CN1891037A - 少动鞘氨醇单胞菌在鳗鲡养殖中的应用 - Google Patents

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曾占壮
林煜
钟全福
余培建
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Abstract

少动鞘氨醇单胞菌在鳗鲡养殖中的应用，涉及少动鞘氨醇单胞菌作为益生菌应用于鳗鲡养殖。少动鞘氨醇单胞菌的适宜生长温度为20～41℃，最适生长温度为30～37℃；适宜生长盐度为0～5％，最适生长盐度为0～2.5％；适宜生长pH值为5.2～8.4，最适生长pH值为6.0～7.6。少动鞘氨醇单胞菌作为益生菌制成微生态制剂应用于鳗鲡养殖，具有提高饲料效率、促进生长和控制肠炎的功能。

Description

少动鞘氨醇单胞菌在鳗鲡养殖中的应用
技术领域
本发明属于鳗鲡养殖技术领域，涉及少动鞘氨醇单胞菌作为益生菌应用于鳗鲡养殖。
背景技术
益生菌(probiotics)是指对人和动植物机体有益的细菌。由益生菌生产的产品称为益生菌制品，主要包括：活菌体、死菌体、菌体成分及代谢产物。益生菌的作用机理主要有：通过分泌抑制性物质、竞争营养物质、竞争宿主着附点或通过竞争排斥原理，抑制有害菌的生长和繁殖；通过增加或减少胞外酶的分泌，改变其他微生物的代谢活动；通过提高机体水平或吞噬细胞的活动，提高宿主的免疫能力。1905年，俄国微生物学家梅奇尼科夫发现高加索地区居民长寿的原因为食用大量含乳酸菌的酸奶，当时使用的是保加利亚乳杆菌；20世纪20年代后，利用能于肠道生存的嗜酸乳杆菌进行酸奶生产；70年代初，利用人体肠道中的优势菌群双歧杆菌进行食品和医药开发。
动物微生态制剂(animal microecological agent AMEA)是指从动物体内外分离的有益微生物，通过特殊工艺制成只含细菌菌体和活菌制剂或包含细菌菌体和细菌代谢产生的活菌制剂。经过70年代，何明清等利用大肠杆菌SY-30和NY-10防治猪下痢以来，研究和应用的菌种、制剂种类、生产规模、应用范围以及产生的经济效益和社会效益备受国内外微生态专家的重视。我国农业部规定的饲料级微生物添加剂有12种：干酪乳杆菌；植物乳杆菌；粪链球菌；屎链球菌；乳酸片球菌；枯草芽孢杆菌；纳豆芽孢杆菌；嗜酸乳杆菌；乳链球菌；啤酒酵母菌；产朊假丝酵母和沼泽红假单胞菌。这些菌株已广泛应用于畜牧养殖业。
益生菌在水产养殖中的应用研究，最早见于1986年的报道，进入20世纪90年代，由于具有诱人的应用前景，有关报道与日俱增。1991年报道用Lactobacillus plantarum和L.helveticus能促进大鲮鲆(Scophthalmus maximus)的生长；1998年报道利用从鳕鱼肠道分离的Carnobacterium divergens能提高鳕鱼鱼苗的成活率。1995年发现一株V.alginolyticus对鱼致病菌具有拮抗功能，投喂后对三文鱼具有保护作用，能提高存活率和一些病原菌的抵抗能力。1998年利用Bacillus spp.细菌投放到养虾池，具有控制虾病发生的作用；2000年，利用Bacillus S11菌株投喂斑节对虾的V.harveyi感染具有保护功能。1994年分离到的一株细菌对太平洋牡蛎具有促生长、提高成活率的功能。1999年利用Alteromonas对轮虫具有提高生长速率、桔抗致病菌Aeromonas hydrophila等致病菌的功能。光合细菌在水产养殖中现已广泛应用于养殖水质处理。我国农业部规定的饲料级微生物添加剂有12种中部分也被利用于水产养殖，如：枯草芽孢杆菌、粪链球菌和啤酒酵母菌。
国内80年代何明清从虾体内分离出有益芽孢杆菌制成微生态添加剂用于鲤鱼抗病和促生长效果明显，1994年王红宁、何明清等研究此微生态添加剂能增加鲤鱼肠道有益微生物的数量；林志新等于罗氏沼虾应用显示促生长、提高产量和降低饲料的作用。1990年，王经邦、洪黎民等利用非O1群霍乱弧菌(BeneckCampbell)、微球菌、双歧杆菌制成僵鳗苗微生物制剂取得成效。
改革开放以来我国鳗鲡养殖业发展迅速，鳗鲡养殖业成为我国水产品出口创汇最重要的行业，至2001年产量约14万吨，居世界第一。烤鳗出口6.3万吨，产值约80亿人民币，全国共有鳗鲡养殖场1700-1800个，福建有养鳗场1300个，养鳗面积3.6万亩，(其中：精养池塘1.1万亩，土池约2.5万亩)，年产量7.9万吨，产值50亿，出口创汇4亿美元，占全国的70％。全省烤鳗加工企业26个，生产线33条，全省鳗鲡饲料厂约67家，鳗鱼饲料年产量约15万吨，占全国鳗鱼饲料生产量的50％。鳗鲡养殖已成为我国水产养殖中最具竞争能力的品种。
随着鳗鲡养殖业的迅猛发展，养殖规模不断扩大、养殖产量不断提高，竞争的价格优胜逐渐使我国的鳗鲡产品占据了主要消费国的市场。但是，由于采用高密度开放式的养殖模式，鳗鲡养殖消耗了大量的水资源，也导致了养殖水环境的污染和水源的匮乏，养殖过程中疾病的发生日趋严重，为了控制疾病，提高养殖成活率及产量，养殖者使用化学制剂进行疾病的控制，导致化学药品对养殖水环境、土壤环境污染以及药物在鳗鲡产品中的残留，影响了产品质量安全，导致消费者对鳗鲡产品消费的下降，从而，影响了产品的出口，严重影响了产品的价格，损害了养殖者的利益。产品质量存在的不安全因素，导致产品进口国对我国输出的鳗鲡产品进行严格的检验检测，从2002年的汞残留事件到2003年的环丙沙星、恩诺沙星事件，导致我国出口日本的鳗鲡产品严重下降，面临被禁止输入的危险境地。国内和其它市场也面临着消费下降的趋势，严重打击了我国存在优势的鳗鲡养殖业，也使养殖及相关企业遭受了严重的经济损失。
为了提高产品质量，增强产品的市场竞争能力，保障消费者的利益，应及时对鳗鲡养殖进行技术革新，我国现正在进行加强规范管理，控制药物使用，从涉及产品质量安全的各环节进行关键点控制。但是，鳗鲡养殖中病害发生是不可避免的，为了控制化学药物的使用，就应积极从病害预防入手，改善养殖生态环境、改良养殖模式解决药物残留的技术点，也是适合我国国情、易满足生产使用的实用技术。
益生菌通过分泌抑制性物质、竞争营养物质、竞争宿主的着附点或抑制有害细菌生长和繁殖达到控制病害的目的。此外，益生菌还具有促进鱼类食欲、提高饲料利用效率、生长和增重和提升机体的免疫能力，鳗鲡养殖中现也在使用益生菌，如使用光合细菌、EM等对养殖池水处理，改良养殖环境；使用加酶益生素、产酶益生素等作为饲料添加剂，用以提高饲料利用效率、稳定肠道正常菌群、抑制病原菌繁殖、提高鳗鲡机体水平等，但作为鳗鲡饲料添加用益生菌，其菌株来源均为畜禽或其它途径分离，鳗鲡为水生生物，属变温动物、肉食性，其肠道菌群肯定有其特性，现有产品在使用中功效显示不明显，因而，通过从鳗鲡肠道本身分离的原籍益生菌使用于鳗鲡，将能充分发挥益生菌的作用，满足鳗鲡养殖使用要求。
应用鳗鲡肠道分离的原籍少动鞘氨醇单胞菌作为益生菌制成微生态制剂应用于鳗鲡养殖提高饲料效率、促进生长和控制肠炎和其他水产养殖品种至今未见报道。
发明内容
本发明的目的在于公开少动鞘氨醇单胞菌作为益生菌制成微生态制剂应用于鳗鲡养殖，具有提高饲料效率、促进生长和控制肠炎的功能。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
(1)少动鞘氨醇单胞菌的来源  采用甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)分离芽孢杆菌、马铃薯葡萄糖(PDA)分离酵母菌、伊红美蓝(EMB)分离大肠菌群、链球菌琼脂(KF)分离肠球菌、CDC厌氧琼脂(CDC)分离厌氧菌、营养琼脂(NA)分离常见细菌，分离白仔养殖期、水蚯蚓投喂期、白仔料投喂期、黑仔料投喂期、幼鳗养殖期投喂期和成鳗养殖期投喂期正常养殖鳗鲡肠道优势菌群，将分离菌株根据分离对象、时间及培养基进行编号建立菌种库。将菌种库菌株进行产酶能力测试、在鳗鲡饲料平板生长、发酵鳗鲡饲料的BOD值进行有益菌的初步筛选，筛选出对部分病原菌具有抑制作用、产酶能力较好、将在鳗鲡饲料平板生长良好和对鳗鲡饲料发酵BOD值较高的菌株进行鱼粉发酵测定游离氨基酸量和对鳗鲡的毒力，选择出能有效提高鱼粉游离氨基酸量和对鳗鲡低毒的菌株，通过对鳗鲡进行鳗鲡饲料表观消化率的测定选择出最优良的菌株A31009NA进行细菌种类鉴定，鉴定结果为少动鞘氨醇单胞菌。
(2)适宜培养条件的研究  将分离到的少动鞘氨醇单胞菌在不同温度、盐度和pH值条件下进行适宜生长条件的研究，寻找到最适宜的培养条件。少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)的适宜生长温度为20～41℃，最适生长温度为30～37℃；适宜生长盐度为0～5％，最适生长盐度为0～2.5％；适宜生长pH值为5.2～8.4，最适生长pH值为6.0～7.6。
(3)优化培养基的研究  在最适宜的30℃、pH 7.2、盐度0.5％培养条件下，利用正交试验设计法对培养基的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和无机盐等研究提高细菌产量的培养基成分进行优化，形成优化培养基配方。形成培养基的优化配方为：蛋白胨1.0％；牛肉膏0.1％；食盐0.5％；葡萄糖1.0％，硫酸铵0.05％；酵母膏0.5％；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CuSO4·5H2O0.15mg/L；MnSO4·H2O 1.5mg/L；CoCl2·6H2O 0.15mg/L。
(4)生长规律研究  在优化培养基中，30℃、振荡培养条件下，采用分光光度计测定细菌悬液的吸光值，描绘出生长曲线，制定收集最适时间。适宜的收集时间为36～40h。
(5)计数方法的研究  生产出的细菌进行显微镜、平板涂布和平板倾注计数方法的研究，确定合适的细菌计数方法。适宜的计数方法为平板涂布和平板倾注法。
(6)少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)对鳗鲡安全性研究  利用鳗鲡进行毒力试验，确定少动鞘氨醇单胞菌对鳗鲡的毒性，制定细菌的应用剂量范围。少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)在浓度＜109cfu/mL或＜109cfu/g条件下，对鳗鲡无毒力表现，因次，应用细菌时剂量控制在＜107cfu/g条件下是安全的，优选为105～107cfu/mL。
(7)少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)对鳗鲡饲料表观消化率影响研究  利用三氧化二铬为指示剂，收集鳗鲡粪便，于实验室测定试验菌株对鳗鲡饲料表观消化率影响，以证实试验菌株具有提高鳗鲡饲料效率的作用。添加少动鞘氨醇单胞菌含量达106cfu/g时，干物质表观消化率和蛋白质表观消化率分别比对照组增加42.96％和13.11％。
(8)产品制作技术研究  发酵液制作成粉状制剂载体、烘干温度、时间选择研究，制定合适的载体使用量和烘干温度和时间。硅藻土和淀粉作载体对细菌损失差异不显著，考虑到鳗鲡饲料以淀粉作黏合剂，因此，选择以淀粉作载体与饲料应用相符；根据少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)适宜生长温度范围，烘干温度应＜40℃；烘干时间根据水分含量最终保持10～12％，时间控制为4～6h.。
(9)产品稳定性的研究  定期检测粉状制品中少动鞘氨醇单胞菌数量变化，确定数量递减速度，确定保存期限。使用剂量要求105～107cfu/g，保存140d数量下降102cfu/g，生产品含量为106～107cfu/g，因此，保存期不得超过120d。
(10)产品使用效果的研究  将含有一定少动鞘氨醇单胞菌数量的粉状制品作为饲料添加剂添加到鳗鲡饲料中，投喂鳗鲡，观察鳗鲡的摄食强度、对肠炎的控制效果和对鳗鲡饲料转化率的影响。使用结果显示，产品能有效控制肠炎，并具有提高饲料转化率的功效。
具体实施方式
本发明的具体实施方式参照下面的实施例进行详细说明，但并不局限于此。
实施例1.养殖鳗鲡肠道菌群菌种库和优势菌群库的建立
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1培养基与工作液成分  分离培养基有：甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)分离芽孢杆菌、马铃薯葡萄糖(PDA)分离酵母菌、伊红美蓝(EMB)分离大肠菌群、链球菌琼脂(KF)分离肠球菌、CDC厌氧琼脂(CDC)分离厌氧菌、营养琼脂(NA)代表肠道菌总量。工作液：PBS(pH 7.3)和厌氧菌稀释液。
厌氧菌稀释液：
Na2HPO4  6g           KH2PO4   4.5g
L-LYS       0.5g          琼脂       1g
吐温80      0.5g
加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌15min
1.1.2试验鳗鲡  日本鳗鲡：玻璃鳗未训饵(平均规格0.2g/尾)、投喂水蚯蚓18d(平均规格0.5g/尾)、白仔料投喂期(转换人工配合饲料后19d，平均规格8.8g/尾)、黑仔料投喂期(转换人工配合饲料后49d，平均规格11.24g/尾)、幼鳗料投喂期(转料87d，平均规格38.46g/尾))和成鳗养殖期(平均规格113.6-250g/尾)。试验鳗鲡由福清三华融兴养殖公司提供。欧洲鳗鲡：白仔养殖期(玻璃鳗未训饵，平均规格0.45g/尾)、投喂水蚯蚓22d(平均规格0.67g/尾)、白仔料投喂期(转换人工配合饲料后20d，平均规格6.3g/尾)、转料45d(黑仔料，平均规格10.55g/尾))、幼鳗养殖期(转料93d(幼鳗料，平均规格38.6g/尾))和成鳗养殖期(成鳗料，平均规格270.0g/尾)。试验鳗鲡由福清海华养殖公司提供。
1.1.3试验时间  日本鳗鲡：2003、1、17；2003、2、25；2003、3、28；2003、4、17；2003、6、17；2004、2、24。欧洲鳗鲡：2003、1、9；2003、2、9；2003、4、9；2003、4、29；2003、6、17；2004、2、24。
1.1.5试验仪器  LRH-250-A生化培养箱(广东省医疗器械厂)；无菌操作台、YQX-II厌氧培养箱(上海跃进医疗器械厂)、BS-IE振荡培养箱(常州国华电器有限公司)。
1.2试验方法
1.2.1鳗鲡采样  白仔未开口期鳗鲡采样为放苗后4～5d，褪盐后的鳗苗；其余样品为投饵后1h采集样品，塑料袋充氧2～3h内运达实验室，一半迅速进行进行肠道细菌分离(饱食状态)，其余于水族箱不投饵、连续充气、每日换水1/2暂养10d，待完全排空消化道食物及粪便后(空腹状态)进行肠道细菌分离。
1.2.2需氧肠道细菌分离与培养  于超净工作台用70％的酒精擦拭体表三遍，无菌解剖，70％的酒精擦拭肠道及胃外壁一遍，轻轻分离肠道，无菌棉线结扎肠道与胃的交界处与肠下端，剪取结扎肠道，放入无菌的玻璃容器内，精确称重。剪取结扎内肠道进入无菌碾钵，加PBS液，使肠道及内含物为总量的10％，加适量无菌细沙碾磨成浆，取1ml浆液进行10倍梯度稀释至10-8，于不同培养基平皿滴种，每稀释度重复3滴，每滴25μl，每个平皿滴种2个稀释度。30℃培养48h。
1.2.3厌氧肠道菌的分离与培养  于超净工作台用70％的酒精擦拭体表三遍后，无菌解剖，70％的酒精擦拭肠道及胃外壁一遍，轻轻分离肠道，无菌棉线结扎肠道与胃的交界处与肠下端，剪取结扎肠道，放入无菌的玻璃容器内，精确称重后进入厌氧手套培养箱，PBS液用厌氧菌稀释液替代，其余同需氧菌方法，30℃培养96h，培养期间不间断以10ml/min的速度给厌氧培养箱补充混合气。
1.2.4计数  选菌落生长蔬密适当的稀释度计菌数，求出3滴样品菌落形成单位(cfu)平均值，由菌落数和稀释指数计算出每克标本中的各种属活菌数(cfu/g)。细菌数(cfu/g)＝菌落数×稀释倍数×1000/滴容积(μl)×(稀释液量(ml)+标本重量(g))/标本重量(g)
1.2.5菌株库和优势菌株库的建立  将所有平板培养出现不同形态的菌落代表肠道菌株，将空腹状态下最高稀释度的生长的不同菌落3～5个，代表优势菌，分别纯化后，NA液体培养基振荡培养18h，加30％无菌丙三醇，-20℃保存，作为菌株库和优势菌株库，以后对其进行初步鉴定。
1.2.6细菌初步鉴定  按照《一般细菌常用鉴定方法》分别进行菌落特征、革兰氏染色、氧化酶、过氧化氢酶、O/F试验、动力和双糖铁试验初步鉴定到科。
2结果
2.1菌种库  建立了养殖鳗鲡肠道菌群菌株448株。
2.2优势菌种库  保存了养殖鳗鲡肠道优势菌株293株，作为养殖鳗鲡肠道优势菌种库。
实施例2分离菌株酶活性和鳗鲡饲料培养基生长的测定
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1培养基  ①明胶液化试验培养基：蛋白胨15g、牛肉浸粉3g、明胶120g、水1000mL、pH 7.0。②脂酶试验培养基：蛋白胨10g、NaCl 5g、CaCl2·7H2O 0.1g、琼脂9g、土温-80 10mL、水1000mL、pH 7.4。③淀粉琼脂：营养琼脂100mL、马铃薯淀粉10g、水1000mL、pH 7.0～7.2。④卵磷脂酶试验培养基：蛋白胨5g、NaCl 1g、磷酸二氢钠2.5g、硫酸镁0.05g、葡萄糖1g、琼脂13g、50％卵黄生理盐水乳化液100mL、水900mL、pH 7.4。⑤酪蛋白琼脂：琼脂13g、脱脂牛奶50mL、水1000mL。⑥甲壳质琼脂：酪素5g、甲壳质盐2g、5％磷酸氢二钾水溶液7mL、硫酸镁(MgSO4·7H2O)(1∶10000)7mL、琼脂15g、水1000mL、pH 7.5。⑦饲料琼脂培养基：鳗鲡成鳗饲料1.8g，琼脂15g，用蒸馏水1000ml，pH值7.5。
1.1.2供试菌株  从正常鳗鲡消化道448株用于酶活性测定。饲料琼脂生长测定选择产生3种以上酶的菌株。
1.1.4试验仪器  LRH-250-A生化培养箱(广东省医疗器械厂)；SHA-B水浴恒温震荡器(江苏金坛中大仪器厂)。
1.2试验方法
1.2.1培养基制备  ①明胶液化试验培养基：各成分相加放在60℃左右水浴中，待完全溶化后，使之沸腾一次，调pH值7.0，每支分装5mL，116℃ 15min高压灭菌，制成高层备用。②脂酶试验培养基：除土温80外，将培养基各成分加入水中，加热溶解，调pH值7.4。121℃ 15min高压灭菌。将土温-80 121℃ 15min高压灭菌，冷却至约50℃，加到冷却至约50℃灭菌的基础培养基中，立即倾注平皿。③淀粉琼脂：淀粉加水50mL，充分振荡成泥状，将其加入已溶化的琼脂中，116℃ 15min高压灭菌后制成平板。④卵磷脂酶试验培养基：除卵黄生理盐水乳化液外，其余成分混合后加热溶化，116℃ 15min高压灭菌，冷却至约50℃，无菌加入无菌的卵黄生理盐水乳化液100mL后制成平板。⑤酪蛋白琼脂：混匀各成分，煮沸，121℃ 15min高压灭菌，制成平板。⑥甲壳质琼脂：将各成分加入水中，加热溶解，116℃ 15min高压灭菌，倾注灭菌平皿。⑦饲料琼脂培养基：将各成分加入水中煮沸溶解，调整pH值7.5，高压灭菌后倒平板。
1.2.2试验用菌液  将供试菌株分别接种牛肉膏蛋白胨培养基，30℃培养过夜。
1.2.3接种与培养  ①明胶液化：取于牛肉膏蛋白胨培养基培养18～24h的待试菌纯培养物，穿刺接种于明胶高层2/3深度，另用未接种培养基同时培养，作为对照。20～22℃培养15d。②脂酶试验：取于牛肉膏蛋白胨培养基培养18～24h的待试菌纯培养物，点种脂酶试验培养基平板，30℃培养4d。③淀粉酶试验：取于牛肉膏蛋白胨培养基培养18～24h的待试菌纯培养物，点种淀粉琼脂平板，30℃培养48h。④卵磷脂酶试验：取于牛肉膏蛋白胨培养基培养18～24h的待试菌纯培养物，点种卵磷脂酶试验培养基平板，30℃培养2d。⑤酪蛋白水解：取于牛肉膏蛋白胨培养基培养18～24h的待试菌纯培养物，点种酪蛋白琼脂培养基平板，30℃培养2d。⑥甲壳质水解：取于牛肉膏蛋白胨培养基培养18～24h的待试菌纯培养物，点种甲壳质琼脂培养基平板，30℃培养4d。⑦饲料琼脂培养基：取于牛肉膏蛋白胨培养基培养18～24h的待试菌纯培养物，点种饲料琼脂培养基平板，30℃培养2d，观察生长情况。
1.2.4结果判定  ①明胶液化：结果观察时，先置于冰箱，待未接种的空白明胶凝固后，再观察接种细菌的培养基是否被细菌液化，如确被液化或部分液化，即为试验阳性，试验期间每天观察一次。②脂酶试验：产生透明圈者为阳性，否则为阴性。③淀粉酶试验：滴卢哥氏液于菌落，若淀粉被分解无色，菌落周围培养基基本透明为阳性；若淀粉未被分解呈紫色为阴性。④卵磷脂酶试验：菌落周围产生乳白色浑浊环者为阳性；反之为阴性。⑤酪蛋白水解：若菌落周围出现透明环，在其表面滴加氯化汞溶液，如仍透明不变，判别为阳性，反之为阴性。⑥甲壳质水解：菌落周围出现透明环者为阳性，反之为阴性，试验期间每天观察一次。⑦饲料琼脂培养基生长：出现良好菌落为生长良好。
2结果
由肠道菌株和水蚯蚓菌株筛选出产生任一试验酶的菌株225株；其中具明胶液化酶139株；脂酶52株；淀粉水解酶67株；卵磷脂酶66株；酪蛋白酶99株；甲壳质酶8株；纤维素水解酶0株。产生2种酶以上101株；产生3种酶以上58株；产生4种酶以上35株。选择产生3种酶以上58株于饲料琼脂培养基，得生长良好的肠道菌共47株。
实施例3  BOD试验
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1饲料培养  基鳗鲡成鳗饲料1.5g(粗蛋白48.4％、粗脂肪4.6％、粗纤维0.7％、水分4.5％、钙4.2％、总磷2.3％、粗灰分15.5％)，用100ml蒸馏水煮沸，调整pH值7.5，121℃高压灭菌20min备用。
1.1.2供试菌株  于饲料琼脂培养基生长良好的肠道菌，共47株。
1.1.3试验仪器  BS-IE振荡培养箱(常州国华电器有限公司)；LRH-250-A生化培养箱(广东省医疗器械厂)MODEL-IIA型差压式BOD测定装置(广东韶关科力实验仪器有限公司生产)培养瓶编号为No：6。
1.2试验方法
1.2.1菌种扩增  由-20℃保存的液体保种管取20ul菌液，接种到饲料液体培养基12ml，30℃振荡培养24h。
1.2.2培养瓶消毒  用自来水配置1000mg/L的菌敌溶液(三氯异氰尿酸钠，含有效氯30％，广州精博动物药业有限公司生产)，将培养瓶及搅拌子、吸收杯于菌敌溶液浸泡4h后，于超净工作台中取出，用无菌自来水冲洗四遍，空干水后使用。
1.2.3接种与培养  根据预备实验，选择量程为450mL。每个培养瓶接种扩增菌液8mL，接种液体培养液72mL，按照仪器使用方法在生化培养箱中20℃培养，测试菌株对鳗鲡饲料的利用能力。于第2d和第5d读数。
1.2.4实际BOD的计算  按照说明书方法，本实验选择水样不稀释，但需扣除接种水的BOD5的测定方案，计算公式如下：
BOD＝(R1×K1-R2×K2×f1)×f2
式中，R1为接种后水样的差压计读数；
K1为接种后水样所选测定量程系数；
R2为接种水的差压计读数，刻度格；
K2为接种水所选测定量程系数；
f1为接种水的比例；f2为1-f1
2结果
2.1BOD测定结果见表1。由BOD测定结果共筛选出19株对饲料具有较好分解能力的菌株。
                          表1.试验菌株BOD测定结果
序号 菌株号   BOD2读数   BOD5读数   对照BOD2读数   对照BOD5读数   实际BOD2   实际BOD5
  1   J40209Y1   8.1   18.4   4.7   9.3   16.6868   38.20689
  2   A40209Y1   8   18.1   4.7   9.3   16.4681   37.55079
  3   A40209NA3   9.6   19.6   4.7   9.3   19.9673   40.83129
  4   J40209CDC4   8.9   19.8   4.7   9.3   18.4364   41.26869
  5   A40209Camp3   7.7   20   4.7   9.3   15.812   41.70609
  6   A40209CDC3   8.3   18.2   4.7   9.3   17.1242   37.76949
  7   A40209CDC4   10   19.5   4.7   9.3   20.8421   40.61259
  8   J40209CDC2   0.1   0.8   0   0   0.40905   3.2724
  9   A40209BA3   4   7.7   0   0   16.362   31.49685
  10   J40209Camp2   0.1   0.1   0   0   0.40905   0.40905
  11   A40209Camp1   1.6   5   0   0   6.5448   20.4525
  12   A40209Camp2   0.3   0.4   0   0   1.22715   1.6362
  13   HH40226Camp1   16.8   22.9   4.7   9.3   35.7137   48.04839
  14   HH40226CDC3   8.9   10.5   0.3   0.3   36.2827   42.82754
  15   A30617Y2   9.7   21   4.7   9.3   20.186   43.89309
  16   J30617CDC2   0.1   0.1   0   0   0.40905   0.40905
  17   A30617CDC1   0.1   0.1   0   0   0.40905   0.40905
  18   J30617N1   0.4   0.4   0   0   1.6362   1.6362
  19   A30617N1   0.1   0.1   0   0   0.40905   0.40905
  20   A30927Y5   2.4   3.2   0.3   0.3   9.69449   12.96689
  21   A30927KF2   0.2   0.2   0   0   0.8181   0.8181
  22   A30927KF3   0.1   0.1   0   0   0.40905   0.40905
  23   A30927CDC1   0.4   4   0   0   1.6362   16.362
  24   A30927NA1   0.3   0.3   0   0   1.22715   1.22715
  25   A30927BA1   0   0.1   0   0   0   0.40905
  26   J30927CDC1   0.4   0.4   0   0   1.6362   1.6362
  27   A30927BA4   0   0.1   0   0   0   0.40905
  28   A30927KF1   0   0   0   0   0   0
  29   A31009CDC10   0.3   1.6   0   0   1.22715   6.5448
  30   A31009CDC15   0.6   1.8   0   0   2.4543   7.3629
  31   A31009NA   4.4   5.2   0.3   0.3   17.8755   21.14789
  32   A31009CDC2   0   0.1   0   0   0   0.40905
  33   J30117Y1   0.1   3.2   0.3   0.3   0.28634   12.96689
  34   J30117N7   3.9   6.2   0   0   15.953   25.3611
  35   J30206CDC4   3.2   4.9   0.3   0.3   12.9669   19.92074
  36   J30329N2   0   0   0   0   0   0
  37   J30329N3   0.3   0.3   0   0   1.22715   1.22715
  38   J30409MYP1   1.8   3.4   0   0   7.3629   13.9077
  39   A40106NA1   4.3   5.4   0   0   17.5892   22.0887
  40   A40106BA1   7.2   9.4   0   0   29.4516   38.4507
  41   A40106P   7.3   9.7   0   0   29.8607   39.67785
  42   J40106Camp   5   8.3   0   0   20.4525   33.95115
  43   J30429M1   0   2.2   0   0   0   8.9991
  44   J30801Camp2   0.3   0.3   0   0   1.22715   1.22715
  45   A40218Y   0   0   0   0   0   0
  46   A40218BA1   0.1   0.1   0   0   0.40905   0.40905
  47   A40218BA2   3.5   4.5   0   0   14.3168   18.40725
实施例4.鱼粉的降解试验
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1牛肉膏蛋白胨培养基  牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL、琼脂15.0g，pH 7.0～7.2。
1.1.2鱼粉  由福建省农科院饲料检测中心提供，美国工船鱼粉，已完成对游离氨基酸的测试。定量称取鱼粉20g，于250mL三角烧瓶中高压灭菌，备用。
1.1.3供试菌株  经BOD试验筛选出19株菌，鉴定后去除未定种和已知为病原的菌株，留下J30117N7(短小芽孢Bacillus pumilus)、A40106BA1(反硝化金氏菌Kingella denitrificans)、A40209CDC4(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)、A30617Y2(威斯康星米勒氏菌Moellerella wisconsensis)、A40106NA1(无色杆菌属某些种Achromobacter species)、J40106Camp(莫拉氏菌属某些种Achromobacter species)、A31009NA(少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis)，合计7株。
1.1.4试验仪器  日立835氨基酸自动分析仪；BS-IE振荡培养箱(常州国华电器有限公司)。
1.2试验方法
1.2.1菌液  将试验用菌株接种牛肉膏蛋白胨培养基平板，30℃培养24h，用无菌蒸馏水洗下后，用无菌蒸馏水稀释，定容60mL；将菌悬液无菌操作加入装有鱼粉的三角烧瓶，振荡箱培养箱30℃、250r·min-1，震荡培养12h，用1000mg/L的鱼虾敌菌灵(山西省运城中达化工有限公司制造，含有效氯30％)1.2mL终止发酵。于4℃冰箱静止24h，4500r·min-1离心10min，取上悬浊液以1∶50比例稀释后测定游离氨基酸。
1.2.2游离氨基酸测定方法：前处理按照GBT18246-2000(7.1.1.1)方法处理。
2结果
2.1试验菌株对鱼粉发酵后游离氨基酸的试验结果见表2。
                               表2.试验菌株对鱼粉发酵后游离氨基酸的测定结果
  氨基酸含量(g/L)   莫拉氏菌属某些种   短小芽孢杆菌   反硝化金氏菌   枯草芽孢杆菌   少动鞘氨醇单胞菌   无色杆菌属某些种   威斯康星米勒氏菌 对照组
  天门冬氨酸   1.62   1.61   1.9   4.71   3.45   1.59   1.61   1.33
  苏氨酸   0.68   0.64   0.75   2   1.58   0.62   0.62   0.55
  丝氨酸   1.04   1.03   1.19   2.64   1.79   1.01   1.01   1
  谷氨酸   2.39   2.37   2.76   7.95   6.39   2.33   2.34   2.23
  甘氨酸   4.22   4.06   4.75   6.75   6.09   3.98   4.02   3.39
  丙氨酸   1.63   1.69   1.8   3.96   4.01   1.5   1.49   1.33
  胱氨酸   0.1   0.1   0.11   0.16   0.14   0.1   0.09   0.09
  缬氨酸   0.59   0.53   0.66   1.79   1.42   0.56   0.57   0.45
  甲硫(蛋)氨酸   0.43   0.44   0.47   1.19   1.11   0.39   0.38   0.39
  异亮氨酸   0.41   0.37   0.46   1.33   0.96   0.39   0.39   0.37
  亮氨酸   0.85   0.84   1.01   3.16   2.17   0.85   0.86   0.85
  酪氨酸   0.43   0.44   0.5   1.07   1.09   0.42   0.43   0.79
  苯丙氨酸   0.38   0.55   0.6   1.32   1.11   0.5   0.5   0.51
  赖氨酸   0.98   0.95   1.05   3.5   3.03   0.86   0.85   0.78
  组氨酸   0.25   0.25   0.3   0.82   0.54   0.25   0.25   0.22
  精氨酸   1.13   1.39   1.42   3.66   2.58   1.14   1.16   1.32
  脯氨酸   0.54   0.97   0.55   1.04   0.59   0.51   0.53   0.73
  色氨酸   /   /   /   /   /   /   /   /
  总量   17.62   18.23   20.28   47.05   38.05   17   17.1   16.33
  粗脂肪(％)   4.82   5.55   5.46   5.19   4.96   3.74   3.68   3.40
试验组与对照组间方差分析结果表明：枯草芽孢杆菌、少动鞘氨醇单胞菌与对照组间差异显著。由于枯草芽孢杆菌为已广泛使用的益生菌，而少动鞘氨醇单胞菌作为有益菌于鳗鲡使用未见报道，所以，将筛选出的少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)进行进一步研究。
实施例5.少动鞘氨醇单胞菌适宜生长条件的研究
1.1适宜温度的测定
1.1.1牛肉膏蛋白胨培养液  牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.0～7.2。
1.1.2供试菌株  少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)
1.1.3试验仪器  BS-IE振荡培养箱(常州国华电器有限公司)；SHA-B水浴恒温震荡器(江苏金坛中大仪器厂)康氏管；微量移液器。
1.1.4培养基制备  将牛肉膏蛋白胨培养液分装康氏管，每管3.0mL，0.1Mpa灭菌25min。
1.1.5试验用菌  液将供试菌株接种牛肉膏蛋白胨培养液，30℃ 230r/min培养过夜。
1.1.6接种与培养  分别取试验用菌液5uL接种装有牛肉膏蛋白胨培养液康氏管，每个设定温度接种2管，分别于设定温度的水浴恒温震荡器培养，分别于第48h和第5d观察结果。
1.1.7结果判定  “+”：生长良好，与对照管相比，可立即判定是浑浊的；“+-”：生长差，与对照管相比，只有在适宜的观察角度时(如：暗背景，并使光线从侧前方而不是从正前方射入)方能看到明显的浑浊；“-”：表示不生长，与对照管相比，在适宜的角度下观察与对照管无差异或不能确定无差异。培养5d能生长者均按生长计，否则，按不生长计。培养5d仍属不生长或可疑者，再重新测定，可能出现生长或不生长的情况，提升或降低温度1℃进行肯定。测试结果结果显示，A31009NA菌株适宜生长温度为20～41℃，最适生长温度为30～37℃，详细结果见表3。
                         表3.温度对A31009NA菌株生长影响
时间   温度(℃)
  4   20   25   30   37   41   50   65
  48h   -   +-   +-   +   +   +-   -   -
  5d   -   +   +   +   +   -   -   -
  适宜生长温度   20～41
  最适生长温度   30～37
1.2适宜盐度的测定
1.2.1牛肉膏蛋白胨培养液  同1.1.1。
1.2.2无盐牛肉膏蛋白胨培养液  牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、、蒸馏水1000mL、pH 7.0～7.2。
1.2.3供试菌株  同1.1.2。
1.2.4试验仪器  同1.1.3。
1.2.5培养基制备  在无盐牛肉膏蛋白胨培养液中根据设定盐度加入NaCL，调pH 7.0～7.2分装试管，每管3.0mL，0.1Mpa灭菌25min。
1.2.6试验用菌液  同1.1.5。
1.2.7接种与培养  分别取试验用菌液5μL接种装有不同盐度牛肉膏蛋白胨培养液康氏管，每个设定盐度接种2管，28℃ 230r/min培养，分别于第3d和第7d观察结果。
1.2.8结果判定  “+”：生长良好，与对照管相比，可立即判定是浑浊的；“+-”：生长差，与对照管相比，只有在适宜的观察角度时(如：暗背景，并使光线从侧前方而不是从正前方射入)方能看到明显的浑浊；“-”：表示不生长，与对照管相比，在适宜的角度下观察与对照管无差异或不能确定无差异。测试结果显示，A31009NA菌株适宜生长盐度为0～5％，最适生长盐度为0～2.5％，详细结果见表4。
                              表4.盐度对A31009NA菌株生长影响
时间   盐度(％)
  0.85   2.5   5   10   15   20   25
  3d   +   +   -   -   -   -   -
  7d   +   +   +   -   -   -   -
  适宜生长盐度   0～5
  最适生长盐度   0～2.5
1.3适宜pH值测定
1.3.1牛肉膏蛋白胨培养液  同1.1.1。
1.3.2试剂0.2moL/L K2HPO4、0.2moL/L硼酸、0.2moL/L NaOH、0.2moL/L柠檬酸。。
1.3.3供试菌株  同1.1.2。
1.3.4试验仪器  同1.1.3。
1.3.5培养基制备  根据表5配置牛肉膏蛋白胨培养液。用pH计矫正pH值后，分装试管，每管3.0mL，0.1Mpa灭菌25min。
1.3.6试验用菌液  同1.1.5。
1.3.7接种与培养  分别取试验用菌液5μL接种装有不同pH值牛肉膏蛋白胨培养液康氏管，每个设定pH值接种2管，28℃ 230r/min培养，分别于第3d和第7d观察结果。
1.3.8结果判定  “+”：生长良好，与对照管相比，可立即判定是浑浊的；“+-”：生长差，与对照管相比，只有在适宜的观察角度时(如：暗背景，并使光线从侧前方而不是从正前方射入)方能看到明显的浑浊；“-”：表示不生长，与对照管相比，在适宜的角度下观察与对照管无差异或不能确定无差异。测试结果显示，A31009NA菌株适宜生长的PH值为5.2～8.4，最适生长的PH值为6.0～7.6，详细结果见表6。
                        表5.不同pH值培养基配制表
  试管序号   K2HPO40.2mol/L   柠檬酸0.1mol/L   NaOH0.2mol/L   硼酸0.2mol/L   牛肉膏蛋白胨培养液(mL)   总量(mL)   PH值(近似值)
  1   0.3   1.7   -   -   8   10   2.8
  2   0.9   1.1   -   -   8   10   4.4
  3   1.1   0.9   -   -   8   10   5.2
  4   1.3   0.7   -   -   8   10   6.0
  5   1.5   0.5   -   -   8   10   6.8
  6   1.9   0.1   -   -   8   10   7.6
  7 - -   0.3   1.7   8   10   8.4
  8 - -   0.7   1.3   8   10   9.2
  9 - -   1.0   1.0   8   10   10.0
                表6.pH值对A31009NA菌株生长影响
时间   pH值
  2.8   4.4   5.2   6.0   6.8   7.6   8.4   9.2   10.0
  3d   -   -   +-   +   +   +   -   -   -
  7d   -   -   +   +   +   +   +-   -   -
  适宜生长pH值   5.2～8.4
  最适生长pH值   6.0～7.6
实施例6.少动鞘氨醇单胞菌优化培养基的研究
1.1试验材料  少动鞘氨醇单胞菌A31009NA为福建省淡水水产研究所自鳗鲡肠道分离的有益菌。BS-IE振荡培养箱由常州国华电器有限公司生产。试剂为分析纯或生物试剂。
1.2培养基成分设计  基础培养基为营养肉汤，配方为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g，加蒸馏水至1000mL，调pH 7.0-7.2。采用正交设计法，分析各因子对生长影响，以极差(R)表示各因子对测定指标的作用，极差计算公式为：R＝kmax-kmin，kmax为同一水平指标的平均值的最大值；kmin为同一水平指标的平均值的最小值。利用优化培养基与未优化培养基进行培养验证。
1.3细菌计数  接种后分别于震荡培养箱30℃、200r·min-1培养12、24、36h，取1.0mL以无菌蒸馏水10倍稀释至10-8，取不同稀释度菌悬液滴种肉汤琼脂平板，每稀释度重复3滴，每滴25μl，每个平皿滴种2个稀释度。30℃培养48h后取适宜的稀释度读数计算细菌浓度，计算公式为：细菌浓度(CFU/mL)＝同一稀释度平均数×(1000/25)×稀释倍数。
2结果
2.1培养基基础成分对少动鞘氨醇单胞菌生长的影响  试验结果显示培养基基础成分含量对少动鞘氨醇单胞菌生长具有显著影响，详细结果见表7、8、9。
表7培养基基础成分对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(12小时)
  编号No.   蛋白胨(％)Peptone   葡萄糖(％)Glucose  牛肉膏(％)Beef extracts   NaCl(％)   菌量(cfu/mL)
  12h
  1   2.0   2.0  1.0   1.0   4.27×105
  2   2.0   1.0  0.5   0.5   7.2×106
  3   2.0   0   0.1   0   7.73×108
  4   1.0   2.0   0.5   0   2.69×108
  5   1.0   1.0   0.1   1.0   2.4×107
  6   1.0   0   1.0   0.5   1.65×109
  7   0.5   2.0   0.1   0.5   2.36×108
  8   0.5   1.0   1.0   0   4.76×108
  9   0.5   0   0.5   1.0   9.2×108
  K1   78.1×107   5.05×108   21.3×108   94.4×107
  K2   194.3×107   5.07×108   11.9×108   189.3×107
  K3   163.2×107   33.43×108   10.33×108   151.8×107
  k1   26.03×107   1.68×108   7.1×108   31.4×107
  k2   64.77×107   1.69×108   3.98×108   63.1×107
  k3   54.4×107   1.14×108   3.44×108   50.6×107
  R   38.56×107   9.46×108   3.65×108   31.63×107
表8培养基基础成分对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(24小时)
  编号No.   蛋白胨(％)Peptone   葡萄糖(％)Glucose   牛肉膏(％)Beef extracts   NaCl(％)   菌量(cfu/mL)
  24h
  1   2.0   2.0   1.0   1.0   8.93×105
  2   2.0   1.0   0.5   0.5   1.87×109
  3   2.0   0   0.1   0   3.86×109
  4   1.0   2.0   0.5   0   1.93×109
  5   1.0   1.0   0.1   1.0   2.26×109
  6   1.0   0   1.0   0.5   5.6×108
  7   0.5   2.0   0.1   0.5   4.0×106
  8   0.5   1.0   1.0   0   1.87×109
  9   0.5   0   0.5   1.0   6.93×108
  K1   5.73×109   1.93×108   2.43×109   2.95×109
  K2   4.75×109   6.0×109   4.49×109   2.4×109
  K3   2.57×109   5.1×109   6.12×109   7.66×109
  k1   1.91×109   6.45×108   8.1×109   9.8×108
  k2   1.58×109   2.0×109   1.49×109   8.1×108
  k3   8.6×108   1.7×109   2.04×109   2.55×109
  R   1.06×109   1.35×109   1.23×109   1.73×109
表9培养基基础成分对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(36小时)
  编号No.   蛋白胨(％)Peptone   葡萄糖(％)Glucose  牛肉膏(％)Beef extracts   NaCl(％)   菌量(cfu/mL)
  36h
  1   2.0   2.0  1.0   1.0   1.19×107
  2   2.0   1.0  0.5   0.5   4.4×109
  3   2.0   0  0.1   0   6.39×109
  4   1.0   2.0  0.5   0   7.73×105
  5   1.0   1.0  0.1   1.0   1.51×109
  6   1.0   0  1.0   0.5   7.73×109
  7   0.5   2.0  0.1   0.5   1.07×108
  8   0.5   1.0  1.0   0   4.0×107
  9   0.5   0  0.5   1.0   8.0×107
  K1   10.8×109   1.19×108  7.78×109   1.6×109
  K2   9.2×109   5.95×109  4.48×109   12.2×109
  K3   2.3×108   14.2×109  8.01×109   6.43×109
  k1   3.6×109   0.39×108  2.59×109   0.53×109
  k2   3.08×109   1.98×109  1.49×109   4.07×109
  k3   0.76×108   4.73×109  2.67×109   2.14×109
  R   3.52×109   4.69×109  1.18×109   3.54×109
2.2主要添加成分对少动鞘氨醇单胞菌生长的影响  以营养肉汤为基础培养基，振荡培养箱30℃、200r·min-1培养，研究甘油、酵母膏、葡萄糖、硫酸铵对少动鞘氨醇单胞菌生长的影响。试验结果显示添加成分对少动鞘氨醇单胞菌生长具有显著影响，详细结果见表10、11、12。
表10主要添加成分对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(12小时)
  编号No.   甘油(％)Glycose   葡萄糖(％)Glucose   酵母膏(％)East extracts   硫酸铵(％)(NH4)2SO4   菌量(cfu/mL)
  12h
  1   1.0   1.0   1.0   0.1   3.9×108
  2   1.0   0.5   0.5   0.05   9.3×108
  3   1.0   0   0   0   2.3×107
  4   0.05   1.0   0.5   0   5.7×108
  5   0.05   0.5   0   0.1   4.3×108
  6   0.05   0   1.0   0.05   3.0×108
  7   0   1.0   0   0.05   8.0×108
  8   0   0.5   1.0   0   1.8×108
  9   0   0   0.5   0.1   7.9×108
  K1   13.43×108   17.6×108   8.7×108   16.1×108
  K2   13.0×108   1.54×108   22.9×108   20.3×108
  K3   17.7×108   11.13×108   12.53×108   7.73×108
  k1   4.48×108   5.87×108   2.9×108   5.37×108
  k2   4.33×108   5.13×108   7.63×108   6.77×108
  k3   5.9×108   3.71×108   4.18×108   2.58×108
  R   1.57×108   2.16×108   4.73×108   4.19×108
表11主要添加成分对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(24小时)
  编号No.   甘油(％)Glycose   葡萄糖(％)Glucose  酵母膏(％)East extracts   硫酸铵(％)(NH4)2SO4   菌量(cfu/mL)
  24h
  1   1.0   1.0   1.0   0.1   2.0×109
  2   1.0   0.5   0.5   0.05   2.5×109
  3   1.0   0   0   0   1.3×106
  4   0.05   1.0   0.5   0   2.4×109
  5   0.05   0.5   0   0.1   4.1×104
  6   0.05   0   1.0   0.05   1.3×109
  7   0   1.0   0   0.05   9.9×105
  8   0   0.5   1.0   0   1.2×109
  9   0   0   0.5   0.1   2.8×109
  K1   4.5×109   4.4×109   4.5×109   4.8×109
  K2   3.7×109   3.7×109   7.7×109   3.8×109
  K3   4.0×109   4.1×109   2.33×106   3.6×109
  k1   1.5×109   1.47×109   1.5×109   1.6×109
  k2   1.23×109   1.23×109   2.57×109   1.27×109
  k3   1.33×109   1.37×109   7.77×105   1.2×109
  R   2.7×108   2.4×108   2.57×109   4.0×108
表12主要添加成分对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(36小时)
  编号No.   甘油(％)Glycose   葡萄糖(％)Glucose  酵母膏(％)East extracts   硫酸铵(％)(NH4)2SO4 菌量(cfu/mL)
36h
  1   1.0   1.0   1.0   0.1 2.8×109
  2   1.0   0.5   0.5   0.05 6.0×109
  3   1.0   0   0   0   3.7×105
  4   0.05   1.0   0.5   0   4.4×109
  5   0.05   0.5   0   0.1   2.7×104
  6   0.05   0   1.0   0.05   4.4×109
  7   0   1.0   0   0.05   1.7×104
  8   0   0.5   1.0   0   2.0×109
  9   0   0   0.5   0.1   3.3×109
  K1   8.8×109   7.2×109   9.2×109   6.1×109
  K2   8.8×109   8.0×109   13.7×109   10.4×109
  K3   5.3×109   7.7×109   4.14×105   6.4×109
  k1   2.93×109   2.4×109   3.07×109   2.03×109
  k2   2.93×109   2.67×109   4.57×109   3.47×109
  k3   1.77×109   2.57×109   1.38×105   2.13×109
  R   1.16×109   2.7×108   4.57×109   1.44×109
2.3无机离子对少动鞘氨醇单胞菌生长的影响  以营养肉汤为基础培养基，振荡培养箱30℃、200r·min-1培养，研究无机离子对少动鞘氨醇单胞菌生长的影响。试验结果显示，无机离子对少动鞘氨醇单胞菌生长具有显著影响，详细结果见表13、14、15。
表13无机离子对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(12小时)
  编号No   MnSO4(mg/L)   MgSO4(g/L)   CaCl2(g/L)   FeSO4(g/L)   ZnSO4(mg/L)   CoCl2(mg/L)   CuSO4(mg/L)   菌量(cfu/mL)
  12h
  1   1.5   0.1   0.02   0.04   3.62   0.15   0.15   1.9×109
  2   1.5   0.1   0.02   0   0   0   0   1.3×109
  3   1.5   0   0   0.04   3.62   0   0   2.3×106
  4   1.5   0   0   0   0   0.15   0.15   1.8×109
  5   0   0.1   0   0.04   0   0.15   0   1.8×109
  6   0   0.1   0   0   3.62   0   0.15   1.8×109
  7   0   0   0.02   0.04   0   0   0.15   3.7×106
  8   0   0   0.02   0   3.62   0.15   0   2.2×109
  K1   5.0×109   6.8×109   5.4×109   3.7×109   5.9×109   7.7×109   5.5×109
  K2   5.8×109   4.0×109   5.4×109   7.1×109   4.9×109   3.1×109   5.3×109
  k1   1.3×109   1.7×109   1.4×109   0.9×109   1.5×109   1.9×109   1.4×109
  k2   1.5×109   1.0×109   1.4×109   1.8×109   1.2×109   0.8×109   1.3×109
  R   0.2×109   0.7×109   0   0.9×109   0.3×109   1.1×109   0.1×109
表14无机离子对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(24小时)
  编号No   MnSO4(mg/L)   MgSO4(g/L)   CaCl2(g/L)   FeSO4(g/L)   ZnSO4(mg/L)   CoCl2(mg/L)   CuSO4(mg/L)   菌量(cfu/mL)
  24h
  1   1.5   0.1   0.02   0.04   3.62   0.15   0.15   4.4×109
  2   1.5   0.1   0.02   0   0   0   0   6.0×109
  3   1.5   0   0   0.04   3.62   0   0   2.8×106
  4   1.5   0   0   0   0   0.15   0.15   6.4×107
  5   0   0.1   0   0.04   0   0.15   0   4.0×109
  6   0   0.1   0   0   3.62   0   0.15   6.2×109
  7   0   0   0.02   0.04   0   0   0.15   2.7×105
  8   0   0   0.02   0   3.62   0.15   0   5.9×106
  K1   10.5×109   20.6×109   10.4×109   8.4×109   10.6×109   8.47×109   10.66×109
  K2   10.2×109   7.3×107   10.3×109   12.27×109   10.1×109   12.2×109   10.01×109
  k1   2.62×109   5.15×109   2.6×109   2.1×109   2.65×109   2.12×109   2.67×109
  k2   2.55×109   1.83×107   2.57×109   3.07×109   2.52×109   3.05×109   2.5×109
  R   7.0×107   5.13×109   3×107   9.7×108   1.3×108   9.3×108   1.7×108
表15无机离子对少动鞘氨醇单胞菌A31009NA株生长的影响(36小时)
  编号No   MnSO4(mg/L)   MgSO4(g/L)   CaCl2(g/L)   FeSO4(g/L)   ZnSO4(mg/L)   CoCl2·6H2O(mg/L)   CuSO4(mg/L)   菌量(cfu/mL)
  36h
  1   1.5   0.1   0.02   0.04   3.62   0.15   0.15   7.9×109
  2   1.5   0.1   0.02   0   0   0   0   7.5×109
  3   1.5   0   0   0.04   3.62   0   0   2.1×105
  4   1.5   0   0   0   0   0.15   0.15   3.5×106
  5   0   0.1   0   0.04   0   0.15   0   7.5×109
  6   0   0.1   0   0   3.62   0   0.15   6.9×109
  7   0   0   0.02   0.04   0   0   0.15   1.9×105
  8   0   0   0.02   0   3.62   0.15   0   4.1×106
  K1   15.4×109   29.8×109   15.4×109   15.4×109   14.8×109   15.4×109   14.8×109
  K2   14.4×109   8.0×106   14.4×109   14.4×109   15.0×109   14.4×109   15.0×109
  k1   3.85×109   7.45×109   3.85×109   3.85×109   3.7×109   3.85×109   3.7×109
  k2   3.6×109   2.0×106   3.6×109   3.6×109   3.75×109   3.6×109   3.75×109
  R   2.5×108   7.45×109   2.5×108   2.5×108   5×107   2.5×108   5.0×107
根据上述试验结果，确定培养基的优化配方为：蛋白胨1.0％；牛肉膏0.1％；食盐0.5％；葡萄糖1.0％，硫酸铵0.05％；酵母膏0.5％；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CuSO4·5H2O 0.15mg/L；MnSO4·H2O 1.5mg/L；CoCl2·6H2O 0.15mg/L。
2.3优化培养基与未优化培养基对少动鞘氨醇单胞菌的培养结果
优化培养基成分：蛋白胨1.0％；牛肉膏0.1％；食盐0.5％；葡萄糖1.0％，硫酸铵0.05％；酵母膏0.5％；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CuSO4·5H2O 0.15mg/L；MnSO4·H2O 1.5mg/L；CoCl2·6H2O 0.15mg/L。
未优化培养基成分：蛋白胨1.0％；牛肉膏0.3％；食盐0.5％。
试验结果显示，优化培养基能显著提高细菌产量。详细结果见表16。
                表16优化与未优化培养基的培养结果
实施例7  少动鞘氨醇单胞菌生长规律研究
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1牛肉膏蛋白胨培养液  牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.0～7.2。
1.1.2供试菌株  A31009NA(少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis)。
1.1.4试验仪器  BS-IE振荡培养箱(常州国华电器有限公司)；721分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
1.2试验方法
1.2.1培养基制备  将牛肉膏蛋白胨培养液分装康氏管，每管3.0mL，0.1Mpa灭菌25min。
1.2.2试验用菌液  将供试菌株分别接种牛肉膏蛋白胨培养液，30℃ 230r/min培养过夜，用牛肉膏蛋白胨培养液百倍稀释。
1.2.3接种与培养  分别取试验用菌液5uL接种装有牛肉膏蛋白胨培养液康氏管，每个设定时间接种2管，30℃ 230r/min振荡培养。
1.2.4测定时间设置：0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、32、36、40、48h。如果48h OD值仍未下降，增设52、56、60h时间点。
1.2.5测定  721分光光度计，λ＝260nm，以牛肉膏蛋白胨培养液调零，测试其吸光值(OD值)。
1.2.6生长曲线的绘制  以时间为横坐标，以OD值对数为纵坐标绘制生长曲线。
2.结果
根据A31009NA少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)生长曲线，收集细菌的适宜时间为培养后36～48h。
实施例8  少动鞘氨醇单胞菌计数方法和载体选择的研究
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCL 5.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。高压灭菌15min。
1.1.2BS-IE振荡培养箱(常州国华电器有限公司)，
1.1.3细菌A31009NA(少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis)
1.1.4细菌载体：硅藻土、木薯淀粉于70℃烘干至恒重，准确称取150g，高压灭菌后烘干至恒重待用。
1.2试验方法
1.2.1接种与培养  将试验用菌株接种600mL牛肉膏蛋白胨培养基，30℃振荡培养30h。
1.2.2培养液计数  取0.5mL培养液10倍梯度稀释至10-9，分别用血球计数板、平板涂布法、倾注平板法计数10-3-10-6稀释度细菌含量，每浓度梯度设置平行组。平板涂布法、倾注平板法以30-300个菌落为有效计数平板。
1.2.3浓缩菌液的计数  将剩余培养液3500r·min离心15min，弃上清夜，沉淀细菌用无菌蒸馏水洗下，定量至20.5mL，取0.5mL同培养液稀释计数法计数。
1.2.4载体吸附细菌后计数  将剩余浓缩菌液分别取10.0mL，以150g载体吸附并混合均匀后，40℃烘干12h，分别取10.0g到装有40g玻璃珠的250mL三角烧瓶中，加90mL无菌蒸馏水，200r·min振荡20min，10倍梯度稀释至10-7，同培养液计数法计数。以后每隔20d如上方法计数1次。
2结果
2.1培养液计数结果显示，以平板涂布法或倾注平板法能相对正确计数细菌含量，详细结果见表17和表18。
                 表17A31009NA培养液计数结果
 计数方法   血球计数法   平板涂布法   倾注平板法
 浓度(CFU/mL)   3.85×109   9.3×109   1.0×1010
 理论细菌总量(CFU)   7.7×1010   1.86×1011   2.0×1011
                表18A31009NA溶缩液计数结果
 计数方法   血球计数法   平板涂布法   倾注平板法
 浓度(CFU/mL)   1.17×1011   1.9×1011   2.1×1011
 理论细菌总量(CFU)   2.34×1012   3.8×1012   4.2×1012
2.2载体选择试验
2.2载体吸附细菌后计数结果显示，硅藻土和淀粉作载体对细菌损失差异不显著，考虑到鳗鲡饲料以淀粉作黏合剂，因此，以淀粉作载体与饲料应用相符，详细结果见表19，20。
       表19A31009NA用硅藻土吸附后计数
 计数方法   平板涂布法   倾注平板法
 细菌溶度CFU/克   7×105   3.8×105
 细菌总数CFU   1×108   5.7×107
 理论细菌总数CFU   1.7×1012   1.9×1012
 细菌损失量(％)   99.994   99.997
          表20A31009NA用淀粉吸附后计数
  计数方法   平板涂布法   倾注平板法
  细菌溶度CFU/克   7.7×105   8.5×105
  细菌总数CFU   1.16×108   1.28×108
  理论细菌总数CFU   1.7×1012   1.9×1012
  细菌损失量(％)   99.993   99.993
实施例9  少动鞘氨醇单胞菌对鳗鲡安全性研究
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1牛肉膏蛋白胨培养基  牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL、琼脂15.0g，pH 7.0～7.2。
1.1.2试验用鱼  欧洲鳗鲡，规格110～120g/尾，已暂养45d，塑料袋充氧打包后运回实验室暂养3天，暂养其间不投饵，连续充气，日换水1次，每次换水50％。暂养及试验用水已暴气24h以上。试验用水为自来水，基本水质为pH 7.3±0.3，NH4 +--N未检出，NO2 --N为0.005mg/L，水温为22-25℃，，余氯未检出。
暂养稳定后试验用鱼随机捞取，分配入各水簇箱，每组随机放鱼5尾。
1.1.3供试菌株  少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)。
1.1.4试验仪器  LRH-250-A生化培养箱由广东省医疗器械厂生产。
1.2试验方法
1.2.1菌悬液  菌株于牛肉膏蛋白胨培养基30℃培养24h，用0.85％无菌生理盐水洗下，用无菌生理盐水做10倍稀释，平板涂布法计数。
1.2.2注射  试验鱼用MS-222麻醉后，将不同稀释度的菌悬液用无菌注射器腹腔注射，注射处用酒精棉球消毒，注射剂量为0.5ml/尾。
1.2.3灌胃  A31009NA菌株除注射外，进行了灌胃试验，用无菌头皮针吸取鱼粉与菌悬液混合物插入胃中灌注。每100g鱼体重灌鱼粉与菌悬液混合物0.5ml(鱼粉与菌悬液混合物：10g鱼粉加25ml无菌生理盐水，取4.5ml鱼粉悬液，加菌悬液4.5ml)。
1.2.4试验鳗鲡暂养与观察  试验期间不换水，不投饵，连续充气，水温：23～25℃，每日观察记录鱼体死亡情况，每日及时捡除死亡鱼体，连续观察172h。
2结果
2.7少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)注射对欧洲鳗鲡的毒力  试验结果显示注射少动鞘氨醇单胞菌浓度达1.2×1010CFU/mL时，172h内鳗鲡未显示异常，详细结果见表21。
表21.少动鞘氨醇单胞菌对欧洲鳗鲡的毒力实验结果(死亡数)
 时间(h)   细菌浓度(CFU/mL)
1.2×109 1.2×108 1.2×107 1.2×106 1.2×105   对照(0.85％生理盐水)
 24   0   0   0   0   0   0
 48   0   0   0   0   0   0
 72   0   0   0   0   0   0
 96   0   0   0   0   0   0
 120   0   0   0   0   0   0
 144   0   0   0   0   0   0
 172   0   0   0   0   0   0
2.8少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)灌胃对欧洲鳗鲡的毒力  试验结果显示灌胃少动鞘氨醇单胞菌浓度达3.37×1013CFU/mL时，24h内显示毒力，172h内鳗鲡未显示异常，详细结果见表22。
表22.少动鞘氨醇单胞菌对欧洲鳗鲡的毒力实验结果(死亡数)
 时间(h)   细菌浓度(CFU/mL)
3.37×109 3.37×108 3.37×107 3.37×106 3.37×105   对照(0.85％生理盐水)
 24   0   0   0   0   0   0
 48   0   0   0   0   0   0
 72   0   0   0   0   0   0
 96   0   0   0   0   0   0
 120   0   0   0   0   0   0
 144   0   0   0   0   0   0
 172   0   0   0   0   0   0
试验证明了A31009NA对鳗鲡毒力低，在使用剂量范围内对鳗鲡未显示毒性的结果
实施例10  少动鞘氨醇单胞菌对鳗鲡饲料表观消化率影响研究
1材料与方法
1.1试验鳗鲡  二龄欧洲鳗鲡(由福建省长乐市某养鳗场提供)，平均体重37g。降温充氧运回实验室后经暂养稳定后，随机分配至各水族箱，每箱18尾，水温恒定22℃，充气、日换水100％，稳定7d后开始驯化投饵。
1.2水族箱  直径85cm、高55cm，凹底圆形不锈钢水族箱，每箱装水约150L。
1.3益生菌制备  将试验菌株于500mL肉汤培养基接接种，30℃振荡培养30h，3500r·min离心15min，收集沉淀细菌，用玉米淀粉混合，40℃烘干6h后计数。
1.4外源指示剂饵料制备  预先将三氧化二铬和饲料过80目筛，用等量混合法配制三氧化二铬含量为1.1％的饲料(天马牌鳗鲡成鳗饲料，蛋白质44.97％水分5.94％)，充分混合均匀。
1.5益生菌饵料制备  于外源指示剂饵料中添加益生菌，使三氧化二铬含量约为1.0％，益生菌含量达106cfu/g；对照组不加益生菌。
1.6投喂  每晚21:00投喂一次，投喂量8～10g/箱，第二天15:00、20:00开始收集粪便。
1.7粪便收集  正常投饵7天后开始收集粪便，每次投饵后12小时开始采集，用带玻璃管的吸球吸取粪便到表面皿，随排随吸，持续4h，用镊子将包膜完整的粪便挑于洁净的称量瓶中，70℃烘干后于冰箱保存，连续收集40天。
1.6分析与计算方法  饲料和粪便中的粗蛋白含量测定用凯氏定氮法，铬含量测定用原子吸收分光光度计。表观消化率计算公式如下：
干物质表观消化率＝100-100C1/C2
蛋白质表观消化率＝100-100C1N2/(C2N1)
上述公式中C1为饲料中三氧化二铬的百分含量；C2为粪便中三氧化二铬的百分含量；N1为饲料中蛋白质百分含量；N2为粪便中蛋白质百分含量。
2结果  实验结果显示，添加少动鞘氨醇单胞菌能显著提高对鳗鲡饲料的干物质和蛋白质表观消化率，因而，作为饲料添加剂应用具有重要的经济价值，详细结果见表23。
表23.少动鞘氨醇单胞菌对鳗鲡饲料干物质和蛋白质表观消化率影响
  菌株号   饲料中Cr2O3含量   粪便中Cr2O3含量   饲料中蛋白质含量(％)   粪便中蛋白质含量(％)   干物质表观消化率(％)   蛋白质表观消化率(％)   蛋白质表观消化率比对照组增加(％)
  A31009NA   9.79×102   2.72×103   41.50   15.02   64.01   86.97   13.11
  对照   9.79×102   1.24×103   41.50   13.74   21.05   73.86   0
实施例11  少动鞘氨醇单胞菌产品制作技术研究
1.1试验材料与方法  将菌株A31009NA接种于优化培养基30℃振荡培养36h作为种子，以0.001％(v/v)接种优化培养基，30℃振荡培养36h，将高压灭菌后70℃烘干至恒重的玉米淀粉通过预备试验后确定以1.2∶1(W/V)比例吸附培养液，35～40℃烘干(控制水分含量为5～7％)，粉碎后过80目筛，测定细菌含量达105～107CFU/g以上为合格产品，铝箔袋包装、封口。
1.2试验结果
1.2.1培养36h后培养基成浑浊状，透明度显著下降，说明细菌生长良好；
1.2.2玉米淀粉以1.2∶1(W/V)比例吸附培养液，能完全吸附培养液，无液体外渗显示吸附剂比例合适；
1.2.3培养液细菌含量达109CFU/mL，未烘干前测定产品细菌含量达109CFU/g，显示吸附过程细菌含量未受损失；
1.2.4烘干后测定产品细菌含量为107CFU/g，显示烘干过程导致细菌的大量损失，由于本菌株在高温和脱水状况下易死亡，而水分含量过高将导致产品质量的改变，因此制定烘干温度不得超过40℃，产品水分含量应保持在10～12％，烘干时间控制为4～6h.。
1.2.5产品的粉碎细度达80目时，细菌在产品中分布均匀，并能与饲料均匀混合，才能达到鳗鲡饲料要求的细度指标，因此，烘干后应将产品过80目筛。
实施例12  少动鞘氨醇单胞菌产品稳定性的研究
1.1试验材料与方法  将菌株A31009NA接种于优化培养基30℃振荡培养36h，木薯淀粉高压灭菌后70℃烘干至恒重，将淀粉以1.2∶1(W/V)比例吸附培养液，35～40℃烘干(控制水分含量为5～7％)，粉碎后过80目筛，测定细菌含量，铝箔袋包装、封口，室温保存于阴凉处，同实施例4方法定时检测细菌含量。
1.2结果  产品细菌含量定时检测结果显示产品储藏过程中损失较高，应用时要求产品细菌含量达105～107CFU/g，因此，产品质量保质期定为120d，试验结果见表24。
表24.少动鞘氨醇单胞菌产品稳定性检测结果
  检测时间(d)   产品细菌含量(CFU/g)
  产品生产当天   8.5×107
  生产后20d   4.8×107
  生产后40d   1.2×107
  生产后70d   5.3×106
  生产后100d   6.7×105
  生产后140d   1.4×105
实施例13  少动鞘氨醇单胞菌产品使用效果的研究
将菌株A31009NA接种于优化培养基30℃振荡培养36h，木薯淀粉高压灭菌后70℃烘干至恒重，将淀粉以1.2∶1(W/V)比例吸附培养液，35～40℃烘干(控制水分含量为5～7％)，粉碎后过80目筛，测定细菌含量达107CFU/g以上为合格产品，铝箔袋包装、封口后作为饲料添加剂混合到鳗鲡人工配合饲料或水蚯蚓中投喂鳗鲡，观察鳗鲡摄食量、肠炎控制情况，养殖一定时间后盘池，计算饲料效率。
9.1少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂在仙游县农贸实业开发公司的使用效果
9.1.1试验鳗鲡为日本鳗鲡，水温18～20℃，平均规格7尾/kg，试验养殖时间45d。
9.1.2试验结果见表25。
表25.少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂的应用效果
  记录数据   试验池   试验池   对照池
  试验开始   面积(m2)   330   315
  规格(尾/kg)   7   7
  重量(kg)   2672   2520
  数量(尾)   18704   17640
  试验结束   重量(kg)   4042   3320
  增重(kg)   1370   800
  饲料用量(kg)   1735   1220
  饲料效率(％)   79   64
  试验池比对照池饲料效率提高(％)   15
  肠炎控制情况   使用后无肠炎
9.2少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂在三华龙鳗养鳗场的使用效果
9.2.1试验鳗鲡为欧洲鳗鲡，水温13～18℃，平均规格56.8尾/kg，试验养殖时间31d。
9.2.2试验结果见表26。
表26.少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂的应用效果
  记录数据   试验池   试验池   对照池
  试验开始   面积(m2)   450   450
  规格(尾/kg)   56.8   43
  重量(kg)   1576   1833
  数量(尾)   85516   78819
  试验结束   重量(kg)   2043.8   2252
  增重(kg)   467.8   419
  饲料用量(kg)   600   602
  饲料效率(％)   78   69.6
  试验池比对照池饲料效率提高(％)   8.4
  肠炎控制情况   使用后无肠炎
8.3少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂在福清海美水产养殖有限公司的使用效果
9.3.1试验鳗鲡为欧洲鳗鲡，水温14～19℃，平均规格14.6尾/kg，试验养殖时间46d。
9.3.2试验结果见表27。
表27.少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂的应用效果
  记录数据   试验池   试验池   对照池
  试验开始   面积(m2)   470   470
  规格(尾/kg)   14.6   18.2
  重量(kg)   2216   2033
  数量(尾)   32353   37000
  试验结束   重量(kg)   3203.3   2936.5
  增重(kg)   987.3   903.5
  饲料用量(kg)   1371.5   1311
  饲料效率(％)   72   68.9
  试验池比对照池饲料效率提高(％)   3.1
  肠炎控制情况   使用后无肠炎
9.4少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂在福清海美水产养殖有限公司的使用效果
9.4.1试验鳗鲡为欧洲鳗鲡，水温14～19℃，平均规格26.8尾/kg，试验养殖时间40d。
9.4.2试验结果见表28。
表28.少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂的应用效果
  记录数据   试验池   试验池   对照池
  试验开始   面积(m2)   420   420
  规格(尾/kg)   26.8   26.8
  重量(kg)   2007   2023
  数量(尾)   53787   54216
  试验结束   重量(kg)   2915   2807
  增重(kg)   908   784
  饲料用量(kg)   1210   1170
  饲料效率(％)   75   67
  试验池比对照池饲料效率提高(％)   7
  肠炎控制情况   使用后无肠炎
9.5少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂在长乐友兴养鳗场的使用效果
9.5.1试验鳗鲡为欧洲鳗鲡，水温19～21℃，平均规格11.1尾/kg，试验养殖时间30d。
9.5.2试验结果见表29。
表29.少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂的应用效果
  记录数据   试验池   试验池   对照池
  试验开始   面积(m2)   350   350
  规格(尾/kg)   11.1   11.1
  重量(kg)   1552   1740
  数量(尾)   17227   19314
  试验结束   重量(kg)   2160   2261
  增重(kg)   608   521
  饲料用量(kg)   943   930
  饲料效率(％)   64.5   56
  试验池比对照池饲料效率提高(％)   8.5
  肠炎控制情况   使用后无肠炎
9.6少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂在建宁开源养鳗场的使用效果
9.6.1试验鳗鲡为欧洲鳗鲡白仔，已发生肠炎，摄食不良，水温26～28℃，平均规格500尾/kg，添加红虫剂量6g/kg，试验养殖时间20d。
9.6.2试验结果见表30。
表30.少动鞘氨醇单胞菌作为饲料添加剂的应用效果
  记录数据   试验池   试验池   对照池
  试验开始   面积(m2)   237   237
  规格(尾/kg)   500   500
  重量(kg)   260   260
  数量(尾)   130000   130000
  试验结束   重量(kg)   493   450
  增重(kg)   233   190
  饲料用量(kg)   1260   1150
  饲料效率(％)   18.5   16.5
  试验池比对照池饲料效率提高(％)   2
  肠炎控制情况   4d后无肠炎

Claims (6)

1.少动鞘氨醇单胞菌在鳗鲡养殖中的应用。
2.如权利要求1所述的少动鞘氨醇单胞菌的适宜生长温度为20～41℃，最适生长温度为30～37℃；适宜生长盐度为0～5％，最适生长盐度为0～2.5％；适宜生长pH值为5.2～8.4，最适生长pH值为6.0～7.6。
3.如权利要求2所述的少动鞘氨醇单胞菌的培养基的优化配方为：蛋白胨1.0％；牛肉膏0.1％；食盐0.5％；葡萄糖1.0％，硫酸铵0.05％；酵母膏0.5％；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CuSO4·5H2O 0.15mg/L；MnSO4·H2O 1.5mg/L；CoCl2·6H2O 0.15mg/L。
4.如权利要求1所述的少动鞘氨醇单胞菌的安全剂量控制在＜107cfu/g，优选为105～107cfu/mL。
5.权利要求1的少动鞘氨醇单胞菌的产品，其特征在于：以淀粉作载体，烘干温度应低于40℃，烘干时间根据水分含量最终保持10～12％，时间控制为4～6h，产品中少动鞘氨醇单胞菌含量为106～107cfu/g，保存期不得超过120d。
6.如权力要求5所述的产品应用于鳗鲡养殖。
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