CN103966136A - 一种双壳气单胞菌及其用途以及饲料及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双壳气单胞菌，该双壳气单胞菌的保藏号为CGMCCNo.9137。本发明还公开了一种饲料，该饲料含有所述双壳气单胞菌和基础营养物质。本发明还公开了所述的双壳气单胞菌和/或所述饲料在对虾培养中的用途。此外，本发明还公开了所述双壳气单胞菌在制备对虾饲料中的用途。本发明的双壳气单胞菌能够分泌淀粉酶，显著提高对虾的生长性能，缩短养殖周期，安全不会对对虾产生不良作用。而且，将本发明的双壳气单胞菌添加到对虾饲料中喂养对虾能明显地增强对虾的免疫力。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地，涉及一种双壳气单胞菌(Aeromonasbivalvium)及其用途以及含有该双壳气单胞菌的饲料及其用途。
背景技术
南美白对虾(Penaeus vannamei Boone)，学名凡纳对虾，属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、对虾科(Penaeidae)、对虾属(Penaeus)，是广温广盐性热带虾类。随着对虾养殖业的发展和集约化程度的提高，各种病害频繁发生，严重制约对虾养殖业的发展。大量抗生素和化学药物的滥用不仅使动物本身的免疫力下降，肠道正常菌群遭到破坏，而且造成生态环境的污染。近些年，备受关注的生态养殖无疑成为突破海水养殖的关键方式，其中益生菌开发成为生态养殖中的重要手段。目前，有关益生菌的基础研究比较薄弱，尤其缺乏系统性的深层次研究。因此，对水产动物肠道微生物多样性和可定植菌群的研究是益生菌开发和应用的首要条件。
传统的病害防治手段主要是使用抗生素及化学药物，不仅会破坏动物机体正常的菌群平衡，导致动物机体免疫功能下降，而且会导致动物体内耐药菌株的增加，进一步加大病害防治的难度。由于缺乏明确的使用准则，长期以来，抗生素及化学药物的滥用，对生态环境和人类健康构成了很大的威胁，药物残留带来的食品安全问题也层出不穷。在保障食品安全、追求绿色生态养殖呼声越来越高的今天，益生菌作为一种高效安全的病害防治手段受到越来越多的关注。益生菌在抑制病原菌、调节肠道菌群平衡、帮助消化和增强机体免疫力、改良水质等方面发挥着显著作用。同抗生素和化学药物相比，益生菌取材于动物体内或其养殖环境，具有高效安全、天然无污染等优点。
目前在国内水产养殖中应用的益生菌主要有光合细菌，拮抗菌，营养和产消化酶微生物群(乳酸菌、酵母菌等)，改善水质菌群(硝化细菌、反硝化菌等)。这些细菌大多源自陆生动物或借鉴陆生动物思路研制，应用于水产中存在难以在养殖环境中存活及在动物体内难以定植的不足，其功效难以发挥。益生菌的筛选原则在国际上已经被广泛接受：必须对宿主无害；能够在宿主体内定植并繁殖；能够到达需要其发挥功能的部位；在体外和体内的实际效果要一致；不含有致病基因及耐药基因。益生菌种的内源和外源是影响益生菌效果的重要因素，从生物体内或其生存的天然环境中筛选益生菌是最好同时也是最有效的途径，Gate认为健康动物中正常的优势菌或次优势菌可以作为益生菌的来源。优势菌群具有可以定植并对宿主及环境无害的优点，极具开发为高效可定植益生菌的潜力。而长期以来，水产动物专业益生菌的筛选研究多集中于肠道菌群鉴定及一些已知的常见益生菌(乳酸菌、芽孢杆菌等)的筛选，筛选具有优异性能的益生菌添加到对虾饲料中从而促进对虾的健康生长具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够促进对虾健康生长的双壳气单胞菌及其用途以及含有该双壳气单胞菌的饲料及其用途。
为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一株性能较佳的双壳气单胞菌，因此，第一方面，本发明提供了一种双壳气单胞菌，该双壳气单胞菌的保藏号为CGMCC No.9137。
第二方面，本发明提供了一种饲料，该饲料含有第一方面所述的双壳气单胞菌和基础营养物质。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的双壳气单胞菌和/或第二方面所述的饲料在对虾培养中的用途。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的双壳气单胞菌在制备对虾饲料中的用途。
本发明的双壳气单胞菌能够分泌淀粉酶，能够改善对虾的消化吸收能力，显著提高对虾的生长性能，缩短养殖周期，安全不会对对虾产生不良作用。而且，将本发明的双壳气单胞菌添加到对虾饲料中喂养对虾能明显地增强对虾的免疫力。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的双壳气单胞菌于2014年5月9日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.9137。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供的双壳气单胞菌的保藏号为CGMCC No.9137。将本发明的双壳气单胞菌在2216E培养基上培养，其培养特征如下表1所示。
表1
| 颜色 | 形状 | 高度 | 边缘 | 透明度 | 光滑度 | 直径(mm) | 革兰氏染色 |
| 白色 | 点状 | 凸起 | 全缘 | 不透明 | 光滑湿润 | 1 | ﹣ |
本发明提供的饲料含有上述双壳气单胞菌和基础营养物质。
根据本发明，对双壳气单胞菌的在饲料中的含量没有特别的要求，优选情况下，以双壳气单胞菌的活菌体计，所述双壳气单胞菌在饲料中的含量为106-108cfu/g。“cfu”为菌落形成单位，可以通过平板菌落计数法测得。
根据本发明，所述基础营养物质可以为常规的用于水产养殖(特别是对虾养殖)的营养物质，包括蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质等。基础营养物质的含量可以根据对虾的营养需求进行适当的选择，优选情况下，以所述饲料的总重量为基准，蛋白质的含量为20-55重量％、脂类的含量为15-20重量％、碳水化合物的含量为20-35重量％、维生素的含量为1-1.5重量％且矿物质的含量为0.2-3重量％。基础营养物质可以由常规的用于配制水产动物饲料的原料提供，例如，所述基础营养物质可以由动物性饲料原料(如鱼粉、肝脏粉、虾粉、虾壳粉、蟹粉、蟹壳粉、鸡肉粉、血粉、蚕蛹等)，植物性饲料原料(如豆粕、花生粕、面粉、棉粕、菜粕、单细胞蛋白(酵母)、酒糟粕、玉米蛋白粉等)，油脂原料(如鱼油、磷脂油、豆油、乌贼膏、玉米油、棕榈油、亚麻籽油等)，维生素(如VC和VE等)等配合提供，例如，由“鱼粉、大豆粉、花生粕、酵母、大豆卵磷脂、虾壳粉、小麦粉、种子脂肪、乳酸钙和磷酸二氢钙”的混合物提供，采用何种配比进行混合得到所述混合物是本领域技术人员能够很容易确定的，在此不再赘述。
一般地，所述饲料含有一定量的水，例如，饲料中水分含量一般为8-12％重量。此外，为了进一步提高对虾的品质并促进培养，所述饲料中还可以含有添加剂，如诱食剂、免疫增强剂、生长促进剂、耐高温酶制剂、抗氧化剂等。添加剂的含量通常为5-10重量％。
本发明还提供了上述双壳气单胞菌和/或饲料在对虾培养中的用途。
此外，本发明还提供了上述双壳气单胞菌在制备对虾饲料中的用途。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
本实施例用来说明本发明的双壳气单胞菌的产酶能力。
将本发明的双壳气单胞菌点种于淀粉酶选择培养基上，28℃培养48h。若菌落周围产生透明环，说明菌株具有相应产酶活力，测量并记录菌落周围透明环与菌落直径比值。相关培养基配方如下：
淀粉酶选择培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母膏1g，琼脂16g，人工海水1000mL；调pH至7.4，121.5℃灭菌20min备用。
测得产酶水解圈与菌落直径比(H/D)为4.00，说明本发明的双壳气单胞菌能分泌淀粉酶，从而具有一定的促进消化吸收的能力，能够提高对虾养殖过程中饲料的利用率，促进对虾的健康生长。
实施例2
本实施例用来说明本发明的双壳气单胞菌的安全性。
(1)溶血性试验
将无菌的山羊血平板复温至25℃，再将活化的双壳气单胞菌接种于山羊血平板上，25℃恒温培养箱中培养48h后，观察发现菌落周围并未出现溶血环，表明该细菌无溶血能力。
(2)饲料饲喂
饲料的营养成分为：38重量％的鱼粉、19重量％的大豆粉、6重量％的花生粕、4重量％的酵母、5重量％的大豆卵磷脂、10重量％的虾壳粉、10.5重量％的小麦粉、1.5重量％的种子脂肪、0.4重量％的乳酸钙、2.6重量％的磷酸二氢钙、3重量％的预混合组分(具体成分为：每千克饲料含有肌醇：3000.0mg；烟酰胺：2000.0mg；生物素：20.0mg；胆碱：4％；泛酸钙：1200.0mg；叶酸：150.0mg；维生素A：300000IU；维生素D：150000IU；维生素E：5000.0mg；维生素K3：150.0mg；维生素B：200.0mg；维生素B2：200.0mg；维生素B6：200.0mg；维生素C：6000.0mg；Cu：220mg；Fe：8000mg；Zn：400；Mn：1200mg；Mg：12000mg；Se：20mg；I：25mg；Co：5000mg)。
选用健康南美白对虾的仔虾(购自海南南疆板桥养殖厂)进行细菌安全性实验，试验用虾暂养三天。选用大小一致，容积约为50L的泡沫箱6个，各桶盛无菌海水32L，并准确计数南美白对虾100尾放入泡沫箱，暂养一天后随机分为2组，1个处理组和1个对照组，每组三个重复。处理组加入含有本发明的双壳气单胞菌(浓度为107cfu/g)的饲料。人工投喂至饱食状态，每天投喂4次，投喂时间：早上6:00，中午10:00，傍晚17:00，晚上22:00。对照组使用的饲料不含本发明的双壳气单胞菌，其它步骤一致，实验持续七天，实验期间连续充气。试验组和对照组的对虾均未出现大量死亡且无显著差异，解剖试验组也没有病理现象。
本实施例的结果说明本发明的双壳气单胞菌对对虾没有毒性，可安全使用。
实施例3
本实施例用来说明本发明的双壳气单胞菌对对虾免疫机能的影响。
统一规格的南美白对虾(购自海南南疆板桥养殖厂)生长于底为3m×3m，水位高为0.7m的养殖池中，海水直接从海洋中抽取，经过沙滤后调整水温至15-18℃后为培养所用海水，持续曝气。试验用南美白对虾暂养3天后分组，试验分为2组，处理组和对照组。处理组投喂含本发明的双壳气单胞菌的饲料(其他成分与实施例2中相同)，对照组饲喂不添加本发明的双壳气单胞菌的饲料。养殖过程中水温保持在16.8-18℃，盐度20-23，pH7.5-7.9，溶解氧不低于7.5mg/L；人工投喂至饱食状态，每天投喂4次，投喂时间：早上6:00，中午10:00，傍晚17:00，晚上22:00。每两天换水一次以维持水质，饲养期为28天。分别在每周末早7点，即第7、14、21、28天。从免疫指标测定实验各组的每个重复中随机选取5-10只南美白对虾，用一次性无菌注射器从南美白对虾腹血窦中取血，每次取血1.5mL。将血淋巴置于冰浴中混合均匀后，从血淋巴混合液中吸取1mL置于1.5mL的Eppendorf管中立即用于血细胞计数、吞噬活力和呼吸爆发检测。余下的血淋巴用低温超速离心机4℃下3000g离心10min得到血清。保存于-20℃用于检测其它免疫指标；取血后的南美白对虾在无菌条件下解剖获得肠道用于肠道菌群分析。所有指标在取血后1天内测完。各个指标的测定方法和结果如下所示：
(1)氧呼吸爆发活力：呼吸爆发活力测定采取NBT还原法。首先，用RPMI1640培养基将血淋巴稀释至1×105cell/mL的浓度；将0.5mL稀释的血淋巴、0.5mL NBT、11μL佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)、89μL培养基一起加入无菌的1.5mL离心管中；25℃放置1h后，540g低温离心10min后倾去上清。加入1mL70％甲醇终止反应后，使反应生成的月甲替(NBT氧化产物)溶解于600μL2M KOH和700μL DMSO中，并于630nm波长下测定OD值。
(2)血清溶菌酶活性：血清溶菌酶活性的测定。该指标测量采用南京建成生物工程研究所生产的溶菌酶检测试剂盒进行，操作过程按照试剂盒的使用说明进行。
(3)酸性磷酸酶：酸性磷酸酶(ACP)活性的测定。该指标测量采用南京建成生物工程研究所生产的酸性磷酸酶检测试剂盒进行，操作过程按照试剂盒的使用说明进行。
(4)血清超氧化物歧化酶(SOD)：血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定。该指标测量采用南京建成生物工程研究所生产的SOD检测试剂盒进行，操作过程按照试剂盒的使用说明进行。
(5)免疫相关基因(酚氧化酶原、脂多糖结合蛋白和抗菌肽基因)测定：用TRIZOL法对保存于-80℃中的血细胞进行总RNA的提取，将纯度检测合格的RNA样品进行反转录合成cDNA，将反转录得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测，实时定量PCR数据结果采用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。
试验数据采用SPSS18.0中的单因素方差分析(ONE-WAY ANVOA)进行统计分析，均值采用Tukey法进行多重比较，试验结果见表2。
表2
注：*表示差异显著(p<0.05)
从表2可以看出，本发明的双壳气单胞菌能够提高对虾细胞免疫、体液免疫和相关免疫基因各项指标水平，增强对虾的免疫力。
实施例4
本实施例用来说明本发明的双壳气单胞菌对对虾抵抗致病菌能力的影响。
将哈维氏弧菌(Vibrio harveyi，购自ATCC，编号为MP-6TM)接种于2216E液体培养基中，28℃培养24h，再将液体接种2216E固体培养基上28℃培养48h，刮下菌苔，用无菌蒸馏水稀释至107cfu/mL。养殖试验结束后，从实施例3的处理组和对照组中分别随机选取60尾南美白对虾，放入6个装有32L海水的塑料泡沫箱中，每组3个重复。每个组肌肉注射0.1mL哈维氏弧菌悬液(107cfu/mL)。设置空白组，空白组注射无菌生理盐水0.1mL。连续统计7d南美白对虾的死亡率。
试验数据采用SPSS18.0中的单因素方差分析(ONE-WAY ANVOA)进行统计分析，均值采用Tukey法进行多重比较，试验结果见表3。
表3
| 组别 | 对照组(％) | 处理组(％) | 空白组 |
| 1d | 11.67±2.89 | 6.67±2.89 | 0 |
| 2d | 25.00±8.67 | 11.67±2.89 | 0 |
| 3d | 26.67±7.64 | 11.67±2.89 | 0 |
| 4d | 31.67±7.64 | 11.67±2.89 | 0 |
| 5d | 35.00±5.00 | 11.67±2.89 | 0 |
| 6d | 38.33±2.89 | 13.33±2.89 | 0 |
| 7d | 43.33±2.89 | 13.33±2.89 | 0 |
从表3的数据可以看出，处理组毒性试验的死亡率显著低于对照组。
实施例5
参照实施例2饲养对虾。饲养结束后，从处理组和对照组中分别随机选取300尾虾进行称重，计算增重率(增重率＝[(末期体重-初始体重)/初始体重]×100)和特定生长率(特定生长率＝[(ln末期体重-ln初始体重)/天数]×100)。
试验数据采用SPSS18.0中的单因素方差分析(ONE-WAY ANVOA)进行统计分析，均值采用Tukey法进行多重比较，试验结果见表4。
表4
| 组别 | 初始体重 | 末期体重 | 增重 | 增重率 | 特定生长率 |
| 对照组 | 4.55±0.15 | 6.81±0.021 | 2.26±0.02 | 49.63±0.51 | 1.44±0.012 |
| 处理组 | 4.55±0.15 | 7.77±0.031* | 3.22±0.03 | 70.83±0.67* | 1.91±0.014* |
注：*表示差异显著(p<0.05)
从表4可以看出，本发明的双壳气单胞菌能够显著提高对虾的生长速度，从而缩短养殖周期。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种双壳气单胞菌(Aeromonas bivalvium)，该双壳气单胞菌的保藏号为CGMCC No.9137。
2.一种饲料，其特征在于，该饲料含有权利要求1所述的双壳气单胞菌和基础营养物质。
3.根据权利要求2所述的饲料，其中，以双壳气单胞菌的活菌体计，所述双壳气单胞菌在饲料中的含量为106-108cfu/g。
4.根据权利要求2或3所述的饲料，其中，所述基础营养物质包括蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质；以所述饲料的总重量为基准，蛋白质的含量为20-55重量％、脂类的含量为15-20重量％、碳水化合物的含量为20-35重量％、维生素的含量为1-1.5重量％且矿物质的含量为0.2-3重量％。
5.权利要求1所述的双壳气单胞菌和/或权利要求2-4中任意一项所述的饲料在对虾培养中的用途。
6.权利要求1所述的双壳气单胞菌在制备对虾饲料中的用途。
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| CN103300209A (zh) * | 2013-06-09 | 2013-09-18 | 广州格拉姆生物科技有限公司 | 一种沼泽红假单胞菌活菌制剂及其制备方法 |
| CN103320365A (zh) * | 2013-07-09 | 2013-09-25 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株及其应用 |
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2014
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