CN86102421B - 一种食用菌液体培养方法 - Google Patents

Abstract

一种食用菌液体培养方法。本发明涉及一种好气菌液体培养方法，特别是一种改进了通气发酵方法的食用菌培养方法。由于本发明采用了多级密封管道系统和灭菌棉花球过滤的小气量深层通气搅拌，革除了摇床，替代了空气压缩机等，从而大为降低了生产成本和提高了产量。本发明简便易行，所需装置小型便携，不仅适合专业户培养菌种，也适合科研单位实验室和野外培养分离菌种使用，也可以应用于其他好气菌，如医用菌的液体菌种培养。

Description

一种食用菌液体培养方法

一种食用菌液体培养方法。

本发明涉及一种好气菌液体培养方法，特别是一种改进了通气发酵方法的食用菌液体培养方法。

目前多种好气菌生产，特别是食用菌生产栽培用菌种的获得，普遍采用多级固体扩大培养方法，但该方法操作繁琐，劳动强度大，培养时间长达20-25天，菌龄不一致且易衰老，生产成本也相当高昂。近年来已开始将工业发酵液体培养好气菌的方法，使用到食用菌栽培播种用菌种的获得。用液体菌种栽培平菇、凤尾菇、金顶蘑等已能使出菇时间大为缩短。与固体菌种相比，液体菌种具有接种方便、菌龄较一致以及生长较快等优点。但是，培养液体菌种需设备投资多，技术要求高。用量不太大的液体菌种可以用摇床来生产，瓶中液体菌种量只能占容量的五分之一。若要获得大量液体菌种，还必须使用发酵罐，对比文献甲提供了这种食用菌培养方法的工艺流程和装置（见附图一），投资额都在几十万元到几百万元以上。厂小不仅产值少，而且效率也低，加之食用菌栽培具季节性，即使大型液体培养菌种工厂，经济效益也不佳。并且，一罐菌种在几吨以上，生产一旦不慎，菌种就会污染变质。日本、西欧的食用菌产量都很大，发酵技术也先进，但至今并未建有大规模生产液体食用菌菌种的工厂。对比文献乙提供了一种小型发酵装置，全套装置包括无油气体压缩机、气水分离器、空气过滤器和发酵瓶等部件组成。空气过滤介质选用新型的特制维尼纶棉花，装填密度为250公斤每平方米。这种小型发酵装置价格一千六百至二千元，无需蒸汽锅炉和搅拌机，每天动力消耗仅三、四度电。本发明介绍了一种更为小型方便、效率高、造价低的食用菌液体培养方法及装置。

本发明的目的是改进食用菌液体培养中的通气发酵方法，简化培养装置，有效地避免杂菌污染和提高产量，从而大为降低生产成本。

构成本发明的必要特征是：将多级发酵装置，通过无菌操作联结成多级密闭管道系统，从而在增级培养接种时，可通过压力将前一级的发酵液在密闭系统中直接转移至下 一级发酵液中。

下面结合附图详细叙述本发明的实施技术方案;

附图二为合乎发明主题的工艺流程示意图;

附图三为合乎发明主题的装置示意图。

参照附图三，按已知配方配制好培养液，并灌注入发酵用玻璃瓶〔1〕、〔2〕、〔3〕（容量可以为0.5、5、10、15升），使培养液占据发酵瓶容积的五分之一以上，最佳为十分之七。瓶口安上打有穿过进、排气及采样玻璃管用孔的橡皮塞〔4〕、〔5〕、〔6〕。带有球形膨大内腔的进、排气用玻璃管〔7〕、〔8〕、〔9〕、〔10〕、〔11〕、〔12〕、〔13〕、〔14〕，并在球形内腔内以1.2-1.5克/立方厘米的密度，均匀充填满普通未脱脂的洁净棉花。供抽样检验和扩大培养时级间密闭连通的玻璃或金属质分叉多通管〔14〕、〔15〕、〔16〕、〔17〕和优质橡皮管及必要时起启闭作用的管夹〔18〕、〔19〕、〔20〕、〔21〕、〔22〕、〔23〕、〔24〕、〔25〕、〔26〕、〔27〕、〔28〕。将上述〔1〕-〔28〕装置及培养液作常规灭菌处理，然后在火焰上作无菌操作，至少应关闭〔22〕、〔24〕、〔28〕处的前提下，联结成如附图三所示的多级密闭管道系统。

为了使培养液中的菌种处于所要求的最佳生长温度，将盛有培养液的发酵瓶置于能进行温度控制的环境中进行培养，本实施方案中具体采用了一个能调温的发酵箱。该发酵箱为夹层中充填有类似于干木屑等保温材料的双层箱或外表面粘贴有类似于发泡硬塑料板等保温层的单层箱，箱的内表面铺垫有均匀缝固于织物中的电热丝作热源，箱内装有控温用双金属片和氖泡等实施温度的调节控制。

进行无菌操作，将选定的固体斜面菌种接种到第一级发酵瓶〔1〕的培养液中，关闭〔19〕、〔20〕、〔22〕、〔23〕处，开通〔18〕、〔21〕处，调节发酵箱内的温度，使培养液中的菌种处于要求的最佳生长温度下，静止培养1-2天后，启动低速率通气装置〔29〕，这种装置可以是利用电磁作用、根据机械原理来实现吸、排气功能的电磁泵，以发酵瓶中每升培养液获得0.1-0.3升/分的小气流量，使空气沿进气管〔7〕、〔8〕，经灭菌处理的棉花球过滤后、送入培养液底部不超过1厘米处，进行低速率通气搅拌培养5-7天，见瓶内培养液中出现0.5-1毫米直径的菌丝球时，并根据需要从取样口〔22〕处取样检验，证实符合要求时，即告完成了一级培养。若需第二级扩大培养时，关闭〔21〕、〔22〕及〔26〕，开通〔23〕，然后启动〔29〕将第一级已培养好的菌种沿密闭管道压流至第二级发酵瓶〔2〕中，接着关闭〔18〕，开通〔19〕，启动〔29〕用上述相同的通气发酵方法通气培养1-2天，即可完成二级液体菌种的培养。若所得的数量仍不够的话，可依上述方法，使逐级发酵瓶中培养液的数量，后级比前级增多，最佳为1∶10地扩大数量，进行多级扩大培养，直至生产或科研所需的液体菌种量得到满足为止。

本发明成功地应用于江苏省丹阳食用菌研究所提供的香菇2株、蘑菇1株、平菇5株、银耳1株、灵芝1株、猴头1株、滑菇1株、金针菇1株、凤尾菇1株、榆黄菇1株、黑木耳1株等17株菌种的液体菌种培养，均获得了具有丰富菌丝球的液体菌种，并使用于生、熟料生产栽培，大多数培育出健壮的子实体;本发明还完成了苏云金杆菌等药用菌的液体菌种培养试验。由于本发明简便易行，所需装置小型便携，也适合在野外采集、分离虫草、竹荪、松茸等野生菌种，进行培养栽培。因此，本发明名为一种食用菌液体培养方法，实际上也可以使用于苏云金杆菌等药用好气菌和虫草、竹荪、松茸等野生菌的菌种培养和分离。由于本发明革除了通常好气菌、特别是食用菌液体培养方法中必须的摇瓶培养工序，因此一方面省去了对比文献甲中价格可观的摇床等装置，从而大为降低了成本;另一方面，本发明中注入培养液数量占所盛发酵瓶容量的五分之一以上，可以增加至十分之七，从而使发酵瓶等设备利用率提高三倍以上。还由于本发明中采用了低速率通气装置，具体装置可以是电磁泵为主的一套通气方法及装置，与对比文献乙中的小型发酵装置相比，替代了价格高得多的无油气体压缩机、气水分离器等通气装置，每日电耗也由3-4度降至0.1-0.3度。这一方面进一步降低了成本，使合乎本发明主题的装置造价在一百多元，约合对比文献乙中小型发酵装置造价的十五分之一还低;另一方面是使本发明更为小型方便，从而便于推广实用。若配套采用小型压力消毒锅、塑料薄膜折叠活动无菌操作箱，则可根据使用目的不同，做成专业户用简易型、野外科研用便携型、医药科研用精密型等商品化液体菌种培养装置。

本发明的实施例之一：昆研平一841少孢子平菇液体菌种的培养。菌种由丹阳县食用菌研究所从昆明食用菌研究所引入。实施装置：（1）。发酵瓶0.5升1只、5升1只、10升或15升4只;上述玻璃发酵瓶相应地配有打好3个直径1厘米圆孔的橡皮塞子;（2）.发酵箱：内箱体积为40厘米×40厘米×50厘米，内壁铺垫缝固于布上的长10米、线径0.1毫米、电阻率100欧姆/米的电热丝，内、外箱壁均用普通市售纤维板裁成，并用铰链联结，内外箱塑间充填数厘米厚的干木屑，采用市售双金属片和氖泡作控温元件及指示灯;（3）.低速率通气装置：采用空载气流量大于1.5升/分的、市售电磁泵;（4）.通气过滤管道：带有球径1.5厘米或2.3厘米球形内腔的、外管径1厘米的玻璃管16根，并在球形内腔中以约1.4克/立方厘米的密度充填普通未脱脂洁净棉花;（5）.联结用管径均为1厘米的三叉多通玻璃管5根、六叉多通玻璃管2根、长度合适的玻璃管5根;（6）.连接并作启闭作用的管径1厘米的优质胶皮管12段，与之相配用的金属质管夹12只。实施方法：（一）.配制培养液40公斤，灌注入各发酵瓶，约占容积的十分之七;（二）.将上述实施装置（1）、（4）、（5）、（6）及已灌入的培养液，置于72厘米×72厘米×110厘米的卧式圆形高压蒸气消毒锅内，经1.2公斤/平方厘米、30分钟的灭菌处理;（三）.参照图三，将上述灭菌处理的装置和装置（3），在高约10厘米，圆径约2厘米的酒精火焰上部，联结成密闭的连续式培养装置;（四）.在塑料薄膜折叠活动无菌操作箱内，从试管固体斜面母种中接种0.5厘米×1厘米的菌种4块于第一级0.5升的发酵瓶内的培养液中;（五）.调节发酵箱中的双金属片控温元件，使箱内温度恒定在菌种所要求的温度，以使放入箱中的第一级培养液中液体菌种维持在26±2℃的最佳生长条件下，静止培养2天;（六）.启动电磁泵，以通气量1升/分的速率向培养液底部不超过1厘米处通气搅拌培养一周时间，箱内温度同上，待眼见0.5-1厘米直径的菌丝球充满培养液为止;（七）.从第一级0.5升发酵瓶的取样口抽取菌种液，用肉眼平皿稀释计数法检验每毫升见500个以上菌丝球，则认为第一级液体菌种已培养好;（八）.启动电磁泵，利用压力将第一级发酵瓶内的菌种液沿密闭管道压入第二级5升的发酵瓶，与瓶内的培养液混合，维持箱内温度26±2℃，以1升/分的通气速率通气搅拌培养2天，用上述相同的检验方法抽样检验认为符合要求后，即认为第二级3.5升液体菌种已培养好;（九）.采用上述同样的方法，经2天、26±2℃的通气培养得到第三级4只10或者15升发酵瓶中约30多公斤液体菌种。

实施例之二：苏云金杆菌-以色列变种血清型H-14液体菌种培养。菌种由山东生物制品研究所引入。培养装置：同实施例之一;实施方案：除培养时最佳生长温度为27±2℃外，均同实施例之一;试验效果：经多项生化检验均符合该菌各种特性要求。将培养好的菌液喷雾于平菇上滋生的红色菇蛆虫体上，20分钟后90%以上死亡，次日未见存活。

对比文献

甲，浅淡液体菌种 上海市工业微生物研究所 冯立才 《食用菌》杂志 1983年第6期

乙，食用菇的深层发酵 上海师范大学 杨庆尧 《中国食用菌》杂志 1985年第4期

Claims (5)

1、一种食用菌液体培养方法，在发酵装置中进行深层通气搅拌培养菌种，其特征是，将多级发酵装置通过无菌操作联结成多级密闭管道系统，从而在增级培养接种时可通过压力将前一级的发酵液，在密闭系统中直接移至下一级发酵液中。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的深层通气搅拌是按发酵瓶中每升培养液获得0.1-0.3升/分的小气流量的低速率通气搅拌。

3、根据权利要求2的方法，其特征是用于低速率通气搅拌的通气装置，可以是利用电磁作用根据机械原理来实现吸、排气功能的电磁泵。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征是将多级发酵装置可置于能进行温度控制的环境中进行培养，本发明是用一种能调温的发酵箱来实现。

5、一种如权利要求4所述的发酵箱，其特征是夹层中充填有类似于木屑等保温材料的双层箱或外表面贴有类似于发泡硬塑料板等保温层的单层箱，箱内表面铺垫有均匀缝固于织物中的电热丝作热源，箱内装有控温用双金属片和氖泡等以实现箱内温度的调节控制。

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