CN111748510A - 可诱导共表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明是能够受控诱导各基因产物的表达的可诱导共表达系统。

Description

可诱导共表达系统
本申请是申请日为2013年08月05日和发明名称为“可诱导共表达系统”的201380041522.X号中国发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年8月5日提交的美国临时申请No.61/679,751和2012年12月29日提交的美国临时申请No.61/747,246的利益，其全部公开通过引用引入本文。
序列表的引用
本申请包括电子提交的序列表，其通过引用引入本文。
发明领域
本发明总体属于分子生物学和生物技术生产的技术领域。更特别地，本发明属于重组蛋白质表达的技术领域。
发明背景
生物技术物质的产生是复杂的过程，在所需的产物是不同基因编码的分子的组合(如由两个或更多个不同多肽形成的多聚蛋白质)时更是如此。多个基因产物的成功共表达需要克服多种挑战，而这由于多于一个基因产物的同时表达而复杂化。必须克服的问题包括当使用多于一个类型的载体时产生相容的表达载体；获得正确化学计量比的产物；产生正确折叠的和对于结合伴体的处于正确构象的基因产物；从细胞和不希望的蛋白质如未正确折叠的和/或处于不正确构象中的蛋白质纯化出所需的产物；和最小化包涵体的形成，其作为最大化所需产物的产率的一个方面。已经采取了许多不同的途径来解决这些挑战，但仍有对于更好的共表达方法的需要。
几种可诱导的细菌蛋白质表达系统(包括含有lac和ara启动子的质粒)已设计用于表达单个蛋白质。这些系统在难以表达的蛋白质的共表达中具有有限的用途，因为它们不能在野生型大肠杆菌的整个生长培养物群体内同质地(homogenously)诱导蛋白质(Khlebnikov和Keasling,“Effect of lacY expression on homogeneity of inductionfrom the Ptac and Ptrc promoter by natural and synthetic inducers”,BiotechnolProg 2002May-Jun；18(3):672-674)。当诱导剂的转运蛋白的表达依赖于诱导剂的存在时，如在野生型大肠杆菌lac和ara系统的情况中，诱导剂的细胞浓度必须达到阈值水平以启动转运蛋白的产生，但一旦达到该阈值，非受控的正反馈环可以出现，其结果是细胞中诱导剂的高水平和相应地来自诱导型启动子的高水平表达：“全或无”现象。提高生长培养基中诱导剂的浓度增加了群体中处于高表达模式的细胞的比例。虽然这种类型的系统导致在群体规模下蛋白质表达的浓度依赖性诱导，但其对于需要对表达的紧密控制的蛋白质(包括为毒性的、具有不良溶解性或因为其它原因要求特定浓度的那些)的表达和产生不是最佳的。
已经进行了一些尝试以通过消除诱导剂依赖性的诱导剂转运而在单一启动子表达系统中解决“全或无”诱导的现象。一个实例是在乳糖渗透酶基因(lac Yam)中产生无效突变和使用lac启动子的可选诱导剂如IPTG(异丙基-硫代-D-半乳糖苷)，其可以在不存在转运蛋白的情况下在一定程度上穿过细胞膜(Jensen等,“The use of lizc-typepromoter in control analysis”,Eur J Biochem 1993Jan 15；211(1-2):181-191)。另一途径是在阿拉伯糖转运蛋白基因缺陷但具有乳糖渗透酶基因中的突变lacY(A117C)(这允许其转运阿拉伯糖到细胞中)的菌株中使用阿拉伯糖诱导启动子(Morgan-Kiss等,“Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coli araBAD promoter byuse of a lactose transporter of relaxed specificity”,Proc Natl Acad Sci U S A2002May 28；99(11):7373-7377)。
单个蛋白质表达系统的成分通常是不相容的，排除了其在共表达系统中的使用，因为它们可能受到不同诱导剂-启动子系统之间“交互”效应的不利影响，或需要相互排斥的基因组修饰，或经历一般的代谢调节。解决lac和ara诱导型启动子系统之间的“交互”问题的尝试包括AraC转录激活剂的定向进化以改善其在IPTG(lac启动子的诱导剂)存在下诱导araBAD启动子的能力(Lee等,“Directed evolution of AraC for improvedcompatibility of arabinose-and lactose-inducible promoters”,Appl EnvironMicrobiol 2007Sep；73(18):5711-5715；Epub 2007Jul 20)。但是，基于ara和lac诱导型启动子的表达载体之间的相容性仍然由于对于相互排斥的基因组修饰的需要而受到限制：对于通过阿拉伯糖对araBAD启动子的同质诱导需要lacY点突变(lacY(A117C))和对于通过IPTG对lac启动子的同质诱导需要无效lacY基因。一般代谢调节-例如，碳分解代谢产物阻遏(CCR)–也可以影响诱导型启动子的相容性。CCR特征在于当存在更优选的化合物时含碳化合物利用所需的基因的阻遏，如在葡萄糖先于其它糖优先利用中看到的。在ara和prp诱导型启动子系统的情况中，阿拉伯糖的存在降低了丙酸盐诱导来自prpBCDE启动子的表达的能力，一种据信涉及CCR的效应(Park等,“The mechanism of sugar-mediatedcatabolite repression of the propionate catabolic genes in Escherichia coli”,Gene 2012Aug 1；504(1):116-121,Epub 2012May 3)。显然存在着对于克服这些问题的可诱导共表达系统的需要。
发明概述
本发明提供了能够受控地诱导各基因产物组分的可诱导共表达系统。
本发明的一个实施方式是一种宿主细胞，其包含两个或更多个类型的表达构建体，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子和编码基因产物的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列由所述诱导型启动子转录，其中(1)至少一个所述诱导型启动子对其作出响应的诱导剂不是另一个所述诱导型启动子的诱导剂；且至少一个所述基因产物与另一个所述基因产物形成多聚体；或(2)至少一个所述基因产物选自以下：(a)缺乏信号肽并形成至少三个二硫键的多肽；(b)选自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶的多肽；和(c)选自木质素降解过氧化物酶的多肽。本发明的另一个实施方式是包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子和编码基因产物的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列由所述诱导型启动子转录；其中各诱导型启动子不是乳糖诱导启动子；且其中至少一个所述基因产物是形成至少两个二硫键的多肽，或形成至少两个和少于十七个二硫键，或形成至少两个和少于十个二硫键，或形成选自两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个和九个的多个二硫键的多肽。在本发明的一些实施方式中，这一宿主细胞是原核细胞，且在一些情况中，它是大肠杆菌细胞。在本发明的其它实施方式中，宿主细胞是真核细胞，且在一些情况中，它是酵母细胞，且在进一步的情况中，它是酿酒酵母细胞。在进一步的实施方式中，宿主细胞包含的表达构建体各自包含至少一个诱导型启动子，其中所述诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子或丙酸盐诱导启动子，或选自araBAD启动子、prpBCDE启动子、rhaSR启动子和xlyA启动子，或者其中所述诱导型启动子不是乳糖诱导启动子。在另外的实施方式中，宿主细胞包含的至少一个表达构建体进一步包含编码与诱导型启动子结合的转录调节子的多核苷酸序列；在一些实施方式中，编码转录调节子的多核苷酸序列及所述转录调节子与其结合的诱导型启动子在相同的表达构建体中；且在更进一步的情况中，转录调节子选自AraC、PrpR、RhaR和XylR；或特别地为AraC或PrpR。在某些实施方式中，宿主细胞包含的至少一个表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入选自pBAD18、pBAD18-Cm、pBAD18-Kan、pBAD24、pBAD28、pBAD30、pBAD33、pPRO18、pPRO18-Cm、pPRO18-Kan、pPRO24、pPRO30和pPRO33的质粒中，或特别地插入pBAD24或pPRO33中的步骤的方法产生。本发明的其它实施例包括包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子和编码基因产物的多核苷酸序列，其中至少一个基因产物是多肽，或选自以下：(a)免疫球蛋白重链、(b)免疫球蛋白轻链和(c)(a)-(b)中任一的片段，或者是免疫球蛋白轻链，或者是免疫球蛋白重链；或者是英夫利昔单抗重链或轻链或者其片段，或者分别在SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的至少50％或80％的长度上具有与SEQID NO:30或SEQ ID NO:31的至少80％或90％的氨基酸序列同一性，或者具有SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在本发明的另外的实施方式中，宿主细胞包含两个或更多个类型的表达构建体，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子和编码基因产物的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列由所述诱导型启动子转录；其中至少一个基因产物是缺乏信号肽并形成至少三个二硫键，或者至少三个和少于十七个二硫键，或者至少十八个和少于一百个二硫键，或者至少三个和少于十个二硫键，或者至少三个和少于八个二硫键的多肽；或者形成选自三个、四个、五个、六个、七个、八个和九个的多个二硫键的多肽；或者是选自以下的多肽：(a)免疫球蛋白重链、(b)免疫球蛋白轻链、(c)锰过氧化物酶和(d)(a)-(c)中任一的片段；或者是英夫利昔单抗重链或轻链或者其片段，或者分别在SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的至少50％或80％的长度上具有与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的至少80％或90％的氨基酸序列同一性，或者分别在SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的至少50％或80％的长度上具有与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的至少80％或90％的氨基酸序列同一性，或者具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列；或者是选自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶如木糖异构酶的多肽；或者是选自木质素降解过氧化物酶如锰过氧化物酶或多能过氧化物酶(versatile peroxidase)的多肽。
在本发明的进一步的实施方式中，提供了包含两个类型的表达构建体的宿主细胞，且在某些情况中，一个类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pBAD24多核苷酸序列中的步骤的方法产生，和另一类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pPRO33多核苷酸序列中的步骤的方法产生。
本发明的另一种情况是包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的表达构建体包含诱导型启动子，且其中宿主细胞具有编码用于至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的转运蛋白的至少一个基因的基因功能的改变，且作为另一实例，其中编码转运蛋白的基因选自araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG和xylH，或特别地是araE。作为进一步的实施方式，提供了包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的表达构建体包含诱导型启动子，且其中宿主细胞编码代谢至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的蛋白质的至少一个基因的基因功能水平的降低，且作为进一步的实例，其中编码代谢至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的蛋白质的基因选自araA、araB、araD、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA和xylB。作为另外的实例，提供了包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的表达构建体包含诱导型启动子，且其中宿主细胞编码参与至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质的至少一个基因的基因功能水平的降低，该基因在进一步的实施方式中选自scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC和rmlD。
本发明还提供包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子，且其中宿主细胞具有影响宿主细胞细胞质的还原/氧化环境的基因(其在一些实例中选自gor和gshB)的改变的基因功能；或者其中宿主细胞具有编码还原酶的基因(其在一些实施方式中是trxB)的降低的基因功能水平；或者其中宿主细胞包含编码至少一种二硫键异构酶蛋白(其在一些实施方式中是DsbC)的至少一个表达构建体；或者其中宿主细胞包含编码缺乏信号肽的DsbC形式的至少一个多核苷酸；或者其中宿主细胞包含编码Erv1p的至少一个多核苷酸。
在本发明的其它方面中，提供了包含两个或更多个类型的表达构建体的宿主细胞，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子，其中各类型的表达构建体包含的诱导型启动子不是各其它类型的表达构建体的诱导型启动子，或者其中各类型的表达构建体包含的复制起点与各其它类型的表达构建体的复制起点不同。
作为本发明的特定实施例，提供了大肠杆菌宿主细胞，其包含两个类型的表达构建体，其中一个类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pBAD24多核苷酸序列中的步骤的方法产生，和另一类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pPRO33多核苷酸序列中的步骤的方法产生；且宿主细胞进一步包含以下的两种或更多种：(a)araBAD基因的删除；(b)araE和araFGH基因的基因功能的改变；(c)lacY(A177C)基因；(d)prpB和prpD基因的降低的基因功能；(e)sbm/scpA-ygfD/argK-ygfGH/scpBC基因的基因功能的降低，没有改变ygfI基因的表达；(f)gor和trxB基因的基因功能的降低；(g)AscG基因的基因功能的降低；(h)编码缺乏信号肽的DsbC形式的多核苷酸；和(i)编码Erv1p、ChuA或伴侣蛋白的多核苷酸；且在某些实例中，宿主细胞进一步包含含有编码基因产物的多核苷酸序列的至少一个表达构建体，所述多核苷酸序列由诱导型启动子转录，且在一些情况中，基因产物选自：(a)免疫球蛋白重链；(b)免疫球蛋白轻链；和(c)锰过氧化物酶；和(d)(a)-(c)中任一的片段；或者是英夫利昔单抗重链或轻链或者其片段，或者分别在SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的至少50％或80％的长度上具有与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的至少80％或90％的氨基酸序列同一性，或者具有SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；或者分别在SEQID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的至少50％或80％的长度上具有与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的至少80％或90％的氨基酸序列同一性，或者具有SEQID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列；或者是选自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶如木糖异构酶的多肽；或者是选自木质素降解过氧化物酶如锰过氧化物酶或多能过氧化物酶的多肽。
本发明还提供了生产产品的方法，如通过生长如上所述的本发明的宿主细胞的培养物；并添加至少一个诱导型启动子的诱导剂到所述培养物中；本发明还提供通过这一方法产生的基因产物或多聚产物，且在一些实施方式中，基因产物或多聚产物是抗体，或在更特别的情况中，是非糖基化抗体、嵌合抗体或人抗体。
本发明的系统和方法还提供包含宿主细胞的试剂盒，该宿主细胞包含两个或更多个类型的表达构建体，其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子；和提供包含通过生长本发明的宿主细胞并添加至少一种诱导剂到培养物中而产生的基因产物或多聚产物的试剂盒，其中在一些实施方式中多聚产物是抗体，或在更特别的情况中，是非糖基化抗体、嵌合抗体或人抗体。
特别地，本申请涉及以下各项：
1.一种宿主细胞，包含两个或更多个类型的表达构建体，
其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子和编码由所述诱导型启动子转录的基因产物的多核苷酸序列；和
至少一个所述诱导型启动子对于与另一个所述诱导型启动子的诱导剂不同的诱导剂有反应；且
至少一个所述基因产物与另一个所述基因产物形成多聚体。
2.一种宿主细胞，包含两个或更多个类型的表达构建体，
其中各类型的所述表达构建体包含诱导型启动子和编码由所述诱导型启动子转录的基因产物的多核苷酸序列；和
至少一个所述基因产物选自以下：
(a)缺乏信号肽并形成至少三个二硫键的多肽；
(b)选自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶的多肽；和
(c)选自木质素降解过氧化物酶的多肽。
3.如第1或2项的宿主细胞，其中至少一个诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子。
4.如第1或2项的宿主细胞，其中至少一个诱导型启动子是丙酸盐诱导启动子。
5.如第1或2项的宿主细胞，其中至少一个诱导型启动子选自araBAD启动子、prpBCDE启动子、rhaSR启动子和xlyA启动子。
6.如第1或2项的宿主细胞，其中各诱导型启动子不是乳糖诱导启动子。
7.如第1或2项的宿主细胞，其中至少一个表达构建体进一步包含编码与诱导型启动子结合的转录调节子的多核苷酸序列。
8.如第7项的宿主细胞，其中所述编码转录调节子的多核苷酸序列及所述转录调节子与其结合的诱导型启动子在相同的表达构建体中。
9.如第7项的宿主细胞，其中所述转录调节子选自AraC、PrpR、RhaR和XylR。
10.如第1或2项的宿主细胞，其中至少一个表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入选自pBAD18、pBAD18-Cm、pBAD18-Kan、pBAD24、pBAD28、pBAD30、pBAD33、pPRO18、pPRO18-Cm、pPRO18-Kan、pPRO24、pPRO30和pPRO33的质粒中的步骤的方法产生。
11.如第1项的宿主细胞，其中至少一个基因产物是多肽。
12.如第1或2项的宿主细胞，其中至少一个基因产物选自：(a)免疫球蛋白重链；(b)免疫球蛋白轻链；和(c)(a)-(b)中任一的片段。
13.如第12项的宿主细胞，其中所述基因产物是免疫球蛋白轻链。
14.如第12项的宿主细胞，其中所述基因产物是免疫球蛋白重链。
15.如第1或2项的宿主细胞，其中至少一个基因产物是缺乏信号肽并形成至少三个二硫键的多肽。
16.如第15项的宿主细胞，其中所述多肽形成选自以下的多个二硫键：(a)至少三个和少于十七个二硫键；和(b)至少十八个和少于一百个二硫键。
17.如第15项的宿主细胞，其中所述多肽形成至少三个和少于十个二硫键。
18.如第15项的宿主细胞，其中所述多肽形成至少三个和少于八个二硫键。
19.如第15项的宿主细胞，其中所述多肽选自：(a)免疫球蛋白重链；(b)免疫球蛋白轻链；(c)锰过氧化物酶；和(d)(a)-(c)中任一的片段。
20.如第2项的宿主细胞，其中至少一个基因产物是选自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶的多肽。
21.如第20项的宿主细胞，其中所述多肽是木糖异构酶。
22.如第20项的宿主细胞，其中至少一个基因产物是选自木质素降解过氧化物酶的多肽。
23.如第22项的宿主细胞，其中所述多肽是锰过氧化物酶。
24.如第22项的宿主细胞，其中至少一个另外的基因产物是蛋白质二硫键异构酶。
25.如第22项的宿主细胞，其中所述多肽是多能过氧化物酶。
26.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含两个类型的表达构建体。
27.如第26项的宿主细胞，其中一个类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pBAD24质粒中的步骤的方法产生，和另一类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pPRO33质粒中的步骤的方法产生。
28.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有至少一个基因的基因功能的改变，所述至少一个基因编码用于至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的转运蛋白。
29.如第28项的宿主细胞，其中所述编码转运蛋白的基因选自araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG和xylH。
30.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞至少一个基因的基因功能水平降低，所述至少一个基因编码代谢至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的蛋白质。
31.如第30项的宿主细胞，其中所述编码代谢至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的蛋白质的基因选自araA、araB、araD、prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA和xylB。
32.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞至少一个基因的基因功能水平降低，所述至少一个基因编码参与至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质。
33.如第32项的宿主细胞，其中所述编码参与至少一个所述诱导型启动子的诱导剂的生物合成的蛋白质的基因选自scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC和rmlD。
34.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
35.如第34项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
36.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞影响宿主细胞细胞质的还原/氧化环境的基因的基因功能发生改变。
37.如第36项的宿主细胞，其中所述影响宿主细胞细胞质的还原/氧化环境的基因选自gor和gshB。
38.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞编码还原酶的基因基因功能水平降低。
39.如第38项的宿主细胞，其中所述编码还原酶的基因是trxB。
40.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码至少一种二硫键异构酶蛋白的至少一个表达构建体。
41.如第40项的宿主细胞，其中至少一个表达构建体编码二硫键异构酶蛋白DsbC。
42.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码缺乏信号肽的DsbC形式的至少一个多核苷酸。
43.如第1或2项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码Erv1p的至少一个多核苷酸。
44.如第1或2项的宿主细胞，其中所述各个类型的表达构建体包含与各其它类型的表达构建体的诱导型启动子不同的诱导型启动子。
45.如第1或2项的宿主细胞，其中所述各个类型的表达构建体包含与各其它类型的表达构建体的复制起点不同的复制起点。
46.一种大肠杆菌宿主细胞，包含两个类型的表达构建体，其中一个类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pBAD24质粒中的步骤的方法产生，和另一类型的表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入pPRO33质粒中的步骤的方法产生；且进一步包含以下的两种或更多种：(a)araBAD基因的删除；(b)araE和araFGH基因的基因功能的改变；(c)lacY(A177C)基因；(d)prpB和prpD基因的基因功能的降低；(e)sbm/scpA-ygfD/argK-ygfGH/scpBC基因的基因功能的降低，优选不影响ygfI基因的表达；(f)gor和trxB基因的基因功能的降低；(g)AscG基因的基因功能的降低；(h)编码缺乏信号肽的DsbC形式的多核苷酸；(i)编码Erv1p的多核苷酸；(j)编码蛋白质二硫键异构酶的多核苷酸；(j)编码ChuA的多核苷酸；和(1)编码伴侣蛋白的多核苷酸。
47.如第46项的宿主细胞，其中至少一个表达构建体进一步包含编码由诱导型启动子转录的基因产物的多核苷酸序列。
48.如第47项的宿主细胞，其中所述基因产物选自：(a)免疫球蛋白重链；(b)免疫球蛋白轻链；和(c)(a)-(b)中任一的片段。
49.一种产生基因产物的方法，该方法包括培养如第1或2项的宿主细胞的培养物并添加至少一个诱导型启动子的诱导剂到所述培养物中。
50.一种通过如第49项的方法产生的基因产物。
51.如第50项的基因产物，其中所述基因产物是多聚产物。
52.如第51项的多聚产物，其中所述多聚产物是抗体。
53.如第52项的多聚产物，其中所述多聚产物是非糖基化的抗体。
54.如第52项的多聚产物，其中所述多聚产物是人抗体。
55.一种包含如第1或2项的宿主细胞的试剂盒。
56.一种包含如第50项的基因产物的试剂盒。
57.一种包含如第51项的多聚产物的试剂盒。
附图简要说明
图1是可诱导共表达系统的示意性图解，其包括宿主细胞(1)，该宿主细胞包含两种不同的可诱导表达载体(3)和(4)，其在施用诱导剂(5)时表达不同的基因产物,因而形成多聚产物(6)。
图2是可诱导共表达系统的特定用途的示意性图解，其中大肠杆菌宿主细胞基因组(2)编码二硫键异构酶DsbC的胞质形式(其缺乏信号肽)；表达载体pBAD24(3)提供免疫球蛋白重链的L-阿拉伯糖诱导的表达，和表达载体pPRO33(4)提供免疫球蛋白轻链的丙酸盐诱导的表达；在诱导(5)时形成多聚的抗体产物(6)。
图3显示细菌细胞中免疫球蛋白重链和轻链共表达的结果。含有pBAD24-HC和pPRO33-LC可诱导表达载体两者的
Figure BDA0002582908380000111
Express和BL21细胞通过在L-阿拉伯糖和丙酸盐中生长而诱导。来自诱导的细胞和未诱导的对照的可溶性蛋白质提取物在4-12％Bis-Tris凝胶上通过SDS凝胶电泳在还原性条件下分离。道1：诱导的
Figure BDA0002582908380000112
Express。道2：未诱导的
Figure BDA0002582908380000113
Express。道3：诱导的BL21。道4:未诱导的BL21。箭头指示51kDa处的蛋白质条带(IgG1重链)和26kDa处的另一蛋白质条带(IgG1轻链)；这些条带存在于诱导的细胞中而不存在于未诱导的细胞中。
图4显示细菌细胞中免疫球蛋白重链和轻链共表达的结果。如对于图3描述的，对于来自含有pBAD24-HC和pPRO33-LC可诱导表达载体两者的诱导的和未诱导的
Figure BDA0002582908380000114
Express和BL21细胞的相同可溶性蛋白质提取物在10-20％Tris-甘氨酸凝胶上在原始(非还原)条件下通过凝胶电泳分离。道1：诱导的
Figure BDA0002582908380000115
Express。道2：未诱导的
Figure BDA0002582908380000116
Express。道3：诱导的BL21。道4：未诱导的BL21。箭头指示154kDa处的蛋白质条带(包含重链和轻链的IgG1抗体)；这一条带存在于诱导的诱导的
Figure BDA0002582908380000121
Express细胞中，而在诱导的BL21细胞中和在未诱导的细胞中显著减少或不存在。
图5显示细菌细胞中锰过氧化物酶(MnP)和蛋白质二硫键异构酶(PDI)在亚铁血红素存在下的共表达结果。含pPRO33-MnP-ChuA和pBAD24-PDI可诱导表达载体两者的
Figure BDA0002582908380000122
Express细胞通过在L-阿拉伯糖和丙酸盐中生长进行诱导。来自未诱导和诱导的细胞的可溶性蛋白质提取物在10％Bis-甘氨酸凝胶上在还原性条件下通过凝胶电泳分离。
标志物:Bio-Rad Precision Plus ProteinTM Standard(预染色的)
道1：未诱导的(无氯高铁血红素(hemin)，无丙酸盐，无阿拉伯糖)
道2：50mM丙酸盐 0.002％阿拉伯糖
道3：25mM丙酸盐 0.002％阿拉伯糖
道4：12.5mM丙酸盐 0.002％阿拉伯糖
道5：50mM丙酸盐 0.01％阿拉伯糖
道6：25mM丙酸盐 0.01％阿拉伯糖
道7：12.5mM丙酸盐 0.01％阿拉伯糖
道8：50mM丙酸盐 0.05％阿拉伯糖
道9：25mM丙酸盐 0.05％阿拉伯糖
道10：12.5mM丙酸盐 0.05％阿拉伯糖
箭头指示蛋白质条带，39kDa的MnP和53kDa的PDI；这些条带在特定诱导条件下于
Figure BDA0002582908380000123
Express细胞中表现为最强，但在未诱导的细胞中显著降低。
图6显示细菌细胞中锰过氧化物酶的可选成熟形式(MnP_FT)和蛋白质二硫键异构酶(PDI)在亚铁血红素存在下的共表达结果。含pBAD24-MnP_FT-ChuA和pPRO33-PDI可诱导表达载体两者的
Figure BDA0002582908380000124
Express细胞通过在0.1％L-阿拉伯糖和50mM丙酸盐中生长进行诱导。来自未诱导的和诱导的细胞的可溶性蛋白质提取物在10％Bis-甘氨酸凝胶上在还原性条件下通过凝胶电泳分离。
道1：分子量标志
Bio-Rad Precision Plus ProteinTM Standard(预染色的)
道2:诱导的共表达(0.1％L-阿拉伯糖,50mM丙酸盐)
道3：未诱导的(无氯高铁血红素，无L-阿拉伯糖，无丙酸盐)
道4:对照诱导的(无蛋白质编码的插入序列)
道5:对照未诱导的(无蛋白质编码的插入序列)
本发明的详细说明
不相容的共表达系统组分的问题通过开发利用位于独立的表达构建体上且在一些实施方式中通过不同诱导剂激活的相容性的可同质诱导的启动子系统的协同细菌共表达系统组分来解决。本发明的优势包括，但不限于：1)可诱导共表达系统内组分的改善的相容性；2)在一起形成多聚体的基因产物或基因产物的其它组合的可诱导表达(两个或更多个基因产物的共表达)；3)通过可独立滴定的诱导对基因产物共表达的改进的控制；4)难以表达的基因产物复合物和其它产物(如多聚体产物和形成二硫键的产物)的改进的表达；5)基因产物共表达的顺利优化。
共表达的基因产物。本发明的可诱导共表达系统设计为共表达两个或更多个不同的基因产物，其构成所需的产物。所需的产物可以是由共表达的基因产物形成的多聚体，或者共表达可以用于产生所需的产物加有助于所需产物的表达的一种或多种另外的产物的组合。
“多聚产物”是指共组装以完成多聚产物的功能的一组基因产物，且不是指基因产物和其它分子如修饰酶(激酶、肽酶等等)、伴侣蛋白、转运蛋白等的暂时缔合。在本发明的某些实施方式中，多聚产物是杂多聚体。在许多实施方式中，共表达基因产物是作为多聚蛋白质的亚基的多肽。但是，也可能使用本发明的可诱导共表达系统以共表达多种不同的非编码RNA分子或多肽和非编码RNA基因产物的组合。非编码RNA分子(也称为非蛋白质编码RNA(npcRNA)、非信使RNA(nmRNA)和功能性RNA(fRNA))包括许多不同类型的RNA分子如微RNA，其不是信使RNA且因此不是用于通过翻译形成多肽的模板。
许多生物学重要的产物由不同多肽链的组合形成。除了抗体和抗体片段外，可以通过本发明的可诱导共表达方法产生的其它多聚产物包括G-偶联的蛋白质受体和配体-门控离子通道如烟碱型乙酰胆碱受体、GABAA受体、甘氨酸受体、5-羟色胺受体、谷氨酸受体和ATP-门控受体如P2X受体。肉毒杆菌神经毒素(通常称为BoTN、BTX，或其商业可得形式之一，
Figure BDA0002582908380000131
(onabotulinumtoxinA))由通过二硫键连接的重链和轻链形成(Simpson等,“The role of the interchain disulfide bond in governing the pharmacologicalactions of botulinum toxin”,J Pharmacol Exp Ther 2004Mar；308(3):857-864,Epub2003Nov 14)。由不同多肽链形成的产物的另一实例是胰岛素，其在真核生物中首先翻译为单一多肽链，折叠并然后切割以最终形成通过二硫键保持在一起的两条多肽链。肉毒杆菌神经毒素或成熟胰岛素在单一宿主细胞中的有效产生是本发明的可诱导共表达方法的用途的实例。
本发明的方法设计为产生正确折叠和/或组装成功能性产物且在这种功能性产物内的所需位置中具有所需数目的二硫键(其可以通过如实施例11中的方法确定)的基因产物。基因产物如多肽的二硫键的数目是在该基因产物以所需功能性产物存在时由该基因产物形成的分子内和分子间键的总数。例如，人IgG抗体的轻链通常具有三个二硫键(两个分子内键和一个分子间键)，且人IgG抗体的重链通常具有七个二硫键(四个分子内键和三个分子间键)。在一些实施方式中，所需基因产物与有益于所需基因产物产生的其它基因产物如伴侣蛋白共表达。伴侣蛋白是帮助其它基因产物的非共价折叠或解折叠和/或组装或分解的蛋白质，但不存在于单体或多聚体基因产物结构执行其正常生物学功能时(已经完成折叠和/或组装的过程)的最终单体或多聚体基因产物结构中。伴侣蛋白可以由表达构建体内的诱导型启动子或组成型启动子表达，或可以由宿主细胞染色体表达；优选地，伴侣蛋白在宿主细胞中的表达以足够高的水平产生正确折叠和/或组装成所需产物的共表达的基因产物。大肠杆菌宿主细胞中存在的伴侣蛋白的实例是折叠因子DnaK/DnaJ/GrpE、DsbC/DsbG、GroEL/GroES、IbpA/IbpB、Skp、Tig(触发因子)和FkpA，其已经用于防止胞质或周质蛋白质的蛋白质聚集。DnaK/DnaJ/GrpE、GroEL/GroES和ClpB可以协同地发挥帮助蛋白质折叠的功能且因此这些伴侣蛋白组合的表达已显示有益于蛋白质表达(Makino等,“Strainengineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria”,Microbcell Fact 2011May 14；10:32)。当在原核宿主细胞中表达真核细胞蛋白质时，真核细胞伴侣蛋白如来自相同或相关真核生物物种的蛋白质二硫键异构酶(PDI)在本发明的某些实施方式中与所需基因产物共表达或可诱导地共表达。
诱导型启动子。以下是可用于表达构建体中以共表达基因产物的诱导型启动子以及可对包含这类表达构建体的宿主细胞进行的一些遗传修饰的描述。除非另外指定，这些诱导型启动子和相关基因的实例来自大肠杆菌(E.coli)菌株MG1655(美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC 700926)，其是E.coli K-12的亚株(美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC10798)。表1列出了诱导型启动子和相关基因的这些实例的核苷酸序列在E.coli MG1655中的基因组位置。如表1中基因组位置所指的核苷酸和其它遗传序列明确地通过引用引入本文。关于本文描述的E.coli启动子、基因和菌株的另外的信息可以在许多公开来源中发现，包括位于ecoliwiki.net的在线EcoliWiki资源。
阿拉伯糖启动子。(如本文中使用的，“阿拉伯糖”意思是L-阿拉伯糖。)参与阿拉伯糖利用的几种E.coli操纵子可通过阿拉伯糖诱导—araBAD、araC、araE和araFGH—但术语“阿拉伯糖启动子”和“ara启动子”通常用于指araBAD启动子。几个另外的术语已用于指E.coli araBAD启动子，如Para、ParaB、ParaBAD和PBAD。本文中“ara启动子”或以上给出的任何可选术语的使用意思是E.coli araBAD启动子。如可从另一术语“araC-araBAD启动子”的使用看到的，araBAD启动子被认为是双向启动子的部分，具有沿一个方向控制araBAD操纵子的表达的araBAD启动子，和与araBAD启动子紧密靠近且在araBAD启动子的相反链上沿另一方向控制araC编码序列的表达的araC启动子。AraC蛋白是araBAD启动子的正向和负向转录调节子。在不存在阿拉伯糖的情况下，AraC蛋白质阻遏由PBAD的转录，但在阿拉伯糖存在下，在结合阿拉伯糖时改变其构象的AraC蛋白质变成允许由PBAD的转录的正向调控元件。araBAD操纵子编码通过将L-阿拉伯糖经中间体L-核酮糖和L-核酮糖-磷酸转化成D-木酮糖-5-磷酸而代谢L-阿拉伯糖的蛋白质。为使由阿拉伯糖诱导启动子的表达的诱导最大化的目的，有利的是消除或降低催化L-阿拉伯糖至L-核酮糖的转化的AraA的功能和也任选地消除或降低AraB和AraD中至少一种的功能。消除或降低宿主细胞降低细胞中阿拉伯糖的有效浓度的能力(通过消除或降低细胞转化阿拉伯糖为其它糖的能力)允许更多的阿拉伯糖可用于阿拉伯糖诱导启动子的诱导。编码将阿拉伯糖移动到宿主细胞中的转录蛋白的基因是araE(其编码低亲和性L-阿拉伯糖质子共输送体)和araFGH操纵子(其编码ABC超家族高亲和性L-阿拉伯糖转录蛋白的亚基)。可以将L-阿拉伯糖转运到细胞中的其它蛋白质是LacY乳糖渗透酶的某些突变体：LacY(A177C)和LacY(A177V)蛋白，其分别具有177位的半胱氨酸或缬氨酸而不是丙氨酸(Morgan-Kiss等,“Long-term and homogeneous regulation of theEscherichia coli araBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxedspecificity”,Proc Natl Acad Sci USA 2002May 28；99(11):7373-7377)。为了获得阿拉伯糖诱导启动子的同质诱导，有利的是使得独立于阿拉伯糖的调节而将阿拉伯糖转运到细胞中。这可以通过消除或降低AraFGH转录蛋白的活性和改变araE的表达以使得其仅由组成型启动子转录来完成。araE的组成型表达可以通过消除或降低原始araE基因的功能并将包括由组成型启动子表达的AraE蛋白质的编码序列的表达构建体引入细胞中来完成。或者，在缺乏AraFGH功能的细胞中，控制宿主细胞的染色体araE基因表达的启动子可以从阿拉伯糖诱导启动子改变为组成型启动子。以类似的方式，作为阿拉伯糖诱导启动子的同质诱导的另外的替代方式，缺乏AraE功能的宿主细胞可以具有由组成型启动子表达的细胞存在的任何功能性AraFGH编码序列。作为另一替代方式，有可能通过用宿主染色体中的组成型启动子取代原始araE和araFGH启动子而由组成型启动子表达araE基因和araFGH操纵子两者。也可能消除或降低AraE和AraFGH阿拉伯糖转运蛋白两者的活性，且在该情况中使用LacY乳糖渗透酶中的突变(其允许这一蛋白质转运阿拉伯糖)。由于lacY基因的表达通常不是由阿拉伯糖调节的，LacY突变体如LacY(A177C)或LacY(A177V)的使用在阿拉伯糖诱导启动子通过阿拉伯糖的存在诱导时不导致“全或无”的诱导现象。因为LacY(A177C)蛋白表现为在转运阿拉伯糖到细胞中更有效，因此编码LacY(A177C)蛋白的多核苷酸的使用相对于编码LacY(A177V)蛋白的多核苷酸的使用是优选的。
丙酸盐启动子。“丙酸盐启动子”或“prp启动子”是E.coli prpBCDE操纵子的启动子，且也称为PprpB。像ara启动子一样，prp启动子是双向启动子的部分,该双向启动子沿一个方向控制prpBCDE操纵子的表达，并具有沿另一方向控制prpR编码序列的表达的prpR启动子。PrpR蛋白是prp启动子的转录调节子，并在PrpR蛋白结合2-甲基柠檬酸(“2-MC”)时激活prp启动子的转录。丙酸盐(也称为丙酸根)是丙酸(或“丙酸”)的离子CH3CH2COO-，并是共有具有通式H(CH2)nCOOH的“脂肪”酸类分子的特定性质的最小脂肪酸：在从水中盐析时产生油层并具有皂性钾盐。商业可得的丙酸盐一般作为丙酸的单价阳离子盐如丙酸钠(CH3CH2COONa)或作为二价阳离子盐如丙酸钙(Ca(CH3CH2COO)2)出售。丙酸盐是膜渗透的并通过由PrpE(丙酰-CoA合成酶)将丙酸盐转化成丙酰-CoA，并然后由PrpC(2-甲基柠檬酸合成酶)将丙酰-CoA转化成2-MC而代谢为2-MC。由prpBCDE操纵子编码的其它蛋白质，PrpD(2-甲基柠檬酸脱水酶)和PrpB(2-甲基异柠檬酸裂合酶)，参与2-MC转化为更小的产物如丙酮酸和琥珀酸的进一步分解代谢。为了最大化通过添加到细胞生长培养基中的丙酸盐对丙酸盐诱导启动子的诱导，因此希望的是具有PrpC和PrpE活性(以将丙酸盐转化成2-MC)但也有消除或降低的PrpD活性及任选地消除或降低的PrpB活性(以防止2-MC被代谢)的宿主细胞。编码参与2-MC生物合成的蛋白质另一操纵子是scpA-argK-scpBC操纵子，也称为sbm-ygfDGH操纵子。这些基因编码琥珀酸转化为丙酰-CoA需要的蛋白质，丙酰-CoA然后可以通过PrpC转化为2-MC。这些蛋白质的功能的消除或降低将除去用于产生2-MC诱导剂的平行途径，并因此可能降低丙酸盐诱导启动子的背景表达水平并提高丙酸盐诱导启动子对外源供应的丙酸盐的敏感性。已发现引入到E.coli BL21(DE3)中以产生菌株JSB的sbm-ygfD-ygfG-ygfH-ygfI的删除(Lee和Keasling,“A propionate-inducible expression systemfor enteric bacteria”,Appl Environ Microbiol 2005Nov；71(11):6856-6862))有助于降低不存在外源供应的诱导剂的情况下的背景表达，但这一删除也降低JSB菌株中由prp启动子的总体表达。但是，应当注意sbm-ygfD-ygfG-ygfH-ygfI删除也明显影响ygfI，其编码具有未知功能的推定LysR-家族转录调节子。基因sbm-ygfDGH作为一个操纵子转录，而ygfI从相反链转录。ygfH和ygfI编码序列的3'末端少量碱基对重叠，因而除去全部sbm-ygfDGH操纵子的删除也明显除去ygfI编码功能。消除或降低sbm-ygfDGH基因产物的子集如YgfG(也称为ScpB，甲基丙二酰-CoA脱羧酶)的功能或删除大部分sbm-ygfDGH(或scpA-argK-scpBC)操纵子的大部分而同时留下足够的ygfH(或scpC)基因的3'末端以使得ygfI的表达不受影响可能足以降低从丙酸盐诱导启动子的背景表达而不降低诱导表达的最高水平。
鼠李糖启动子。(如本文中使用的，“鼠李糖”意思是L-鼠李糖。)“鼠李糖启动子”或“rha启动子”或PrhaSR是E.coli rhaSR操纵子的启动子。像ara和prp启动子一样，rha启动子是双向启动子的部分，该双向启动子沿一个方向控制rhaSR操纵子的表达，且具有沿另一方向控制rhaBAD操纵子的表达的rhaBAD启动子。但是，rha启动子具有参与调节表达的两个转录调节子：RhaR和RhaS。RhaR蛋白质在鼠李糖存在下激活rhaSR操纵子的表达，而RhaS蛋白质分别激活L-鼠李糖分解代谢和转运操纵子(rhaBAD和rhaT)的表达(Wickstrum等,“TheAraC/XylS family activator RhaS negatively autoregulates rhaSR expression bypreventing cyclic AMP receptor protein activation”,J Bacteriol 2010Jan；192(1):225-232)。虽然RhaS蛋白质也可以激活rhaSR操纵子的表达，但实际上RhaS通过干扰环AMP受体蛋白质(CRP)与RhaR共激活表达到高得多的水平的能力而负向地自动调节这种表达。rhaBAD操纵子编码鼠李糖分解代谢蛋白RhaA(L-鼠李糖异构酶)，其转化L-鼠李糖为L-鼠李树胶糖(rhamnulose)；RhaB(鼠李树胶糖激酶)，其磷酸化L-鼠李树胶糖以形成L-鼠李树胶糖-1-P；和RhaD(鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶)，其转化L-鼠李树胶糖-1-P为L-乳醛(lactaldehyde)和DHAP(二羟基丙酮磷酸)。为使细胞中可供诱导鼠李糖诱导启动子的表达的鼠李糖量最大化，希望的是通过消除或降低RhaA或任选地RhaA及RhaB和RhaD中至少一种的功能来降低通过分解代谢降解的鼠李糖的量。E.coli细胞也可以通过由rmlBDACX(或rfbBDACX)操纵子编码的蛋白质RmlA、RmlB、RmlC和RmlD(也分别称为RfbA、RfbB、RfbC和RfbD)的活性从α-D-葡萄糖-1-P合成L-鼠李糖。为降低从鼠李糖诱导启动子的背景表达和增强外源供应的鼠李糖对鼠李糖诱导启动子诱导的敏感性，可能有利的是消除或降低RmlA、RmlB、RmlC和RmlD蛋白质中一种或多种的功能。L-鼠李糖通过RhaT，鼠李糖渗透酶或L-鼠李糖:质子共输送体，转运到细胞中。如上所述，RhaT的表达通过转录调节子RhaS激活。为使RhaT的表达独立于鼠李糖(其诱导RhaS的表达)的诱导，宿主细胞可以改变以使得细胞中所有功能性RhaT编码序列由组成型启动子表达。另外，RhaS的编码序列可以删除或灭活，以使得不产生功能性RhaS。通过消除或降低细胞中RhaS的功能，来自rhaSR启动子的表达水平由于不存在RhaS的负向自动调节而提高，且鼠李糖分解代谢操纵子rhaBAD的表达水平降低，从而进一步提高鼠李糖诱导来自rha启动子的表达的能力。
木糖启动子。(如本文中使用的，“木糖”意思是D-木糖。)木糖启动子或“xyl启动子”或PxylA意思是E.coli xylAB操纵子的启动子。木糖启动子区域在组织上与其它诱导型启动子类似，其中xylAB操纵子和xylFGHR操纵子在E.coli染色体上沿相反的方向由邻近木糖诱导启动子表达(Song和Park,“Organization and regulation of the D-xyloseoperons in Escherichia coli K-12:XylR acts as a transcriptional activator”,JBacteriol.1997Nov；179(22):7025-7032)。PxylA和PxylF启动子两者的转录调节子是XylR，其在木糖的存在下激活这些启动子的表达。xylR基因作为xylFGHR操纵子的部分表达或由位于xylH和xylR蛋白质编码序列之间的其自身的弱启动子(其不是由木糖诱导)表达。D-木糖通过XylA(D-木糖异构酶)分解代谢，其将D-木糖转化为D-木酮糖，D-木酮糖然后通过XylB(木酮糖激酶)磷酸化以形成D-木酮糖-5-P。为使细胞中可供诱导从木糖诱导启动子的表达的木糖量最大化，希望的是通过消除和降低至少XylA或任选地XylA和XylB两者的功能来降低通过分解代谢降解的木糖的量。xylFGHR操纵子编码XylF、XylG和XylH，ABC超家族高亲和性D-木糖转运蛋白的亚基。编码E.coli低亲和性木糖-质子共输送体的xylE基因代表单独的操纵子，其表达也可通过木糖诱导。为使木糖转运体的表达独立于木糖的诱导，宿主细胞可以改变以使得所有功能性木糖转运蛋白由组成型启动子表达。例如，xylFGHR操纵子可以改变以使得xylFGH编码序列被删除，留下XylR为由木糖诱导PxylF启动子表达的唯一活性蛋白质，并使xylE编码序列由组成型启动子而不是其原始启动子表达。作为另一实例，xylR编码序列由表达构建体中的PxylA或PxylF启动子表达，而xylFGHR操纵子被删除和xylE组成型地表达，或者可选地xylFGH操纵子(缺乏xylR编码序列，因为其存在于表达构建体中)由组成型启动子表达和xylE编码序列被删除或改变以使得它不产生活性蛋白质。
乳糖启动子。术语“乳糖启动子”指的是lacZYA操纵子的乳糖诱导启动子，也称为lacZp1的启动子；这一乳糖启动子位于E.coli K-12亚株MG1655的基因组序列(NCBIReference Sequence NC 000913.2,l l-JAN-2012)中的ca.365603-365568(负链，具有ca.365603-365598处的RNA聚合酶结合('-35')位点、365579-365573处的Pribnow盒('-10')和365567处的转录起始位点)。在一些实施方式中，本发明的可诱导共表达系统可以包含乳糖诱导启动子如lacZYA启动子。在其它实施方式中，本发明的可诱导共表达系统包含非乳糖诱导启动子的一个或多个诱导型启动子。
表1.E.coli诱导型启动子和相关基因的基因组位置[1]
Figure BDA0002582908380000191
Figure BDA0002582908380000201
Figure BDA0002582908380000211
Figure BDA0002582908380000221
Figure BDA0002582908380000231
表1的注解：
[1]所有基因组序列位置是指E.coli K-12亚株MG1655的基因组序列，其由National Center for Biotechnology Information(NCBI)作为NCBI ReferenceSequence NC 000913.2,11-JAN-2012提供。
[2]启动子区域的5'(或“上游”)末端的位置是近似的；对于“双向”启动子，在转录起始位点之间大致等距的核苷酸序列位置选择为这两个单个启动子的指定的5'“末端”。实际上，表达构建体的启动子部分可以在其5'末端具有比如表中所示的启动子序列稍少的序列，或它可以具有包括从如表中所示的启动子序列的5'(或“上游”)区域的另外序列的核苷酸序列，只要它保持以可诱导方式启动下游编码序列的转录的能力。
[3]Smith和Schleif,“Nucleotide sequence of the L-arabinose regulatoryregion of Escherichia coli K12”,J Biol Chem 1978Oct 10；253(19):6931-6933。
[4]“RNA pol”在整个表中指RNA聚合酶。
[5]Miyada等,“DNA sequence of the araC regulatory gene fromEscherichia coli B/r”,Nucleic Acids Res 1980Nov 25；8(22):5267-5274。
[6]Stoner和Schleif,“E.coli araE regulatory region araE codes for thelow affinity L-arabinose uptake protein”,GenBank Database Accession X00272.1,修正日期06-JUL-1989。
[7]Hendrickson等,“Sequence elements in the Escherichia coli araFGHprotomer”,J Bacteriol 1992Nov；174(21):6862-6871。
[8]美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay；图9。
[9]Wickstrum等,“The AraC/XylS family activator RhaS negativelyautoregulates rhaSR expression by preventing cyclic AMP receptor proteinactivation”,J Bacteriol 2010Jan；192(1):225-232。
[10]Vía等,“Transcriptional regulation of the Escherichia coli rhaTgene”,Microbiology 1996Jul；142(Pt 7):1833-1840。
[11]Song和Park,“Organization and regulation of the D-xylose operonsin Escherichia coli K-12:XylR acts as a transcriptional activator”,JBacteriol.1997Nov；179(22):7025-7032。
[12]Davis和Henderson,“The cloning and DNA sequence of the gene xylEfor xylose-proton symport in Escherichia coli K12”,J Biol Chem 1987Oct 15；262(29):13928-13932。
表达构建体。表达构建体是设计用于一个或多个目标基因产物的表达的多核苷酸，并因此不是天然发生的分子。表达构建体可以整合到宿主细胞染色体中或作为独立于宿主细胞染色体复制的多核苷酸分子(如质粒或人工染色体)保持在宿主细胞内。表达构建体的实例是由一个或多个多核苷酸序列插入到宿主细胞染色体中而得到的多核苷酸，其中插入的多核苷酸序列改变染色体编码序列的表达。表达载体是特别地用于一个或多个基因产物的表达的质粒表达构建体。一个或多个表达构建体可以整合到宿主细胞染色体中或保持在染色体外多核苷酸如质粒或人工染色体上。以下是可在用于基因产物共表达的表达构建体中使用的特定类型的多核苷酸序列的说明。
复制起点。表达构建体必须包含复制起点(也称为复制子)以作为独立复制的多核苷酸保持在宿主细胞内。使用相同的复制机制的不同复制子不能通过重复的细胞分裂一起保持在单一宿主细胞中。结果，质粒可以根据它们包含的复制起点分类到不相容性组中，如表2中所示。
表2.用于表达构建体中的复制起点和代表性质粒[1]
Figure BDA0002582908380000251
表2的注解：
[1]采自www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/Protocols/ORIs.html,及Sambrook和Russell,“Molecular Cloning:A laboratory manual”,3rd Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001。
[2]Kües和Stahl,“Replication of plasmids in gram-negative bacteria”,Microbiol Rev 1989Dec；53(4):491-516。
[3]pPRO33质粒(美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay)可从Addgene(www.addgene.org)作为Addgene质粒17810获得。
[4]openwetware.org/wiki/CH391L/S12/Origins_of_Replication；03Aug 2013访问。
复制起点在其它标准中可特别地基于不相容性组、拷贝数和/或宿主范围选择用于表达构建体中。如上所述，如果两个或更多个不同表达构建体用于相同宿主细胞中以共表达多个基因产物，不同表达构建体包含来自不同不相容性组的复制起点的情况是最好的：例如，一个表达构建体中的pMB1复制子和另一表达构建体中的p15A复制子。细胞中相对于宿主染色体分子数的表达构建体平均拷贝数通过该表达构建体中包含的复制起点确定。拷贝数范围可以从每细胞几个拷贝到几百个(表2)。在本发明的一个实施方式中，使用包含通过相同诱导剂激活的诱导型启动子但具有不同复制起点的不同表达构建体。通过选择将各不同表达构建体以特定的近似拷贝数保持在细胞中的复制起点，有可能相对于从不同表达构建体表达的另一基因产物调整从一个表达构建体表达的基因产物的总体产生水平。举例来说，为共表达多聚蛋白质的亚基A和B，产生包含colEl复制子、ara启动子和由ara启动子表达的亚基A的编码序列的表达构建体：“colEl-Para-A”。产生包含p15A复制子、ara启动子和亚基B的编码序列的另一表达构建体：“p15A-Para-B”。这两个表达构建体可以一起保持在相同宿主细胞中，且亚基A和B两者的表达通过添加一种诱导剂(阿拉伯糖)到生长培养基中诱导。如果亚基A的表达水平需要相对于亚基B的表达水平显著提高以使得这两个亚基的表达量的化学计量比更接近于所需的比率，例如，可以产生具有如在pUC9质粒的复制起点(“pUC9ori”)中发现的修饰pMB1复制子的用于亚基A的新表达构建体：pUC9ori-Para-A。从高拷贝数表达构建体如pUC9ori-Para-A表达亚基A应当相对于从p15A-Para-B的亚基B表达提高所产生的亚基A的量。以相似的方式，使用以较低拷贝数保持表达构建体的复制起点如pSC101可以降低从该构建体表达的基因产物的总体水平。复制起点的选择也可以确定哪些宿主细胞可以保持包含该复制子的表达构建体。例如，包含colEl复制起点的表达构建体具有相对窄的可用宿主范围，肠杆菌科内的物种，而包含RK2复制子的表达构建体可以保持在E.coli、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginsa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、棕色固氮菌(azotobacter vinelandii)和真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)中，且如果表达构建体包含RK2复制子和来自RK2质粒的一些调节基因，它可以保持在多样的如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcocaceticus)和球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的宿主细胞中(Kües和Stahl,“Replication of plasmids in gram-negative bacteria”,Microbiol Rev 1989Dec；53(4):491-516)。
类似的考虑可以用于建立在真核细胞中可诱导共表达的表达构建体。例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2-微米环状质粒与来自其它酵母菌株的质粒如pSR1(ATCC保藏No.48233和66069；Araki等,“Molecular and functional organization ofyeast plasmid pSR1”,J Mol Biol 1985Mar 20；182(2):191-203)和pKD1(ATCC保藏No.37519；Chen等,“Sequence organization of the circular plasmid pKD1 from theyeast Kluyveromyces drosophilarum”,Nucleic Acids Res 1986Jun 11；14(11):4471-4481)相容。
选择标记。表达构建体通常包含编码宿主细胞在选择培养基中存活或生长必需的蛋白质的选择基因，也称为选择标记。不包含含有选择基因的表达构建体的宿主细胞在培养基中不能存活。典型的选择基因编码赋予对抗生素或其它毒素的抗性的或补充宿主细胞的营养缺陷型的蛋白质。选择方案的一个实例利用药物如抗生素以抑止宿主细胞的生长。包含含有选择标记的表达构建体的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质并从选择方案存活下来。通常用于选择标记的选择的抗生素(及表示提供抗生素抗性表型的基因的缩写)的一些实例是：氨苄青霉素(AmpR)、氯霉素(CmlR或CmR)、卡那霉素(KanR)、壮观霉素(SpcR)、链霉素(StrR)和四环素(TetR)。表2中的许多代表性质粒包含选择标记如pBR322(AmpR,TetR)；pMOB45(CmR,TetR)；pACYC177(AmpR,KanR)和pGBM1(SpcR,StrR)。通常包括选择基因的原始启动子区域以及其基因产物的编码序列作为表达构建体的选择标记部分的一部分。或者，选择基因的编码序列可以由组成型启动子表达。
诱导型启动子。如本文中描述的，存在几种可作为本发明可诱导共表达系统的部分包括在表达构建体中的不同诱导型启动子。优选的诱导型启动子与通过参照E.coli K-12亚株MG1655基因组序列在表1中定义的启动子多核苷酸序列的至少30(更优选至少40，和最优选至少50)个连续碱基共有至少80％的多核苷酸序列同一性(更优选至少90％同一性，和最优选至少95％同一性)，其中百分多核苷酸序列同一性使用实施例13的方法确定。在“标准”诱导条件下(参见实施例5)，优选的诱导型启动子具有相应的E.coli K-12亚株MG1655的“野生型”诱导型启动子强度的至少75％(更优选至少100％，和最优选至少110％))，如使用De Mey等的定量PCR方法测定的(实施例8)。在表达构建体内，诱导型启动子设置于可诱导地表达的基因产物的编码序列的5'侧(或“上游”)，以使得诱导型启动子的存在将沿相对于编码基因产物的多核苷酸编码链的5'-3'方向指导基因产物编码序列的转录。
核糖体结合位点。对于多肽基因产物，转录起始位点和待可诱导地表达的基因产物编码序列的起始密码子之间区域的核苷酸序列对应于多肽基因产物的mRNA的5'非翻译区(“UTR”)。优选地，对应于5'UTR的表达构建体区域包含类似于在宿主细胞物种中发现的共有核糖体结合位点(RBS，也称为Shine-Dalgarno序列)的多核苷酸序列。在原核生物(古细菌(archaea)和细菌)中，RBS共有序列是GGAGG或GGAGGU，且在细菌如E.coli中，RBS共有序列是AGGAGG或AGGAGGU。RBS通常与起始密码子分隔5-10个插入核苷酸。在表达构建体中，RBS序列优选与AGGAGGU共有序列至少55％相同，更优选至少70％相同，和最优选至少85％相同，且与起始密码子分隔5-10个插入核苷酸，更优选6-9个插入核苷酸，和最优选6-7插入核苷酸。给定RBS产生所需的翻译起始率的能力可以在网站salis.psu.edu/software/RBSLibraryCalculatorSearchMode上使用RBS Calculator计算；相同的工具可用于对于100,000+倍范围的翻译率优化合成的RBS(Salis,“The ribosome binding sitecalculator”,Methods Enzymol 2011；498:19-42)。
多克隆位点。多克隆位点(MCS)，也称为多接头，是包含彼此密切靠近或彼此重叠的多个限制性位点的多核苷酸。MCS中的限制性位点通常在MCS序列内出现一次，且优选地不在质粒的其余部分或其它多核苷酸构建体内存在，从而允许限制性酶仅在MCS内切割质粒或其它多核苷酸构建体。MCS序列的实例是表达载体的pBAD系列(包括pBAD18、pBAD18-Cm、pBAD18-Kan、pBAD24、pBAD28、pBAD30和pBAD33)中的那些(Guzman等,“Tightregulation,modulation,and high-level expression by vectors containing thearabinose PBAD promoter”,J Bacteriol 1995Jul；177(14):4121-4130)；或源自pBAD载体的pPRO系列表达载体(如pPRO18、pPRO18-Cm、pPRO18-Kan、pPRO24、pPRO30和pPRO33)中的那些(美国专利No.8178338B2；May 152012；Keasling,Jay)。多克隆位点可以用于建立表达构建体：通过将多克隆位点置于启动子序列的3'侧(或下游)，MCS可用于将待共表达的基因产物的编码序列插入到构建体中相对于启动子的适当位置，以使得编码序列的转录发生。取决于哪些限制性酶用于在MCS内切割，在编码序列或其它多核苷酸序列插入到表达构建体中后有可能某些部分的MCS序列保留在表达构建体内。任何残留的MCS序列可以在插入序列的上游或下游或两侧。核糖体结合位点可以置于MCS的上游，优选紧邻MCS或与MCS仅分隔几个核苷酸，在该情况中RBS在插入MCS中的任何编码序列的上游。另一替代方式是包括MCS内的核糖体结合位点，在该情况中用于在MCS内切割的限制性酶的选择将决定是否RBS保留且与插入序列具有什么样的关系。进一步的替代方式是包括将在MCS处插入到表达构建体中，优选与任何编码序列具有适当关系的多核苷酸序列内的RBS，以刺激从转录的信使RNA的翻译起始。
从组成型启动子的表达。本发明的表达构建体也可以包含从组成型启动子表达的编码序列。与诱导型启动子不同，组成型启动子在大多数生长条件下启动连续的基因产物产生。组成型启动子的一个实例是Tn3 bla基因的组成型启动子，Tn3 bla基因编码β-内酰胺酶且造成通过许多质粒(包括pBR322(ATCC 31344)、pACYC177(ATCC 37031)和pBAD24(ATCC 87399))赋予宿主细胞的氨苄青霉素抗性(AmpR)表型。可用于表达构建体中的另一组成型启动子是E.coli脂蛋白基因,lpp(其位于E.coli K-12亚株MG1655中的位置1755731-1755406(正链)处)的启动子(Inouye和Inouye,“Up-promoter mutations in theIpp gene of Escherichia coli”,Nucleic Acids Res 1985May 10；13(9):3101-3110)。已用于在E.coli中异质基因表达的组成型启动子的进一步实例是trpLEDCBA启动子，其位于E.coli K-12亚株MG1655的位置1321169-1321133(负链)(Windass等,“Theconstruction of a synthetic Escherichia coli trp promoter and its use in theexpression of a synthetic interferon gene”,Nucleic Acids Res 1982Nov 11；10(21):6639-6657)。组成型启动子可用于表达构建体中以用于选择标记的表达，如本文中所述，且也用于可用于共表达所需产物的其它基因产物的组成型表达。例如，诱导型启动子的转录调节子如AraC、PrpR、RhaR和XylR，如果不由双向诱导型启动子表达，可以替代地在与它们调节的诱导型启动子相同的表达构建体上或在不同的表达构建体上由组成型启动子表达。类似地，可用于诱导剂如PrpEC、AraE或Rha的产生或转运的基因产物或者改变细胞的还原-氧化环境的蛋白质，举例来说，可以由表达构建体内的组成型启动子表达。可用于共表达基因产物的产生的基因产物及最终的所需产物也包括伴侣蛋白、辅因子转录蛋白等。
信号肽。通过本发明的方法共表达的多肽基因产物可以包含信号肽或缺乏信号肽，这取决于是否希望这类基因产物分别从宿主细胞胞质输出到周质中或保留在胞质中。信号肽(也称为信号序列、前导序列或前导肽)结构上特征在于具有形成单一α-螺旋倾向的疏水氨基酸的延伸段，大约5-20个氨基酸长且通常约10-15个氨基酸长。这种疏水性延伸段通常之前紧接富含带正电的氨基酸(特别是赖氨酸)的较短延伸段。未从成熟多肽切除的信号肽通常以被信号肽酶识别和切割的氨基酸延伸段结束。信号肽功能上特征在于在翻译同时或翻译后直接转运多肽通过原核生物的质膜(或革兰氏阴性细菌如E.coli的内膜)或转运到真核细胞的内质网中的能力。例如，信号肽使得多肽能够被转运到宿主细胞如E.coli的周质空间中的程度可以使用如实施例12中提供的方法通过分离周质蛋白质和保留在胞质中的蛋白质来确定。
宿主细胞。本发明的可诱导共表达系统设计为表达多个基因产物；在本发明的某些实施方式中，基因产物在宿主细胞中共表达。提供了允许多聚产物的成分高效和经济地可诱导共表达的宿主细胞的实例。除了培养物中分离的细胞外，宿主细胞还可以包括作为多细胞生物体的部分的细胞或在不同的生物体或生物体系统内生长的细胞。另外，本发明的可诱导共表达系统的表达构建体可以用于无细胞系统中，如基于麦胚抽提物或基于细菌细胞抽提物的那些，如使用E.coli提取物和孵育设备如RTS ProteoMaster(RocheDiagnostics GmbH；Mannheim,Germany)的连续交换无细胞(CECF)蛋白质合成系统(Jun等,“Continuous-exchange cell-free protein synthesis using PCR-generated DNA andan RNase E-deficient extract”,Biotechniques 2008Mar；44(3):387-391)。
原核宿主细胞。在本发明的一些实施方式中，设计用于基因产物共表达的表达构建体提供在宿主细胞中，优选原核宿主细胞。原核宿主细胞可以包括古细菌(如沃氏盐杆菌(Haloferax volcanii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus))、革兰氏阳性细菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans))或革兰氏阴性细菌，包括α-变形菌(Alphaproteobacteria)(根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、新月柄杆菌、球形红细菌和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))、β-变形菌(Betaproteobacteria)(真养产碱杆菌)和γ-变形菌(Gammaproteobacteria)(乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和恶臭假单胞菌)。优选的宿主细胞包括肠杆菌科的γ-变形菌，如肠杆菌属(Enterobacter)、欧文菌属(Erwinia)、埃希氏杆菌属(Escherichia)(包括E.coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(包括粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)。
真核宿主细胞。许多另外类型的宿主细胞可以用于本发明的可诱导共表达系统，包括真核细胞如酵母(休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、其它克鲁维酵母菌种、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母、巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)，也称为卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酵母(Dekkera)/酒香酵母(Brettanomyces)种和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))；其它真菌(构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、里氏木霉(Trichoderma reesia))；昆虫细胞系(果蝇(Drosophilamelanogaster)Schneider 2细胞和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞)；和哺乳动物细胞系包括永生化细胞系(中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾(HEK,293或HEK-293)细胞和人肝细胞癌细胞(Hep G2))。上述宿主细胞可从美国典型培养物保藏中心获得。
宿主细胞基因功能的改变。可以对包含可诱导表达构建体的宿主细胞的基因功能进行某些改变以促进诱导剂对宿主细胞群体的有效和同质诱导。优选地，表达构建体、宿主细胞基因型和诱导条件的组合导致培养物中的至少75％(更优选至少85％，和最优选至少95％)的细胞由各诱导的启动子表达基因产物，如通过实施例8中描述的Khlebnikov等的方法测量的。对于E.coli以外的宿主细胞，这些改变可以涉及结构上与E.coli基因相似的基因或者完成宿主细胞内与E.coli基因的功能相似的功能的基因的功能。宿主细胞基因功能的改变包括通过删除整体的基因蛋白质-编码序列，或删除基因的足够大的部分、将序列插入基因中或另外地改变基因序列以使得从该基因形成降低的功能性基因产物水平而消除或降低基因功能。宿主细胞基因功能的改变也包括通过例如改变原始启动子以产生指导基因的更高转录水平的更强启动子或将无义突变引入产生更高活性的基因产物的蛋白质-编码序列中而提高基因功能。宿主细胞基因功能的改变包括以任何方式改变基因功能，包括例如改变原始诱导型启动子以产生组成型激活的启动子。除了对于诱导剂转运和代谢的基因功能的改变(如本文中对于诱导型启动子所描述的)和伴侣蛋白表达的改变外，也可能改变碳分解代谢产物阻遏(CCR)调控系统和/或宿主细胞的还原-氧化环境。
碳分解代谢产物阻遏(CCR)。宿主内活性CCR调控系统的存在可以影响诱导剂激活从诱导型启动子的转录的能力。例如，当宿主细胞如E.coli在含葡萄糖的培养基中生长时，利用其它碳源所需要的基因如araBAD和prpBCDE操纵子以低水平(如果有的话)表达，即使阿拉伯糖或丙酸盐诱导剂也存在于生长培养基中。也存在葡萄糖以外碳源利用的等级：如在ara和prp诱导型启动子系统的情况中，其中阿拉伯糖的存在降低丙酸盐诱导从prpBCDE启动子的表达的能力(Park等,“The mechanism of sugar-mediated cataboliterepression of the propionate catabolic gene in Escherichia coli”,Gene 2012Aug1；504(1):116-121；Epub 2012May 3)。因此，细胞的CCR机制使得其更难以在可诱导共表达系统中使用两种或更多种碳源诱导剂，因为作为优选碳源的诱导剂的存在抑制较不优选碳源的诱导。Park等作者尝试通过使用产生改变的cAMP受体蛋白质(其可以独立于cAMP发挥功能)的突变体crp基因或参与CCR调节的PTS(磷酸转移酶系统)基因的缺失缓解阿拉伯糖对prp启动子的阻遏；两种途径大部分是成功的。但是，Park等作者使用的PTS-敲除的菌株是基于菌株TP2811，其是E.coli ptsHI-crr操纵子的删除(Hernández-Montalvo等,“Characterization of sugar mixtures utilization by an Escherichia coli mutantdevoid of the phosphotransferase system”,Appl Microbiol Biotechnol 2001Oct；57(1-2):186-191)。整个ptsHI-crr操纵子的删除已发现比仅crr基因的删除更显著地影响总cAMP合成(Lévy等,“Cyclic AMP synthesis in Escherichia coli strains bearingknown deletions in the pts phosphotransferase operon”,Gene 1990Jan 31；86(1):27-33)。不同的途径是消除或降低宿主细胞中ptsG基因的功能，其编码葡萄糖特异性EII A(EII Aglc)，E.coli中CCR的一种关键元件(Kim等,“Simultaneous consumption ofpentose and hexose sugars:an optimal microbial phenotype for efficientfermentation of lignocellulosic biomass”,Appl Microbiol Biotechnol 2010Nov；88(5):1077-1085,Epub 2010Sep 14)。宿主细胞如E.coli的基因组中的另一改变(其导致增加的prp启动子的转录)是消除或降低其编码AscG的ascG基因的基因功能。AscG是β-D-葡苷糖利用操纵子ascFB在正常生长条件下的阻遏物，且也阻遏prp启动子的转录；AscG编码序列的破坏已显示增加从prp启动子的转录(Ishida等,“Participation of regulator AscGof the beta-glucoside utilization operon in regulation of the propionatecatabolism operon”,J Bacteriol 2009Oct；191(19):6136-6144；Epub 2009Jul 24)。进一步的替代方式是通过将可由较不优选的碳源诱导剂诱导的启动子的转录调节子置于强组成型启动子的控制下或更优选的碳源诱导剂的控制下增加其表达。例如，为提高在更优选的阿拉伯糖存在下较不优选的碳源木糖的利用所需的基因的诱导，XylR的编码序列置于E.coli araBAD操纵子中(Groff等,“Supplementation of intracellular XylR leads tocoutilization of hemicellulose sugars”,Appl Environ Microbiol 2012Apr；78(7):2221-2229,Epub 2012Jan 27)。包含可诱导共表达构建体的宿主细胞因此优选包括对于可由较不优选的碳源诱导剂诱导的启动子的转录调节子的提高的基因功能水平及对于涉及CCR系统的基因如crr和/或ptsG和/或ascG的消除或降低的基因功能水平。
亚铁血红素和其它辅因子的细胞转录。当使用本发明的可诱导共表达系统产生需要辅因子发挥功能的酶时，有利的是使用能够从可得的前体合成辅因子或将其从环境摄取的宿主细胞。常见的辅因子包括ATP、辅酶A、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、NAD+/NADH和亚铁血红素。亚铁血红素基团包含称为卟啉的大的杂环有机环中心的铁离子。最常见类型的亚铁血红素基团是亚铁血红素B；其它主要的类型是亚铁血红素A、亚铁血红素C和亚铁血红素O，其在卟啉的侧链中发生变化。氯高铁血红素是亚铁血红素B的氯盐且可以作为亚铁血红素源添加到细菌生长培养基中。亚铁血红素的其它潜在来源包括细胞色素、血红蛋白和含血红蛋白的物质如血液。源自E.coli K12的E.coli实验室菌株通常缺乏外膜亚铁血红素受体，且因此不转运亚铁血红素到细胞中，从而不能在其中亚铁血红素是唯一铁源的培养基中生长。E.coli的病原性菌株如O157:H7和CFT073包含不存在于E.coli K12中的和含有编码参与亚铁血红素摄取和利用的蛋白质的两个相异转录的操纵子(chuAS操纵子和chuTWXYUhmuV操纵子)的大约9-kb基因组片段。这一基因组片段在E.coli CFT073中发现并包括4,084,974-4,093,975位的NCBI Reference Sequence NC 004431.1(20-JAN-2012)。用chuA基因(例如，NCBI Gene ID No.1037196)(其编码外膜氯高铁血红素特异性受体)的转化足以赋予K12-来源的E.coli菌株以氯高铁血红素作为铁源生长的能力(Torres和Payne,“Haem iron-transport system in enterohaemorrhagic Escherichia coliO157:H7”,Mol Microbiol 1997Feb；23(4):825-833)。除ChuA外，一些其它的异源亚铁血红素受体可以允许E.coli K12-来源的菌株摄取亚铁血红素：小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)HemR、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)HasR和痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteria)ShuA；和来自革兰氏阴性细菌：百日咳杆菌(Bordatellapertussis)和支气管败血波氏杆菌(B.bronchiseptica)BhuR、绿脓假单胞菌PhuR和荧光假单胞菌(P.fluorescens)PfhR。ChuS蛋白也参与亚铁血红素的利用：它是亚铁血红素降解的亚铁血红素加氧酶。在E.coli aroB菌株(它是铁螯合分子肠杆菌素合成缺陷的)中，用chuS的转化可用于降低由于在不存在肠杆菌素情况下以氯高铁血红素生长引起的细胞毒性。当Fur与Fe2+结合时，chuAS和chuTWXYUhmuV操纵子及几个参与铁代谢且存在于E.coli K12菌株中的其它操纵子的转录被E.coli Fur转录调节子阻遏；这些基因的转录因此在细胞内铁离子浓度存在下降时激活。
宿主细胞如E.coli K12-来源的菌株可以通过用包含至少chuA的chuAS–chuTWXYUhmuV区域的全部或部分或用chuAS操纵子(任选地包括来自chuTWXYUhmuV操纵子的另外的基因)转化来改变以使得它们能够摄取亚铁血红素。在其中指导chuA转录的启动子可被Fur阻遏的实施方式中，Fur阻遏可以通过删除编码Fur的宿主细胞基因、通过在不存在游离铁的情况下生长宿主细胞、通过在存在游离铁离子的螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)的情况下生长宿主细胞或通过用包含多个拷贝的Fur结合位点的多核苷酸构建体(如以高拷贝数保持的质粒)转化细胞以减少可用于铁代谢操纵子阻遏的Fur-Fe2+复合物的量而消除或降低。在优选的实施方式中，表达构建体引入宿主细胞中，其中表达构建体包含在组成型启动子的转录控制下编码ChuA及也任选地编码ChuS的多核苷酸。
宿主细胞还原-氧化环境。许多多聚基因产物如抗体包含二硫键。E.coli和许多其它细胞的胞质正常情况下通过硫氧还蛋白和谷氧还蛋白/谷胱甘肽酶系统维持在还原状态中。这排除了胞质中二硫键的形成，且需要二硫键的蛋白质输出到其中二硫键形成和异构化通过包含DsbABCD和DsbG的Dsb系统催化的周质中。增加的半胱氨酸氧化酶DsbA、二硫键异构酶DsbC或Dsb蛋白的组合(其全都正常地转运到周质中)的表达已用于需要二硫键的异源蛋白质的表达中(Makino等,“Strain engineering for improved expression ofrecombinant protein in bacteria”,Microb Cell Fact 2011May 14；10:32)。也可能表达这些Dsb蛋白质的胞质形式，如DsbC的胞质形式(“cDsbC”),其缺乏信号肽且因此不转运到周质中。胞质Dsb蛋白质如cDsbC可用于使得宿主细胞的胞质更高氧化且因此更有助于胞质中产生的异源蛋白质中二硫键的形成。宿主细胞胞质也可以通过直接改变硫氧还蛋白和谷氧还蛋白/谷胱甘肽酶系统使得更高氧化：谷胱甘肽还原酶(gor)或谷胱甘肽合成酶(gshB)以及硫氧还蛋白还原酶(trxB)缺陷的突变体菌株赋予胞质氧化性。这些菌株不能够还原核糖核苷酸并因此不能在不存在外源还原剂如二硫苏糖醇(DTT)的情况下生长。编码过氧化物氧化还原蛋白(peroxiredoxin)AhpC的基因ahpC中的抑制基因突变(ahpC*)将其转化为产生还原的谷胱甘肽的二硫键还原酶，从而允许电子输送到酶核糖核苷酸还原酶和使得gor和trxB缺陷或gshB和trxB缺陷的细胞能够在DTT不存在下生长。不同种类的AhpC突变形式可以允许γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(gshA)活性缺陷的和trxB缺陷的菌株在DTT不存在下生长；这些包括AhpC V164G、AhpC S71F、AhpC E173/S71F、AhpC E171Ter和AhpCdup162-169(Faulkner等,“Functional plasticity of a peroxidase allows evolutionof diverse disulfide-reducing pathways”,Proc Natl Acad Sci U S A 2008May 6；105(18):6735-6740,Epub 2008May 2)。在具有氧化的胞质的这类菌株中，暴露的蛋白质半胱氨酸在硫氧还蛋白以其反向生理功能催化的过程中变得更容易氧化，从而导致二硫键的形成。
可对宿主细胞进行的另一改变是从宿主细胞胞质中酵母线粒体的内膜空间表达巯基氧化酶Erv1p，其已显示在E.coli的胞质中甚至在不存在gor或trxB中的突变的情况下增加多种复合物，真核生物起源的二硫键键合的蛋白质的产生(Nguyen等,“Pre-expression of a sulfhydryl oxidase significantly increases the yields ofeukaryotic disulfide containing protein expressed in the cytoplasm of E.coli”Microb Cell Fact 2011Jan 7；10:1)。包含可诱导共表达构建体的宿主细胞优选也表达cDsbC和/或Erv1p，是trxB基因功能缺乏的，也是gor、gshB或gshA的基因功能缺乏的，且表达AhpC的适当突变体形式，以使得宿主细胞可以在DTT不存在下生长。
多肽基因产物的糖基化。宿主细胞可以具有其使多肽糖基化的能力的改变。例如，真核宿主细胞可以具有糖基转移酶和/或寡糖转移酶基因的消除或降低的基因功能，从而损害多肽形成糖蛋白的正常真核糖基化。不使多肽正常糖基化的原核宿主细胞如E.coli可以改变以表达提供糖基化功能的一组真核生物和原核生物基因(DeLisa等,“Glycosylatedprotein expression in prokaryotes”,WO2009089154A2,2009Jul 16)。
具有改变的基因功能的可用宿主细胞株。为产生用于本发明的可诱导共表达系统和方法中的优选宿主细胞株，有利的是以早已包含所需遗传改变的株开始(表3)。
表3.宿主细胞株
Figure BDA0002582908380000361
改变宿主细胞基因功能的方法。具有许多本领域中已知用于进行宿主细胞基因的改变以消除、降低或改变基因功能的方法。进行宿主细胞如E.coli和其它原核细胞中基因的靶向破坏的方法已经被描述(Muyrers等,“Rapid modification of bacterialartificial chromosomes by ET-recombination”,Nucleic Acids Res 1999Mar 15；27(6):1555-1557；Datsenko和Wanner,“One-step inactivation of chromosomal gene inEscherichia coli K-12using PCR products”,Proc Natl Acad Sci U S A 2000Jun 6；97(12):6640-6645)，且使用类似的Red/ET重组方法的试剂盒是商购可得的(例如，来自Gene Bridges GmbH,Heidelberg,德国的Quick&Easy E.coli Gene Deletion Kit)。在本发明的一个实施方式中，宿主细胞的一个或多个基因的功能通过鉴定待破坏基因的编码序列内的核苷酸序列(如本文中通过引用序列的基因组位置并入的E.coli K-12亚株MG1655编码序列中的一个)，和更特别地通过选择该编码序列内各50个核苷酸的两个邻接延伸段而消除或降低。Quick&Easy E.coli Gene Deletion Kit然后按照制造商的指示用于将含有选择标记的多核苷酸构建体插入到所选择的编码序列的邻接延伸段之间，从而消除或降低基因的正常功能。Red/ET重组方法也可以用于以预测促进特定转录水平的不同启动子如组成型启动子或人工启动子的序列替换启动子序列(De Mey等,“Promoter knock-in:anovel rational method for the fine tuning of gene”,BMC Biotechnol 2010Mar 24；10:26)。宿主细胞基因的功能也可以通过RNA沉默方法消除或降低(Man等,“Artificialtrans-encoded small non-coding RNAs specifically silence the selected geneexpression in bacteria”,Nucleic Acids Res 2011Apr；39(8):e50,Epub 2011Feb 3)。此外，改变宿主细胞基因功能的已知突变可以通过传统的遗传方法引入宿主细胞中。
本发明的可诱导共表达系统
本发明的可诱导共表达系统涉及包含两个或更多个表达构建体的宿主细胞，其中表达构建体包含指导基因产物的表达的诱导型启动子，且宿主细胞具有允许基因产物的同质诱导表达的改变的基因功能。图1显示本发明的可诱导共表达系统的示意性图解，其具有以下成分：(1)宿主细胞，(2)宿主基因组(包括遗传改变),(3)包含指导基因产物表达的诱导型启动子的表达载体“X”，(4)包含指导另一基因产物表达的诱导型启动子的不同表达载体“Y”，(5)表达的化学诱导剂和(6)多聚的共表达产物。
图2显示本发明可诱导共表达系统的特定实施例的示意性图解，其在带有允许可同质诱导的表达的适宜基因组改变的E.coli宿主细胞中与pPRO33表达载体(美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay)上的丙酸盐诱导启动子(prpBCDE启动子)结合利用pBAD24表达载体上的araBAD启动子。以这种方式，可以实现多聚产物各成分的表达的紧密控制和优化以用于多种共表达应用中。在这一实施方式中，宿主细胞(1)是通常用于蛋白质表达领域中的革兰氏阴性细菌大肠杆菌。宿主基因组(2)是具有利于同质诱导蛋白质共表达的突变或其它改变的宿主细胞生物体的基因组，包括缺乏信号肽的二硫键异构酶DsbC的胞质形式的表达。在这一实施方式中，基因组改变包括araBAD操纵子敲除突变及从组成型启动子的araE和araFGH的表达或araEFGH缺陷背景中lacY基因(A117C)中的点突变以利于用外源施加的L-阿拉伯糖对质粒基ara启动子的同质诱导，且也包括灭活的丙酸盐代谢基因prpD以利于用外源施加的丙酸盐(其在体内转化为2-甲基柠檬酸盐)对质粒基丙酸盐启动子的同质诱导。可用于可诱导共表达系统且可以引入宿主细胞中的其它基因组改变包括，但不限于：scpA-argK-scpBC操纵子的靶向灭活以减少从prpBCDE启动子的背景表达；从L-阿拉伯糖诱导启动子如araBAD启动子的较不优选碳源(丙酸盐)的转录调节子(prpR)的表达和/或参与CCR系统的基因如crr和/或ptsG的消除或降低的基因功能以避免在L-阿拉伯糖存在下丙酸盐对诱导的CCR系统的抑制；谷胱甘肽还原酶(gor)或谷胱甘肽合成酶(gshB)以及硫氧还蛋白还原酶(trxB)的基因功能水平的降低和/或宿主细胞胞质中酵母线粒体巯基氧化酶Erv1p的表达以提供宿主细胞胞质中强度较低的还原环境和促进二硫键形成；伴侣蛋白如DnaK/DnaJ/GrpE、DsbC/DsbG、GroEL/GroES、IbpA/IbpB、Skp、Tig(触发因子)和/或FkpA的提高的表达水平(如从强组成型启动子)；和其它突变以降低内源蛋白酶活性(如Lon和OmpT蛋白酶的活性)和重组酶活性。
如图2中所示，两个相容的表达载体(3,4)保持在宿主细胞中以允许两个不同基因产物的同时表达(共表达)。在这一实施方式中，一个表达载体(“L-阿拉伯糖诱导的表达载体”)包含L-阿拉伯糖诱导的启动子，并与pBAD或其中araBAD启动子驱动克隆到多克隆位点(MCS)中的插入表达序列的表达的相关质粒相似或相同。L-阿拉伯糖诱导的表达载体也包含抗生素抗性基因(如Tn3 bla基因，其编码β-内酰胺酶并赋予对氨苄青霉素的抗性)的编码序列以利于包含完整表达载体的宿主细胞(细菌集落)的选择。复制起点(ORI)是细菌宿主细胞内质粒的扩增需要的。L-阿拉伯糖诱导的表达质粒也包含编码araC(一种允许araBAD启动子的L-阿拉伯糖诱导)的多核苷酸序列，且通过转录阻遏降低非诱导状态中的“泄漏(leaky)”背景表达。其它表达载体(“丙酸盐诱导的表达载体”)与pPRO或其中丙酸盐诱导的启动子驱动克隆到多克隆位点(MCS)中的插入表达序列的表达的相关质粒相似或相同。质粒也包含抗生素抗性基因(如编码氯霉素乙酰转移酶的cat基因，其赋予对氯霉素的抗性)的编码序列以利于包含完整表达载体的宿主细胞的选择。复制起点(ORI)是细菌宿主细胞内质粒的扩增需要的。另外，丙酸盐诱导的表达载体包含编码prpR(一种允许prpBCDE启动子的丙酸盐(2-甲基柠檬酸盐)诱导的转录调节子)的多核苷酸序列，且降低非诱导状态中的“泄漏”背景表达。为利于诱导的单独滴定、质粒相容性和表达载体的共扩增，有利的是,表达载体包含响应于不同诱导剂的启动子、相容的复制起点和不同抗生素抗性标记。在本发明的一个实施方式中，pBAD24或包含L-阿拉伯糖诱导的araBAD启动子的相关表达载体(pMB1或“pBR322”ORI,AmpR)在宿主细胞中与pPRO33或包含丙酸盐诱导的prpBCDE启动子的相关表达载体(p15A ORI,CmR)组合。表达载体使用补充有氨苄青霉素和氯霉素的生长培养基共扩增并保持。在一个实施方式中，一个表达载体包含编码全长抗体的重链的多核苷酸序列，和另一表达载体包含编码全长抗体的轻链的多核苷酸序列，各编码序列同框克隆到相应表达载体的MCS中。对于特定基因产物如抗体的产生，针对宿主生物体的编码序列优化(在其它考虑中特别地包括对于密码子偏倚性和GC含量的调整)将确定待插入到共表达系统的表达构建体中的编码序列。
再参照图2，基因产物的共表达通过便宜的外源施加的化学代谢产物L-阿拉伯糖和丙酸盐(5)诱导。各基因产物的表达诱导水平用其自身的化学诱导剂独立地滴定，从而有助于蛋白质共表达的优化。这对于蛋白质复合物和需要结合伴体以稳定化的蛋白质的表达是有用的，且可以有利于另外难以表达的蛋白质如具有差溶解性或细胞毒性的那些蛋白质的表达。在这一实例中，在诱导时，抗体重链和短链各自独立地表达，然后蛋白质接合并形成链间二硫键(在细菌宿主的胞质内)，其允许由重链和轻链构成的全长抗体的形成和稳定化。蛋白质可以被指导到宿主生物体的各个不同区室。例如，在E.coli中，蛋白质可以在胞质、细胞膜、周质中表达或分泌到培养基中。在适宜的孵育时间后，收集细胞和培养基，且提取总蛋白质，其包括共表达的基因产物(6)。在提取后，所需的产物可以根据共表达系统中产生的基因产物的特性使用本领域中公知的多种方法(例如液相色谱)纯化。在图2中所示的实施例中，多聚产物(全长抗体)使用色谱方法提取和纯化。纯化的完整抗体在非变性凝胶上使用标准技术可视化，包括蛋白质-结合染料或免疫组织化学。全长抗体产物然后可以用于多种研究、诊断或其它应用。
通过本发明的方法制备的产物
在多种共表达应用中利用本发明的可诱导共表达系统及在产物的性质中具有广泛的多样性。
糖基化。通过本发明的方法共表达的基因产物可以是糖基化的或未糖基化的。在本发明的一个实施方式中，共表达的基因产物是多肽。糖基化的多肽是包含共价连接的糖基基团的多肽，且包括包含通常与该多肽的特定残基连接的所有糖基基团的多肽(完全糖基化的多肽)、部分糖基化的多肽、具有一个或多个残基(其中通常不发生糖基化)处的糖基化(改变的糖基化)的多肽和用结构上与通常连接于一个或多个指明的残基的糖基基团不同的至少一个糖基基团糖基化(修饰的糖基化)的多肽。修饰的糖基化的实例是通过在缺乏使多肽岩藻糖基化的能力的宿主细胞中表达多肽来产生“脱岩藻糖基化”或“缺乏岩藻糖”的多肽，在与其连接的糖基基团中缺乏岩藻糖基部分的多肽。未糖基化的多肽是不包含共价结合的糖基基团的多肽。未糖基化的多肽可以是多肽脱糖基化或非糖基化多肽产生的结果。脱糖基化的多肽可以通过使糖基化多肽酶促地脱糖基化而获得，而非糖基化多肽可以通过在不具有使多肽糖基化的能力的宿主细胞(如原核细胞或其中至少一个糖基化酶的功能已经被消除或降低的细胞)中表达多肽而产生。在特定的实施方式中，共表达的多肽是非糖基化的，且在更特别的实施方式中，非糖基化的多肽在原核细胞如E.coli中共表达。
基因产物的其它修饰。通过本发明的方法共表达的基因产物可以与其它类型的分子共价连接。可以与共表达基因产物共价连接的分子的实例(非限制本发明的范围)包括多肽(如受体、配体、细胞因子、生长因子、多肽激素、DNA-结合结构域、蛋白质相互作用结构域如PDZ结构域、激酶结构域、抗体和任何这类多肽的片段)；水溶性聚合物(如聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙二醇丙醛及类似的化合物、衍生物或其混合物)；和细胞毒性剂(如化疗剂、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)和放射性同位素)。
另外，通过本发明的方法共表达的基因产物可以设计为包括帮助基因产物的纯化和/或检测的分子部分。许多这类部分是本领域中已知的；举例来说，多肽基因产物可以设计为包括在其N-或C-末端的多组氨酸“标签”序列-六个或更多个组氨酸，优选6-10个组氨酸残基和最优选6个组氨酸的延伸。在多肽末端上多组氨酸序列的存在允许其被钴-或镍-基亲和介质结合并与其它多肽分离。多组氨酸标签序列可以通过外肽酶除去。作为另一实例，荧光蛋白序列可以表达为多肽基因产物的部分，使得荧光蛋白的氨基酸序列优选添加在多肽基因产物的氨基酸序列的N-或C-末端。所得的融合蛋白在暴露于特定波长的光时发荧光，从而允许融合蛋白质的存在目视地检测。公知的荧光蛋白是维多利亚水母(Aequoreavictoria)的绿色荧光蛋白，且许多其它的荧光蛋白以及它们的编码核苷酸序列是商购可得的。
抗体。在本发明的一个实施方式中，共表达的基因产物是抗体。术语“抗体”以最广泛的意义使用并特别地包括“原始”抗体、全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段和能够结合抗原的源自抗体的其它多肽。除非本文中另外表明，免疫球蛋白重链中残基的编号(“EU编号”)是如Kabat等,Sequence of protein of Immunological Interest,Fifth Edition,1991,NationalInstitute of Health,Bethesda,Maryland中的EU索引的编号(人IgG1 EU抗体的残基编号)。
“原始”抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成。各轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而链间二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间存在变化。各重链和轻链也具有规律地间隔的链中二硫键。各重链在其N-末端具有可变结构域(VH)，接着是多个恒定结构域。各轻链具有其N-末端的可变结构域(VL)和其C-末端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。术语“可变”是指可变结构域的特定部分在抗体之间的序列中广泛不同的事实，并用于各特定抗体对抗原的结合和特异性中。但是，变异性不是均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。它集中于轻链和重链可变结构域两者的称为高变区(HVR)的三个片段中。可变结构域的较高保守性的部分称为框架区(FR)。原始重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个HVR连接的四个FR区，其与来自另一链的HVR一起造成抗体的抗原结合位点的形成。
术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区域，并包括原始Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能发生变化，人IgG重链Fc区可以限定为从Cys226或Pro230位的氨基酸残基延伸到其羧基末端的延伸段。或者Fc区可以限定为从保守的CH2免疫球蛋白结构域的N-末端残基(Ala231)延伸到C-末端，并可以包括多个保守的结构域如CH2、CH3和CH4。原始Fc区的C-末端赖氨酸(根据编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中或通过编码抗体重链的核酸重组工程化而除去。因此，完整抗体的组合物可以包含所有K447残基被除去的抗体群体、K447残基未被除去的抗体群体和具有含或不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。抗体的Fc区对于免疫细胞的募集和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是重要的。特别地，由抗体引发的ADCC反应的特性依赖于Fc区与位于许多细胞类型的表面上的受体(FcR)的相互作用。人类含有至少五种不同类别的Fc受体。抗体与FcR的结合决定其募集其它免疫细胞的能力和募集的细胞类型。因此，使具有改变的Fc区(其可以仅募集特定种类的细胞)的抗体工程化的能力对于治疗可能是特别重要的(美国专利申请20090136936Al,05-28-2009,Georgiou,George)。哺乳动物细胞产生的原始抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297的连接的分支的二天线寡糖。在某些实施方式，本发明的方法产生的抗体不是糖基化的或是非糖基化的，例如由于Fc区的残基297的置换或由于在不具有多肽糖基化的能力的宿主细胞中表达。由于改变的ADCC反应，未糖基化的抗体可以刺激较低水平的炎性反应如神经炎症。而且，因为具有非糖基化的Fc区的抗体对于Fc受体具有非常低的结合亲和力，这类抗体不结合携带这些受体的大量的免疫细胞。这是一种显著的优势，因为它减少了非特异性结合且也提高抗体的体内半衰期，从而使这一特性在治疗中非常有利。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”互换地使用以指基本上完整的“原始”形式的抗体而不是以下定义的抗体片段。该术语特别是指具有各包含可变结构域和Fc区的重链的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fd和Fv片段；双特异抗体；线性抗体；单链抗体分子如scFv；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。“嵌合”抗体是其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或与其共有特定的氨基酸序列同一性水平，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的对应序列相同或与其共有特定的氨基酸序列同一性水平的抗体以及这类抗体的片段。“人源化”抗体是包含最少的源自非人免疫球蛋白分子的氨基酸残基的嵌合抗体。在一个实施方式中，人源化抗体是其中人免疫球蛋白(受体抗体)的HVR残基被来自非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的免疫球蛋白HVR(供体抗体)的残基替换的受体抗体。在一些情况中，人受体抗体的FR残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含未在受体抗体中或供体抗体中发现的残基。术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，其中构成该群体的单个抗体除了可能少量存在的可能的突变(如天然发生的突变)外是相同的。因此，修饰语“单克隆”指示抗体不是离散抗体的混合物的特征。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的相同单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体制剂是有利的，因为它们通常不被其它免疫球蛋白污染。
分子如抗体的“结合亲和力”一般是指分子的单一结合位点与其结合伴体(如抗体及与其所结合的抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其伴体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)代表。低亲和力抗体(较高Kd)一般缓慢地结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和力抗体(较低Kd)一般更快地结合抗原并倾向于保持结合更长时间。测量结合亲和力的多种方式是本领域中已知的，其中任何一种可以用于本发明的目的。用于测量结合亲和力的特定说明性方法描述于实施例10中。通过本发明的方法产生和/或用于本发明的方法中的抗体和抗体片段优选具有低于100nM的结合亲和力，更优选具有低于10nM的结合亲和力，和最优选具有低于2nM的结合亲和力，如通过实施例10中描述的表面等离子体共振分析测量的。
识别非糖基化抗体的抗体(二级)。在没有糖基化酶的基于E.coli或其它原核表达系统中产生抗体通常得到非糖基化的抗体，其可以用作一级抗体。除了使用本发明可诱导共表达系统产生非糖基化一级抗体外，本发明的可诱导共表达系统也可以用于有效地产生特异性地识别非糖基化一级抗体的二级抗体。本发明的一个方面是能够检测未糖基化的或非糖基化的一级抗体的二级抗体系统用于研究、分析、诊断或治疗目的。作为一个实施例，二级抗体系统具有以下组分：表位、一级抗体、二级抗体和检测系统。表位是抗原(通常蛋白质)的一部分，其是在引入活的动物体中或另外地可被抗体识别时产生免疫反应的抗原决定簇。实际上，目标表位可以存在于混合物或组织中。在一个实施方式中，表位是人体组织的癌细胞中表达的蛋白质。一级抗体是识别和结合该表位和优选特异性结合该表位的抗体片段、单一全长抗体(单克隆)或不同全长抗体的混合物(多克隆)。这一实例中的全长抗体包含通过二硫键接合的两个重链多肽和两个轻链多肽。各链包含恒定区(Fc)和可变区(Fv)。在全长抗体中具有两个抗原结合位点。在本发明的一个实施方式中，一级抗体是识别和结合目标表位的全长非糖基化抗体(如在E.coli基表达系统中产生的)。二级抗体是识别和结合非糖基化一级抗体和优选特异性结合非糖基化一级抗体的抗体片段、单一全长抗体(单克隆)或不同全长抗体的混合物(多克隆)。在本发明的一个实施方式中，二级抗体是识别和结合全长一级抗体的非糖基化Fc部分的全长抗体。在这种情况中，抗体结合位点经选择和/或工程化以特异性识别具有或不具有C-末端赖氨酸残基的非糖基化一级抗体的Fc部分。在其它实施方式中，二级抗体可以工程化以识别非糖基化一级抗体的另外的区域(表位)或另外的工程化表位，包括但不限于与一级抗体共价连接的多肽序列。二级抗体可以针对全长非糖基化抗体分子(包括各种免疫球蛋白类别如IgG、IgA等)或抗体片段如Fc或Fab上的单一或多个位点(表位)。因此，以这种方式产生的一些二级抗体具有对于任何非糖基化全长抗体的广谱特异性。本发明的一级和二级抗体也可以包括通过传统方法(使用免疫的兔的多克隆抗体产生和使用小鼠杂交瘤的单克隆抗体产生)和重组DNA技术如用于鉴定抗原结合多肽的噬菌体展示方法产生的那些。
检测系统一般包含与二级抗体连接或结合二级抗体的试剂，从而使得能够进行二级抗体的检测、可视化和/或定量。各种检测系统是本领域中公知的，包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素或重金属。它们可以涉及或不涉及另外的多肽与二级抗体的物理连接。这一二级抗体系统的应用包括但不限于免疫组织化学、Western印迹和酶联免疫吸附分析(ELISA)。例如，在用于免疫组织化学的一个实施方式中，目标表位存在于薄组织切片上，然后非糖基化一级抗体应用于该组织并使其结合该表位。未结合的一级抗体被除去，且然后能够特异性结合非糖基化一级抗体的二级抗体应用于该组织并使其结合一级抗体。未结合的二级抗体被除去，且然后应用检测系统试剂。例如，如果二级抗体与酶连接，则显色酶底物应用于组织并使其反应。然后可以进行反应性酶底物的直接显微或荧光可视化。其它检测方法是本领域中公知的。使用识别非糖基化抗体的二级抗体的系统的优势包括，但不限于以下：1)在免疫组织化学中提高的特异性，因为二级抗体设计为结合不会另外地存在于真核生物组织中的一级抗体的非糖基化Fc部分；2)由于提高的对于一级抗体的特异性而降低的背景染色；3)降低的二级抗体系统生产的费用，因为一级和/或二级抗体可以在原核生物如E.coli中产生；和4)避免不必要地利用哺乳动物包括小鼠和兔，因为抗体开发的整个过程可以在原核生物如E.coli中进行。
工业应用中使用的酶。许多工业过程利用可通过本发明的方法产生的酶。这些过程包括废水的处理及其它生物整治和/或脱毒过程；造纸和纺织工业中材料的漂白；和生物质降解成可有效地发酵为生物燃料的材料。在许多情况中，希望的是在微生物宿主细胞中产生用于这些应用的酶，但活性酶由于酶折叠和/或对辅因子的需要的问题而难以大量表达。在本发明的以下实施方式中，本发明的可诱导共表达方法用于产生具有工业应用的酶。
利用阿拉伯糖和利用木糖的酶。D-木糖是在多糖、半纤维素和果胶中发现的植物生物质中最丰富的戊糖，而L-阿拉伯糖是第二丰富的戊糖。对于生物燃料和其它生物产品的开发和生产，有用的是将D-木糖和L-阿拉伯糖转化成己糖包括葡萄糖和果糖，因为己糖更有效地发酵成生物燃料如乙醇。如上所述，E.coli araBAD操纵子编码如下催化L-阿拉伯糖的蛋白质：通过L-阿拉伯糖异构酶(AraA,EC 5.3.1.4)将L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖；通过L-核酮糖激酶(AraB,EC 2.7.1.16)将L-核酮糖转化成L-核酮糖-磷酸；通过L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(AraD,EC 5.1.3.4)将L-核酮糖-磷酸转化成D-木酮糖-5-磷酸(也称为D-木酮糖-5-P)，其是形成果糖和葡萄糖的戊糖磷酸途径的部分。将L-阿拉伯糖转化成木糖醇(其然后可以转化成D-木酮糖-5-P)的另一酶学途径(“氧代-还原性途径(oxo-reductivepathway)”)如下：通过L-阿拉伯糖/D-木糖还原酶(EC 1.1.1.21)将L-阿拉伯糖转化成L-阿拉伯糖醇；通过L-阿拉伯糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.12)将L-阿拉伯糖醇转化成L-木酮糖；和通过L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)将L-木酮糖转化成木糖醇。E.coli xylAB操纵子编码一种用于利用D-木糖的以下酶学途径(“异构酶途径”)：通过D-木糖异构酶(XylA,EC5.3.1.5)将D-木糖转化成D-木酮糖；通过木酮糖激酶(XylB,EC 2.7.1.17)将D-木酮糖转化成D-木酮糖-5-P。用于将D-木糖转化成D-木酮糖-5-P的另一酶学途径(“氧代-还原性途径”)是：通过D-木糖还原酶(EC 1.1.1.21)将D-木糖转化成木糖醇；通过木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.9)将木糖醇转化成D-木酮糖；通过木酮糖激酶(XylB,EC 2.7.1.17)将D-木酮糖转化成D-木酮糖-5-P。因为氧代-还原性途径中需要的不同辅因子如NADPH、NAD-和ATP及这些辅因子可供使用的水平，不平衡可导致木糖醇副产物的过度产生。D-木酮糖-5-P+赤藓糖-4-磷酸可通过转酮醇酶(EC 2.2.1.1)转化成甘油醛-3-磷酸+果糖-6-磷酸。
本发明的可诱导共表达方法可用于产生利用阿拉伯糖和利用木糖的酶，其定义为是在前一段中通过EC编号列出的酶。各酶的EC(或“Enzyme Commission”)编号由International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUBMB)建立。关于这些酶的进一步信息以及其特定实施例可以容易地通过UniProt蛋白质数据库(www.uniprot.org/uniprot)和BRENDA数据库(www.brenda-enzymes.org/index)获得；利用阿拉伯糖和利用木糖的酶的BRENDA和UniProt数据库条目通过引用并入本文。在一些实施方式中，利用阿拉伯糖或利用木糖的酶与伴侣蛋白共表达；在本发明的进一步实施方式中，利用阿拉伯糖或利用木糖的酶与辅因子的转运蛋白共表达。在某些实施方式中，L-阿拉伯糖异构酶(AraA,EC 5.3.1.4)或L-阿拉伯糖还原酶(EC 1.1.1.21)通过本发明的方法产生；在这些实施方式中，阿拉伯糖诱导的启动子不用于任何表达构建体中，因为诱导剂L-阿拉伯糖分别转化为L-核酮糖或L-阿拉伯糖醇。对于L-阿拉伯糖异构酶(AraA,EC 5.3.1.4)或L-阿拉伯糖还原酶(EC 1.1.1.21)以外的利用阿拉伯糖的酶的产生，如果宿主细胞存在EC 5.3.1.4和/或EC 1.1.1.21中的缺陷如araA突变体且不能分解代谢L-阿拉伯糖，则可以利用阿拉伯糖诱导启动子。类似地，在其中D-木糖异构酶(XylA,EC 5.3.1.5)或D-木糖还原酶(EC 1.1.1.21)通过本发明的方法产生的实施方式中，木糖诱导启动子不用于任何表达构建体中，因为诱导剂D-木糖分别转化为D-木酮糖或木糖醇。对于D-木糖异构酶(XylA,EC5.3.1.5)或D-木糖还原酶(EC 1.1.1.21)以外的利用木糖的酶的产生，如果宿主细胞存在EC 5.3.1.5和/或EC 1.1.1.21中的缺陷如xylA突变体且不能分解代谢D-木糖，则可以利用木糖诱导启动子。
木糖异构酶(XylA,EC 5.3.1.5)是在微生物、厌氧真菌和植物中发现的酶，其催化醛糖(D-木糖)与酮糖(D-木酮糖)的相互转化。它也可以异构化D-核糖为D-核酮糖和异构化D-葡萄糖为D-果糖。这一酶属于异构酶的家族，特别是相互转化醛糖和酮糖的那些分子内氧化还原酶。这一酶类别的系统名称是D-木糖醛糖-酮糖-异构酶。常用的其它名称包括D-木糖异构酶、D-木糖酮异构酶,D-木糖酮醇-异构酶和葡萄糖异构酶。该酶在工业上在高果糖玉米糖浆的制造中用于转化葡萄糖为果糖，且如上所述可以用于戊糖至己糖的转化以生产生物燃料。木糖异构酶是同型四聚体且需要两个二价阳离子-Mg2+、Mn2+和/或Co2+-以获得最大活性。木糖异构酶活性可以使用NADH-连接的阿拉伯糖醇脱氢酶分析测量(Smith等,“D-xylose(D-glucose)isomerase from Arthrobacter strainN.R.R.L.B3728.Purification and properties”,Biochem J 1991Jul 1；277(Pt 1):255-261)，其中一个单位的木糖异构酶活性是在一分钟内将1微摩尔D-木糖转化为D-木酮糖的酶量。在至少一些物种中，木糖异构酶对于其活性需要镁(或在植物的情况中需要锰)，而钴可能是稳定该酶的四聚体结构所需的。各木糖异构酶亚基包含与其它二价金属依赖性TIM(丙糖磷酸异构酶)桶酶的结构相似的α/β-桶折叠，且C-末端的较小部分形成参与多聚化的延伸的螺旋折叠。所有已知木糖异构酶中的保守残基是酶的N-末端段中的组氨酸(其显示为参与酶的催化机制)及形成两个金属结合位点的两个谷氨酸残基、组氨酸和四个天冬氨酸残基，各金属结合位点结合镁、钴或锰的离子(Katz等,“Locating active-sitehydrogen atoms in D-xylose isomerase:time-of-flight neutron diffraction”,ProcNatl Acad Sci USA 2006May 30；103(22):8342-8347；Epub 2006May 17)。
在本发明的一些实施方式中，可诱导的共表达用于表达木糖异构酶蛋白；在某些实施方式中，木糖异构酶(“XI”)选自下组：节杆菌(Arthrobacter sp.)菌株NRRL B3728 XI(UniProt P12070)；粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)XI(UniProt B0NPH3)；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)XI(UniProt Q8G3Q1)；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)XI(UniProt Q1BG90)；玻璃海鞘(Ciona intestinalis)XI(UniProtF6WBF5)；Clostridium phytofermentans XI(UniProt A9KN98)；根囊鞭菌(Orpinomycessp.)ukk1 XI(UniProt B7SLY1)；梨囊鞭菌(Piromyces sp.)E2 XI(UniProt Q9P8C9)；浅青紫链霉菌XI(UniProt Q9RFM4)；浅青紫链霉菌TK24 XI(UniProt D6ESI7)；产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW 200XI(UniProt D2DK62)；Thermoanaerobacteryonseii XI(UniProt Q9KGU2)；新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)XI(UniProtP45687)；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)XI(UniProt P26997)；和弧菌(Vibrio sp.)菌株XY-214XI(UniProt C7G532)。在特定的实施方式中，木糖异构酶与二价离子转运蛋白如CorA(UniProt P0ABI4)可诱导地共表达：使用诱导型启动子以控制离子转运的时机和程度可有助于降低金属离子如Co2+对宿主细胞的毒性。在另外的实施方式中，影响XI单体对之间的相互作用的突变引入木糖异构酶蛋白质中；例如，半胱氨酸残基的引入以使得一对单体之间的二硫键可以形成(参见Varsani等,“Arthrobacter D-xylose isomerase:protein-engineered subunit interfaces”,Biochem J 1993Apr 15；291(Pt 2):575-583)。在这一实例中，因为半胱氨酸残基在单体内互反的但不相同的位置中引入，产生了两个不同类型的改变的单体，且本发明的可诱导共表达系统用于滴定两个类型的单体的相对表达以获得所需的化学计量比。
木质素降解过氧化物酶。过氧化物酶是氧化还原酶的亚组并用于催化多种工业过程。氧化还原酶可以分解木质素或作为还原酶在纤维素和半纤维素的降解中发挥作用，从而允许植物生物质加工中使用的酶在生物燃料如乙醇的生产过程中更容易达到糖残基。氧化还原酶可以是氧化酶或脱氢酶。氧化酶使用分子氧作为电子受体，而脱氢酶通过转移H-基团到受体如NAD/NADP+或黄素依赖性酶而氧化底物。过氧化物酶催化过氧化物如过氧化氢(H2O2)的还原。其它类型的氧化还原酶包括加氧酶、羟化酶和还原酶。除氧、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD和NADP外，氧化还原酶的潜在辅因子包括细胞色素和亚铁血红素、二硫化物和铁-硫蛋白。
木质素降解过氧化物酶可以氧化多种芳香化合物包括高氧化还原电势化合物如木质素、工业染料、杀虫剂等。四个类型的木质素修饰酶已经鉴定和表征：木质素过氧化物酶(LiP,EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(MnP,EC 1.11.1.13)、多能过氧化物酶(VP,EC1.11.1.16)和漆酶(EC 1.10.3.2)。LiP、MnP和VP是具有四或五个二硫键和两个用于结构Ca2+离子的结合位点的亚铁血红素蛋白，且是高氧化还原电势的过氧化物酶，其可以直接氧化高氧化还原电势底物和/或Mn2+。MnP的过氧化物酶活性可以使用以下的实施例4，E节中描述的2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)氧化分析测量；LiP活性可以通过在H2O2存在下藜芦基醇至藜芦基醛的氧化来测量(Orth等,“Overproduction of lignin-degrading enzyme byan isolate of Phanerochaete chrysosporium”,Appl Environ Microbiol 1991Sep；57(9):2591-2596)。漆酶不与亚铁血红素关联而与铜离子(通常4个铜离子每漆酶蛋白质)关联，且低氧化还原电势氧化还原酶(其仅可以在氧化还原介质存在下氧化高氧化还原电势底物)。漆酶的活性可以使用如Zhao等,“Characterisation of a novel white laccasefrom the deuteromycete fungus Myrothecium verrucaria NF-05and itsdecolourisation of dyes”,PLoS One 2012；7(6):e38817；Epub 2012Jun 8中描述的ABTS(2,2'-连氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))氧化分析测量；一个单位的活性定义为每分钟产生1微摩尔产物。
本发明的可诱导共表达方法可用于产生木质素降解过氧化物酶，其定义为是在前一段中通过EC编号列出的酶；木质素降解过氧化物酶的BRENDA和UniProt数据库条目通过引用并入本文。在一些实施方式中，木质素降解过氧化物酶与伴侣蛋白共表达；在本发明的进一步实施方式中，木质素降解过氧化物酶与辅因子如亚铁血红素的转运蛋白共表达。
LiP可以使用本发明的可诱导共表达系统表达；在某些实施方式中，LiP选自下组：黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)(Sporotrichum pruinosum)LiP同工酶“木质酶A”(UniProt P31837)、“木质酶B”(UniProt P31838)、“木质酶H2”(UniProtP11542)、“木质酶H8”(UniProt P06181)、“木质酶LG2”(UniProt P49012)、“木质酶LG3”(UniProt P21764)、“木质酶LG5”(UniProt P11543)和“木质酶LG6”(UniProt P50622)；射脉齿菌(Phlebia radiata)“木质酶-3”(UniProt P20010)；粗毛栓菌(Trametesversicolor)(云芝(Coriolus versicolor))LiP同工酶“木质酶C”(UniProt P20013)、LP7(UniProt Q99057)和LP12(UniProt Q7LHY3)；和Trametopsis cervina LiP(UniProtQ3C1R8)和(UniProt Q60FD2)。
在本发明的一些实施方式中，可诱导共表达用于表达MnP；在某些实施方式中，MnP选自下组：双孢蘑菇(Agaricus bisporus)MnP(UniProt Q5TJC2)；田头菇(Agrocybepraecox)MnP(UniProt G4WG41)；灵芝(Ganoderma lucidum)MnP(UniProt C0IMT8)；偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)MnP(UniProt C3V8Q9)；黄孢原毛平革菌MnP同工酶MNP1(UniProtQ02567)；H3(UniProt P78733)；和H4(UniProt P19136)；射脉齿菌MnP同工酶MnP2(UniProtQ70LM3)和MnP3(UniProt Q96TS6)；射脉菌(Phlebia sp.)b19 MnP(UniProt B2BF37)；射脉菌MG60 MnP同工酶MnP1,MnP2,MnP3(分别UniProt B1B554、B1B555和B1B556)；糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)MnP3(UniProt B9VR21)；肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)MnP5(UniProt Q2VT17)；皮孔菌(Spongipellis sp.)FERM P-18171MnP(UniProt Q2HWK0)；和粗毛栓菌(云芝)MnP同工酶(UniProt Q99058、Q6B6M9、Q6B6N0、Q6B6N1和Q6B6N2)。MnP与蛋白质二硫键异构酶在亚铁血红素存在下的共表达描述于实施例4中。
漆酶可以使用本发明的可诱导共表达系统表达；在某些实施方式中，漆酶选自下组：富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)(灰葡萄孢(Botrytis cinerea))漆酶同工酶(UniProt Q 12570、Q96UM2和Q96WM9)；齿毛菌(Cerrena sp.)WR1漆酶同工酶(UniProtE7BLQ8、E7BLQ9和E7BLR0)；一色齿毛菌(Cerrena unicolor)(Daedalea unicolor)漆酶(UniProt B8YQ97)；灵芝漆酶同工酶(UniProt Q6RYA2、B5G547、B5G549、B5G550、B5G551和B5G552)；Melanocarpus albomyces漆酶(UniProt Q70KY3)；糙皮侧耳漆酶同工酶(UniProtQ 12729、Q12739、Q6RYA4、Q6RYA4和G3FGX5)；朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)漆酶同工酶(UniProt 059896、Q9UVQ2、D2CSG0、D2CSG1、D2CSG4、D2CSG6和D2CSG7)；绯红密孔菌(Pycnoporus coccineus)漆酶同工酶(UniProt D2CSF2、D2CSF5、D2CSF6、D2CSM7和D7F484)；毛栓菌(Trametes hirsuta)(毛云芝菌(Coriolus hirsutus))漆酶(UniProtQ02497)；Trametes maxima(Cerrena maxima)漆酶(UniProt D0VWU3)；粗毛栓菌(云芝)漆酶同工酶(UniProt Q12717、Q12718和Q12719)；和长绒毛栓菌(Trametes villosa)漆酶同工酶(UniProt Q99044、Q99046、Q99049、Q99055和Q99056)。
尽管白腐真菌的三个主要木质素修饰酶是LiP、MnP和漆酶，但另一类型的过氧化物酶，多能过氧化物酶(VP)，在侧耳属(Pleurotus)和烟管菌属(Bjerkandera)的几个物种中发现。VP由于其催化多能性而是有意义的：它可以氧化LiP底物、藜芦基醇、甲氧基-苯和非酚类木质素模型化合物以及MnP底物Mn2+。VP的多能活性可以使用MnP 2,6-DMP测定法或LiP藜芦基醇测定法或漆酶ABTS测定法(参见以上)分析。本发明的一些实施方式中，可诱导共表达用于表达VP；在某些实施方式中，VP选自下组：黑管菌(Bjerkandera adusta)VP(UniProt A5JTV4)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)VP同工酶(UniProt O94753、Q9UR19和Q9UVP6)；和肺形侧耳VP(UniProt I6TLM2)。
实施例1
IgG1重链和轻链的可诱导共表达以在细菌细胞中产生全长抗体
A.表达载体的构造
可诱导共表达系统用于在细菌细胞中产生全长抗体，特别地小鼠抗-人CD19 IgG1抗体。小鼠抗-人CD19 IgG1重链(“IgG1重链”、“IgG1HC”、“重链”或“HC”)的编码序列提供为SEQ ID NO:l并与GenBank Accession No.AJ555622.1的序列相同，和特别地与GenBankAJ555622.1核苷酸序列的碱基13-1407相同。相应的全长小鼠抗-人CD19 IgG1重链氨基酸序列提供为SEQ ID NO:2(且与GenBank Accession No.CAD88275.1相同)。小鼠抗-人CD19IgG1轻链(“IgG1轻链”、“IgG1LC”、“轻链”或“LC”)的编码序列提供为SEQ ID NO:3并与GenBank Accession No.AJ555479.1的序列相同，和特别地与GenBank AJ555479.1核苷酸序列的碱基23-742相同。相应的全长小鼠抗-人CD19 IgG1轻链氨基酸序列提供为SEQ IDNO:4(且与GenBank Accession No.CAD88204.1相同)。
编码IgG1重链和轻链的多核苷酸的合成及用于在E.coli中表达的优化通过GenScript(Piscataway,NJ)进行。GenScript's Optimum GeneTM Gene Design系统使用了算法(Optimum GeneTM算法)，其考虑涉及蛋白质表达的不同阶段的多种因素，如密码子使用偏倚性、GC含量、CpG二核苷酸含量、预测的mRNA结构及转录和翻译中的各种顺式-元件。IgG1重链和轻链的优化序列分别提供为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；这些优化序列包括在编码序列上游和下游的一些另外的核苷酸；编码序列是SEQ ID NO:5的碱基25-1419和SEQID NO:6的碱基25-747。SEQ ID NO:10中对于IgG1轻链的优化编码序列编码相对于SEQ IDNO:4的IgG1轻链氨基酸序列在所编码氨基酸序列的2位的另外的氨基酸(丙氨酸残基)。优化的重链和轻链序列两者包含TAA终止密码子和位于起始密码子上游-14到-9碱基处的优选E.coli核糖体结合序列(AGGAGG)。另外，IgG1重链优化序列(SEQ ID NO:5)包含含有ATG起始密码子的NcoI限制性位点和紧接TAA终止密码子下游的HindIII限制性位点，而IgG1轻链优化序列(SEQ ID NO:6)包含紧接核糖体结合序列上游的NheI限制性位点以及紧接TAA终止密码子下游的HindIII限制性位点。
IgG1重链和轻链的优化编码序列作为克隆到pUC57中的多核苷酸从GenScript获得。pBAD24载体作为ATCC 87399从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，且具有GenBankDatabase Accession No.X81837.1(25-OCT-1995)中所示的核苷酸序列；pPRO33载体从University of California(Berkeley,California)获得，并具有SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列。pPRO33的核苷酸序列从pBAD18载体(GenBank Accession No.X81838.1)、prpR-PprpB区域的E.coli基因组序列和pBAD33载体的序列编译，如在Guzman等,“Tightregulation,modulation,and high-level expression by vectors containing thearabinose PBAD promoter”,J Bacteriol 1995Jul；177(14):4121-4130中和在美国专利No.8178338B2；May 15 2012；Keasling,Jay中描述的。为克隆IgG1重链到pBAD24载体中和克隆IgG1轻链到pPRO33载体中，pUC57-HC和pUC57-LC构建体首先使用热休克方法转化到E.coli BL21细胞(New England Biolabs(或“ΝΕΒ”),Ipswich,Massachusetts)中。这些载体各自的质粒DNA然后通过小量制备方法获得。除非另外注明，E.coli细胞在液体培养物中的生长是在37℃下伴有250RPM旋转振荡。含有质粒的E.coli细胞株(含pUC57-HC的BL21、含pUC57-LC的BL21和含pBAD24的DH5α)各自在8mL LB+氨苄青霉素(“AMP”)培养基中生长，且含有pPRO33的E.coli DH10B细胞(Life Technologies,Grand Island,New York)在5mLLB+氯霉素(“CAM”)培养基中生长，持续14小时或过夜，然后细胞沉淀，裂解，并使用
Figure BDA0002582908380000521
离心柱(QIAGEN,Germantown,MD)按照制造商的方案分离质粒DNA。为得到提高的产率，
Figure BDA0002582908380000522
离心柱方案用添加到PE缓冲液中的100％乙醇进行，且上清液输送通过柱两次而不是一次。
为克隆IgG1重链到pBAD24中，纯化的pUC57-HC和pBAD24质粒用NcoI和HindIII限制性酶(NEB)消化，然后IgG1HC NcoI-HindIII片段和NcoI-HindIII切割的pBAD24质粒通过凝胶电泳与其它多核苷酸片段分离，从凝胶切除并使用Illustra GFX Gel BandPurification Kit(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)按照制造商的指示纯化。IgG1HC NcoI-HindIII片段然后连接(在16℃下过夜)于NcoI-HindIII切割的pBAD24质粒以形成pBAD24-HC表达构建体。因为IgG1HC NcoI-HindIII片段中的NcoI限制性位点包含IgG1HC编码序列的ATG起始密码子，当IgG1HC NcoI-HindIII片段插入NcoI-HindIII切割的pBAD24载体中时，IgG1HC编码序列置于pBAD24载体中存在的优选的E.coli核糖体结合序列AGGAGG的下游(参见Guzman等,“Tight regulation,modulation,and high-levelexpression by vectors containing the arabinose PBAD promoter”,J Bacteriol1995Jul；177(14):4121-4130的图1)。在所得的pBAD24-HC表达构建体中，核糖体结合序列位于IgG1HC起始密码子上游的-14至-9碱基处。
为克隆IgG1轻链到pPRO33中，纯化的pUC57-LC和pPRO33质粒用NheI和HindIII限制性酶(NEB)消化。因为pPRO33质粒具有两个HindIII限制性位点，因此具有两个从pPRO33NheI-HindIII消化物凝胶纯化的片段：4.4kb片段和1.5kb片段。在所有所需片段的凝胶纯化后，使用illustra GFX Gel Band Purification Kit(参见以上)，纯化的4.4kb pPRO33片段按照制造商的指示用碱性磷酸酶(也称为小牛肠磷酸酶或CIP)(NEB)处理。CIP处理的4.4kb pPRO33片段使用illustra GFX Purification Kit(参见以上)从磷酸酶反应混合物纯化，且然后连接于1.5kb pPRO33片段(16℃下10.5小时)。所得的NheI-HindIII切割的pPRO33质粒连接于IgG1LC NheI-HindIII片段(16℃下过夜)以形成pPRO33-LC表达构建体。因为IgG1LC NheI-HindIII片段中的NheI限制性位点紧接优化的轻链序列(SEQ ID NO:6)中核糖体结合序列AGGAGG的上游，当IgG1LC NheI-HindIII片段插入NheI-HindIII切割的pPRO33载体中时，IgG1LC序列保留其优选的E.coli核糖体结合序列。
B.细菌细胞中IgG1重链和轻链的可诱导共表达
pBAD24-HC表达构建体和pPRO33-LC表达构建体使用热休克方法共转化到E.coliBL21中和E.coli
Figure BDA0002582908380000531
Express细胞(NEB)中。转化的BL21(pBAD24-HC/pPRO33-LC)和
Figure BDA0002582908380000532
Express(pBAD24-HC/pPRO33-LC)细胞在37℃下在具有30微克/mL CAM和100微克/mL AMP的5mL LB液体培养基中生长。因为
Figure BDA0002582908380000533
Express细胞似乎比BL21细胞更缓慢地生长，2％(100微升)的
Figure BDA0002582908380000541
Express(pBAD24-HC/pPRO33-LC)过夜培养物和1％(50微升)的BL21(pBAD24-HC/pPRO33-LC)过夜培养物用于接种具有酪蛋白氨基酸和0.2％甘油+30微克/mL CAM和100微克/mL AMP的5mL M9最低培养基。这些培养物生长直到OD600为大约0.5：
Figure BDA0002582908380000542
Express(pBAD24-HC/pPRO33-LC)细胞为3.1小时和BL21(pBAD24-HC/pPRO33-LC)细胞为2.5小时。在诱导前，对照样品从在没有诱导的情况下生长的各培养物获取。剩余的
Figure BDA0002582908380000543
Express(pBAD24-HC/pPRO33-LC)和BL21(pBAD24-HC/pPRO33-LC)细胞培养物然后通过添加0.2％阿拉伯糖和50mM丙酸盐诱导，并与非诱导的对照样品平行生长6小时。在该时间结束时，所有细胞培养物离心以沉淀细胞，并置于-80℃冰箱中。细胞团在冰上解冻，且细胞使用Qproteome Bacterial Lysis Kit(QIAGEN)按照制造商的指示裂解，除了在添加溶菌酶和核酸酶之前将Complete Mini Protease Inhibitor CocktailTablet(Roche,Indianapolis,Indiana)添加到10mL原始裂解缓冲液中及样品在25℃下而不是在4℃下离心。
来自诱导的细胞和未诱导的对照的可溶性蛋白质提取物在
Figure BDA0002582908380000544
4-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies,Grand Island,New York)上还原性条件下通过SDS凝胶电泳分离。凝胶使用RAPIDstainTM(G-Biosciences,St.Louis,Missouri)染色。如图3中所示的，蛋白质条带(重链)观察到迁移在51kDa处和另一蛋白质条带(轻链)迁移在26kDa处；这些条带存在于诱导的细胞中但不存在于未诱导的细胞中。来自包含pBAD24-HC和pPRO33-LC可诱导表达载体两者的诱导的和未诱导的
Figure BDA0002582908380000545
Express和BL21细胞的相同可溶性蛋白质提取物在
Figure BDA0002582908380000546
10-20％Tris-Glycine凝胶(Life Technologies)上原始(非还原)条件下通过凝胶电泳分离。凝胶使用RAPIDstainTM(G-Biosciences)染色。如图4中所示的，蛋白质条带(包含重链和轻链的IgG1抗体)迁移在154kDa处。这一条带存在于诱导的
Figure BDA0002582908380000547
Express细胞中，但在诱导的BL21细胞中和在未诱导的细胞中显著减少或不存在。
实施例2
表达构建体和细菌细胞中产生的IgG1全长抗体的表征
A.表达载体的表征
pBAD24-HC和pPRO33-LC表达构建体的序列使用启动双脱氧链终止测序反应的下表中所示的引物以及按需要设计的其它引物来确认。prpBCDE启动子和MCS上游的pPRO24载体区域的核苷酸序列(如美国专利No.8178338B2的图1C中所示)用于设计至少一个正向寡核苷酸引物以测序克隆到pPRO表达载体的MCS中的编码序列。
表4.寡核苷酸引物
Figure BDA0002582908380000551
B.小鼠IgG1全长抗体在Western印迹上的检测
用于通过电泳分离可溶性蛋白质提取物的蛋白质凝胶(
Figure BDA0002582908380000552
4-12％Bis-Tris凝胶或
Figure BDA0002582908380000553
10-20％Tris-Glycine凝胶)，如实施例1中所述，置于XCell IITMBlot Module(Life Technologies,Grand Island,New York)中。电流按照制造商的指示应用于凝胶，导致蛋白质从凝胶转移到硝基纤维素膜。硝基纤维素膜然后与一级抗体(抗-小鼠IgG)在4℃下孵育过夜。硝基纤维素膜然后洗涤以除去未结合的抗体，并与二级抗体(与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG)在室温下孵育一小时。硝基纤维素膜然后洗涤以除去未结合的二级抗体，与包含氮蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-吲哚基-磷酸(BCIP)的溶液一起孵育以染色蛋白质条带，且然后洗涤以除去过量的染色溶液。
实施例3
基因组改变引入宿主细胞以促进共表达
如上所述，宿主细胞基因表达中的特定变化可以改善所需基因产物的共表达。以下删除和改变在E.coli
Figure BDA0002582908380000561
Express宿主细胞基因组中由Gene Bridges GmbH(Heidelberg,德国)使用无缝地去除基因组序列的重组工程方法(描述为通过反选择的删除)进行。进行宿主细胞araBAD操纵子的删除以降低宿主细胞的阿拉伯糖分解代谢，使得更多的阿拉伯糖诱导剂可用于从包含araBAD启动子的表达构建体诱导共表达的基因产物。这一删除除去araBAD操纵子的4269个碱基对，对应于E.coli基因组的位置70,135-65,867(负链)(基因组核苷酸序列内的位置全部如表1中给出)，以使得除AraD编码区域的少量密码子以外的原始araBAD启动子的大部分被除去。删除接合点(位置70,136|位置65,866)附近的核苷酸序列(负链)是：TTAT|TACG。另一删除在sbm-ygfDGH(也称为scpA-argK-scpBC)操纵子内进行，从而消除参与2-甲基柠檬酸生物合成的基因的功能，以提高宿主细胞的丙酸盐诱导启动子对外源供应的丙酸盐的敏感性。sbm-ygfDGH删除除去5542个碱基对(E.coli基因组中的位置3,058,754-3,064,295)，除去sbm-ygfDGH启动子和除ygfH编码序列的最后密码子之外的所有操纵子，而保留邻接的ygfI编码序列和终止密码子完整。删除接合点(位置3,058,753|位置3,064,296)附近的核苷酸序列(正链)是：ACAA|GGGT。除E.coli
Figure BDA0002582908380000562
Express宿主细胞基因组中进行的这些删除外，Gene Bridges GmbH在基因组rpsL基因编码序列(其在负链上从位置3,472,574延伸到3,472,200)中引用点突变，改变位置3,472,447处的A为G，从而将Lys43的密码子改变为Arg的密码子，这在突变体rpsL-Arg43基因表达时产生链霉素抗性表型。对宿主细胞基因组的另一改变(允许如上所述更紧密地控制可诱导的表达)是使得araE启动子为组成型的而不是响应于阿拉伯糖。大部分的原始araE启动子(包括CRP-cAMP和AraC结合位点)通过删除97个碱基对(位置2,980,335-2,980,239(负链))和用组成型J23104启动子的35-碱基对的序列替换该序列而除去，具有最终的接合位点序列：TGAA|TTGA←J23104启动子→TAGC|TTCA。具有任何这些基因组改变或它们的任何组合的E.coli宿主细胞如E.coli
Figure BDA0002582908380000571
Express宿主细胞可以用于基因产物的可诱导共表达。
实施例4
锰过氧化物酶和蛋白质二硫键异构酶在亚铁血红素存在下的可诱导共表达
A.表达载体的构建
锰过氧化物酶(“ΜnΡ”；也称为锰依赖性过氧化物酶)是使得一些类型的真菌能够降解木质素为二氧化碳和介导广泛的有机污染物质的氧化的酶。锰过氧化物酶的一个实例是白腐菌黄孢原毛平革菌(UniProtKB/Swiss-Prot Accession No.P19136)的H4同工酶(本文中称为“ΜnΡ-Η4”)。以其功能性形式存在时，MnP-H4与锰离子(Mn2+)、含铁的亚铁血红素分子和两个钙离子(Ca2+)结合；MnP-H4也具有五个二硫键(Sundaramoorthy等,“Thecrystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at
Figure BDA0002582908380000572
resolution”,J Biol Chem 1994Dec 30；269(52):32759-32767)。MnP-H4酶的热灭活包括MnP-H4和钙离子之间相互作用的丧失。在MnP-H4中通过改变MnP-H4的氨基酸序列以在靠近远端钙相互作用位点的两个位置处用半胱氨酸替代另一氨基酸产生另外的二硫键(如MnP-H4 A48C/A63C变体)使得所得的MnP-H4A48C/A63C酶对热灭活具有更高抗性(Reading和Aust,“Engineering a disulfide bond in recombinant manganeseperoxidase results in increased thermostability”,Biotechnol Prog 2000May-Jun；16(3):326-333)。为以促进二硫键形成的方式表达MnP-H4，产生表达缺乏信号肽的MnP-H4酶的表达构建体，以使得蛋白质保留在宿主细胞(E.coli
Figure BDA0002582908380000573
Express)的氧化胞质环境中。
没有信号肽的MnP-H4的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:13；这一形式的MnP-H4蛋白质具有连接于预测的成熟氨基酸序列(在全长氨基酸序列的A14处开始)的起始甲硫氨酸残基，如Pease等,“Manganese-dependent peroxidase from Phanerochaetechrysosporium.Primary structure deduced from cDNA序列”,J Biol Chem 1989Aug15；264(23):13531-13535中所述的。在其它参考文献中，如Sundaramoorthy等,“Thecrystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at
Figure BDA0002582908380000574
resolution”,J Biol Chem 1994Dec 30；269(52):32759-32767，成熟MnP-H4氨基酸序列表示为开始于全长氨基酸序列的A25处。
包含SEQ ID NO:13的氨基酸13-370(其对应于较短的成熟氨基酸序列)的蛋白质也通过本发明的方法产生，且在某些实施方式中，具有连接于SEQ ID NO:13的氨基酸13-370的起始甲硫氨酸残基，且因此具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。已针对在E.coli中表达MnP-H4的SEQ ID NO:13形式进行优化的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；包含SEQID NO:14的表达构建体用于本发明的方法中以表达MnP-H4。SEQ ID NO:14的核苷酸37-1110编码较短的MnP-H4成熟氨基酸序列(开始于全长氨基酸序列的A25处)；包含SEQ IDNO:14的核苷酸37-1110的多核苷酸用于本发明的一些实施方式中以产生MnP-H4蛋白质，且在某些实施方式中，包含连接于SEQ ID NO:14的37-1110的核苷酸序列5'末端的起始甲硫氨酸残基的ATG密码子。
类似的表达构建体产生以用于表达对应于A48C/A63C MnP-H4蛋白质并缺乏信号肽的MnP-H4蛋白质(如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；优化的编码序列如SEQ ID NO:16所示)。由于与较短的成熟MnP-H4氨基酸序列相比SEQ ID NO:15中额外的十二个氨基酸，丙氨酸至半胱氨酸的改变显示为SEQ ID NO:15中的A60C/A75C。用于本发明方法中的表达构建体的另外实例编码包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:15的氨基酸13-370或连接于SEQ IDNO:15的氨基酸13-370的起始甲硫氨酸残基的蛋白质。在某些实施方式中，用于本发明方法中的表达构建体包含SEQ ID NO:16或SEQ ID:16的核苷酸37-1110或连接于SEQ ID NO:16的37-1110的核苷酸序列的5'末端的起始甲硫氨酸残基的ATG密码子。MnP-H4氨基酸序列的另一变异发生于全长氨基酸序列的位置105处，其中丝氨酸改变为天冬酰胺(asperagine)。本发明的方法用于产生具有这一变异(丝氨酸在SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的位置93处改变为天冬酰胺)的MnP-H4蛋白质，其中表达构建体包含使得SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的位置278处的G改变为A的核苷酸序列从而将丝氨酸的AGC密码子改变为天冬酰胺的AAC密码子。
除促进MnP-H4中二硫键的形成以产生完全活性的MnP-H4酶外，该酶最佳地在亚铁血红素存在下表达。为使得E.coli宿主细胞能够从培养基摄取含亚铁血红素的分子如氯高铁血红素，编码E.coli O157:H7 ChuA外膜氯高铁血红素特异性受体的核苷酸序列也包括在MnP-H4表达构建体中。ChuA多肽具有与原始E.coli O157:H7菌株EC4113 ChuA蛋白质(SEQ ID NO:17)相同的N-末端氨基酸序列，包括信号肽，以使得其将插入E.coli宿主细胞的外膜中。ChuA多肽(SEQ ID NO:17)的优化编码序列显示在SEQ ID NO:19的位置68-2047处。来自E.coli O157:H7菌株EC41 13的SEQ ID NO:17中所示的ChuA氨基酸序列与来自E.coli CFT073的ChuA氨基酸序列(NCBI Gene ID No.1037196)不同之处在于在SEQ IDNO:17的位置106处具有缬氨酸(EC4113)而不是异亮氨酸(CFT073)。ChuA氨基酸序列中的V106I改变可以通过SEQ ID NO:19的位置383-385处GTG Val密码子至ATT或ATC Ile密码子的改变编码。用于亚铁血红素相关蛋白质的表达中的ChuA蛋白质氨基酸序列中的其它变异包括，例如，在SEQ ID NO:17的位置259处谷氨酸变为甘氨酸(通过SEQ ID NO:19的位置842-844处GAG Glu密码子至GGT或GGC Gly密码子的改变编码)或在SEQ ID NO:17的位置262处谷氨酸变为天冬酰胺(通过SEQ ID NO:19的位置851-853处GAG Glu密码子至GAT或GAC Asp密码子的改变编码)。
对于在E.coli中表达的优化和对应于SEQ ID NO:18、19和22的多核苷酸的合成通过DNA2.0(Menlo Park,CA)进行。SEQ ID NO:18编码MnP-H4蛋白质，且设计为插入在紧接启动子如诱导型启动子的下游。SEQ ID NO:18核苷酸序列开始于其5'末端的GCTAGC NheI限制性位点，并具有SEQ ID NO:18的核苷酸7-12处的AGGAGG核糖体结合位点，之后是SEQ IDNO:18的核苷酸21-1130处的优化MnP-H4编码序列。MnP-H4终止密码子的下游是B0015双重终止子，从SEQ ID NO:18的位置1142至1270，之后是TCTAGA XbaI限制性位点。B0015双重终止子的核苷酸序列从partsregistry.org网站获得。SEQ ID NO:19编码ChuA，并包括组成型启动子，因此ChuA的这一表达构建体可以置于任何表达载体中或宿主细胞基因组内；因为ChuA编码序列已置于J23104组成型启动子控制下，其转录不再受到Fur的阻遏。在这一实施方式中，SEQ ID NO:19开始于其5'末端的TCTAGA XbaI限制性位点，并设计为置于表达载体内SEQ ID NO:18序列的3'侧。SEQ ID NO:19的核苷酸7-41是J23104组成型启动子和SEQ IDNO:19的核苷酸50-61是B0034核糖体结合位点，两者都置于SEQ ID NO:19的核苷酸68-2047处的ChuA编码序列的上游；J23104和B0034的核苷酸序列从partsregistry.org网站获得。SEQ ID NO:19以GTCGAC SalI限制性位点结束。SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中的XbaI位点允许这些核苷酸序列在XbaI位点处连接到一起；所得的MnP-H4 ChuA表达构建体的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:20中。分别SEQ ID NO:18和19中及SEQ ID NO:20中的NheI和SalI位点允许MnP-H4 ChuA表达构建体使用其多克隆位点中的NheI and SalI限制性位点插入到表达载体如pPRO33中。
为利于正确折叠的MnP-H4酶的产生，MnP-H4与来自特异腐质霉(Humicolainsolens)(一种嗜热的、纤维素水解的和腐生的土壤丝孢菌(软腐真菌(soft-rotfungus)))的伴侣蛋白蛋白质二硫键异构酶(“PDI”)共表达。共表达的PDI的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:21；其缺乏原始蛋白质的信号肽以使得它如MnP-H4多肽一样在产生时保留在宿主细胞胞质中。编码PDI的核苷酸序列也优化用于在E.coli中表达；PDI的表达构建体显示为SEQ ID NO:22。SEQ ID NO:22包含其5'末端的GCTAGC NheI限制性位点、核苷酸7-12处的AGGAGG核糖体结合位点、核苷酸21-1478处的PDI编码序列和其3'末端的GTCGAC SalI限制性位点。SEQ ID NO:22的核苷酸序列设计为紧接在启动子如诱导型启动子的下游插入。SEQ ID NO:22中的NheI和SalI限制性位点用于将其插入pBAD24表达载体的多克隆位点中。
包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的合成表达构建体及pPRO33和pBAD24载体用NheI和SalI限制性酶切割，且合成的表达构建体片段连接到载体中以产生pPRO33-MnP-ChuA和pBAD24-PDI，如恰在以上和在实施例1中所述的。E.coli
Figure BDA0002582908380000601
Express细胞(New England Biolabs(或“ΝΕΒ”),Ipswich,Massachusetts)采用热休克方法用所得的表达载体(pPRO33-MnP-ChuA和pBAD24-PDI)共转化。
B.锰过氧化物酶和蛋白质二硫键异构酶在细菌细胞中的可诱导共表达
用pPRO33-MnP-ChuA和pBAD24-PDI表达载体共转化的宿主细胞(
Figure BDA0002582908380000602
Express(pPRO33-MnP-ChuA/pBAD24-PDI)细胞)用于接种在各包含5ml LB液体培养基+34微克/mL CAM和100微克/mL AMP的四个振摇管中。在孵育(30℃下以250RPM旋转振摇)16小时，细胞以4000rpm在4℃下旋转10分钟，LB液体培养基倾出，且细胞重悬于具有酪蛋白氨基酸和0.2％甘油+34微克/mL CAM和100微克/mL AMP的4x 400微升的M9最低培养基(“M9-CA-gly+CAM+AMP”)中。然后组合体积的1.6ml重悬细胞的75微升添加到含有5ml M9-CA-gly+CAM+AMP的十个振摇管的各管中，且所得培养物的OD600测定为0.6。氯高铁血红素(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri)在所有管中(除了管1，未诱导的对照)添加达到8微摩尔的最终浓度。L-阿拉伯糖和丙酸盐诱导剂按以下浓度添加到管2-10中：
管1 未诱导的(无氯高铁血红素，无丙酸盐，无阿拉伯糖)
管2 50mM丙酸盐 0.002％阿拉伯糖
管3 25mM丙酸盐 0.002％阿拉伯糖
管4 12.5mM丙酸盐 0.002％阿拉伯糖
管5 50mM丙酸盐 0.01％阿拉伯糖
管6 25mM丙酸盐 0.01％阿拉伯糖
管7 12.5mM丙酸盐 0.01％阿拉伯糖
管8 50mM丙酸盐 0.05％阿拉伯糖
管9 25mM丙酸盐 0.05％阿拉伯糖
管10: 12.5mM丙酸盐 0.05％阿拉伯糖
细胞在25℃下伴旋转振摇诱导12小时，然后旋转并置于-80℃冰箱中。细胞团在冰上解冻，且细胞使用Qproteome Bacterial Lysis Kit(QIAGEN)按照制造商的指示裂解；Protease Inhibitor Cocktail不添加，且样品在4℃下离心。来自诱导的细胞和未诱导的对照的可溶性蛋白质提取物在10％Bis-Tris凝胶(Life Technologies,Grand Island,NewYork)上还原性条件下通过SDS凝胶电泳分离。凝胶使用RAPIDstainTM(G-Biosciences)染色。如图5中所示，来自诱导的细胞的裂解产物包含对应于PDI(53kDa)和MnP-H4(39kDa)的蛋白质，表明这些蛋白质在细菌细胞中表达为可溶性蛋白质。最大量的可溶性MnP-H4通过用50mM丙酸盐和0.002％阿拉伯糖诱导来产生(道2)。
C.锰过氧化物酶的可选成熟形式以及蛋白质二硫键异构酶的可诱导共表达和MnP-H4活性的测量
制备了表达载体以表达更完全截短形式的MnP-H4，称为MnP-H4_FT，其对应于如Sundaramoorthy等,1994(以上引用)中所述的成熟形式的MnP-H4蛋白质。MnP-H4_FT氨基酸序列因此具有连接于SEQ ID NO:13的氨基酸13-370的起始甲硫氨酸残基，并提供为SEQ IDNO:23。在这一实验中，针对在E.coli中表达优化的MnP-H4_FT编码序列(源自如上所述的优化的MnP-H4编码序列)及ChuA编码序列在pBAD24载体中表达，和PDI编码序列(类似地如上所述针对在E.coli中表达优化的)在pPRO33载体中表达。pBAD24-MnP_FT-ChuA表达构建体通过分别使用SEQ ID NO:24和25的正向和反向引物PCR扩增来自包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列的MnP-H4编码序列和终止子而制备。SEQ ID NO:24正向引物的使用将NcoI限制性位点和ATG密码子置于SEQ ID NO:13的氨基酸13-370的编码序列的紧上游，并因此产生SEQID NO:23的MnP-H4_FT氨基酸序列的编码序列。ChuA表达构建体序列分别使用SEQ ID NO:26和27的正向和反向引物从包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列的模板PCR扩增。MnP-H4_FT和ChuA PCR产物分别NcoI和SalI及用SalI和HindIII切割，并凝胶纯化和一起连接到已经用NcoI和HindIII切割、CIP处理和凝胶纯化的pBAD24载体中。连接的pBAD24-MnP FT-ChuA产物包含由pBAD启动子表达的MnP-H4_FT编码序列，之后是B0015双重终止子、J23104组成型启动子、B0034核糖体结合位点和ChuA蛋白质编码序列。这一pBAD24-MnP_FT-ChuA表达构建体具有SEQ ID NO:28中提供的核苷酸序列。
pPRO33-PDI表达构建体通过用NheI和SalI切割如上所述针对在E.coli中表达优化并包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的pPRO33载体和PDI表达构建体、用CIP处理切割的pPRO33载体、凝胶纯化片段并将其连接到一起而制备。所得的pPRO33-PDI表达构建体具有SEQ ID NO:29中提供的核苷酸序列。pBAD24-MnP_FT-ChuA和pPRO33-PDI表达构建体用于在37℃下共转化E.coli
Figure BDA0002582908380000621
Express细胞(NEB)过夜以形成
Figure BDA0002582908380000622
Express(pBAD24-MnP_FT-ChuA/pPRO33-PDI)细胞。
Figure BDA0002582908380000623
Express(pBAD24-MnP_FT-ChuA/pPRO33-PDI)和对照
Figure BDA0002582908380000624
Express(pBAD24/pPRO33)细胞用于接种5毫升的LB培养基+CAM(34微克/毫升)+AMP(100微克/毫升)并在30℃下伴随250rpm的振摇生长过夜。细胞以4000rpm在4℃下旋转10分钟，并首先重悬于400微升M9最低(CA_noGlycerol：具有酪蛋白氨基酸作为碳源，但没有甘油)+CAM+AMP培养基中，和随后75微升添加到5毫升M9(CA noGlycerol)最低培养基+CAM+AMP中。在于30℃下伴随250rpm的振摇生长的培养物达到0.6的OD600后，获得十等份的
Figure BDA0002582908380000625
Express(pBAD24-MnP_FT-ChuA/pPRO33-PDI)细胞并在不同浓度的氯高铁血红素和不同浓度的阿拉伯糖和丙酸盐诱导剂中诱导。样品1(对照)不接受氯高铁血红素和诱导剂；其它九个样品具有添加达到8微摩尔最终浓度的氯高铁血红素；0.025％、0.05％或0.1％的阿拉伯糖浓度；和12.5mM、25mM或50mM的丙酸盐浓度。对照
Figure BDA0002582908380000626
Express(pBAD24/pPRO33)细胞(没有插入序列)也包括在诱导过程中，具有“诱导的”样品和未诱导的对照样品。细胞在25℃下伴随250rpm的振摇诱导12小时，然后旋转并储存在-80℃下。为使通过诱导的共表达产生的蛋白质可视化，冷冻的细胞团解冻并使用Qproteome Bacterial Lysis Kit(QIAGEN)按照指示裂解，但35微升的裂解缓冲液用于各1微升的细菌培养物。来自
Figure BDA0002582908380000631
Express(pBAD24-MnP_FT-ChuA/pPRO33-PDI)诱导的细胞和未诱导的对照的可溶性蛋白质提取物在10％Bis-Tris凝胶上还原性条件下通过SDS凝胶电泳分离；样品在加载到凝胶上之前在70℃下加热10分钟。在用RAPIDstainTM染色凝胶(凝胶未显示)后，在所有诱导的样品中但未在未诱导的对照中具有对应于MnP-H4_FT和PDI的可见条带，且凝胶上条带的表观密度表明0.1％阿拉伯糖和50mM丙酸盐的组合产生最多的MnP-H4_FT蛋白质且较高的阿拉伯糖浓度一般产生更多的MnP-H4_FT，而较低的阿拉伯糖浓度一般产生更多的PDI，这可能是由于阿拉伯糖对丙酸盐启动子的分解代谢产物阻遏。
为测定可诱导共表达产生的MnP-H4_FT的活性水平，由0.1％阿拉伯糖和50mM丙酸盐下MnP-H4_FT蛋白质的共表达获得的0.5毫升可溶性细胞裂解部分使用0.5-毫升20,000-MWCO(分子量截止值)Slide-A-LyzerTM(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham MA)针对10毫摩尔乙酸钠、5毫摩尔CaCl2,pH 4.5透析。样品在4℃下透析2小时，缓冲液更换为新鲜缓冲液，且透析在4℃下持续过夜。在透析结束时具有蛋白质沉淀，但MnP-H4_FT蛋白质仍然是可溶的和活性的，如通过凝胶电泳和通过比色酶活性分析证明的。包含MnP-H4_FT的透析蛋白质样品以及从
Figure BDA0002582908380000632
Express(pBAD24-MnP_FT-ChuA/pPRO33-PDI)未诱导对照细胞和从非插入
Figure BDA0002582908380000633
Express(pBAD24/pPRO33)诱导的和未诱导对照细胞获得的可溶性蛋白质部分在10％Bis-Tris凝胶上还原性条件下通过SDS凝胶电泳分离；样品在加载到凝胶上之前在70℃下加热10分钟。在用RAPIDstainTM染色凝胶后，如图6中所示，对应于PDI(54kDa)和MnP-H4_FT(38kDa)的条带在通过0.1％阿拉伯糖和50mM丙酸盐中共表达产生的透析蛋白质样品中明显可见(图6,道2)，且在任何对照样品(道3-
Figure BDA0002582908380000634
Express(pBAD24-MnP_FT-ChuA/pPRO33-PDI)未诱导对照；道4–非插入诱导对照；道5-非插入未诱导对照)中不可见。通过可诱导共表达产生的MnP-H4_FT蛋白质的酶学活性使用以下实施例4的E节中描述的比色锰过氧化物酶测定法分析，且共表达的MnP-H4_FT蛋白质显示为具有与阳性对照MnP样品相当的锰过氧化物酶活性。
D.锰过氧化物酶的产生和纯化
已用MnP-ChuA和PDI表达载体共转化的宿主细胞划线接种到包含氯霉素和氨苄青霉素的LB板上。挑取单一集落且各自用于接种含有15ml LB+CAM+AMP液体培养基的振摇管。在孵育(30-37℃下，伴随250RPM的旋转振摇)足够的时间长度以产生静止相培养物后，来自具有成功生长的各管的5ml用于接种包含100ml LB+CAM+AMP液体培养基的Erlenmeyer摇瓶。在足以产生静止相培养物的进一步孵育(30-37℃下，伴随250RPM的旋转振摇)后，来自各摇瓶的样品针对足够的细胞密度进行检验。来自摇瓶的适宜体积引入无菌和pH-校准的生物反应器中并在30-37℃搅拌条件下生长；在一段时间的生长后，细胞在包含氯高铁血红素或另一亚铁血红素源的培养基中生长，直到细胞达到约0.5的OD600。细胞然后通过添加阿拉伯糖和丙酸盐诱导，例如，0.02％阿拉伯糖和50mM丙酸盐，或如通过实施例7的滴定方法确定的，且25-30℃下伴随搅拌的生长继续。在孵育后，细胞从生长培养基回收，裂解，并收集裂解产物上清液(可溶性蛋白质提取物)。MnP-H4蛋白质使用如具有尺寸排阻柱或离子交换柱的快速蛋白质液相色谱(FPLC)的方法从可溶性蛋白质提取物纯化。
E.锰过氧化物酶活性的测定
样品中锰过氧化物酶活性的量且因此活性锰过氧化物酶的浓度可以通过测试其在锰和过氧化氢存在下氧化2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)为木醋醌(coerulignone)的能力而测定。以下分析用于10微升样品；对于1微升样品的可选量在括号中给出。在添加样品前，以下成分添加到分光光度计比色皿中：0.590ml dH2O(0.599ml dH2O)；0.1ml丙二酸二钠盐一水合物(MDSH)溶液(5g MDSH在60ml dH2O,pH 4.5中)；和0.1ml MnSO4·H2O溶液(0.06gMnSO4·H2O在90ml dH2O中)。恰在测量前，0.1ml 2,6-DMP溶液(0.014g 2,6-二甲氧基苯酚在90ml dH2O中)和10微升(1微升)样品添加到比色皿中。比色皿置于分光光度计中并在469nm下归零，且0.1ml新鲜H2O2(3.4微升30％H2O2在30ml dH2O中)然后添加到比色皿中。比色皿内容物通过移液器吸打三次进行混合。添加H2O2后一分钟，测量469nm下的OD。如果OD大于0.2，样品大小减小到1微升，或待测量样品被稀释；如果OD小于0.005，样品大小增加到0.1ml和dH2O体积降低到0.500ml，所有其它体积保持相同；分析然后重复。
测量的吸光度用于按照以下公式计算以单位/L计的酶浓度(EC)：
Figure BDA0002582908380000651
其中ε1cm＝49600吸光度/M·cm·min和光路长度＝1cm。如上计算的酶浓度按照以下公式转化为mg/L：EC[mg/L]＝酶浓度[U/L]/酶比活性[U/mg]，其中MnP的标准酶比活性是160U/mg。酶比活性通过独立地测量样品中以mg/L计的蛋白质浓度(例如通过280nm下的分光光度分析)而对于任何MnP样品计算。当酶浓度(EC)使用以上2,6-DMP氧化分析测定时，以U/mg计的比活性计算为：EC[U/L]/浓度[mg/L]＝比活性[U/mg]。
实施例5
英夫利昔单抗的可诱导共表达
英夫利昔单抗是结合TNF-α(一种炎性细胞因子)的嵌合单克隆抗体，且用于治疗涉及TNF-α的状况如自身免疫性疾病(克罗恩氏病、类风湿性关节炎、银屑病等)。英夫利昔单抗由重链(显示为SEQ ID NO:30的氨基酸序列)和轻链(显示为SEQ ID NO:31的氨基酸序列)形成；这些链各自具有源自小鼠抗-TNF-α抗体的可变结构域序列和人恒定结构域。针对在E.coli中表达的密码子优化和编码SEQ ID NO:30和31的多核苷酸的合成通过DNA2.0(Menlo Park,CA)进行。通过连接英夫利昔单抗重链的优化编码序列到pBAD24表达载体的多克隆位点(MCS)中形成的表达构建体是pBAD24-英夫利昔单抗_HC，其具有如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列。通过连接英夫利昔单抗轻链的优化编码序列到pPRO33表达载体的MCS中形成的表达构建体是pPRO33-英夫利昔单抗_LC，其具有如SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列。pBAD24-英夫利昔单抗_HC和pPRO33-英夫利昔单抗_LC表达构建体用于在37℃下转化E.coli
Figure BDA0002582908380000652
Express细胞(NEB)过夜，以产生
Figure BDA0002582908380000653
Express(pBAD24-英夫利昔单抗_HC/pPRO33-英夫利昔单抗_LC)细胞。这些细胞一般地如实施例1和4中所述生长，包括按照需要添加选择化合物如氨苄青霉素和/或氯霉素，除铁优选但任选地添加到LB生长培养基中(例如以FeSO4·7H2O的形式按3.0mg/l的浓度)以外。细胞旋转并重悬在M9培养基中，优选但任选地添加作为碳源的乙酸盐(例如，0.27％乙酸钠(C2H3O2Na))以及酪蛋白氨基酸(其提供必需氨基酸，以及作为碳源)，且也优选但任选地如上所述具有培养基的铁补充，并生长直到培养物的光密度(OD600)达到0.8(参见Paliy和Gunasekera,“Growth ofE.coli BL21 in minimal media with different gluconeogenic carbon sources andsalt contents”,Appl Microbiol Biotechnol 2007Jan；73(5):1 169-1172；Epub2006Aug 30；Erratum in:Appl Microbiol Biotechnol 2006Dec；73(4):968)。此时，细胞通过添加阿拉伯糖(最初以包括0.1％的浓度)和丙酸盐(最初以包括50mM的浓度)诱导。阿拉伯糖和丙酸盐浓度的调整可以如实施例7中所述进行，且产生的英夫利昔单抗抗体如实施例9至实施例11中所述纯化和表征。
实施例6
酵母细胞中蛋白质的可诱导共表达
用于在酵母宿主细胞中可诱导地共表达MnP-H4 FT和PDI及可诱导地共表达小鼠抗-人CD19 IgG1抗体重链和轻链的表达构建体通过由GenWay Biotech Inc.(San DiegoCA)完成的以下方法产生。pJ1231-03C和pJ1234-03C载体(DNA2.0,Menlo Park,CA)用作酵母表达构建体的骨架部分，因为它们包含用于在E.coli(pUC复制起点)或酿酒酵母(2-微米环状复制起点)中质粒维持所必要的元件以及用于任一宿主中的选择标记：pJ1231-03C中的KanR(E.coli)和Leu2(酵母)；pJ1234-03C中的AmpR(E.coli)和Ura3(酵母)。pJ1231-03C和pJ1234-03C载体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:34和35所示。pJ1231-03C和pJ1234-03C载体用BfuA1限制性核酸内切酶(NEB,Catalog No.R0701S)处理；在BfuA1消化后未保留的载体片段包含表达启动子、DasherGFP编码序列和CYC1终止子序列。PCR在包含待表达多肽的编码序列的四个表达构建体上进行，以产生随后连接到bfuA1切割的pJ1231-03C和pJ1234-03C载体中的序列。所有PCR反应使用
Figure BDA0002582908380000661
Pfx DNA Polymerase(LifeTechnologies,Grand Island,New York,Catalog No.11708021)进行，且QIAEX II DNA纯化试剂盒(QIAGEN,Catalog No.20051)按照制造商的指示用于纯化PCR产物和载体片段。
pBAD24-MnP_FT-ChuA表达构建体(SEQ ID NO:28)(包含AraC编码序列、pBAD阿拉伯糖诱导启动子及MnP-H4_FT和ChuA编码序列)在两个独立的PCR反应中用作模板以添加在MnP-H4 FT编码序列和ChuA编码序列的C-末端的6xHis标签及用于克隆到载体中的BsaI限制性位点。(优选地但任选地，ChuA编码序列不改变以在其C-末端添加His标签；这可以通过使用序列与SEQ ID NO:39相似但没有SEQ ID NO:39的碱基21-38的引物完成。)用于这两个PCR反应中的引物是(1)BsaI-AraC-MnP-H4_FT引物(SEQ ID NO:36)和MnP-H4_FT-6xHis-反向引物(SEQ ID NO:37)，和(2)MnP-H4_FT-6xHis-正向引物(SEQ ID NO:38)和ChuA-6xHis-BsaI引物(SEQ ID NO:39)。进一步的PCR反应然后使用BsaI-AraC-MnP-H4_FT和ChuA-6xHis-BsaI引物在两个纯化的PCR产物上进行，以产生单一产物(AraC-MnP-H4_FT-ChuA,SEQ ID NO:40)，其被纯化，用BsaI(NEB,Catalog No.R0535S)切割并使用T4 DNA连接酶(Life Technologies,Catalog No.15224025)连接到BfuA1切割的pJ1231-03C载体中以产生pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA表达构建体。(优选地，BsaI切割的AraC-MnP-H4_FT-ChuA片段也连接到BfuA1切割的pJ1234-03C载体中，以产生pJ1234-AraC-MnP-H4_FT-ChuA表达构建体。)
pPRO33-PDI表达构建体(SEQ ID NO:29)(包含PrpR编码序列、pPRO丙酸盐诱导启动子和PDI编码序列)在PCR反应中用作模板，该PCR反应添加PDI编码序列的C-末端的5xHis标签和用于克隆到载体中的BsaI限制性位点。(优选地但任选地，PDI编码序列不改变以在其C-末端添加His标签；这可以通过使用序列与SEQ ID NO:42相似但没有SEQ ID NO:42的碱基21-35的引物完成。)用于这一PCR反应中的引物是BsaI-PrpR-PDI引物(SEQ ID NO:41)和PDI-5xHis-BsaI引物(SEQ ID NO:42)，以产生PCR产物(PrpR-PDI,SEQ ID NO:43)，其被纯化，用BsaI切割并使用T4 DNA连接酶连接到BfuA1切割的pJ1231-03C载体中以产生pJ1231-PrpR-PDI表达构建体。(优选地，BsaI切割的PrpR-PDI片段也连接到BfuA1切割的pJ1234-03C载体中，以产生pJ1234-PrpR-PDI表达构建体。)
分别编码小鼠抗-人CD19 IgG1重链和小鼠抗-人CD19 IgG1轻链的表达构建体-pBAD24-HC和pPRO33-LC-各自在两个独立的PCR反应中用作模板以在从各编码序列除去信号序列和添加用于克隆到载体中的BsaI限制性位点。对于pBAD24-HC，用于这两个PCR反应中的引物是(1)BsaI-AraC-HC-正向引物(SEQ ID NO:44)和HC-反向引物(SEQ ID NO:45)，和(2)HC-正向引物(SEQ ID NO:46)和HC-BsaI-反向引物(SEQ ID NO:47)。对于pPRO33-LC，用于这两个PCR反应中的引物是(1)BsaI-PrpR-LC-正向引物(SEQ ID NO:48)和LC-反向引物(SEQ ID NO:49)，和(2)LC-正向引物(SEQ ID NO:50)和LC-BsaI-反向引物(SEQ ID NO:51)。BsaI-AraC-HC-正向引物(SEQ ID NO:44)和BsaI-PrpR-LC-正向引物(SEQ ID NO:48)在这些反应中的使用产生缺乏信号序列的HC和LC编码序列，称为HC NS(无信号)和LC_NS：修饰的HC NS编码序列产生具有起始甲硫氨酸残基接着SEQ ID NO:2的氨基酸20-464的HC_NS多肽；修饰的LC_NS编码序列产生具有起始甲硫氨酸残基接着SEQ ID NO:4的氨基酸21-239的LC_NS多肽。进一步的PCR反应然后分别使用BsaI-AraC-HC-正向和HC-BsaI-反向引物及BsaI-PrpR-LC-正向和LC-BsaI-反向引物在各组的两个纯化的PCR产物上进行，以产生两个单独的产物(AraC-HC_NS,SEQ ID NO:52，和PrpR-LC_NS,SEQ ID NO:53)，其各自被纯化，用BsaI切割并使用T4 DNA连接酶连接到BfuA1切割的pJ1231-03C载体(PrpR-LC_NS)或BfuA1切割的pJ1234-03C载体(AraC-HC_NS)中，以产生pJ1231-PrpR-LC_NS和pJ1234-AraC-HC_NS表达构建体。
连接酶混合物转化到E.coli DH5α细胞中并接种在具有足够量的卡那霉素或氨苄青霉素的LB琼脂板上以维持质粒在DH5α细胞中。质粒DNA的制备按照标准方法进行。(任选地但优选地，制备的质粒DNA用于测序反应中以确认质粒插入片段的序列。)
感受态的INVSc-1酿酒酵母细胞使用S.c.EasyCompTM Transformation Kit(LifeTechnologies,Catalog No.K5050-01)按照制造商的指示制备。INVSc-1酿酒酵母菌株具有以下基因型(MATa his3Δ1leu2 trp1-289 ura3-52/MATαhis3Δ1leu2 trp1-289 ura3-52)和表型：His-,Leu-,Trp-,Ura-。简言之，来自INVSc-1菌株的单一集落接种在10毫升的YPD培养基(包含，每升：10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖)中并在250rpm的振动培养箱中30℃下生长过夜。第二天，过夜培养物在10毫升新鲜YPD培养基中稀释到0.3的OD600并生长直到OD600达到0.8。细胞通过在室温下以1500rpm离心5分钟收集。之后，细胞重悬在10毫升溶液1(洗涤溶液)中并通过在室温下以1500rpm离心5分钟收集。上清液弃去且细胞重悬在1毫升溶液2(重悬溶液)中，分成50微升等份并储存在-80℃下。为用表达构建体转化感受态酵母细胞，50微升的INVSc-1感受态细胞与1.2微克的各表达载体或对照载体和500微升溶液3(转化溶液)混合。然后细胞剧烈混合并在30℃水浴中孵育1小时和每15分钟涡旋10秒。100-和400-微升等份的转化混合物在不存在适宜选择试剂的情况下接种在SC最低琼脂板上。SC最低培养基包含，每升：6.7g酵母氮基质、20g葡萄糖、0.05g天冬氨酸、0.05g组氨酸、0.05g异亮氨酸、0.05g甲硫氨酸、0.05g苯丙氨酸、0.05g脯氨酸、0.05g丝氨酸、0.05g酪氨酸、0.05g缬氨酸、0.1g腺嘌呤、0.1g精氨酸、0.1g半胱氨酸、0.1g亮氨酸(在-Leu选择培养基中省略)、0.1g赖氨酸、0.1g苏氨酸、0.1g色氨酸和0.1g尿嘧啶(在-Ura选择培养基中省略)。用pJ1231-PrpR-PDI、pJ1231-PrpR-LC_NS和pJ1231-03C对照载体转化的INVSc-1细胞在30℃下没有亮氨酸的板上选择48-72小时。用pJ1234-AraC-HC_NS和用pJ1234-03C对照载体转化的INVSc-1细胞在相同条件下在没有尿嘧啶的SC最低琼脂板上生长。(优选地，用pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA、用pJ1234-AraC-MnP-H4_FT-ChuA和用pJ1234-PrpR-PDI转化的INVSc-1细胞也在相同条件下在没有尿嘧啶的SC最低琼脂板上生长。)用pJ1234-AraC-HC_NS和pJ1231-PrpR-LC_NS同时共转化的INVSc-1细胞在相同条件下在没有亮氨酸或尿嘧啶的SC最低琼脂板上选择。(优选地，用pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA和pJ1234-PrpR-PDI或用pJ1234-AraC-MnP-H4_FT-ChuA和pJ1231-PrpR-PDI同时共转化的INVSc-1细胞在相同条件下在没有亮氨酸或尿嘧啶的SC最低琼脂板上选择。)
刮取来自各转化的所有集落的细胞并重悬在4毫升的没有适宜的选择试剂和碳源的液体最低SC培养基中。测量各培养物中的OD600并标准化到0.4光学单位。蛋白质表达通过添加2％无菌过滤的阿拉伯糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,Catalog No.A3256-25G)到用pJ1234-AraC-HC_NS转化的培养物中诱导。在用pJ1231-PrpR-PDI和pJ1231-PrpR-LC_NS转化的细胞中，蛋白质表达通过添加2％无菌过滤的丙酸盐(Sigma-Aldrich,CatalogNo.PI 88-100G)诱导。且pJ1234-AraC-HC_NS和pJ1231-PrpR-LC_NS在相应培养物中的共表达通过添加1％阿拉伯糖和1％丙酸盐诱导。(优选地，用于通过用pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA转化的细胞的蛋白质表达和用于用pJ1231-AraC-MnP-H4_FT-ChuA和pJ1234-PrpR-PDI或用pJ1234-AraC-MnP-H4_FT-ChuA和pJ1231-PrpR-PDI共转化的细胞的诱导培养基也包含添加达到8微摩尔的最终浓度的氯高铁血红素(Sigma-Aldrich,Catalog Nos.H9039或51280))。蛋白质表达的时程是24小时，在30℃下250rpm的振动培养箱中。来自0.5毫升的各诱导前培养物的细胞通过离心收集，用1毫升的去离子水洗涤并储存在-80℃下。来自诱导后培养物的样品以相同方式制备。总蛋白质提取物从诱导前和诱导后培养物制备，在4-20％SDS-PAGE中解析，并转移到PDVF膜。目标蛋白质的表达水平通过Western印迹使用抗-6xHis标签和抗人IgG抗体进行分析。
实施例7
通过不同诱导剂浓度的共表达的滴定
为使用本发明的可诱导共表达系统优化多聚产物的产生，有可能独立地调节或滴定诱导剂的浓度。包含L-阿拉伯糖诱导的和丙酸盐诱导的表达构建体的宿主细胞在包含适宜抗生素的最低培养基中生长到所需密度(如大约0.5的OD600)，然后细胞等分到小体积的M9最低培养基(任选地没有碳源如甘油并用适宜抗生素和变化浓度的各诱导剂制备)。诱导表达必要的L-阿拉伯糖浓度通常低于2％。在滴定试验中，测试的L-阿拉伯糖浓度范围可以是2％-1.5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.005％、0.002％和0.001％。诱导L-鼠李糖诱导的和D-木糖诱导的启动子的表达必要的L-鼠李糖或D-木糖浓度类似地测试，测试的浓度范围为5％-0.01％。对于测试的L-阿拉伯糖(或L-鼠李糖或D-木糖)的各浓度“x”，添加到含浓度“x”的第一诱导剂的各管中的不同诱导剂如丙酸盐的浓度在各系列的样品中变化，其在丙酸盐的情况中范围为1M-750mM、500mM、250mM、100mM、75mM、50mM、25mM、10mM、5mM和1mM。或者，滴定试验可能以诱导剂浓度的“标准”组合(其为0.002％的L-阿拉伯糖、L-鼠李糖或D-木糖任何一种，和/或50mM丙酸盐)开始，并测试从该“标准”组合的浓度开始变化的诱导剂浓度的新组合。类似的滴定试验可以对于用于本发明可诱导共表达系统中的任何诱导剂组合进行，包括但不限于L-阿拉伯糖、丙酸盐、L-鼠李糖和D-木糖。在诱导剂存在下生长6小时后，细胞成团，所需的产物从细胞提取，且每质量值细胞的产物产率通过定量免疫分析如ELISA或通过产物的纯化和280nm下UV吸光度的定量测定。
也可能使用高通量分析滴定诱导剂浓度，其中待表达的蛋白质经工程化以包括荧光蛋白质部分，如mKate2红色荧光蛋白质(Evrogen,Moscow,Russia)提供的部分，或来自维多利亚水母和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的增强绿色荧光蛋白质。在高通量滴定试验中测定通过不同浓度诱导剂产生的基因产物的量和活性的另一途径是使用能够测量生物分子结合相互作用的传感器，如检测表面等离子体共振的传感器或利用生物层干涉测量法(BLI)的传感器(例如,来自forteBIO,Menlo Park,CA的
Figure BDA0002582908380000712
QK系统)。
实施例8
启动子强度和可诱导表达的同质性的测量
启动子的强度作为相对于合适的对照在该启动子处启动的基因产物转录的量被测量。对于指导表达构建体中基因产物的表达的组成型启动子，合适的对照可以使用相同的表达构建体，除了使用该启动子的“野生型”形式或来自“管家”基因的启动子取代待测试的启动子外。对于诱导型启动子，从该启动子的基因产物表达可以在诱导和非诱导条件下比较。
A.使用定量PCR测定由该启动子转录的RNA的水平而测量启动子强度
De Mey等的方法(“Promoter knock-in:a novel rational method for thefine tuning of gene”,BMC Biotechnol 2010Mar 24；10:26)用于测定启动子在可以在培养物中生长的宿主细胞中的相对强度。包含具有待测试启动子的表达构建体的宿主细胞和包含对照表达构建体的对照宿主细胞在培养物中一式三份地生长。在OD600＝1.0下收集一ml样品用于mRNA和蛋白质的收集。总RNA提取使用RNeasy小型试剂盒(QIAGEN,TheNetherlands)进行。RNA的纯度如QIAGEN推荐的在FA-琼脂糖凝胶上验证且RNA浓度通过测量260nm下的吸光度测定。两微克的RNA用于使用随机引物和RevertAid H Minus M-MulV反转录酶(Fermentas,Glen Burnie,Maryland)合成cDNA。启动子的强度使用设计为扩增对应于由该启动子产生的转录物的cDNA的正向和反向引物通过在iCycler
Figure BDA0002582908380000711
(Bio-Rad,Eke,Belgium)中完成的RT-qPCR测定。(为这一目的，De Mey等作者使用Fw-ppc-qPCR和Rv-ppc-qPCR引物及来自对照管家基因rpoB的引物Fw-rpoB-qPCR和Rv-rpoB-qPCR。)SYBR GreenERqPCR supermix(Life Technologies,Grand Island,New York)用于进行简短的UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)孵育(50℃，2min)，紧接着PCR扩增(95℃，8.5min；40个循环的95℃，15s及60℃，1min)和解链曲线分析(95℃，1min；55℃，1min和80个循环的55℃+0.5℃/循环，10s)以鉴定引物二聚体的存在和分析反应的特异性。PCR循环之前的这一UDG孵育步骤破坏来自之前反应的任何污染的含dU产物。UDG然后在正常PCR循环期间通过高温灭活，从而允许真正的靶序列的扩增。各样品一式三份地进行。相对表达率使用PE Applied Biosystems(PerkinElmer,Forster City,California)的“Delta-delta ct方法”计算。
B.使用荧光报道基因测量诱导型启动子强度和诱导的同质性
这些试验使用Khlebnikov等的方法(“Regulatable arabinose-inducible geneexpression system with consistent control in all cells of a culture”,JBacteriol 2000Dec；182(24):7029-7034)进行。测量诱导型启动子的诱导的试验在补充有3.4％甘油作为碳源的C培养基中进行(Helmstetter,“DNA synthesis during thedivision cycle of rapidly growing Escherichia coli B/r”,J Mol Biol 1968Feb14；31(3):507-518)。包含含有控制荧光报道基因表达的至少一个诱导型启动子的表达构建体的E.coli菌株在37℃下抗生素选择下生长到0.6-0.8的600nm光密度(OD600)。细胞通过离心(15,000x g)收集，在没有碳源的C培养基中洗涤，重悬于含抗生素、甘油和/或诱导剂(用于基因表达的诱导)的C培养基中达到0.1-0.2的OD600，并孵育6h。在生长期间中常规地获取样品用于分析。培养物荧光在具有360/40-nm波长激发和520/10-nm波长发射滤波器的Versafluor Fluorometer(Bio-Rad Inc.,Hercules,California)上测量。在诱导时来自诱导型启动子的表达的强度可以表示为诱导的细胞的最大群体平均荧光(荧光/OD比率)相对于对照(如未诱导)细胞的最大群体平均荧光的比率。为确定细胞群体内诱导的同质性，流式细胞分析在配备有氩激光器(488nm发射波长和15mW)和525-nm波长带通滤波器的Beckman-Coulter EPICS XL流式细胞仪(Beckman Instruments Inc.,Palo Alto,California)上进行。在分析前，采样的细胞用经过过滤(过滤器孔径0.22微米)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，稀释到0.05的OD600，并置于冰上。对于各样品，以500-1,000事件/s的速率收集30,000个事件。诱导的(荧光)细胞在各样品中的百分比可以从流式细胞分析数据计算。
实施例9
抗体的纯化
通过本发明可诱导共表达系统产生的抗体通过以10,000x g离心裂解的宿主细胞的样品10分钟以除去任何细胞和碎片而纯化。上清液通过0.45微粒滤器过滤。1-ml重组蛋白质
Figure BDA0002582908380000721
4B柱(Life Technologies,Grand Island,New York)设置用于获得1ml/min的流率，并用于以下缓冲液：结合缓冲液：0.02M磷酸钠,pH 7.0；洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl,pH 2.7；和中和缓冲液：1M Tris-HCl,pH 9.0。柱用5倍柱体积(5ml)的结合缓冲液平衡，然后样品施加到柱上。柱用5-10倍柱体积的结合缓冲液洗涤以除去杂质和未结合的物质，持续直到无蛋白质在洗脱液中检测到(通过280nm的UV吸光度确定)。柱然后用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，且柱立即用5-10倍柱体积的结合缓冲液再平衡。
实施例10
抗体结合亲和力的测量
抗体结合亲和力(表示为“Kd”或“Kd值”)通过用目标抗体的Fab形式及其抗原进行的放射标记抗原结合分析(RIA)测量，如以下分析所述的。全长抗体的Fab形式的产生在本领域中公知。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原存在下用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体涂覆的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如,Chen等,“Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody:crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen”,J MolBiol 1999Nov 5；293(4):865-881)。为建立用于该分析的条件，微量滴定板(DYNEXTechnologies,Inc.,Chantilly,Virginia)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5微克/ml的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs,West Chester,Pennsylvania)涂覆过夜，且随后在室温下(大约23℃)用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620；Thermo Scientific,Rochester,New York)中，100pM或26pM[125I]-抗原与系列稀释的目标Fab混合(例如，与Presta等,“Humanization of an anti-vascular endothelial growthfactor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and otherdisorders”,Cancer Res 1997Oct 15；57(20):4593-4599中抗-VEGF抗体,Fab-12的评估一致)。目标Fab然后孵育过夜；但是，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。之后，混合物转移到捕获板用于在室温下孵育(例如，一小时)。溶液然后移除且板用PBS中的0.1％TWEEN-20TM表面活性剂洗涤8次。当板已经干燥，添加150微升/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；PerkinElmer,Waltham,Massachusetts)，且板在TOPCOUNTTMγ计数器(PerkinElmer)上计数10分钟。给出低于或等于最大结合的20％的各Fab的浓度选择用于竞争结合分析。
或者，Kd或Kd值使用具有固定的抗原CM5芯片以～10反应单位(RU)在25℃下使用
Figure BDA0002582908380000741
-2000或
Figure BDA0002582908380000742
-3000仪(BIAcore,Inc.,Piscataway,New Jersey)利用表面等离子体共振测量。简言之，羧甲基化的萄聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcoreInc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基-丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照供应商的指示活化。抗原用10mM乙酸钠,pH 4.8稀释到5微克/ml(～0.2微摩尔)，之后以5微升/分钟的流率注射以获得大约10RU的偶联蛋白质。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，两倍系列稀释的Fab(0.78nM-500nM)25℃下在具有0.05％TWEEN 20TM表面活性剂的PBS(PBST)中以大约25微升/分钟的流率注射。结合速率(kon)和解离速率(koff)使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0002582908380000743
EvaluationSoftware 3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图来计算。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。如果结合速率通过以上的表面等离子体共振分析超过106M-1s-1，则结合速率可以如分光光度计(如配备停止流的分光光度计(stop-flow-equipped spectrophotometer)(Aviv Instruments)或具有搅拌池的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的，在增加浓度的抗原存在下，通过使用测量PBS,pH 7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的提高或降低的荧光淬灭技术来测定。
实施例11
表征共表达产物中存在的二硫键
共表达的蛋白质产物中二硫键的数目和位置可以通过在非还原条件下用蛋白酶如胰蛋白酶消化蛋白质并使得所得肽片段进行与顺序电子转移解离(ETD)和碰撞诱导的解离(CID)MS步骤(MS2,MS3)结合的质谱法(MS)来测定(Nili等,“Defining the disulfidebonds of insulin-like growth factor-binding protein-5by tandem massspectrometry with electron transfer dissociation and collision-induceddissociation”,J Biol Chem 2012Jan 6；287(2):1510-1519；Epub 201 1Nov 22)。
共表达的蛋白质的消化。为防止二硫键重排，任何游离半胱氨酸残基首先通过烷基化封闭：共表达的蛋白质在20℃下在具有4M尿素的缓冲液中避光与烷基化剂碘乙酰胺(5mM)在振摇情况下孵育30分钟，且然后使用预制凝胶通过非还原SDS-PAGE分离。或者，共表达的蛋白质在电泳后在凝胶中与碘乙酰胺或作为对照没有碘乙酰胺孵育。蛋白质条带进行染色、用双重去离子水脱色、切割和在500微升的50mM碳酸氢铵、50％(v/v)乙腈中20℃振摇条件下孵育30分钟两次。蛋白质样品在100％乙腈中脱水2分钟，通过真空离心干燥并用10mg/ml的胰蛋白酶或糜蛋白酶在含50mM碳酸氢铵和5mM氯化钙的缓冲液中在冰上重新水化15分钟。除去过量缓冲液并用50微升的没有酶的相同缓冲液更换，之后对于胰蛋白酶和糜蛋白酶分别在37℃或20℃振摇条件下孵育16小时。消化通过添加3微升的88％甲酸停止，且在短暂涡旋后，除去上清液并储存在-20℃下直到分析。
二硫键通过质谱定位。肽在含0.1％甲酸的流动相中以20微升/分钟注射到1mm x8mm捕集柱(Michrom BioResources,Inc.,Auburn,CA)上。捕集盒然后在线设置含有5mmZorbax SB-C18固定相的0.5mm x 250mm柱(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)，且肽用1100系列毛细管HPLC(Agilent Technologies)通过2-30％乙腈梯度以10微升/分钟经90分钟分离。肽使用具有ETD源(Thermo Scientific,San Jose,CA)的LTQ Velos线性离子阱进行分析。电喷雾离子化使用Captive Spray源(Michrom Bioresources,Inc.)进行。普查MS扫描(suevey MS scan)之后是由对于普查扫描中最高强度的离子的CID和ETD MS2扫描组成的七个数据相关扫描，之后是对ETD MS2扫描中第一至第五高强度离子的五个MS3CID扫描。CID扫描使用标准化的碰撞能量35，和ETD扫描使用100ms激活时间，使得补充激活成为可能。启动MS2 CID和ETD扫描的最小信号是10,000，用于启动MS3 CID扫描的最小信号是1000，且所有MS2和MS3扫描的分离宽度是3.0m/z。软件的动态排除特征用1的重复计数、100的排除列表大小和30s的排除持续时间实现。使用靶定用于收集ETD MS2扫描的特定交联物质的包含列表。MS2和MS3扫描的独立数据文件使用ZSA负荷状态(charge state)分析通过Bioworks 3.3(Thermo Scientific)产生。MS2和MS3扫描与肽序列的匹配通过Sequest(V27,Rev 12,Thermo Scientific)进行。该分析在没有酶特异性的情况下进行，母离子质量公差2.5、片段质量公差1.0，和对于氧化的甲硫氨酸残基+16的可变质量。结果然后使用程序Scaffold(V3_00_08,Proteome Software,Portland,OR)进行分析，使用95和99％的最小肽和蛋白质概率。来自MS3结果的肽通过扫描数分选，且含半胱氨酸的肽从由ETD MS2扫描中观察到的五个最高强度离子产生的MS3扫描组鉴别。参与到二硫键连接的物质中的半胱氨酸肽的身份进一步通过在普查扫描和ETD MS2扫描中观察到的母离子质量的人工检查来确认。
实施例12
共表达产物从细菌细胞周质、从原生质球和从全细胞的分离
本发明的可诱导共表达系统可用于表达在细胞的不同区室如胞质或周质中累积的基因产物。宿主细胞如E.coli或酿酒酵母具有外细胞膜或细胞壁，且可以在外膜或壁除去时形成原生质球。在这种宿主中形成的共表达的蛋白质可以特别地使用以下方法从周质或从原生质球或从全细胞纯化(Schoenfeld,“Convenient,rapid enrichment ofperiplasmic and spheroplasmic protein fractions using the new PeriPrepsTMPeriplasting Kit”,Epicentre Forum 1998 5(1):5；参见www.epibio.com/newsletter/f5_l/f5_lpp.asp)。使用PeriPrepsTM Periplasting Kit(
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Biotechnologies,Madison WI；方案可在www.epibio.com/pdftechlit/107pl0612.pdf获得)的这一方法设计用于E.coli和其它革兰氏阴性细菌，但一般方法可以改进以用于其它宿主细胞如酿酒酵母。
1.细菌宿主细胞培养物仅生长到后对数期，因为静止期的较老的细胞培养物通常表现出对溶菌酶处理的一些抗性。如果重组蛋白质的表达过度，则细胞可能过早地裂解；因此，细胞培养物不在可能诱导过度蛋白质合成的丰富培养基中或较高生长温度下生长。然后诱导蛋白质表达；细胞应当处于对数期或早静止期。
2.细胞培养物通过在室温下以最低1,000x g离心10分钟而成团。注：细胞必须是新鲜的，非冷冻的。测定细胞团的湿重以计算这一方案所需的试剂量。
3.细胞完全重悬于每克细胞最少2ml的PeriPreps Periplasting Buffer(200mMTris-HCl pH 7.5,20％蔗糖,1mM EDTA和30U/微升Ready-Lyse Lysozyme)中，或者通过涡旋混合或者通过吸液直到细胞悬液是均质的。注：过度搅拌可以引起原生质球的过早裂解，导致周质部分被胞质蛋白质污染。
4.在室温下孵育五分钟。最佳地，Ready-Lyse Lysozyme在室温下是活性的。在较低温度(0℃-4℃)下的裂解需要额外的孵育时间；在这样的温度下孵育时间延伸2-4倍。
5.在4℃下对于每克原始细胞团重量(步骤2)添加3ml的纯化水并通过反转混合。
6.在冰上孵育10分钟。
7.裂解的细胞通过在室温下以最低4,000x g离心15分钟而沉淀。
8.包含周质部分的上清液转移到清洁管中。
9.为降解污染的核酸，OmniCleave Endonuclease任选地添加到PeriPreps LysisBuffer。包含核酸酶通常提高蛋白质的产率和裂解产物操作的简易性，但核酸酶的添加在一些情况中是不希望的：例如，如果残留核酸酶活性或对镁辅因子的短时暴露干扰后续分析或纯化蛋白质的使用，则核酸酶的使用应当避免。相同地，添加EDTA到裂解产物中以灭活OmniCleave Endonuclease可能干扰后续分析或纯化蛋白质的使用。如果添加核酸酶，2微升的OmniCleave Endonuclease和10微升的1.0M MgCl2对于步骤10中需要的各微升的Lysis Buffer用PeriPreps Lysis Buffer(10mM Tris-HCl pH 7.5,50mM KC1,1mM EDTA和0.1％脱氧胆酸)稀释到最多1ml。
10.团块对于每克原始细胞团重量重悬在5ml的PeriPreps Lysis Buffer中。
11.团块在室温下孵育10分钟(如果包括核酸酶，OmniCleave Endonuclease活性将引起粘度的显著降低；孵育继续直到细胞悬液具有水的稠度)。
12.细胞碎片通过在4℃下以最低4,000x g离心15分钟而沉淀。
13.包含原生质球的上清液转移到清洁管中。
14.如果OmniCleave Endonuclease添加到PeriPreps Lysis Buffer中，20微升的500mM EDTA添加到每毫升所得的原生质球部分中以螯合镁(裂解产物中EDTA的最终浓度是10mM)。在核酸用OmniCleave Endonuclease水解后，裂解产物可以包含显著量的单核苷酸或寡核苷酸。这些降解产物的存在可以影响裂解产物的进一步处理：例如，核苷酸可以通过与树脂相互作用降低阴离子交换树脂的结合能力。
上述方案可以利用以下改进用于制备总细胞蛋白质。在步骤2中沉淀的细胞可以是新鲜的或冷冻的；在步骤4，细胞孵育15分钟；步骤5-8省略；在步骤10，每克原始细胞团重量添加3ml的PeriPreps Lysis Buffer。
在制备周质或原生质球或全细胞蛋白质样品后，样品可以通过多种蛋白质鉴定和/或定量方法中的任一种进行分析。在一个实施例中，周质和原生质球蛋白质的成功分级分离通过用SDS-PAGE分析一等份的周质和原生质球部分而确认(两微升的各部分一般足以通过用Coomassie Brilliant Blue染色而可视化)。独特蛋白质的存在或特定蛋白质在给定部分中的富集表明成功的分级分离。例如，如果宿主细胞包含具有氨苄青霉素抗性标记的高拷贝数质粒，则主要在周质部分中的β-内酰胺酶(31.5kDa)的存在表明成功的分级分离。周质空间中发现的其它E.coli蛋白质包括碱性磷酸酶(50kDa)和延伸因子Tu(43kDa)。给定部分中发现的蛋白质的量可以使用多种方法中的任一种(如SDS-PAGE和染色或标记的蛋白质条带的光密度分析、放射标记蛋白质的闪烁计数、酶联免疫吸附分析(ELISA)或闪烁迫近分析，以及其它方法)定量。如与原生质球部分比较的比较的周质部分中发现的蛋白质的量表明蛋白质从胞质输出到周质中的程度。
实施例13
多核苷酸或氨基酸序列相似性的测定
百分多核苷酸序列或氨基酸序列同一性定义为在两个比对的序列中相同的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列的比对中的符号的总数(包括空位)。两个序列之间的相似性程度(百分同一性)可以通过使用在网站blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi可得的Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment Tool中由NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)实施的Needleman和Wunschas的总体比对方法(J.Mol.Biol.48:443,1970)比对序列来确定。在一个实施方式中，Needleman和Wunsch比对参数设置为默认值(匹配/失配评分分别为2和-3，且存在和延伸的空位损失分别为5和2)。序列比较领域的技术人员使用的其它程序也可以用于比对序列，例如基本局部比对检索工具或
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程序(Altschul等,“Basic local alignment search tool”,J MolBiol 1990Oct 5；215(3):403-410)，如由NCBI实施的，其使用在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站描述的默认参数设置。BLAST算法具有多个任选的参数，包括可以如下使用的两个：(A)包括过滤器以掩蔽查询序列的具有低组成复杂性的片段或由短周期性内部重复序列组成的片段，其优选不使用或设置为“Off”，和(B)报告针对数据库序列的匹配的统计显著性域值，称为“预测(Expect)”或E-评分(仅偶然发现为匹配的预期概念；如果归因于匹配的统计显著性大于这一E-评分域值，匹配将不报告)。如果这一“预测”或E-评分值从默认值(10)调节，优选的域值是0.5，或按照增加优先级的顺序，0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、0.00001和0.000001。
在实施本发明中，任选地使用分子生物学、微生物学和重组DNA技术中的许多常规技术。这类常规技术涉及载体、宿主细胞和重组方法。这些技术是公知的且在例如Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume152Academic Press,Mc,San Diego,CA；Sambrook等,Molecular Cloning-A LaboratoryManual(3rd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork,2000；及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编辑,CurrentProtocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.,(2006增刊)中说明。其它可用的参考文献，例如用于细胞分离和培养及用于后续核酸或蛋白质分离，包括Freshney(1994)Culture of Animal Cell,a Manual ofBasic Technique,第三版,Wiley-Liss,New York及其中引用的参考文献；Payne等(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,NY；Gamborg和Phillips(Eds.)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NewYork)；及Atlas和Parks(Eds.)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRCPress,Boca Raton,FL。制备核酸的方法(例如，通过体外扩增、从细胞纯化或化学合成)、操作核酸的方法(例如，通过定点诱变、限制性酶消化、连接反应等)和可用于操作和制备核酸的各种载体、细胞系等描述于以上参考文献中。另外，基本上任何多核苷酸(包括标记的或生物素化多核苷酸)可以是从多个商业来源的任一个定制或标准订购的。
本发明已经依照发现或提议包含用于实施本发明的特定模式的特定实施方式进行了描述。本领域技术人员可以理解，根据本公开，可以在示例的实施方式中进行多种修饰和改变而不脱离本发明的预期范围。
所有引用的参考文献，包括专利公开，通过引用全文并入本文中。通过公布的基因组位置或其它描述指代的核苷酸和其它遗传序列也明确地通过引用并入本文中。
序列表中呈现的序列
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Claims (17)

1.一种大肠杆菌宿主细胞，其经修饰以包含降低阿拉伯糖分解代谢的araBAD操纵子的删除和消除参与2-甲基柠檬酸生物合成的一个或多个基因的功能的sbm-ygfDGH操纵子的删除。
2.如权利要求1所述的宿主细胞，其中所述sbm-ygfDGH操纵子的删除保留邻接的ygfI编码序列和终止密码子完整。
3.如权利要求1所述的宿主细胞，其中原始araE启动子用组成型启动子替换。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其中所述组成型启动子是J23104启动子。
5.如权利要求1所述的宿主细胞，其中rpsL基因具有产生rpsL-Arg43基因的突变。
6.一种大肠杆菌SHuffle Express宿主细胞，其经修饰以包含降低阿拉伯糖分解代谢的araBAD操纵子的删除和消除参与2-甲基柠檬酸生物合成的一个或多个基因的功能的sbm-ygfDGH操纵子的删除。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其中所述sbm-ygfDGH操纵子的删除保留邻接的ygfI编码序列和终止密码子完整。
8.如权利要求6所述的宿主细胞，其中原始araE启动子用组成型启动子替换。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述组成型启动子是J23104启动子。
10.如权利要求6所述的宿主细胞，其中rpsL基因具有产生rpsL-Arg43基因的突变。
11.一种酿酒酵母宿主细胞，其包含两个或更多个类型的表达构建体，其中
所述两个或更多个类型的表达构建体中的每一个类型包含诱导型启动子和编码由所述诱导型启动子转录的基因产物的多核苷酸序列；
第一诱导型启动子是丙酸盐诱导启动子和第二诱导型启动子是L-阿拉伯糖诱导启动子；
至少一个所述基因产物是选自免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的多肽，其中所述多肽缺乏信号肽；和
至少一个所述基因产物与另一个所述基因产物形成多聚体。
12.权利要求11所述的宿主细胞，其中至少一个类型的表达构建体进一步包含编码与诱导型启动子结合的转录调节子的多核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其中所述转录调节子选自AraC和PrpR。
14.如权利要求1所述的宿主细胞，其中至少一个表达构建体通过包括将多核苷酸序列插入选自pJ1231-03C和pJ1234-03C的质粒中的步骤的方法产生。
15.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含两个类型的表达构建体。
16.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述各个类型的表达构建体包含与各其它类型的表达构建体的诱导型启动子不同的诱导型启动子。
17.一种包含如权利要求1-16中任一项所述的宿主细胞的试剂盒。
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