间的结合的超过10、20、30、40、50倍。

在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞选自骨髓纤维化细胞、原发性血小板增多症细胞、真性红细胞增多症细胞或慢性骨髓癌细胞，任选地其中：

骨髓增殖性肿瘤细胞不包含JAK2 V617F突变，或

骨髓增殖性肿瘤细胞不包含MPL突变。

在一些实施方案中，多特异性分子还包含接头，例如，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间的接头。

在一些实施方案中，接头选自：可切割接头、不可切割接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头或非螺旋接头。

在一些实施方案中，接头为肽接头。

在一些实施方案中，肽接头包含Gly和Ser。

在一些实施方案中，肽接头包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：6214-6217或6220-6221和77-78。

在另一方面，本公开内容提供了编码如本文所述的多功能分子的核酸分子。

在另一方面，本公开内容提供了包含如本文所述的核酸分子的载体，例如表达载体。

在另一方面，本公开内容提供了包含如本文所述的核酸分子或载体的宿主细胞。

在另一方面，本公开内容提供了一种制备(例如，产生)如本文所述的多功能分子的方法，该方法包括在合适的条件下(例如，适合于基因表达和/或同二聚化或异二聚化的条件)，培养本文所述的宿主细胞。

在另一方面，本公开内容提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的多功能分子和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。

在另一方面，本公开内容提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向需要其的受试者施用如本文公开的多功能分子，其中所述多功能分子以有效治疗癌症的量施用。

在另一方面，本公开内容提供了如本文所述的多功能分子在治疗癌症中的用途。在另一方面，本公开内容提供了用于治疗癌症的本文公开的多功能分子。

在一些实施方案中，受试者具有表达第一钙网蛋白和/或第二钙网蛋白的癌细胞。

在一些实施方案中，其中受试者具有JAK2 V617F突变。

在一些实施方案中，其中受试者不具有JAK2 V617F突变。

在一些实施方案中，受试者具有MPL突变。

在一些实施方案中，受试者不具有MPL突变。

在一些实施方案中，癌症是血液学癌症，任选地其中癌症是骨髓增殖性肿瘤，例如原发性或特发性骨髓纤维化(MF)、原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)或慢性髓细胞性白血病(CML)，任选地其中癌症为骨髓纤维化。

在一些实施方案中，癌症是实体瘤癌症(solid tumor cancer)。

在一些实施方案中，该方法或用途还包括施用第二治疗性治疗。

在一些实施方案中，第二治疗性治疗包括治疗剂(例如，化学治疗剂、生物药剂、激素治疗)、放射或手术。

在一些实施方案中，治疗剂选自：化学治疗剂或生物药剂。

在另一个方面，本公开内容的特征在于一种多功能分子(例如，多肽或编码其的核酸)，所述多功能分子包括：

(ii)以下中的一个、两个或全部：

(a)免疫细胞衔接物，其选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物；

(b)细胞因子分子；

(c)基质修饰部分；或

(d)肿瘤靶向部分，其与例如选自以下的肿瘤抗原结合：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

在一个方面，本公开内容的特征在于一种多功能分子(例如，多肽或编码其的核酸)，所述多功能分子包括：

(ii)第二抗原结合结构域，其包含免疫细胞衔接物(例如，T细胞衔接物，例如结合例如本文所述的TCRβV的抗原结合结构域)。

(i)第一抗原结合结构域，其结合钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)；和

(ii)第二抗原结合结构域，其包含例如与选自以下的肿瘤抗原结合的肿瘤靶向部分：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

(i)第一抗原结合结构域，其结合钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)；

(ii)第二抗原结合结构域，其包含免疫细胞衔接物(例如，T细胞衔接物，例如结合例如本文所述的TCRβV的抗原结合结构域，例如，本文所述的抗TCRβV抗体分子)；和

(iii)第三抗原结合结构域，其包含例如与选自以下的肿瘤抗原结合的肿瘤靶向部分：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

在一些实施方案中，多功能分子还包含细胞因子分子或细胞因子分子的调节剂，例如本文所述的TGF-β抑制剂。

在一些实施方案中，多功能分子还包含NK细胞衔接物，例如结合例如本文所述的Nkp30的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285或6286。在一些实施方案中，野生型钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285。在一些实施方案中，钙网蛋白突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6224、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6226、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6228、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6230。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，其包含：重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6232、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6234、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6236、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6230。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6238、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6240、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6242、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6244。

在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含选自SEO IDNO：6285-6312的氨基酸序列。在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含选自SEQ ID NO：6313-6346的氨基酸序列。在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)是表2或3中公开的钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)。在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6287。在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含氨基酸序列SEQID NO：6313。在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6288。在一些实施方案中，钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6314。

在一些实施方案中，多功能分子还包含优选结合第二钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，第二钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含基酸序列SEQ ID NO：6286。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域与第一抗原结合结构域不同。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域与第一抗原结合结构域相同。在一些实施方案中，第二钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含选自SEQ ID NO：6287-6312的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)包含选自SEQ ID NO：6313-6346的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)是表2或3中公开的钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)。在一些实施方案中，第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6287。在一些实施方案中，第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313。在一些实施方案中，第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6288。在一些实施方案中，第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6314。

在一些实施方案中，第一钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)是1型钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)，并且第二钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)是2型钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)。在一些实施方案中，第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6287，并且第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6288。在一些实施方案中，第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313，并且第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6314。

在一些实施方案中，野生型钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域对第一钙网蛋白(例如，突变型钙网蛋白)和野生型钙网蛋白具有大致相同的亲和力(例如，相等的亲和力)。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域对第二钙网蛋白(例如，突变型钙网蛋白)和野生型钙网蛋白具有大致相同的亲和力(例如，相等的亲和力)。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域对第一钙网蛋白突变蛋白的亲和力高于对野生型钙网蛋白的亲和力。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与第一钙网蛋白突变蛋白之间结合的K_D不超过第一抗原结合结构域与野生型钙网蛋白之间结合的K_D的40％、30％、20％、10％、1％、0.1％或0.01％。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至位于第一钙网蛋白突变蛋白C-末端内的表位。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至位于氨基酸序列SEQ ID NO：6286内的表位。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域不与野生型钙网蛋白结合。在一些实施方案中，野生型钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285。

在一些实施方案中，第二抗原结合结构域对第二钙网蛋白突变蛋白的亲和力高于对野生型钙网蛋白的亲和力。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域与第二钙网蛋白突变蛋白之间结合的K_D不超过第二抗原结合结构域与野生型钙网蛋白之间结合的K_D的40％、30％、20％、10％、1％、0.1％或0.01％。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合至位于第二钙网蛋白突变蛋白C-末端内的表位。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合至位于氨基酸序列SEQ ID NO：6286内的表位。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域不与野生型钙网蛋白结合。在一些实施方案中，野生型钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285。

在一些实施方案中，相比于非肿瘤细胞，多功能分子优先结合骨髓增殖性肿瘤细胞。在一些实施方案中，多功能分子与骨髓增殖性肿瘤细胞之间的结合是多功能分子与非肿瘤细胞之间的结合的超过10、20、30、40、50倍。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞选自骨髓纤维化细胞、原发性血小板增多症细胞、真性红细胞增多症细胞或慢性骨髓癌细胞。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞不包含JAK2 V617F突变。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞不包含MPL突变。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6253(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6254(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6255(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQID NO：6259(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6261(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6253(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6254(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6255(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6259(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6261(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6253、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6254、和VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO：6255。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6259、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260、和VLCDR3氨基酸序列SEQ IDNO：6261。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6253、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6254、和VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6255，和

(ii)VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6259、VLCDR2氨基酸序列SEQ IDNO：6260、和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6261。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6224、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6226、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6228、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6230。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6238、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6240、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6242、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6244。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6224、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6226、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6228、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6230，和

(ii)VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6238、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6240、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6242、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6244。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6263(或具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6264(或具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6265(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6277(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6278(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6279(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6280。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6263(或具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6264(或具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6265(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228，和

(ii)VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6277(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6278(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6279(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6280。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6263、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6264、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6265、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6277、VLFWR2氨基酸序列SEQ IDNO：6278、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6279、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6280。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6263、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6264、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6265、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228，和

(ii)VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6277、VLFWR2氨基酸序列SEQ IDNO：6278、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6279、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6280。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6247(或与SEQ ID NO：6247具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249(或与SEQ ID NO：6249具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6247(或与SEQ ID NO：6247具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和

(ii)VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249(或与SEQ ID NO：6249具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6247。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6247，和(ii)VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含与SEQ ID NO：6250具有至少70％或75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含与SEQ ID NO：6252具有至少85％或90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含(i)VH，其包含与SEQ ID NO：6250具有至少70％或75％序列同一性的氨基酸序列，和(ii)VL，其包含与SEQ ID NO：6252具有至少85％或90％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6256(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6257(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6258或116(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6259(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6261(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6256(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6257(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6258或116(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6232、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6234、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6236、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6230。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6238、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6240、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6242、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6244。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6232、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6234、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6236、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6230；和

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6266(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6267(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6268(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6269。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6277(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6278(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6279(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6280。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含重链框架1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6266(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6267(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6268(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6269；和

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6248(或与SEQ ID NO：6248具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249(或与SEQ ID NO：6249具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含

(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6248(或与SEQ ID NO：6248具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6248。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6248，和(ii)VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VH，其包含与SEQ ID NO：6251具有至少70％或74％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含VL，其包含与SEQ ID NO：6252具有至少85％或90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含(i)VH，其包含与SEQ ID NO：6251具有至少70％或74％序列同一性的氨基酸序列，和/或(ii)VL，其包含与SEQ ID NO：6252具有至少85％或90％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多功能分子包含选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物的免疫细胞衔接物。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物结合并激活免疫细胞，例如效应细胞。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物结合但不激活免疫细胞，例如效应细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞衔接物是T细胞衔接物，例如介导结合并激活T细胞的T细胞衔接物，或介导结合但不激活T细胞的T细胞衔接物。在一些实施方案中，T细胞衔接物结合CD3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRζ、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2或CD226。在一些实施方案中，T细胞衔接物是抗-CD3抗体分子。在一些实施方案中，T细胞衔接物是抗-TCRβ抗体分子，例如本文所述的抗-TCRβV抗体分子。

在一些实施方案中，免疫细胞衔接物是NK细胞衔接物，例如，介导结合并激活NK细胞的NK细胞衔接物，或介导结合但不激活NK细胞的NK细胞衔接物。在一些实施方案中，NK细胞衔接物选自结合(例如激活)以下的抗体分子(例如抗原结合结构域)或配体：NKp30、NKp40、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM1、DAP10、CD16(例如、CD16a、CD16b或两者)、CRTAM、CD27、PSGL1、CD96、CD100(SEMA4D)、NKp80、CD244(也称为SLAMF4或2B4)、SLAMF6、SLAMF7、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR2DS1、CD94、NKG2C、NKG2E或CD160。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是结合(例如，激活)NKp30的抗体分子或配体。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是抗体分子，例如抗原结合结构域。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是结合NKp30或NKp46的抗体分子，例如抗原结合结构域。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是配体，任选地所述配体还包含免疫球蛋白恒定区，例如Fc区。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是NKp44或NKp46的配体，例如病毒HA。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是DAP10的配体，例如NKG2D的共受体。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是CD16的配体，例如CD16a/b配体，例如还包含抗体Fc区的CD16a/b配体。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物介导结合或激活，或结合并激活，B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞中的一个或多个。

在一些实施方案中，免疫细胞衔接物包括选自以下的一种或多种的B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞衔接物：CD40配体(CD40L)或CD70配体；与CD40或CD70结合的抗体分子；针对OX40的抗体分子；OX40配体(OX40L)；Toll样受体的激动剂(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4)，或TLR9激动剂)；41BB；CD2激动剂；CD47；或STING激动剂，或其组合。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物是B细胞衔接物，例如CD40L、OX40L或CD70配体，或结合OX40、CD40或CD70的抗体分子。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物是巨噬细胞衔接物，例如CD2激动剂；CD40L；OX40L；结合OX40、CD40或CD70的抗体分子；Toll样受体(TLR)的激动剂(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4)或TLR9激动剂)；CD47；或STING激动剂。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物是树突细胞衔接物，例如CD2激动剂、OX40抗体、OX40L、41BB激动剂、Toll样受体激动剂或其片段(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4))、CD47激动剂或STING激动剂。在一些实施方案中，STING激动剂包含环状二核苷酸，例如环状二GMP(cdGMP)、环状二AMP(cdAMP)或其组合，任选地具有2′，5′或3′，5′磷酸键，例如其中STING激动剂与多功能分子共价偶联。

在一些实施方案中，多功能分子包括细胞因子分子或其调节剂。在一些实施方案中，细胞因子分子选自TGF-β、白介素-2(IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。在一些实施方案中，细胞因子分子是单体或二聚体。在一些实施方案中，细胞因子分子还包含受体二聚化结构域，例如IL15Rα二聚化结构域。在一些实施方案中，细胞因子分子(例如，IL-15)和受体二聚化结构域(例如，IL15Rα二聚化结构域)不是共价连接的，例如，是非共价结合的。

在一些实施方案中，细胞因子分子的调节剂包括TGF-β抑制剂。

在一些实施方案中，多功能分子包含基质修饰部分。在一些实施方案中，基质修饰部分引起以下中的一项或多项：降低间质或细胞外基质(ECM)组分的水平或产生；减少肿瘤纤维化；增加间质性肿瘤运输；改善肿瘤灌注；扩大肿瘤微血管系统；降低肿瘤中的间质液压力(IFP)；或减少或增强药剂(例如癌症治疗剂或细胞治疗剂)进入肿瘤或肿瘤脉管系统的渗透或扩散。在一些实施方案中，减少的间质或ECM组分选自糖胺聚糖或细胞外蛋白或其组合。在一些实施方案中，糖胺聚糖选自透明质酸(hyaluronan)(也称为透明质酸(hyaluronic acid)或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、巢蛋白、腱生蛋白、聚集蛋白聚糖或硫酸角蛋白。在一些实施方案中，细胞外蛋白选自胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白或玻连蛋白。在一些实施方案中，基质修饰部分包含降解肿瘤间质或细胞外基质(ECM)的酶分子。在一些实施方案中，酶分子选自透明质酸酶分子、胶原酶分子、软骨素酶分子、基质金属蛋白酶分子(例如，巨噬细胞金属弹性蛋白酶)或任何上述物质的变体(例如，片段)。在一些实施方案中，基质修饰部分降低透明质酸的水平或产生。在一些实施方案中，基质修饰部分包含透明质酸降解酶、抑制透明质酸合成的试剂或抗透明质酸的抗体分子。在一些实施方案中，透明质酸降解酶是透明质酸酶分子或其变体(例如，其片段)。在一些实施方案中，透明质酸降解酶在中性或酸性pH(例如，约4-5的pH)下有活性。在一些实施方案中，透明质酸酶分子是哺乳动物透明质酸酶分子，例如重组人透明质酸酶分子，或其变体(例如，其截短形式)。在一些实施方案中，透明质酸酶分子选自HYAL1、HYAL2或PH-20/SPAM1或其变体(例如，其截短形式)。在一些实施方案中，截短形式缺少C-末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或GPI附着位点的一部分。在一些实施方案中，透明质酸酶分子是糖基化的，例如，包含至少一个N-连接的聚糖。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含氨基酸序列SEQ ID NO：6213，或其片段，或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与其具有95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6213具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换))。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含SEQ ID NO：6213的氨基酸残基36-464。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含PH20的氨基酸残基36-481、36-482或36-483，其中PH20具有氨基酸序列SEQID NO：6213。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含与氨基酸序列SEQ ID NO：6213的多肽或截短形式具有至少95％至100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含对氨基酸序列SEQ ID NO：6213具有30、20、10、5或更少的氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含与氨基酸序列SEQ ID NO：6213具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，透明质酸酶分子由与SEQ ID NO：6213的核苷酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，透明质酸酶分子是PH20，例如rHuPH20。在一些实施方案中，透明质酸酶分子为HYAL1，并且包含氨基酸序列SEQID NO：6218，或其片段，或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与其95％至99.9％相同，或对于氨基酸序列SEQ ID NO：6218具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换))。在一些实施方案中，透明质酸降解酶、例如透明质酸酶分子还包含聚合物，例如缀合至聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，透明质酸降解酶是聚乙二醇化的PH20酶(PEGPH20)。在一些实施方案中，透明质酸降解酶，例如透明质酸酶分子还包含免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)，其选自例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，更特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区(例如，Fc区)连接至(例如共价连接至)透明质酸降解酶，例如透明质酸酶分子。在一些实施方案中，免疫球蛋白链恒定区(例如Fc区)改变(例如突变)以增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能或补体功能。在一些实施方案中，透明质酸降解酶，例如透明质酸酶分子形成二聚体。在一些实施方案中，基质修饰部分包含透明质酸合成抑制剂，例如HA合酶。在一些实施方案中，抑制剂包含针对HA合酶的有义或反义核酸分子，或为小分子药物。在一些实施方案中，抑制剂是4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物(例如，6，7-二羟基-4-甲基香豆素或5，7-二羟基-4-甲基香豆素)，或来氟米特(leflunomide)或其衍生物。在一些实施方案中，基质修饰部分包含胶原酶分子，例如哺乳动物胶原酶分子，或其变体(例如，片段)。在一些实施方案中，胶原酶分子是胶原酶分子IV，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6219，或其片段，或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与其95％至99.9％相同，或对于氨基酸序列SEQ ID NO：6219具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换))。

在一些实施方案中，多功能分子包含免疫细胞衔接物(例如，T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物)和细胞因子分子。在一些实施方案中，多功能分子包含免疫细胞衔接物(例如，T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物)和基质修饰部分。在一些实施方案中，多功能分子包含细胞因子分子和基质修饰部分。在一些实施方案中，多功能分子包含免疫细胞衔接物(例如，T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物)、细胞因子分子和基质修饰部分。

在一些实施方案中，多功能分子包含至少两条不连续的多肽链。

在一些实施方案中，多功能分子包含以下构型：

A，B-[二聚化模块]-C，-D

例如，图1A、1B和1C中所示的构型，其中：

(1)所述二聚化模块包含免疫球蛋白恒定结构域，例如，重链恒定结构域(例如，同源二聚体或异二聚体重链恒定区，例如，Fc区)，或免疫球蛋白可变区的恒定结构域(例如，Fab区)；并且

(2)A、B、C和D独立地不存在；(i)结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或突变型钙网蛋白)的抗原结合结构域，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286；(ii)免疫细胞衔接物，其选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物；(iii)细胞因子分子；或(iv)基质修饰部分，条件是：

A、B、C和D中的至少一个、两个或三个包含结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且

其余A、B、C和D中的任何一个都不存在，或包含免疫细胞衔接物、细胞因子分子或基质修饰部分之一。

在一些实施方案中，

(i)A包含结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B、C或D包含免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子；

(ii)A包含结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B、C或D包含细胞因子分子；

(iii)A包含结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B、C或D包含基质修饰部分；

(iv)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，B包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且C或D包含免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子；

(v)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286；B包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且C或D包含细胞因子分子；

(vi)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，B包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且C或D包含基质修饰部分；

(vii)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，C包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B或D包含免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子；

(viii)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，C包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B或D包含细胞因子分子；

(ix)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，C包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B或D包含基质修饰部分；

(x)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B、C或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子和(b)细胞因子分子；

(xi)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B、C或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子和(b)基质修饰部分；

(xii)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B、C或D包含(a)细胞因子分子和(b)基质修饰部分；

(xiii)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，B包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且C或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子和(b)细胞因子分子；

(xiv)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，B包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且C或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子和(b)基质修饰部分；

(xv)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，B包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且C或D包含(a)细胞因子分子和(b)基质修饰部分；

(xvi)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，C包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子和(b)细胞因子分子；

(xvii)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，C包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子和(b)基质修饰部分；

(xviii)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，C包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B或D包含(a)细胞因子分子和(b)基质修饰部分；

(xix)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B、C或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子，(b)细胞因子分子，和(c)基质修饰部分；

(xx)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，B包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且C或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子，(b)细胞因子分子，和(c)基质修饰部分；或

(xxi)A包含结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，C包含结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且B或D包含(a)免疫细胞衔接物，例如T细胞衔接物，例如抗-CD3抗体分子，(b)细胞因子分子，和(c)基质修饰部分。

在一些实施方案中，所述二聚化模块包括一个或多个免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)，所述免疫球蛋白链恒定区包括以下中的一种或多种：成对的腔-突起(“杵臼结构”)、静电相互作用或链交换。在一些实施方案中，所述一个或多个免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)在选自例如人IgG1的Fc区的347、349、350、351、366、368、370、392、394、395、397、398、399、405、407或409中的一个或多个的位置包括氨基酸置换。在一些实施方案中，所述一个或多个免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)包括选自以下的氨基酸置换：T366S、L368A或Y407V(例如，对应于腔或臼)，或T366W(例如，对应于突起或杵)或其组合。

在一些实施方案中，多功能分子还包含接头，例如以下中的一项或多项之间的接头：抗原结合结构域和免疫细胞衔接物、抗原结合结构域和细胞因子分子、抗原结合结构域和基质修饰部分、免疫细胞衔接物和细胞因子分子、免疫细胞衔接物和基质修饰部分、细胞因子分子和基质修饰部分、抗原结合结构域和二聚化模块、免疫细胞衔接物和二聚化模块、细胞因子分子和二聚化模块，或基质修饰部分和二聚化模块。在一些实施方案中，接头选自：可切割接头、不可切割接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施方案中，接头为肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含Gly和Ser。在一些实施方案中，肽接头包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：6214-6217或6220-6221和77-78。

在一个方面，本发明提供一种多功能分子，其包含：

(i)结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，例如，其中钙网蛋白突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286；和

(ii)结合CD3的部分，例如结合CD3的抗体分子。

在一些实施方案中，多功能分子包含：

第一多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VL和第一CL；

第二多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VH、第一CH1、第一二聚化结构域(例如，第一Fc)、和结合CD3的第一部分(例如，结合CD3的第一scFv)；

第三多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VH、第二CH1、第二二聚化结构域(例如，第二Fc)、和任选地结合CD3的第二部分(例如，结合CD3的第二scFv)；

第四多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VL和第二CL，其中：

第一VL和第一VH形成结合第一钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域，并且第二VL和第二VH形成结合第二钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域，其中第一钙网蛋白和第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，任选地其中第一钙网蛋白和第二钙网蛋白各自独立地选自：包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313的分子，或包含氨基酸序列SEQ ID NO：6314的分子。

在一些实施方案中，多功能分子包含图2A或图2B的构型。

在一个方面，本发明提供一种多功能分子，其包含：

(i)结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，例如，其中钙网蛋白突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，和

(ii)结合TCR(例如TCRβ)的部分，例如，结合TCR(例如TCRβ)的抗体分子。

在一些实施方案中，多功能分子包含：

第一多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VL和第一CL，

第二多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VH、第一CH1、第一二聚化结构域(例如，第一Fc)、和结合TCR(例如TCRβ)的第一部分(例如，结合TCR(例如TCRβ)的第一scFv)，

第三多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VH、第二CH1、第二二聚化结构域(例如，第二Fc)、和任选地结合TCR(例如TCRβ)的第二部分(例如，结合TCR(例如TCRβ)的第二scFv)，

在一些实施方案中，多功能分子包含图3A或图3B的构型。

在一个方面，本发明提供一种多功能分子，其包含：

(i)结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，例如，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286；和

(ii)结合NKp30的部分，例如结合(例如，激活)NKp30的抗体分子或配体。

在一些实施方案中，多功能分子包含：

第一多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VL和第一CL；

第二多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VH、第一CH1、第一二聚化结构域(例如，第一Fc)、和结合NKp30的第一部分(例如，结合NKp30的第一抗体分子或配体)；

在一些实施方案中，多功能分子包含图4A或图4B的构型。

在另一个方面，本公开内容提供了编码本文所述的任何多特异性或多功能分子的分离的核酸分子。在另一个方面，本公开内容提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本文所述的任何多特异性或多功能分子的核苷酸序列，或与其基本上同源的核苷酸序列(例如，与其具有至少80％、90％、95％或99.9％同一性)。在另一个方面，本公开提供了一种包含本文所述的核酸分子或载体的宿主细胞。

在另一个方面，本公开内容提供了一种制备(例如，产生)本文所述的多特异性或多功能分子多肽的方法，所述方法包括在合适的条件(例如，适合于基因表达和/或同二聚化或异二聚化的条件)下，培养本文所述的宿主细胞。

在另一个方面，本公开内容提供了一种药物组合物，其包含本文所述的多特异性或多功能分子多肽和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。

在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的多特异性或多功能分子多肽，其中多特异性抗体以有效治疗癌症的量施用。在一些实施方案中，受试者具有表达第一和/或第二钙网蛋白突变体的癌细胞。在一些实施方案中，受试者具有表达第一、第二或第三肿瘤抗原的肿瘤细胞，例如受试者具有表达选自以下的肿瘤抗原的肿瘤细胞：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B、或TM4SF1。在一些实施方案中，受试者具有JAK2 V617F突变。在一些实施方案中，其中受试者不具有JAK2V617F突变。在一些实施方案中，受试者具有MPL突变。在一些实施方案中，受试者不具有MPL突变。在一些实施方案中，癌症是血液学癌症，任选地其中癌症是骨髓增殖性肿瘤，例如原发性或特发性骨髓纤维化(MF)、原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)或慢性髓细胞性白血病(CML)。在一些实施方案中，癌症是骨髓纤维化。在一些实施方案中，癌症是实体瘤癌症。在一些实施方案中，实体瘤癌症是胰脏癌(pancreatic cancer)(例如，胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma)、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌(例如，小细胞或非小细胞肺癌)、皮肤癌、卵巢癌或肝癌中的一种或多种。

在一些实施方案中，癌细胞包含骨髓增殖性肿瘤细胞。在实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞选自骨髓纤维化细胞、原发性血小板增多症细胞、真性红细胞增多症细胞或慢性骨髓癌细胞。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞是骨髓纤维化细胞。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞是原发性血小板增多症细胞。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞是真性红细胞增多症细胞。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞是慢性骨髓癌细胞。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞包含JAK2突变(例如，JAK2 V617F突变)。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞包含钙网蛋白突变。在一些实施方案中，骨髓增殖性肿瘤细胞包含MPL突变。

在一些实施方案中，方法还包括施用第二治疗性治疗。在一些实施方案中，第二治疗性治疗包括治疗剂(例如，化学治疗剂、生物药剂、激素疗法)、放射或手术。在一些实施例中，治疗剂选自：化学治疗剂或生物药剂。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管下面描述了合适的方法和材料，但类似于或等同于本文所述方法和材料的方法和材料均可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文并入本文。在发生抵触的情况下，以包括定义的本说明书为准。此外，材料、方法和示例仅是说明性的，并不意图是限制性的。

通过以下详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。

附图说明

本专利或申请文件包括至少一张彩色附图。专利局将在收到请求和必要费用后，提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

图1A-图1B示出了抗体A来源小鼠VH和VL框架区1、CDR1、框架区2、CDR 2、框架区3、CDR3和框架区4以其各自的人源化序列的比对。Kabat CDR以粗体示出，Chothia CDR以斜体示出，并且组合的CDR以方框示出。反向突变的框架位置用双下划线标出。图1A示出了鼠抗体A的VH序列(SEQ ID NO：1)和人源化抗体A-H的VH序列(SEQ ID NO：9)。图1B示出了鼠抗体A的VL序列(SEQ ID NO：2)和人源化抗体A-H的VL序列(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)。

图2A-图2B示出了抗体B来源小鼠VH和VL框架区1、CDR1、框架区2、CDR2、框架区3、CDR3和框架区4以其各自的人源化序列的比对。Kabat CDR以粗体示出，Chothia CDR以斜体示出，组合的CDR以方框示出。反向突变的框架位置用双下划线标出。图2A示出了鼠抗体B的VH序列(SEQ ID NO：15)和人源化VH序列B-H.1A至B-H.1C(SEQ ID NO：23-25)。图2B示出了鼠抗体B的VL序列(SEQ ID NO：16)和人源化VL序列B-H.1D至B-H.1H(SEQ ID NO：26-30)。

图3描绘了TCRBV基因家族和亚家族的系统发生树，并映射了相应的抗体。亚家族身份如下：亚家族A：TCRβV6；亚家族B：TCRβV10；亚家族C：TCRβV12；亚家族D：TCRβV5；亚家族E：TCRβV7；亚家族F：TCRβV11；亚家族G：TCRβV14；亚家族H：TCRβV16；亚家族I：TCRβV18；亚家族J：TCRβV9；亚家族K：TCRβV13；亚家族L：TCRβV4；亚家族M：TCRβV3；亚家族N：TCRβV2；亚家族O：TCRβV15；亚家族P：TCRβV30；亚家族Q：TCRβV19；亚家族R：TCRβV27；亚家族S：TCRβV28；亚家族T：TCRβV24；亚家族U：TCRβV20；亚家族V：TCRβV25；以及亚家族W：TCRβV29亚家族。亚家族成员在本文标题为“TCR beta V(TCRβV)”的部分详细描述。

图4A-图4C示出了被抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1)激活6天的人CD3+ T细胞。使用磁珠分离(阴性选择)分离人CD3+ T细胞，并用固定的(板包被的)抗TCR Vβ13.1(A-H.1)或抗CD3e(OKT3)抗体以100nM激活6天。图4A示出了先使用抗TCRVβ13.1(A-H.1)，后使用荧光物缀合的二抗用于流式细胞术分析而评估了TCRVβ13.1表面表达的扩增T细胞的两个散点图(左：用OKT3激活；右：用A-H.1激活)。图4B示出了由抗TCRVβ13.1(A-H.1)或抗CD3e(OKT3)激活的TCRVβ13.1阳性T细胞相对于总T细胞(CD3+)的百分比(％)。图4C示出了通过以60μl/min的恒定速率对20秒内每个T细胞亚群门(CD3或TCRVβ13.1)中的事件数进行计数而获得的相对细胞计数。数据示出为3个供体的平均值。

图5A-图5B示出了被抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1)激活的人CD3+ T细胞对转化细胞系RPMI 8226的溶细胞活性。图5A描绘了用A-H.1或OKT3激活的人CD3+ T细胞的靶细胞裂解。使用磁珠分离(阴性选择)分离人CD3+ T细胞，并在指定的浓度下用固定的(板包被的)A-H.1或OKT3激活4天，然后与RPMI 8226细胞在5∶1的(E∶T)比下共培养2天。接下来，使用流式细胞术分析，通过CFSE/CD138标记的且膜不透性的DNA染料(DRAQ7)进行FACS染色，来分析样品中RPMI 8226细胞的细胞裂解。图5B示出了将被A-H.1或OKT3激活的人CD3+ T细胞以5∶1的(E∶T)比与RPMI-8226温育6天，随后如上所述对RPMI 8226细胞进行细胞裂解分析而得到的靶细胞裂解。靶细胞裂解百分比(％)通过使用公式[(x-基础)/(100％-基础)，其中x为样品的细胞裂解]，相对于基础靶细胞裂解(即，无抗体处理)归一化来确定。示出的数据代表n＝1个供体。

图6A-图6B示出了通过用所示抗体激活的人PBMC的IFNg产生。从指定数量的供体的全血中分离人PBMC，然后用所示抗体以100Nm进行固相(板包被)刺激。在第1、2、3、5或6天收集上清液。图6A是比较在激活后第1、2、3、5或6天，用所示抗体激活(用抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1或A-H.2)或抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活)的人PBMC中的IFNg产生的图。图6B示出了在激活后第1、2、3、5或6天，用所示抗体激活(用所示抗TCRVβ13.1抗体或抗CD3e抗体(OKT3)激活)的人PBMC中的IFNg产生。

图7A-图7B示出了用所示抗体激活的人PBMC的IL-2产生。使用与图6A-图6B所述的类似实验设定。

图8A-图8B示出了用所示抗体激活的人PBMC的IL-6产生。使用与图6A-图6B所述的类似实验设定。

图9A-图9B示出了用所示抗体激活的人PBMC的TNF-α产生。使用与图6A-图6B所述的类似实验设定。

图10A-图10B示出了用所示抗体激活的人PBMC的IL-1β产生。使用与图6A-图6B所述的类似实验设定。

图11A-图11B是示出与被抗CD3e抗体OKT3激活的PBMC相比，被抗TCRVβ13.1抗体A-H.1激活的人PMBC中的IFNg分泌的延迟动力学的图。图11A示出了来自4个供体的IFNg分泌数据。图11B示出了来自另外4个供体的IFNg分泌数据。示出的数据代表n＝8个供体。

图12描绘了与被抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，被抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1或A-H.2)激活的人PBMC中增加的CD8+ TSCM和Temra T细胞亚群。

图13A-图13F示出了抗TCRVb抗体的表征。图13A是描绘用抗CD3(OKT3)抗体或抗TCRVb抗体激活的T细胞增殖的图。图13B示出了采用抗TCRVb抗体时的CD45RA+效应记忆CD8+和CD4+ T细胞(TEMRA细胞)的选择性扩增。Tn＝幼稚T细胞；Tscm＝干细胞记忆T细胞；Tcm＝中央记忆T细胞；Tem＝效应记忆T细胞；Temra＝效应记忆CD45RA+ T细胞。图13C是示出用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的PBMC的IFN-g分泌的图。图13D示出了用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞的靶细胞裂解。刺激细胞4天，然后与多发性骨髓瘤靶细胞温育2天，以评估细胞杀伤力。图13E是示出用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞的穿孔素分泌的图。用100ng/ml平板结合抗体刺激5天后，通过FACS染色来分析PBMC中的TCRVB阳性和TCRVB阴性T细胞中的穿孔素。图13F是示出用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞的粒酶B的图。用100ng/ml平板结合抗体刺激5天后，通过FACS染色来分析PBMC中的TCRVB阳性和TCRVB阴性T细胞中的粒酶B。

图14A-14B示出了通过用抗TCRVb抗体以100nM的剂量刺激PBMC 6天，IL-2和IL-15的产生以及人NK细胞的扩增。图14A示出了用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞中IL-2或IL-15的分泌。图14B描绘了流式细胞术点图，其示出了在用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体或对照样品刺激的细胞中NKp46染色与CD56抗体染色。

图15A-图15C示出了用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的PBMC中细胞因子的分泌。

图16A-图16B示出了通过双重靶向BCMA-TCRvb抗体分子杀死MM细胞。图16A示出了以下双重靶向抗体分子之一的体外杀伤：BCMA-TCRVb、BCMA-CD3或对照-TCRVb；或同型对照。图16B示出了通过双重靶向BCM-TCRVb抗体对MM细胞的体内杀伤。

图17示出了具有识别一个臂上的FcRH5和另一臂上的TCRVb的双重靶向抗体的MM靶细胞的裂解。

图18A-18C为与二聚化模块(例如，免疫球蛋白恒定结构域)连接的功能部分的示例性形式和构型的示意图。图18A描绘了与异二聚体Fc结构域共价连接的部分A、B、C和D。图18B描绘了与同二聚体Fc结构域共价连接的部分A、B、C和D。图18C描绘了与异二聚体重和轻恒定结构域(例如，Fab CH₁和Fab CL)共价连接的部分A、B、C和D。在一些实施方案中，功能部分为结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，功能部分为以大致相同的亲和力结合野生型钙网蛋白和钙网蛋白突变蛋白的抗原结合结构域。在一些实施方案中，功能部分为相比于野生型钙网蛋白优先结合钙网蛋白突变蛋白的抗原结合结构域，例如，其中第一钙网蛋白突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6286，并且野生型钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285。在一些实施方案中，功能部分为免疫细胞衔接物，其选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物。在一些实施方案中，功能部分为细胞因子分子。在一些实施方案中，功能部分为基质修饰部分。

图19A和图19B为多功能分子的示例性形式和构型的示意图，所述多功能分子包含结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域(例如，第一Fab)、结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域(例如，第二Fab)和一个或多个结合CD3的部分(例如，结合CD3的scFv)。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域(例如，第一Fab)结合本文公开的钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)，例如，表2或3中公开的钙网蛋白突变蛋白，例如表2或3中公开的1型或2型钙网蛋白突变蛋白，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6113或6314的钙网蛋白突变蛋白。在一个实施方案中，第二抗原结合结构域(例如，第二Fab)结合本文公开的钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)，例如，表2或3中公开的钙网蛋白突变蛋白，例如表2或3中公开的1型或2型钙网蛋白突变蛋白，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313或6314的钙网蛋白突变蛋白。

图20A和图20B为多功能分子的示例性形式和构型的示意图，所述多功能分子包含结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域(例如，第一Fab)、结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域(例如，第二Fab)、和一个或多个结合TCR(例如TCRβ)的部分(例如结合TCR(例如TCRβ)的scFv)。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域(例如，第一Fab)结合本文公开的钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)，例如，表2或3中公开的钙网蛋白突变蛋白，例如表2或3中公开的1型或2型钙网蛋白突变蛋白，例如，包含氨基酸序列SEQID NO：6313或6314的钙网蛋白突变蛋白。在一个实施方案中，第二抗原结合结构域(例如，第二Fab)结合本文公开的钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)，例如，表2或3中公开的钙网蛋白突变蛋白，例如表2或3中公开的1型或2型钙网蛋白突变蛋白，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313或6314的钙网蛋白突变蛋白。

图21A和图21B为多功能分子的示例性形式和构型的示意图，所述多功能分子包含结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的第一抗原结合结构域(例如，第一Fab)、结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的第二抗原结合结构域(例如，第二Fab)、和一个或多个结合NKp30的部分(例如结合NKp30的抗体分子或配体)。在一个实施方案中，第一抗原结合结构域(例如，第一Fab)结合本文公开的钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)，例如，表2或3中公开的钙网蛋白突变蛋白，例如表2或3中公开的1型或2型钙网蛋白突变蛋白，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313或6314的钙网蛋白突变蛋白。在一个实施方案中，第二抗原结合结构域(例如，第二Fab)结合本文公开的钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)，例如，表2或3中公开的钙网蛋白突变蛋白，例如表2或3中公开的1型或2型钙网蛋白突变蛋白，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6313或6314的钙网蛋白突变蛋白。

图22是示出NKp30抗体与NK92细胞的结合的图。将数据计算为AF747阳性群体百分比。

图23是示出通过NKp30抗体激活NK92细胞的图。使用仓鼠抗NKp30 mAb生成数据。

图24A-24D为示出了包含TGFβ抑制剂的示例性多特异性分子的示意图。在一些实施方案中，TGFβ抑制剂包含TGF-β受体ECD同二聚体。在一些实施方案中，TGFβ抑制剂包含TGFBR2 ECD异二聚体。在图24A和图24B中，两个TGFBR ECD结构域连接至两个Fc区的C-末端。在一些实施方案中，图24A或图24B中所示的CH1-Fc-TGFBR ECD区包含氨基酸序列SEQID NO：6405或3193。在一些实施方案中，图24A或图24B中所示的Fc-TGFBR ECD区包含氨基酸序列SEQ ID NO：6407或6408。在图24C和图24D中，两个TGFBR ECD结构域分别连接至CH1和CL。在一些实施方案中，图24C或图24D中所示的TGFBR ECD-CH1-Fc区包含氨基酸序列SEQID NO：6409或6410。在一些实施方案中，图24C或图24D中所示的TGFBR ECD-CL区包含氨基酸序列SEQ ID NO：6411或6412。在一些实施方案中，多特异性分子包含结合部分A和结合部分B。在一些实施方案中，结合部分A或结合部分B是本文公开的靶向钙网蛋白的抗原结合结构域。

具体实施方式

本文公开了包含多个(例如，两个或更多个)功能部分(或结合特异性部分)的多功能分子(本文也称为“多特异性分子”)，其包含(i)结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，例如，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285或6286，和(ii)以下的一项、两项或全部：(a)免疫细胞衔接物，其选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物；(b)细胞因子分子；(c)基质修饰部分，和(d)肿瘤靶向部分(例如，其结合选自以下的肿瘤抗原：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1)。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或突变型钙网蛋白，例如如本文所述的)。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合表2或表3中公开的钙网蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合表2或表3中公开的1型钙网蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合表2或表3中公开的2型钙网蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合表2或表3中公开的1型和2型钙网蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，T细胞衔接物包含结合TCR的β亚基的可变链(TCRβV)(例如TCRβV6或TCRβV12)的另外的抗原结合结构域。

在一个实施方案中，多特异性或多功能分子是双特异性(或双功能)分子、三特异性(或三功能)分子或四特异性(或四功能)分子。在一个实施方案中，多特异性或多功能分子是双特异性分子。

不受理论束缚，期望在例如在表面上表达钙网蛋白的细胞的存在下，本文公开的多特异性或多功能分子定位(例如，桥接)和/或激活免疫细胞(例如，选自T细胞、NK细胞、B细胞、树突细胞或巨噬细胞的免疫效应细胞)。在表达钙网蛋白的细胞的存在下，使用本文所述的多特异性或多功能分子增加免疫细胞的接近度和/或活性预期增强针对靶细胞的免疫应答，从而提供更有效的治疗。

公开了新型多功能、例如多特异性分子，其包括(i)基质修饰部分和(ii)结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白和/或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域，例如，其中钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：6285或6286。不受理论束缚，据信本文公开的多功能分子尤其是靶向(例如，定位于)癌症部位，并改变肿瘤间质，例如，改变癌症部位附近的肿瘤微环境。多功能分子还可包括以下中的一项或两项：免疫细胞衔接物(例如，选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物中的一种、两种、三种或全部)；和/或细胞因子分子。因此，本文尤其提供了包括上述部分的多功能、例如多特异性分子，编码所述分子的核酸，生产上述分子的方法和使用上述分子治疗癌症的方法。

因此，本文尤其提供了包含前述部分的多特异性或多功能分子(例如，多特异性或多功能抗体分子)、编码所述分子的核酸、产生前述分子的方法，以及使用前述分子治疗疾病或病症例如癌症的方法。

定义

在一些实施方案中，多功能分子包含免疫细胞衔接物。“免疫细胞衔接物”是指结合和/或激活免疫细胞(例如，参与免疫应答的细胞)的一种或多种结合特异性。在实施方案中，免疫细胞选自T细胞、NK细胞、B细胞、树突细胞和/或巨噬细胞。免疫细胞衔接物可以是抗体分子、受体分子(例如，全长受体、受体片段或其融合体(例如，受体-Fc融合体))或配体分子(例如，全长配体、配体片段或其融合体(例如，配体-Fc融合体))，其结合至免疫细胞抗原(例如，T细胞、NK细胞抗原、B细胞抗原、树突细胞抗原和/或巨噬细胞抗原)。在实施方案中，免疫细胞衔接物特异性结合至靶免疫细胞，例如，优先结合至靶免疫细胞。例如，当免疫细胞衔接物是抗体分子时，它以小于约10nM的解离常数结合至免疫细胞抗原(例如，T细胞抗原、NK细胞抗原、B细胞抗原、树突细胞抗原和/或巨噬细胞抗原)。

如本文所用，术语“T细胞受体β可变链”、“TCRVβ”、“TCRVb”和“TCRβV”可互换使用，是指包含T细胞受体的抗原识别结构域的T细胞受体β链的细胞外区域。术语TCRVβ或TCRβV包括亚型，哺乳动物(例如人)TCRβV、人的种类同系物(species homologs)和包含至少一个与TCRβV的共用表位的类似物。人TCRβV包括包含亚家族的基因家族，所述亚家族包括但不限于：TCRβV6亚家族、TCRβV10亚家族、TCRβV12亚家族、TCRβV5亚家族、TCRβV7亚家族、TCRβV11亚家族、TCRβV14亚家族、TCRβV16亚家族、TCRβV18亚家族、TCRβV9亚家族、TCRβV13亚家族、TCRβV4亚家族、TCRβV3亚家族、TCRβV2亚家族、TCRβV15亚家族、TCRβV30亚家族、TCRβV19亚家族、TCRβV27亚家族、TCRβV28亚家族、TCRβV24亚家族、TCRβV20亚家族、TCRβV25亚家族或TCRβV29亚家族。在一些实施方案中，TCRβV6亚家族包含：TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01。在一些实施方案中，TCRβV包含TCRβV6-5*01。TCRβV6-5*01已知为TRBV65；TCRBV6S5；TCRBV13S1或TCRβV13.1。TCRβV6-5*01(例如人TCRβV6-5*01)的氨基酸序列是本领域已知的，例如由IMGT ID L36092所提供的。在一些实施方案中，TCRβV6-5*01由核酸序列SEQ ID NO：1043，或与其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列编码。在一些实施方案中，TCRβV6-5*01包含氨基酸序列SEQ ID NO：1044，或与其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。

在一些实施方案中，多功能分子包含细胞因子分子。如本文所用，“细胞因子分子”是指细胞因子的全长、片段或变体；还包含受体结构域，例如，细胞因子受体二聚化结构域的细胞因子；或细胞因子受体的激动剂，例如，针对细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引发天然存在的细胞因子的至少一种活性。在一些实施方案中，细胞因子分子选自白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、白介素-21(IL-21)或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。在实施方案中，细胞因子分子可以进一步包含细胞因子受体二聚化结构域。在其他实施方案中，细胞因子分子是细胞因子受体的激动剂，例如，针对选自IL-15Ra或IL-21R的细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)

如本文所用，在例如抗体分子、细胞因子分子、受体分子中使用的术语“分子”包括全长的、天然存在的分子，以及变体，例如，功能变体(例如，其截短物、片段、突变(例如，基本上相似的序列)或衍生形式)，只要未修饰的(例如，天然存在的)分子的至少一种功能和/或活性得到保留。

在一些实施方案中，多功能分子包含基质修饰部分。如本文所用，“基质修饰部分”是指能够改变，例如，降解基质的组分的试剂，例如，蛋白质(例如，酶)。在实施方案中，基质的组分选自，例如，ECM组分，例如，糖胺聚糖，例如，玻尿酸(也称为透明质酸或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、巢蛋白、生腱蛋白、聚集蛋白聚糖和硫酸角蛋白；或细胞外蛋白，例如，胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白。

某些术语定义如下。

如本文所用，冠词“一”和“一个”是指一个或多于一个(例如，是指至少一个)的冠词语法对象。当与术语“包括”一起使用时，术语“一”或“一个”的使用可以表示“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

如本文所用，“约”和“近似”通常是指在给定测量的性质或精度的情况下，所测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值范围的20％之内，通常在10％之内，更通常在5％之内。

如本文所用，“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。在实施方案中，抗体分子包括全长抗体的抗原结合或功能片段，或全长免疫球蛋白链。例如，全长抗体是天然存在或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(Ig)分子(例如，IgG抗体)。在实施方案中，抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分，如抗体片段。抗体片段，例如，功能片段，是抗体的一部分，例如，Fab、Fab′、F(ab′)₂、F(ab)₂、可变片段(Fv)、结构域抗体(dAb)或单链可变片段(scFv)。功能性抗体片段结合与完整(例如，全长)抗体识别的抗原相同的抗原。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离的片段(如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段)，或重组单链多肽分子，其中轻链和重链可变区通过肽接头连接(“scFv蛋白”)。在一些实施方案中，抗体片段不包括无抗原结合活性的抗体部分，如Fc片段或单个氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如，dAb(结构域抗体)、单链、Fab、Fab’和F(ab’)₂片段，以及单链可变片段(scFv)。

如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指可以形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，该序列可以包括天然存在的可变结构域的全部或部分氨基酸序列。例如，该序列可以包括或可以不包括一个、两个或更多个N-或C-末端氨基酸，或可以包括与蛋白质结构的形成相容的其他改变。

在实施方案中，抗体分子是单特异性的，例如，其包含对单个表位的结合特异性。在一些实施方案中，抗体分子是多特异性的，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，而第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方案中，抗体分子是双特异性抗体分子。如本文所用，“双特异性抗体分子”是指对多于一个(例如，两个、三个、四个或更多个)表位和/或抗原具有特异性的抗体分子。

如本文所用，“抗原”(Ag)是指可以引起免疫应答(例如涉及某些免疫细胞的激活和/或抗体生成)的分子。包括几乎所有蛋白质或肽在内的任何大分子均可以是抗原。抗原也可以源自基因组重组体或DNA。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都编码“抗原”。在实施方案中，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也根本不必由基因编码。在实施方案中，抗原可以是合成的或者可以得自生物样品，例如组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物学组分的流体。如本文所用，“肿瘤抗原”或可互换地，“癌抗原”包括存在于癌(例如可以引发免疫应答的癌细胞或肿瘤微环境)上或与之相关的任何分子。如本文所用，“免疫细胞抗原”包括存在于可引起免疫应答的免疫细胞上或与之相关的任何分子。

抗体分子的“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的抗体分子例如免疫球蛋白(Ig)分子的一部分。在实施方案中，抗原结合位点由重(H)链和轻(L)链的可变(V)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的可变区内的三个高度分歧的序列段称为高变区，位于更保守的侧翼序列段(称为“框架区”(FR))之间。FR是天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在实施方案中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面，其与结合抗原的三维表面互补。每一个重链和轻链的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR已经例如在Kabat，E.A.，等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242和Chothia，C.等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917中定义和描述。每条可变链(例如，可变重链和可变轻链)通常由三个CDR和四个FR组成，它们按以下氨基酸顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

如本文所用，“癌症”可以涵盖所有类型的致癌过程和/或癌性生长。在实施方案中，癌症包括原发性肿瘤以及转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官。在实施方案中，癌症涵盖所有组织病理学和阶段，例如癌症的浸润性/严重性的阶段。在实施方案中，癌症包括复发性和/或耐药性癌症。术语“癌症”和“肿瘤”可以互换使用。例如，两个术语都包括实体瘤和液体瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。

如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫系统中起作用以例如保护免受感染原和异物侵害的各种细胞中的任何一种。在实施方案中，该术语包括白细胞，例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。固有的白细胞包括吞噬细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和天然杀伤细胞。固有白细胞通过经由接触来攻击更大的病原体或通过吞噬并然后杀死微生物来识别和消灭病原体，并且是激活适应性免疫应答的介质。适应性免疫系统的细胞是特殊类型的白细胞，称为淋巴细胞。B细胞和T细胞是重要的淋巴细胞类型，它们来源于骨髓中的造血干细胞。B细胞参与体液免疫应答，而T细胞参与细胞介导的免疫应答。术语“免疫细胞”包括免疫效应细胞。

如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，例如，促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括但不限于T细胞(例如α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NK T)细胞和肥大细胞。

术语“效应子功能”或“效应子应答”是指细胞的专有功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

本发明的组合物和方法包括具有指定序列或与其基本相同或相似的序列(例如与指定序列至少80％、85％、90％、95％相同或更高相同的序列)的多肽和核酸。在氨基酸序列的上下文中，本文使用的术语“基本上相同”是指第一氨基酸包含与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基i)相同，或ii)具有保守置换的足够或最少数目的氨基酸残基，使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可以具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，氨基酸序列含有与参考序列(例如本文提供的序列)具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的共同结构域。

在核苷酸序列的上下文中，本文使用的术语“基本上相同”是指第一核酸序列包含与第二核酸序列中的比对核苷酸相同的足够或最小数目的核苷酸，使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同的结构多肽结构域或共同的功能多肽活性的多肽。例如，与参考序列(例如本文提供的序列)具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

术语“变体”是指具有与参考氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，或由基本相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，变体是功能变体。

术语“功能变体”是指具有与参考氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，或由基本相同的核苷酸序列编码，并且能够具有参考氨基酸序列的一个或多个活性的多肽。

如下进行序列之间的同源性或序列同一性(这些术语在本文中可互换使用)的计算。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位，以供最佳比对，并且出于比较的目的可以忽略非同源序列)。在一个优选的实施方案中，出于比较的目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、60％，并且甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。

在考虑到需要被引入以供两个序列进行最佳比对的空位的数目和每个空位的长度的情况下，两个序列之间的同一性百分比是由该序列共享的相同位置的数目的函数。

可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。在一个优选的实施方案中，使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(已结合到GCG软件包(可从http：//www.gcg.com获取)中的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重，来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包(可从http：//www.gcg.com获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵，40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重，来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。一组特别优选的参数(除非另有说明，否则应使用的一组参数)是Blossum 62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。

可以使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)的算法(已结合至ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4，来确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比。

本文所述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，从而例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行此类搜索。可以用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的空位化BLAST。使用BLAST和空位化BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.

应当理解，本发明的分子可以具有另外的保守或非必需氨基酸置换，该置换对它们的功能没有实质性影响。

术语“氨基酸”旨在涵盖所有分子，无论是天然的还是合成的，其既包括氨基官能团又包括酸官能团并且能够被包括在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性的氨基酸包括天然存在的氨基酸；类似物、其衍生物和同类物；具有变异侧链的氨基酸类似物；以及前述的任一种的所有立体异构体。如本文所用，术语“氨基酸”包括D-或L-旋光异构体和拟肽。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的一种置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

本文可互换地使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果是单链的话)是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物，例如，经二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，例如与标记组分的缀合。多肽可以从天然来源中分离，可以通过重组技术从真核或原核宿主中产生，或者可以是合成过程的产物。

术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以是单链或双链的，并且如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步被修饰，例如与标记组分缀合。核酸可以是重组多核苷酸，或者是基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，其不是天然存在的，或是以非天然的方式与另一多核苷酸连接。

如本文所用，术语“分离的”是指从其来源或天然环境(例如，自然环境，如果其天然存在的话)中取出的材料。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是没有分离的，而通过人为干预从天然系统中的某些或全部共存物质中分离的相同多核苷酸或多肽则是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，并且/或者这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是其在自然界中发现的环境的一部分。

如本文所用，术语“转化生长因子β-1(TGF-β1)”是指人类由基因TGFB1或其同源序列编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P01137提供了示例性的人TGF-β1氨基酸序列。示例性的不成熟的人TGF-β1氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6378。示例性的成熟的人TGF-β1氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6395。

如本文所用，术语“转化生长因子β-2(TGF-β2)”是指人类由基因TGFB2或其同源序列编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P61812提供了示例性的人TGF-β2氨基酸序列。示例性的不成熟的人TGF-β2氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6379。示例性的成熟的人TGF-β2氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6396。

如本文所用，术语“转化生长因子β-3(TGF-β3)”是指人类由基因TGFB3或其同源序列编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P10600提供了示例性的人TGF-β3氨基酸序列。示例性的不成熟的人TGF-β3氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6380。示例性的成熟的人TGF-β3氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6397。

如本文所用，“TGF-β受体多肽”是指TGF-β受体(例如，TGFBR1、TGFBR2或TGFBR3)或其片段，或其变体。

如本文所用，术语“转化生长因子β受体1型(TGFBR1)”(还称为ALK-5或SKR4)是指人类由基因TGFBR1或其同源序列编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P36897提供了示例性的人TGFBR1氨基酸序列。示例性的不成熟的人TGFBR1氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6381，6382和6383。示例性的成熟的人TGFBR1氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6398，6399和6400。如本文所用，“TGFBR1多肽”是指TGFBR1或其片段，或其变体。

如本文所用，术语“转化生长因子β受体2型(TGFBR2)”是指人类由基因TGFBR2或其同源序列编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P37173提供了示例性的人TGFBR2氨基酸序列。示例性的不成熟的人TGFBR2氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6384和6385。示例性的成熟的人TGFBR2氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6401和6402。如本文所用，“TGFBR2多肽”是指TGFBR2或其片段，或其变体。

如本文所用，术语“转化生长因子β受体3型(TGFBR3)”是指人类由基因TGFBR3或其同源序列编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q03167提供了示例性的人TGFBR3氨基酸序列。示例性的不成熟的人TGFBR3氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6392和6393。示例性的成熟的人TGFBR3氨基酸序列提供为SEQ ID NO：6403和6404。如本文所用，“TGFBR3多肽”是指TGFBR3或其片段，或其变体。

下面更详细地描述本发明的各个方面。在整个说明书中阐述了其他定义。

抗体分子

在一些实施方案中，如本文所述的多功能分子、多特异性分子和/或抗原结合结构域包含抗体分子。在一个实施方案中，抗体分子与癌抗原，例如肿瘤抗原或基质抗原结合。在一些实施方案中，癌抗原是例如哺乳动物例如人的癌抗原。在其他实施方案中，抗体分子与免疫细胞抗原，例如哺乳动物(例如人)免疫细胞抗原结合。例如，抗体分子特异性结合癌抗原或免疫细胞抗原上的表位，例如线性或构象表位。

在一个实施方案中，抗体分子是单特异性抗体分子，并结合单个表位。例如，单特异性抗体分子具有多个免疫球蛋白可变结构域序列，每个序列结合相同的表位。

在一个实施方案中，抗体分子是多特异性或多功能抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，而所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同抗原，例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。

在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或Fab或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或Fab或其片段。

在一个实施方案中，抗体分子包括双抗体、单链分子以及抗体的抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)₂和Fv)。例如，抗体分子可以包含重(H)链可变结构域序列(在本文中缩写为VH))和轻(L)链可变结构域序列(在本文中缩写为VL)。在一个实施方案中，抗体分子包含重链和轻链(在本文中称为半抗体)或由其组成。在另一个实例中，抗体分子包含两个重(H)链可变结构域序列和两个轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点，例如Fab、Fab′、F(ab’)₂、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变结构域抗体、双抗体(Dab)(双价和双特异性)和嵌合(例如人源化)抗体，它们可以通过修饰完整抗体而产生或使用重组DNA技术从头合成。这些功能性抗体片段保留与它们各自的抗原或受体选择性结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何种类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，以及来自抗体的任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体分子的制剂可以是单克隆的或多克隆的。抗体分子也可以是人的、人源化的、CDR移植的或体外产生的抗体。抗体可以具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可以与术语“抗体”互换使用。

抗体分子的抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，一种包含两个在铰链区通过二硫键桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的双抗体(dAb)片段；(vi)骆驼或骆驼化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)；(viii)单结构域抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

抗体分子包括完整分子及其功能片段。可以改变抗体分子的恒定区，例如使其突变，以修饰抗体的特性(例如，增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能，或补体功能)。

抗体分子也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然不含轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化的抗体和并非衍生自抗体的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域的任何单结构域抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人类、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。根据本发明的另一个方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。例如在WO9404678中公开了这种单结构域抗体。为了清楚起见，这种源自天然缺乏轻链的重链抗体的可变结构域在本文中被称为VHH或纳米抗体，以使其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这样的VHH分子可以源自在骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼)中产生的抗体。除骆驼科外，其他物种也可产生天然缺乏轻链的重链抗体；这样的VHH在本发明的范围内。

VH和VL区可以细分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为“框架区”(FR或FW)。

框架区和CDR的范围已通过多种方法精确地定义(参见Kabat、E.A.，等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Chothia，C.等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；和Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。通常参见，例如，抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains)。载于《抗体工程实验室手册(AntibodyEngineering Lab Manual)》(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。

如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。通常，每个重链可变区中有三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。

可以使用多种已知方案中的任何一种来确定给定CDR的精确氨基酸序列边界，包括Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局(Public Health Service，National Institutes ofHealth)，Bethesda，MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273，927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也称为“高变环”。

例如，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；而轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；而VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。

每个VH和VL通常包括三个CDR和四个FR，它们按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

抗体分子可以是多克隆或单克隆抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术或不使用杂交瘤技术的方法(例如重组方法)制备。

抗体可以重组产生，例如通过噬菌体展示或通过组合方法产生。

用于产生抗体的噬菌体展示和组合方法在本领域中是已知的(如在例如Ladner等人，美国专利号5,223,409；Kang等人，国际公开号WO 92/18619；Dower等人，国际公开号WO91/17271；Winter等人，国际公开号WO 92/20791；Markland等人，国际公开号WO 92/15679；Breitling等人，国际公开号WO 93/01288；McCafferty等人，国际公开号WO 92/01047；Garrard等人，国际公开号WO 92/09690；Ladner等人，国际公开号WO 90/02809；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人，(1989)Science246：1275-1281；Griffths等人，(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人，(1992)J Mol Biol226：889-896；Clackson等人，(1991)Nature 352：624-628；Gram等人，(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；以及Barbas等人，(1991)PNAS88：7978-7982中所述，其全部内容通过引用并入本文)。

在一个实施方案中，抗体是完全人抗体(例如，在已被基因工程化以从人免疫球蛋白序列产生抗体的小鼠中制备的抗体)，或非人抗体，例如啮齿动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如猴)、骆驼抗体。优选地，非人抗体是啮齿动物抗体(小鼠或大鼠抗体)。产生啮齿动物抗体的方法是本领域已知的。

可以使用携带人免疫球蛋白基因而非小鼠系统的转基因小鼠来产生人单克隆抗体。来自这些用感兴趣的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞被用于产生杂交瘤，该杂交瘤分泌对人蛋白质的表位具有特定亲和力的人mAb(参见，例如，Wood等人，国际申请WO 91/00906，Kucherlapati等人，PCT公开WO 91/10741；Lonberg等人，国际申请WO 92/03918；Kay等人，国际申请92/03917；Lonberg，N等人，1994Nature 368：856-859；Green，L.L.等人，1994Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等人，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等人，1993Year Immunol 7：33-40；Tuaillon等人，1993PNAS 90：3720-3724；Bruggeman等人，1991Eur J Immunol 21：1323-1326)。

抗体分子可以是在非人类生物体例如大鼠或小鼠中产生可变区或其一部分例如CDR的抗体分子。嵌合的、CDR移植的和人源化的抗体在本发明之内。在非人类生物体例如大鼠或小鼠中产生，然后例如在可变框架或恒定区中修饰以降低在人中的抗原性的抗体分子在本发明之内。

“有效人”蛋白是基本上不引起中和抗体应答，例如人抗鼠抗体(HAMA)应答的蛋白。在许多情况下，例如，如果反复施用抗体分子，例如用于治疗慢性或复发性疾病，HAMA可能会成问题。由于从血清中清除的抗体增加(参见例如Saleh等人，CancerImmunol.Immunother.，32：180-190(1990))，并且还由于潜在的变态反应(参见，例如LoBuglio等人，Hybridoma，5：5117-5123(1986))，HAMA应答可能会使重复的抗体施用无效。

嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来产生(参见Robinson等人，国际专利公开号PCT/US86/02269；Akira等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，国际申请WO 86/01533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better等人，(1988 Science 240：1041-1043)；Liu等人，(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等人，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人，(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等人，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood等人，(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等人，1988，J.NatlCancer Inst.80：1553-1559)。

人源化或CDR移植的抗体将有(免疫球蛋白重链和/或轻链的)至少一个或两个，但通常所有三个受体CDR被供体CDR置换。抗体可以被非人CDR的至少一部分置换，或者仅一些CDR可以被非人CDR置换。仅需要置换与抗原结合所需的CDR数量。优选地，供体将是啮齿动物抗体，例如大鼠或小鼠抗体，而受体将是人框架或人共有框架。通常，提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人的(例如啮齿动物)。受体框架是天然存在的(例如人)框架或共有框架，或与其具有约85％或更高，优选90％、95％、99％或更高的同一性的序列。

如本文所用，术语“共有序列”是指在相关序列家族中由最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国1987)。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置都被该家族中该位置最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸频率均等地出现，则任何一个都可以包括在共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区域。

抗体分子可以通过本领域已知的方法人源化(参见例如Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207；Oi等人，1986，BioTechniques 4：214以及Queen等人，US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，其全部内容通过引用并入本文)。

人源化或CDR移植的抗体分子可以通过CDR移植或CDR置换来产生，其中免疫球蛋白链的一个、两个或全部CDR可以被置换。参见，例如，美国专利5,225,539；Jones等人，1986Nature 321：552-525；Verhoeyan等人，1988 Science 239：1534；Beidler等人，1988J.Immunol.141：4053-4060；Winter US 5,225,539，其全部内容通过引用明确并入本文。Winter描述了可用于制备本发明的人源化抗体的CDR移植方法(1987年3月26日提交的英国专利申请GB 2188638A；Winter 5,225,539)，其内容通过引用明确并入本文。

人源化抗体分子也在本发明的范围内，其中已置换、缺失或添加特定氨基酸。从供体选择氨基酸的标准描述于US 5,585,089，例如，US 5,585,089的第12-16栏，例如，US 5,585,089的第12-16栏中，其内容通过引用并入本文。用于使抗体人源化的其他技术描述于1992年12月23日公开的Padlan等人，EP 519596 A1中。

抗体分子可以是单链抗体。可以对单链抗体(scFV)进行工程化(例如，参见Colcher，D.等人，(1999)Ann N Y Acad Sci 880：263-80；以及Reiter，Y.(1996)ClinCancer Res 2：245-52)。可以将单链抗体二聚化或多聚化以产生对相同靶蛋白的不同表位具有特异性的多价抗体。

在又一些其他实施方案中，抗体分子具有重链恒定区，所述重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人)重链恒定区。在另一个实施方案中，抗体分子具有选自例如κ或λ的(例如人的)轻链恒定区的轻链恒定区。可以改变恒定区，例如使其突变，以修饰抗体的性质(例如，增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能和/或补体功能)。在一个实施方案中，该抗体具有：效应子功能；并可以修复补体。在其他实施方案中，抗体不会：募集效应细胞；或修复补体。在另一个实施方案中，抗体具有降低的结合Fc受体的能力或没有结合Fc受体的能力。例如，它是不支持与Fc受体的结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，其具有诱变或缺失的Fc受体结合区。

改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。功能改变(例如对效应子配体(例如细胞上的FcR或补体的C1成分)的亲和力改变)的抗体，可以通过用不同的残基置换抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基来产生(参见例如EP 388,151 A1，美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，其全部内容通过引用并入本文)。可以描述相似类型的改变，如果其应用于鼠或其他物种，免疫球蛋白将减少或消除这些功能。

抗体分子可以被衍生或连接至另一功能分子(例如，另一种肽或蛋白质)。如本文所用，“衍生的”抗体分子是已被修饰的抗体分子。衍生方法包括但不限于添加荧光部分、放射性核苷酸、毒素、酶或亲和配体例如生物素。因此，本发明的抗体分子旨在包括本文所述抗体的衍生形式和其他修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，抗体分子可以被功能性地连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体，例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒剂、药物试剂，和/或可介导抗体或抗体部分与另一种分子结合的蛋白质或肽(例如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)。

一种类型的衍生抗体分子是通过交联两种或更多种抗体(相同或不同类型，例如以产生双特异性抗体)而产生的。合适的交联剂包括异双功能的交联剂，具有两个被适当的间隔基隔开的不同的反应性基团(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，或同双功能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。此类接头可从Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill获得。

多特异性或多功能抗体分子

全文描述了本文定义的多特异性和多功能分子的示例性结构。在以下文献中进一步描述了示例性结构：Weidle U等人，(2013)The Intriguing Options of MultispecificAntibody Formats for Treatment of Cancer，Cancer Genomics&Proteomics 10：1-18(2013)；以及Spiess C等人(2015)Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies，Molecular Immunology 67：95-106；其全部内容通过引用并入本文。

在实施方案中，多特异性抗体分子可包含超过一个的抗原结合位点，其中不同的位点对不同的抗原具有特异性。在实施方案中，多特异性抗体分子可以结合同一抗原上的超过一个(例如，两个或更多个)的表位。在实施方案中，多特异性抗体分子包含对靶细胞(例如癌细胞)特异性的抗原结合位点和对免疫效应细胞特异性的不同抗原结合位点。在实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性、三特异性或四特异性抗体分子。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体分子可分为五个不同的结构组：(i)双特异性免疫球蛋白G(BsIgG)；(ii)附加有另外的抗原结合部分的IgG；(iii)双特异性抗体片段；(iv)双特异性融合蛋白；和(v)双特异性抗体缀合物。

BsIgG是对每种抗原为单价的形式。示例性的BsIgG形式包括但不限于crossMab、DAF(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵臼结构的常见LC、杵臼结构组装体、电荷对、Fab臂交换、SEEDbody、triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ-bodv、正交Fab。参见Spiess等人，Mol.Immunol.67(2015)：95-106。示例性的BsIgG包括卡妥索单抗(catumaxomab)(Fresenius Biotech，Trion Pharma，Neopharm)，其包含抗CD3臂和抗EpCAM臂；以及厄妥索单抗(ertumaxomab)(Neovii Biotech，Fresenius Biotech)，其靶向CD3和HER2。在一些实施方案中，BsIgG包含经工程化用于异二聚化的重链。例如，可以使用“杵臼结构”策略、SEED平台、常见的重链(例如，在kλ体中)和使用异二聚体Fc区来将重链工程化以进行异二聚化。参见Spiess等人，Mol.Immunol.67(2015)：95-106。用来避免BsIgG中同源二聚体的重链配对的策略包括杵臼结构、duobody、azymetric、电荷对、HA-TF、SEEDbody和差异A蛋白亲和力。参见同上。BsIgG可以通过在不同宿主细胞中分别表达组分抗体并随后纯化/组装成BsIgG来产生。BsIgG也可以通过在单个宿主细胞中表达组分抗体来产生。可以使用亲和色谱法纯化BsIgG，例如使用A蛋白和连续的pH洗脱。

附加有额外的抗原结合部分的IgG是双特异性抗体分子的另一种形式。例如，可以通过在单特异性IgG上(例如在重链或轻链的N-末端或C-末端)附加额外的抗原结合单元，将单特异性IgG工程化为具有双特异性。示例性的额外的抗原结合单元包括单结构域抗体(例如，可变重链或可变轻链)、工程化的蛋白支架和成对的抗体可变结构域(例如，单链可变片段或可变片段)。参见同上。附加的IgG形式的实例包括双可变结构域IgG(DVD-Ig)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L，H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、zybody和D VI-IgG(四合一)。参见Spiess等人，Mol.Immunol.67(2015)：95-106。IgG-scFv的实例是MM-141(Merrimack Pharmaceuticals)，其结合IGF-1R和HER3。DVD-Ig的实例包括结合IL-1α和IL-1β的ABT-981(AbbVie)；以及结合TNF和IL-17A的ABT-122(AbbVie)。

双特异性抗体片段(BsAb)是缺乏一些或全部抗体恒定结构域的双特异性抗体分子的形式。例如，一些BsAb缺乏Fc区。在实施方案中，双特异性抗体片段包括通过肽接头连接的重链区和轻链区，所述肽接头允许BsAb在单个宿主细胞中有效表达。示例性的双特异性抗体片段包括但不限于纳米抗体、纳米抗体-HAS、BiTE、双抗体、DART、TandAb、sc双抗体、sc双抗体-CH3、双抗体-CH3、三体(triple body)、微抗体、微体、TriBi微体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、sc双抗体-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc和细胞内抗体。参见同上。例如，BiTE形式包括串联scFv，其中组分scFv与T细胞上的CD3和癌细胞上的表面抗原结合。

双特异性融合蛋白包括与其他蛋白连接的抗体片段，例如，以增加额外的特异性和/或功能。双特异性融合蛋白的一个实例是immTAC，其包含与识别HLA呈递肽的亲和力成熟的T细胞受体连接的抗CD3 scFv。在实施方案中，对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法可用于产生具有更高价态的双特异性抗体分子。而且，与白蛋白结合蛋白或人血清白蛋白的融合体可以延长抗体片段的血清半衰期。参见同上。

在实施方案中，化学缀合，例如抗体和/或抗体片段的化学缀合，可用于产生BsAb分子。参见同上。示例性的双特异性抗体缀合物包括CovX体形式，其中低分子量药物在每个Fab臂或抗体或其片段中位点特异性地缀合至单个反应性赖氨酸。在实施方案中，缀合改善了低分子量药物的血清半衰期。示例性的CovX体是CVX-241(NCT01004822)，其包含缀合至两个抑制VEGF或Ang2的短肽的抗体。参见同上。

可以通过在宿主系统中重组表达例如至少一种或多种组分来产生抗体分子。示例性的宿主系统包括真核细胞(例如乳动物细胞，例如CHO细胞，或昆虫细胞，例如SF9或S2细胞)和原核细胞(例如，大肠杆菌)。双特异性抗体分子可以通过组分在不同宿主细胞中的单独表达以及随后的纯化/组装来产生。或者，可以通过在单个宿主细胞中表达组分来产生抗体分子。双特异性抗体分子的纯化可以通过各种方法进行，例如亲和色谱法，例如，使用A蛋白和连续的pH洗脱。在其他实施方案中，亲和标签可以用于纯化，例如含组氨酸的标签、myc标签或链霉亲和素标签。

CDR移植的支架

在实施方案中，抗体分子是CDR移植的支架结构域。在实施方案中，支架结构域基于纤连蛋白结构域，例如纤连蛋白III型结构域。纤连蛋白III型(Fn3)结构域的整体折叠与最小的功能性抗体片段(抗体重链的可变结构域)的整体折叠紧密相关。Fn3的末尾有三个环；BC、DE和FG环的位置大致对应于抗体的VH结构域的CDR1、2和3的位置。Fn3没有二硫键；因此，与抗体及其片段不同，Fn3在还原条件下是稳定的(参见，例如，WO 98/56915；WO 01/64942；WO 00/34784)。可以修饰(例如，使用本文所述的CDR或高变环)或改变Fn3结构域，例如，以选择与本文所述的抗原/标志物/细胞结合的结构域。

在实施方案中，支架结构域，例如折叠结构域，是基于抗体，例如通过从单克隆抗体的重链可变结构域中缺失三条β链而产生的“微抗体”支架(参见，例如，Tramontano等人，1994，J Mol.Recognit.7：9；和Martin等人，1994，EMBO J.13：5303-5309)。“微抗体”可用于呈现两个高变环。在实施方案中，支架结构域是V样域(参见，例如，Coia等人，WO 99/45110)或是衍生自tendamistatin的结构域，tendamistatin是由两个二硫键保持在一起的74残基的六链β片层夹心结构(参见例如McConnell和Hoess，1995，J Mol.Biol.250：460)。例如，可以修饰(例如，使用CDR或高变环)tendamistatin的环或将其改变，例如以选择与本文所述的标志物/抗原/细胞结合的结构域。另一个示例性的支架结构域是衍生自CTLA-4的细胞外结构域的β-夹心结构(参见，例如，WO 00/60070)。

其他示例性的支架结构域包括但不限于T细胞受体；MHC蛋白；细胞外结构域(例如纤连蛋白III型重复序列，EGF重复序列)；蛋白酶抑制剂(例Kunitz结构域、大肠杆菌素(ecotin)、BPTI等)；TPR重复序列；三叶(trifoil)结构；锌指结构域；DNA结合蛋白；特别是单体DNA结合蛋白；RNA结合蛋白；酶，例如蛋白酶(特别是灭活的蛋白酶)，RNA酶；分子伴侣，例如硫氧还蛋白和热休克蛋白；以及细胞内信号传导结构域(例如SH2和SH3结构域)。参见，例如，US 20040009530和US 7,501,121，其通过引用并入本文。

在实施方案中，例如通过以下标准中的一个或多个来评价和选择支架结构域：(1)氨基酸序列，(2)多个同源域的序列，(3)3维结构，和/或(4)在pH、温度、盐度、有机溶剂、氧化剂浓度范围内的稳定性数据。在实施方案中，支架结构域是小的、稳定的蛋白质结构域，例如少于100、70、50、40或30个氨基酸的蛋白质。该结构域可以包含一个或多个二硫键或可以螯合金属，例如锌。

基于抗体的融合体

可以产生包含附接于抗体N或C末端的另外结合实体的多种形式。这些与单链或二硫键稳定化的Fv或Fab的融合体导致产生对每种抗原具有二价结合特异性的四价分子。scFv和scFab与IgG的结合使得能够产生可识别三种或更多种不同抗原的分子。

抗体-Fab融合体

抗体-Fab融合体是双特异性抗体，其包含与抗体重链的C末端融合的针对第一靶标的传统抗体和针对第二靶标的Fab。通常，抗体和Fab将具有共同的轻链。抗体融合体可以通过以下产生：(1)将靶标融合体的DNA序列工程化，以及(2)将靶标DNA转染到合适的宿主细胞中以表达融合蛋白。如Coloma，J.等人(1997)Nature Biotech 15：159所述，似乎抗体-scFv融合体可以通过CH3结构域的C末端与scFv的N末端之间的(Gly)-Ser接头连接。

抗体-scFv融合体

抗体-scFv融合体是双特异性抗体，其包含与抗体重链的C末端融合的传统抗体和具有独特特异性的scFv。scFv可以直接通过scFv的重链或通过接头肽融合至C末端。抗体融合体可以通过以下产生：(1)将靶标融合体的DNA序列工程化，以及(2)将靶标DNA转染到合适的宿主细胞中以表达融合蛋白。如Coloma，J.等人(1997)Nature Biotech 15：159所述，似乎抗体-scFv融合体可以通过CH3结构域的C末端与scFv的N末端之间的(Gly)-Ser接头连接。

可变结构域免疫球蛋白DVD

一种相关的形式是双重可变结构域免疫球蛋白(DVD)，其通过较短的接头序列由在V结构域的N末端的第二个特异性位置的VH和VL结构域组成。

其他示例性的多特异性抗体形式包括，例如在以下中描述的那些：US20160114057A1、US20130243775A1、US20140051833、US20130022601、US20150017187A1、US20120201746A1、US20150133638A1、US20130266568A1、US20160145340A1、WO2015127158A1、US20150203591A1、US20140322221A1、US20130303396A1、US20110293613、US20130017200A1、US20160102135A1、WO2015197598A2、WO2015197582A1、US9359437、US20150018529、WO2016115274A1、WO2016087416A1、US20080069820A1、US9145588B、US7919257和US20150232560A1。采用完整抗体-Fab/scFab形式的示例性的多特异性分子包括在以下中描述的那些：US9382323B2、US201400/2581A1、US20140308285A1、US20130165638A1、US20130267686A1、US20140377269A1、US7741446B2和WO1995009917A1。采用结构域交换形式的示例性的多特异性分子包括在以下中描述的那些：US20150315296A1、WO2016087650A1、US20160075785A1、WO2016016299A1、US20160130347A1、US20150166670、US8703132B2、US20100316645、US8227577B2、US20130078249。

含Fc的实体(微抗体)

含Fc的实体(也称为微抗体)可以通过将scFv与恒定重链结构域3的C末端(CH3-scFv)和/或与具有不同特异性的抗体的铰链区(scFv-铰链-Fc)融合而产生。也可以制备具有与IgG的CH3结构域的C末端融合的二硫键稳定化的可变结构域(无肽接头)的三价实体。

含Fc的多特异性分子

在一些实施方案中，本文公开的多特异性分子包括免疫球蛋白恒定区(例如，Fc区)。示例性的Fc区可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区；更特别地，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。

在一些实施方案中，改变免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)，例如使其突变，以增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能。

在其他实施方案中，将第一免疫球蛋白链恒定区和第二免疫球蛋白链恒定区(例如，第一Fc区和第二Fc区)的界面改变(例如使其突变)，以例如相对于非工程化界面(例如自然存在的界面)增加或减少二聚化。例如，免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)的二聚化可以通过为第一Fc区和第二Fc区的Fc界面提供以下中的一种或多种来增强：成对的突起-腔(“杵臼结构”)、静电相互作用或链交换，使得例如相对于非工程化界面，异源多聚体与同源多聚体的比例更大。

在一些实施方案中，多特异性分子包括在选自例如人IgG1的Fc区的347、349、350、351、366、368、370、392、394、395、397、398、399、405、407或409的一个或多个中的位置处的成对的氨基酸置换。例如，免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)可以包括选自以下的成对的氨基酸置换：T366S、L368A或Y407V(例如，对应于腔或臼)和T366W(例如，对应于突起或杵)。

在其他实施方案中，多功能分子包括半衰期延长剂，例如人血清白蛋白，或针对人血清白蛋白的抗体分子。

异二聚化的抗体分子及其制备方法

已经公开了产生多特异性抗体的各种方法来解决不正确的重链配对的问题。示例性方法描述如下。示例性的多特异性抗体形式和制备所述多特异性抗体的方法也公开于例如Speiss等人，Molecular Immunology 67(2015)95-106；和Klein等人，mAbs 4：6，653-663；2012年11月/12月中；其每一个的全部内容通过引用并入本文。

异二聚化的双特异性抗体基于天然IgG结构，其中两个结合臂识别不同的抗原。通过强制重链异二聚化，并结合将轻链(例如共有轻链)错配最小化的技术，来产生能够实现确定的单价(和同时)抗原结合的IgG衍生形式。强制重链异二聚化可以使用例如杵-臼结构或链交换工程化结构域(SEED)获得。

杵臼结构

杵臼结构在US 5,731,116、US 7,476,724和Ridgway，J.等人(1996)Prot.Engineering 9(7)：617-621中描述，宽泛地涉及：(1)使一种或两种抗体的CH3结构域突变以促进异二聚化；和(2)在促进异二聚化的条件下将突变的抗体组合。“杵”或“突起”通常是通过将亲本抗体中的小氨基酸置换为较大的氨基酸(例如T366Y或T366W)来生成的；“臼”或“腔”是通过将亲本抗体中的较大残基置换为较小氨基酸(例如，Y407T、T366S、L368A和/或Y407V)来生成的。

对于包括Fc结构域的双特异性抗体，可以利用将特定突变引入重链的恒定区来促进Fc部分的正确异二聚化。在Klein等人，(mAbs(2012)4：6，1-11)中综述了多种这样的技术，其内容通过引用整体并入本文。这些技术包括“杵臼结构”(KiH)法，该方法涉及将庞大的残基引入一条抗体重链的一个CH3结构域中。该庞大的残基配合到配对重链的另一个CH3结构域中的互补“臼”中，从而促进重链的正确配对(参见，例如，US7642228)。

示例性的KiH突变包括“杵”重链中的S354C、T366W和“臼”重链中的Y349C、T366S、L368A、Y407V。表1中提供了其他示例性的KiH突变，以及另外的可选的稳定化Fc半胱氨酸突变。

表1：示例性的Fc KiH突变和可选的半胱氨酸突变

Igawa和Tsunoda提供了其他Fc突变，他们识别了一条链的CH3结构域中的3个带负电荷的残基，其与另一条链的CH3结构域中的3个带正电荷的残基配对。这些特定的带电荷残基对为：E356-K439、E357-K370、D399-K409，反之亦然。通过单独地或与新识别的二硫桥结合地在链A中引入以下三个突变中的至少两个：E356K、E357K和D399K，以及在链B中引入以下三个突变中的至少两个：K370E、K409D、K439E，能够促进非常有效的异二聚化，同时抑制同二聚化(Martens T等人，A novel one-armed antic-Met antibody inhibitsglioblastoma growth in vivo.Clin Cancer Res 2006；12：6144-52；PMID：17062691)。Xencor基于结构计算和序列信息(随后针对最大异二聚化进行了筛选)的组合定义了41个变体对，定义了链A上的S364H、F405A(HA)和链B上的Y349T、T394F(TF)的组合(Moore GL等人，A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent andmonovalent co-engagement of distinct target antigens.MAbs 2011；3：546-57；PMID：22123055)。

促进多特异性抗体异二聚化的其他示例性的Fc突变包括在以下参考文献中描述的那些，其各自内容通过引用并入本文：WO2016071377A1、US20140079689A1、US20160194389A1、US20160257763、WO2016071376A2、WO2015107026A1、WO2015107025A1、WO2015107015A1、US20150353636A1、US20140199294A1、US7750128B2、US20160229915A1、US20150344570A1、US8003774A1、US20150337049A1、US20150175707A1、US20140242075A1、US20130195849A1、US20120149876A1、US20140200331A1、US9309311B2、US8586713、US20140037621A1、US20130178605A1、US20140363426A1、US20140051835A1和US20110054151A1。

稳定化半胱氨酸突变也已经与KiH和其他促进Fc异二聚化的变体组合使用，参见例如US7183076。其他示例性半胱氨酸修饰包括，例如在US20140348839A1、US7855275B2和US9000130B2公开的那些。

链交换工程化结构域(SEED)

通过设计链交换工程化结构域(SEED)C(H)3异二聚体来支持双特异性和不对称融合蛋白设计的异二聚体Fc平台是已知的。人IgG和IgA C(H)3结构域的这些衍生物产生互补的人SEED C(H)3异二聚体，其由人IgA和IgG C(H)3序列的交替区段组成。当在哺乳动物细胞中表达时，所得的一对SEED C(H)3结构域优先缔合形成异二聚体。SEEDbody(Sb)融合蛋白由[IgG1铰链]-C(H)2-[SEED C(H)3]组成，其可以与一个或多个融合伴侣遗传连接(例如，参见Davis JH等人，SEEDbodies：fusion proteins based on strand exchangeengineered domain(SEED)CH3 heterodimers in an Fc analogue platform forasymmetric binders or immunofusions and bispecific antibodies，Protein Eng DesSel 2010；23：195-202；PMID：20299542和US8871912。其每一个的内容通过引用并入本文)。

Duobody

产生具有正确重链配对的双特异性抗体的“Duobody”技术是已知的。DuoBody技术涉及三个基本步骤，用于在生产后的交换反应中生成稳定的双特异性人IgG1抗体。第一步中，使用标准的哺乳动物重组细胞系分别生产两个IgG1，每个IgG1在第三恒定(CH3)域中包含单个匹配的突变。随后，根据用于回收和纯化的标准方法来纯化这些IgG1抗体。在生产和(生产后的)纯化后，将两个抗体在定制的实验室条件下重组，从而以非常高的产率(通常＞95％)产生双特异性抗体产品(参见例如Labrijn等人，PNAS 2013；110(13)：5145-5150和Labrijn等人，Nature Protocols 2014；9(10)：2450-63，其各自的内容通过引用并入本文)。

静电相互作用

公开了采用带电荷的氨基酸，使用CH3氨基酸变化而制备多特异性抗体的方法，使得同二聚体的形成在静电上是不利的。EP1870459和WO 2009089004描述了在宿主细胞中共表达不同抗体结构域时有利于异二聚体形成的其他策略。在这些方法中，用带电荷的氨基酸置换两个CH3结构域中组成重链恒定结构域3(CH3)、CH3-CH3界面的一个或多个残基，使得同二聚体形成在静电上是不利的并且异二聚化在静电上是有利的。在以下参考文献中描述了使用静电相互作用制备多特异性分子的其他方法，每个参考文献的内容通过引用并入本文，包括US20100015133、US8592562B2、US9200060B2、US20140154254A1和US9358286A1。

共有轻链

需要避免轻链错配以产生双特异性IgG的均质制剂。其实现方式之一是通过使用共有轻链原理，即将共享一个轻链但仍具有不同特异性的两种结合物组合。增强由单体混合物形成期望的双特异性抗体的示例性方法是通过提供共有的可变轻链来与双特异性抗体的每个异聚可变重链区域相互作用。产生具有共有轻链的双特异性抗体的组合物和方法公开于例如US7183076B2、US20110177073A1、EP2847231A1、WO2016079081A1和EP3055329A1中，其各自的内容通过引用并入本文。

CrossMab

减少轻链错配的另一种选择是CrossMab技术，其通过交换一半双特异性抗体的Fab中的CH1和CL结构域来避免非特异性L链错配。这样的交错变体保留了结合特异性和亲和力，但是使两个臂如此不同，以至于防止了L链错配。CrossMab技术(如同上Klein等人中所概述)涉及重链和轻链之间的结构域互换，以促进正确配对的形成。简而言之，为了通过使用两个不同的轻链-重链对来构建可以结合两种抗原的双特异性IgG样CrossMab抗体，采用了两步式修饰过程。首先，使用异二聚化方法(例如，杵臼结构(KiH)技术)将二聚化界面工程化到每个重链的C末端，以确保仅有效地形成了来自一个抗体(例如，抗体A)和第二抗体(例如抗体B)的两条不同重链的异二聚体。接下来，交换一种抗体(抗体A)的恒定重链1结构域(CH1)和恒定轻链结构域(CL)，同时使可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域保持如一。CH1和CL结构域的交换确保修饰的抗体(抗体A)轻链仅能与修饰的抗体(抗体A)重链有效地二聚化，而未修饰的抗体(抗体B)轻链仅能与未修饰的抗体(抗体B)的重链有效地二聚化；因此仅有效地形成期望的双特异性CrossMab(参见例如Cain，C.SciBX 4(28)；doi：10.1038/scibx.2011.783，其内容通过引用并入本文)。

共有重链

增强由单体混合物形成期望的双特异性抗体的示例性方法是通过提供共有的可变重链来与双特异性抗体的每个异聚可变轻链区相互作用。产生具有共有重链的双特异性抗体的组合物和方法公开于例如US20120184716、US20130317200和US20160264685A1中，其各自的内容通过引用并入本文。

氨基酸修饰

产生具有正确的轻链配对的多特异性抗体的替代组合物和方法包括各种氨基酸修饰。例如，Zymeworks描述了在CH1和/或CL结构域中具有一个或多个氨基酸修饰，在VH和/或VL结构域中具有一个或多个氨基酸修饰，或其组合的异二聚体，这些修饰是轻链和重链之间的界面的一部分，并在每条重链和所期望的轻链之间建立优先配对，使得当异二聚体对的两条重链和两条轻链在细胞中共表达时，第一异二聚体的重链优先与一条轻链而不是彼此配对(例如，参见WO2015181805)。其他示例性方法记载于WO2016026943(Argen-X)、US20150211001、US20140072581A1、US20160039947A1和US20150368352中。

λ/κ形式

包含λ轻链多肽和κ轻链多肽的多特异性分子(例如，多特异性抗体分子)可用于允许异二聚化。产生包含λ轻链多肽和κ轻链多肽的双特异性抗体分子的方法公开于PCT公开号WO2018/057955(对应于2017年9月22日提交的PCT/US17/53053中)，其通过引用整体并入本文。

在实施方案中，多特异性分子包括多特异性抗体分子，例如，具有两种结合特异性的抗体分子，例如，双特异性抗体分子。多特异性抗体分子包含：

对第一表位具有特异性的λ轻链多肽1(LLCP1)；

对第一表位具有特异性的重链多肽1(HCP1)；

对第二表位具有特异性的K轻链多肽2(KLCP2)；以及

对第二表位具有特异性的重链多肽2(HCP2)。

如本文所用，术语“λ轻链多肽1(LLCP1)”是指包含足够的轻链(LC)序列的多肽，使得当与同源重链可变区结合时，可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP1的复合。在一个实施方案中，LLCP1包含CH1区的全部或片段。在一个实施方案中，LLCP1包含LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4和CH1，或来自其中的足以介导其表位的特异性结合以及与HCP1的复合的序列。LLCP1与其HCP1一起对第一表位提供特异性(而KLCP2与其HCP2一起对第二表位提供特异性)。如本文其他地方所述，LLCP1对HCP1的亲和力高于对HCP2的亲和力。

如本文所用，术语“κ轻链多肽2(KLCP2)”是指包含足够的轻链(LC)序列的多肽，使得当与同源重链可变区结合时，可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP2的复合。在一些实施方案中，KLCP2包含CH1区的全部或片段。在一个实施方案中，KLCP2包含LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4和CH1，或来自其中的足以介导其表位的特异性结合以及与HCP2的复合的序列。KLCP2与其HCP2一起对第二表位提供特异性(而LLCP1与其HCP1一起对第一表位提供特异性)。

如本文所用，术语“重链多肽1(HCP1)”是指包含足够的重链(HC)序列(例如，HC可变区序列)的多肽，使得当与同源LLCP1结合时可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP1的复合。在一些实施方案中，HCP1包含CH1区的全部或片段。在一个实施方案中，HCP1包含CH2和/或CH 3区的全部或片段。在一个实施方案中，HCP1包含HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4、CH1、CH2和CH3，或来自其中的足以实现以下各项的序列：(i)介导其表位的特异性结合以及与LLCP1的复合，(ii)如本文所述优先与LLCP1而非KLCP2复合；以及(iii)如本文所述优先与HCP2而非另一HCP1分子复合。HCP1与其LLCP1一起提供对第一表位的特异性(而KLCP2与其HCP2一起提供对第二表位的特异性)。

如本文所用，术语“重链多肽2(HCP2)”是指包含足够的重链(HC)序列(例如，HC可变区序列)的多肽，使得当与同源LLCP1结合时可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP1的复合。在一个实施方案中，HCP2包含CH1区的全部或片段。在一些实施方案中，HCP2包含CH2和/或CH3区的全部或片段。在一个实施方案中，HCP1包含HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4、CH1、CH2和CH3，或来自其中的足以实现以下各项的序列：(i)介导其表位的特异性结合以及与KLCP2的复合，(ii)如本文所述优先与KLCP2而非LLCP1复合；(iii)如本文所述优先与HCP1而非另一HCP2分子复合。HCP2与其KLCP2一起提供对第二表位的特异性(而LLCP1与其HCP1一起提供对第一表位的特异性)。

在本文公开的多特异性抗体分子的一些实施方案中：

LLCP1对HCP1的亲和力高于对HCP2的亲和力；并且/或者

KLCP2对HCP2的亲和力高于对HCP1的亲和力。

在实施方案中，LLCP1对HCP1的亲和力充分大于其对HCP2的亲和力，使得在预选条件下，例如在水性缓冲液中(例如在pH 7下)、在盐水中(例如在pH 7下)，或在生理条件下，至少75％、80％、90％、95％、98％、99.5％或99.9％的多特异性抗体分子具有与HCP1复合或接合的LLCP1。

在本文公开的多特异性抗体分子的一些实施方案中：

HCP1对HCP2的亲和力大于对HCP1第二分子的亲和力；并且/或者

HCP2对HCP1的亲和力大于对HCP2第二分子的亲和力。

在实施方案中，HCP1对HCP2的亲和力充分大于其对第二HCP1分子的亲和力，使得在预选条件下，例如在水性缓冲液中(例如在pH 7下)、在盐水中(例如在pH 7中)，或在生理条件下，至少75％、80％、90％、95％、98％、99.5％或99.9％的多特异性抗体分子分子具有与HCP2复合或接合的HCP1。

在另一方面，本文公开了用于制备或产生多特异性抗体分子的方法。该方法包括在(i)-(iv)缔合的条件下：

(i)提供第一重链多肽(例如，包含第一重链可变区(第一VH)、第一CH1、第一重链恒定区(例如，第一CH2、第一CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)；

(ii)提供第二重链多肽(例如，包含第二重链可变区(第二VH)、第二CH1、第二重链恒定区(例如，第二CH2、第二CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)；

(iii)提供优先与第一重链多肽(例如第一VH)缔合的λ链多肽(例如λ轻可变区(VLλ)、λ轻恒定链(VLλ)或两者)；和

(iv)提供优先与第二重链多肽(例如第二VH)缔合的K链多肽(例如κ轻可变区(VLκ)、κ轻恒定链(VLκ)或两者)。

在实施方案中，第一重链多肽和第二重链多肽形成增强异二聚化的Fc界面。

在实施方案中，将(i)-(iv)(例如，编码(i)-(iv)的核酸)引入单个细胞，例如单个哺乳动物细胞，例如CHO细胞中。在实施方案中，在细胞中表达(i)-(iv)。

在实施方案中，将(i)-(iv)(例如，编码(i)-(iv)的核酸)引入不同的细胞，例如不同的哺乳动物细胞，例如两个或更多个CHO细胞中。在实施方案中，在细胞中表达(i)-(iv)。

在实施方案中，该方法进一步包括例如使用λ特异性和/或κ特异性纯化，例如亲和色谱，纯化细胞表达的抗体分子。

在实施方案中，该方法进一步包括评价细胞表达的多特异性抗体分子。例如，纯化的细胞表达的多特异性抗体分子可以通过本领域已知的技术(包括质谱法)进行分析。在一个实施方案中，将纯化的细胞表达的抗体分子裂解，例如用木瓜蛋白酶消化以产生Fab部分，并使用质谱法进行评价。

在实施方案中，该方法以高产率，例如至少75％、80％、90％、95％、98％、99.5％或99.9％，产生正确配对的κ/λ多特异性(例如双特异性)抗体分子。

在其他实施方案中，多特异性(例如双特异性)抗体分子包括：

(i)第一重链多肽(HCP1)(例如，包含第一重链可变区(第一VH)、第一CH1、第一重链恒定区(例如，第一CH2、第一CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)，例如，其中HCP1与第一表位结合；

(ii)第二重链多肽(HCP2)(例如，包含第二重链可变区(第二VH)、第二CH1、第二重链恒定区(例如，第二CH2、第二CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)，例如，其中HCP2与第二表位结合；

(iii)优先与第一重链多肽(例如第一VH)缔合的λ轻链多肽(LLCP1)(例如，λ轻可变区(VL1)、λ轻恒定链(VL1)或两者)，例如，其中LLCP1与第一表位结合；以及

(iv)优先与第二重链多肽(例如，第二VH)缔合的κ轻链多肽(KLCP2)(例如，κ轻可变区(VLk)、κ轻恒定链(VLk)或两者)，例如其中KLCP2与第二表位结合。

在实施方案中，第一重链多肽和第二重链多肽形成增强异二聚化的Fc界面。在实施方案中，多特异性抗体分子具有第一结合特异性和第二结合特异性，所述第一结合特异性包括杂合的VL1-CL1，其异二聚化至与Fc恒定CH2-CH3结构域连接的第一重链可变区(具有杵修饰)，而所述第二结合特异性包括杂合的VLk-CLk，其异二聚化至与Fc恒定CH2-CH3结构域连接的第二重链可变区(具有臼修饰)。

钙网蛋白靶向抗原结合结构域

本公开内容提供了尤其是多特异性(例如，双特异性、三特异性、四特异性)或多功能分子，其包括(例如被工程化为含有)一个或多个结合钙网蛋白(例如，野生型钙网蛋白或钙网蛋白突变蛋白)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，多功能分子以相似的亲和力结合野生型钙网蛋白和钙网蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，相比于野生型钙网蛋白，多功能分子优选结合钙网蛋白突变蛋白。

示例性野生型人钙网蛋白为SEQ ID NO：6285。

已鉴定并发现钙网蛋白突变蛋白与骨髓癌有关，例如参见Nangalia等人，N EnglJ Med.2013Dec 19；369(25)：2391-2405，Klampfl等人，N Engl J Med.2013 Dec 19；369(25)：2379-90和US20170269092，其通过引用整体并入本文。突变的钙网蛋白在野生型钙网蛋白的编码序列的外显子9中具有移码，导致野生型钙网蛋白的C端带负电荷的氨基酸被主要带正电荷的多肽取代。表2公开了36种钙网蛋白突变蛋白的全长氨基酸序列。表3公开了36种钙网蛋白突变蛋白的C端氨基酸序列。所有36种钙网蛋白突变蛋白都包含以下氨基酸序列RRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA(SEQ ID NO：6286)。

钙网蛋白的主要突变为1型和2型突变(见表2和3)。1型突变是52个碱基对缺失(c.1092_1143缺失)，而2型突变是5个碱基对插入(c.1154_1155插入TTGTC)。

表2.钙网蛋白突变体的全长氨基酸序列

表3.钙网蛋白突变体的C端氨基酸序列

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含表4-7中公开的任何CDR氨基酸序列、框架区(FWR)氨基酸序列或可变区氨基酸序列。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含来自鼠16B11.1抗体的1、2、3个CDR，例如表4中描述的。例如，在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6358(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6360(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO：227(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6358(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6360(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：227(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6358(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6360(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：227(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6358(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6360(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：227(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

可替代地或与包含含有来自鼠16B11.1抗体的1、2、3个CDR的VH的钙网蛋白靶向抗原结合结构域相结合地，所述钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含来自鼠16B11.1抗体的1、2或3个CDR，例如表4所描述的。例如，在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：251(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：246(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VLCDR3氨基酸序列SEQID NO：248(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：251、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：253，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：255。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：258、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：260，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：262。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：265、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：267，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：269。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：272、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：274，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：276。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：279、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：281，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：283。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6253(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6254(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6255(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6253、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6254，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6255。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6259(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6261(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6259、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6261。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含来自人源化16B11.1抗体的1、2、3或4个框架区，例如表4中所描述的。例如，在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6357、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6359、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6361，和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6273。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6362、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6363、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：226，和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQID NO：229、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6369、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6371，和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6373、VHFWR2氨基酸序列SEQ IDNO：6369、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6371，和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6374、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6375、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：247，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：249。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：250、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：252、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：254，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：256。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：257、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：259、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：261，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：263。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ IDNO：264、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：266、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：268，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：270。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：271、VLFWR2氨基酸序列SEQ IDNO：273、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：275，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：277。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：278、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：280、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：282，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：284。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6224、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6226、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6228，和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6230。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6238、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6240、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6242，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6244。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6263(或具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6264(或具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6265(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：228。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6277(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6278(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6279(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6280。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6263、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6264、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6265，和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：228。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6277、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6278、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6279，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6280。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：6347(或与SEQ ID NO：6347具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6348(或与SEQ ID NO：6348具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6349(或与SEQ ID NO：6349具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6350(或与SEQ ID NO：6350具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6351(或与SEQ ID NO：6351具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6352(或与SEQ IDNO：6352具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6353(或与SEQ ID NO：6353具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6354(或与SEQ ID NO：6354具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6355(或与SEQ ID NO：6355具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6356(或与SEQ ID NO：6356具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：6247(或与SEQ ID NO：6247具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249(或与SEQ ID NO：6249具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6247。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6247；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6249。

表4.钙网蛋白靶向抗原结合结构域的示例性重链CDR和FWR

表5.钙网蛋白靶向抗原结合结构域的示例性轻链CDR和FWR

表6.钙网蛋白靶向抗原结合的示例性FWR

表7A.钙网蛋白靶向抗原结合的示例性可变区(下划线表示CDR序列)

另外的钙网蛋白靶向抗原结合结构域

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含表16-19中公开的任何CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6253(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：243(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6255(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6253、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：243，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6255。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQID NO：6259(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6261(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6259、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6260，和VLCDR3氨基酸序列SEQID NO：6261。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：244(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQID NO：245(或与其具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：244，和/或VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：245。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372、234、235、236或237，或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238、239、240、241或242，或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：236；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372；和VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：239。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：234(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：235；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：239。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：6372(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：234；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：240。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQID NO：241(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：236(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：241(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：241。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6372；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：234；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：235；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：236；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：237；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：242。

在一些实施方案中，钙网蛋白靶向抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：236；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：238。

表16.另外的钙网蛋白靶向抗原结合结构域的示例性可变区

表17.钙网蛋白靶向抗原结合结构域的示例性重链CDR

表18.钙网蛋白靶向抗原结合结构域的示例性轻链CDR

表19.示例性的钙网蛋白靶向抗原结合结构域

免疫细胞衔接物

本文公开的多特异性或多功能分子的免疫细胞衔接物可以介导与免疫细胞例如免疫效应细胞的结合和/或活化。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物选自T细胞、NK细胞、B细胞、树突细胞或巨噬细胞衔接物，或其组合。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突细胞衔接物或巨噬细胞衔接物中的一个、两个、三个或全部，或其组合。免疫细胞衔接物可以是免疫系统的激动剂。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物可以是抗体分子、配体分子(例如，进一步包含免疫球蛋白恒定区，例如Fc区的配体)、小分子或核苷酸分子。

T细胞衔接物

本公开内容尤其提供了多特异性(例如，双、三、四特异性)或多功能分子，其被工程化以包含介导与T细胞结合和/或对其激活的一个或多个T细胞衔接物。因此，在一些实施方案中，T细胞衔接物选自结合(例如，并且在一些实施方案中激活)TCR(例如，TCRβV)、CD3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRζ、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2或CD226的β亚基的可变链中的一个或多个的抗原结合结构域或配体。在其他实施方案中，T细胞衔接物选自结合但不激活TCRβV、CD3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRζ、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2或CD226的抗原结合结构域或配体。在一些实施方案中，T细胞衔接物结合TCRβV。

人类T细胞受体(TCR)复合物

T细胞受体(TCR)可以在T细胞表面发现。TCR识别呈现在(例如结合在)细胞(例如抗原呈递细胞)表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子上的抗原(例如肽)。TCR是异二聚体分子，并且可以包含α链、β链、γ链或δ链。包含α链和β链的TCR也称为TCRαβ。TCRβ链由以下区域(也称为区段)组成：可变(V)、多样(D)、连接(J)和恒定(C)(参见Mayer G.和Nyland J.(2010)第10章：Major Histocompatibility Complex and T-cell Receptors-Role in Immune Responses.In：Microbiology and Immunology on-line，University ofSouth Carolina School of Medicine)。TCRα链由V区、J区和C区组成。通过可变(V)、多样(D)、连接(J)和恒定(C)区的体细胞重组而进行的T细胞受体(TCR)重排是T细胞发育和成熟的决定性事件。TCR基因重排发生在胸腺中。

TCR可包括被称为TCR复合物的受体复合物，其包含由α链和β链组成的TCR异二聚体和二聚体信号传送分子，例如CD3共受体，例如CD3δ/ε和/或CD3γ/ε。

TCRβV(TCRβV)

免疫系统的多样性使得能够对多种病原体提供保护。由于种系基因组的大小受到限制，多样性不仅可以通过V(D)J重组的过程来实现，而且可以通过核苷酸的连接(VD和DJ区段之间的连接)缺失和伪随机非模板核苷酸的添加来实现。TCRβ基因经过基因排列产生多样性。

由于例如在功能性基因区段中经常出现7种失活多态性以及涵盖2个Vβ基因区段的大的与插入/缺失相关的多态性，TCR Vβ的所有组成成分因个人和群体而异。

本公开内容尤其提供了抗体分子及其片段，例如，如本文所述，其结合(例如特异性结合)至人TCRβV链(TCRβV)，例如TCRβV基因家族(也称为组)，例如TCRβV亚家族(也称为亚组)。TCRβV家族和亚家族是本领域已知的，例如，如在Yassai等人，(2009)Immunogenetics 61(7)第493-502页；Wei S.和Concannon P.(1994)Human Immunology 41(3)第201-206页所述。本文所述的抗体可以是重组抗体，例如重组非鼠抗体，例如重组人或人源化抗体。

在一方面，本公开内容提供了与人TCRβV，例如TCRβV家族，例如基因家族或其变体结合的抗TCRβV抗体分子。在一些实施方案中，TCRBV基因家族包含例如如本文例如图3、表8A或表8B中所述的一个或多个亚家族。在一些实施方案中，TCRβV基因家族包括：TCRβV6亚家族、TCRβV10亚家族、TCRβV12亚家族、TCRβV5亚家族、TCRβV7亚家族、TCRβV11亚家族、TCRβV14亚家族、TCRβV16亚家族、TCRβV18亚家族、TCRβV9亚家族、TCRβV13亚家族、TCRβV4亚家族、TCRβV3亚家族、TCRβV2亚家族、TCRβV15亚家族、TCRβV30亚家族、TCRβV19亚家族、TCRβV27亚家族、TCRβV28亚家族、TCRβV24亚家族、TCRβV20亚家族、TCRβV25亚家族、TCRβV29亚家族、TCRβV1亚家族、TCRβV17亚家族、TCRβV21亚家族、TCRβV23亚家族或TCRβV26亚家族。

在一些实施方案中，TCRβV6亚家族也称为TCRβV13.1。在一些实施方案中，TCRβV6亚家族包括：TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-9*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-8*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-2*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-3*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-1*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6，例如TCRβV6-5*01，被SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2识别，例如结合。在一些实施方案中，TCRβV6，例如TCRβV6-5*01，被SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10识别，例如结合。在一些实施方案中，TCRβV6被SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：11识别，例如结合。

在一些实施方案中，TCRβV10亚家族也称为TCRβV12。在一些实施方案中，TCRβV10亚家族包括：TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01或TCRβV10-2*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV12亚家族也称为TCRβV8.1。在一些实施方案中，TCRβV12亚家族包括：TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV12被SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16识别，例如结合。在一些实施方案中，TCRβV12被SEQ ID NO：23-25中的任何一个和/或SEQ ID NO：26-30中的任何一个识别，例如结合。

在一些实施方案中，TCRβV5亚家族选自：TCRβV5-5*01、TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-8*01、TCRβV5-1*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV7亚家族包括TCRβV7-7*01、TCRβV7-6*01、TCRβV7-8*02、TCRβV7-4*01、TCRβV7-2*02、TCRβV7-2*03、TCRβV7-2*01、TCRβV7-3*01、TCRβV7-9*03或TCRβV7-9*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV11亚家族包括：TCRβV11-1*01、TCRβV11-2*01或TCRβV11-3*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV14亚家族包括TCRβV14*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV16亚家族包括TCRβV16*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV18亚家族包括TCRβV18*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV9亚家族包括TCRβV9*01或TCRβV9*02或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV13亚家族包括TCRβV13*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV4亚家族包括TCRβV4-2*01、TCRβV4-3*01或TCRβV4-1*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV3亚家族包括TCRβV3-1*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV2亚家族包括TCRβV2*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV15亚家族包括TCRβV15*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV30亚家族包括TCRβV30*01或TCRβV30*02或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV19亚家族包括TCRβV19*01或TCRβV19*02或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV27亚家族包括TCRβV27*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV28亚家族包括TCRβV28*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV24亚家族包括TCRβV24-1*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV20亚家族包括TCRβV20-1*01或TCRβV20-1*02或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV25亚家族包括TCRβV25-1*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV29亚家族包括TCRβV29-1*01或其变体。

表8A：TCRβV亚家族和亚家族成员的列表

表8B：另外的TCRβV亚家族

亚家族
	TCRβV1
TCRβV17
	TCRβV21
TCRβV23
	TCRβV26

抗TCRβV抗体

本文公开了发现一类新型抗体，即本文公开的抗TCRβV抗体分子，其尽管具有低序列相似性(例如，识别不同TCRβV亚家族的不同抗体分子之间的序列同一性低)，但仍识别TCRβV蛋白上的结构保守区，例如结构域，并具有相似的功能(例如，相似的细胞因子谱)。因此，本文公开的抗TCRβV抗体分子共用结构-功能关系。

在一些实施方案中，本文公开的抗TCRβV抗体分子不识别(例如不结合至)TCRβV：TCRα复合物的界面。

在一些实施方案中，本文公开的抗TCRβV抗体分子不识别(例如不结合至)TCRβV蛋白的恒定区。结合至TCRBV区的恒定区的示例性抗体是Viney等人，(Hybridoma.1992年12月；11(6)：701-13)中所述的JOVI.1。

在一些实施方案中，本文公开的抗TCRβV抗体分子不识别(例如不结合至)TCRβV蛋白的一个或多个(例如全部)互补决定区(例如CDR1、CDR2和/或CDR3)。

在一些实施方案中，本文公开的抗TCRβV抗体分子结合(例如特异性结合)至TCRβV区。在一些实施方案中，本文公开的抗TCRβV抗体分子的结合导致的细胞因子谱不同于与除TCRβV区以外的受体或分子结合的T细胞衔接物(“非TCRβV-结合T细胞衔接物”)的细胞因子谱。在一些实施方案中，非TCRβV结合T细胞衔接物包括与CD3分子(例如，CD3ε(CD3e)分子)或TCR阿尔法(TCRα)分子结合的抗体。在一些实施方案中，非TCRβV结合T细胞衔接物是OKT3抗体或SP34-2抗体。

在一方面，本公开内容提供了与人TCRβV，例如TCRβV基因家族，例如TCRβV亚家族中的一个或多个，例如，如本文例如在图3、表8A或表8B中所述的那些结合的抗TCRβV抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子与选自以下的一个或多个TCRβV亚家族结合：TCRβV6亚家族、TCRβV10亚家族、TCRβV12亚家族、TCRβV5亚家族、TCRβV7亚家族、TCRβV11亚家族、TCRβV14亚家族、TCRβV16亚家族、TCRβV18亚家族、TCRβV9亚家族、TCRβV13亚家族、TCRβV4亚家族、TCRβV3亚家族、TCRβV2亚家族、TCRβV15亚家族、TCRβV30亚家族、TCRβV19亚家族、TCRβV27亚家族、TCRβV28亚家族、TCRβV24亚家族、TCRβV20亚家族、TCRβV25亚家族、TCRβV29亚家族、TCRβV1亚家族、TCRβV17亚家族、TCRβV21亚家族、TCRβV23亚家族或TCRβV26亚家族或其变体。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子与TCRβV6亚家族结合，所述TCRβV6亚家族包括：TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6亚家族包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-9*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-8*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-2*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-3*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-1*01或其变体。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子与TCRβV10亚家族结合，所述TCRβV10亚家族包括：TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01或TCRβV10-2*01或其变体。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子与TCRβV12亚家族结合，所述TCRβV12亚家族包括：TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01或其变体。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子与TCRβV5亚家族结合，所述TCRβV5亚家族包括：TCRβV5-5*01、TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-8*01、TCRβV5-1*01或其变体。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子不结合TCRβV12，或以小于(例如，小于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)如美国专利5，861，155中所述的16G8鼠抗体或其人源化形式的亲和力和/或结合特异性的亲和力和/或结合特异性结合至TCRβV12。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子以大于(例如，大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)如美国专利5,861,155中所述的16G8鼠抗体或其人源化形式的亲和力和/或结合特异性的亲和力和/或结合特异性结合至TCRβV12。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子以大于(例如，大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)如美国专利5,861,155中所述的16G8鼠抗体或其人源化形式的亲和力和/或结合特异性的亲和力和/或结合特异性结合至除TCRβV12以外的TCRβV区(例如，如本文所述的TCRβV区，例如，TCRβV6亚家族(例如，TCRβV6-5*01))。

在一些实施方案中，抗-TCRβV抗体分子不与TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01结合，或以小于(例如，小于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)如美国专利5，861，155中所述的鼠抗体C或其人源化形式的亲和力和/或结合特异性的亲和力和/或结合特异性结合至TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01。

在一些实施方案中，抗-TCRβV抗体分子以大于(例如，大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)如美国专利5,861,155中所述的鼠抗体C或其人源化形式的亲和力和/或结合特异性的亲和力和/或结合特异性结合至TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子以大于(例如，大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)如美国专利5,861,155中所述的鼠抗体C或其人源化形式的亲和力和/或结合特异性的亲和力和/或结合特异性结合至除TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01以外的TCRβV区(例如，如本文所述的TCRβV区，例如，TCRβV6亚家族(例如，TCRβV6-5*01))。

抗TCRβV6抗体

因此，一方面，本公开内容提供了与人TCRβV6(例如，TCRβV6亚家族)结合的抗TCRβV抗体分子，所述TCRβV6亚家族包括：TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01。在一些实施方案中，TCRβV6亚家族包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-9*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-8*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-2*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-3*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-1*01或其变体。

在一些实施方案中，TCRβV6-5*01由SEQ ID NO：43的核酸序列，或与其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列编码。

SEQ ID NO：43

在一些实施方案中，TCRβV6-5*01包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列，或与其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO：44

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是非鼠抗体分子，例如人或人源化抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是人源化抗体分子。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是分离的或重组的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个抗原结合区，例如可变区或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个、两个、三个或四个可变区.

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个重链可变区.

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子包含具有SEQ ID NO：231或3290的共有序列的重链可变区(VH).

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包括来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子包含具有SEQ ID NO：230或3289的共有序列的轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区。在又一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含IgG1(例如人IgG1)的重链恒定区。在一个实施方案中，重链恒定区包含表3A中列出的氨基序列或与其基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含κ轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区。在一个实施方案中，轻链恒定区包含表3A中列出的氨基序列或与其基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列的重链可变区(VH)的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自包含表1A所示氨基酸序列或由表1A所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一个实施方案中，相对于表1A中所示的氨基酸序列，或由表1A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有1、2、3、4、5、6个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自包含表1A所示氨基酸序列或由表1A所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一个实施方案中，相对于表1A中所示的氨基酸序列，或由表1A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有1、2、3、4、5、6个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自包含表1A所示氨基酸序列或由表1A所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或所有CDR)。在一个实施方案中，相对于表1A中所示的氨基酸序列，或由表1A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有1、2、3、4、5、6个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体)的所有六个CDR，或密切相关的CDR，例如相同CDR或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可以包含本文所述的任何CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1A所列的Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1A所列的Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，根据表1A所列的Kabat定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Kabat等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Kabat等人的所有六个CDR(例如，根据表1A所列的Kabat定义的所有六个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Kabat等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可以包含本文所述的任何CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含至少一个、两个或三个具有与本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体)的相应高变环相同的规范结构的高变环，例如与本文所述抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2具有相同的规范结构。高变环规范结构的描述参见，例如Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798。这些结构可以通过查看这些参考文献中描述的表来确定。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Chothia等人所述的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1A所列的Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Chothia等人所述的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1A所列的Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Chothia等人所述的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，根据表1A所列的Chothia定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Chothia等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或表1A中所述的抗体，或由表1A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Chothia等人所述的所有六个CDR(例如，根据表1A所列的Chothia定义的所有六个CDR)；或相对于表1A中所示的根据Chothia等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可以包含本文所述的任何CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含根据Kabat等人、Chothia等人定义或如表1A所述的CDR或高变环的组合。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可包含根据Kabat和Chothia定义的CDR或高变环的任何组合。

在一些实施方案中，如表1A列出的组合的CDR是包括Kabat CDR和Chothia CDR的CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含CDR或高变环的组合，其被标识为表1A中的组合的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可包含根据表1A中所述的“组合的”CDR的CDR或高变环的任何组合。

在一个实施方案中，例如在包含可变区、CDR(例如组合的CDR、Chothia CDR或Kabat CDR)或本文在例如表1A中提及的其他序列的实施方案中，抗体分子是单特异性抗体分子、双特异性抗体分子、二价抗体分子、双互补位抗体分子，或包含抗体的抗原结合片段(例如，半抗体或半抗体的抗原结合片段)的抗体分子。在某些实施方案中，抗体分子包括多特异性分子，例如双特异性分子，例如，如本文所述的。

在一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：

(i)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个、两个或全部，和/或

(ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个、两个或全部。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含SEQ ID NO：2的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及SEQ ID NO：1的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含SEQ ID NO：10的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及SEQ ID NO：9的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含SEQ ID NO：11的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及SEQ ID NO：9的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3。

(i)SEQ ID NO：6的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：7的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：8的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO：3的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：4的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的HC CDR3氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：

(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：6的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：7的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：8的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：3的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：4的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的HC CDR3氨基酸序列。

(i)SEQ ID NO：51的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：52的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：53的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO：45的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：46的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：47的HC CDR3氨基酸序列。

(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：51的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：52的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：53的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：45的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：46的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：47的HC CDR3氨基酸序列。

(i)SEQ ID NO：54的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：55的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：56的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO：48的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：49的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：50的HC CDR3氨基酸序列。

(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：54的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：55的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：56的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：48的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：49的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：50的HC CDR3氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子的轻链或重链可变框架(例如包括至少FR1、FR2、FR3和任选FR4的区)可以选自：(a)轻链或重链可变框架，其包含至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(b)轻链或重链可变框架，其包含20％至80％、40％至60％、60％至90％或70％至95％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(c)非人框架(例如，啮齿动物框架)；或(d)已被修饰以例如去除抗原或细胞毒性决定簇的非人框架，例如去免疫或部分人源化的非人框架。在一个实施方案中，轻链或重链可变框架区(特别是FR1、FR2和/或FR3)包含与人种系基因的VL或VH区段的框架相同或至少70、75、80、85、87、88、90、92、94、95、96、97、98、99％相同的轻链或重链可变框架序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含重链可变结构域，其相对于A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的氨基酸序列，例如整个可变区(例如图1A所示的区域)中的FR区的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：9中的的氨基酸序列具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个改变(例如氨基酸置换或缺失)。

可替代地，或与本文所述的重链置换组合地，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含轻链可变结构域，其相对于A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的氨基酸序列，例如整个可变区(例如图1B所示的区域)中的FR区的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中的的氨基酸序列具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个改变(例如氨基酸置换或缺失)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含如图1A所示的一个、两个、三个或四个重链框架区，或与其基本上相同的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含如图1B所示的一个、两个、三个或四个轻链框架区，或与其基本上相同的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区1。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区2。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区3。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区4。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含轻链可变结构域，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包含改变，例如根据Kabat编号在位置10处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR1在位置10处包含苯丙氨酸，例如丝氨酸至苯丙氨酸置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含轻链可变结构域，其包含框架区，例如框架区2(FR2)，所述框架区包含改变，例如根据Kabat编号在本文公开的位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR2在位置36处包含组氨酸，例如根据Kabat编号在位置36处的置换，例如酪氨酸至组氨酸的置换。在一些实施方案中，FR2在位置46处包含丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置46处的置换，例如精氨酸至丙氨酸的置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含轻链可变结构域，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包含改变，例如根据Kabat编号在本文公开的位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR3在位置87处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置87处的置换，例如酪氨酸至苯丙氨酸的置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：(a)框架区1(FR1)，其在位置10处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置10处的置换，例如丝氨酸至苯丙氨酸置换；(b)框架区2(FR2)，其在位置36处包含组氨酸，例如根据Kabat编号在位置36处的置换，例如酪氨酸至组氨酸的置换，并且在位置46处包含丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置46处的置换，例如精氨酸至丙氨酸的置换；和(c)框架区3(FR3)，其在位置87处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置87处的置换，例如酪氨酸至苯丙氨酸的置换，例如，如SEQ ID NO：10的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：(a)框架区2(FR2)，其在位置36处包含组氨酸，例如根据Kabat编号在位置36处的置换，例如酪氨酸至组氨酸置换，并且在位置46处包含丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置46处的置换，例如精氨酸至丙氨酸的置换；和(b)框架区3(FR3)，其在位置87处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置87处的置换，例如酪氨酸至苯丙氨酸的置换，例如，如SEQ ID NO：11的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：(a)框架区1(FR1)，其包含根据Kabat编号在本文公开的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)；(b)框架区2(FR2)，其包含根据Kabat编号在本文公开的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)；以及(c)框架区3(FR3)，其包含根据Kabat编号在本文公开的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区1。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区2。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区3。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含例如如图1A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区4。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含重链可变结构域，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包含改变，例如根据Kabat编号在本文公开的位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR3在位置73处包含苏氨酸，例如根据Kabat编号在位置73处的置换，例如谷氨酸至苏氨酸的置换。在一些实施方案中，FR3在位置94处包含甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置94处的置换，例如精氨酸至甘氨酸的置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系重链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含重链可变结构域，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区在位置73处包含苏氨酸，例如根据Kabat编号在位置73处的置换，例如谷氨酸至苏氨酸的置换，并且在位置94处包含甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置94处的置换，例如精氨酸至甘氨酸的置换，例如，如SEQ ID NO：10的氨基酸序列所示。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含A-H.1或A-H.2的重链框架区1-4，例如SEQ ID NO：9或如图1A和图1B所示。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含A-H.1的轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO：10或如图1A和图1B所示。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含A-H.2的轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO：11或如图1A和图1B所示。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含A-H.1的重链框架区1-4(例如SEQ ID NO：9)；和A-H.1的轻链框架区1-4(例如SEQID NO：10)，或如图1A和1B所示。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含A-H.2的重链框架区1-4(例如SEQ ID NO：9)；和A-H.2的轻链框架区1-4(例如SEQID NO：11)，或如图1A和1B所示。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子的重链或轻链可变结构域或两者包含氨基酸序列，其与本文公开的氨基酸基本相同，例如与本文所述抗体(例如，选自A-H.1至A-H.68中的任一项(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的抗体，或如表1A所述的抗体，或由表1A的核苷酸序列编码的抗体)的可变区至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同；或与本文所述抗体的可变区相差至少1或5个残基，但相差少于40、30、20或10个残基.

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含至少一个、两个、三个或四个抗原结合区(例如，可变区)，该抗原结合区具有表1A所列的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，序列与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，或与表1A中所示序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基)。在另一实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，包含由具有表1A所列的核苷酸序列或与其基本相同的序列(例如，序列与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，或与表1A中所示序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸)的核酸编码的VH和/或VL结构域。

VH结构域，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和/或

VL结构域，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

VL结构域，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是完整的抗体或其片段(例如，Fab、F(ab’)₂、Fv或单链Fv片段(scFv))。在实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是单克隆抗体或具有单一特异性的抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，也可以是人源化的、嵌合的、骆驼的、鲨鱼的或体外产生的抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是人源化抗体分子。抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子的重链和轻链可以是全长的(例如，抗体可以包含至少一条，优选两条完整的重链，以及至少一条，优选两条完整的轻链)或可以包含抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)₂、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体、双抗体(dAb)、二价抗体，或双特异性抗体或其片段、其单结构域变体或骆驼抗体)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子为多特异性分子，例如双特异性分子的形式，例如如本文所述。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区的重链恒定区(Fc)。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1或IgG2(例如人IgG1或IgG2)的重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区是人IgG1。在一些实施方案中，Fc区包含FcFc区变体，例如如本人所公开的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，具有选自例如κ或λ，优选κ(例如人κ)的轻链恒定区的轻链恒定区。在一个实施方案中，使恒定区改变，例如使其突变，以修饰抗TCRβV抗体分子例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子的性质(例如增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能)。例如，相对于例如人IgG1，恒定区在位置296(M至Y)、298(S至T)、300(T至E)、477(H至K)和478(N至F)处发生突变，以改变Fc受体结合(例如突变位置对应于SEQ ID NO：212或214的位置132(M至Y)、134(S至T)、136(T至E)、313(H至K)和314(N至F)；或SEQ ID NO：215、216、217或218的位置135(M至Y)、137(S至T)、139(T至E)、316(H至K)和317(N至F))。

抗体A-H.1包含含有SEQ ID NO：3278氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：72氨基酸序列的轻链。抗体A-H.2包含含有SEQ ID NO：3278氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：3279氨基酸序列的轻链。抗体A-H.68包含氨基酸序列SEQ ID NO：1337，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

其他示例性人源化抗TCRB V6抗体在表1A中提供。在一些实施方案中，抗TCRβV6抗体是抗体A，例如人源化抗体A(抗体A-H)，如表1A中提供。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表1A中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表1A中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，抗体A包含表1A中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。表1A：结合至TCRVB 6例如TCRVB 6-5的鼠、嵌合和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。抗体分子包括鼠mAb抗体A和人源化mAb抗体A-H克隆A-H.1至A-H.68。示出了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含表1A所述抗体的VH和/或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含表1A所述抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

在一些实施方案中，本文公开的抗TCRVb抗体具有抗原结合结构域，该抗原结合结构域具有含有SEQ ID NO：230共有序列的VL，其中位置30是G、E、A或D；位置31是N或D；位置32是R或K；位置36是Y或H；并且/或者位置56是K或S。

在一些实施方案中，本文公开的抗TCRVb抗体具有抗原结合结构域，该抗原结合结构域具有含有SEQ ID NO：231共有序列的VH，其中：位置27是H或T或G或Y；位置28是D或T或S；位置30是H或R或D或K或T；位置31是L或D或K或T或N；位置32是W或F或T或I或Y或G；位置49是R或W；位置50是V或I或F；位置51是F或S或Y；位置52是A或P；位置56是N或S；位置57是T或V或Y或I；位置58是K或R；位置97为G或V；位置99是Y或I；位置102是Y或A；并且/或者位置103是D或G。

抗TCRβV12抗体

因此，一方面，本公开内容提供了与人TCRβV12，例如，TCRβV12亚家族结合的抗TCRβV抗体分子，所述TCRβV12亚家族包括：TCRβV12-4*01，TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01。在一些实施方案中，TCRβV12亚家族包括TCRβV12-4*01。在一些实施方案中，TCRβV12亚家族包括TCRβV12-3*01。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是非鼠抗体分子，例如人或人源化抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是人源化抗体分子。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是分离的或重组的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如，表2A中所述抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个抗原结合区，例如可变区或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如，表2A中所述抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个、两个、三个或四个可变区。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如，表2A中所述抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个重链可变区。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如，表2A中所述抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区。在又一实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含IgG1(例如人IgG1)的重链恒定区。在一个实施方案中，重链恒定区包含表3A中列出的氨基酸序列，或与其基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含κ轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区。在一个实施方案中，轻链恒定区包含表3A中列出的氨基酸序列，或与其基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如，表2A中所述抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包括来自包含表2A中所示的氨基酸序列，或由表2A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一个实施方案中，相对于表2A中所示的氨基酸序列，或由表2A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有1、2、3、4、5、6个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自本文所述抗体(例如，表2A中所述抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自包含表2A中所示的氨基酸序列，或由表2A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一个实施方案中，相对于表2A中所示的氨基酸序列，或由表2A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有1、2、3、4、5、6个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含来自包含表2A中所示的氨基酸序列，或由表2A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或所有CDR)。在一个实施方案中，相对于表2A中所示的氨基酸序列，或由表2A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有1、2、3、4、5、6个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体)的所有六个CDR，或密切相关的CDR，例如相同CDR或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包含本文所述的任何CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如如表2A中所述选择的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，如表2A所列的根据Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，如表2A所列的根据Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，如表2A所列的根据Kabat定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Kabat等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Kabat等人的所有六个CDR(例如，如表2A所列的根据Kabat定义的所有六个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Kabat等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包含本文所述的任何CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含至少一个、两个或三个与本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体)的相应高变环具有相同的规范结构的高变环，例如与本文所述抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2具有相同的规范结构。高变环规范结构的描述参见，例如Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798。这些结构可以通过查看这些参考文献中描述的表来确定.

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述选择的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，如表2A所列的根据Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，如表2A所列的根据Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCR[3V抗体分子，例如抗TCRl3 V12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或由表2A中的核苷酸编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，如表2A所列的根据Chothia定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Chothia等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据Chothia等人的所有六个CDR(例如，如表2A所列的根据Chothia定义的所有六个CDR)；或相对于表2A中所示的根据Chothia等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包含本文所述的任何CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述选择的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据组合的CDR的至少一个、两个或三个CDR(例如，如表2A所列的根据组合的CDR定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2A中所示的根据组合的CDR的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据组合的CDR的至少一个、两个或三个CDR(例如，如表2A所列的根据组合的CDR定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2A中所示的根据组合的CDR的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或由表2A中的核苷酸编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据组合的CDR的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，如表2A所列的根据组合的CDR定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表2A中所示的根据组合的CDR的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述抗体(例如表2A中所述的抗体，或由表2A中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区和轻链可变区的根据组合的CDR的所有六个CDR(例如，如表2A所列的根据组合的CDR定义的所有六个CDR)；或相对于表2A中所示的根据组合的CDR的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包含本文所述的任何CDR。

在一些实施方案中，表1A中所列出的组合的CDR为包括Kabat CDR和Chothia CDR的CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含CDR或高变环的组合，其被标识为表1A中的组合的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，可以包含CDR或高变环的任何组合，根据表1A中所述的“组合的”CDR。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含根据Kabat等人和Chothia等人定义的或如表1A所述的CDR或高变环的组合。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包含根据Kabat等人和Chothia定义的CDR或高变环的组合。

在一个实施方案中，例如在包含可变区、CDR(例如组合的CDR、Chothia CDR或Kabat CDR)或本文在例如表2A中提及的其他序列的实施方案中，抗体分子是单特异性抗体分子、双特异性抗体分子、二价抗体分子、双互补位抗体分子，或包含抗体的抗原结合片段(例如，半抗体或半抗体的抗原结合片段)的抗体分子。在某些实施方案中，抗体分子包括多特异性分子，例如双特异性分子，例如，如本文所述的.

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：

(i)SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个、两个或全部，和/或

(ii)SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个、两个或全部。

(i)SEQ ID NO：20的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：21的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：22的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO：17的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：18的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：19的HC CDR3氨基酸序列。

(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：20的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：21的LC CDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO：2的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)重链可变区(HL)，其包含SEQ ID NO：17的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：18的HC CDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO：19的HC CDR3氨基酸序列。

(i)SEQ ID NO：63的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：64的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：65的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO：57的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：58的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：59的HC CDR3氨基酸序列。

(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：63的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：64的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：65的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)重链可变区(HL)，其包含SEQ ID NO：57的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：58的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：59的HC CDR3氨基酸序列。

(i)SEQ ID NO：66的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：67的LC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：68的LC CDR3氨基酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO：60的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：61的HC CDR2氨基酸序列，或SEQ ID NO：62的HC CDR3氨基酸序列。

在一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子的轻链或重链可变框架(例如包括至少FR1、FR2、FR3和任选FR4的区)可以选自：(a)轻链或重链可变框架，其包含至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(b)轻链或重链可变框架，其包含20％至80％、40％至60％、60％至90％或70％至95％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(c)非人框架(例如，啮齿动物框架)；或(d)已被修饰以例如去除抗原或细胞毒性决定簇的非人框架，例如去免疫或部分人源化的非人框架。在一个实施方案中，轻链或重链可变框架区(特别是FR1、FR2和/或FR3)包含与人种系基因的VL或VH区段的框架相同或至少70、75、80、85、87、88、90、92、94、95、96、97、98、99％相同的轻链或重链可变框架序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含重链可变结构域，其相对于表2A所述氨基酸序列，例如整个可变区(例如图2A和2B所示)中的FR区的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：23-25中的氨基酸序列具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个改变(例如氨基酸置换或缺失)。

备选地，或与本文所述的重链置换组合，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含轻链可变结构域，其相对于本文所述抗体的氨基酸序列，例如整个可变区(例如图2A和2B所示)中的FR区的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：26-30中的氨基酸序列具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个氨基酸改变(例如氨基酸置换或缺失)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含如图2A所示的一个、两个、三个或四个重链框架区，或与其基本上相同的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含如图2B所示的一个、两个、三个或四个轻链框架区，或与其基本上相同的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2B所示的轻链框架区1。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2B所示的轻链框架区2。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2B所示的轻链框架区3。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2B所示的轻链框架区4。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包含改变，例如根据Kabat编号在本文公开的一个或多个(例如所有)位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR1在位置1处包含天冬氨酸，例如根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换。在一些实施方案中，FR1在位置2处包含天冬酰胺，例如根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，FR1在位置4处包含亮氨酸，例如根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区1(FRi)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换；根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换；和根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换；和根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包含改变，例如根据Kabat编号在本文公开的一个或多个(例如所有)位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR3在位置66处包含甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换。在一些实施方案中，FR3在位置69处包含天冬酰胺，例如根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，FR3在位置71处包含酪氨酸，例如根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换；和根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换；根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，所述轻链包含框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换；以及框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ IDNO：26的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换，以及根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换；和(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO：27的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如丝氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换；和(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO：28的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如丝氨酸至天冬酰胺置换；以及(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换；根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置71处的置换，例如丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO：29的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换；以及(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如丝氨酸至甘氨酸置换；根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO：29的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号的在本文公开的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)；和(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号的在本文公开的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列而言的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2A所示的重链框架区1。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2A所示的重链框架区2。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2A所示的重链框架区3。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2A所示的重链框架区4。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2A所示的重链框架区1-4，例如SEQ ID NO：20-23。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图2B所示的轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO：26-30。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含重链框架区1-4，例如SEQ ID NO：23-25；和轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO：26-30，或图2A和2B所示的那些。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子的重链或轻链可变结构域或两者包含氨基酸序列，其与本文公开的氨基酸基本相同，例如与本文所述抗体(例如，表2A所述的抗体，或由表2A的核苷酸序列编码的抗体)的可变区至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同；或与本文所述抗体的可变区相差至少1或5个残基，但相差少于40、30、20或10个残基。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个具有表2A所列的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，序列与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，或与表2A中所示序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基)的抗原结合区(例如，可变区)。在另一实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，包含由具有表2A所列的核苷酸序列或与其基本相同的序列(例如，序列与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，或与表2A中所示序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸)的核酸编码的VH和/或VL结构域。

VH结构域，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：25的氨基酸序列，与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEOID NO：25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和/或

VL结构域，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列，与SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

VH结构域，其包含：SEQ ID NO：23的氨基酸序列，与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和

VL结构域，其包含：SEQ ID NO：26的氨基酸序列，与SEQ ID NO：26的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：26的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

VL结构域，其包含：SEQ ID NO：27的氨基酸序列，与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：27的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

VL结构域，其包含：SEQ ID NO：28的氨基酸序列，与SEQ ID NO：28的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：28的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

VL结构域，其包含：SEQ ID NO：29的氨基酸序列，与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：29的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

VL结构域，其包含：SEQ ID NO：30的氨基酸序列，与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗TCRpV抗体分子，例如抗TCRp V12抗体分子包含：

VH结构域，其包含：SEQ ID NO：24的氨基酸序列，与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：24的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和

VH结构域，其包含：SEQ ID NO：25的氨基酸序列，与SEQ ID NO：25的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是完整的抗体或其片段(例如，Fab、F(ab’)₂、Fv或单链Fv片段(scFv))。在实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是单克隆抗体或具有单一特异性的抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子也可以是人源化的、嵌合的、骆驼的、鲨鱼的或体外产生的抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是人源化抗体分子。抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子的重链和轻链可以是全长的(例如，抗体可以包含至少一条，优选两条完整的重链，以及至少一条，优选两条完整的轻链)或可以包含抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)₂、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体、双抗体(dAb)、二价抗体，或双特异性抗体或其片段、其单结构域变体或骆驼抗体)。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子为多特异性分子，例如双特异性分子的形式，例如，如本文所述的。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区的重链恒定区(Fc)。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1或IgG2(例如人IgG1或IgG2)的重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区是人IgG1。

在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子具有轻链恒定区，所述轻链恒定区选自例如κ或λ、优选κ(例如人κ)的轻链恒定区。使在一个实施方案中，恒定区改变(例如使其突变)，以改变抗TCRβV抗体分子(例如抗TCRβV12抗体分子)的特性(例如，增加或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能或补体功能)。例如，恒定区在位置296(M突变为Y)、298(S突变为T)、300(T突变为E)、477(H突变为K)和478(N突变为F)发生突变以改变Fc受体结合(例如，突变位置对应于SEQIDNO：212或214的位置132(M突变为Y)、134(S突变为T)、136(T突变为E)、313(H突变为K)和314(N突变为F)；或SEQIDNO：215、216、217或218的位置135(M突变为Y)、137(S突变为T)、139(T突变为E)、316(H突变为K)和317(N突变为F))。

抗体B-H.1包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：3280的第一链和含有氨基酸序列SEQID NO：3281的第二链。

本公开的其他示例性抗TCRB V12抗体在表2A中提供。在一些实施方案中，抗TCRβV12是抗体B，例如人源化抗体B(抗体B-H)，如表2A中提供。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表2A中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表2A中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗体B包含表2A中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％同一性的序列。

表2A：结合至TCRVB12例如TCRVB 12-3或TCRVB 12-4的鼠和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。抗体分子包括鼠mAb抗体B和人源化mAb抗体B-H.1至B-H.6。示出了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。

表3A.人IgG重链和人κ轻链的恒定区氨基酸序列

抗TCRβV5抗体

因此，在一方面，本公开内容提供了与人TCRβV5结合的抗TCRβV抗体分子。在一些实施方案中，TCRβV5亚家族包括TCRβV5-5*01、TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-8*01、TCRβV5-1*01或其变体。

本公开内容的示例性抗TCRβV5抗体提供在表10A中。在一些实施方案中，抗TCRβV5是如表10A中提供的抗体C，例如，人源化抗体C(抗体C-H)。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表10A中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表10A中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗体C包含表10A中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％同一性的序列。

表10A：抗TCRβV5抗体的氨基酸序列

结合至TCRVB 5例如TCRVB 5-5或TCRVB 5-6的鼠和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。示出了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。

本公开内容的示例性抗TCRβV5抗体提供在表11A中。在一些实施方案中，抗TCRβV5是如表11A中提供的抗体E，例如，人源化抗体E(抗体E-H)。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表11A中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表11A中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗体E包含表11A中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％同一性的序列。

在一些实施方案中，抗体E包含重链和/或轻链，所述重链包含SEQ ID NO：3284的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO：3285的氨基酸序列，或与其具有至少95％同一性的序列.

表11A：抗TCRβV5抗体的氨基酸序列

在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表10A中所述抗体的VH和/或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表10A中所述抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表11A中所述抗体的VH和/或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表11A中所述抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

抗TCRβV10抗体

因此，一方面，本公开内容提供了与人TCRβV10亚家族成员结合的抗TCRβV抗体分子。在一些实施方案中，TCRβV10亚家族也称为TCRβV12。在一些实施方案中，TCRβV10亚家族包括：TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01或TCRβV10-2*01或其变体。

本公开内容的示例性抗TCRβV10抗体提供在表12A中。在一些实施方案中，抗TCRβV10是如表12A中提供的抗体D，例如，人源化抗体D(抗体D-H)。在一些实施方案中，抗体D包含表12A中提供的一个或多个(例如，三个)轻链CDR和/或一个或多个(例如，三个)重链CDR，或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗体D包含表12A中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％同一性的序列.

表124：抗TCRβV10抗体的氨基酸序列

结合至TCRBV 10例如TCRBV 10-1、TCRBV 10-2或TCRBV 10-3的鼠和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。示出了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列

在一些实施方案中，抗TCRβV10抗体分子包含表12A中所述抗体的VH或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

在一些实施方案中，抗TCRβV10抗体分子包含表12A中所述抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

其他抗TCRVβ抗体

本公开内容的其他示例性抗TCRβV抗体提供在表13A中。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体是如表13A中提供的人源化抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表13A中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表13A中提供的HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表13A中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％同一性的序列。

表13A：其他抗-TCRβV抗体的氨基酸序列

公开了结合各种TCRVB家族的鼠和人源化的抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。示出了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。表中公开的抗体包括MPB2D5、CAS1.1.3、IMMU222、REA1062和JOVI-3。MPB2D5结合人TCRβV 20-1(根据旧命名法为TCRβV2)。CAS1.1.3结合人TCRβV 27(根据旧命名法为TCRβV14)。IMMU 222结合人TCRβV 6-5、TCRβV 6-6或TCRβV 6-9(根据旧命名法为TCRβV13.1)。REA1062结合人TCRβV 5-1)。JOVI-3结合人TCRβV 28(根据旧命名法为TCRβV3.1)。

抗-TCRVβ抗体效应子功能和Fc变体

在一些实施方案中，本文公开的抗-TCRVβ抗体包含Fc区，例如如本文所描述的。在一些实施方案中，Fc区是野生型Fc区，例如，野生型人Fc区。在一些实施方案中，Fc区包含变体，例如，在Fc区中包含至少一个氨基酸残基的添加、置换或缺失的Fc区，这导致例如对至少一种Fc受体的亲和力降低或消融(ablate)。

抗体的Fc区与多个受体或配体相互作用，包括Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、补体蛋白CIq和其他分子(如蛋白A和G)。这些相互作用对于多种效应子功能和下游信号传导事件(包括：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)是关键的。

在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗-TCRVβ抗体对Fc受体(例如，本文所述的Fc受体)的亲和力降低，例如消融。在一些实施方案中，将降低的亲和力与具有野生型Fc区的其他方面相似的抗体进行比较。

在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗-TCRVβ抗体具有一个或多个以下属性：(1)降低的效应子功能(例如，降低的ADCC、ADCP和/或CDC)；(2)与一个或多个Fc受体的结合降低；和/或(3)与C1q补体的结合降低。在一些实施方案中，属性(1)-(3)的任一个或全部的降低均为与具有野生型Fc区的其他方面相似的抗体进行比较。

在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗-TCRVβ抗体对人Fc受体(例如，FcγR I、FcγR II和/或FcγR III)的亲和力降低。在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗-TCRVβ抗体包含人IgG1区或人IgG4区。

在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗-TCRVβ抗体激活和/或扩展T细胞，例如如本文所述的。在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗-TCRVβ抗体具有本文所述的细胞因子谱(cytokine profile)，例如与结合TCRβV区以外的受体或分子的T细胞衔接物(“非TCRβV结合的T细胞衔接物”)的细胞因子谱不同的细胞因子谱。在一些实施方案中，非TCRβV结合的T细胞衔接物包含结合CD3分子(例如CD3ε(CD3e)分子)或TCRα(TCRα)分子的抗体。

示例性的Fc区变体在表21A中提供，并且还公开于Saunders O，(2019)Frontiersin Immunology；第10卷，文章1296中，其全部内容通过引入并入本文。

在一些实施方案中，本文公开的抗-TCRVβ抗体包含表21A中公开的Fc区变体(例如突变)中的任一种或全部或任意结合。在一些实施方案中，本文公开的抗-TCRVβ抗体包含Asn297Ala(N297A)突变。在一些实施方案中，本文公开的抗TCRVβ抗体包含Leu234Ala/Leu235Ala(LALA)突变。

表21A：示例性的Fc修饰

天然杀伤细胞衔接物

天然杀伤(NK)细胞以独立于抗体的方式识别和破坏肿瘤和病毒感染的细胞。NK细胞的调节是通过激活和抑制NK细胞表面上的受体来介导的。激活受体的一个家族是天然细胞毒性受体(NCR)，其包括NKp30、NKp44和NKp46。NCR通过识别癌细胞上的硫酸乙酰肝素来启动肿瘤靶向。NKG2D是一种受体，其在激活的杀伤(NK)细胞上提供刺激性和共刺激性先天免疫应答，从而导致细胞毒性活性。DNAM1是参与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞介导的细胞间粘附、淋巴细胞信号传导、细胞毒性和淋巴因子分泌的受体。DAP10(也称为HCST)是一种跨膜衔接蛋白，可与KLRK1缔合形成淋巴样和髓样细胞中的激活受体KLRK1-HCST；该受体在触发针对表达细胞表面配体(例如MHC I类链相关的MICA和MICB)和U(任选地L1)6-结合蛋白(ULBP)的靶细胞的细胞毒性中起主要作用；KLRK1-HCST受体在针对肿瘤的免疫监视中起作用，并且是肿瘤细胞的细胞溶解所必需的；实际上，不表达KLRK1配体的黑色素瘤细胞逃脱了NK细胞介导的免疫监视。CD16是IgG Fc区的受体，其结合复合或聚集的IgG以及单体IgG，从而介导抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)和其他抗体依赖性应答，例如吞噬作用。

本公开内容尤其提供了多特异性(例如，双，三，四特异性)或多功能分子，其被工程化为包含一个或多个介导与NK细胞结合和/或激活NK细胞的NK细胞衔接物。因此，在一些实施方案中，NK细胞衔接物选自结合(例如激活)以下的抗原结合结构域或配体：NKp30、NKp40、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM1、DAP10、CD16(例如，CD16a、CD16b或两者)、CRTAM、CD27、PSGL1、CD96、CD100(SEMA4D)、NKp80、CD244(也称为SLAMF4或2B4)、SLAMF6、SLAMF7、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR2DS1、CD94、NKG2C、NKG2E或CD160。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物是与NKp30(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的NKp30)结合的抗原结合结构域并且包含表7-10中公开的任何CDR氨基酸序列、框架区(FWR)氨基酸序列或可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，NK细胞衔接物是与NKp30(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的NKp30)结合的抗原结合结构域并且包含美国专利号6,979,546、美国专利号9,447,185、PCT申请号WO2015121383A1、PCT申请号WO2016110468A1、PCT申请号WO2004056392A1或美国申请公开号US20070231322A1中公开的任何CDR氨基酸序列、框架区(FWR)氨基酸序列或可变区氨基酸序列，其序列通过引用并入本文。在一些实施方案中，NK细胞衔接物(例如，与NKp30结合的抗原结合结构域)与NK细胞的结合激活NK细胞。与NKp30(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的NKp30)结合的抗原结合结构域可被称为靶标NKp30、NK细胞或两者。

在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含表7、表18或表8中公开的一个或多个CDR(例如，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3)或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含表7、表18或表8中公开的一个或多个框架区(例如，VHFWR1、VHFWR2、VHFWR3、VHFWR4、VLFWRl、VLFWR2、VLFWR3和/或VLFWR4)或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含表9中公开的VH和/VL或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，可将表9中公开的任何VH结构域与表9中公开的任何VL结构域配对以形成与NKp30结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含表10中公开的氨基酸序列或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)、VHCDR2和VHCDR3；以及VL，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)、VLCDR2和VLCDR3。

在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、6001和7315的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、6001和6002的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、6008和6009的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ IDNO：7313、7385和7315的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、7318和6009的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。

在一些实施方案中，VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：7326、7327和7329的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：6063、6064和7293的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：6070、6071和6072的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ IDNO：6070、6064和7321的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。

在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、6001、7315、7326、7327和7329的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、6001、6002、6063、6064和7293的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、6008、6009、6070、6071和6072的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、7385、7315、6070、6064和7321的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO：7313、7318、6009、6070、6064和7321的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。

在一些实施方案中，VH包含选自SEQ ID NO：7298或7300-7304的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)并且/或者VL包含选自SEQ ID NO：7299或7305-7309的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：7302和7305的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：7302和7309的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。

在一些实施方案中，VH包含选自SEQ ID NO：6121或6123-6128的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)并且/或者VL包含选自SEQ ID NO：7294或6137-6141的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VH包含选自SEQ ID NO：6122或6129-6134的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)并且/或者VL包含选自SEQ ID NO：6136或6142-6147的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：7295和7296的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：7297和7296的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：6122和6136的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。

在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：7310的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：7311的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。在一些实施方案中，与NKp30结合的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：6187、6188、6189或6190的氨基酸序列(或与其具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列)。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含SEQ ID NO：6000的重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变，例如，置换、添加或缺失的序列)、SEQ ID NO：6001的VHCDR2氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变，例如，置换、添加或缺失的序列)和/或SEQ ID NO：6002的VHCDR3氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变，例如，置换、添加或缺失的序列)。在一些实施方案中，NKp30抗原结合结构域包含VH，其包含SEQ ID NO：6000的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：6001的VHCDR2氨基酸序列和/或SEQ ID NO：6002的VHCDR3氨基酸序列。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含SEQ ID NO：6063的轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变，例如，置换、添加或缺失的序列)、SEQ ID NO：6064的VLCDR2氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变，例如，置换、添加或缺失的序列)和/或SEQ ID NO：7293的VLCDR3氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变，例如，置换、添加或缺失的序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含SEQ ID NO：6063的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：6064的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：7293的VLCDR3氨基酸序列。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6000(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6001(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6002(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和VL，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6063(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6064(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：7293(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，NKp30抗原结合结构域包含VH，其包含VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6000、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6001、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6002；和VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6063、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6064，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：7293。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6007(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6008(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6009(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，所述NKp30抗原结合结构域包含VH，其包含VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6007、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6008，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6009。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6070(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6071(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6072(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6070、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6071，和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6072。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6007(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6008(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6009(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和VL，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6070(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6071(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6072(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，所述NKp30抗原结合结构域包含VH，其包含VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6007、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6008、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6009；和VL，其包含VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6070、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6071、和VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6072。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6003、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6004、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6005、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6006。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6066、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6067、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：7292、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6069。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6003、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6004、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6005、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6006；和VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6066、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6067、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：7292、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6069.

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6003(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6004(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6005(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6006。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6066(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6067(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：7292(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6069。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6003(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6004(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6005(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6006；和VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6066(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6067(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：7292(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6069。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6010、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6011、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6012、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6013。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6073、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6074、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6075，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6076.

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6010、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6011、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6012、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6013；和VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6073、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6074、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6075、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6076。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6010(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6011(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6012(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6013。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6073(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6074(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6075(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6076。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6010(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6011(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6012(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6013；和VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6073(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6074(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6075(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6076。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6014、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6015、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6016、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6017。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6014(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6015(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6016(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6017。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6077、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6078、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6079、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6080。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6077(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6078(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6079(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6080。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6018、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6019、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6020、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6021。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6018(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6019(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6020(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6021。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6081、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6082、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6083、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6084。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6081(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6082(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6083(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6084。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6022、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6023、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6024、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6025。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6022(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6023(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6024(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6025。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6085、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6086、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6087、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6088。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6085(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6086(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6087(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6088。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6026、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6027、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6028、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6029。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6026(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6027(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6028(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6029。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6089、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6090、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6091、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6092。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6089(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQID NO：6090(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6091(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6092。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6030、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6032、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6033、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6034。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6030(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6032(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6033(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6034。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6093、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6094、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6095、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6096。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6093(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6094(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6095(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6096。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6035、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6036、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6037、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6038。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6035(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6036(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6037(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6038。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6039、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6040、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6041、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6042。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6039(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6040(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6041(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6042。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6097、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6098、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6099、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6100。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6097(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6098(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6099(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6100。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6043、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6044、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6045、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6046。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6043(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6044(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6045(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6046。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6101、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6102、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6103、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6104。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6101(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6102(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6103(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6104。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6047、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6048、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6049、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6050。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6047(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6048(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6049(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6050。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6105、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6106、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6107、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6108。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6105(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6106(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6107(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6108。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6051、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6052、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6053、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6054。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6051(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6052(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6053(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6054。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6109、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6110、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6111、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6112。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6109(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQID NO：6110(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6111(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6112。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6055、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6056、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6057、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6058。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6055(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6056(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6057(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6058。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6113、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6114、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6115、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6116。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6113(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6114(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6115(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6116。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6059、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6060、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6061、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6062。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含VHFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6059(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6060(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6061(或具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHFWR4氨基酸序列SEQ IDNO：6062。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6117、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6118、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6119、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6120。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含VLFWR1氨基酸序列SEQ ID NO：6117(或具有不超过1、2或3个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6118(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6119(或具有不超过1个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6120。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：6148(或与SEQ ID NO：6148具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6149(或与SEQ ID NO：6149具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6150(或与SEQ ID NO：6150具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6148。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6149。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6150。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：6148；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6150。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6149；和VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：6150。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：6151(或与SEQ ID NO：6151具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6152(或与SEQ ID NO：6152具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6153(或与SEQ ID NO：6153具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6151。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6152。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6153。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQID NO：6151；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6153。在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6152；和VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：6153。

在一些实施方案中，靶向NKp30的抗原结合结构域包含scFv。在一些实施方案中，scFv包含选自SEQ ID NO：6187-6190的氨基酸序列，或与其具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

表7.NKp30靶向抗原结合结构域的示例性重链CDR和FWR

表18.NKp30靶向抗原结合结构域的示例性重链CDR和FWR(根据Kabat编号方案)

表8.NKp30靶向抗原结合结构域的示例性轻链CDR和FWR

表9.NKp30靶向抗原结合结构域的示例性可变区

表10.示例性的NKp30靶向抗原结合结构域/抗体分子

在一些实施方案中，NK细胞衔接物是与NKp46(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的NKp46)结合的抗原结合结构域并且包含表15中公开的任何CDR氨基酸序列、框架区(FWR)氨基酸序列或可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，NK细胞衔接物，例如，与NKp46结合的抗原结合结构域与NK细胞的结合激活NK细胞。与NKp46(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的NKp46)结合的抗原结合结构域可被称为靶向NKp46、NK细胞或两者。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物是与NKG2D(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的NKG2D)结合的抗原结合结构域并且包含表15中公开的任何CDR氨基酸序列、框架区(FWR)氨基酸序列或可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，NK细胞衔接物，例如，与NKG2D结合的抗原结合结构域与NK细胞的结合激活NK细胞。与NKG2D(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的NKG2D)结合的抗原结合结构域可被称为靶向NKG2D、NK细胞或两者。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物是与CD16(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的CD16)结合的抗原结合结构域并且包含表15中公开的任何CDR氨基酸序列、框架区(FWR)氨基酸序列或可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，NK细胞衔接物，例如，与CD16结合的抗原结合结构域与NK细胞的结合激活NK细胞。与CD16(例如，在NK细胞的表面存在，例如，表达或展示的CD16)结合的抗原结合结构域可被称为靶向CD16、NK细胞或两者。

表15.NKp46、NKG2D或CD16-靶向抗原结合结构域的示例性可变区

在一个实施方案中，NK细胞衔接物为NKp30的配体，例如为B7-6，例如，包含以下氨基酸序列：

DLKVEMMAGGTQITPLNDNVTIFCNIFYSQPLNITSMGITWFWKSLTFDKEVKVFEFFGDHQEAFRPGAIVSPWRLKSGDASLRLPGIQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLEVVASPASRLLLDQVGMKENEDKYMCESSGFYPEAINITWEKQTQKFPHPIEISEDVITGPTIKNMDGTFNVTSCLKLNSSQEDPGTVYQCVVRHASLHTPLRSNFTLTAARHSLSETEKTDNFS(SEQ ID NO：6198)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6198具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物是NKp44或NKp46的配体，其是病毒HA。病毒血凝素(HA)是病毒表面的糖蛋白。HA蛋白允许病毒通过唾液酸糖部分与细胞膜结合，唾液酸糖部分有助于病毒膜与细胞膜融合(参见例如，Eur J Immunol.2001年9月；31(9)：2680-9“Recognition of viral hemagglutinins by NKp44 but not by NKp30”；以及Nature.2001年2月22日；409(6823)：1055-60“Recognition of haemagglutinins onvirus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells”，其各自的内容均通过引用并入本文)。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为选自MICA，MICB或ULBP1的NKG2D的配体，例如，其中：

(i)MICA包含以下氨基酸序列：

EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHW(SEQ ID NO：6199)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ IDNO：6199具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列；

(ii)MICB包含以下氨基酸序列：

AEPHSLRYNLMVLSQDESVQSGFLAEGHLDGQPFLRYDRQKRRAKPQGQWAEDVLGAKTWDTETEDLTENGQDLRRTLTHIKDQKGGLHSLQEIRVCEIHEDSSTRGSRHFYYDGELFLSQNLETQESTVPQSSRAQTLAMNVTNFWKEDAMKTKTHYRAMQADCLQKLQRYLKSGVAIRRTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLVLQSQRTD(SEQ IDNO：6200)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQID NO：6200具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列；或

ULBP1包含以下氨基酸序列：

GWVDTHCLCYDFIITPKSRPEPQWCEVQGLVDERPFLHYDCVNHKAKAFASLGKKVNVTKTWEEQTETLRDVVDFLKGQLLDIQVENLIPIEPLTLQARMSCEHEAHGHGRGSWQFLFNGQKFLLFDSNNRKWTALHPGAKKMTEKWEKNRDVTMFFQKISLGDCKMWLEEFLMYWEQMLDPTKPPSLAPG(SEQ ID NO：6201)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6201具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为选自NECTIN2或NECL5的DNAM1的配体，例如，其中：

NECTIN2包含以下氨基酸序列：

QDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGG(SEQ ID NO：6202)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6202具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列；或

NECL5包含以下氨基酸序列：

WPPPGTGDVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRN(SEQ ID NO：6203)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6203具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物是DAP10的配体，其是NKG2D的衔接子(参见例如Proc Natl Acad Sci U S A.2005年5月24日；102(21)：7641-7646；和Blood，2011年9月15日，第118卷第11期，其各自的全部内容通过引用并入本文)。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物是CD 16的配体，其是CD16a/b配体，例如，进一步包含抗体Fc区的CD16a/b配体(参见，例如，Front Immunol.2013；4：76讨论了抗体如何使用Fc通过CD16触发NK细胞，其全部内容并入本文)。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为CRTAM的配体，其为NECL2，例如其中NECL2包含以下氨基酸序列：

QNLFTKDVTVIEGEVATISCQVNKSDDSVIQLLNPNRQTIYFRDFRPLKDSRFQLLNFSSSELKVSLTNVSISDEGRYFCQLYTDPPQESYTTITVLVPPRNLMIDIQKDTAVEGEEIEVNCTAMASKPATTIRWFKGNTELKGKSEVEEWSDMYTVTSQLMLKVHKEDDGVPVICQVEHPAVTGNLQTQRYLEVQYKPQVHIQMTYPLQGLTREGDALELTCEAIGKPQPVMVTWVRVDDEMPQHAVLSGPNLFINNLNKTDNGTYRCEASNIVGKAHSDYMLYVYDPPTTIPPPTTTTTTTTTTTTTILTIITDSRAGEEGSIRAVDH(SEQ ID NO：6204)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6204具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为CD27的配体，其是CD70，例如，其中CD70包含以下氨基酸序列：

QRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP(SEQ ID NO：6205)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6205具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为PSGL1的配体，其是L-选择蛋白(CD62L)，例如，其中L-选择蛋白包含以下氨基酸序列：

WTYHYSEKPMNWQRARRFCRDNYTDLVAIQNKAEIEYLEKTLPFSRSYYWIGIRKIGGIWTWVGTNKSLTEEAENWGDGEPNNKKNKEDCVEIYIKRNKDAGKWNDDACHKLKAALCYTASCQPWSCSGHGECVEIINNYTCNCDVGYYGPQCQFVIQCEPLEAPELGTMDCTHPLGNFSFSSQCAFSCSEGTNLTGIEETTCGPFGNWSSPEPTCQVIQCEPLSAPDLGIMNCSHPLASFSFTSACTFICSEGTELIGKKKTICESSGIWSNPSPICQKLDKSFSMIKEGDYN(SEQ ID NO：6206)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6206具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为CD96的配体，其是NECL5，例如，其中NECL5包含以下氨基酸序列：

WPPPGTGDVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRN(SEQ ID NO：6203)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6203或6204具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为CD100(SEMA4D)的配体，其是CD72，例如，其中CD72包含以下氨基酸序列：

RYLQVSQQLQQTNRVLEVTNSSLRQQLRLKITQLGQSAEDLQGSRRELAQSQEALQVEQRAHQAAEGQLQACQADRQKTKETLQSEEQQRRALEQKLSNMENRLKPFFTCGSADTCCPSGWIMHQKSCFYISLTSKNWQESQKQCETLSSKLATFSEIYPQSHSYYFLNSLLPNGGSGNSYWTGLSSNKDWKLTDDTQRTRTYAQSSKCNKVHKTWSWWTLESESCRSSLPYICEMTAFRFPD(SEQ ID NO：6207)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6207具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为NKp80的配体，其为CLEC2B(AICL)，例如其中CLEC2B(AICL)包含以下氨基酸序列：

KLTRDSQSLCPYDWIGFQNKCYYFSKEEGDWNSSKYNCSTQHADLTIIDNIEEMNFLRRYKCSSDHWIGLKMAKNRTGQWVDGATFTKSFGMRGSEGCAYLSDDGAATARCYTERKWICRKRIH(SEQ ID NO：6208)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6208具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在其他实施方案中，NK细胞衔接物为CD244的配体，其是CD48，例如，其中CD48包含以下氨基酸序列：

QGHLVHMTVVSGSNVTLNISESLPENYKQLTWFYTFDQKIVEWDSRKSKYFESKFKGRVRLDPQSGALYISKVQKEDNSTYIMRVLKKTGNEQEWKIKLQVLDPVPKPVIKIEKIEDMDDNCYLKLSCVIPGESVNYTWYGDKRPFPKELQNSVLETTLMPHNYSRCYTCQVSNSVSSKNGTVCLSPPCTLARS(SEQ ID NO：6209)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6209具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物是病毒血凝素(HA)，HA是在流感病毒表面上发现的糖蛋白。它负责使病毒与膜上带有唾液酸的细胞，例如上呼吸道中的细胞或红细胞结合。HA具有至少18种不同的抗原。这些亚型被命名为H1至H18。NCR可以识别病毒蛋白。已经证明NKp46能够与流感的HA和副粘病毒(包括仙台病毒和新城疫病毒)的HA-NA相互作用。除了NKp46，NKp44也可以在功能上与不同流感亚型的HA相互作用。

在本文所述的任意多功能分子的一些实施方案中，免疫细胞衔接物为NK细胞衔接物，例如介导结合并激活NK细胞的NK细胞衔接物，或介导结合但不激活NK细胞的NK细胞衔接物。在某些实施方案中，NK细胞衔接物选自抗体分子，例如结合(例如，激活)以下的抗原结合结构域或配体NKp30、NKp40、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM1、DAP10、CD16(例如，CD16a、CD16b，或两者)、CRTAM、CD27、PSGL1、CD96、CD100(SEMA4D)、NKp80、CD244(还已知为SLAMF4或2B4)、SLAMF6、SLAMF7、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR2DS1、CD94、NKG2C、NKG2E或CD160，例如NK细胞衔接物是结合(例如，激活)NKp30的抗体分子或配体。在某些实施方案中，NK细胞衔接物是抗体分子，例如抗原结合结构域。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物能够衔接NK细胞。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物为抗体分子，例如，结合NKp30、NKp46、NKG2D或CD16的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，多功能分子：

(i)特异性地结合NKp30、NKp46、NKG2D或CD16的表位，例如，与本文所述的抗-NKp30、抗-NKp46、抗-NKG2D或抗-CD16抗体分子识别的表位相同或相似的表位；

(ii)显示出与本文所述的抗-NKp30、抗-NKp46、抗-NKG2D或抗-CD 16抗体分子相同或相似的结合亲和力或特异性，或两者；

(iii)抑制(例如，竞争性抑制)本文所述的抗-NKp30、抗-NKp46、抗-NKG2D或抗-CD16抗体分子的结合；

(iv)结合与本文所述的抗-NKp30、抗-NKp46、抗-NKG2D或抗-CD16抗体分子相同或重叠的表位；或

(v)与本文所述的抗-NKp30、抗-NKp46、抗-NKG2D或抗-CD16分子竞争结合和/或结合相同的表位。

在一些实施方案中，抗-NKp30、抗-NKp46、抗-NKG2D或抗-CD16抗体分子包含一个或多个CDR、框架区、可变结构域、重链或轻链、或选自表7-10或15的抗原结合结构域、或与其基本上相同的序列。在一些实施方案中，NK细胞衔接物为抗体分子，例如，结合NKp30的抗原结合结构域。在一些实施方案中，淋巴瘤细胞或淋巴细胞的裂解由NKp30介导。在一些实施方案中，在淋巴瘤细胞上不存在肿瘤抗原或在淋巴细胞上不存在TRBC1或TRBC2的情况下，当与NK细胞一起培育时，多功能分子不激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞是表达NKp30的NK细胞并且：(1)淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在，或(2)淋巴细胞上的TRBC1或TRBC2也存在时，多功能分子激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞不是表达NKp30的NK细胞并且：(1)淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在，或(2)淋巴细胞上的TRBC1或TRBC2也存在时，多功能分子不激活NK细胞。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6000(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6001(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6002(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6063(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6064(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：7293(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6000、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6001、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6002；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6063、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6064、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：7293。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6003(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6004(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6005(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6006(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(2)轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6066(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6067(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：7292(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6069(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(3)轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6066、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6067、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：7292、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6069。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6121(或与SEQ ID NO：6121具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(ii)VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：7294(或与SEQ ID NO：7294具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6148或6149(或与SEQ ID NO：6148或6149具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6150(或与SEQ ID NO：6150具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6148或6149(或与SEQ ID NO：6148或6149具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和轻链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6150(或与SEQ ID NO：6150具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6014(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6015(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6016(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6017(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6014、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6015、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6016、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6017。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6123(或与SEQ ID NO：6123具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6018(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6019(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6020(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6021(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6018、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6019、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6020、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6021。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6124(或与SEQ ID NO：6124具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6022(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6023(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6024(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6025(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6022、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6023、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6024、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6025。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6125(或与SEQ ID NO：6125具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6026(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6027(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6028(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6029(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6026、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6027、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6028、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6029。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6126(或与SEQ ID NO：6126具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6030(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6032(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6033(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6034(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6030、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6032、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6033、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6034。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6127(或与SEQ ID NO：6127具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6035(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6036(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6037(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6038(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6035、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6036、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6037、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6038。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6128(或与SEQ ID NO：6128具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6077(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6078(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6079(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6080(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6077、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6078、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6079、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6080。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6137(或与SEQ ID NO：6137具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6081(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6082(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6083(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6084(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6081、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6082、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6083、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6084。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6138(或与SEQ ID NO：6138具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6085(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6086(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6087(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6088(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6085、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6086、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6087、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6088。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6139(或与SEQ ID NO：6139具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6089(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6090(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6091(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6092(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6089、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6090、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6091、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6092。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6140(或与SEQ ID NO：6140具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6093(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6094(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6095(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6096(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6093、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6094、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6095、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6096。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6141(或与SEQ ID NO：6141具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6007(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6008(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6009(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6070(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6071(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6072(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6007、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6008、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6009；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6070、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6071、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6072。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6010(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6011(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6012(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6013(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(2)轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6073(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6074(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6075(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6076(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6010、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6011、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6012、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6013；和

(3)轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6073、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6074、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6075、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6076。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含：

(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6122(或与SEQ ID NO：6122具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(ii)VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6136(或与SEQ ID NO：6136具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6151或6152(或与SEQ ID NO：6151或6152具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6153(或与SEQ ID NO：6153具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6151或6152(或与SEQ ID NO：6151或6152具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和轻链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6153(或与SEQ ID NO：6153具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6039(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6040(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6041(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6042(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6039、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6040、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6041、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6042。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6129(或与SEQ ID NO：6129具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6043(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6044(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6045(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6046(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6043、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6044、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6045、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6046。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6130(或与SEQ ID NO：6130具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6047(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6048(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6049(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6050(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6047、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6048、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6049、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6050。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6131(或与SEQ ID NO：6131具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6051(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6052(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6053(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6054(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6051、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6052、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6053、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6054。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6132(或与SEQ ID NO：6132具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6055(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6056(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6057(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6058(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6055、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6056、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6057、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6058。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6133(或与SEQ ID NO：6133具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6059(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6060(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6061(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6062(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6059、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6060、VHFWR3氨基酸序列SEQID NO：6061、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6062。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6134(或与SEQ ID NO：6134具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，其中NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6097(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6098(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6099(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6100(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6097、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6098、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6099、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6100。在某些实施方案中，其中NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6142(或与SEQ ID NO：6142具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6101(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6102(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6103(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6104(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6101、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6102、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6103、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6104。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6143(或与SEQ ID NO：6143具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6105(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6106(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6107(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6108(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6105、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6106、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6107、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6108。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6144(或与SEQ ID NO：6144具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6109(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6110(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6111(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6112(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6109、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6110、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6111、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6112。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6145(或与SEQ ID NO：6145具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6113(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6114(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6115(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6116(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6113、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6114、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6115、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6116。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6146(或与SEQ ID NO：6146具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6117(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6118(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO：6119(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6120(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6117、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO：6118、VLFWR3氨基酸序列SEQID NO：6119、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO：6120。在某些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6147(或与SEQ ID NO：6147具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物为抗体分子，例如，结合NKp46的抗原结合结构域。在某些实施方案中，淋巴瘤细胞的裂解由NKp46介导。在一些实施方案中，在淋巴瘤细胞上不存在肿瘤抗原的情况下，当与NK细胞一起温育时，多功能分子不激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞是表达NKp46的NK细胞并且淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在时，多功能分子激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞不是表达NKp46的NK细胞并且淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在时，多功能分子不激活NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6182(或与SEQ ID NO：6182具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6183(或与SEQ ID NO：6183具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含scFV，其包含氨基酸序列SEQID NO：6181(或与SEQ ID NO：6181具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物为抗体分子，例如，结合NKG2D的抗原结合结构域。在某些实施方案中，淋巴瘤细胞的裂解由NKG2D介导。在一些实施方案中，在淋巴瘤细胞上不存在肿瘤抗原的情况下，当与NK细胞一起温育时，多功能分子不激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞是表达NKG2D的NK细胞并且淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在时，多功能分子激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞不是表达NKG2D的NK细胞并且淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在时，多功能分子不激活NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6176(或与SEQ ID NO：6176具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6177(或与SEQ ID NO：6177具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含scFV，其包含氨基酸序列SEQID NO：6175(或与SEQ ID NO：6175具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6179(或与SEQ ID NO：6179具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6180(或与SEQ ID NO：6180具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含scFV，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6178(或与SEQ ID NO：6178具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物为抗体分子，例如，结合CD16的抗原结合结构域。在一些实施方案中，淋巴瘤细胞的裂解由CD16介导。在一些实施方案中，在淋巴瘤细胞上不存在肿瘤抗原的情况下，当与NK细胞一起温育时，多功能分子不激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞是表达CD16的NK细胞并且淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在时，多功能分子激活NK细胞。在一些实施方案中，当NK细胞不是表达CD16的NK细胞并且淋巴瘤细胞上的肿瘤抗原也存在时，多功能分子不激活NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6185(或与SEQ ID NO：6185具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6186(或与SEQ ID NO：6186具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，NK细胞衔接物包含scFV，其包含氨基酸序列SEQID NO：6184(或与SEQ ID NO：6184具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，NK细胞衔接物是配体，任选地所述配体还包含免疫球蛋白恒定区，例如Fc区。在某些实施方案中，NK细胞衔接物是NKp44或NKp46的配体，例如病毒HA。在某些实施方案中，NK细胞衔接物是DAP10的配体，例如NKG2D的共受体。在某些实施方案中，NK细胞衔接物是CD16的配体，例如CD16a/b配体，例如还包含抗体Fc区的CD16a/b配体。

B细胞、巨噬细胞和树突细胞衔接物

宽泛地说，B细胞(也称为B淋巴细胞)是淋巴细胞亚型的一种白细胞。它们通过分泌抗体在适应性免疫系统的体液免疫成分中起作用。此外，B细胞呈递抗原(它们也被分类为专业抗原呈递细胞(APC))并分泌细胞因子。巨噬细胞是一种白细胞，其通过吞噬作用吞噬并消化细胞碎片、异物、微生物、癌细胞。除吞噬作用外，它们在非特异性防御(先天免疫)中起重要作用，并通过募集其他免疫细胞(如淋巴细胞)来帮助启动特异性防御机制(适应性免疫)。例如，它们作为T细胞的抗原呈递者很重要。除了增加炎症和刺激免疫系统外，巨噬细胞还起重要的抗炎作用，并且可以通过释放细胞因子来降低免疫反应。树突细胞(DC)是抗原呈递细胞，其作用于处理抗原物质并将其在细胞表面呈递给免疫系统的T细胞。

本公开内容尤其提供了多特异性(例如，双、三、四特异性)或多功能分子，其包括例如经工程化以包含一种或多种介导与B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞的结合和/或激活的B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞衔接物。

因此，在一些实施方案中，免疫细胞衔接物包括选自以下中的一种或多种的B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞衔接物：CD40配体(CD40L)或CD70配体；与CD40或CD70结合的抗体分子；针对OX40的抗体分子；OX40配体(OX40L)；Toll样受体的激动剂(例如，如本文所述，例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4)，或TLR9激动剂)；41BB；CD2；CD47；或STING激动剂，或其组合。

在一些实施方案中，B细胞衔接物是CD40L、OX40L或CD70配体，或与OX40，CD40或CD70结合的抗体分子。

在一些实施方案中，巨噬细胞衔接物是CD2激动剂。在一些实施方案中，巨噬细胞衔接物是与以下结合的抗原结合结构域：CD40L或与CD40结合的抗原结合结构域或配体、Toll样受体(TLR)激动剂(例如，如本文所述)，例如TLR9或TLR4(例如caTLR4(组成型活性TLR4))、CD47或STING激动剂。在一些实施方案中，STING激动剂是环二核苷酸，例如环二GMP(cdGMP)或环二AMP(cdAMP)。在一些实施方案中，STING激动剂是生物素化的。

在一些实施方案中，树突细胞衔接物是CD2激动剂。在一些实施方案中，树突细胞衔接物是与以下中的一种或多种结合的配体、受体激动剂或抗体分子：OX40L、41BB、TLR激动剂(例如，如本文所述)(例如TLR9激动剂、TLR4(例如caTLR4(组成型活性TLR4))、CD47或STING激动剂。在一些实施方案中，STING激动剂是环二核苷酸，例如环二GMP(cdGMP)或环二AMP(cdAMP)。在一些实施方案中，STING激动剂是生物素化的。

在其他实施方案中，免疫细胞衔接物介导与B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞中的一个或多个的结合或激活。示例性的B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞衔接物可以选自以下中的一种或多种：CD40配体(CD40L)或CD70配体；与CD40或CD70结合的抗体分子；针对OX40的抗体分子；OX40配体(OX40L)；Toll样受体激动剂(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4)或TLR9激动剂)；41BB激动剂；CD2；CD47；或STING激动剂，或其组合。

在一些实施方案中，B细胞衔接物选自CD40L、OX40L或CD70配体或与OX40、CD40或CD70结合的抗体分子中的一种或多种。

在其他实施方案中，巨噬细胞衔接物选自以下中的一种或多种：CD2激动剂；CD40L；OX40L；与OX40、CD40或CD70结合的抗体分子；Toll样受体激动剂或其片段(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4))；CD47激动剂；或STING激动剂。

在其他实施方案中，树突细胞衔接物选自以下中的一种或多种：CD2激动剂、OX40抗体、OX40L、41BB激动剂、Toll样受体激动剂或其片段(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4))、CD47激动剂或STING激动剂。

在一个实施方案中，OX40L包含以下氨基酸序列：

QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL(SEQ ID NO：6210)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ IDNO：6210具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，CD40L包含以下氨基酸序列：

MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(SEQ ID NO：6211)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6211具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，STING激动剂包含环二核苷酸，例如环二GMP(cdGMP)、环二AMP(cdAMP)或其组合，任选地具有2′，5′或3′，5′磷酸键。

在一个实施方案中，免疫细胞衔接物包括41BB配体，其例如，其包含以下氨基酸序列：

ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE(SEQ ID NO：6212)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ IDNO：6212具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

Toll样受体

Toll样受体(TLR)是进化保守的受体，是果蝇属Toll蛋白的同系物，识别被称为病原体相关微生物模式(PAMP)(仅由微生物病原体表达)或与危险相关的分子模式(DAMP)(从坏死或垂死细胞释放的内源性分子)的高度保守的结构基序。PAMP包括各种细菌细胞壁组分，例如脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和脂肽，以及鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒双链RNA。DAMP包括细胞内蛋白(例如热休克蛋白)以及来自细胞外基质的蛋白质片段。相应的PAMP或DAMP对TLR的刺激会引发信号传导级联反应，从而导致转录因子(例如AP-1、NF-κB和干扰素调节因子(IRF))的激活。通过TLR信号传导会导致多种细胞反应，包括干扰素(IFN)、促炎性细胞因子和效应细胞因子的产生，它们指导适应性免疫应答。TLR与多种炎症和免疫疾病有关，并在癌症中起作用(Rakoff-Nahoum S.和Medzhitov R.，2009.Toll-1ike receptors andcancer，Nat Revs Cancer 9：57-63)。

TLR是I型跨膜蛋白，其特征在于含有富含亮氨酸的重复序列(LRR)的细胞外结构域和含有称为Toll/IL-1受体(TIR)结构域的保守区的胞质尾区。已表征出十种人类TLR和十二种鼠TLR，人类中为TLR1至TLR10，小鼠中为TLR1至TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，TLR10的同源物是假基因。TLR2对于识别革兰氏阳性细菌中的多种PAMP，包括细菌脂蛋白、脂甘露聚糖和脂磷壁酸至关重要。TLR3与病毒衍生的双链RNA有关。TLR4主要被脂多糖激活。TLR5检测细菌鞭毛蛋白，而对未甲基化的CpG DNA的应答则需要TLR9。最后，TLR7和TLR8识别小的合成抗病毒分子，据报道单链RNA是其天然配体。据报道，TLR11识别来自尿道致病性大肠杆菌和鼠弓形虫的抑制蛋白样蛋白质。TLR彼此异二聚化的能力显然可以扩展TLR的全部特异性。例如，对二酰化脂蛋白的应答需要TLR2和TLR6的二聚体，而TLR2和TLR1相互作用以识别三酰化脂蛋白。TLR的特异性还受到各种衔接子和辅助分子的影响，例如MD-2和CD 14，它们响应于LPS而与TLR4形成复合物。

TLR信号传导由至少两个不同的途径组成：导致炎症细胞因子产生的MyD88依赖性途径，以及与IFN-β刺激和树突细胞成熟相关的MyD88非依赖性途径。MyD88依赖性途径是除TLR3以外的所有TLR共有的(Adachi O.等人，1998.Targeted disruption ofthe MyD88gene results in loss of IL-1-and IL-18-mediated function，Immunity.9(1)：143-50)。通过PAMP或DAMP激活后，TLR异源或同二聚化通过胞质TIR结构域诱导衔接蛋白的募集。各个TLR通过使用不同的衔接分子诱导不同的信号传导响应。TLR4和TLR2信号传导需要衔接子TIRAP/Mal，其参与MyD 88依赖性途径。TLR3以MyD88非依赖性方式通过衔接子TRIF/TICAM-1触发对双链RNA的应答的IFN-β产生。TRAM/TIC AM-2是参与MyD 88非依赖性途径的另一个衔接分子，其功能被限制于TLR4途径。

TLR3、TLR7、TLR8和TLR9识别病毒核酸并诱导I型IFN。根据激活的TLR，导致I型IFN诱导的信号传导机制不同。它们涉及干扰素调节因子IRF-已知在抗病毒防御、细胞生长和免疫调节中起关键作用的转录因子亚家族。三个IRF(IRF3、IRF5和IRF7)充当病毒介导的TLR信号传导的直接转导物。TLR3和TLR4激活IRF3和IRF7，而TLR7和TLR8激活IRF5和IRF7(Doyle S.等人，2002.IRF3 mediates a TLR3/TLR4-specific antiviral gene program，Immunity.17(3)：251-63)。此外，已显示由TLR9配体CpG-A刺激的I型IFN产生是由PI(3)K和mTOR介导的(Costa-Mattioli M.和Sonenberg N.2008.RAPping production of type Iinterferon in pDCs through mTOR，Nature Immunol.9：1097-1099)

TLR-9

TLR9识别DNA分子中未甲基化的CpG序列。与细菌基因组或病毒DNA相比，CpG位点在脊椎动物基因组上相对较少(约1％)。TLR9由免疫系统的许多细胞表达，例如B淋巴细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞和浆细胞样树突细胞。TLR9在核内体区室中细胞内表达，并用于通过与富含CpG基序的DNA结合来提醒免疫系统有病毒和细菌感染。TLR9信号导致激活引发促炎症反应的细胞，从而导致产生细胞因子，如I型干扰素和IL-12。

TLR激动剂

TLR激动剂可以激动一种或多种TLR，例如人TLR-1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的一种或多种。在一些实施方案中，本文所述的辅助剂是TLR激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂特异性地激动人TLR-9。在一些实施方案中，TLR-9激动剂是CpG部分。如本文所用，CpG部分是线性的二核苷酸，其具有序列：5’-C-磷酸酯-G-3’，即，仅被一个磷酸酯分开的胞嘧啶和鸟嘌呤。

在一些实施方案中，CpG部分包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，CpG部分由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个CpG二核苷酸组成。在一些实施方案中，CpG部分具有1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、5-10、5-20、5-30、10-20、10-30、10-40或10-50个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，TLR-9激动剂是合成的ODN(寡脱氧核苷酸)。CpG ODN是短的合成的单链DNA分子，其在特定的序列环境中包含未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)。与基因组细菌DNA中发现的天然磷酸二酯(PO)骨架相反，CpG ODN具有部分或完全硫代磷酸酯化(PS)骨架。CpG ODN主要有三类：A、B和C类，它们的免疫刺激活性不同。CpG-A ODN的特征是PO中心含CpG回文基序和PS修饰的3’多聚鸟苷酸(poly-G)串(string)。它们诱导pDC产生大量IFN-α，但是是TLR9依赖性NF-κB信号传导和促炎性细胞因子(例如IL-6)产生的较弱刺激物。CpG-B ODN包含具有一个或多个CpG二核苷酸的完整PS骨架。它们强烈激活B细胞和TLR9依赖性NF-κB信号传导，但微弱刺激IFN-α分泌。CpG-C ODN结合了A类和B类两者的特征。它们包含完整的PS骨架和含CpG的回文基序。C类CpG ODN诱导pDC产生大量的IFN-α并刺激B细胞。

细胞因子分子

细胞因子通常是例如通过信号转导途径影响细胞活性的多肽。因此，多特异性或多功能多肽的细胞因子是有用的，并且可以与受体介导的信号传导相关，该信号传导从细胞膜外传递信号以调节细胞内的应答。细胞因子是蛋白质信号传导化合物，其为免疫应答的介质。它们控制许多不同的细胞功能，包括增殖、分化和细胞存活/凋亡；细胞因子也参与多种病理生理过程，包括病毒感染和自身免疫性疾病。细胞因子在先天免疫系统(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)和适应性免疫系统(T细胞和B细胞)的各种细胞的不同刺激下合成。细胞因子可分为两组：促炎的和抗炎的。包括IFNγ、IL-1、IL-6和TNF-α在内的促炎细胞因子主要来源于先天免疫细胞和Th1细胞。包括IL-10、IL-4、IL-13和IL-5在内的抗炎细胞因子由Th2免疫细胞合成。

本公开内容尤其提供了多特异性(例如，双、三、四特异性)或多功能分子，其包括例如经工程化以包含一种或多种细胞因子分子，例如免疫调节性(例如促炎性)细胞因子及其变体，例如其功能变体。因此，在一些实施方案中，细胞因子分子是白介素或其变体，例如其功能变体。在一些实施方案中，白介素是促炎白介素。在一些实施方案中，白介素选自白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、白介素-21(IL-21)、白介素7(IL-7)或干扰素γ。在一些实施方案中，细胞因子分子是促炎细胞因子。

在某些实施方案中，细胞因子是单链细胞因子。在某些实施方案中，细胞因子是多链细胞因子(例如，细胞因子包含2个或更多个(例如2个)多肽链。示例性的多链细胞因子是IL-12。

有用的细胞因子的实例包括但不限于GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-21、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNFβ。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是选自以下的细胞因子：GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β和TGF-β。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是选自IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α和IFN-γ的细胞因子。在某些实施方案中，使细胞因子突变以去除N-和/或O-糖基化位点。消除糖基化增加了重组生产中可获得的产物的均质性。在某些实施方案中，细胞因子是TGF-β。在某些实施方案中，多特异性或多功能多肽包含TGF-β抑制剂。

在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-2。在具体的实施方案中，IL-2细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：激活的T淋巴细胞的增殖、激活的T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞的增殖、激活的B细胞的分化、天然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、由激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌、以及NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤细胞毒性。在另一个特定的实施方案中，IL-2细胞因子是对IL-2受体的α-亚基具有降低的结合亲和力的突变体IL-2细胞因子。α-亚基(也称为CD 25)与β-亚基和γ-亚基(分别称为CD 122和CD132)一起形成异三聚体的高亲和力IL-2受体，而仅由β-亚基和γ-亚基组成的二聚体受体称为中等亲和力IL-2受体。如在PCT专利申请号PCT/EP2012/051991中描述的(其通过引用整体并入本文)，与IL-2受体的α-亚基的结合减少的突变体IL-2多肽，与野生型IL-2多肽相比，具有降低的在调节性T细胞中诱导IL-2信号传导的能力，在T细胞中诱导更少的激活诱导的细胞死亡(AICD)，并且在体内具有降低的毒性特征。这种具有降低的毒性的细胞因子的使用在根据本发明的多特异性或多功能多肽中特别有利，该多肽由于存在Fc结构域而具有较长的血清半衰期。在一个实施方案中，根据本发明的多特异性或多功能多肽的突变体IL-2细胞因子包含至少一种氨基酸突变，其与未突变的IL-2细胞因子相比，降低或消除了突变体IL-2细胞因子对IL-2受体的α-亚基(CD25)的亲和力，但保留突变体IL-2细胞因子对中等亲和力IL-2受体(由IL-2受体的β和γ亚基组成)的亲和力。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸突变是氨基酸置换。在一个具体的实施方案中，突变体IL-2细胞因子在选自对应于人IL-2的残基42、45和72的位置的一个、两个或三个位置处包含一个、两个或三个氨基酸置换。在更具体的实施方案中，突变体IL-2细胞因子在对应于人IL-2的残基42、45和72的位置处包含三个氨基酸置换。在甚至更具体的实施方案中，突变体IL-2细胞因子是人IL-2，其包含氨基酸置换F42A、Y45A和L72G。在一个实施方案中，突变体IL-2细胞因子在与人IL-2的位置3相对应的位置处另外包含氨基酸突变，这消除了IL-2的O-糖基化位点。特别地，所述另外的氨基酸突变是通过丙氨酸残基代替苏氨酸残基的氨基酸置换。可用于本发明的特定的突变体IL-2细胞因子在对应于人IL-2的残基3、42、45和72的位置处包含四个氨基酸置换。特定的氨基酸置换是T3A、F42A、Y45A和L72G。如PCT专利申请号PCT/EP2012/051991和所附实施例所示，所述四重突变体IL-2多肽(IL-2qm)表现出与CD25没有可检测的结合，在T细胞中诱导凋亡的能力降低，在T.sub.reg细胞中诱导IL-2信号传导的能力降低，并且体内毒性特征降低。但是，它保留了激活效应细胞中IL-2信号传导，诱导效应细胞增殖以及由NK细胞产生IFN-γ作为次级细胞因子的能力。

根据上述实施方案中任一项的IL-2或突变体IL-2细胞因子可包含提供进一步的优势例如增加的表达或稳定性的其他突变。例如，位置125处的半胱氨酸可以用中性氨基酸例如丙氨酸代替，以避免形成二硫键桥接的IL-2二聚体。因此，在某些实施方案中，根据本发明的多特异性或多功能多肽的IL-2或突变体IL-2细胞因子在对应于人IL-2的残基125的位置处包含另外的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸置换C125A。

在一个具体的实施方案中，多特异性或多功能多肽的IL-2细胞因子包含SEQ IDNO：6364的多肽序列[APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT]。在另一个具体的实施方案中，多特异性或多功能多肽的IL-2细胞因子包含SEQ ID NO：6365的多肽序列[APASSSTKKTQLQLEHLLLD LQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHL RPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT]。

在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-12。在具体的实施方案中，所述IL-12细胞因子是单链IL-12细胞因子。在甚至更具体的实施方案中，单链IL-12细胞因子包含SEQ ID NO：6366的多肽序列[IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS]。在一个实施方案中，IL-12细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：NK细胞的增殖、NK细胞的分化、T细胞的增殖和T细胞的分化。

在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-10。在具体的实施方案中，所述IL-10细胞因子是单链IL-10细胞因子。在甚至更具体的实施方案中，单链IL-10细胞因子包含SEQ ID NO：6367的多肽序列[SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN]。在另一个具体的实施方案中，IL-10细胞因子是单体IL-10细胞因子。在更具体的实施方案中，单体IL-10细胞因子包含SEQ ID NO：6368的多肽序列[SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN]。在一个实施方案中，IL-10细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：抑制细胞因子分泌、抑制抗原呈递细胞的抗原呈递、减少氧自由基释放和抑制T细胞增殖。根据本发明的多特异性或多功能多肽，其中细胞因子是IL-10，其特别适用于下调炎症，例如用于治疗炎性疾病。

在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-15。在具体的实施方案中，所述IL-15细胞因子是对IL-15受体的α-亚基具有降低的结合亲和力的突变体IL-15细胞因子。不希望受到理论的束缚，与野生型IL-15多肽相比，与IL-15受体的α-亚基的结合减少的突变体IL-15多肽具有降低的与整个身体的成纤维细胞结合的能力，从而导致改善的药代动力学和毒性特征。使用毒性降低的细胞因子，如所述的突变体IL-2和突变体IL-15效应子部分，在根据本发明的多特异性或多功能多肽中特别有利，该多肽由于存在Fc结构域而具有较长的血清半衰期。在一个实施方案中，根据本发明的多特异性或多功能多肽的突变体IL-15细胞因子包含至少一种氨基酸突变，与未突变的IL-15细胞因子相比，其降低或消除了突变体IL-15细胞因子对IL-15受体的α-亚基的亲和力，但保留突变体IL-15细胞因子对中等亲和力IL-15/IL-2受体(由IL-15/IL-2受体的β-亚基和γ-亚基组成)的亲和力。在一个实施方案中，氨基酸突变是氨基酸置换。在具体的实施方案中，突变体IL-15细胞因子在对应于人IL-15的残基53的位置处包含氨基酸置换。在更具体的实施方案中，突变体IL-15细胞因子是包含氨基酸置换E53A的人IL-15。在一个实施方案中，突变体IL-15细胞因子在对应于人IL-15的位置79的位置处另外包含氨基酸突变，其消除了IL-15的N-糖基化位点。特别地，所述另外的氨基酸突变是用丙氨酸残基代替天冬酰胺残基的氨基酸置换。在甚至更具体的实施方案中，IL-15细胞因子包含SEQ ID NO：6370[NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLASGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGAVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS]的多肽序列。在一个实施方案中，IF-15细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：激活的T淋巴细胞的增殖、激活的T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞的增殖、激活的B细胞的分化、天然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、由激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(FAK)抗肿瘤细胞毒性。

可用作多特异性或多功能多肽中的效应子部分的突变体细胞因子分子可以使用本领域熟知的遗传或化学方法通过缺失、置换、插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性致突变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸改变可以例如通过测序来验证。置换或插入可涉及天然以及非天然氨基酸残基。氨基酸修饰包括众所周知的化学修饰方法，例如添加或去除糖基化位点或碳水化合物附着等。

在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是GM-CSF。在具体的实施方案中，GM-CSF细胞因子可以在粒细胞、单核细胞或树突细胞中引起增殖和/或分化。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IFN-α。在具体的实施方案中，IFN-α细胞因子可以引起选自以下的一种或多种细胞应答：抑制病毒感染的细胞中的病毒复制，以及上调主要组织相容性复合体I(MHC I)的表达。在另一个具体的实施方案中，IFN-α细胞因子可以抑制肿瘤细胞的增殖。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IFNγ。在具体的实施方案中，IFNγ细胞因子可以引起选自以下的一种或多种细胞应答：增加的巨噬细胞活性、增加的MHC分子表达和增加的NK细胞活性。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IL-7。在具体的实施方案中，IL-7细胞因子可引起T和/或B淋巴细胞的增殖。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IL-8。在具体的实施方案中，IL-8细胞因子可以引起嗜中性粒细胞的趋化性。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是MIP-1α。在具体的实施方案中，MIP-1α细胞因子可引起单核细胞和T淋巴细胞的趋化性。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是MIR-1β。在具体的实施方案中，MIR-1β细胞因子可引起单核细胞和T淋巴细胞的趋化性。在一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是TGF-β。在具体的实施方案中，TGF-β细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：单核细胞的趋化性、巨噬细胞的趋化性、激活的巨噬细胞中IL-1表达的上调、和激活的B细胞中IgA表达的上调。

在一个实施方案中，本发明的多特异性或多功能多肽以是对照细胞因子的至少约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍的解离常数(K_D)结合细胞因子受体。在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽以是对应的包括两个或更多个效应子部分的多特异性或多功能多肽的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的K_D结合细胞因子受体。在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽以是对应的包含两种或更多种细胞因子的多特异性或多功能多肽的10倍的解离常数K_D与细胞因子受体结合。

在一些实施方案中，本文公开的多特异性分子包含细胞因子分子。在实施方案中，细胞因子分子包括细胞因子的全长、片段或变体；细胞因子受体结构域，例如，细胞因子受体二聚化结构域；或细胞因子受体的激动剂，例如针对细胞因子受体的抗体分子(例，激动性抗体)。

在一些实施方案中，细胞因子分子选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-7、IL-21或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。在实施方案中，细胞因子分子可以进一步包括细胞因子受体二聚化结构域。

在其他实施方案中，细胞因子分子是细胞因子受体的激动剂，例如针对选自IL-15Ra或IL-21R的细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)。

在一个实施方案中，细胞因子分子是IL-15，例如人IL-15(例如，其包含以下氨基酸序列：

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO：6191)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6191具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，细胞因子分子包含受体二聚化结构域，例如IL15Rα二聚化结构域。在一个实施方案中，IL15Rα二聚化结构域包含以下氨基酸序列：

MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVL(SEQ ID NO：6192)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6192具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施方案中，多特异性分子的细胞因子分子(例如IL-15)和受体二聚化结构域(例如IL15Rα二聚化结构域)，例如通过接头(例如Gly-Ser接头，例如包含氨基酸序列SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ(SEQ ID NO：6193)的接头)共价连接。在其他实施方案中，多特异性分子的细胞因子分子(例如IL-15)和受体二聚化结构域(例如IL15Rα二聚化结构域)不是共价连接，例如非共价结合。

在其他实施方案中，细胞因子分子是IL-2，例如人IL-2(例如，其包含以下氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：6194)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ IDNO：6194具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列)。

在其他实施方案中，细胞因子分子是IL-18，例如人IL-18(例如，其包含以下氨基酸序列：

YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO：6195)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ ID NO：6195具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列)。

在其他实施方案中，细胞因子分子是IL-21，例如人IL-21(例如，其包含以下氨基酸序列：

QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO：6196)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQ IDNO：6196具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列)。

在另外的实施方案中，细胞因子分子是干扰素γ，例如人干扰素γ(例如，其包含以下氨基酸序列：

QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRG(SEQ IDNO：6197)，其片段，或与其基本上相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对氨基酸序列SEQID NO：6197具有至少1个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列)。

TGF-β抑制剂

在一个方面，本文提供了包含TGF-β调节剂(例如，TGF-β抑制剂)的多特异性或多功能多肽(例如，抗体分子)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂与TGF-β结合并且抑制TGF-β，例如，降低TGF-β的活性。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂抑制TGF-β1(例如，降低TGF-β1的活性)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂抑制TGF-β2(例如，降低TGF-β2的活性)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂抑制TGF-β3(例如，降低TGF-β3的活性)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂抑制TGF-β1和TGF-β3(例如，降低TGF-β1和TGF-β3的活性)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂抑制TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3(例如，降低TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的活性)。

在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含能够抑制TGF-β(例如，降低TGF-β的活性)的TGF-β受体的一部分(例如，TGF-β受体的胞外结构域)，或其功能片段或变体。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR1多肽(例如，TGFBR1的胞外结构域或其功能变体)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR2多肽(例如，TGFBR2的胞外结构域或其功能变体)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR3多肽(例如，TGFBR3的胞外结构域或其功能变体)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR1多肽(例如，TGFBR1的胞外结构域或其功能变体)和TGFBR2多肽(例如，TGFBR2的胞外结构域或其功能变体)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR1多肽(例如，TGFBR1的胞外结构域或其功能变体)和TGFBR3多肽(例如，TGFBR3的胞外结构域或其功能变体)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR2多肽(例如，TGFBR2的胞外结构域或其功能变体)和TGFBR3多肽(例如，TGFBR3的胞外结构域或其功能变体).

可用作TGF-β抑制剂的示例性TGF-β受体多肽已公开于US8993524、US9676863、US8658135、US20150056199、US20070184052和WO2017037634，其全部通过引用整体并入本文.

在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR1的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6381的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6382的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6383的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6390的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6391的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。

在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR2的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6384的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6385的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6386的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6387的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6388的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6389的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。

在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含TGFBR3的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6392的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6393的胞外结构域或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含SEQ ID NO：6394的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少80％、85％、90％或95％相同的序列)。

在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含不超过一个TGF-β受体胞外结构域。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂包含两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)例如通过接头连接在一起的TGF-β受体胞外结构域。

在一些实施方案中，多特异性分子包含图24A-24D中所示的构型。在一些实施方案中，TGFβ抑制剂包含TGF-β受体ECD同二聚体。在一些实施方案中，TGFβ抑制剂包含TGF-β受体ECD异二聚体。在一些实施方案中，两个TGFBR ECD结构域连接至两个Fc区，例如，两个Fc区的C-末端。在一些实施方案中，两个TGFBR ECD结构域分别连接至CH1和CL。

表4A.TGF-β多肽或TGF-β受体多肽的示例性氨基酸序列

基质修饰部分

实体瘤具有模仿正常组织的独特结构，并包含两个不同但相互依存的区室：实质(赘生性细胞)和赘生性细胞诱导并分散于其中的基质。所有肿瘤都具有基质，需要基质来提供营养支持和清除废物。在肿瘤以细胞悬液(例如白血病、腹水肿瘤)生长的情况下，血浆充当基质(Connolly JL等人，Tumor Structure and Tumor Stroma Generation，载于：Kufe DW等人编辑的Holland-Frei Cancer Medicine，第六版，Hamilton：BC Decker；2003中)。基质包括多种细胞类型，包括成纤维细胞/肌成纤维细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、脂肪细胞、血管细胞、平滑肌细胞和免疫细胞，以及细胞外基质(ECM)和细胞外分子(J ofCellular Biochemistry 101：805-815(2007)中的Li Hanchen等人，TumorMicroenvironment：The Role of the Tumor Stroma in Cancer)。

本文所述的基质修饰部分包含能够降解基质组分的部分，该基质组分是例如ECM组分，例如糖胺聚糖，例如玻尿酸(也称为透明质酸或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、巢蛋白、腱生蛋白、聚集蛋白聚糖和硫酸角蛋白；或细胞外蛋白，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白。

基质修饰酶

在一些实施方案中，基质修饰部分是酶。例如，基质修饰部分可包括但不限于透明质酸酶、胶原酶、软骨素酶、基质金属蛋白酶(例如，巨噬细胞金属弹性蛋白酶)。

透明质酸酶

透明质酸酶是在整个动物界中发现的一组中性和酸性的活性酶。透明质酸酶在底物特异性和作用机理方面有所不同。透明质酸酶一般分为三类：(1)哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)，其是内切-β-N-乙酰基己糖胺酶，其中四糖和六糖为主要终产物。它们同时具有水解和转糖苷酶活性，并且可以降解玻尿酸和硫酸软骨素；(2)细菌透明质酸酶(EC4.2.99.1)降解玻尿酸，并在不同程度上降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素。它们是内切-β-N-乙酰基己糖胺酶，通过β消除反应起作用，主要产生二糖终产物；(3)来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)是内切β-葡糖醛酸酶，可通过水解β1-3键产生四糖和六糖终产物。

哺乳动物的透明质酸酶可以进一步分为两组：(1)中性活性酶和(2)酸性活性酶。人类基因组中有六个透明质酸酶样基因：HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是假基因，尚未显示HYAL3具有针对任何已知底物的酶活性。HYAL4是一种软骨素酶，对玻尿酸缺乏活性。HYAL1是原型酸活性酶，PH20是原型中性活性酶。酸性活性透明质酸酶(例如HYAL1和HYAL2)在中性pH下缺乏催化活性。例如，HYAL1在pH超过4.5的条件下在体外没有催化活性(Frost和Stern，“A Microtiter-Based Assay for HyaluronidaseActivity Not Requiring Specialized Reagents”.Analytical Biochemistry，第251卷，第263-269页(1997)。HYAL2是一种在体外具有非常低的特异性活性的酸性活性酶。

在一些实施方案中，透明质酸酶是哺乳动物透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是重组人透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是中性活性透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是中性活性的可溶性透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是重组PH20中性活性酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是重组PH20中性活性的可溶性酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是糖基化的。在一些实施方案中，透明质酸酶具有至少一种N-连接的聚糖。重组透明质酸酶可以使用本领域技术人员已知的常规方法例如US7767429来生产，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，透明质酸酶是rHuPH20(也称为

；目前由Halozyme制造；在2005年被FDA批准(参见例如Scodeller P(2014)Hyaluronidase and otherExtracellular Matrix Degrading Enzymes for Cancer Therapy：New Uses and Nano-Formulations.J Carcinog Mutage 5：178；US7767429；US8202517；US7431380；US8450470；US8772246；US8580252，其各自的全部内容通过引用并入本文)。rHuPH20由基因工程化的CHO细胞产生，该细胞含有编码人透明质酸酶PH20的可溶性片段的DNA质粒。在一些实施方案中，透明质酸酶是糖基化的。在一些实施方案中，透明质酸酶具有至少一种N-连接的聚糖。重组透明质酸酶可以使用本领域技术人员已知的常规方法例如US7767429来生产，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，rHuPH20具有与以下氨基酸序列至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％、100％)相同的序列LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS(SEQ ID NO：6213)。

在本文提供的任何方法中，抗玻尿酸试剂可以是降解玻尿酸的试剂或可以是抑制玻尿酸合成的试剂。例如，抗玻尿酸试剂可以是玻尿酸降解酶。在另一个实例中，抗玻尿酸试剂为抑制玻尿酸合成的试剂。例如，抗玻尿酸试剂是抑制玻尿酸合成的试剂，例如针对HA合酶的有义或反义核酸分子，或者是小分子药物。例如，抗玻尿酸试剂是4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物，或来氟米特或其衍生物。这样的衍生物包括例如4-甲基伞形酮(MU)的衍生物，即6，7-二羟基-4-甲基香豆素或5，7-二羟基-4-甲基香豆素。

在本文提供的方法的其他实例中，玻尿酸降解酶是透明质酸酶。在一些实例中，玻尿酸降解酶是PH20透明质酸酶或其截短形式，该截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或GPI附着位点的一部分。在特定的实例中，透明质酸酶是选自人、猴、牛、绵羊、大鼠、小鼠或豚鼠的PH20的PH20。例如，玻尿酸降解酶是具有中性活性并被N-糖基化的人PH20透明质酸酶，并且选自(a)为全长PH20或为PH20的C末端截短形式的透明质酸酶多肽，其中截短形式至少包含SEQ ID NO：6213的氨基酸残基36-464，例如36-481、36-482、36-483，其中全长PH20具有SEQ ID NO：6213所示的氨基酸序列；或(b)包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：6213所示的氨基酸序列的多肽或截短形式具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的透明质酸酶多肽；或(c)包含氨基酸置换的(a)或(b)的透明质酸酶多肽，其中该透明质酸酶多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：6213所示的多肽或其相应的截短形式具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在示例性实例中，玻尿酸降解酶是PH20，其包含称为rHuPH20的组成。

在其他实例中，抗玻尿酸试剂是玻尿酸降解酶，其通过缀合至聚合物而被修饰。聚合物可以是PEG，抗玻尿酸试剂是PEG化的玻尿酸降解酶。因此，在本文提供的方法的一些实例中，玻尿酸降解酶通过缀合至聚合物而被修饰。例如，玻尿酸降解酶缀合至PEG，因此玻尿酸降解酶被PEG化。在示例性的实例中，玻尿酸降解酶是PEG化的PH20酶(PEGPH20)。在本文提供的方法中，皮质类固醇可以是糖皮质激素，其选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙和泼尼松。

软骨素酶

软骨素酶是在整个动物界中发现的一种酶，其通过内切糖苷酶反应降解糖胺聚糖，特别是软骨素和硫酸软骨素。在一些实施方案中，软骨素酶是哺乳动物软骨素酶。在一些实施方案中，软骨素酶是重组人软骨素酶。在一些实施方案中，软骨素酶是HYAL4。其他示例性的软骨素酶包括软骨素酶ABC(衍生自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)；日本专利申请公开号6-153947；T.Yamagata等人，J.Biol.Chem.，243，1523(1968)；S.Suzuki等人，J.Biol.Chem.，243，1543(1968))、软骨素酶AC(衍生自肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)；T.Yamagata等人，J.Biol.Chem.，243，1523(1968))、软骨素酶AC II(衍生自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)；K.Hiyama和S.Okada，J.Biol.Chem.，250，1824(1975)；K.Hiyama和S.Okada，J.Biochem.(Tokyo)，80，1201(1976))、透明质酸酶ACIII(衍生自黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)Hpl02；Hirofumi Miyazono等人，Seikagaku，61，1023(1989))、软骨素酶B(衍生自肝素黄杆菌；Y.M.Michelacci和C.P.Dietrich，Biochem.Biophys.Res.Commun.，56，973(1974)；Y.M.Michelacci和C.P.Dietrich，Biochem.J.，151，121(1975)；Kenichi Maeyama等人，Seikagaku，57，1189(1985))、软骨素酶C(衍生自黄杆菌属物种Hp 102；Hirofumi Miyazono等人，Seikagaku，61，1023(1939))等。

基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性肽链内切酶，是参与细胞外基质(ECM)降解的主要蛋白酶。MMP能够降解各种细胞外分子和许多生物活性分子。已在人体中鉴定出二十四种MMP基因，根据结构域排布和底物偏好可将其分为六组：胶原酶(MMP-1、-8和-13)、明胶酶(MMP-2和MMP-9)、基质溶素(MMP-3、-10和-11)、基质溶解因子(MMP-7和MMP-26)、膜类型(MT)-MMP(MMP-14、-15、-16、-17、-24和-25)和其他(MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27和-28)。在一些实施方案中，基质修饰部分是人重组MMP(例如，MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、10、-11、-12、-13、-14、15、-15、-17、-18、-19、20、-21、-22、-23或-24)。

胶原酶

三种哺乳动物胶原酶(MMP-1、-8和-13)是能够裂解胶原细胞外基质的主要分泌的肽链内切酶。除了纤维胶原，胶原酶还可以裂解其他多种基质和非基质蛋白，包括生长因子。胶原酶被合成为非活性的替代形式，一旦被激活，其活性就会被金属蛋白酶、TIMP的特异性组织抑制剂以及非特异性蛋白酶抑制剂所抑制(Ala-aho R等人，Biochimie.Collagenases in cancer.2005年3月-4月；87(3-4)：273-86)。在一些实施方案中，基质修饰部分是胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶是人重组胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶是MMP-1。在一些实施方案中，胶原酶是MMP-8。在一些实施方案中，胶原酶是MMP-13。

巨噬细胞金属弹性蛋白酶

巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MME)，也称为MMP-12，是MMP基质溶素亚组的成员，催化可溶和不可溶弹性蛋白以及多种基质和非基质底物的水解，包括IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、乙酰肝素和硫酸软骨素(Erja

等人，Journal ofInvestigative Dermatology(2000)114，1113-1119；doi：10.1046/j.1523-1747.2000.00993)。在一些实施方案中，基质修饰部分是MME。在一些实施方案中，MME是人重组MME。在一些实施方案中，MME是MMP-12。

其他基质修饰部分

在一些实施方案中，基质修饰部分引起以下中的一种或多种：降低基质或细胞外基质(ECM)组分的水平或产生；减少肿瘤纤维化；增加间质肿瘤的运输；改善肿瘤灌注；扩展肿瘤微脉管系统；降低肿瘤中的间质液压(IFP)；或减少或增强诸如癌症治疗剂或细胞疗法的药剂向肿瘤或肿瘤脉管系统的渗透或扩散。

在一些实施方案中，降低的基质或ECM组分选自糖胺聚糖或细胞外蛋白，或其组合。在一些实施方案中，糖胺聚糖选自玻尿酸(也称为透明质酸或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、巢蛋白、腱生蛋白、聚集蛋白聚糖和硫酸角蛋白。在一些实施方案中，细胞外蛋白选自胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白或玻连蛋白。在一些实施方案中，基质修饰部分包括降解肿瘤基质或细胞外基质(ECM)的酶分子。在一些实施方案中，酶分子选自透明质酸酶分子、胶原酶分子、软骨素酶分子、基质金属蛋白酶分子(例如，巨噬细胞金属弹性蛋白酶)或上述任何一种的变体(例如，片段)。术语“酶分子”包括酶的全长、片段或变体，例如保留天然存在的酶的至少一种功能性质的酶变体。

在一些实施方案中，基质修饰部分降低了透明质酸的水平或产生。在其他实施方案中，基质修饰部分包含玻尿酸降解酶、抑制玻尿酸合成的试剂或抗透明质酸的抗体分子。

在一些实施方案中，玻尿酸降解酶是透明质酸酶分子，例如其全长或其变体(例如，其片段)。在一些实施方案中，玻尿酸降解酶在中性或酸性pH，例如约4-5的pH下具有活性。在一些实施方案中，透明质酸酶分子是哺乳动物透明质酸酶分子，例如重组人透明质酸酶分子，例如其全长或变体(例如其片段，例如截短形式)。在一些实施方案中，透明质酸酶分子选自HYAL1、HYAL2或PH-20/SPAM1，或其变体(例如，其截短形式)。在一些实施方案中，截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或GPI附着位点的一部分。在一些实施方案中，透明质酸酶分子被糖基化，例如包含至少一种N-连接的聚糖。

在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含氨基酸序列：LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS(SEQ ID NO：6213)，或其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO：6213的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含：

(i)SEQ ID NO：6213的36-464的氨基酸序列；

(ii)PH20的36-481、36-482或36-483的氨基酸序列，其中PH20具有SEQ ID NO：6213所示的氨基酸序列；或者

(iii)与SEQ ID NO：6213所示的氨基酸序列的多肽或截短形式具有至少95％至100％序列同一性的氨基酸序列；或者

(iv)对SEQ ID NO：6213所示的氨基酸序列具有30、20、10、5或更少的氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含与SEQ ID NO：6213的氨基酸序列至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、100％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，透明质酸酶分子由与SEQ ID NO：6213的核苷酸序列至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％、100％)相同的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，透明质酸酶分子是PH20，例如rHuPH20。在一些实施方案中，透明质酸酶分子是HYAL1并包含以下氨基酸序列：FRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW(SEQID NO：6218)，或其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO：6218的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过5、10或10个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。

在一些实施方案中，玻尿酸降解酶，例如透明质酸酶分子，进一步包含聚合物，例如缀合至聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，玻尿酸降解酶是PEG化的PH20酶(PEGPH20)。在一些实施方案中，玻尿酸降解酶，例如透明质酸酶分子，进一步包含免疫球蛋白链恒定区(例如Fc区)，该免疫球蛋白链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更具体而言，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区(例如Fc区)与玻尿酸降解酶例如透明质酸酶分子连接，例如共价连接。在一些实施方案中，改变免疫球蛋白链恒定区(例如Fc区)，例如使其突变，以增加或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能。在一些实施方案中，玻尿酸降解酶，例如透明质酸酶分子形成二聚体。

在一些实施方案中，基质修饰部分包含玻尿酸合成例如HA合酶的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂包含针对HA合酶的有义或反义核酸分子或为小分子药物。在一些实施方案中，抑制剂是4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物(例如6，7-二羟基-4-甲基香豆素或5，7-二羟基-4-甲基香豆素)或来氟米特或其衍生物。

在一些实施方案中，基质修饰部分包含针对透明质酸的抗体分子。

在一些实施方案中，基质修饰部分包含胶原酶分子，例如哺乳动物胶原酶分子，或其变体(例如，片段)。在一些实施方案中，胶原酶分子是胶原酶分子IV，例如，包含以下氨基酸序列：

YNFFPRKPKWDKNQITYRIIGYTPDLDPETVDDAFARAFQVWSDVTPLRFSRIHDGEADIMINFGRWEHGDGYPFDGKDGLLAHAFAPGTGVGGDSHFDDDELWTLGEGQVVRVKYGNADGEYCKFPFLFNGKEYNSCTDTGRSDGFLWCSTTYNFEKUGKYGFCPHEALFTMGGNAEGQPCKFPFRFQGTSYDSCTTEGRTDGYRWCGTTEDYDRDKKYGFCPETAMSTVGGNSEGAPCVFPFTFLGNKYESCTSAGRSDGKMWCATTANYDDDRKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHAMGLEHSQDPGALMAPIYTYTKNFRLSQDDIKGIQELYGASPDIDLGTGPTPTLGPVTPEICKQDIVFDGIAQIRGEIFFFKDRFIWRTVTPRDKPMGPLLVATFWPELPEKIDAVYEAPQEEKAVFFAGNEYWIYSASTLERGYPKPLTSLGLPPDVQRVDAAFNWSKNKKTYIFAGDKFWRYNEVKKKMDPGFPKLIADAWNAIPDNLDAVVDLQGGGHSYFFKGAYYLKLENQSLKSVKFGSIKSDWLGC(SEQ ID NO：6219)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO：6219的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过5、10或15个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。

肿瘤靶向部分

在一些实施方案中，本文公开的多特异性和/或多功能分子包含肿瘤靶向部分。在一些实施方案中，所述肿瘤靶向部分靶向(例如结合至)选自以下的肿瘤抗原：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。在实施方案中，所述肿瘤靶向部分靶向(例如结合至)G6B。

G6B是指MPIG6B，也称为巨核细胞和血小板抑制受体G6b或C6orf25。Swiss-Prot登录号O95866提供了示例性的人G6B氨基酸序列。在一些实施方案中，G6B或G6B分子为天然存在的G6B或其功能变体或片段。

CD34是指造血祖细胞抗原CD34。Swiss-Prot登录号P28906提供了示例性的人CD34氨基酸序列。在一些实施方案中，CD34或CD34分子是天然存在的CD34或其功能变体或片段。

CD41是指ITGA2B，也称为整合蛋白α-IIb。Swiss-Prot登录号P08514提供了示例性的人CD41氨基酸序列。在一些实施方案中，CD41或CD41分子是天然存在的CD41或其功能变体或片段。

P-选择蛋白是指SELP，也称为CD62P、GMP-140或LECAM3。Swiss-Prot登录号P16109提供了示例性的人P-选择蛋白氨基酸序列。在一些实施方案中，P-选择蛋白或P-选择蛋白分子是天然存在的P-选择蛋白或其功能变体或片段。

Clec2是指CLEC1B，也称为C型凝集素结构域家族1成员B。Swiss-Prot登录号Q9P126提供示例性的人Clec2氨基酸序列。在一些实施方案中，Clec2或Clec2分子是天然存在的Clec2或其功能变体或片段。

cKIT是指肥大/干细胞生长因子(mast/stem cell growth factor)受体试剂盒，也称为CD117。Swiss-Prot登录号P10721提供了示例性的人cKIT氨基酸序列。在一些实施方案中，cKIT或cKIT分子是天然存在的cKIT或其功能变体或片段。

FLT3是指受体型酪氨酸蛋白激酶FLT3，也称为CD135。Swiss-Prot登录号P36888提供了示例性的人FLT3氨基酸序列。在一些实施方案中，FLT3或FLT3分子是天然存在的FLT3或其功能变体或片段。

MPL是指血小板生成素受体，也称为CD110。Swiss-Prot登录号P40238提供了示例性的人MPL氨基酸序列。在一些实施方案中，MPL或MPL分子是天然存在的MPL或其功能变体或片段。

ITGB3是指整合蛋白β-3，也称为CD61。Swiss-Prot登录号P05106提供了示例性的人ITGB3氨基酸序列。在一些实施方案中，ITGB3或ITGB3分子是天然存在的ITGB3或其功能变体或片段。

ITGB2是指整合蛋白β-2，也称为CD18。Swiss-Prot登录号P05107提供了示例性的人ITGB2氨基酸序列。在一些实施方案中，ITGB2或ITGB2分子是天然存在的ITGB2或其功能变体或片段。

GP5是指血小板糖蛋白V，也称为CD42d。Swiss-Prot登录号P40197提供了示例性的人GP5氨基酸序列。在一些实施方案中，GP5或GP5分子是天然存在的GP5或其功能变体或片段。

GP6是指血小板糖蛋白VI。Swiss-Prot登录号Q9HCN6提供了示例性的人GP6氨基酸序列。在一些实施方案中，GP6或GP6分子是天然存在的GP6或其功能变体或片段。

GP9是指血小板糖蛋白IX，也称为CD42a。Swiss-Prot登录号P14770提供了示例性的人GP9氨基酸序列。在一些实施方案中，GP9或GP9分子是天然存在的GP9或其功能变体或片段。

GP1BA是指血小板糖蛋白Ibα链，也称为CD42b。Swiss-Prot登录号P07359提供了示例性的人GP1BA氨基酸序列。在一些实施方案中，GP1BA或GP1BA分子是天然存在的GP1BA或其功能变体或片段。

DSC2指桥粒糖蛋白-2，也称为钙粘蛋白家族成员2。Swiss-Prot登录号Q02487提供示例性的人DSC2氨基酸序列。在一些实施方案中，DSC2或DSC2分子是天然存在的DSC2或其功能变体或片段。

FCGR2A是指Fc-γ-RIIa，也称为CD32。Swiss-Prot登录号P12318提供了示例性的人FCGR2A氨基酸序列。在一些实施方案中，FCGR2A或FCGR2A分子是天然存在的FCGR2A或其功能变体或片段。

TNFRSF10A是指肿瘤坏死因子受体超家族成员10A，也称为死亡受体4、TNF相关凋亡诱导配体受体1、TRAIL-R1或CD261。Swiss-Prot登录号O00220提供了示例性的人TNFRSF10A氨基酸序列。在一些实施方案中，TNFRSF10A或TNFRSF10A分子是天然存在的TNFRSF10A或其功能变体或片段。

TNFRSF10B是指肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，也称为死亡受体5、TNF相关凋亡诱导配体受体2、TRAIL-R2或CD262。Swiss-Prot登录号O14763提供了示例性的人TNFRSF10B氨基酸序列。在一些实施方案中，TNFRSF10B或TNFRSF10B分子是天然存在的TNFRSF10B或其功能变体或片段。

TM4SFl是指跨膜4L6家族成员1。Swiss-Prot登录号P30408提供了示例性的人TM4SF1氨基酸序列。在一些实施方案中，TM4SF1或TM4SF1分子是天然存在的TM4SF1或其功能变体或片段。

在一些实施方案中，多特异性和/或多功能分子包含一个或多个另外的肿瘤靶向部分。在实施方案中，所述一个或多个另外的肿瘤靶向部分靶向(例如结合至)与第一肿瘤靶向部分所靶向的相同肿瘤抗原。在实施方案中，所述一个或多个另外的肿瘤靶向部分靶向(例如结合至)与第一肿瘤靶向部分所靶向的不同肿瘤抗原。在一些实施方案中，多特异性和/或多功能分子包含多个靶向同一细胞(例如，肿瘤细胞)上存在的不同肿瘤抗原的肿瘤靶向部分。在一些实施方案中，多特异性和/或多功能分子包含多个靶向不同细胞(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的肿瘤细胞)上存在的不同肿瘤抗原的肿瘤靶向部分。在实施方案中，各个肿瘤抗原选自：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

在实施方案中，多特异性和/或多功能分子包含第一肿瘤靶向部分(例如，靶向第一肿瘤抗原)和第二肿瘤靶向部分(例如，靶向第二肿瘤抗原)。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原和第二肿瘤抗原存在于相同肿瘤细胞上。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原和第三肿瘤抗原存在于相同肿瘤细胞上。在一些实施方案中，第二肿瘤抗原和第三肿瘤抗原存在于相同肿瘤细胞上。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原、第二肿瘤抗原和第三肿瘤抗原存在于相同肿瘤细胞上。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原和第二肿瘤抗原存在于不同肿瘤细胞上。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原和第三肿瘤抗原存在于不同肿瘤细胞上。在一些实施方案中，第二肿瘤抗原和第三肿瘤抗原存在于不同肿瘤细胞上。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原、第二肿瘤抗原和第三肿瘤抗原存在于不同肿瘤细胞上。

在一些实施方案中，与非肿瘤细胞相比，第一肿瘤抗原、第二肿瘤抗原和第三肿瘤抗原在肿瘤细胞(例如骨髓增殖性肿瘤细胞)中具有更高的表达。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原、第二肿瘤抗原和第三肿瘤抗原在肿瘤细胞(例如骨髓增殖性肿瘤细胞)中的表达是第一肿瘤抗原、第二肿瘤抗原和第三肿瘤抗原在非肿瘤细胞中的表达的至少1.5、2、4、6、8或10倍高。在一些实施方案中，与非肿瘤细胞相比，多功能分子优先结合至肿瘤细胞，例如骨髓增殖性肿瘤细胞。在一些实施方案中，多功能分子与肿瘤细胞(例如骨髓增殖性肿瘤细胞)的结合为多功能分子与非肿瘤细胞的结合的超过10、20、30、40、50倍。在一些实施方案中，第一和第二肿瘤靶向部分对肿瘤细胞(例如骨髓增殖性肿瘤细胞)的亲和力(例如，结合亲和力)大于仅具有第一肿瘤靶向部分或第二肿瘤靶向部分之一的类似多功能分子的亲和力。在一些实施方案中，第一和第二肿瘤靶向部分对肿瘤细胞(例如骨髓增殖性肿瘤细胞)的亲和力(例如，结合亲和力)为仅具有第一肿瘤靶向部分或第二肿瘤靶向部分之一的类似多功能分子的亲和力的至少2、5、10、20、30、40、50、75或100倍。

在一些实施方案中，第一、第二和第三肿瘤靶向部分对肿瘤细胞(例如骨髓增殖性肿瘤细胞)的亲和力(例如，结合亲和力)大于仅具有第一肿瘤靶向部分、第二肿瘤靶向部分或第三肿瘤靶向部分之一的类似多功能分子的亲和力，或仅具有第一肿瘤靶向部分、第二肿瘤靶向部分或第三肿瘤靶向部分之二的类似多功能分子的亲和力。在一些实施方案中，第一、第二和第三肿瘤靶向部分对肿瘤细胞(例如骨髓增殖性肿瘤细胞)的亲和力(例如，结合亲和力)为仅具有第一肿瘤靶向部分、第二肿瘤靶向部分或第三肿瘤靶向部分之一的类似多功能分子的亲和力，或仅具有第一肿瘤靶向部分、第二肿瘤靶向部分或第三肿瘤靶向部分之二的类似多功能分子的亲和力的至少2、5、10、20、30、40、50、75或100倍。

在一些实施方案中，第一肿瘤靶向部分和第二肿瘤靶向部分对第一和第二肿瘤抗原的亲和力(例如，结合亲和力)等于或大于(iii)、(iv)或(v)单独地或作为多功能分子的一部分对其相应结合成员的亲和力。在一些实施方案中，第一肿瘤靶向部分和第二肿瘤靶向部分对第一和第二肿瘤抗原的亲和力(例如，结合亲和力)为(iii)、(iv)或(v)单独地或作为多功能分子的一部分对其相应结合成员的亲和力的至少2、5、10、20、30、40、50、75或100倍。

在一些实施方案中，第一肿瘤靶向部分、第二肿瘤靶向部分和第三肿瘤靶向部分对第一、第二和第三肿瘤抗原的亲和力(例如，结合亲和力)等于或大于(iii)、(iv)或(v)单独地或作为多功能分子的一部分对其相应结合成员的亲和力。在一些实施方案中，第一肿瘤靶向部分、第二肿瘤靶向部分和第三肿瘤靶向部分对第一、第二和第三肿瘤抗原的亲和力(例如，结合亲和力)为(iii)、(iv)或(v)单独地或作为多功能分子的一部分对其相应结合成员的亲和力的至少2、5、10、20、30、40、50、75或100倍。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为CD41，第三肿瘤抗原为G6B。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为CD41，第三肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为G6B，第三肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为G6B，第三肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为CD41，第三肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为G6B，第三肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为G6B，第三肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白，第三肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白，第三肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白，第三肿瘤抗原为Clec2。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD34，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CD41，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为G6B，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为P-选择蛋白，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为Clec2，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为CKIT，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FLT3，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为MPL，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB3，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为ITGB2，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP5，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP6，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP9，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为GP1BA，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为DSC2，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为FCGR2A，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF 10A，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10A，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TNFRSF10B，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

在上述方面的一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为G6B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为Clec2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为CKIT。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为ITGB3。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为ITGB2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为GP5。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为GP6。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为GP9。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为GP1BA。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为TNFRSF10A。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为TNFRSF10B。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原为TM4SF1，第二肿瘤抗原为TM4SF1。

靶向肿瘤抗原的抗体分子

在一些实施方案中，肿瘤靶向部分包含表A中所示的CDR、框架区或可变区序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

表A.能够结合至示例性靶分子的示例性抗体的序列

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为CD34。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2001(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)VH，SEQ ID NO：2001(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(iii)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2002(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(iv)VL，SEQ ID NO：2002(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，其中第一、第二或第三肿瘤抗原为CD41。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2007(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)VH，SEQ ID NO：2007(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(iii)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2008(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(iv)VL，SEQ ID NO：2008(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为P-选择蛋白。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2013(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)VH，SEQ ID NO：2013(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(iii)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2014(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(iv)VL，SEQ ID NO：2014(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为cKIT。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2003(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)VH，SEQ ID NO：2003(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(iii)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2004(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(iv)VL，SEQ ID NO：2004(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为FLT3。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2005(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)VH，SEQ ID NO：2005(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(iii)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2006(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(iv)VL，SEQ ID NO：2006(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为MPL。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2009(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2009(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2010(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2010(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；或

(ii)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2011(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2011(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2012(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2012(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为DSC2。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2015(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2015(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2016(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2016(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；或

(ii)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2017(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2017(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2018(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2018(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为FCGR2A。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2019(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2019(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2020(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2020(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；

(ii)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2021(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2021(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2022(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2022(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；或

(iii)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2023(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2023(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2024(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2024(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为TNFRSF10A或TNFRSF10B.在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2025(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2025(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2026(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2026(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；或

(ii)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2027(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2027(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2028(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2028(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；

(iii)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2029(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2029(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2030(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2030(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；

(iv)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2031(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2031(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2032(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2032(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)；或(v)(a)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2033(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(b)VH，SEQ ID NO：2033(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(c)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2034(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(d)VL，SEQ ID NO：2034(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤抗原为TM4SF1。在一些实施方案中，第一、第二或第三肿瘤靶向部分包含：

(i)HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，来自SEQ ID NO：2035(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)VH，SEQ ID NO：2035(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)，

(iii)LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，来自SEQ ID NO：2036(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(iv)VL，SEQ ID NO：2036(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

示例性抗-CD34抗体序列

在一个方面，本文提供了包含肿瘤靶向部分的多特异性或多功能分子，所述肿瘤靶向部分包含CD34-靶向部分。在另一个方面，本文提供了抗-CD34抗体分子(例如，单克隆抗-CD34抗体分子)。

在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含表20或表21中公开的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含表20或表21中公开的CDR、框架区或可变区序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列)。

在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含含有重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6239(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)的VH、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：6241(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6243(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含含有VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6239的VH、VHCDR2氨基酸序列SEQ IDNO：6241、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6243。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含含有轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO：6245(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)的VL、VLCDR2氨基酸序列SEQ IDNO：1236(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO：6246(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含含有VLCDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6245的VL、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO：1236、和VLCDR3氨基酸序列SEQ IDNO：6246。

在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79、6225、6227或6229，或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231、6233、6235或6237，或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225；和VL，其包含氨基酸序列SEQID NO：6231。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6231。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：6233(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6235。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225；和VL，其包含氨基酸序列SEQID NO：6235。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6235。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6235(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6235。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6237。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6225；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6237。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：6237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6227；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6237。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6237(或与其具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6229；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6237。

在一些实施方案中，CD34-靶向部分或抗-CD34抗体分子包含VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：79；和VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6233。

表20.抗-CD34抗体的示例性可变区序列

表21.抗-CD34抗体的示例性CDR

接头

本文公开的多特异性或多功能分子可以进一步包括接头，例如，在以下一种或多种之间的接头：抗原结合结构域和细胞因子分子、抗原结合结构域和免疫细胞衔接物、抗原结合结构域和基质修饰部分、细胞因子分子和免疫细胞衔接物、细胞因子分子和基质修饰部分、免疫细胞衔接物和基质修饰部分、抗原结合结构域和免疫球蛋白链恒定区、细胞因子分子和免疫球蛋白链恒定区、免疫细胞衔接物和免疫球蛋白链恒定区，或基质修饰部分和免疫球蛋白链恒定区。在实施方案中，接头选自：可切割的接头、不可切割的接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头或非螺旋接头，或其组合。

在一个实施方案中，多特异性分子可包括一个、两个、三个或四个接头，例如肽接头。在一个实施方案中，肽接头包括Gly和Ser。在一些实施方案中，肽接头选自GGGGS(SEQID NO：6214)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6215)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6216)；和DVPSGPGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6217)。在一些实施方案中，肽接头是接头的A(EAAAK)nA(SEQ ID NO：6413)家族(例如，如Protein Eng.(2001)14(8)：529-532)所述)。这些是刚性螺旋接头，其中n范围为2-5。在一些实施方案中，肽接头选自AEAAAKEAAAKAAA(SEQ ID NO：6220)；AEAAAKEAAAKEAAAKAAA(SEQ ID NO：6221)；AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA(SEQ ID NO：77)；和AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA(SEQ ID NO：78)。

核酸

还公开了编码前述多特异性或多功能分子的核酸。

在某些实施方案中，本发明的特征在于核酸，其包含编码如本文所述的抗体分子的重链和轻链可变区和CDR或高变环的核苷酸序列。例如，本发明的特征在于分别编码选自本文公开的一种或多种抗体分子的抗体分子的重链和轻链可变区的第一核酸和第二核酸。核酸可包含如本文表中所列的核苷酸序列，或与其基本相同(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列)或与本文表中所示的序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列。

在某些实施方案中，核酸可包含编码来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，所述重链可变区具有如本文表中所列的氨基酸序列或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或具有一个或多个置换，例如保守置换的序列)。在其他实施方案中，核酸可包含编码来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，所述轻链可变区具有如本文表中所列的氨基酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或具有一个或多个置换，例如保守置换)的序列。在又一个实施方案中，核酸可以包含编码来自重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR或高变环的核苷酸序列，所述重链可变区和轻链可变区具有本文表中所列的氨基酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或具有一个或多个置换，例如保守置换的序列)。

在某些实施方案中，核酸可以包含编码来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，所述重链可变区具有如本文表中所列的核苷酸序列，与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或能够在本文描述的严格条件下杂交的序列)。在另一个实施方案中，核酸可以包含编码来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，所述轻链可变区具有如本文表中所列的核苷酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或能够在本文描述的严格条件下杂交的序列)。在又一个实施方案中，核酸可以包含编码来自重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR或高变环的核苷酸序列，所述重链可变区和轻链可变区具有本文表中所列的核苷酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或能够在本文描述的严格条件下杂交的序列)。

在某些实施方案中，核酸可以包含编码本文公开的细胞因子分子、免疫细胞衔接物或基质修饰部分的核苷酸序列。

在另一方面，本申请的特征在于含有本文所述核酸的宿主细胞和载体。核酸可以存在于同一宿主细胞或不同的宿主细胞中的单个载体或不同载体中，如下文更详细地描述。

载体

本文还提供了载体，其包含编码本文所述的多特异性或多功能分子的核苷酸序列。在一个实施方案中，载体包含编码本文所述的多特异性或多功能分子的核苷酸。在一个实施方案中，载体包含本文所述的核苷酸序列。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。

可以采用许多载体系统。例如，一类载体利用来自动物病毒的DNA元件，所述动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(Rous肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另一类载体利用来自RNA病毒(例如西门利克森林病毒、东方马脑炎病毒和黄病毒)的RNA元件。

另外，可以通过引入一种或多种允许选择转染的宿主细胞的标记来选择使DNA稳定整合到其染色体中的细胞。例如，标记可以向营养缺陷宿主提供质子移变、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的抗性等。可选择的标记基因可以直接连接到要表达的DNA序列，或可以通过共转化引入相同的细胞。mRNA的最佳合成可能还需要其他元件。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

一旦准备好用于表达的表达载体或包含DNA序列的构建体，就可以将表达载体转染或引入合适的宿主细胞中。可以采用多种技术来实现这一点，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，使细胞在培养基中生长并针对适当的活性筛选。

用于培养所得转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的，并且基于本说明书，可以根据所使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞进行改变或优化。

细胞

另一方面，本申请的特征在于含有本文所述核酸的宿主细胞和载体。核酸可以存在于同一宿主细胞或不同宿主细胞中的单个载体或不同载体中。宿主细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞，例如，大肠杆菌。例如，哺乳动物细胞可以是培养的细胞或细胞系。示例性的哺乳动物细胞包括淋巴细胞细胞系(例如，NSO)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS细胞、卵母细胞和来自转基因动物的细胞，例如，乳腺上皮细胞。

本发明还提供了包含编码本文所述抗体分子的核酸的宿主细胞。

在一个实施方案中，对宿主细胞进行遗传工程化以包含编码抗体分子的核酸。

在一个实施方案中，通过使用表达盒对宿主细胞进行遗传工程化。短语“表达盒”是指核苷酸序列，其能够影响基因在与此类序列相容的宿主中的表达。这样的盒可以包括启动子，具有或没有内含子的开放阅读框以及终止信号。也可以使用对影响表达所必需或有帮助的其他因素，例如可诱导的启动子。

本发明还提供了包含本文所述载体的宿主细胞。

该细胞可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。

用途和联合疗法

本文所述的方法包括通过使用本文所述的多特异性分子(例如，使用本文所述的药物组合物)来治疗受试者中的癌症。还提供了减轻或缓解受试者中的癌症的症状的方法，以及抑制癌症生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在实施方案中，本文所述的方法在施用本文所述的多特异性分子或本文所述的药物组合物的受试者中减小肿瘤的大小和/或减少癌细胞的数量。

在实施方案中，癌症是血液学癌症。在实施方案中，血液学癌症是白血病或淋巴瘤。如本文所用，“血液学癌症”是指造血或淋巴组织的肿瘤，例如，影响血液、骨髓或淋巴结的肿瘤。示例性的血液学恶性肿瘤包括但不限于白血病(例如，急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病、急性单核细胞白血病(AMoL)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、少年骨髓单核细胞白血病(JMML)或巨粒淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(例如艾滋病相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(例如经典霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤)、蕈样真菌病、非霍奇金淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或T细胞非霍奇金淋巴瘤(蕈样真菌病、退行性大细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞性淋巴瘤))、原发性中枢神经系统淋巴瘤、Sézary综合征、

巨球蛋白血症)、慢性骨髓增殖性肿瘤、郎格汉斯细胞组织细胞增多症、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、骨髓增殖异常综合征或骨髓增殖异常/骨髓增殖性赘生物。

在实施方案中，癌症是骨髓增殖性赘生物，例如原发性或特发性骨髓纤维化(ML)、原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)或慢性髓细胞性白血病(CML)。在实施方案中，癌症是骨髓纤维化。在实施方案中，受试者患有骨髓纤维化。在实施方案中，受试者具有钙网蛋白突变，例如本文公开的钙网蛋白突变。在实施方案中，受试者不具有JAK2-V617L突变。在实施方案中，受试者具有JAK2-V617L突变。在实施方案中，受试者具有MPL突变。在实施方案中，受试者不具有MPL突变。

在实施方案中，癌症是实体癌。示例性的实体癌包括但不限于卵巢癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌、肛门区域癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、卡波济氏肉瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、子宫颈鳞状细胞癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、软组织肉瘤、尿道癌、外阴癌、阴茎癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、脊柱轴肿瘤、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、所述癌症的转移性病变，或其组合。

在实施方案中，多特异性或多功能分子(或药物组合物)以适合待治疗或预防的疾病的方式施用。施用的量和频率将取决于患者的病况、患者疾病的类型和严重性等因素。适当的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医师可以通过考虑肿瘤大小的个体差异、感染或转移的程度、受试者的年龄、体重和病况来确定要施用的药物组合物(或多特异性或多功能分子)的精确量。在实施方案中，本文描述的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量施用，例如10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有整数值。在实施方案中，本文所述的药物组合物可以以这些剂量多次施用。在实施方案中，本文所述的药物组合物可以使用在免疫疗法中所述的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676，1988)。

在实施方案中，多特异性或多功能分子或药物组合物经肠胃外施用予受试者。在实施方案中，将细胞经静脉内、皮下、肿瘤内、结节内、肌内、皮内或腹膜内施用给受试者。在实施方案中，将细胞直接施用(例如注射)到肿瘤或淋巴结中。在实施方案中，将细胞以输注(例如，如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676，1988)或静脉推注的形式施用。在实施方案中，细胞以可注射的储库型长效制剂形式施用。

在实施方案中，受试者是哺乳动物。在实施方案中，受试者是人、猴、猪、狗、猫、牛、绵羊、山羊、兔、大鼠或小鼠。在实施方案中，受试者是人。在实施方案中，受试者是儿科受试者，例如小于18岁，例如小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或更小。在实施方案中，受试者是成年人，例如至少18岁，例如至少19、20、21、22、23、24、25、25-30、30-35、35-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90岁。

联合疗法

本文公开的多特异性或多功能分子可与第二治疗剂或过程组合使用。

在实施方案中，多特异性或多功能分子和第二治疗剂或过程在受试者被诊断患有癌症之后(例如在癌症从受试者消除之前)施用/进行。在实施方案中，多特异性或多功能分子和第二治疗剂或过程同时或并行地施用/进行。例如，当第二治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍在进行，例如，治疗的施用存在重叠。在其他实施方案中，多特异性或多功能分子和第二治疗剂或过程顺序地施用/进行。例如，一种治疗的递送停止，然后开始其他治疗的递送。

在实施方案中，联合疗法可以比单独使用任一药剂的单一疗法产生更有效的治疗。在实施方案中，第一治疗和第二治疗的联合比单独的第一治疗或第二治疗更有效(例如，导致症状和/或癌细胞的更大减少)。在实施方案中，与作为单一疗法施用时通常达到相似效果所需的第一或第二治疗剂量相比，联合疗法允许使用更低剂量的第一治疗或第二治疗。在实施方案中，联合疗法具有部分加和作用、完全加和作用或大于加和作用。

在一个实施方案中，多特异性或多功能分子与疗法、例如癌症疗法(例如，一种或多种抗癌剂、免疫疗法、光动力疗法(PDT)、手术和/或放射疗法)联合施用。本文中，术语“化学疗法”、“化疗剂”和“抗癌剂”可互换使用。多特异性或多功能分子的施用和疗法(例如癌症疗法)可为顺序的(有或没有重叠)或同时的。在疗法(例如癌症疗法)过程中，多特异性或多功能分子的施用可以是连续的或间断的。本文所述的某些疗法可用于治疗癌症和非癌性疾病。例如，使用本文描述的方法和组合物可以在癌性和非癌性病况(例如，结核病)中增强PDT功效(综述于例如Agostinis，P.等人(2011)CA Cancer J.Clin.61：250-281)。

抗癌疗法

在其他实施方案中，多特异性或多功能分子与低分子量或小分子量化学治疗剂联合施用。示例性的低分子量或小分子量化学治疗剂包括但不限于：l3-顺式-维A酸(异维A酸，

)、2-CdA(2-氯脱氧腺苷，克拉屈滨，LEUSTATIN^TM)、5-阿扎胞苷(阿扎胞苷，

)、5-氟尿嘧啶(5-FU，氟尿嘧啶，

)、6-巯嘌呤(6-MP，巯嘌呤，

)、6-TG(6-硫鸟嘌呤，硫鸟嘌呤，THIOGUANINE

)、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)(紫杉醇蛋白结合型)、放线菌素D(放线菌素，

)、阿利维A酸

全反式维A酸(ATRA，维A酸，

)、六甲蜜胺(六甲基三聚氰胺，HMM，

)、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤，甲氨蝶呤钠，MTX，TREXALL^TM，

)、氨磷汀

阿糖胞嘧啶(Ara-C，阿糖胞苷，

)、三氧化二砷

天冬酰胺酶(欧文氏菌L-天冬酰胺酶，L-天冬酰胺酶，

)、BCNU(卡莫司汀，

)、苯达莫司汀

贝沙罗汀

博来霉素

白消安

甲酰四氢叶酸钙(嗜橙菌因子，亚叶酸，甲酰四氢叶酸)、喜树碱-11(CPT-11，伊立替康，

)、卡培他滨

卡铂

卡莫司汀wafer(带有卡莫司汀植入物的prolifeprospan 20，

wafer)、CCI-779(坦罗莫司，

)、CCNU(洛莫司汀，CeeNU)、CDDP(顺铂，

)、苯丁酸氮芥(留可然)、环磷酰胺

达卡巴嗪(DIC，DTIC，咪唑羧酰胺，

)、道诺霉素(柔红霉素，盐酸柔红霉素，盐酸红比霉素，

)、地西他滨

右雷佐生

DHAD(米托蒽醌，

)、多西紫杉醇

多柔比星

表柔比星(ELLENCE^TM)、雌莫司汀

依托泊苷(VP-16，依托泊苷磷酸盐，

)、氟尿苷

氟达拉滨

氟尿嘧啶(霜剂)(CARAC^TM，

)、吉西他滨

羟基脲(

DROXIA^TM，MYLOCEL^TM)、伊达比星

异环磷酰胺

伊沙匹隆(IXEMPRA^TM)、LCR(醛基长春碱，长春新碱，VCR，

VINCASAR

)、L-PAM(L-溶赘瘤素，美法仑，苯丙氨酸氮芥，

)、二氯甲基二乙胺(盐酸二氯甲基二乙胺，氮芥，氮芥子气(nitrogenmustard)，

)、美司钠(MESNEX^TM)、丝裂霉素(丝裂霉素-C，MTC，

)、奈拉滨

奥沙利铂(ELOXATIN^TM)、紫杉醇(

ONXAL^TM)、培门冬酶(PEG-L-天冬酰胺酶，

)、培美曲塞(PEMETREXED)

喷司他丁

丙卡巴肼

链脲菌素

替莫唑胺

替尼泊苷(VM-26，

)、TESPA(硫代磷酰胺，塞替派，TSPA，

)、托泊替康

长春碱(硫酸长春碱，长春花碱，VLB，

)、长春瑞滨(酒石酸长春瑞滨，

)和伏立诺他

在其他实施方案中，多特异性或多功能分子与生物制剂联合施用。可用于治疗癌症的生物制剂是本领域已知的，并且本发明的结合分子可以例如与此类已知的生物制剂联合施用。例如，FDA已批准以下用于治疗乳腺癌的生物制剂：

(曲妥珠单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，Calif.；在HER2阳性乳腺癌中具有抗肿瘤活性的人源化单克隆抗体)；

(氟维司群，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP，Wilmington，Del.；用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；

(阿那曲唑，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；阻断芳香酶(产生雌激素所需的酶)的非甾体芳香酶抑制剂)；

(依西美坦，Pfizer Inc.，New York，N.Y.；用于治疗乳腺癌的不可逆的甾族芳香酶灭活剂)；

(来曲唑，Novartis Pharmaceuticals，EastHanover，N.J.；FDA批准用于治疗乳腺癌的非甾体芳香酶抑制剂)；和

(他莫昔芬，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；FDA批准用于治疗乳腺癌的非甾体抗雌激素药)。可以与本发明的结合分子联合的其他生物制剂包括：

(贝伐单抗，Genentech Inc.；第一种经FDA批准的旨在抑制血管生成的疗法)；和

(替伊莫单抗，Biogen Idec，Cambridge，Mass.；目前批准用于治疗B细胞淋巴瘤的放射性标记的单克隆抗体)。

此外，FDA已批准以下用于治疗结直肠癌的生物制剂：

(西妥昔单抗，ImClone Systems Inc.，New York，N.Y.和Bristol-MyersSquibb，New York，N.Y.；是针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；

(甲磺酸伊马替尼；一种蛋白激酶抑制剂)；和

(盐酸左旋咪唑，JanssenPharmaceutica Products，LP，Titusville，N.J.；一种免疫调节剂，1990年被FDA批准在Dukes C期结肠癌患者手术切除后，与5-氟尿嘧啶联合用作辅助治疗)。

对于肺癌的治疗，示例性的生物制剂包括

(盐酸厄洛替尼，OSIPharmaceuticals Inc.，Melville，N.Y.；设计为靶向人表皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。

对于多发性骨髓瘤的治疗，示例性的生物制剂包括

万珂(硼替佐米，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge Mass.；一种蛋白酶体抑制剂)。其他生物制剂包括

(沙利度胺，Clegene Corporation，Warren，N.J.；一种免疫调节剂，似乎具有多种作用，包括抑制骨髓瘤细胞的生长和存活以及抗血管生成的能力)。

另外的示例性癌症治疗性抗体包括但不限于3F8，阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、培化阿珠单抗(alacizumab pegol)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)

喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)

马安那莫单抗(anatumomabmafenatox)、安芦珠单抗(anrukinzumab)(IMA-638)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)

巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)

、贝利木单抗(belimumab)

贝索单抗(besilesomab)

贝伐珠单抗(bevacizumab)

莫比伐单抗(bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗维度丁(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗美登素(cantuzumab mertansine)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)

卡妥索单抗(catumaxomab)

CC49、西妥昔单抗(cetuximab)(C225，

)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(cixutumumab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumabtetraxetan)、可那木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、地舒单抗(denosumab)

地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依屈洛单抗(edrecolomab)

埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)

埃达珠单抗(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)

吉瑞昔单抗(girentuximab)、glembatumumab vedotin、伊莫单抗(ibritumomab)(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，

)、伊戈伏单抗(igovomab)

英妥木单抗(intetumumab)、伊珠单抗奥加米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)

、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)

巯诺莫单抗(nofetumomab merpentan)

、奥法木单抗(ofatumumab)

奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)

帕木单抗(panitumumab)

培妥莫单抗(pemtumomab)

培妥珠单抗(pertuzumab)

平妥莫单抗(pintumomab)、普立木单抗(pritumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷珠单抗(ranibizumab)

利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)

罗妥木单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)

帕他莫单抗(taplitumomab paptox)、替妥莫单抗(tenatumomab)、TGN1412、替昔木单抗(Ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗(tigatuzumab)、TNX-650、托西莫单抗(tositumomab)

曲妥珠单抗(trastuzumab)

曲美木单抗、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、维妥珠单抗(veltuzumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥木单抗(votumumab)

扎芦木单抗(zalutumumab)

和扎木单抗(zanolimumab)

在其他实施方案中，多特异性或多功能分子与病毒癌症治疗剂联合施用。示例性的病毒癌症治疗剂包括但不限于牛痘病毒(vvDD-CDSR)、表达癌胚抗原的麻疹病毒、重组牛痘病毒(TK-缺失加GM-CSF)、塞内卡谷病毒001、新城病毒、柯萨奇A21病毒、GL-ONC1、表达EBNA1 C末端/LMP2嵌合蛋白的重组修饰牛痘安卡拉疫苗、表达癌胚抗原的麻疹病毒、G207溶瘤病毒、表达p53的修饰牛痘病毒安卡拉疫苗、OncoVEX GM-CSF修饰的单纯疱疹1病毒、鸡痘病毒疫苗载体、重组牛痘前列腺特异性抗原疫苗、人乳头瘤病毒16/18L1病毒样颗粒/AS04疫苗、MVA-EBNA1/LMP2注射疫苗、四价HPV疫苗、四价人乳头瘤病毒(6、11、16、18型)重组疫苗

重组鸡痘-CEA(6D)/TRICOM疫苗、重组牛痘-CEA(6D)-TRICOM疫苗、重组修饰牛痘安卡拉-5T4疫苗、重组鸡痘-TRICOM疫苗、溶瘤性疱疹病毒NV1020、HPV L1VLP疫苗V504、人乳头瘤病毒二价(16和18型)疫苗

单纯疱疹病毒HF10、Ad5CMV-p53基因、重组牛痘DF3/MUC1疫苗、重组牛痘-MUC-1疫苗、重组牛痘-TRICOM疫苗、ALVAC MART-1疫苗、表达人前脑啡肽原(NP2)的复制缺陷型单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体、野生型呼肠孤病毒、呼肠孤病毒3 Dearing型

溶瘤病毒HSV1716、基于重组修饰牛痘安卡拉(MVA)的编码爱泼斯坦-巴尔病毒靶抗原的疫苗、重组鸡痘-前列腺特异性疫苗抗原疫苗、重组牛痘前列腺特异性抗原疫苗、重组牛痘B7.1疫苗、rAd-p53基因、Ad5-δ24RGD、HPV疫苗580299、JX-594(胸苷激酶缺失的牛痘病毒加GM-CSF)、HPV-16/18 L1/AS04、鸡痘病毒疫苗载体、牛痘酪氨酸酶疫苗、MEDI-517HPV-16/18 VLP AS04疫苗、含有单纯疱疹病毒的胸苷激酶的腺病毒载体TK99UN、HspE7、FP253/氟达拉滨、ALVAC(2)黑色素瘤多抗原治疗疫苗、ALVAC-hB7.1、金丝雀痘-hIL-12黑色素瘤疫苗、Ad-REIC/Dkk-3、rAd-IFNSCH 721015、TIL-Ad-INFg、Ad-ISF35和柯萨奇病毒A21(CVA21，

)。

在其他实施方案中，多特异性或多功能分子与纳米药物联合施用。示例性的癌症纳米药物包括但不限于

(紫杉醇结合的白蛋白纳米颗粒)、CRLX101(CPT与线性环糊精系聚合物缀合)、CRLX288(将多西紫杉醇与可生物降解的聚合物聚(乳酸-共-乙醇酸)缀合)、阿糖胞苷脂质体(脂质体Ara-C，DEPOCYT^TM)、柔红霉素脂质体

多柔比星脂质体

胶囊化的柔红霉素柠檬酸盐脂质体

和PEG抗VEGF适体

在一些实施方案中，多特异性或多功能分子与紫杉醇或紫杉醇制剂，例如

结合蛋白质的紫杉醇(例如

))联合施用。示例性的紫杉醇制剂包括但不限于结合纳米颗粒白蛋白的紫杉醇(由Abraxis Bioscience销售的

)、二十二碳六烯酸结合的紫杉醇(DHA-紫杉醇，Taxoprexin，由Protarga销售)、聚谷氨酸盐结合的紫杉醇(PG-紫杉醇，聚谷氨酸紫杉醇，CT-2103，XYOTAX，由CellTherapeutic销售)、肿瘤激活的前药(TAP)、ANG105(与紫杉醇的三个分子结合的Angiopep-2，由ImmunoGen销售)、紫杉醇-EC-1(与识别erbB 2的肽EC-1结合的紫杉醇；参见Li等人，Biopolymers(2007)87：225-230)和葡萄糖缀合的紫杉醇(例如2’-紫杉醇甲基2-吡喃葡萄糖基琥珀酸酯，参见Liu等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(2007)17：617-620)。

用于治疗癌症的示例性的RNAi和反义RNA试剂包括但不限于CALAA-01、siGl2DLODER(本地药物EluteR)和ALN-VSP02。

其他癌症治疗剂包括但不限于细胞因子(例如，阿地白介素(IL-2，白介素-2，

)、α干扰素(IFN-α，干扰素α，

A(干扰素α-2b)、

(干扰素α-2a))、依泊汀α

非格司亭(G-CSF，粒细胞-集落刺激因子，

)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，沙格司亭，LEUKINE^TM)、IL-11(白介素-11，奥普瑞白介素，

)、干扰素α-2b(PEG缀合物)(PEG干扰素，PEG-INTRON^TM)和培非司亭(NEULASTA^TM))、激素治疗剂(例如，氨鲁米特

阿那曲唑

比卡鲁胺

依西美坦

氟甲睾酮

氟他胺

、氟维司群

戈舍瑞林

来曲唑

亮丙瑞林(ELIGARD^TM，

LUPRON

VIADUR^TM)、甲地孕酮(醋酸甲地孕酮，

)、尼鲁米特

奥曲肽(醋酸奥曲肽，

SANDOSTATIN

)、雷洛昔芬

罗米司亭

他莫昔芬

和托瑞米芬

)、磷脂酶A2抑制剂(例如阿那格雷

)、生物应答调节剂(例如BCG

和达贝汀α

)、靶向治疗剂(例如硼替佐米

达沙替尼(SPRYCEL^TM)、地尼白介素

厄洛替尼

依维莫司

吉非替尼

甲磺酸伊马替尼(STI-571，GLEEVEC^TM)、拉帕替尼

索拉非尼

和SU11248(舒尼替尼，

)、免疫调节和抗血管生成剂(例如CC-5013(来那度胺，

)和沙利度胺

)、糖皮质激素(例如可的松(氢化可的松，氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠，

HYDROCORT

氢化可的松磷酸盐

)、地卡特隆(地塞米松，醋酸地塞米松，地塞米松磷酸钠，

)、甲基泼尼松龙(6-甲基泼尼松龙，醋酸甲基泼尼松龙，甲基泼尼松龙琥珀酸钠，

)、泼尼松龙

和泼尼松(

LIQUID

))和双膦酸盐(例如帕米膦酸二钠

和唑来膦酸

)。

在一些实施方案中，多特异性或多功能分子与酪氨酸激酶抑制剂(例如受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)联合使用。示例性的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于表皮生长因子(EGF)途径抑制剂(例如表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)，血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂(例如针对VEGF的抗体、VEGF阱、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂))，血小板衍生的生长因子(PDGF)途径抑制剂(例如，血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如，PDGFR-β抑制剂))，RAF-1抑制剂，KIT抑制剂和RET抑制剂。在一些实施方案中，与AHCM试剂联合使用的抗癌剂选自：阿昔替尼(AG013736)、波舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RECENTIN^TM，AZD2171)、达沙替尼(

BMS-354825)、厄洛替尼

吉非替尼

伊马替尼(

CGP57148B，STI-571)、拉帕替尼

来妥替尼(CEP-701)、奈拉替尼(HKI-272)、尼洛替尼

司马尼布(司马沙尼(semaxinib)，SU5416)、舒尼替尼(

SU11248)、托西尼布

凡他尼布(

ZD6474)、伐拉尼布(PTK787，PTK/ZK)、曲妥珠单抗

贝伐珠单抗

利妥昔单抗

西妥昔单抗

帕木单抗

雷珠单抗

尼洛替尼

索拉非尼

阿仑珠单抗

吉姆单抗奥佐米星

ENMD-2076、PCI-32765、AC220、度维替尼乳酸盐(TKI258，CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOK^TM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120

AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃扎尼(tivozanib)(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡他尼布(凡德他尼(zactima))、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(利尼伐尼(linifanib))、AEE788、AP24534(泊那替尼)、AV-951(替沃扎尼(tivozanib))、阿昔替尼、BAY73-4506(瑞戈非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布立尼布(brivanib)(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(度维替尼)、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(motesanib diphosphate)(AMG-706)、MP-470、OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)、SU 5402、TSU-68(SU6668)、伐拉尼布、XL880(GSK1363089，EXEL-2880)。选定的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、厄洛替尼、吉非替尼或索拉非尼。在一个实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。

在一个实施方案中，多特异性或多功能分子与抗血管生成剂，或血管靶向剂或血管破坏剂中的一种或多种联合施用。示例性的抗血管生成剂包括但不限于VEGF抑制剂(例如抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)；VEGF受体抑制剂(例如伊曲康唑)；细胞增殖素和/或内皮细胞迁移的抑制剂(例如，羧酰胺基三唑，TNP-470)；血管生成刺激剂的抑制剂(例如，舒拉明)等。血管靶向剂(VTA)或血管破坏剂(VDA)被设计成损害癌症肿瘤的脉管系统(血管)，引起中心性坏死(在例如Thorpe，P.E.(2004)Clin.Cancer Res.第10卷：415-427中概述)。VTA可以是小分子。示例性的小分子VTA包括但不限于微管失稳药物(例如康普瑞汀A-4磷酸二钠(CA4P)、ZD6126、AVE8062、Oxi 4503)；和伐地美生(ASA404)。

免疫检查点抑制剂

在其他实施方案中，本文所述的方法包括将免疫检查点抑制剂多特异性或多功能分子联合使用。该方法可用于体内治疗方案。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂抑制检查点分子。示例性的检查点分子包括但不限于CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM3、LAG3、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、BTLA、KIR、MHC I类、MHC II类、GAL9、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1和A2aR。参见，例如，Pardoll.Nat.Rev.Cancer 12.4(2012)：252-64，通过引用并入本文。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体，例如纳武利尤单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)或匹地利珠单抗(Pidilizumab)。纳武利尤单抗(也称为MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558)是特异性抑制PD1的完全人IgG4单克隆抗体。参见，例如，US 8,008,449和WO2006/121168。派姆单抗(也称为帕博利珠单抗(Lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或

Merck)是与PD-1结合的人源化IgG4单克隆抗体。参见，例如Hamid，O.等人，(2013)New EnglandJournal of Medicine 369(2)：134-44、US 8,354,509和WO2009/114335。匹地利珠单抗(也称为CT-011或Cure Tech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。参见，例如，WO2009/101611。在一个实施方案中，PD-1的抑制剂是具有与纳武利尤单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗的序列基本相同或相似的序列(例如，与其至少85％、90％、95％或更加相同的序列)的抗体分子。另外的抗PD1抗体，例如AMP 514(Amplimmune)，在例如US 8,609,089、US2010028330和/或US 20120114649中描述。

在一些实施方案中，PD-1抑制剂是免疫粘附素，例如包含与恒定区(例如，免疫球蛋白的Fc区)融合的PD-1配体(例如PD-L1或PD-L2)的细胞外/PD-1结合部分的免疫粘附素。在实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg，例如，在WO2011/066342和WO2010/027827中所述)，一种阻断B7-H1与PD-1之间的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂，例如抗体分子。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是MSB0010718C(也称为A09-246-2；Merck Serono)，其是与PD-L1结合的单克隆抗体。例如在WO2013/079174中描述了示例性的人源化抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体，例如YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体描述于例如WO 2010/077634中。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是MDX-1105(也称为BMS-936559)，其描述于例如WO2007/005874中。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是MDPL3280A(Genentech/Roche)，其是针对PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。参见例如美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906。在一个实施方案中，PD-L1的抑制剂是具有与YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105的序列基本相同或相似的序列(例如，与其至少85％、90％、95％或更加相同的序列)的抗体分子。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L2抑制剂，例如AMP-224(其是阻断PD1和B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体)。参见例如WO2010/027827和WO2011/066342。

在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是LAG-3抑制剂，例如抗LAG-3抗体分子。在实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016(也称为BMS986016；Bristol-Myers Squibb)。BMS-986016和其他人源化抗LAG-3抗体描述于例如US 2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218中。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是TIM-3抑制剂，例如抗TIM3抗体分子，例如描述于美国专利号8,552,156、WO 2011/155607、EP 2581113和美国公开号2014/044728中。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂，例如抗CTLA-4抗体分子。示例性的抗CTLA4抗体包括曲美木单抗(来自辉瑞的IgG2单克隆抗体，以前称为提昔单抗(ticilimumab)，CP-675,206)；和伊匹木单抗(也称为MDX-010，CAS号477202-00-9)。其他示例性的抗CTLA-4抗体描述于例如美国专利号5,811,097中。

CRS等级

在一些实施方案中，与其他组合物相比，本文所述的组合物可诱导较低水平的细胞因子释放综合征(CRS)和/或可具有较低地引起(例如，可不引起)CRS的可能性。在一些实施方案中，CRS可以以严重性分为如下1-5级。1-3级低于严重CRS。4-5级是严重CRS。对于1级CRS，仅需要对症治疗(例如，恶心、发烧、疲劳、肌痛、心神不安、头痛)，并且症状不会危及生命。对于2级CRS，症状需要进行中等程度的干预，并且通常会对中等程度的干预产生应答。患有2级CRS的受试者出现，对流体或一种低剂量的升压药产生应答的低血压；或他们出现对低流量氧气(＜40％氧气)产生应答的2级器官毒性或轻度呼吸道症状。在3级CRS受试者中，低血压通常无法通过流体疗法或一种低剂量升压药逆转。这些受试者通常需要超过低流量的氧气，并具有3级器官毒性(例如，肾或心脏功能障碍或凝血病)和/或4级转氨酶升高。3级CRS受试者需要更深入的干预，例如40％或更高的氧气、高剂量的升压药和/或多种升压药。4级CRS受试者患有立即威胁生命的症状，包括4级器官毒性或需要机械通气。4级CRS受试者通常不具有转氨酶升高。在5级CRS受试者中，毒性导致死亡。本文表5A、表6A和表7B提供了用于对CRS进行分级的标准集。除非另有说明，否则本文使用的CRS指的是根据表6A的标准的CRS。

在实施方案中，CRS根据表5A分级

表5A：CRS分级

表6A：CTCAE v 4.0 CRS分级量表

表7B：NCI CRS分级量表

实施例

实施例1.α-TRBV6-5抗体克隆抗体A的人源化

使用IMGT命名法分配小鼠α-TCRβ抗体克隆抗体A VH和VL的种系，其中通过Kabat和Chothia分类的组合定义CDR区。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别是抗体A VH和VL序列，其中VH种系是小鼠IGHV1S 12*01，而VL种系是小鼠IGKV6-15*01。SEQ ID NO：3-5分别是抗体A VH CDR区1-3，而SEQ ID NO：6-8分别对应于VL CDR区1-3(如表1A中所述)。

使用相似的方法分别完成了抗体A VH和VL序列的人源化。在框架区中鉴定出对于CDR移植的成功很重要的氨基酸位置。鉴定了人种系序列，其保留了必要的残基并包含大量的整体同一性。当人种系框架序列不包含匹配的重要氨基酸时，将其回复突变以匹配小鼠序列。将CDR区原样移植到人种系上。将抗体A VH人源化为人IGHV1-69*01，将抗体A VL人源化为IGKV1-17*01和IGKV1-27*01。证实所有3种人源化序列均不包含由于人源化过程而引入的潜在负面的翻译后修饰位点，例如NG、DG、NS、NN、DS、NT、NXS或NXT。SEQ ID NO：9是人源化抗体A-H.1VH，SEQ ID NO：10和11分别是人源化VL IGKV1-17*01和IGKV1-27*01种系(如表1A中所述)。图1A和1B显示了具有注释的鼠和人源化序列，描绘了CDR和框架区(FR)。

实施例2：α-TRBV12-3和TRBV12-4抗体克隆抗体B的人源化

使用IMGT命名法分配小鼠α-TCRβ抗体克隆抗体B VH和VL的种系，其中通过Kabat和Chothia分类的组合定义CDR区。SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16分别是抗体B VH和VL序列，其中VH种系是小鼠IGHV5-17*02，而VL种系是小鼠IGKV4-50*01。SEQ ID NO：17-19分别是B-H VH CDR区1-3，而SEQ ID NO：20-22是B-H VL CDR区1-3(如表2A中所述)。

使用实施例1中所述的用于人源化抗体A的方法来人源化抗体B。将抗体B VH人源化为人IGHV3-30*01、IGHV3-48*01和IGHV3-66*01，并且将抗体B VL人源化为人IGKV1-9*01、IGKV1-39*01、IGKV3-15*01、IGLV1-47*01和IGLV3-10*01。SEQ ID NO：23-25是BH.1A、BH.1B和BH.1C人源化重链，且SEQ ID NO：26-30是B-H.1D、BH.1E、BH.1F、BH.1G和BH.1H人源化轻链(如表2A中所述)。图2A和2B显示了带有注释的鼠和人源化序列，描绘了CDR和框架区(FR)。

实施例3：抗TCRβV抗体的特征

介绍

设计用于重定向T细胞以促进肿瘤细胞裂解以用于癌症免疫治疗的当前双特异性构建体通常利用源自针对T细胞受体(TCR)的CD3e亚基的单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFV)。但是，这种方法存在的局限性可能会阻止这种双特异性构建体的治疗潜力的完全实现。先前的研究表明，例如，低“激活”剂量的抗CD3e mAb可以引起长期的T细胞功能障碍并发挥免疫抑制作用。此外，抗CD3e mAb与所有T细胞结合，从而均等地激活所有T细胞，这与大规模T细胞激活导致的抗CD3e mAb的第一剂量副作用有关。这些大量的激活T细胞分泌大量的细胞因子，其中最重要的是干扰素γ(IFNg)。该过量的IFNg进而例如激活巨噬细胞，然后巨噬细胞可以过量产生促炎细胞因子，例如IL-1、IL-6和TNF-α，引起称为细胞因子释放综合征(CRS)的“细胞因子风暴”。因此，开发能够仅结合和激活必需的效应T细胞亚群以减少CRS的抗体可能是有利的。

结果

为此，鉴定了针对TCR的β亚基的可变链(TCR Vb)的抗体。这些抗TCR Vb抗体结合并激活T细胞的一个亚群，但是例如没有CRS或具有显著降低的CRS。使用板结合的抗TCRVb13.1 mAb(A-H.1和A-H.2)，显示可以扩增T细胞群体，如A-H.1阳性染色定义(从细胞培养的第0天的约5％的T细胞到第6天的几乎60％总T细胞)(图4A-4C)。对于该实验，使用磁珠分离(阴性选择)分离人CD3+T细胞，并用固定化的(板包被的)A-H.1或OKT3(抗CD3e)抗体以100nM激活6天。当与纯化的CD3+T细胞共培养时，扩增的Vb13.1+T细胞显示出对转化的细胞系RPMI-8226的溶细胞活性(图5A-5B)。

接下来，评估了被抗TCR VB抗体激活的PBMC产生细胞因子的能力。将用抗TCR VB抗体激活的PBMC的细胞因子产生与用以下抗体激活的PBMC的细胞因子产生进行比较：(i)抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)；(ii)抗TCR Vα(TCR VA)抗体，包括抗TCR VA 12.1抗体6D6.6，抗TCR VA24JA18抗体6B 11；(iii)抗TCRαβ抗体T10B9；和/或(iv)同型对照(BGM0109)。测试的抗TCR VB抗体包括：人源化抗TCRVB 13.1抗体(A-H.1或A-H.2)、鼠抗TCR VB5抗体E、鼠抗TCR VB8.1抗体抗体B和鼠抗TCR VB 12抗体抗体D。BGM0109包含以下氨基酸序列：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGGLNDIFEAQKIEWHEGGGGSEPRTDTDTCPNPPDPCPTCPTPDLLGGPSVFIFPPKPKDVLMISLTPKITCVVVDVSEEEPDVQFNWYVNNVEDKTAQTETRQRQYNSTYRVVSVLPIKHQDWMSGKVFKCKVNNNALPSPIEKTISKPRGQVRVPQIYTFPPPIEQTVKKDVSVTCLVTGFLPQDIHVEWESNGQPQPEQNYKNTQPVLDSDGSYFLYSKLNVPKSRWDQGDSFTCSVIHEALHNHHMTKTISRSLGNGGGGS(SEQ ID NO：3282)。

如图6A所示，当使用板结合的A-H.1或A-H.2或抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)来激活人PBMC时，诱导了T细胞细胞因子IFNg(图6A)。测试的所有抗TCR VB抗体对IFNg的产生具有相似的作用(图6B)。抗TCR VA抗体没有诱导类似的IFNg产生。

关于IL-2产生，与用抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，用A-H.1和A-H.2激活的PBMC导致IL-2的产生增加(图7A)，且具有延迟的动力学(图7B)。图7B显示，抗TCRVB抗体激活的PBMC在激活(与板包被的抗体一起温育)后第5天或第6天显示IL-2的产生达到峰值。相比之下，用OKT3激活的PBMC中IL-2的产生在激活后第2天达到峰值。与IFNG一样，在所有测试的抗TCR VB抗体中，IL-2影响(例如，IL-2的产生增加和动力学延迟)相似(图7B)。

在相似的条件下也评估了与“细胞因子风暴”(以及相应的CRS)相关的细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的产生。图8A、9A和10A显示，用抗CD3e抗体激活的PBMC显示出IL-6(图8A)、TNF-α(图9A)和IL-1β(图10A)的产生，但是没有或几乎没有观察到用A-H.1或A-H.2激活的PBMC诱导这些细胞因子。如图9B和10B所示，通过用任何抗TCR VB抗体激活PBMC未诱导TNF-α和IL-1β的产生。

进一步注意到，相对于由抗CD3e mAb(OKT3和SP34-2)激活的CD3+T细胞产生的动力学，由A-H.1-1激活的CD3+T细胞产生IFNg的动力学被延迟(图11A和11B)。

最后，观察到被称为T_EMRA的记忆效应T细胞亚群优先在被A-H.1或A-H.2激活的CD8+T细胞中扩增(图12)。将分离的人PBMC用固定的(板包被的)抗CD3e或抗TCR Vβ13.1以100nM激活6天。温育6天后，通过FACS染色以下细胞的表面标记来鉴定T细胞亚群：幼稚T细胞(CD8+、CD95-、CD45RA+、CCR7+)、干细胞记忆T细胞(TSCM；CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7+)、中央记忆T细胞(Tcm；CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7+)、效应记忆T细胞(Tem；CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7-)和重新表达CD45RA的效应记忆T细胞(Temra；CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7-)。与被抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，被抗TCR Vβ13.1抗体(A-H.1或A-H.2)激活的人PBMC增加了CD8+TSCM和Temra T细胞亚群。用CD4+T细胞观察到类似的扩增。

结论

本实施例中提供的数据表明，针对TCR Vb的抗体可以例如优先激活T细胞的亚群，从而导致T_EMRA扩增，这可以例如促进肿瘤细胞裂解而非CRS。因此，利用针对TCR Vb的Fab或scFV或肽的双特异性构建体可以例如用于激活和重定向T细胞以促进肿瘤细胞裂解以用于癌症免疫疗法，而没有例如与抗CD3e靶向相关的CRS的有害副作用。

实施例4：采用针对BCMA和T细胞衔接物的双重靶向抗体分子对多发性骨髓瘤(MM)细胞的中靶T细胞介导的细胞毒性

本实施例显示了采用双重靶向抗体分子对多发性骨髓瘤(MM)细胞的中靶T细胞介导的细胞毒性，所述双重靶向抗体分子识别T细胞上的T细胞衔接物，例如TCRVb，和MM细胞上的BCMA。

如图13A所示，被板结合的抗TCRVb抗体激活5天的纯化人T细胞以高于被板结合的抗CD3(OKT3)抗体激活的纯化人T细胞的速率增殖。T细胞的抗TCRVb抗体刺激导致CD45RA+效应记忆CD8+和CD4+ T细胞(TEMRA)细胞的选择性扩增(图13B)。与未经刺激的细胞或由抗CD3(SP34)抗体刺激的细胞相比，当用抗TCRVb抗体刺激时，CD8+和CD4+ Temra细胞群体扩增更多。与用抗CD3抗体刺激的PBMC相比，抗TCRVb抗体导致用抗TCRVb抗体刺激的PBMC延迟分泌IFN-g(图13C)。另外，如图13D所示，用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞导致多发性骨髓瘤靶细胞的裂解相当。如图13E-13F所示，用100ng/ml板结合的抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激5天的T细胞分泌穿孔素和粒酶B。

与用抗OKT3抗体激活的PBMC相比，用抗TCRVb抗体激活的PBMC导致更高的IL-2和/或IL-15的产量和/或分泌(图14A)。抗TCRVb抗体激活的PBMC还导致扩增和/或存活，例如天然杀伤(NK)细胞的增殖(图14B)。相比之下，用抗OKT3抗体激活的PBMCS不会导致NK细胞扩增。此外，如实施例3中所述，用抗TCRVb抗体激活的PBMC不导致产生与CRS相关的细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α(图15)。这些体外表征研究表明，在一些实施方案中，抗TCRVb抗体例如激活和/或刺激T细胞以促进T细胞杀伤，如由靶细胞裂解、穿孔素分泌和粒酶B的分泌所证明的，以及具有例如动力学延迟的IFN-g的分泌。

接下来，测试了在一个臂上靶向BCMA且在另一臂上靶向TCRVb的双重靶向抗体分子(分子I)靶向并杀死多发性骨髓瘤(MM)细胞的能力。将健康的供体PBMC与RMPI8226 MM细胞系和以下双重靶向抗体分子之一共同温育：BCMA-TCRVb、BCMA-CD3或对照-TCRVb；或者同种型对照。然后使用流式细胞仪评估靶细胞裂解。如图16A所示，双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子导致在体外杀死MM细胞。

在MM小鼠模型中进一步测试了双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子体内抑制MM肿瘤生长的能力。在第0天将NCI-H929细胞系注射到NOD-scid IL2 rγnull(NSG)受体小鼠中，然后在第9天递送PBMC。在第12、15、18和21天，以0.5mg/kg的剂量通过腹膜内注射施用双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子。图16B显示了使用双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子防止(例如抑制)体内MM肿瘤生长。这些结果证明，在一些实施方案中，双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子例如可以在体外和体内杀死肿瘤细胞，例如MM肿瘤细胞。因此，在一些实施方案中，可以将双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子用作癌症(例如，血液学癌症，例如MM)的疗法。

实施例5：针对FcRH5和T细胞衔接物的双重靶向抗体分子的体外细胞毒性

本实施例显示了双重靶向抗体分子对多发性骨髓瘤(MM)细胞的体外细胞毒性，所述双重靶向抗体分子识别T细胞上的T细胞衔接物，例如TCRVb，和MM细胞上的FcRH5。将健康的供体PBMC或纯化的T细胞与MOL8M MM细胞系以及在一个臂上靶向FcRH5且在另一臂上靶向TCRVb的双重靶向抗体分子或与同种型对照抗体共同温育。然后使用流式细胞仪评估靶细胞裂解。如图17所示，双重靶向FcRH5-TCRVb分子导致由纯化的T细胞或PBMC杀死MM细胞。这表明双重靶向FcRH5-TCRVb分子可以靶向MM细胞并促进免疫细胞(例如在包括T细胞的PBMC中的免疫细胞)杀死MM细胞。

实施例6：对亚美尼亚仓鼠进行免疫接种以产生抗NKp30抗体

简而言之，用完全弗氏佐剂中的人NKp30蛋白的胞外结构域对亚美尼亚仓鼠进行免疫接种，并在第14天和第28天用不完全弗氏佐剂(IFA)中的NKp30加强两次。在第56天施予在IFA中的再次加强，并在三天后收获动物。收集脾脏并与P3X63Ag8.653鼠骨髓瘤细胞系融合。以0.9x10^5个细胞/孔将125ul置于96孔板中并饲喂125μl的I-20+2ME+HAT(IMDM(4g/L葡萄糖))，其中补充有20％胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50U青霉素、50μg链霉素和50μM 2-ME，不存在或存在HAT或HT以用于选择，并且在第7、11天和此后所需的时间饲喂杂交瘤克隆因子(最终1％)。在融合后大约2周(细胞汇合约50％)，收集上清液并测定结合。

实施例7：NKp30 mAb的杂交瘤筛选

筛选前用BG160(hNKp30细胞抗原)转染Expi293细胞18小时。筛选当天，将转染的细胞稀释至0.05x10^⁶/mL，并添加抗亚美尼亚仓鼠Fc Alexa Fluor 488至终浓度为0.4ug/mL。将50uL(2,500个细胞)该混合物添加到384孔板的每个孔中。使用相同密度带有二抗的未转染293细胞作为阴性对照。将5uL杂交瘤上清液添加到细胞混合物中，并将板在37℃下温育1小时。然后将板在Mirrorball上成像。鉴定阳性克隆物并通过连续稀释来亚克隆以获得克隆选择的杂交瘤。使用相同方案再次确认后，收获杂交瘤细胞并回收相应的重链和轻链序列。将DNA亚克隆到pcDNA3.4中以用于随后表达相应抗体并进行进一步验证。

实施例8：NKp30抗体与NK92细胞的结合

用含有0.5％BSA和0.1％叠氮化钠(染色缓冲液)的PBS洗涤NK-92细胞，并以200,000个细胞/孔添加到96孔V型底的板中。将仓鼠NKp30抗体以2.0倍连续稀释添加到细胞，并在室温下温育1小时。将板用染色缓冲液洗涤两次。以1∶100的稀释度(1.4mg/ml的原液)添加与AF647缀合的抗仓鼠Fc的二抗(Jackson，127-605-160)，并在4℃下与细胞温育30分钟，然后用染色缓冲液洗涤。随后将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟。在CytoFLEX LS(Beckman Coulter)上读取该板。将数据计算为AF747阳性群体的百分比(图22)。

实施例9：使用NK92细胞系测量NKp30抗体活性的生物测定

将NKp30抗体在PBS中进行三倍连续稀释，并于2-8℃下在平底96孔板中温育过夜。将板在PBS中洗涤两次，并将40,000个NK-92细胞添加至含有IL-2的生长培养基中。在收集上清液之前，将板在37℃、5％CO2的加湿培养箱中温育16-24小时。按照MSD测定说明书测量上清液中的IFNγ水平(图23)。将从与仓鼠同种型IgG一起温育的细胞收集的上清液用作阴性对照，并将来自与NKp30单克隆抗体(R&D，克隆物210847)一起温育的细胞的上清液用作阳性对照。使用仓鼠抗NKp30 mAB生成数据。

实施例10：抗钙网蛋白抗体的表征

将鼠抗钙网蛋白抗体AbM-1(也称为BIM0031)(其包含SEQ ID NO：6250的VH和SEQID NO：6252的VL)进行人源化。产生5个人源化的VH(SEQ ID NO：6372和234-237，示于表16中)和5个人源化的VL(SEQ ID NO：238-242，示于表16中)。所有人源化的VH包含HCDR2中的半胱氨酸到丙氨酸置换。合成如表19中所公开的抗体BJM0040-BJM0064，并表征其生化和功能活性。

简而言之，在蛋白质A洗脱后测量纯化蛋白质的表达水平。通过分析型SEC分析蛋白质以评估聚集，并通过差示扫描荧光法(DSF)进行测试以鉴定更稳定的候选物。候选物的结合亲和力在ELISA测定中针对与人Fc融合的突变体钙网蛋白C-末端肽进行测量。结果总结在表22中。与亲本鼠抗体相比，包含HCDR2中半胱氨酸到丙氨酸置换的人源化抗体表现出减少的聚集。

表22.抗钙网蛋白抗体的表征总结

实施例11：人源化抗NKp30抗体的生成和表征

选择一系列仓鼠抗NKp30抗体。这些抗体显示与人NKp30和食蟹猴NKp30结合并诱导NK-90细胞产生IFNγ(数据未显示)。示例性的仓鼠抗NKp30抗体15E1、9G1、15H6、9D9、3A12和12D10的VH和VL序列公开于表9。基于15E1、9G1和15H6的示例性人源化抗NKp30抗体的VH和VL序列也公开于表9。这些抗体的Kabat CDR公开于表18和表8。

选择两个基于15E1的人源化构建体。第一构建体BJM0407是Fab，其包含含有SEQID NO：7302的氨基酸序列的重链可变区以及含有SEQ ID NO：7305的氨基酸序列的λ轻链可变区。其对应的scFv构建体BJM0859包含SEQ ID NO：7310的氨基酸序列。第二构建体BJM0411是Fab，其包含含有SEQ ID NO：7302的氨基酸序列的重链可变区以及含有SEQ IDNO：7309的氨基酸序列的κ轻链可变区。其对应的scFv构建体BJM0860包含SEQ ID NO：7311的氨基酸序列。BJM0407和BJM0411显示出相当的生物物理特性，例如对NKp30的结合亲和力和热稳定性。scFv构建体BJM0859和BJM0860也显示出相当的生物物理特性。

援引并入

本文提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利均被特别地和单独地指出通过引用并入。

等同方案

本领域技术人员将认识到，或仅通过常规实验便能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案旨在由以下权利要求书涵盖。

Claims

1.一种多功能分子，包含：

(i)第一抗原结合结构域，其结合钙网蛋白(例如，野生型或突变型钙网蛋白)，

和

(ii)第二抗原结合结构域，其结合TCRβV，例如在表1A、表2A、表3A、表10A、表11A、表12A或表13A中的任一个公开的抗-TCRβV抗原结合结构域，或

第二抗原结合结构域，其结合NKp30，例如在表7-10或18中公开的抗-NKp30抗原结合结构域。

2.根据权利要求1所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域结合TCRβV。

3.根据权利要求2所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域激活T细胞或所述第二抗原结合结构域不激活T细胞。

4.根据权利要求2或3所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域结合TCRβV12或TCRβV6(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:1044)。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含表1A、表2A、表3A、表10A、表11A、表12A或表13A中列出的一个或多个氨基酸序列。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VHCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHCDR2，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VHCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VHCDR3，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VHCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，

(ii)所述VL包含轻链互补决定区1(VLCDR1)，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VLCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VLCDR2，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VLCDR2的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VLCDR3，其具有表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VLCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:3(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:4(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO:5(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)所述VL包含轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:6(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:7(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO:8(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(c)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:45(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:46(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO:47(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)所述VL包含轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:51(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:52(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO:53(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(d)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:48(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:49(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO:50(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)所述VL包含轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:54(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:55(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO:56(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

7.根据权利要求2-5中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中的VH的氨基酸序列(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)所述VL包含表1A、表2A、表10A、表11A、表12A或表13A中VL的氨基酸序列(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)

(iii)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:9(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(iv)所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:9(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:11(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(c)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:1312(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:1314(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

8.根据权利要求2-5中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:17(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:18(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO:19(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)所述VL包含轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:20(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:21(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO:22(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:57(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:58(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO:59(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)所述VL包含轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:63(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:64(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO:65(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

(c)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:60(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:61(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ IDNO:62(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)，和/或

(ii)所述VL包含轻链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:66(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:67(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQID NO:68(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

9.根据权利要求2-5中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(a)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:15(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(b)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：

(i)所述VH包含：

氨基酸序列SEQ ID NO:23(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO:24(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，或

氨基酸序列SEQ ID NO:25(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

(ii)所述VL包含：

氨基酸序列SEQ ID NO:26(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO:27(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO:28(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，

氨基酸序列SEQ ID NO:29(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，或

氨基酸序列SEQ ID NO:30(或与其具有至少约77％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

10.根据权利要求2-9中任一项所述的多功能分子，包含：

第一多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VL和第一CL；

第二多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VH、第一CHl、第一二聚化结构域(例如，第一Fc)、和结合TCR(例如，TCRVβ)的第一部分(例如，与TCR(例如，TCRVβ)结合的第一scFv)；

第四多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VL和第二CL，

其中：

所述第一VL和所述第一VH形成结合第一钙网蛋白的第一抗原结合结构域，并且所述第二VL和所述第二VH形成结合第二钙网蛋白的第三抗原结合结构域，

任选地其中所述第一钙网蛋白和所述第二钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:6285或6286，

任选地其中所述第一钙网蛋白和所述第二钙网蛋白突变蛋白各自独立地选自：包含氨基酸序列SEQ ID NO:6313的分子，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:6314的分子，

任选地其中所述多功能分子包含图3A或图3B的构型。

11.根据权利要求1所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域结合NKp30。

12.根据权利要求11所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域选自结合(例如，激活)NKp30的抗体分子(例如抗原结合结构域)或配体，例如，所述第二抗原结合结构域为结合(例如，激活)NKp30的抗体分子或配体。

13.根据权利要求11或12所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含：重链互补决定区1(VHCDR1)，其具有表7、表9、表10或表18的VHCDR1的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；VHCDR2，其具有表7、表9、表10或表18的VHCDR2的氨基酸序列的(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或VHCDR3，其具有表7、表9、表10或表18的VHCDR3的氨基酸序列(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)；和/或

14.根据权利要求13所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:7313(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VHCDR2氨基酸序列SEQID NO:6001(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:7315(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列；和/或

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:7326(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、VLCDR2氨基酸序列SEQID NO:7327(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:7329(或具有不超过1、2、3或4个突变(例如置换、添加或缺失)的序列)。

15.根据权利要求13或14所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含SEQ ID NO:7298或7300-7304中的任一项的氨基酸序列(或与SEQ IDNO:7298或7300-7304中的任一项具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和/或

(ii)VL，其包含SEQ ID NO:7299或7305-7309中的任一项的氨基酸序列(或与SEQ IDNO:7299或7305-7309中的任一项具有至少约93％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含SEQ ID NO:7302的氨基酸序列(或与7302具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；以及VL，其包含SEQ ID NO:7305的氨基酸序列(或与7305具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；或

(ii)VH，其包含SEQ ID NO:7302的氨基酸序列(或与7302具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；以及VL，其包含SEQ ID NO:7309的氨基酸序列(或与7309具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(i)SEQ ID NO:7310的氨基酸序列(或与7310具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；或

(ii)SEQ ID NO:7311的氨基酸序列(或与7311具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

18.根据权利要求11或12所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(VHCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:6000、VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:6001、和/或VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:6002；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(VLCDR1)氨基酸序列SEQ ID NO:6063、VLCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:6064、和/或VLCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:7293。

19.根据权利要求11、12或18中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含：重链框架区1(VHFWR1)，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR1的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；VHFWR2，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR2的氨基酸序列(或从具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；VHFWR3，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR3的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；或VHFWR4，其具有表7、表9、表10或表18的VHFWR4的氨基酸序列(或从其具有不超过1、2、3、4、5或6个突变(例如，置换、添加或缺失)的序列)；和/或

20.根据权利要求19所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含重链框架区1(VHFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO:6003、VHFWR2氨基酸序列SEQ ID NO:6004、VHFWR3氨基酸序列SEQ ID NO:6005、或VHFWR4氨基酸序列SEQ ID NO:6006；和

(3)轻链可变区(VL)，其包含轻链框架区1(VLFWR1)氨基酸序列SEQ ID NO:6066、VLFWR2氨基酸序列SEQ ID NO:6067、VLFWR3氨基酸序列SEQ ID NO:7292、或VLFWR4氨基酸序列SEQ ID NO:6069。

21.根据权利要求11、12或18-20中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：

(i)VH，其包含表7、表9、表10或表18的VH的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)，和/或

22.根据权利要求11、12或18-21中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含重链，其包含表10的重链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

23.根据权利要求11、12或18-22中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含轻链，其包含表10的轻链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

24.根据权利要求11、12或18-23中任一项所述的多功能分子，其中所述第二抗原结合结构域包含：重链，其包含表10的重链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)；和轻链，其包含表10的轻链的氨基酸序列(或与其具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。

25.根据权利要求11-24中任一项所述的多功能分子，包含：

第一多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第一VL和第一CL；

第四多肽，其包含例如自N-末端至C-末端，第二VL和第二CL，

其中：

任选地其中所述多功能分子包含图3A或图3B的构型。

26.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其中所述钙网蛋白包含选自SEQID NO:6285-6312的氨基酸序列，任选地其中所述钙网蛋白包含选自SEQ ID NO：6313-6346的氨基酸序列。

27.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其中所述钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:6285。

28.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其中所述钙网蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:6286。

29.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其中所述第一抗原结合结构域结合至位于所述钙网蛋白C-末端内的表位，任选地其中所述第一抗原结合结构域结合至位于所述氨基酸序列SEQ ID NO:6285或6286内的表位。

30.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，还包含结合第二钙网蛋白的第三抗原结合结构域，例如，其中第二钙网蛋白突变蛋白包含所述氨基酸序列SEQ ID NO:6285或6286，任选地其中：

(i)所述第三抗原结合结构域与所述第一抗原结合结构域不同，或

(ii)所述第三抗原结合结构域与所述第一抗原结合结构域相同。

31.根据权利要求30所述的多功能分子，其中所述第二钙网蛋白分子与所述第一抗原结合结构域结合的所述钙网蛋白分子相同。

32.根据权利要求30所述的多功能分子，其中所述第二钙网蛋白分子与所述第一抗原结合结构域结合的所述钙网蛋白分子不同。

33.根据权利要求30-32中任一项所述的多功能分子，其中所述第二钙网蛋白包含选自SEQ ID NO:6285-6312的氨基酸序列，任选地其中所述第二钙网蛋白包含选自SEQ ID NO:6313-6346的氨基酸序列。

34.根据权利要求33所述的多功能分子，其中所述第一抗原结合结构域结合的所述钙网蛋白包含所述氨基酸序列SEQ ID NO6285，并且所述第二钙网蛋白包含所述氨基酸序列SEQ ID NO:6286。

35.根据权利要求30-34中任一项所述的多功能分子，其中所述第三抗原结合结构域结合至位于所述第二钙网蛋白C-末端内的表位，任选地其中所述第三抗原结合结构域结合至位于所述氨基酸序列SEQ ID NO:6285或6286内的表位。

36.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其中所述第一抗原结合结构域包含：

37.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其中所述多功能分子还包含肿瘤靶向部分。

38.根据权利要求37所述的多功能分子，其中所述肿瘤靶向部分与肿瘤抗原结合。

39.根据权利要求38所述的多功能分子，其中所述肿瘤抗原选自G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

40.根据权利要求37所述的多功能分子，其中所述肿瘤靶向部分包含抗体分子，例如结合选自以下的肿瘤抗原的抗体分子：G6B、CD34、CD41、P-选择蛋白、Clec2、cKIT、FLT3、MPL、ITGB3、ITGB2、GP5、GP6、GP9、GP1BA、DSC2、FCGR2A、TNFRSF10A、TNFRSF10B或TM4SF1。

41.根据权利要求40所述的多功能分子，其中所述肿瘤靶向部分包含VH和/或VL序列，例如如表A或表20中所列的。

42.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其中所述多功能分子相比于非肿瘤细胞优先结合骨髓增殖性肿瘤细胞，任选地其中所述多功能分子与所述骨髓增殖性肿瘤细胞之间的结合是所述多功能分子与所述非肿瘤细胞之间的结合的超过10、20、30、40、50倍。

43.根据权利要求42所述的多功能分子，其中所述骨髓增殖性肿瘤细胞选自骨髓纤维化细胞、原发性血小板增多症细胞、真性红细胞增多症细胞或慢性骨髓癌细胞，任选地其中：

所述骨髓增殖性肿瘤细胞不包含JAK2 V617F突变，或

所述骨髓增殖性肿瘤细胞不包含MPL突变。

44.根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子，其还包含接头，例如所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域之间的接头。

45.根据权利要求44所述的多功能分子，其中所述接头选自：可切割接头、不可切割接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头或非螺旋接头。

46.根据权利要求44或45所述的多功能分子，其中所述接头为肽接头。

47.根据权利要求46所述的多功能分子，其中所述肽接头包含Gly和Ser。

48.根据权利要求46所述的多功能分子，其中所述肽接头包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:6214-6217或6220-6221和77-78。

49.一种核酸分子，其编码根据前述权利要求中任一项所述的多功能分子。

50.一种载体，例如表达载体，包含根据权利要求49所述的核酸分子。

51.一种细胞，包含根据权利要求49所述的核酸分子或根据权利要求50所述的载体。

52.一种制备、例如生产根据权利要求1-48中任一项所述的多功能分子的方法，其包括在合适的条件、例如适合于基因表达和/或同二聚化或异二聚化的条件下，培养根据权利要求51所述的细胞。

53.一种药物组合物，包含根据权利要求1-48任一项所述的多功能分子和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。

54.一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-48中任一项所述的多功能分子，其中所述多功能分子以有效治疗癌症的量施用。

55.根据权利要求1-48任一项所述的多功能分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

56.根据权利要求54所述的方法或根据权利要求55所述的用途，其中所述受试者具有表达所述第一钙网蛋白和/或所述第二钙网蛋白的癌细胞。

57.根据权利要求54或56所述的方法或根据权利要求55或56所述的用途，其中所述受试者具有JAK2 V617F突变。

58.根据权利要求54或56所述的方法或根据权利要求55或56所述的用途，其中所述受试者不具有JAK2 V617F突变。

59.根据权利要求54或56-58中任一项所述的方法或根据权利要求55-58中任一项所述的用途，其中受试者具有MPL突变。

60.根据权利要求54或56-58中任一项所述的方法或根据权利要求55-58中任一项所述的用途，其中受试者不具有MPL突变。

61.根据权利要求54或56-60中任一项所述的方法或根据权利要求55-60中任一项所述的用途，其中所述癌症是血液学癌症，任选地其中所述癌症是骨髓增殖性肿瘤，例如原发性或特发性骨髓纤维化(MF)、原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)或慢性粒细胞白血病(CML)，任选地其中所述癌症为骨髓纤维化。

62.根据权利要求54或56-60中任一项所述的方法或根据权利要求55-60中任一项所述的用途，所述癌症是实体瘤癌症。

63.根据权利要求54或56-62中任一项所述的方法或根据权利要求55-62中任一项所述的用途，其还包含给予第二治疗性治疗。

64.根据权利要求63所述的方法或根据权利要求63所述的用途，其中所述第二治疗性治疗包括治疗剂(例如，化学治疗剂、生物药剂、激素治疗)、放射或手术。

65.根据权利要求64所述的方法或根据权利要求64所述的用途，其中所述治疗剂选自：化学治疗剂或生物药剂。